Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ АЛЬФА-КЕТОГЛУТАРОВОЙ И ФУМАРОВОЙ КИСЛОТ НА АЗОТИСТЫЙ ОБМЕН В РУБЦЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ АЛЬФА-КЕТОГЛУТАРОВОЙ И ФУМАРОВОЙ КИСЛОТ НА АЗОТИСТЫЙ ОБМЕН В РУБЦЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

. На правах рукописи Софья Вениаминовна СМЕЛОВА

Влияние «-кетоглутаровой и фумаровой кислот на авотистый .обмен в рубце крупного рогатого скота

(Специальность № 03.00.13,— физиология с.-х. животных)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА —1972

Диссертационная работа.выполнена на кафедре физиологии и биохимии с^-х. животных Московской ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени с.-х. академии имени К. А- Тимирязева. ■ -■ ■

Научные (руководители: доктор биологический наук профессор П. И. Жеребцов и кандидат биологических наук доцент А. И. Солнцев.

Официальные оппоненты: доктор биологических'наук А. А. Алиев и кандидат биологических наук К). Н. Шамберев.

Автореферат разослан . года. >

Защита диссертации состоится на заседании Ученого совета

зоотехнического факультета ТСХА « У. . 1972 г.

в . . /А . час.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ {10-й корпус).

Просим Вас принять личное участие в работе Ученого совета или прислать письменный отзыв на данный реферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, по адресу: г. М(}сква 125008, Тимирязевская улица,'д. 47, корпус 8, Ученый совет ТСХА. 1 . ■

Ученьш секретарь Совета ТСХА '

\доцент Ф. А. Девочки н.

В ВЕДЕНИЕ,-

Большую роль в обмене, веществ в рубце жвачных животных играют кетокислоты. В рубце кетокислоты образуются' при дезаминнровании аминокислот. Другими процессами, приводящими 'к образованию .кетокислот, являются цикл ди- и трикарбочовых 'кислот, а также реакции анаэробного распада углеводов. Участвуя в цикле — ди- и т'рикарбоновых кислот, кетокислоты могут выходить ;из цикла; и превращаться в соответствующие аминокислоты.путем прямого аминирования пли переаминирования. Важная роль в этих реакциях ■ принадлежит сс-кетоглутаровой кислоте,' как одному из основных акцепторов аммиака или аминогруппы. .

Синтез глутаминовой .кислоты из а-кетоглутаровой и аммиака является широко распространенной реакцией восстановительного аминирования. О , . ~ ■

Мак Ларен и сотр. .(Мае. Laren eial, 1964) на ге-могенатах слизистой оболочки рубца наблюдали .'синтез тлутамииовой кислоты из аммика и а-кетоглутаровон.

. Исследованиями зарубежных авторов {Hoshino Sadao, Sa-rumaru Katzucharu, Morimoto Kazuwo) было показано, что при высоком содержании аммиака в рубце происходит синтез глут-аминовой кислоты' путем восстановления а-кетоглутаровой.

Реакция восстановительного аминирования а-кетоглутаро-вой кислоты аммиаком играет большую роль в вовлечении неорганического азота в обмен клетки и.является одним из основных .путей, связывающих между собой-об мен углеводов,' сводной стороны, и обмен .аминокислот и белков, — с другой,.

Известна важная роль а-кетоглутаровой кислоты как акцептора аминогрупп в реакциях переаминирования с различи ными аминокислотами (Браунштейн-А. Е,, Крицман М, Г., 1937). Реакции переаминирования играют важную роль в синтезе аминокисдот Рубцовыми* бактериями. Основанием для такого предположения является наличие в рубцовой жидкости многих кетокислот, --включая—сс-кчтоглутаровую и пировпно-традиую,. lUtiT-:'.-"" .

v- а - kè то гл ута ровая к йс л о тая в л яетс яте м и'« do р От а ми», через' ~ "которые аммиак': включается в ;обмен>веществ;И- используется: для аштеза.азотистых соединений. • ' . : . v'

Обмен; аммиака в р у б цесвя з анс ~ обм е ном ; а сп а р а г и н о во й : . и фумаровой кислот, с действием фермента;;аспартазй.- Biip:v ' J_ танен( Virtancn ,71932),а поздн е е" ; Квостел .Iji : В ул ьф ~ - ( Q u a s - ;, ; - tel К. and Woolf В.; 1936) показали,- что ; у." некоторых.6 ajÎTeVi ' рнП имеется ; фермент аспар т а за катали з и ру ю щй fr ■ ре а к ци ю .

- 'ам ш шро в а н и я - фу ма р о во йки с л о ты а м м и а ко м ; ; ' J": ■ ^ v А ; -; - -, Этот фермент был также найден в;рубце-жвачных живот-;.

ных. Б опытах ^vitro (П,;И. Жеребцов; Л. Иг Солнцев,\ 1965).:, н а б л юд а л i [ ;;что до б а в лен и е ' фу м а ровой ; кн слоты.. Kvp у б цово й ? жидкости, ведет^ к снижению концентрации аммиачного' азота л ^ j вел едстви i г о бр а зо в а и ияас п а р а г и н ов о й * к н с л оты/; Ф у м аровая • г к не лот апр н введении ёевгх 11 м ус; р у б ц а, 'вер оят но, Ум ожет'св я -

* зывать излишки4 аммиака"и;тем предохранять.организм ^жвачг^ -О- и ого. ; от потерн азота и от е г ото кс и чес ко годе йств и я .;П р нг -"'уменьшении; аммиака в ; рубце, -аммиак -из, связанной ". формы,s :>;:т;-е;;нз аспарагиновои к и сл оты м о жет по дд е й стви е .\f ф е р м ента К

- : ■ a cri а рта з ы " освоб о жд а ться - и ; исп ол ьзовать ся "дл я ^о б р азо ва нйя

