Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ АКРИФЛАВИНА И КОФЕИНА НА ПРОЦЕССЫ ПОСТРАДИАЦИОННОЙ РЕПАРАЦИЙ В КЛЕТКАХ СИНЕ-ЗЕЛЕНОЙ ВОДОРОСЛИ. AHACYSTIS NIDULANS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ АКРИФЛАВИНА И КОФЕИНА НА ПРОЦЕССЫ ПОСТРАДИАЦИОННОЙ РЕПАРАЦИЙ В КЛЕТКАХ СИНЕ-ЗЕЛЕНОЙ ВОДОРОСЛИ. AHACYSTIS NIDULANS"



Биологический факультет

На правах рукописи

ВОРОНЦОВА ,- Галина Владимировна

ВЛИЯНИЕ АКРИФЛАВИНА И КОФЕИНА НА ПРОЦЕССЫ : ПОСТРАДИАЦИОННОЙ РЕПАРАЦИЙ В КЛЕТКАХ СИНЕ-ЗЕЛЕНОЙ ВОДОРОСЛИ АИАСУЗТ13 НХВиЬАНЗ

03.00.15 Генетика 03.00.07 Микробиология

„ - ' А в т о р е ф в р а ,т

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА* 1975

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Биологичес-. «ого факультета Московского государственного университета имени К,В.Ломоносова.. -

Научные руководители:

Академик Академии педагогических наук СССР, ■ ■ "

Профессор в.н.СТ0Л2Т0В

Кандидат биологических наук.старший научный

, сотрудник с.В.ШЕСТАКОВ ~ - V .".-Г ,

Официальные оппоненты:

"Доктор биологических каук»профессор Б.Н.КОНДРАТЬЕВА Кандидат биологических наук,В,Н,СОЙФЕР

На официальный отзыв диссертация направлена в Институт общей генетики АН СССР^ ,

Автореферат разослан "30" ' 1975 г. , ■

; Защита диссертации состоится 1975 г.

в "(Б"7 часов на заседании Секционного Ученого совета по ботаника фиэиолого-биохииичеокого отделения Биологического факультета Московского государственного университета по адресу: Москва,В-234, Дениские горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ^

Ученый секретарь

Л.Ф.НИКОЛАЕВА г

ВВЕДЕНИЕ

К актуальным вопросам генетики, молекулярной и радиационной биологии откосятся проблема пос традиационного вое становления клеток и реаарашга генетического материала, интенсивно разрабатываемые на гетеротрофных бактерия*, эукариотпеских микроорганизма* и соматических клетках млекопатавдаг.

Исследования механизмов генетической репарации имеют первостепенное значение для выяснения генетического контроля радиорезистентности и мутационной изменчивости организмов, принципов организации систем« поддерживающих стабильность наследственной информация,

О репарационных системах у фотосинтезируодих организмов известно очень мало. В этом отношении привлекательными объектами являются сине-зеленые водоросли, отличающиеся большой генетической стабильностью и высокой устойчивостью к радиации. Выделение радиочувствительных мутантов у ряда сине-зеленых водорослей позволило предположить! Singh, Шестаков и др., 1972; Aeato, 1972) Zherner, shestakov, 1972), что эти организмы обладают не только системой фотореактивации, но и другими Эффективными механизмами репарации радиационных повреждений ДНК. Однако природа этих репарационных систем остается недостаточно изученной.

Для выявления я расшифровки систем репарации у микроорганизмов используются разнообразные методы, среди которых немаловажную роль играют методы ингибнторного анализа, изучение эффектов реактивации вируса клеткой хозяина, процессов пострадиационной деградации ДНК. Применение кофеина, акрифлавина и других агентов, блокирущих процессы репфации ДНК^ дает возможность не только обнаружить репарационные механизмы различного типа, но и определить в отдельных случаях характер мутаций, изменяющих радиочувствительность клеток.

Основываясь аа экспериментальных подходах и методет генетика бактерий, мы предприняли попытку исследовать природу а особенности репарационных процессов у одноклеточной сине-зеленой водоросли Ajiacyatie niduiane. С этой цельв в настоящей работе изучалось модифицирующее действие ингибиторов репарационных процессов, кофеина и акри-fлавина на:

I. внушаемость клеток дикого типа и радиочувствительных мутантов водоросли, облученных УФ или рентгеновыми лучами;

1-10/7

__лсралыш i....<.....i Ь.^ли;

Ыоскоьек«; ..: :::а (Vibioj.

2. вииввемэсть УФ-обдученваго циавофага АМ-1 в клетках различая« птвшгсо водоросли;

3. уроаевь пострадиационной деградация ДНК, индуцированной в клетках дикого типа и радиочувствительных мутантов УФ или ионизирующей радиацией.

УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИИ

РЛ - рентгеновы© лучи;

УФ - ультрафиолетовые лучи;

КНФ . - кислотонераотвориная Франция;

ТХУ - трихлоруксусная кислота;

ОТЗ - мутеяти с повышенной чувствительность» к УФ-лучам;

хвз - мутант« о повышенной чувствительностью к рентгеновым Лучам»

ОЕЕЖта И МЕТОДЫ Ж СЛЕДОВАНИЯ

В работе но пользовала бактериально чистую культуру фотоавто-трофной сине-зеленой водоросли Ал, яЗДиЮнв штамп * €02 (из коллекции Ленинградского государственного университета), ОУЭ-мутанты водоросли, подученные на кафедре генетики и селекции Биологического Факультета МГУ (Шеетаков и др., 1972; Карбышева и др.,1974,табл.I), а также циаяо^аг АМ-1, выделенный в лаборатории вирусов водорослей Института вирусологии я микробиологии АН УССР {Горюшн,Чаплинская, 1ЭБ5).

Таблица I

Свойства отз - мутаэтов Ап. п1аи1апа.

Штамм Чувствительность к - Способность к

УФ-дучам Р1 митодаци-ну с фотореак-тившяи трансформации

3 я II 0 Л

Вг-13 3 «1 Й « л

Ап-2 3 3 .3 А й

Рг-13 ; . яз 33 3 м

7а-£5 ; 35 3 » 4

Примечание; з - повышенная чувствительность, к - повышенная устойчивость; - равная или пониженная способность по сравнению со штаммом дикого типа,

Водоросли выращивали m модифицированном среде С следующего состава 'в г/л): 0,25 MgS04, 0,165 цитрата На, 1,0 КЖ>3, 0,004 РвС13, 0,04 К2НР04, 0,024 СаС12'6Н20 и I ил раствора макроэлементов (Столетов и др., 1965). Конечный рй среды 7,3-7,6. Культивирование водорослей проводил фи 36°С в лшеномате, при освещенности 2500-300£)лк. Число газнеспособны! клеток в популяции (выживаемость) определяли по количеству колоний .образующихся на чашках с плотной средой (1,5$ агара J через S-I0 суток культивирования.

Для УФ-облучения использовали спаренные бактерицидные лампа БУФ Л 5 с наксимумои излучения при 254 нх и скоростью дозы 120 эрг/ ю^/сек. Облучение рентгеновыми лучавш проводили на установке PJM-II (мощность дозе 2 кр в щи.; при комнат но® температуре в атмэ сфере воздуха. В работе применяли следующие ингибитора: кофеин фирмы "CalMochem" (США), акрифлавин фирмы "British Drug House"(Англия) и тлорамфеаикол ^яриы «sigma" (США),

Титр цианофага определяли с помощью двуслойного метода. К 3,9 мл суспензии 5-суточноЙ культур* водорослей (6-8*10 клеток/мл) добавляли 0,1 мл очищенного феголиэага, смесь выдерживали I час на свету для адсорбции вируса, центрифугировали в стерильных условиях, ресуспендировали в 4 мл свечей среды, смешивали с 4 мл среды в теплом 1,2% агаре Дифио и разливали по четам Петри, Негативные колонии цийнофага подсчитывали через 6-8 дней культивирования в люмено-стате при 28-32°. Выживаемость облученного циакофага выражали в процентах от числа негативных колоний на газоне водоросли, инфицированной не обменным цианофагом.

Уровень пострадиационной деградации ДНК оценивали но величине остаточной радиоактивности в кис&отокерастворимой щелочестабильной фракции клеток, предварительно печеных % или 2 С-урацилом (Шеета-ков и др., 1972). Аналогичным способом по включение меченого урацв-ла измеряли синтез ДНК в облученных и необлученных клетках. Об уровне белкового синтеза судили из включению метет из 2-^С-лвйцйна ь КШ клеток.

Синтезы ДНК, белка, а также уровень пострадиационной деградации ДНК изучали в динамике развития культуры. Радиоактивность в проб« под толуольным сшштиллятором определяли на автоматическом счетчике Bucleal Chicago Mark-II.

2- ton з

РЕЗУЛЬТАТЫ Н ИХ ОБСЩВНИБ

I. Ьд^ит^машэтшее действие яоФеина ж «рдфлод» та вьадзаеуость облтченаах кдугож даяаооедя

С целью определеяия условий модя^яцжрупжго хейотвж ипбгго-ров процессов репарация не облучеавае клети вморосл«€ боло вссяе-доваяв влхявие различных концентраций акряфлавина и кофеина на внии-ваеиооть не облученных клеток дикого типа и шгг -иутаитов. По чувствительности к акрифлавину отз-мутаяти сушественио не отличаются от дикого типа. Близкая к су<3летальной оптимальная концентрация ак-рифлавнна для изучения иоадфицирувдэго действия составляет 0,5 шг/ыл среды. Клетка ли. п1аи1апв обладает сравнительно высокой устойчивость!) я кофеину, что согласуется с дявнкж, полученным в отношения нпчатиг ферм сине-зеленых водорослей (зг1тпв*ата, 1969; зхп^ь ег ,1972). Для последующи опытов была выбрана тонцентращвя кофеина I кг/мл, снижающая выживаемость кеоблученаых клеток дикого тяпа и большинства ОТЗ-мутантоэ яе более «ем на 20%, В случае цутавта Вг-18, отличавшегося повышенной резистентностью к кофейку, кспользовали ингибитор в неяеевой концентрации 2 иг/мл.

