Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Вирусные болезни промышленных цветочных культур и биотехнологические приемы их оздоровления

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Вирусные болезни промышленных цветочных культур и биотехнологические приемы их оздоровления"

6} п г ' ' / ;

российская акадещн сельскохозяйстбешш наук

всероссийский на1шю-иссадомтельский инститп' защиты растешь!

На правая рукописи

митрофанова ольга кщщшроша

\

\

вирусные болезни промышленных цветочных культур и биотехкологические привш их оздоровление

06.01.11 - защита растений от вредителей и болезней

Диссертация на соискание ученом степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Санкт-Петербург - 1992

Работа выполнена в Государственном Никитской ботанической саду /Республика Крым, г. Ялта/.

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, академик РАСХН Р.Г.Бутенко;

доктор биологических наук, профессор Ю,И.Власов;

доктор биологических наук, профессор А.В.Конарев

Ботанический институт им. В.Л.Комарова РАК

Защита состоится "Л6 " 1992 года в {иС часов на

заседании Специализированного совета Д 020.01.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений по адресу 189620, г.Санкт-Петербург-Пушкин, шоссе Подбельского, док о, ЙЕР.

С диссертацией в форг.:е научного доклада мохко ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений /ЗИЗР/.

Диссертация в форме научного доклада разослана "/О" ЩпТ^Сс}. 1992 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Г.А.Наседкина

библий''(й.'сйощая. ш

РАБОТЫ

Актуальность теш. Уровень производства в иромлое-кном цветоводстве является отражением культурных и эстетических потребностей общества, слепыш его индустриального развития. Сирое на живие гшетк в настоящее врслся значительно оаеретлот лредлсжеьхд производства, л удовлетворить его было бы воэкожно на имеющихся площадях, без сокращений! их под сельскохоэ.шственшш угодили, на основе более интенсивного ведения отрасли. Однако сдерживающим фактором в развитии промышленного цветоводства являются инфекционные болезни, среди которых вирусные зэнжают наибольший удельный вес. Они вызывают потерю декоративных качеств, ухудшение физиологического состоя1шя растений и, з конечное итеге, причиняют значитель-чый экономический ущерб, особенно выращиванию вегетативно размножаемых цветочных культур, у которых постоянным источшком инфекции является зараженный посадочный матзрцел /луковицы, клубпелу-ковицы, корневища, черепки/. Отрицательное влияние вирусов на репродуктивную способность растений приводит к фенстклическом.у изменению признаков сорта, сиоосенаэ урожая на 40-702 и вырожденно восприимчивых к вирусам сортов. Имеется достаточно много примеров вырождения от вирусной кнфекши культурных сортов тюльпанов, лилии, нарциссов, гладиолусов, фреезии, хризантемы, георгины.

Широкое распространение и усиление'зредсноечостк вирусов на цветочных культурах, отсутствие радикальных мер борьбы с вирусными болезнями способствовало объединению усилий фитовирусологов , биотехнологов и цветоводов многих стран для решения проблемы перевода отрасли цветоводства на безьируснув основу. Наш эта проблема решалась з содружестве со специалистами стран-членов бывшего СЭВ: Чехословакией, Венгрией, Болгарией к ГДР,.

Отечественный и зарубежный опыт с большей убедительностью показывает актуальность решения проблемы ббявирусного цветоводства. Однако существующий и шярокс примзняемый метод культуры Епикаль •• ных меристем, в качестве основного метода огдорозлежя иеэточшх растений, <..граш™шваот возможность получения высокого выхода без--вирусных мериклонов.

Изучение важнейших физико-химических сзойств вирусов, етиоло-гии вызываемых ими болезней, совершенствование существующих и раз-

работка ноыйс ¡фнекоа оздоровления, с интеграцией их е еданый duo-теянслогическкй процесс, представляет теоретический шперес, так как &ти 5:сследования являются научным обоснованием модели системы освобоадангя цзеточнкх растений от вирусов.

Цель у задачи исследований. Цель исследований изучение еи-руснхх полезней вгянейшж промышленных цветочных культур ы разработка быотехнологнчвских приемов гас оздоровления. Для достижения поставленной цели потребовалось решить рлд задач:

1. Проанализировать состояние изученности зируоэз щеточных культур к причин низкой «рфехтивности применяемых методов оздоровления .

2о Исследовать видовой состав, вредоносность м распространенность возбудителей вирусных болезней цветочных культур, имовдих наибольшее экономическое зьачение для цветоводства Крыма и Украяны

3. Выявить возбудителей вирусных болезней, лимитирующих шра-даванке изеточшх растений и причиняющих ущерб цветоводству.

4. Кзучсть сравнительную эффективность методов терапии /тар-»отерадии, культуры меристсмн, гемотерапии/ и дать научюо обоскс-шнже щшьцияем их применения»

5. Создать научно обоснованную модель система освобождения К&зточшх растений от вирусов на база интеграции методов.

6. Разработать принципиально новые„ экологически чистне гех-нологин получения и глобального микроразмнокаьиа бозвкруспого посадочного материала, применительно к конкретной культуре.

7. Защита безвирусннх растений от повторного зарааения.

Научная новизна. Идентифицированы 33 ранее неизвестных к малоизвестных на Украине, в том числе и в Крыму, возбудителя вирус-выя болезней 12 важнейших промышленных цветочны культур /гвоздика,, хризантемы, цямбидиума, антуриума Акдрэ, розы, тюльпана, лилии. гиппеаструма, нарцисса, гиацинта, гладиолуса, фрэезии/ с непользованием высокочувствительных методоз диагностики.

Определены вирусы, причиняющие значительный экономический ущерб цветочным культурам: Chrysanthemum virus В . Chr„ аврвпву virus, Carnation.nottie virus , Сг-г. vein mottle virus , Cars necrotic. ileoJciYirua , ire.bis .ncaaie virus /впервые обнаружен нами как.латегон, вызывающий элифчтотпи появления "ведьмишге мзтл" таоадамг.э Крыму/, AntUurium mosaic virus , Cynbidium mosaic vi-ms,,,üdccitoglausum ringspot virus , Rose mouaic virus , Нова yel-

low ¡aosaie virus , Trianus neerotia rlagsoot vims , i4ilip bssnX" ins virus , Lily riacspot virus . illy symptomless via-ua , Bssar. у allot? mosaic Tirus , Hlppeaetrvsa rtoeolc virue , iJaroisivtaa soEisio /Iran t Ncxoiscus yellow strips virus , Tobaeso rattl® elvus 0 Hyacinttaaa eoeaie virus , Tobacco nacrosia "rims«»

Установлены ранее не изгестнне на Украине растенаь-хозяваа широко распространенных неспепыфцчеоких возбудителей вирусных болезней: AMV — хризантема, гвоздика, posa, тюльлен; 4W - тюльпан, хризантема; try - гиапинт, тюльпан; CMV - антуриум Андр&0 хризаа-теча, гиппеаструтл: ЗУЫУ - фреезия» .Проведено сравнительное изучение вредоносности и особенностей распространения к локаливандгн вирусов в растении-хозяине.