микробного белка. _ .г.-**w"^"v"'дГГГ^"?.'.-! : ; Фумаровая ~кисл'ота приннмает^участие -в 'бносинтезе'моче^ X вии ывп е че н и ,С н итез м оч е в ин ы* ос у шест в л я етс я 'та к имо бр а Г зо м то; пол овин а аз ота ' n р ох одит; ч е р ез';т ста д н ю Г а м м и а к а*, " а другая ^через;стадию;аспарашновой'кислоты;*п6этому; вероятно, добавление фумаровой кислоты'в корм' животным! бу-; ■ f Д е т^ст и м ул про в а ть биосинтез; мочевины ; в - печениИ;;-?^ ч < Образуемая7 и з~ а_с п л р а г й но вой^ф'у м аров 5 я кн сл от а,;я в л я ет-. ! :'с я од ни мнз "член о в т р и ка р бон ового^ -ци к л a уй воз нй кает. к а к^-■'"пролшжуточний ; продукт; прйра'щенйя -углеводов,;-. ^ ч

: ^ л- Учйтывая^высокое бнологнческое 'значение,. а-кетоглутаро-1 -у вой и фу ¿1 а ровой кислот"в ■ обменных гпроцессах^и их связь с г\циклом ди-и тр и к арб он овых1 к не л от.м ы п оста вили задачу, — И изучить роль этих.кислот в азотистом обмене у крупного,рога-';

. .того, скота.":.-. ;•' ■ У'-Щ ^ f ■■ • •; -<■■ --у.

■ -2 Для.выяснения" ролн.фумаровой .и а-кетоглутаровой kiîc-, лоты в азотистом о б м ей еукру пно го рогатого скота нами были -, запланированы:исследования;^в следующих-направлениях:у-■ "Изучить ;В: условиях, in л'Цго^рол ь'а - кетогл у f ар ово fr к ис-; лоты-в"связывании аммиачногo àзота рубцовой жидкости. ■

Выяснить роль фумарЪвой'кислоты^-в-связывании : аммн-"7' . ачного азота'рубцовой жйдкослцк! vitro. , ';' Изучить влияние скармливания; фумаровой 'кислоты-на;-; содержание/азотиешх фракций.в"'рубцовой:^жидкосги^крови ■ ■ и моче in vivo. ' vV

. H аш ара бот ая вл яе тс яч a сть юо б ще й ' про б лемы «П ищев а

рёйнб и. обмен:.веществ у' сельскохозяйственных, животных й птиц в* онтогенезе, разрабатываемой на кафедре физиологии, и. биохимии сельскохозяйственных. жи в о тных ,Т С X Л».

- - /Методика исследования

,'.: Опыты, про в од и л п с ь на бычках-кастратах холмогорской породы б возрасте .старше 9-месяцев. ;Животным в 4-месячном возрасте били наложены фистулы рубца по Басову. V В течение все гоо пы т н о гоп е р и од лж и both ы ее од е р ж а л и сь -на трех рационах— двух зимних и одном летнем, составленных согласно норм ВИЖа. - . _

I рацион включал в себя следующие корма: сено луговое разнотравное,-"силос кукурузный,, свекла кормовая, ячменная, дерть,' II рацион — с тем» же компонентами,- но 20%перева-рнмого протеина было заменено;мочевиной.

■ 11Г летнннрацион —зеленая -трава — вико-овсяная. смесь' и 'ячменная дерть. ' ■:> ■ ' - - :: ■'.-.", ' -,."' -

Г; . .Опыты проводились методом периодов. Каждому .рациону "предшествовал подготовительный период 30 дней. Кормление животных трехразовое (8, 14, 20) часов. ■ '.'■■'.

Для того чтобы выяснить роль_ а-кетоглутаровой и фума-ровой кислотГп связыванни"'аммиачного азота рубцовой жидкости, полученной от животных,: содержащихся на различных : рационах, - и. принтом исключить влияние'животного организма ,мы использовал]! метод in vitro. -.;

От_ каждого животного были взяты .через 4'нстулу пробы рубцовой жидкости в количестве 1200 мл—пробы брали до кормления и через 3 часа после кормления. Взятую пробу тщательно перемешивали н- разливали в:10 стаканов искусственного рубца. Первые два. стакана были контрольными, рг 3-й н '4-й —добавляли 0,5 г а-кетоглутаровой кислоты, что соответствовало 0,3 моля, 5-й и 6-й — по 0,5 г фумаровон кислоты, что-соответствовало 0,4.моля, в 7-й и 8-й — по 1,0 г фумаро-вой кислоты, что соответствовало 0,8 моля, 9 и 10—1,5 г фума-ровой кислоты, что соответствовало 1,2 моляна 100 мл рубцо-boiV жидкости. Затем пробы ставили инкубировать в искусственном рубце при t=38°—39®C в течение 4 часов; В рубцовой жидкости определяли -количество общего, белкового, небелкового и аммиачного азота. ' i ' .

Общий и небелковый азот определяли классической методикой по макро-Кьельдалю, белковый —по разнице между общими небелковым, азот аммиака -- по Фердману. Определение велось с тем расчетом, чтобы не допустить разрушения аспа-рагнпа н глутамнна. Отгонка аммиака проводилась при, 50° С боратны.м буфером в течение 30 минут. -' '

fe. задачу наших исследований входило -проверить волыта^ ■in vivo данные, полученные в условиях in vitro. ,-, "

С этой целью животным скармливалифумаровую кислоту -на фоне этих же рационов 2 зимних и одном летнем.^Расчет количества фумаровой кислоты ; проводили " следующий образом. В опытах in vitro максимальное.связывание аммиачного азота отмечено при добавлении10,8 моля фумаровой, кислоты на 100 мл рубцовой жидкости. Исходя из этого, количество фу-.маровой. кислоты, необходимое для скармливания, подсчитали эмпирически. Фумаровую кислоту, в количестве 143 гна голову 3 раза,в^сутки скармливали в течение 15 дней. При этом разовую - дозу растворяли в 100 мл воды и равномерно поливали концентраты, которые немедленно скармливали животным. Через 15 дней после скармливания определяли концентрацию аммиачного азота в' рубцовой жидкости по Фердману.

От каждого животного брали пробы рубцовой.'жидкости, крови до кормления н через' 3 часа после кормления, мочу бра-,ли суточную. В рубцовой жидкости определяли: общий белковый, небелковый азот, аммиачный азот; в крови —общий, белковый, небелковый, мочевинный; в моче— общий и мочевин-■ ныи." \ ■ '■.

i ' > V РЕЗУЛЬТАТЫ,ИССЛЕДОВАНИЙ " ^ :

1;;; Влияние а-кетоглутаровой;кислоты' на 'содержание азотистых фракций в рубцовой жидкости In vitro

При добавлении а-кетоглутаровой кислоты к рубцовой жидкости в условиях in vitro происходит достоверное/снижение концентрации аммиачного азота,; как в пробах; взятых до кормления, гак и через 3 часа после кормления по сравненню: слонтрол«м. .-у-;, '.:';-:л."'