Кривяе выживаемости не обработанных акряфлавивон, УФ-облучетшх клеток различаются по кинетике, что свидетельствует о различной природе отз-муташй (ряс Д). Бели при небольших дозах облучения кривая инактивации клеток дикого тиса характеризуется наличием плеча (отражающего, со-вадаиому, функционирование репаратнвнщ систем),то на кривой выживаемости итз -цгтаятов и Вг-18 это плечо вираже-во слабее или отсутствует в случае штата ?а-25.

Наличие акрйфлавива в среде пострадиационной инвубации клеток приводит к усилению летального действия УФ-сэета аа клетки дикого типа, а также мутантов «-1 и Ра-25 (рис.1). В меньшей степени пострадиационная обработка акрифаавином влияет на У4>-чувствительность клеток мутантов 8 и Ап-2. Различая в степени медвфицирупцего эффекта акрифлавина на УФ-инактивацкв клеток дикого типа и итз-цутантов отчетливо видны при сопоставлении коэффициентов модификации, отражающих снижение выживаемости при определенных дозах УФ ■ли рентгеновского облучения (тебяЛ).

*

УФ-экспозиция, сек.

Рис.1. Влияете акрифлавина на выживаемость УФ-облученных клеток ДИКОГО типа И UVS-ЦутаНТОв An. Iildulana.

Облучение проводили в среде С; акрифлавда добавляли в суспензию сразу после облучения я инкубировали в люменостате под желтым фильтром в течение 6 часов. За 100% принята ваяяваемоеть клеток в необ луч вшой культуре. Обозначения: I - дикий тип, 2 - Вг-18, 3 - Mt-1,4 - Fa-25, 5 - An-г, ovo до- выживаемость облученных клеток без акряйлавина, •»»*♦-после обработки ингибитором.

Таблица 2

Модифицирующее влияние анрифлавина а кофеина на детальное действие УФ-света я рентгеновых лучей яа к легки дикого типа и UV5-мутантов An. nldulane.

Игами Ув-KMj-Q СО РЛЛМад (%)

ахрифлавия кофеин акрифлавин

Дикий 20 3,5 120

Mt-1 20 3,8 143

Рв-25 22 20

Аи-2 16 2,9 92

Ьг-16 1,8 1,5

Коэффициента модификации KK^q - при УФ-зкспозиции 10 сек t ~ ПРЯ Дозе рентгеновых лучей 20 яр - выражали отношением уровней выживаемости облученных клеток к выживаемости облученных клеток, обработанных ингибитором.

По сравнению с акрифла вином кофеин оказквает более слабое вяактквируювее действие на УФ-облучетше клетки водоросли, но и в втом случае величина иоди фициру пае го эффекта для культуры дикого типа и мутанта Mt-1 вше, чем для цттанта Вг-18. Следует отметить, что усиление летального действия ГФ-лучей кофеином н акрифлавином наблюдается только при постобработке ингибиторами облученных клеток. Инкубация клеток с ингибиторами до облучения с последувдим отмыванием клеточной суспензии не сенсибилизирует водоросли к УФ^зблучению, Как известно, кофеин, и акрлфлавин подавляет выщедлевне пирши-диновнх димеров из IHK УФ-обдучевдаг клеток (Setlow, Carrier, 1967; Slderopuoloe, Shankel, 1963j bunb et al., 1968) И блокируют систему эксотзионной репарации, что а приводит к усялевню УС-иыактв-вацдн организмов. WS -штаммы бактерий, дефектные со начальным втащи зкецизвонного механизма репарации.отличаются повыиенной устойчивостью к кофеину и пониженной чувствительностью к модифитшрушему д«*ствию акрифлавина и кофеина на ГФ-облучевнве клетки ( Harra, 1967; Gries, 1968). Таким образом, стимуляция инактивирупдего действия

_ е -

ЛВ-света ахряфлавином ели кофеином расскатрггя»тся в качеств» одного кэ доказательств ^ккцзоагровгзля репарационное, систеш веспяз*оиного тпца, а блокиров*яне юхжфетдрувдего э»£фекта в клетках некагорах Ц73 -мутантов указывает на нутационное нгрушен*в этоЯ систекя. ы

Исходя кз этих представлени!, данные о «зифацирупце* до!ст-вни кофеина и акрифлэвина на УФ-облученные ж-гетхл Ал. таатвля мохно рассматривать в пользу преддолохеяия о каличии у скзе-эедевой водоросли процессов эксциэионнов репарации ДЯК. В клетках мутанта Б1—18, по-видимому, блокировав один из очалькых, чувствительных х акрифлавгну и кофеину, этапов эксаязхоняого механизма, л это является причиной повышенной чувствительности данного штампа к УФ-лу-чаи. Отсутствие различий в шлиф: цярутщих аффект ас между атенаюм диаэго типа и иге -мутантами свидетельствует о том, что снижение УО-ревястеятностя путая тоз не связано с дефектами в системе вылеплен ея цкрямидиновых дилеров к определяется нарушениями в других мг-ханиэмаг, контролирующих радгочувствитеяьлость клеток. Действительно, было показано, что у мутанта («-1 блокирован процесо эязивати-ческой фотореактивамии димеров, а мутант Ра-25 характеризуется пониженной способности) к генетической рекомбинации при трансформации {Карбышева и др., 1974).