Впервые дане теоретическое обоснование разрабогкк и практя~ ческого использование биотехнологичеоких приемов получеы!я безна-русьых клонов вегетативно размножает* цзл'оч;цгх культур.

Уточнены pezuvji гсрмичсского воздействии? на сюшениз репродуктивной способности вирусов в растопила изучаеглых культур в условиях in Yitro и in sivo ; установлены ептгшкше ксыхеатрацаи эи-роаида - виразола для ипактизааш латегона в условиях in °

Создана научно о^осков:шн*я модель сястел.н оозобозденяя цветочных растений о? вирусов, состоящая из Ллоков-кэтодовг тестирования pacierci-l на вирусы, "ермо- или хемстералил в условиях ±и vitro или in rrivo , культуры ткаы: и регенератам растений in vit-rc. адаптации растокий-реге.чераьтоз in vivo , ретестироьшшя адат-ткровэ^ннх растеннй-регенсфантов ьа вирусы, сертификации беэвирус-кых растений, защиты г/.аточього и посадочного г»:атерлала от вторяч-.-:ого заражения. Разработанная концептуальная модель позволила создать новые /для гвоздики, хризантем, розы, ци».бидирг;1/ и усовершенствовать известные /для ¿ктурлума Андрэ, лилил, гкаданта м гал:-пелструма/ технолог;;;: получения и и зонального адпероразулгояонаь бозвкрусного посадочного катгриола экономически вакшх цветочных культур.

Разработают оригинальные шм технологические приемы уекерзкко-го кпкрораз.мнежени^ бэзвпруешх растешь5! розы, хризантему, димби-диу/.а и гилпеаструка.

На защиту выносятся основные л э л о о к а я ново!! концепции освобождения вегетативно разкяожао^кх ЦЕеточлгых растений от вирусов, включений;

- уточненные данные о вадовом составе вирусов основных промышленных цветочных культур, насчитывающих 33 возбудителя вирусных болезней. Ксвые данные о их свойствах, распространении и растениях-хозяевах,

- разработанные -специальные технологии получения безвирусного посадочного материала применительно к конкретным культурам, основанные на концептуальной модели оздоровления цветочных растении от вирусных инфекции;

- блотехнологические приемы повышения рентабельности процесса кло-нальпого шкроразмноженлл безвирусных цветочных культур: оригинальные и '«одафицирозанные синтетические питательные среды для индукции морфогенеза и получения растений-регенерантов розы,

. хризантемы, цимбидиума, гвоздики, гшшеаструма, лилии, гиацинта; принципы отбора экспла.чтов; режимы культивирования тканей, полученных растений in vitro и адаптации их in vivo .

Практическая ценность работу и реализация результатов" исследовании , В итоге ib-легких исследований /1974-1991 гг./ стало возможным внести вклад в развитие безвирусного цветоводства в нашей стране. Впервые создана модель системы освобождения растений от вирусов, включающая S блокоз-методов оздоровления: тестирована растений на вирусы, термо- или хемотерашы в условиях in vitro ше: in vivo , культура ткани н регенерация растении in vitro .ада; ташя растзний-ркгеьерантоз in vivo , ретестирование ¿¿цаптирован-нцх растений-регенерантов на вирусы, сертификации; безвирусных растений. Практическое использование модзли и разработанных ьа ее основе технологий нолу^еш-я безвирусного посадочного г.^терпала цветочных культур меристемшми лабораторией!, имеющейся в раз<;ых регионах страны /цветоводческих совхозах, кооперативное и других учреждениях/ позволит обеспечить промышленное цветоводстьо и озел?-штельные организации суперолитиыл: посадочным материном дл.ч закладки безвирусных питомников, продлить сроки вег'о'/ации цветочные: культур до 2-х и более лег /для гвоздики-и других культур/, в 3-Ь раз увеличив зыход высококачественной цветочно;! цредукцлп пс сравнению с суцествукииьш технологиям выращивания. /ля ботанических садов и селекционных центров представляется возможность созданы rei;o6a;u:a беззкрус;тых сортов цепных и редких культур, определение их потенциальной продуктивности, более успешного ведения селекции на иммунитет- к други:: богюзк/.м.

На основании проведенных исследований и полученных результатов с участием автора разработаны методические рекомендации: "Методические указания по ограничению распространения вирусных болезней луковичных и клубкелуковичных ив отечна: культур" /Ялта, lS7ü¡/'; "Методические указания по диагностике болезней цветочных культур и мерам борьбы с ними" /Ялта, 1977/; "методические рекомендации по получению безвирусного посадочного материала гвоздики садовой группы Сим" /Симферополь, 19ЬС/; "Матодическиз рекомендации по размножении цветочных растений гвоздики, хризантемы, фреезии.Сро-мелкевнх in vitro " /.'jira, 1965/;-. "Рекомендация по получению исходного безвирусного посадочного материала хризантемы", утвердпен-ные HÏC Госагроарсма СССР /Махарадзе-АнасеукИр 19о7/. Результаты многолетних исследований автора изложены в монографии "Вирусные болезни промышленных цветочных культур и биотэхнолэгическиз призам оздоровления" /депонирована; М., 1532, .v 1723-rf32/0

При непосредственном участки автора, с использованием результатов его исследований, впервые на Украине /в Крш.:у/ построек и введен в эксплуатацию промышленный керистемный ко,«пледе Республиканского концерна "Крымзеленстрой" по получению а размнояеяяв in vitro безвирусной гвоздики садовой группы Сил.

Научные разработки экспонировались на ДдНХ СССР: "Технология получения безЕирусного посадочного материала гвоздики ездовой грусти Сим" /1978 г./, "Технологи»- ползания и размножения беззирусно-. го посадочного материала хризантемы" /1ЭБЗ г./, "Бпотехпэлогэтзс-ше приемы получения л выращивания безвирусных луковичных цзоточ-шх растений" /19Е4 г./, "Биотехнология ускоренного размножения в ;терилыюи культуре антуриума Лндрэ на безвирусной основе" /lüGor,/ i были отмечены двумя серебряны:..!! л двумя бронзоЕ^ми ./.едлта/ш.