На первом рацноне отмечается снижение аммиачного азота в пробах до кормления на 39,1%, через 3 часа после кормления на 55,3% на 2-м рационе —до кормления на 39,2%, через 3 часа после кормления на 39,6%, на 3-м рационе — до кормления на 37,6%, через 3 часа после кормления на 45,8%; • ,

Это объясняется, по-видимому; тем что при добавлении а-кетоглутаровой кислоты к рубцовой жидкости, под действием фермента глутамнндегидрогеназы, соединенного с никотина мндаде ннндннуклеотндом, и " никотинамидадениндинукл ео-тидфосфатом/' находящегося в рубцовых микроорганизмах, происходит реакция восстановительного а м и н и р о в а н ня {а-к ето-глутаровой кислоты с образованием глутаминовой кислоты. ■ ? Для подтверждения такого предположения мы исследовали , рубцовую жидкость,- применяя; ' хроматографию , на бумаге. _ После проявления хроматограммы получилось пятно^ отвечав-

г шее гл у та м н'нов он' к и с л от е.' Содер ж а ни е гл ута м и н о в о ГГ к) ¡слоты . Г:1'в контрольных-0бразцах';состав11ло 5,28%-к протеин^,-после до-1 Давления к пробаа1чрубцовой'жидкосл1 а-кетог л у та р qpo й » к и с- . с,-"лоты содержание ее значительно увеличилось и; составило. ■"* 8,39% к протеину,/ ; .-Данные статистическидостоверны ■

(p<o,ooi). . ... . • .

: -. Это все дает основание утверждать, - что' в инкубируемойс v;. ру б цо во fr " ж и д ко ст и д е нствительно происходило во сст а нов н -Г тельное амннирование а-кетоглутаровой кислоты "аммиаком с " - .'образованием глутампновой кислоты. Наши данные согласуют^ Ч.ся также с работами зарубежкых"авторов, (Hoshino Sadao, Sa-^ ' rumaru Katzucharu,Morimoto Kazuwo), которые.показали, что .

' при выроком содержании аммиака в рубде происходит синтез '^ глутаминовой кислоты путем восстановления а-кетоглутаровой. I" Наличие в Рубцовых микроорганизмах дсгвдрогеназы -глу-.: тамнновой кислоты, соединенной- с .никотинамидадешшдннук-'. "леотйдом, дает, основание"утверждать,', что первая ступень пе*„ "- рехода аммиака вЧаминокислоту включает "реакцию аминиро-ванн я. V *

Ко н це н т'р а ш i я-об ute го' ;а з о т ас- /р у бцо в ой жид kocti i, по с л с инкубирования при добавлении 0,3 моля а-кетоглутаровой кнс:,, ¿/-лоты достоверно-увеличилась по сравнению с контролем на ' всех рационах (Р<0,001; р<0,01). '. . ;. г * " * -•: Данные .исследований по содержанию' азотистых фракций в рубцовой жидкости; иолучепноиот животных, содержащихся"; на различных рационах, представлены в табл.; 1. : : v

-4 ' г Увеличение концентрации общего^ азота после добавления в/ • инкубируемую рубцоиую жидкость"'а-кетоглутаровой' кислоты,', л отмечается'как в пробах, до кормления, так. и через 3 часа после кормления." На всех рационах идет примерно "одинаковое: увеличение -концентрации ; общего "азота."IIa I рационе кон-" ,' : иентрация' общего азота! увеличилась* п пробах до кормления " :на 15,5 мг. через 3 часа;после^ормлення на 20,2 мг; II рацио*. ' -недо кормления,на'27: мг, через 3 паса после кормления на-.

24,5 мг; на .III.'рационе^-до кормления на 22 мг/ через 3 часа v после кормления на 23,3 мг на.100 мл рубцовой жидкости. Дан. ные статистически достоверны.(р<0,001; р<0,01). : . - -i г/,: Л ~г Такое: увеличение; общего азота, врубцовой. жидкости мы : . объясняем /тем, что;:>аобавление а-кетоглутаровой - кислоты Vв инкубнруе^ю рубцовую жидкость ведет; к фиксации': азотаj в', виде глутариновой аминокислоты, которая, путем * перса мини-, '.'"рования включается, в обмен веществ~с образованием разлнч-л ных азотистых соединений.' -' . • -..••- "';, ..'...•-v*/

: Концентрация белкового азота в рубцовой жидкости нзме* -^ияется подобно общему.: При* добавлении 'к;пробам \ рубцовой,, - .жидкости 0,3 м о л яа-кето глу т а ро во й кислоты наблюдается увеличение концентрации белкового азота ;ка'к в пробах до корм-.

.■ ■■. v " УУ-'J"- Таблица Л, ;

''■• Влияние а-кетоглутаровоП кислоты на'содержание азотистых фракций ^ * * в рубиовой жидкости in vitre *srr-Z.

" Б ром я взятия • проб • ..'-. . *-. :

.; ' До кормления'' ■ г через Л часа' после'' V .";';. '- кормления-

• контроль" . "0,3 моля''. контроль ' J - 0.3 моля-

■'. '. Т опыт

ОбишП азот . , . . 171,3 ±1,14' 18G.8 ±1,71 169,3¿1,19 191,5 ±1,39 •

■Белковый азот . 126,0 ±.1;1С 145,7 -1,45 131,8 ±1,08- 15G.8 ±1,24" -.;

Небелковый'азог---44,0 ±1,90 41,4'±0,82 .38,1 <:¿0,98: 34,7 ±0.М -

;-Ли«:Вач«ый.азот-.-,л;-:' ■ ;3,38±0;1;); -2,00^:0.11 : 4.69 ±0,39 2,10±0,1С ■'

> 'I' опыт . •..'- .Л .'-'л/ л; .■

, Общий азот - : ; . .- 183,1 ±1,70 210.3 ±2.02 172,2 ±1,57 196,7 ±2,10 '