Помимо кеханиэка оксцвзиокпоЗ репарации, клетки дп. шаи1апа очевидно, обладают и-другими чувствительными к акрифлавину и кофеину системами, принимающими участие в реперации радиационных оэвреладе-ыия в ДНК. Об этой свидетельствуют результаты опытов по изучению влияния ингибиторов на выживаемость клеток дикого типа и шгз -ь^утактов водоросли, облученных рентгеновыми лучами. Пострадиагаонн ая инкубация клеток в присутствии акргфлавина увеличивает инактипирущее действие ионизирующей радиации (рис.2). Обработка ингибторами уравнивает выживаемость РЛ-облученных клеток шгз -мутантов, различавдих-ся по исходным уровням чувствительности к рештеновь'м лучам. Как видно из рисунка 2 и таблицы 2, наибольшее иодифидирущее действие акрифлавина наблюдается в культуре мутанта , облацаэдего повышенной устойчивостью к рентгеновым лучам; наименьший эффект отмечается у мутанта Ра-25 о плейотродной чувствительностью к УФ, РЛ и алкюгируюдим агентам. Эти данные позволяет предяоложхгь, что в клетках ли. имеется чувствительная к акрнфдавиву репарационная

100

10

ОД

0,01

,5 \ '2. Тк

■ С —

РЛГ-доэа, .

Рис.2. Влияние акрифлавива на вааиваемооть клеток дикого типа и -иутантов ав. планам, облученных рентгеновыми лучами•

Обозначения, как ш рис.1.

- а -

система, ликвидирующая повреждения, индуцируете рентгеновыми лучами.' Эта система отличается от механизма эксшгэионной репарации УФ-поврежденкй, поскольку выявляется по модифицирующему действии акри-^лавика и в клетках мутанта Вг-18 с пр едполагаемым де^-тч в зксцизиовной системе.

По данным рзда авторов, акри?«лявип и кофеин ингибируюг не только вкщепление димеров, по и процессы восстановления однонитеоих разрывов в Д!К, индупировашгах ионизирующей радиацией в клетках различав* организмов (А1Рег, 1963; Саиегмег, 1964г УатаплПо, Н1когчк±, 1969; Айказяп и др., 1973; Еестянжов, Семенова, 1973). Известно такт.е, что кэ^езя и акркфдавип могут подавлять у бактерий процесс рекомбинации, в ходе которого происходит образование однонитевых разрывов И бреаей' в ДНК (Ьк1п, РагчгЛагооп, 19б9( ЗеЪ1а* et п1.,

Учитывая эти данные, можно предположить, что в клетках л». п1-й«1опа функционирует система восстановления разрыв®, индуояруе-шлс в ДНК рентгенов яки дучага. Процесс репарации осуществляется с высокой эгТ^кт явностью в клетках РЛ-резистентного мутанта и протекает значительно слабее в клетках РЛ-чувствительного мутанта Ра-25. Снижение способности клеток мутанта к пострадиацион-

ной репарации РЛ-ишсуцированных разрывов в ДИК было доказано также с помощью биохимических методов (Глазер и др., 1973; Шестакш,1974). Налечяе корреляции метау чувствительностью клеток мутанта Ра-25к рентгеновым лучам и пониженной способностью к рекомЭинациа указывает на возможное участие гес-за виси мой системы репарации (рекоибтшци-онного типа) в устранении разрывов, вызываемых ионизирующей радиацией. ЭтапыР шггибируемые акрафлавином вгео -системе и а механизме эксцизкокной репарации, по-вадимоку, различны. Не исключено, что остаточное мсдифицирушее действие аярифлавина на выживаемость РЛ-облучекпих клеток гес~-мутанта Ра-25 связано именно с подавлением процесса внгданления продуктов фотолиза, образующихся в ДНК под действием ионизирующей радиации { НаПЬагаа, СегиЬ-Ы, 1973 ).

Про веде няне исследования показали, что в клетках виие-зеле«^х водорослей имеется несколько чувствительных к ингибиторам репарации систен (или этапов одной сложной систем), ответственных эа пострадиационное восстановление клеток, облученных УФ- или рентгеновыми

9

> л

Лучами. Рввуяътати иэяифпгцируюгцего действия алрпфлавива и

«офежиа на У®- или РЛЕ-облучеяные клетки различных итэ -вдтантов Ля. в1с1и1апа свидетельств у юг о возможности существования у этой водоросли иегжнкзиов эксажэиогаюй и рекомбинацаонной реварации ДНК.