Результаты исследовании внедрена е одном из групчеЛших ;;пеы!ч-шзированных цв'.'Товодчсскйх хозяйств "ирадасренььш комплекс", ныне 1КЦ1тйнерное общее тес "Элита" российской 'Ьедерадш, в ?.<ор;1стемном :ол.пле;:се Республиканского коы'ерцн "Хрымзслекстроп''. :iu;.ïb,:i цо-:од от применения бнотехно.тагичегдаос приемов ц гоу.нологиИ получе-!Н.ч безвирусного посадочного .va i ерзала гвоздшеи, хризантема, акту->иу'«а розы, богоьпч v-jiaïiiop и других состизчл в иенах 199С

•ода оолсе миллиона рублей, б каздо;.. из шх.

'тробгл7!."! работа. Результата исоледснаннЛ и отдельные по.>;о;ке-гля работы доказывались и обсуздо-шсъ н,д научнэ-т^хничоокок. Сове-

те Минсельхоьа и Госагродрогла СССР "Интенсификация промышленного цзетовоцстш" /Москва, 1Э75, 1Э78, 1985; Таллин, 1982/; lia У1 Всесоюзном совещании но иммунитету сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям Д'.ос.ква, 1975/; на Всесоюзной научно-практической конференции "Гащивание цветочных культур мористшным способе«" /Рига, 1977/; на Ш Всесоюзном Координационном совещании цо защите декоративных растеьий в ботанических садах СССР /Киев,1979/, на Всесоюзном совещании по проблеме организации и производства безвирусного посадочного материала /f/.осква, ifflliX. СССР, 1979, 1983/; на Всесоюзной конференции "Состояние и перспективы развития сельскохозяйственной биотехнологии" /Москва, 19ь6/; на Совещании стран-членов СЭВ по разработке технологий получения и выращивания безви-руснсго посадочного материала цветочных растений /Кишинев, 1SB5 ; Сочи, 1988/; на Международном симпозиуме цо вирусньс.. боле эти/. растений /Ашэрглебен, ГД"Р, 1979/; на Конференции фито-медлцинского общества по вирусным болезням растений /Дрезден-1шлышце, 1991/; на ¡¿езд-у на родном симпозиуме "Селекция, размножение, борьба с болезнями цветочных культур закрытого х'рунта и других декоративных растений" /Рига. 1991/, а также на ряде других республиканская и региональных научных, научно-производственных конференций и совещаний „

Публикации о Основные результаты проведенных исследований опубликованы в 50 работах и обобщены в монографии "Вирусные болезни промышленных цветочных культур и биотехкологические приемы оздоровления", депонирована ВИНИТИ, & 172Э-В92, 1992, 8,Ь п.л.

СОДЕРУАКИЕ РАБОТЫ

3. Анализ состояния изученности вопроса

ПерЕые сообщения о вирусных болезнях цветочных культур появились в 1S2G году в C11L", где был описан вирус желтухи астр /Kunkel, 1926/ л несколько позднее в Англии ошсаи вирус бронзовой пятнистость тсмата на хризантеме /Smith , 1935/.

Широкое и планомерной изучение вирусов у нас и за рубежом с привлечением большого количества видов растений из разных ботанических семэйоть началось ь 50-е годы /Рыасксз, 1946; Париевская,

1S48; Проиенко, 1953; Гольдин, 1354; Smith . Brierley , 1948 ; Nooráam , 1952; Kaasanls , 1955; Hollings , 1957; Oer-tel , 1959/.

В отечественной литературе к 70-м гг. наиболее полж) были изучены вирусы семейства лилейных /Проценко, 1954; КорнееваД367; Проиенко, Шатрова, 1969/, гвоздики /Килевиц, 1970/, фрезами /Пола, Зунде, 1970/. Стали известны резерваторы вирусов^ обнаруженные среди дикорастущей и культурной флоры цветочных растений /Макутенайто, Власов, 1971/. Установлено, что вирус мозаики мышиного гиацинта может заражать культурный гиацинт. Вирус пестроле-пестности тюльпана обнаружен нами на диких тюльпанах Tulipa os-s-rowokiana Regel , T.alberti Regel , T.Kolpakowakiana Regel , T. greigii в горах Средней Азии. Найден вирус мозаики лилии на образцах Li llura tenuifolium Fisch. , собранных в долина реки Туда-чоу, на скалах в отрогах Сихотэ-Алиня / Митрофанова, Проценко, 1975/.

Интенсивное изучение вирусов цветочных растений наолядаяось в последние годы /Макутенайто-Навалинскене, 1Э31; дола, 1982; Зирка, 19L4; Коев, 19Ь4; Павленко, 1985; Болощук, Теплоуяова, 1986; Савенкова, 1987/, что обусловлено усилением шс вредсноснос-ти, повсеместного распространения и снижения уровня устойчивости вводимых в размножение и выращивание сортов, а также активизацией поисков новых путей решения проблемы борьбы с. вирусами.

В результате проведенных исследований на территории быЕкего СССР известно около 130 вирусов, поражающих цветочные растения, среди которых имеются неспецифические, способные заражать насколько растений-хозяев.Так, например, вирус огуречной мозаики /В0М-1/ поражает не только овощные, но может заражать бобовые, технические, плодовые культуры, а также лили*», хризантему, гладиолус,тюльпан и другие /Проценко, Шатрова, 19G9; Власов, .7оку?енейте, 1971/, Вирус кспермин томата оказался резерваторсм вирусов хризантем /'Лгнаш, 1974, 1978/. Вирус желтой мозалки фасоли поражает фреезшс, бобовые, гладиолус /Козицкий, 1975/.

С развитием молекулярной вирусологии появились нявые критерии классификации вирусов растений /Ьренкель-Конрат, 1972; Мртьюэ, 5.97o; ncbielzor , Sraer , 1980; Гга.-.clti , I.'i3no,Hntta , 1385; Крылов, Ларина ;; др.,1987; Бил;Jt.Гвоздик,Скрипаль и др,.1^3о/0чго позволило разделить вирусы цветочных культу]) на 12 таксономических групп /'¿обравирусы, потексвпрусы, клрлавирусы, пстивкрусы, ллостеровиру-

сы, тобшловирусы, томбусвирусы, неповирусы, кукумовирусы, иларви-русы, тимовнрусы, каулиыовирусы/.

Извеитяо несколько обзоров литературы, наиболее нолно обобща-шд полученные результаты кзучэния вирусов цветочных растений, дающие представление о состоянии исследований в этой области /Козицкий, IS VIS; Проценко, Митрофанова, 1975; Митрофанова, 1981; tóa--кутенайте-Навалинскена, 1981; Рыбалко, 1984; Кеглер, Кляйкхемпель, Эртель, 1986; Митрофанова, 1932; üertel „ 1369; KlinJcowski ,1977/.