■ Белковый азот- Ч 147,0±1,71 101 ,в ¿1,20 139,5 ±1,34 160,0 ±1,94'. Небелковийазот ЗС.Л ¿1,00 48,7 ±1,19 .32,7.±1,21- 36,6 ±1,15' ■ Аммиачный, азот . -1,29±0,29 , 2,67±0,22, : 5,26 ± $32 \3,18±0,26'-;

'.:..".■*■ r \ utопыт / У-Д.-..^.-"., \ '-.■■.■.:"

OOuuní "азот . 7- . . 113,6 ±0,96" i33.0 ¿1,41 103,0 ±1.32 ¡27,1 ±1,51

Белковый азот : , 61,1 ±0,76 82,2 ±1,11 .63,5 ±0,95 83,7 ±1,23 . .-

Небелковый азот- "-.- :49,Г ¿1,63 53,3 ±1,03 40.0-'±1,07 , 43,4 ±1,02

Аммиачный азот í -М,13±0,30 ' 2,70±0,18 7,30±0,1G 3.90±0,И :

лен и я, так « через З чяса после кормления на всех рационах. О бр аз ов а и н а я , и з а: к сто глут a р о в ой ..кислоты глутаминовая/-;,' в спою очередь дает начало важным аминокислотам как про-лин, оксипролин, -гистйдин;. оршиин.арпииш, лизин :(Браун-штейн, ;1957;'гКретопнч, 1957, 1961,, 19G4, 1965, Манстер, ;19G1) .-: - : а-к ето гл у т а р о в а як 11 с л от австу п а етвр с а к цннфе рмен'т ал ib ного амнннрования с различными -аминокислотами.; Реакции} пе pea мини ров а ни я игр а ют важную роль к синтезе аминокислот Рубцовыми- бактериями.' Основанием; для такого предположе- ;,

■ ния является наличие п рубиовой жидкости многих кстокнс- -. лот, включая а-кетоглутаровую и 11нроинноградпу|о.;Добавле-

; нне а - кетоглу т ар о во ñ к и слотыоказ ало пол ож i !те л ь ное в л и я -- ' ние на синтез микробного белка, вследствие чего отмечается увеличение концентрации белкового азота. ' / ^ /*.■._-

: Максимальная концентрашш";белкового азота'в контрЬль- . пых-пробах на летнем рационе составила в среднем в пробах после кормления 139 мг на 100 мл; самая низкая концентрация ~была':на рационе с включением мочевнны —Й мг на 100 мл рубцовой жидкости. ; - \\

\ Следовательно, на летнем рационе шел самыйинтенсивный < синтез микробного белка. Разницы в содержании'небелкового ; азота в контрольных: образцах в пробах, взятых-до ■кормления и через 3 часа после кормления, не обнаружено. '"

-.Наибольшее количество небелкового;азота отмечено на ра-, ' ционе с мочевиной. Концентрация небелкового азота в рубцовой жидкости существенно не'изменялась от добавления а-ке- ,■ ' тоглутаровой кислоты. ;; ■ . .: - : " .''■• , - '";'_-: у.'

2. Роль фу маровой кислоты4 в связывании аммиачного азота - - в рубцовой жидкости в условиях in vitro :

: 1 Б задачу наших исследований входило — изучение роли фу- . умаровой кислоты в связывании аммиачного азота.

Исследования показали, что добавление различных доз фУл маровой кислоты к рубцовой жидкости, полученной от живот- . ;ных, содержащихся на I рационе, ведет, к достоверному сниже-.'-',.- нию аммиачного; азота: по, сравнению с контролем в пробах, '. взятых до кормления. При добавлении ■-_ дозы 0,4 моля на . 100 мл рубцовой-жидкости концентрация азота аммиака снижается по -сравнению с контролем на- 16,6%; от добавления дозы 0,8 моля—-нал27,3% н от добавления дозы !,2 моля — X на .14,3%, Данные • статистически > достоверны (Р<0,001; р<0,01). . . . .;.. ".v.-.i; •

Добавление фу маровой кислоты к рубцовой жидкости ведет . к снижению ^уровня; аммиака, особенно сметному в пробах, ;.' взятых через'З часа после начала кормления. Отмечается сни-- женне концентрации аммиака от добавления дозы 0,4 моля фу-маровой кислоты на 100 мл рубцовой жидкости на 29,9%, при добавлении 0,8 моля на 52,7%, 1,2 моля — на 47,8.% по сравне-' . нию с контролем. Данные статистически достоверны {р<0,01;'" р<0.001). ' --;,■/ ■ - При содержании животных на II рационе,- с добавлением S мочевины, происходит снижение аммиачного азота в пробах, взятых до кормлення: на 30% лрн добавлении-дозы 0,4 моля ■' на 100 мл рубцовой жидкости; при добавлении дозы 0,9 моля \ "; на-46,8%, дозы 1,2 моля на — 47,8% по сравнению с контро-: лём, В пробах, взятых через 3 часа после кормления от добав->ления дозы 0,4 моля —на 29,2%, от 0,8 моля на 46,4% и от 1,2 моля на 30,6%. На 3-м летнем рационе отмечается аналогичная тенденция к снижению аммиачного азота. -:У При добавлении различных доз фу маровой кислоты к руб. цовой. жидкости, ■ полученной - от животных^ содержащихся' на* различных рационах, отмечается снижение аммиачного азота, . как в пробах,'взятых до кормления, так и'через 3 часа после кормления по сравнению с контролем. Максимальное связыва-

у;нне "аммиака происходит 'от'добавления, дозы.. 0,8 мрля~;на-''.,* 100 мл рубцовой; жидкости. -; : .¿.'..г.;..;.' :/ ^

: v' : -Данные исс ледова ний-но; изменен ню концентрации аммиач-

• ного азбта прй;добанлен1Ш различных'доз фумаровой кислоты^ •' представлены" на рис. 1. ..,.■.'■,'.. ■.