П. ДеДствге кофеигяа я акргсфлавича на выживаемость УФ-облученного пгап^ага АМ-1 в клетках Ап, с1аи1аав.

Изучение процессов реактивации вирусов в клетках микроорганиз-ыа-хозявна является эффективным тестой на выявление репаративных систем. В связл с этим мы совместно о Е.А.Карбыпевой и В.А.Горвдааым исследовали влияние ингибиторов репарации на выживаемость УФ-облу-чешгого циаио^га АМ-1 а клетках различных штатов Аю. Контрольное ояыгы с использованием яеоОлученного фаголазата не выявили существенных различий в выякваеиэсти фага'в клетках дикого типа к КУЗ-цутантов. Таким образом, ШГ2 -мутациа не влияют ва вза-ишотнотеит необлученного цганофага и клеток водоросли. Кная кар-гдаа наблюдается пря инфицировании клеток водорослей УФ-об лученный фагом.

УФ-доза, эрг/ии2

Рис.3, Вшиваеюсть УФ^з <5 лученного шшнофага АМ-1 в клетках

дгкого тяпа а 1775 -нутангоа ал. а±Ли1впв. За 100%. принимала выживаемость не облученного цианофага. Обо» вначеыия: I - дикий тип; 2 - Бг~13, 3 - , 4 - Уг-13.

Как видно is рисунка 3, при недолызях дозах УФ-лучей на кривых выживаемости цванофага в клетках дикого типа, а такт штаммов рг-1;з я i;t-1 (но не Вг-19 ) ншеетея плечо, которое может быть связано с функционирование и репаративных систем. Различия в характере кривых выживаемости цианофага в клетках дикого типа и uvs -цутантов свидетельствует о том, что клетки штампов Ht-1 и Вг-18 отличается пониженной способностью к восстановлению УФ-повретаений в геноме пиано-фага. Зависимость выживаемости облученного циаяофага от генотипа клетки-хозяина указывает на участие репаративник систем водоросли в исправлении радиационных повреждений в фаговой ДШС,

Какие механизма могут участвовать в репарации ДНК цианофага? Из результатов, представлении* на риоунке 3, следует, что одним из таких механизмов в клетке водоросли является система фотореактивации: нарушение процесса фотореактивации у мутанта ut-i проявляется в снижения репарируипей активности и в отношении УФ-облученного циа-нофага. &гот вывод согласуется с данными, полученными при изучении реактивации клеткамя сине-зеленой водоросли Plectoaema toriimuni ДНК цжшофага iPP-1, облученного УФ-светом (*ц et ai,, 1967), Выживаемость цианофага AM-I, облученного высокими лозами ГФ-света, заметно снижается в клетках мутанта Вг-iS с npesnoxtraeionr нарушением в эксцизжонком механизме репэдации. Как яэвестко, муташш, блокяру таие первые этапы процессе экецкэионной репарации у бактерий, подавляет и способность клетки-хозяина репервровагь радиационные повреждения в ДНК некоторых бактериофагов ( Rupert, Наш, i э£6 ¡Захаров, Кря-вяский, 1972). Поэтому можно предположить, что влияние uvs -цггадии в ягтадае Вг-13 на выживаемость УФ-облученного «анофига АИ-1 обусловлено нарушением в системе ней -тжд», реяаржруадей длмерн де только в геноме водоросли, во и в ДНК цванофага.

Итгвд не отличается от дикого тюа оо способности к реактивации облученного цваяофага. Учитывая, что у мутанта Рг-13 снижена способность к генетической рекомбинации ■ реаарацик РЛ-по-вреждениЯ, можно предположить, что rec-зависимая система репарации не участвует э и справлен жх повреждений, ивдущрованных в генома цианофага УФ-лучаш. Это совпадает о данными, полученными в аналогичных опытах на клетках E.coli о УФ-облученным бактериофагом TI < K<n»ard-Flandere, Bo^e«, 19&6).

В пользу участия эксцизконкой репаротпвной системы водоросли в исправлении УФ-етовре:вдеяиЯ в Д11К цианозе га свидетельствуют результата опытов с применением ингибиторов процессов репарации - кофеина к акряфлавина. Использованные концентрации кофеина (I иг/шг) и акри-флавина (0,5 ккг/ил) не подавляют размножение нео б дучентго дианофа-га в клетках исследованных пггаммэв. Вместе с тем из приведении на рисунке 4 данных видно, что выживаемость УФ-о б лученного цаанофага модифицируется при обработке инфицированных клеток водоросли ■ сублетальными дозаж этик агентов. Выживаемость облученного циапофага снижается под действием icof екна и акри1 лавина одинаково в клетках дикого типа и UVS -мутантов Ht-i и Рг-13. Следовательно,ингиби-рушее действие кофе сна и акр.тфлавкпа^УФ-облучении;! цяанофат не обусловлено подавлением процессов фото реактивации или rec-эавиелкой репарация. С другой стороны, этот факт является дополнительным лод-тве раде наем того, что мутант Fr-о аналогичен гес~-!^утантш бактерий с нарушенной системой рекомбинацийиной репарации, которая не чувствительна к кофеину и акри^лаз^ну в случае яосстановления У4-Облученных КЛСТОК ( Ileun et al., 1970; Cries, 1970, Witte, Bohne, 1972). Акрифлавкп и кофеил блокируют в клетках мутанта Рг-13 Другую реваративяую стстег/у. поврежденпуп у штамма Вг-iG мутацией, сходной по своему проявлении с НСи-мутацияит у бактерий С Rupert, Harra, I9G6; Хестянгков, I ЭТО). Отсутствие мэдифкцирувдего действия ингибиторов на выживаемость УФ-о б лученного цнанофага в клетках мутанта Вг-1ь хорошо согласуется с предложением о нарушении у этого мутанта чувствительного к акряфлазину и кофеину этапа эксцизнойного процесса репарации.