Таким образом, в области изучения вирусов и вызываемых ини болезней цветочных культур у странах бывшего СССР к середине 70-х гг. были достигнуты определенные успехи; изучены Еирусы и вирусные болезни однолетних цветочных культур, определен состав и изучена вредоносность вирусов гиацинта, нарцисса, тшьпана, гладиолуса, фроезии, лилии, пеона, герани. Били начаты исследования по идентификации вирусов гвоздики, хризантемы и розы.

Предположение о возможности отсутствия вирусов в меристемати-ческих тканях больных растений впервые высказано Чунгок /ïhung, 1938/ и Уайтом /'White , 1943/'. Начиная с 50-х т. были предприняты первые успешные опыты по получению свободных от вирусов растений георгину из точки роста /Мorul , Martin , 1352, 1955; Thorneon, 1056/. С! тех пер технология культивирования апикальных меристем и получения растений-регенерантов стала интенсивно совершенствоваться /Бутонко, Яковлева. 1962; Бугенхо, 1964, 1970, 1971; Каз-sekIe , 1S67; Брегетона и др., 1970/, особенно применительно к сельскохозяйственным культурам.

Автора метода /Morel , Martin , 1952, 1955/ полагали, что в больном растении вирус распространяется с отставанием от быстро растущих молодых органов, особенно в молодых недифференцированных тканях, где концентрация вируса может стоиться, вплоть до полного отсутствия. Теоретические концепции,, положенные в основу этого уатода, стали проясняться в последнее время.

Структурной основой испо;лзуемого на практике явления служит специфика строения точки роста растений: дистальная ее часть,ире-дотавлс*нкаг1 апикальной меристемой, у разных растений имеет средний- даэмэтр до 200 шм и высоту от 20 до 150 ¡mí /üedesdem ,1958; Rasa „ Essau , 3961/. fi солее- нижних слоях диффср91ширушщесл клоткк меристем образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей систеш. Б колеоптиле злаков, например, размеры участка вер-

хушхи, не содержащей сосуда, могут достигать до 250 мкм /o«Brian, тМгасшп 0 1SS7, пит» по Журавлеву, 1973/« Такая особенность строения апикальной меристема асключает проникновенна в нее вируса путем быстрого транспортирования по проводящей системе, ко допускает возмоаность медленного распространения через плазмодезмы, соединяющие ыеристематичоские клетка /Яуравяев, 1979/.

Применение электронной микроскопии часто обнаруживает наличие вирусов в меристеме пораженных ими растений, что, впрочем, подтверждает общеизвестный факт, что количество лишенных вируса растений после подобной операции чрезвычайно кало.и многие меристемы пораженных растений инфекционны / Kausœnis, 1957/.

' Таким образом, эффективность применения апикальной керйсто-мы в качестве метода оздоровления зараженных вирусами цветсчшх растений оказывается низкой.

Известный метод термотерапии цветочных и других растений от вирусов широко применяется в Голландии, Даши, Германии /Hollinga, Kaasania , 1S57; Ston® , 1968; Oertal „ 1974, 1976/, в странах бившего СССР из-за своей сложности и недостаточной изученности в промышленном цветоводстве пало используется. При термотерапии тер-молабилышх вирусов иногда удается излечить растения целиком /Hollings , Kassanis , 1957/.

Однако чаще от вирусов освобождаются отдельные органа и только верхушки побега, отросшие во время термообработки /¿ерде-ревская, Цуркан, 1971; Вердеревскал, 1977, 1981; Помагков, 1977; Oartel , 1978; Mitrophanova , Oeriel , 1981/. Для объяснения ;лз~ ханизиа освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной их них, высокие температуры воздействуют непосредственно на вирусные часхкш через их рибонуклеиновую кислоту и белковую оболочку, вызывая физическое разрушение и лишая вирусные частицы инфешшошгасти. вторая гипотеза состоит в том, что высокая темдератуоа действует на аиру-сы через метаболизм растений /Kassanis , 1957; ^¿равлез, 1019/, Под влиянием высоких температур нарушается равновесие мехду синтезом и деградацией вирусных частиц, ¿ели преобладает синтез, то концентрация вируса в зараженных тканях растет м наоборот»

Имеются сообщения о некоторых антивирусных веществах •- влро-цидах /Бобырь, 1976; Абрамонко, Султанова, 1977; калыхин, Лшшц-кая, Шмнгля и др., 19г_6; Митрофанова, 1992/. Усилия .»лнетих кселе-

доЕГ.телей били затрачены на поиск ингибиторов, которые доданы были блокировать заражение растеши и процесс репродукции вирусов. В с&^.зи с ?№: возниклу трудности, связанные с фитотохсичкостью препаратов. Большинство соединений, обладающих антивирусной актив коотью8 быство инактивирозались в растениях цри воздействии различных экологических факторов /Бойко, 1990/.

Я. Условия и место проведения работы, методы исследований

Исследования ясоеодилмсь в 1974-1591 гг. в соответствии с тематическими план:LV.ii научно-исследовательских работ Государствен ного Никитского ботанического сада, являацихсл составной частью целевой комплексной научно-технической программы СЗВ "Ускоренное развитие биотехнологии з сельском хозяйстве" 5.1„1„3. "Еезвирус-ное растениеводство'', О.СХ.Л "Разработать и внедрить биотехиоло-1"Ивеские методы повышения эффективности расте^еводства и животно водстза"о

В экспериментальной работе использованы общепринятые метода вирусологических всследовашй и биотехнологии, а также разработан ш:е неми, либо у.сдкфипчрованные применительно к конкретно,': требо-ванкям и не,тал опытов.

Для выявления вирусных болезней и их распространения обследо вались прсшлжнные плантации открытого и защищенного грунта цветоводческих хозяйств, коллекционных посадок ботанических садов К;,ыма и Украины, а также изучались образцы пораненных органов рас тений „ присылаемые в Никитский ботанической сад из других регионов.

. Идентификация вирусов и тестирование цветочных растений ьа вирусы проводились по общеприняты!/, модельным схемам, с использова киек стандартного набора растение-индикаторов /шихсов, Ларина, 1983; Власов, 1969, 1973; Оэг1;о1 „ 1369; Митрофанова, 1902/

серологически /Души, Попова, 1937; ОисМег1опу , 1953; СегЬо1 , 1976/ и электронной микроскопии /БгапйвБ „ 1957; Проденко, Лзгун-хова, 1982; Иропеько, 1966; СогЪе-Ь , 1974; Аа^ев о* а1. , 1974/.