■ ; Уменьшение концентрации аммиачного* азота ;после; 4-ча-" -сового инкубировании" в присутствии ф у м а р о в о йг. ки с л отыЧ> бъ-' •' ясняётся тем,'что при добавлении ее'к рубцовой жидкости,;под^ .действием фермента acripfaT — аммиак — лиазы (аспартазы) Г "она связывает аммиак с образованием аспарагнновой1 кислоты.,';

:ДДанные.опытов были подтверждены хроматографией на:бу-д маге. Дли хроматографии применяли "инкубируемую рубиовую "жидкость'с добавлением 0,4 моля фумаровои кислоты.; После

проявления нингндрнном, получилось пятно, соответствовавшее ; /■'аспарагнновой кислоте. Концентрация'пепараглновой'кислоты-./.в. контрольных п р о б а х р убцо в ой ид ко стя :Соста в л л л а:3,8 6 % ■ : к протеину, после добавления 0,4'моля фумаровои кислоты на ■; ЮО.мл р'у.бцовой, жидкости, концентрация ее увеличилась и'со-: ставил а* 4,53% к протеину. Данные статистически достоверны I :Чр<0,05). .. : ; • - j'

.Имеются данные, что в рубце жвачных: в условиях in vitro фумаровая кислота подвергается ферментативному, амнннрова-. :

• -нию.с образованием аспарагнновой кислоты (П.Л1.,Жеребцов;,: • Л.' И. Солнцев, 1965, 1967), Наши данные согласуются с дан- :

У ными,.'полученными п опытах in yitrb на кафедре .фнзнологшь и.биохимии с.-х. животных ТСХЛ. • 'У-.-i'.--'.'¡V■ \

.Как;уже отмечалось, что максимальное снижениеаммиач- -ного :азот,т происходит при добавлении 0,8 "моля фумаровой^ кислоты на 100-мл рубцовой жидкости, ^Увеличивая дозу'-доV у 1,2 моля. на всех трех ранпонах н пробах, взятых;до кормления, , наблюдается уменьшение азота аммиака по сравнению с кон, тролънымп пробами (р<0,001; р<0,01) и тенденция: к увели-'; ■; чонию по/сравнению с дозой 0,8 моля на 10 0' м л :р у Сцо в о й;ж и д - ; кости. Это объясняется, по-видимому тем, что при добавлении к рубцовой жидкости 1,2 моля фумаровой кислоты, изменяется ; рН в "кислую сторону, ингибнруется действие фермента аспарг.; тазы, имеющего активность в щелочной зоне pl l. . Синтез аспарагнновой кислоты нз; аммиаками'.-фумаровой': ■ кислоты замедляется. Пр данным ряда авторов,'зона действия -' .аспа'ртазы рН 6—9. ' .■.■>■';"■-: 'V:^

' > В ряде-работ, указывается на способность многих микр6:> организмов синтезировать аспарагпновую кислоту.прямым.,/ ■ампнированнем фумаровой, благодря наличию у них.фермента '/: ; ■ аспартазы. Этотферментбыл также- найден в рубцежвачных-:'.

• животных. • ■ ■:/.' .'■■ '■'...'. " л

; ■ Лспартаза в 'енлу обратимости действия может участвовать

' 48 -

// о л е и.

Рас/. jte&aw&r /rascs/ж

"/иг cafytomwue амяшмеи a&ma jfyJj^m xec/nu v&t-s S vaca. л^глУМ^гми// vt td&ô , (Х>][яМ—ю/te/ntif/wmw)

'■' в i процессе ■ связывания неорганического азота путем вовлече-"-ния аммиака'в аминокислотный:обмен (Кретович'В.Л.у 1961),,

Прэтому'восстаи'овительное аминирование фумаровой кис- ^, v лоты^приводящее к образованию аспарагиновон, является од-* ним:нз путей связывания аммиачного азота. Образование'ами-'.нокислот путем" прямого амцнирования органических кислот 'играет большую роль в биологических синтезах. v

л 3; Влияние различных: доз фумаровой кислоты на содержание ;азотистых фракций в рубцовой жидкости In vitro "

. Данные по ~содержанию>азотистых^фракций 'в рубцовой жидкости полученной от животных, содержавшихся на разных рационах прн'добавленни 'различных доз фумаровон кислоты,-;представлены' в табл. 2: : ; у "; .'■*■'- У , "' :

".— Проведенные: исследования показали, что добавление различных "доз фумаровой';КИСлоть1 к" пробам 'рубцовой жидкости " ведетГк-увеличению общего азота как в пробах до кормления, ■ так и через *3 часа после, кормления. Концентрация общего

• азота в контрольных пробах до кормления составила 171,6 мг; при добавлении дозы- 0,4 моля,отмечается тенденция к увели- ■ чению': (данные; статистически недостоверны), при добавлении '-,-дозы 0,8 'моля увеличивается до 200 мг — дозы 1,2 моля —г 191 мг. :''.";''-'V- ■'■■.-■■.'. ,.■."■'

: При добавлении дозы Ч),4 моля фумаровон кислоты отмечается тенденция к увеличению общего азота (данные стати- '; 'стически.иёдостоверны) по сравйеншо с контролем, от добавления/дозы: 0,8; моля идет увеличение концентрации общего ;азота.по сравнению с крнтролем, от добавления дозы 1,2 моля ' идет увеличение по Н еравнению с контрольными ; пробами ; (р<0,05) и снижение по сравнению с дозой 0,8 моля (р<0,05).

Через' З-часа;после кормления на , 1-м рационе концентрация общего азота в рубцовой жидкости составляла 157,3 мг, ; „ в 100 мл, от.добавления дозы 0,4 моля на 100 мл рубцовой жид-; : кости концентрация общего азота повысилась до 167;7, дозы ' :0,8 до; 185,0, дозы 1,2 моля отмечается достоверное снижение ■ по сравнению с дозой 0,8 моля ii увеличение по сравнению с

• контролем (р<0,001; р<0,01; р<0,05).

На II н 111 рационах отмечается такая '-же картина в нзме- : .нении концентрации общего азота п рубцовой жидкости,,

Концентрация аммиачного азота как уже отмечалось выше, -' " снижалась вследствие реакции восстановительного аминирона-■'. ння'фумаровой кислоты. - ' - ■ .' / у .

Аналогичные изменения -происходили в концентрации бел- . .'.нового'азота. Максимальное увеличение содержания общего .'и белкового азота наблюдалось при добавлении дозы, 0,8 моля на 100:мл рубцовой жидкости. Увеличение концентрации обще- *

->-■■! ■ ..: .-у :■ у У ■■■1 ч''..' - .■':"' л - '-.■:- '■"■

Влияние различных-доз фумаровой кислоты на содержание азотистых ;' у. фракции в рубцоеой жидкости trivitro u/t£f№*UJ*!г

■Таблица"2 ;

Азотистые

' . Время взятия проб ,.'..;.