Таким образом, данные, полученные в этом разделе диссертации, 'являются егце одним доказательством в пользу существования в клетках An.aidulans эксциэаоапой системы ршорадгз JS2K.

Ш. пострядтапсонной дегро^ягсги в клетках

ДИКОГО ТКПа И UVS -МУТаНТОВ Ад. nldwlans.

В третьей главе настоящей работы представлены данные изучения особенности репаративнкс систем сине-зеленых водорослей с яоиодьи ингибиторного анализа процессов пострадиационной деградации ДНК в клетках различных мутантов An. nidulana,Йядуцкрованнал радиацией

100

2

а =?

ю

0 ё

¥

1

о

1000 3000 5000 1000 УФ-доза, эрг/ыи2

3000

5000

Рис.4. Влияние кофеина и акрмфлавина на выживаемость УФ-облу-чаиного циавофага АЫ-1 в клетках дикого типа и иуз-патентов Ап. и1<3ц1аив.

Обозначения: I - контроль, 2 - обработано кофеинок» 3 - обработано акрифлавиноы. -.13 -

деградация ДНК может служить причиной лучевой гибели микроорганизмов и является одпим из показателей при оцепке природы и эффективности репарационных процессов(Follard, 1968).

Исследования, вроведешше наш совместно с К .И Дукасом, показали, что э пострадиационный период в УФ- или РЛ-облученных клетках дикого типа An, nidu lana происходит деградация illffi до кислотораст-воримвх продуктов. Интенсивность деградации возрастает с увеличением дозы облучения. Как видно из рисунков 5 и б, кинетика процессов УФ- и РЛ-кндусяро паяной деградации ДНК различна. В УФ-облучен-янх клетках деградация ДНК начинается через 2-3 часа после облучения и прогрессивно развивается в ходе после душей инкубации. РЯ-об л учение индуцирует деградацию ДНК уже в первые часы пострадиационное инкубации. Деградация ДНК, индуцированная низки»« дозам« радиация, имеет ферментативную природу к связана с йушспионированием репарационных механизмов (Кукас, 1974). Индуцированная высокими дозами радиации и усиливающаяся в ходе пострадиационной инкубации в клетках рвда uvs -цутантов неспециЗическая деградация ДНК, по-ввдй-иому, обеспечивается другим набором яуклеаэ й обусловлена нарушениями в процессах реларагаги.

Мутанты Mt-i и вг-18 ре отличаются по уровню УФ-индуцярован-кой деградации ДНК от дикого тиса, а у ^анта Ра-25 те же дозы УФ-лучей вызывает иптсиеишое разрушение ДИК (рио.7), В РЛ-облученных клеткат xrs-мутантов Fn-25 и гг-тз ДЕК деградирует такие значительно сильнее, чем в клетках дикого тияг (рио.З). Задето с тем, у вы-сокоустойчавого к рентгеновым лучам мутанта Kt-1 РЛ-облучение не вызывает заметкой деградации ДНК до кислоторастнорккых продуктов. Результаты изучения кинетики и уровней деградации дш позволяют заключить, кто: I) уровень РЛ-ипдуцированной деградации ДНК коррелирует с РЛ-чувствительностью клеток; 2) усиленная УФ- и РЛ-иедупи-рованная деградация ДНК в клетках некоторых tfvs -мутантов может быть связана с нарушениями процессов репарации ДНК.контролирувдих радиочувствительность водоросли; 3) процессы УФ- и РЛ-индуиированзой деградации ДНК осуществляются различными механизмам:. Последний вывод не противоречит высказанному в предыдущих разделах предположешго о величии в клетках ля: niduians различных систем репарации в ¿ЛК УФ- и РЛ-и вдугтированйых повреждений и подтверждается даннмда о

- И -

100

90

80

■А

Н и 70

о

» во

н

а) о 50

а

а 1 40

л « А 30

э-

н <и 20

я

и о 10

Рис,7.

УФ-индуцированная деградация ДНК в клетках дикого типа > иТЗ-ЦугаВТОВ А>1. п1Эи1Ш1а.