Тестирование и ретестирование на вирусы исходного и оздоровленного посадочного ь;аториала выполнялись методом к^/унофоркенж

о анализа /KlerJc, Adams , 1977; Oertel • 1977/ с скстзмой прибо-ов СУМАЛЬ.

Математическая обработка экспериментальных данных проводилась о стандартным методикам, основанным на применении ститлотичеог.сго кализа /Афифи, Зйзен. 1982/.

При изучении морфологических свойств вирусных частиц, /.ссло-уемых вирусов, электронную микроскошш в большинстве случаиа осу-ествллли прямым методом с использованием 2$-нсй соли фссфорноволь-раковой кислота /ФВК/, фосфорновольфрамовоикслого натрия /фВкь / ри pH 5-S или 2,5,v-Korо раствора ураннлацвтата, на иккроскодах арки " Те sie." a Jems-7 •

Для изучения локализации вирусов з апикальных меристемах и протокормах /цимбидаума/ кусочки исследуемой ткали фиксировали в ,5-5^-нсм глатаральдегидо, приготовленном на 0С21 какодилагксм буере /рН 7,2/, содержащего. 0,05М СаС12, з течение двух часов npz омнатной температуре и трех часов при температуре Поила 4-х ратной промывка в том не буфере,., образцы йнксяровалз в j.$-eom ~с-кеном фиксаторе» Обеззонешше в спиртах кусо^з ткани залива-пи в ионы /Ушшi, 1975/. Срезы готовила на ультоамккротсыз 1KB их ополнителько окрашивали 2$-ккм раствором ураыаладзтата и джмонко-ислнм свинцом / ¡Reynolds, 1963/ а исследовали в электронном лзкро-кспе м&ркк Jens -7 в лаборатории электронной микроскопии Инстату-а Микробиологии АН /г.Москва/. Обнаружение зирускнх частиц зозбу-ителя крапчатости / CarMV / в апикальной меристеме гвоздика осуществляли катодом "давленных препаратов". К&здую ыерисгему в стельности помешали в специально сделанную лунку предметного стекла иаметрсм 2 мм, в каплю стерильной дистиллированной йоды и pacti^pa-ii. Затем гомогенат нагосили на оетки-подяояки, контрастировали ,t-noñ ФВХ и просматривали в электронном микроскопе.

Основным методом исследований при разработке и олтпмпгцгаи зхнологий получения я клепального микроразунокешш с'езвпрусних веточных растений являлся метод культивирования in vitro/Бутен-о, 1964, 1370, 1971; Pioidi: , 197S; плинии и др., 1S8C/ я pusum*-нх его модификациях /СсСюлозс-., '¿итрсфанова, 1985; ¿яхрофакэва, устафин, 1S8d; Митрофанова, Иванова, 1S8G; ¡иигрофадаль. 1966/,

ОсБООеждэпиа цветочных растения от вирусной инфекции провода-ось аптогрзт'ои м-этодои огооуа иьль.с здоровых растений л теотл-овуния их на вярусь, trps;o-, х1мт>]ч:ш:и in vitro ша; in vivo,

культуры апикальных меристем, аддукции органогенеза и условий культивирования растений-регенерантов, адаптации пробирочных растений in vivo а их ретестщювания на вирусы /Митрофанова, Смирнова,Иль-шщкий, 1Э78; MiSrophanava , Oerrel, 1979; Митрофанова,Кудрявцев, и др., 1Э80; Митрофанова, 1989/.

Количественный анализ проводался на основе схем дисперсионного многофакторного анализа. Использовались также критерии Стыодвн-га и Пирсона /Корзе невский, Кузнецов, Лищук, 19В7/. Были выявлены достоверные различия между сравниваемыми вариантами /уровень значимости ке превышал пороговую величину 0,05/. В результате прове~ денного анализа были установлены оцтшальнне уровни значений факторов внешней среды, обеспечивающие реаим максимального благоприятствуя развитию и размножению.

Для характеристики интенсивности роста и рентабельности процесса клонального микроразмнонения безвирусаых цветочных растений определяла ростовой ивдекс. Прирост протокормов у иимбмдиума учитывали за 80, 90 и 120 дней по формуле:

х = й_=_8 , В

где х - ростовой индекс,

а - конечный вес протокорма, в - начальный вес протокорма.

В исследованиях по отдельным вопросам проблемы в разные года принимали участие сотрудники руководимого автором коллектива /Т.А. Сщрнова, Н.Н.Иванова, А.Ф.Евменеико, Н.А.Кормшшпина/, сотрудники отделов цветоводства и дендрологии /Л.Е.Соболева, А.С.Кольцова, ГоНХестачанко, Г.Ф.Феофилова, З.К.Кдимэнко/, специалисты инкзнер-ного обеспечения /O.A.Иль шщкий, А.Н.Рнндан, В.Г.Ивандов/« Произ= водственную проверку и внедрение полученных результатов осуществляли в мвристешшх биокомплексах Акционерного общества "Элита" „ г.Москва /М.Л.пленко, Г.Д.Алехно/, Республиканского концерна "Крыюзленсгрой", г.Сшферополь /И.П.Кудрявцев, А.В.Шэец/. Многие яэ нмл являются соавторами наших публикаций. Всем им диссертант зыр&яает искреннюю благодарность. За постоянные консультации я шз-слэдованиях по теме автор глубоко признателен профессору К.Эртолю /с.Oerbel/ и директору г-ну В.Эльзкору /и0Е1еа®г/ - Elener рас jyngpíIsasen-Dre sden /Германия/.

3. Видовой состав вирусов, врздсжссноеть а распространенность возбудителей вирусных болезней цветочных культур

3.1, Распространение и вредоносность

Вирусы цветочных культур распространены повсеместное Однако, исходя из данных, полученных наш, можно отметить, что з koiux регионах многие возбудители в Настоящее время занимают весь возможный ареал и высокую степень поражения, совпадающий с ареалом выращивания поражаемых ими видовщеточных растений. В одних случаях тго-происходит из-за благоприятных условий для развития переносчиков, в других - наличие восприимчивых видов растений0 являющихся резерваторами для многих вирусов /мышиный гиацинт, дихке виды тюльпанов, орхидей и др./. Наиболее широкое распространение зиру-сы имеют на юге Украины, однако при выращивании цветочных культур в закрытом грунте их распространение носит повсеместный характер. В этом случае регулирующим фактором их распространения является зараженный посадочный материал, ввозимый из разных регионов.