до кормления V

1 фракции . ■ :контроль.. 0,4 моля 0,8 моля • 15. моля контроль ■ 0,4 моля 0,8 моля 1,2 моля

; Общий азот » Белковый азот Небелковый азот - Аммиачный азот I7i,6±t,70 129,0 ± 1,30 42,6; ¿0,16 3,38±0,19, 177,4 ±1,82 137,2! ±1,65.: : 40,1 +0,19 .:: 1,81+0,20; 200.1-±5,17 155,1-±2,10' 45,8+1,60 ,1.46±0.21 ' 1 опыт 182.0 ±1,83 149,2 ±1,93 32.6 ±0,41 , 2,02 ±0,11 157,2 ±'2,70 114.4 ±1,52: 42,9 ±1,17 4,09±0,39 167,7 +1,20 123,5 ±1,56 44Л ±1,41- - 3,29±0,22 1 *J л ' . 1 185,0 ±2,06 139,5 ±1,91- •155 ±1,90 2,20±0,18 O.'/V..:'-.; 164,0 ±1,46' 128,2 ±1,16: 'Л 36,4 +1,93: : 2,45 ±0,20;

til ОПЫТ

Общий азот ■ 183,1 ±2,01 186,3 ±1,51 214,2 *±3,С4 200,8 ±2,71

Белковий азог ' 147,0 ±|1,95 147,2 ±1,90 163,4 ±2,01 1.51,8 ±й,11

Небел ков и fi : ' ' ' 1 ч ■■ ■■ 1 .■ - .'■..

азот .'-'\< 'V 36.1 ±1,0) 31,9 ±1,09' 50,0 ±.152 48.9 ±1/34

Аммначний'азо! 4,29 +0,29: • 3,16±0,23- /2,26 ±0,18 2^Й±0,34,

1722 ±2,14 139,5.±1,42.

32.7 ±'1,21: :' 6,20+0,32;

llf опыт

180,9 ±5,03 146,0 ±1,65

«Ц.9 ±1,31 ; 4^5 ±<1,2?

205,1 ■:+2.-16 158,0+2,00

46,5 ±1^6 1 3,76 ±,-0,28

Общий азот Белковый' азот .Небелковый г ■ „ ■ азот ■■- '■:" Аммиачный а зо1

117,6+1,60 . 80,5 ±0,92 125,5 ±4,31 89,7. ±151 148.0 ±0,82 107.1 ±1,-22 139,0 ±1,36 106,6; + 1,56; 99,6 ±1,72 68,3 +0,74: 102,6 ±1,75 67,9+0,95 1234 ±2,60 83,1 ±1,13

37,1 ±0,90 -3,9 (±0,28 3.51 + 1.60 2,74+0,20 '41,7 ±1,3} 2,03±0,Г2 33.6 ¿1,12 - 2,45+0,18" 31,2, ±0,74 5,72±0,39 31,0 ±1,92 4.11 ±0,26 40,1 ±0,92, 3.07±0,20

191,4 :±1,76 ■-■ 151,9 ±2.13-

39,5 ±1.11 " 4,00 ±0.30

111,4 ±1,43 79,9 ±4,25

31,4 ±0,02 3,97±0,22\<'

го и белкового азота при добавлении,в инкубируемую рубцо- .'■--вую жидкость - фумаровой кислоты, происходит вследствие синтеза, из аммиака и фумаровой к н с лотыа с пар а ги н о вой аминокислоты и-других азотсодержащих соединений. .. .:}'

. ' • 4. Роль фумаровой кислоты •':! ; ; ; л; о ; . в связывании аммиака рубцовой жидкости ¡п у1уо ^

•""в опытах-¡п^уНго мы наблюдали, что при Добавлении к рубцовой жидкеюти различных доз фумаровой кислоты происходит снижение концентрации аммиачного, азота. Мы объясняем это тем, что в"рубцовой- жидкости под действием фермента аспар- ';■ тазы происходит, восстановительное; ¿минирование фумаровой : кислоты с образованием аспарагнновой кислоты.

В задачу наших исследований входило проверить в опытах ¡п \чуо.данные, полученные в условиях ¡п уИго.'- -V -¡:

•-'_ С этой, целью животным'скармливали фумаропую кислоту -на фоне этих же рационов — 2 зимних и одном летнем. ' . "г- - Данные оЬытовгт:;уНго -нашли свое подтверждение в опытах ¡п >чуо. Проведенные исследования показали, . что при скармливании;; фумаровой-кислоты; животным,'содержавшимся на различных'рационах как в пробах до кормления, так и через -3 часа^после.кормлення::наблюдалось уменьшение-концентра- у Лйн "аммиачного;азотагго сравнению с контролем.;"; ;у ; /..у V;..' ,

На 1-м зимнем рационе п пробах до кормления происходило "достоверное ~ снижение'.: (р<0,001)-"концентрации:аммиачного • \ азота по сравпе1П1ю;с;,контролем на 36,6%;;в пробах,:взятых ; .'...„ через 3'часа после кормления,— на'.36,1,'%.■>: .'■■".'".' ■;-;..'.;:;."■■" '.-' На- Н рационе с включением мочевины при1 скармливакии: ; фумаровой-кйслоты;^концентрация-'азота1''в пробах-до корм- . лени я ; снизил ась- {р < 0,001, ; Р < 0,01 ) иа 4 3,4 %,'через 3 часа после кормления-на 53,7%.-Ан.ллоги,'пап картина отмечается ' . н на летнем рационе. .'..".>;:■ * '.. : >, г-'/'■'/';.■ ->

В пробах до кормления отмечалось достоверное снижение азота аммиака на, 32,4%,.через 3 часа на 31,0% по сравнению . '.;. с контролем. • •'.-'-"'... . . ■ ■ :' ";л '■"'.11 V ..

Уч>НаЧ1;'рацнонЬ с включением мочевины отмечено наиболее -интенсивное; снижение аммнчного азота в рубцовой жидкости, чем -на VI - и III. Снижение концентрации аммиачного азота в рубцовой жидкости "объясняется тем/что, под действием :'фер- -мента аспарт"азы,\- содержащегося\в микроорганизмах проис-.; / ходит восст а н о в ител ы Iоеламинирование. фумаровой~ кислоты^^ с образованием аспарагнновой кислоты.1 . , . - , ;;.'■'.V.