Обозначения: I - дикий тип,2 г Вт-18,3 - (Н-1,4 - Г8-25

3

100

90

80

*

н о 70-

о я

& во

в*

к »

1 *

&м 40

« § 30

в _ р *

г 20-

ч

и о 10

1 2 3 4 5

Оэвтриваоионвая инкубации

Ржо.8. р1-вэдуцжров«гаая дегр&пщи ДНК в клетках лююго пи» I (ЛГЗ-нутшто» ш. п1йи1апв.

Обозначай*. как на рно.7, * - Ап-2..

1 2 3 4 5 Поатреддацтонная инкубация, чае

Рис. 5. Влияние кофеина на УФ (^о РЛ а-*)-инду-

цирован ау® деградацию ДНК в клетках дикого типа а». п13.и1апв.

Обозначения: 1,3 - контроль, 2,4 - после обработки кофеином.

100

I 2 34 5 6 7 Т

Пострадиационная инкубация, час

Рио.6. Влияние акрифжвява на УФ (о-о а^О-и РЛ (•-•

индупированну» деградации ДНК а клетках дикого тана Ад. и1в«1апв.

Обозначения: 1,3 - контроль, акрифлавином.

16

2,4 - после обработки

различном влияв** ингибиторов репарации ш пострадиационную деградацию ДНК в УС- 1 РЛ-облученных клетках водоросли.

Кэ рисунка 5 я 6 видно, что обработка кофеином или акрифлави-ном РЛ-обдученных клеток дикого типа стимулирует пострадиационную деградацию ДНК, тогда как в УФ-об лученных клетках уровень деградации ДНК не изменяется (в пробах с кофеином) или даже уменьшается в присутствии акрифлавина. В этом отношении ские-зеленые водоросли несколько отличаются от бактерий, в клетках которых кофеш существенно подавляет УФ-индуцированнув деградапию ДНК <ЗЬ±та<За, Takagl, 19.68'; Уопе1, ноги, 1972), но не влияет яа деградацию, вызванную РЛ-облучением ( КПее, 1970). По-видимому, акрифлавин, с одной стороны, блокирует вышепление димеров и тем самим сникает уровень УФ-ивдуцироваяной деградации, а с другой стороны, ингибирует процесс репарации разрывов в ДНК водоросли и поэтому способствует РЛ-ипду~ цированной деградации. Следует отметить, что а использованных концентрациях кофеин и акрифггавин не яодавлзют процессы синтеза ДНК, РНК и белка, определяемые по включению меченого урацпла или лейци-ва, и поэтому их влияние па пострадиационную деградацию ДНК можно объяснить взаимодействием ингибиторов с ДНК и нерушением работы ферментов реп арат явных систем.

Хлорамфеяияол, ингибирующий в клетках лп. пШиХаив синтезы белка и ДНК, также оказывает различное влияние на пострадиационные процессы - усиливает РЛ-индуцированцу ю и снижает УФ-индуцированную деградацию ДНК (табл.3). Эти данные свидетельствует о важной роли синтеза белка или ДНК в репарации повреждений, возникающих в ДНК под действием ионизирующей радиации. Не исключено, что для завершения РЛ-индуцарованноЙ деградации (в отличие от УФ-индуцированной) необходим синтез белков-терминаторов, как это предполагается в отношении пострадиационной деградации ДНК у М.гвйюлигаюв (Оегш ег а1. 1970).

Отсутствие стимулирующего эффекта хлорамфеникола на уровень РЛ-ицдуцированноЙ деградации ДНК в клетках хкз -»цутантов Рз-25 и

3 может означать, что у этих кутантов нарушены процессы терма-нации деградации ДНК, связанной с функционированием гее -зависимой системы репарации. Система, контролирующая РЛ-индуцированную деградацию, чувствительна:и к акрифлавкну, поскольку обработка клеток

этим агентом сенсибилизирует к рентгеновым лучам культуры мутантов М1г-1 и вг-18, но не влияет на хдз-мутантов ув-25, Рг-13 и дц-г (табл.3). Подавление же акр ифлав ином деградации ДНК в УФ-облученных клетка? мутантов ра-25 и Рг-1э сввдетельствует о том, что чувствительные к акрифлавину этапы эксдизионного процесса реоерадии УФ-повреадений у этих мутантов не нарушена.

Таблица 3

Влияние различных ингибиторов на пострадиационную деградацию ДНК в клетках дикого типа и отэ -п^утантов Ап. п1йи1аяз.

Остаточная радиоактивность в ДЮС •^аи» ' _7&&йДИЁНДе__РЛ-облучение

Контр, КФ АФ ХФ Контр, КФ АФ

ДикиЗ 55 56 86 78 78 эе 26 36

Ал-2 53 56 81 57 54 - 54 -

«№-1 63 72 - 63 130 30 38 64

Вг-Тв 41 59 64 - 65 40 33 -

Ра-2 5 24 30 50 27 30 27 36 26

Рг-13 27 - 78 - 40 - 32 38

Концентрация кофеина - I мг/мл, акрифлавина - 0,5 шг/ш, хдорамфе-никола - 0,25 мкг/мл; пострадиационная инкубация - 5 часов, КФ - кофеин, АФ - акрифлавин, ХФ - хлорамфеникол.