Повсеместно распространены такие вирусные болезнл, как асаер-мня на мелко- и крупнецветкоъых сортах хризантемы, Б-вирус - на крупноцветковых сортах хризантемы, пестролепестмсть тюльпанов» гвоздики, мозаика цимбидиума, мозаик^ нарцисса и другие»

Ряд заболеваний имеет ярко выраженную приуроченность к экологическим районам. Так, вирус погремковости табака и могилка резухи-гвоздики, тюльпана и гиацинта носят очаговый характер. Значительное место площади поражения и численности занимает вирусы, слоссб-1ше кроме своего основного растения-хозяина поражать широкий круг видов среди цветочных растений, obo:;;jihx„ технических и даже плодовых. Сюда входа т как культурные, так и дикие виды растении, которые становятся резерваторамишрусон. поражающих сельскохозяйственные культуры, К ним относятся вирусы табачной мозаики, огуречно'1 мозаики, некроза табака и мозаики резухи. Скрытыми посители.л вирусов часю оказываются и растения природной флоры. Tíüí, вируо иес.'ролс-лсстлости Т'олъг;;.:Ка обнаружен нами на дики* тюльпанах lulipa огДго-wekiana Regel , T.alberti Regel. T.KcO.paUcwskiana Reg¿l. T.^rei-gii б горах Сродной Азии. На!дон вирус лилии на образцах Lilium •fceiuiíoliu® Pisch., собранных в долине роки Тудачоу, на ск;»л..х в

отрогах Сихогэ-Алиня /Митрофанова, Процонхо, 1975/. .

К возбудителям с относительно узкой специализацией ¡сотю ири-чпохичъ вирусы кольцевой гравзрокш, дрижилковой крадчатооти, некротической еятшотостй и латентный вирус гвоздакк садсвой группа Сам, вирус раает&чностк хризантема, вирус поотролькесхноотв тюль-пака, вируса шгаиш актура^ Андрэ, розы, гиазшнта, фреззы: гагшеаструм&е латентный икрус и вирус кольцевой пятнистости лилии, сохрашщненя в порыганиом растеиш.

На основания зета сказанного мэжко заключить, что основным источником первичной ккфокцик многих возбудителей Езрусннж болезней цаэясчшх культур в гшпкх, вго-западкых и других регионах, особенно дет закрытого грунта, остается посадочный материал, об-цэгаазй и КЕтродуцарованный, дакоравтудкв виды растений, а так&е пэроносчики вирусов /тли, нематода и др./.

3.2. Кцэатафщгэдач вирусов

В процессе ^следований нами вдзнтифадирован» 33 возбудителя вирусбслазний, неизвестных йлн мало кгвзсгных в Крыму и на Украине, обнару&екккх на екокодачески ьазнкх промышленных цветочных культурах с применением методов гмиуиоферыэкткого аиашза, диффузии в агар-гело, капельного метода, электрзшюй мизрогкодаи ц стшщартиого набора растений-иддикаторов /та5л о 1/.

Анализ сдавленных вирусных болезней покагавает, что балык других от ¡¡прусов стрздазт хризантема, гзоздкка, пимбидаум, роза, лил&я, толйпаа и гладиолус; ущерб о? вирусов на многих цветочках культурах весьма оаутим. При сильном поранении огдаяьниз культуры могут "вырождаться" и вытисняться из сортимента. Такое нолоаэнио слоилось, например, с луковичными и клубнелуковичныш культурам« в зжных регионах.

При сораааннк цветочных растений обычно наблэдя'отся проявления различного типа еикштоюв: мозаик, некроза тканей, задержка 1уш усилишь вегетативного роста, различного рода шшшстостей, дефоргшшм соцветий, -луковиц к гауйнелуковиц /роза, хризантема, гвозди!«*,, гладиолус, тмльиан, лютая/, пестролепестнссть и песгро-лцстнсють.

от и> i-i I

ей I -< [

S

со í C>! О M

(О и

M С)

о щ са « о, с

X M I

О.Я « W

""tí" я в

о «

О

а?

О

о а>

3" й я

О"

W я ■ i

о §

о.

о

а

е р.

о

Си

« g

о рн

о"'-? о о

Т> 1-4

о

w

о о

M [1.1

о

3

13- "О N Pol öo i

-, УС\!

Щ

О) M 3! <0

, п

й! 0J

s <

Я о л

о о

с

si

§

о

о -d'

СО !

( ti) E>

•л 1

CO I ! ' ~ ¡« LO tJJ (

да S «

F4 " ¡K!

E-i fr-i C-i и P-i È-.

о о

ч -ч

£> ¡ i

£• I te

о

Ш g

зш

S3

гз н

й

т i

о о

о -r-t т?

I

ОЭ СО

í г i

н й р

е-« Í-< «

« J!

o Г!

a M ^

Я 81

Hilo"

O 15 CD СО о

Я '0 jr Ч N tun

o,HO 1 ft® 1

Г! «'ООО

Д МС-И -Ч C--J

í> о

Í; •ri

ra р-а

<131

OU M

£0 4 51 О Ш Í4 !Ч

Я» d

*¡Ci5 е> а.1 ai гз1т а

л;

а

о р.

¿3

fj

о ю m г

(? 3

со

а.

ai Я

5

i с !

й

5-t £-i е

1С ñ

О S

as® s äs

o.qi ! ГМЧХ! I'Q О CM

■it >

С л ;

г-* п

•H -i

К s

£ M M ■р

г: -¡-i С 'H с ■П c;J

О г" о i> о ч о +>

•H •м ■r¡ О

«М о т-> СО ■:.! ц- г.

c¿ H «■1 г-1 W .11 о 1.1

с +-• 5 S fî Л*

Í4 -V О й ь С

Ö С rf о с к -И tt

о £ о а О í-t

C?stia'cioa necrotic ileeîe virus

Closteî'o'vlïus

Вариона нктезэдшэ s 1250=1350 X 12=13 ем

Carnation latent virun

Sarltw±?u6

Еирионы нитевидные о 650=700 х 10=12 m .