Результаты опытов -нйуИго'подтвердились хроматографией У . на бумаге.* С этой целью на II рационе с включением мочевины .'-'"' были взяты; пробы рубцовой жидкости;для .хроматографиче-ски* анализов. ;■■ '■■"."; ■■ ■ ;';.■■:;■.-' . ' '■-'.;;

ч'::^ Количество - а'спа р а гн н о во й: к и с л оты' в.; проб ах, 'вз я тыхудо'';'

скармливания}фумаровой кислоты составило 3,05;вл%;к про^; . ' тсииу, после включения,-в-;рацион 'фумаровой;кислоты .содep-, X ржание, ее у в ел и чн л ось - до .'4,19% ;; к п роте н ну: ~ Д а и и ые ;стат иД стически достоверны (р<0,05). "'^V^vv^'-^-'W Vy^v^Äy - Таким образом,1 результаты; опытов,.; проведенных in' vivo,- '-; ■ дают основание: утверждать,".что-в.'рубцовой - жидкогти^одним1 /, ■Гиз путей связывания аммиачногоiазота может явиться-.'восстя ;новите.1ьное аминнрование.фумар'овой- кислоты с рбразованйем Л-'.асиарагиновой аминокислоты:-'. 1: : • ' : .

5. Содержание азотистых фракций: в* рубцовой жидкости, -крови и моче при включении вУрацион фумаровой кислоты

' riC"•■ Содержание;общего ;азота рубцовой, жидкости, получен-"" , ной от животных, содержащихся^наI рационе.при скармливании фумаровой кислоты достоверно * увеличилось • {р<0,01; У р <0,05) по' сравнению с контрольными.пробами.. В,пробах до;у . кормления, концентрация общего {азота увеличилась на'10 мг;

* через Зч а с а. п ос л ек ор м лени я — на Л мг но сравнению с контролем.. . - Г ^у^уУ'уУ^Ууу^ у; у-;} Увел и ч е i J неко н цент ра ш i и - о бщег оазота ;Bi р у бцо в о й - ж й д ко -у сти при скармливании фумарово^ кислоть! мы объясняем тем;*

Учто фумаровая кислота,'попадая.в-' рубец, ■фиксирует, : аммиак,у -'с образованием ;асларагнновой аминокислоты; которая в'клю- : -. чается';в обмен с образованием;различных; азотистых^соеди- V \ "нений!: ; ,У :У-; / ■ -.-.^iW^-.-Г'-."s^

' Белковый'аз от Щзменяетсяподобно: общему,- При введений У' в рацион фумаровой кислоты;в;пробах.до;и после кормления• ' д увеличивается [белковыйу:синтезУ Концентрация аммиачного ; ¿азота, как ужеотмечалось, достове[Жоснижаласьп|Ш;скарм-Уливанни ;фумаровой^кйслоты,-' вследствие^,восстановительного-

аминировання фумаровой. кислоты. ' 'л :.-'У ''.;"' 'V?У'-[.у Ко11иентрация обп1его""азота:крови имеет.тендтенцию к.по- • в ы ш е и и юп р ндо б а в л е ни н; вкор м :жи вот н ыхф ума р о во й, к йс-v.

• лоты. Концентрация'белкового азота крови изменяется' подоб--!но общему, .11то'же'касастся небелкового'азЬта крови/ло нами;У

не обнаружено изменений.. 4 . ' ' • . :; . . 'У'УУ УУ у Согласно полученным нами данных,.Мочевина в,крови{прн

"включении в рацион:фумаровой кислоты несколько повышается г. (данные достоверны). .. . : '. . уУУ.^-:->УV"У Анализируя содержа[нне;азотнстых''фракций в крови мы об- ■ : наружйваем, -что'.-при.*'скармливании уживотнымК - фумаровой у '■;; кислоты ;неотмечается'достоверных^изменений;вих-концен-у трацни. :^ ---г V"чЧ:--'"/-Ц"-';"-''!"■ГУ:'---

v- v ■

Влияние фумаровой кислоты на содержание азотистых фракций в рубцовой жидкости крови и моче У ; , .

• Т а б л и и а 3 .

■ ■ . ' .1 ; 1 ' ; " -' Через 3 часа после кормления с 4 ' ' ' '

* ■- ; • - i V . '. '. . ; ; ' ' ' ". 1 опит ' . ' " . ; ' ' II. опыт " i ■ ' ' '.' 111 опыт

- ■ : , ■ Л*'1- 'S' контроль " ■ опит контроль;_ ',? • .' опит " . .контроль . - олыт! '!'■.

, Рубцовая жидкость .Лг iIPCJjj. ^ .

Общий азот.'. ;I64,2 ±l,20-i , Белковин азот ';' v.. .129,1- ±1,42 ;

• Небелковый азот V . . '35,1 ±0,73

Аммиачный азог ... * 5,81 ±0,11

Общий.азот . . . 2114,0 ±38,70 Белкооий азот , ,■. 2é01.5±20,31, v Небел ко в й А ->110,1 ±' 1,11

МочевштиЙ азот1 . , . ,10,03± 0,78

178.8 ±1,13 ■147,7-±1,50 32,10£1,12 3,75 ±0,10

249«)±26,20 2383,8±20,3G 113,1± 1,10 . 11,3± 0l84

96,1 ±2,10 01,1 ±1,12

35,0 ±0,83 8,91+0,28 ;

.115,7 ±1,73' '86,5 ±1,21 31,2 '±0,15 ; 4,13±0,83

Кровь .uiitCÇJbt.