Таким образом, результата изучения особенностей пострадиационной деградации ДНК и влияния на этот процесс ингибиторов репарации подтвердили высказанные ©.предыдущих разделах диссертации предположения о множественности и неоднозначности репаретявных систем, исправляющих в ДНК клеток Аи> пДаи1апа пов ре вденет, индуцированные ио низ иру шей радиацией и УФ-светоы, ь

На основании изучения модифицирующего действия кофеина.акрвфла-вина и хлораифеникола ва пострадиационные процессы в клетках раздач- . нет штаммов Ал- п1<1и1а1ш можно сделать вывел о том, что у мутанта > вг-ч блокирован один из начальных этапов механизма нсп-эксцизионной репарации УФчговреждениЙ, а у мутантов Ра-25 и рг-13, по-ввдиюму, нарушена гес-зависимая репаративная система, ликвидирующая разрывы в ДВЕ, индуцированные различными инактквирущими факторами,

выводы

I. Пострадиационная инкубация клеток дикого типа сняе-зелеаэй водоросли An* nldul&na с кофейной или акрифлавяном усаливает инак-тявирупцее действие УФ и рентгеновых лучей, Модифицирующее действие ингибиторов ваблвдает ся в облученных клетках мутанта Mt-t дефектного по фотореактивацшг, ш проявжется в УФ-облученных клетках ЭТЭ-муханта Ва>-78 и снижается в РЛ-облученных клетках XKS-мутанта ?®-25.Это позволяет предположить наличие у An. nldulane репарационных систем, отличающихся от фотореактивации.

„ 2. Обнаруюнв 473 -мутации в оноросли, снахагщяе выгававмость УФ-облучеяного цвазофага ЛМ-I в клетках хозяина. Обработка водорослей сублетальными дозами кофеине и акрифлввина увеличивает УФ-ннак-тиьацих» тайно фага в клетках дикого типа к UVS-мутанта Fa-25, но не влияет на его выживаемость в клетках мутанта В г-та. Эти данные свидетельствуют об участии репаративкнх систем водоросли в исправления радиационных повреждений в геноме циадафага.

3. Облучение An. nlduiane УФ или рентгеновыми лучами индуцирует деградацию 1Ш, уровень которой зависит от дозы облучения, продолжительности тострадиа одонной инкубация и генотипа клеток. Высокая радиочувствительность некоторых UVS-мутантов коррелирует с повышенным-уровнем пострадиационной деграцашд в их клетках.

4. Акрифлавнн стимулирует РЛ-индуцированную деградацию ДНК, во подавляет деградацию ДНК в ГФ-об лученных клетках, что указывает на различия в механизмах деградации ДНК индуцируемой УФ- и рентгеновыми лучами. Хлорамфешкол блокирует синтез ДНК, белка я усиливает РЯ-индуцированную деградацию ДНК в клетках дикого типа, ж> не у xrs -мутанта Fa-2S.

5. Результаты изучения модифицирующего действия ингибиторов репарационных процессов на. внжяваеюсть УФ- и РЛ-облученных водорослей, на выживаемость УФ-облуче иного цианофага AM-I в клетках радиочувствительных цутантов, а такте на процессы пострадиационной деградации ДНК свидетельствует о функционировании у An, aldulaa« репарационных механизмов, сходных с системами вксцкзиояной а рекой-/ дотационной реперацна у бактерий.

Материалы диссертации отражены в следумнх публикациях:

1. %кас К.И., Воронцова Г .В., Грэшев 83. 1973. Изучение пострадиационной деградации ДНК в клетках сине-зеленых водорослей. В сб. " Ультрафиолет о вое излучение и его применение в биологии". Пукино на Оке, 40.

2. Воронцова Г .В., ЕСарбыпева ЕЛ., Горшин BJU, Шестаяов C.B.

1974. Влияние яо$еяна и акрифлавипа на выживаедасть облученного ультрафиолетом цганофага AM-I в клетках радиочувствительных мутантов Anaeyetla aidulsae. Биолог.науки, S II, 107.

3. Жукас К.И., Воронцова Г.В., Гро-лев З.В., Шестаксо C.B.

1975. Индуцированная рентгеновым! лучами деградация ДНК у радиочувствительных мутантов Anacystis nldulans. Биолог .наук а, .""

Материалы диссертации доложены на Конференции молодых ученых Биологического ф-та ИТ, 197^.

Полп, к печати 7/I-?£f, Ф. 60x90/,î Фнз, П. л. Уч.-Hîi, л. 1,0 Зака! fG<?

Тираж ¿ОС?'*.-

Изд-во Московского университета, Москва, К-9. ул. Гериена, ЬП. Типшрафия Ил-fia МГУ. Москва, Лемгоры