Arabia mosaic Hepovlrua virus

Вмшога Сфвр2Ч80КИЭ c

30 ш

Chrysanthemen aspermy virus

Cucumsvlrus

I P H S A 1

ВирКОЕМ ейюрическйэ, 26-30 m

Chrysan »Ьеаон Carlairtrus Ввркош virus в штевзднне „

700=750 ж 12=15 EM

Продолжение таблицы 1

' 4

ТТИ - 45'43°С. ТПР = 1г12С0 ДСИ - 3=5 ДНЙЙ

тти » 6í>=65°8 TIP - 1er4 ПСИ 2-3 да

m - €0=62^0 Ш - . Л0~3 ПОИ - 3 дш

ТЕМА

ТТИ - 65--7Q°0 ТЩ> = .I0"3

ПСИ - 3 дня

ТТИ " 70-?2°е ТПР - 1СГ4 ПСИ — 2 дни

Узкий Ыеханкчоски,,

тжша

Узкий Механически, тлями

м-

Шаро1ЯЙ Межадачесш, нематодами

Широкий Механически, тли

Широкий Механически, ТЛЯМИ

I I _ 2 ! 3

Tomato opottsd 7,lit Virus

Tomato spotted B'.ipJIOHH v;lit Virus cispiiMeciaio, Group <¿0-80

Chryoanthernum rorc-ttc virjs

ipymia He oapeASJiena

'i'O'D&OCC

necroaia virus

Tobacco BapnoilH

r.ucrosia virus cJepiiMecKiie, group

28 km

Cucumber mor'd.c \'iru3

Cucumovirxis

Ehphouh criepinecioie, 2§ mi

Ara'cis n.osaic vj run

ilepovirus

BnpHOHU CT^p^eGKHe, 28-30 HM

Продолжение таолицы I

I

40-45°С ■1СГ4 5-6 часов

Широкий

Механически,

ТЛШМЙ,

трипсами

Узкий

Прививкой, тлями

72-75°С Ю"3

5-10 дней

Широкий

Механически

65-о8°й

■ ХО"4 5 дней

Широкий

Ыехаличбскя,

ТЛЯМИ

5Б-62°С .Ю"4

4 для

ШирокаЙ

Нака'годаш

Продолжение таслщы J

Cyabidiura 3!osaic virur

ЦЙМБИДИУМ Potexvirus Еирноны ш- ТТй « 65->7С°С

ЛОТКОВЗДНЫ0,

475 X 13

Ж>

10"

ПСИ - 7-26 дней

Широкий

Механически

Odontcglosrroin riagnpot virus

Tobemorirus Взризны па- ТТЙ = 85-93°С Широкай

Л0ЧК0ЕЕДНЫ8 „ тттр

300 s 18 ш w

10

2-3 года

Механически

t-b ш

Cynibiditan iàngspot virus

ïombusvlrus

Вирнонн сферические, 20 нм

ТТЙ - 85 G ТЩ> -

ПСИ - недели

Широкий

Механически

АНТУРИУМ АНДРЭ

Antîiurium raosaio virus

Группа не определена

Бирионы нитеЕЛдшв, 754 нм

Узкий

Механически, белокрялкамя

Cueumber moeaic virus

CueiîmaYlrus

Виркож E30-метрические, 29 нм

ТТЙ - 65-78 С

ТШ5

10'

,-4

ПСИ - 3-5 дней

Широкий

Меха/шческп, тлями

Продолжение таблицы!

РОЗА

.'runurj necrotic Ilarvirua Вирноны изо- TTÍ1 •- 55-G2°C Широкий Механически,

rinespot virus метрические, ГТр тгг9- " прививкой

¿3-25 нм ujr " iU ПСИ - I день

Apple mosaic viru2

Ilarvirus

Виршш изометрические, 25-30 нм

Широкий Прививкой

м о

Rose streak virus

Группа не определена

Втаионн изометрические. 28-30 ни

Широкий

Окулировкой, прививкой

pr.ee r.lC3biC virus

{tore yellow rroaaio viru^

Clai-virua

1"рупга не определен?.

Еирионн изо— метрические, 2Ь нм

Вярпош; палочковидные , 297-310 х 14-Ir. нм

ТТИ - 52-5 4°С TilP ~ Iff"4 ПСИ ~12-24часа

Узкий

Узкий

Механически, окулировкой, пшвазкой

Прививкой, окулировкой

2 ! 3 1

яювеЛе Иерот1гиа Виряонк ГШ

сшзряческизо тттр 30 т ииг

ПСИ

лилия

руг, г !;о:тЛ.овб

СагХатагиз

Вирионы ТТИ

нитевидные, ^тт,

620-700 х АШ

13-15 ш ПСИ

7,Ну г±пвэро^

Группа не определена

Виряояы ТТИ

ссЬеричзскиз, ттгр да ал

ПСИ

С-асигаЪег тоаа!с у±гие

Сисгшот±гип

Вирионы ГШ

Ж"0' ИР

ПСИ

"'и Ир Ро^згЛхгш

-/1гиз

Вирионы нитевидные, 760 х 12 нм

ТТИ ТИР ПСИ

Продолжение уабищы I

Широкий Кзматодеш, механически

70°С Узкей Механически,

■ -¡-д-З таяш

2-3 дш

60=65°С Узкий Механически,

ТЛ53.Ш

2 дня

60=65°0 Шарокий Механически,

1Т4. тлями

3=4 дня

60-65 °С Широкий 1,'еханическй,

-1СГ4 тлякп

3-4 дня

a

о a> ?!

э

га g у, g а> Ч

ï= и

Шн

os

2 §

й!

а> Ф

5?

S g

S

.Щ

О

Bs

ж я

°i аз cd f см и о . .. d ta 'tí œ аз о *н <a X О Pi в а) о ri h со o^a

f"t

<a о

•Нт1

g О

Яi р*

>>

о.

-1

tí «

о ü.

ra

о СЦ

ш

«

§

о Рч

О

О т1<

а о

ci

W

ь

0) in

4

i i i

^ р. о L-< (И "3

О

о ю

о

я

г--о

i i i

PS с<

О Oí

1-1 1-4 .1

й!

0 -J О чг ш

Й Ь й

1 М О Ю 1-Н

( i i

ЕЬ ~

Й Cj

b-« Е-" ^

О

О П<

зь

I н

£

«

ÍB

Π1-( I

LO

! ¡

I

¿

s

en hi

О • :

ri

I

pj

0 Pi

И <U

С) о

1

о S3

м

s P.e.,

Cl ЯН

Гч éhCJ

nu--

I О)

а гя с N i? -"i ra d a яо

О OCVO -J К I 0J »mV i « о j m ■—i •—'

A ai

о 2

Я <и к

rrt г

о tío « р<го с, Cr' J si (Dril

ra s cv

А со

" S ° «

a oj H

« V o к; CO t; ос\г Д!< i S ü>u>

I Й 'tí cu я я U§ rtm

a oS я чэт

w ß

■s

s

ч»

о

ta g

£

а

M

С

ы

а ñ

I

с.