288I,4±3l,42 2665,3±30,84 '■"■! 116,(±2,45 ' 22,0± ОД) :

; /

Общий азот , ,<'_. . 1 Gi;23±l,83 lu Мочевнпний азот. .: 30,91±0,80

: /-' Моча (г в сутки)

58,70^1,12 30,51±0,65

55,83±0,93 30,С ±0,41

2956,1 ±27,39 2816α20^0 109,9± 4,80 •23,1± О,СО"

52,55±0,8G. 40,3 ±0,71

' 158,1 ±1,36 123,0'±1,25' 36; 1 ±1,30 . 6,82 ±0,20,

J ,.'■ 31G4,8±6I,78 3086,8±2G,78 77,9± 3,23*. 21,2± 0,87 -

68,77±1,22 41,42±0,56

169,4 ±1,78 138,1 ±1Д5 " 31,3 ±1,52 . 4,ft(±0,22

3140;Э±59,72 307G,6±34,87, , 82,5± 1,17 ' 25,6±-1,13

С3,15±1,03 47,14±0,73г

'ЛЛспарапГновая nit слота очень подвижна в обмене веществ. ■ Она принимает участие в процессах переамннирования с образованием новых аминокислот и' кетокислот.; По-видимому, об-разоваиная:на -фумаровой; аспарагиновая;кислота-и другие ; аминокислоты не накапливаются в крови, а идут на биосинтез ■ тканевого' белка. Лспарагнновая кислота с;током' крови посту, пает в печень, где принимает участие в оринтиновом цикле.

. -Относительно концентрации общего азота в моче, наши дан-"/пыё показывают, что при добавлении в' корм животных фума-"ровой кислоты отмечается тенденция-к,снижению общего азота в суточной моче. " - - ;' ^ У/' " - .

' Концентрация мочевинного азота в моче резко увеличилась при скармливании фумаровой' кислоты.;Увеличение ".мочевнй-<■:. ного азота "в .моче мы объясняем следующим образом. -Фу: маровая кислота, поступающая с кормом,' идет на.синтез аспарагнновой кислоты из аммиака посредством реакции восстано-. ;вительного амцннровання. Образуемая из.фумаровой, аспара-гиповая кислота может частично идти на синтез белка| частично поступать вмесёс;кровью в печень, где она принимает участие в оринтиновом цикле. Так как синтез мочевины: в печени ■: осуществляется по современной теорий мочецинообразовання таким образом, что одна половина азота проходит через ста-■дию.аммиака, а другая — через стадию аспарагнновой кисло;; ты, отсюда естественно, что накопление.в организме животных аспарагнновой• кислоты может стимулировать биосинтез мочевины в печени. (Данные по содержанию азотистых ,фракций

рубцовой жидкости, крови и моче, полученные от, животных; -содержащихся на I рационе, представлены в.табл; 3). ; : ' ..

■ Анало'гичные данные но изменению.концентрации азотистых " фракций в рубцовой. жидкости, крови и моче- отмечены на II. •' и III рационах. •. ... • . . . . . ' ■.■;..''■'.

■Д. ■ -v.■ ' .Выводы * ■ .

' 1. Добавление а-кетоглутаровой кислоты к рубцовой жидкости в условиях in vitro, сопровождается достоверным сниже--/ нием концентрации аммиачного азота по' сравнению .с контро-: л ем .Уменьшение концентрации азота аммиака связано с тем, , что в рубцовой жидкости. под действием - фермента" глутамнн-де гидр о ген азы; соединенного с никотин амид ад ениндинуклеоти-" дом it никотинамидадениндинуклеотидфосфатом, находящегося * в Рубцовых микроорганизмах, происходит восстановительное аминнрованне а-кетоглутаровоЙ кислоты с образованием* глу-тампиовой аминокислоты. Включение аммиака в се-кстоглута-ровую кислоту, протекает интенсивнее, чем в- фумаровую. . ; 2. После 4-часового инкубирования рубцовой жидкости в : присутствии фумаровой . кислоты . наблюдается уменьшение ' концентрации аммиачного азота. Это объясняется тем. что под

■действней ферментаГаспартаз^

: н ого ам и н и р ов а н и й ф у м а р о во й к ис лот ыс: о б р азова н нем .а с ri а-Д; 'рагиновой-кислоты.'- . ;'.•• '^Ь^-'Л'^"';^'-'' I

3.~ Снижение концентрации аммиачного/азота, в' рубцовой жид кости при добавлении фумаровой кислоты зависит от исны-

- туемой дозы. Максимальное связывание ~азота_ аммйака^от-;' /мечено при добавлений дозы 0,8 мо ля н al 00-млр у бцо в о и

жидкости. . • /." ""." " 'л/л

- Данные опытов in vitro подтвердились вг опытах in vivo.'. 1 При включении'в рацион животных фумаровой кислоты 'ден- ;

ствительно происходило -уменьшение'концентрации аммначио- ' го азота - в рубцовой жидкости , вследствие синтеза ' аспараги- " /новой,кислоты;из-''аммнакай!-фумаровой. Следовательно; вое-::станов'«тельное^ аминирование - фумаровой- ^кислоты■. можег i явиться одним из путей связывания/аммиачного азота^ в рубце ' крупного.рогатого скота. „ : -/".у/;''"

'. 5.; При скармливании фумаровой Кислоты наблюдалось увеличение концентрации общего «'белкового а з ота" в i р у б цо в о й у ^"жидкости/за счёт образования лепарагиновон 'кислоты(и других азотистых соединений. > "."•'■■''■'

Д6; При включении ;в рацион животных фумаровой кислоты отмечалось'резкое повышение коншштрашш мочевинного азота Ч /в мо че, Мож ноп р ед по лагат ь ,/ч т оф у ма р о в а я кис л о та j вы з ы вас т. усиление биосинтеза мочевины в орннтнковом .цикле; вслед-/ " :ствне чего происходит-увеличение-доли мочевинного азота в: общем азоте мочи. • ' ' y'/'-'/^h'^-y -у/^ :';'у

Материалы .'диссертации опубликованывследующмхработах"'

~. 1. Влияние фумаровой кислоты на содержание аммиачного/Г -азота в рубцовой жидкости крупного рогатого скота. Известия/ tcxav.nb?; 1972к.'. •; /уч уу/у.

-;2.В л>Гя н и е.а-кет о гл у т ар о во к кислотьг'на содержание ам:,;'^ миачного .'" азота '. в ; рубцовой жидкости.*, . Доклады :ТСХЛ, У • вып.-.185,-1972 г.-Г' у Г- • • о /ГУ.^У^УУ;.-^''y.'y У'

■ "'Л';.:

\ \ •

-7188099 20/XI—72.г.'^У'-■' Объем l'n.-.i. . .Заказ 1054.". г—-Тираж. 150 7/

í """'}"'■ Типография 'Московской 'с.-х. акадешшИм: К.;А."-Тимирязева У ч; ■ У; ^ . . ... Москва 125008, Тимирязевская ул., 44. . •■ . '.' ■ .■■ .,/