ф

а

О т( о а о о д> и о о о

& а

>

о

ja

О (Н

г -, m

Я Ti

С i-i

СЙ -4-5

S Fi

о

Й

Ü

CT О -ri О 'Л

о о

с) h

.о о

о а>

f-< tí

2 тг

о

» о

d "3

,о ¡p о о ti £

Продолхениз таблицы I

СасшлЬех' Сиситпо"У±гиз

Вириопн изо- ПИ - 65-Р7°С Широки ТИР - : 1ПГ4 ПСИ - 3-5 дней

кетричесхяз 30 ни

Механически, тлями

ЕСЕКО Т±1ТиЗ

РсЬетлгАгиа

НАРЦИСС

Влрионы па- ТОЙ лочковддные, тттс 500-675 ЕМ пиг.

ПСИ

- 70-75°С Широкий

- ",1£Г6

- 6-11 недель

Механически,

глями,

семенами

й

ув Нот. ссг1ре

у! спя

Варяонн Т*И

нитевидные, «гт 750 х 12 да

ПСИ

68-70°С Узкий

1СГ2 2-3 дня

Механически, тлями

ТоЪасоо ТоЪгауХгив ВлрИОНН СО— ГШ - 75-80°С Широкий

1е/и1е VI гиг лочковддные, тттр тгт~4

85-120 НМ Л1* ~ 1и

ПСИ - 4-5 недзль

Механически, нематодами

СисигЪег тоз&Зе у1гив

СизитэуХгив

Вирионы

с^ические, ^

ТТИ - 50~68°С Широкий

■ИГ-

ПСИ - 3-5 дней

Механически, тлями

Продолжение таблвды I

I ______2_! _3 ?___4__! 5 ! 6

Arabia mccaic repovirua Вирлоны ТТИ - G0-65°C Широкий Нематодами

virus. сферические, ^ _ 10-4

ПСИ - 2-4 дня

i А ц п 11 1

Hyacir.thus Группа не Внрпоны TLi - 68-70°С Узкий Механически,

snsej.c virus определена нитевидные, г™ т>г"* тлями

700-725 пм — го

ПСИ - 3-7 дней

Tobacco Tcbravirut? Вирионы па- ТТЛ - 70-75°С Широкий Механически,

rat-nie virus лочковяд!ше, ^¡р _ -¡-g-З нематодами

130-250 нм

ПСИ - 3-4 недели

ФРЕЕЗ

Eoan yelloi" :.'.GEcic virud

iotyvirus

B;:pi50HU нятевидныз 725-750 x 17 км

ТТИ - 5С-60°С

TCP ECU

IC~J 3 дня

Широкий

Механически, тлями

Продолжение таблицы I

!

Freesia mosaic vims

iotyvlrus Bznnora ТТИ - GG-70°C

нитевидные, тггр _ Т.Т5

640-S50 x w *iJ 15 нм

Узкий

Тлями

ГЛАДИОЛУС

Bean yellow Potyvirus Вярионы ТТИ - 56-60°С

mosaic virus нитевидные, .др ^

0 х U йм

ПСй ~ 2-3 дня

¡¡¡крокгй

Механически,

тлями,

триасами

fo

СЛ

Cucumber Cucumovirus Вирионы изо- ТТИ - 58~70°С

mosaic virus метрические, r^ _

29 нм

ПСИ - 4-5 дней

Широкий

Механически, тлями

Hippeastrun mosaic vix-ue

Г И II П Е А С Т Р У М

Potyvirus Вирионы ТТИ - 70°С

нитевидные, фттР тп~2 ssn-Rsn нм -lL ~ ■ 1и

ПСИ - 2 дня

Узкий

Механически, тлями

Продолжение таблица I

Сисигзсег

Сисшпоу1гио

Вираонн Й30-.•¿етюпческиг. 28-29 ям

63

Г1И ТПР ПСИ - 3 дня

Ог-

1СГ3

Шиюокий

Механически, глями

- Точка тертляческо:! инактивации. : - Точка предельного разведения.

Выстаивание инфекционного сока 1п vit.ro яри коанагной температуре.

Гр СГ)

При диагностике вирусов хризантем» в одних и тех ке образцах, одновременно удалось обнаружить несколько возбудителей в сме-ейкшх инфокцаях, при этом отмечено варьирование в симптомов болезни з зависимости от сорта /Табл„ 2/„

Таблица 2

Результаты сорологической идентификации вирусов на различных сортах хризантемы

!К~во !.

В и

Сорте

Симптомы болезни

Т

!рас.- 5 !

!тегшй! ТД7 ! BV j CMV | IKV j ¿.,-v

IsaimL_I_L_I__L__

3 ! 4 ! 5 ! 6

I

Красный зкаво- Нарастание отдельных

pöEOK

цветоносов,хлоротичес~ кие и некротические пятка на листьях

20

Willie® Утонченные цветоносы,

а'игпаг насколько изогнутые»

хловотические пятна и некроз отдельных участков

20

Olimpiede Слабая мозаика на

листьях,некроз ткани 30

Prlaeeasj Alice Хлороз к кекрсе по

Monaco

кра» листа в виде колец,накротиче ские пятна дцоль центральной жилкиоотдельные цветки грязно-бе-яые

30

Diplcaiat Хяоэоютеская пятнис-Woirot тость,некроз тканн на

листьях, посветленио жилок с на некоторых цветках наблюдалась деформация ложасязыч-ковнх цветков

40

+

Темное Пламя, Мягкое Золото

Хлоротические и гшк-ротачоские пятна на листьях

Продолжение таблицы 2

Воеort

Золотой Фонарь

Matterhorn Tresor

Увядание цветоносов, некроз листьев

Хлоротически« пятна на листьях, деформация цветков

Деформация листьев„ хлорстическая мозаика

Хлоротическке пятна вдоль центральной галки,крапчатость

! 3 ! 4

20

35 40

20

+ - ~ -

Fortuna Посветленио палок,

слабый хлороз реформация цветков

30

lili Gallen

Exscel

Soleil Kiooio

Хлоротяческяе и некротические пятна на листьях, слабая деформация пвзтха 30

Хлоратическив пятна вдоль центральной жилка, укороченные цветоносы 30

Слабая мозаика листьев 40

^ .. п

+ - -

Алdree Hose

Southdevm Pink

Слабая мозаика,некротические пятна на листьях

Слабая мозаика

40 23

-t- - ~

ОаяеПе Хлороз и некроз по.

краю листа в виде колец, отделы-ке цветки грязно-белые

20

+ - -

Продолжение т&блтш 2

2

IS ! 4 ! 5 j 6 ! 7 ' 8

Diplomat Purpur

Golden Boy 1>Л Cagouille

Wim Lange

Ar de с. lAiiona

Бесформенные некротические пяша ка листьях, чередование красной и желтой окраски ложно—яеычкобых цеотков 40 - + + - -

Некротические пятна

на листьях - '30 + - - +

Деформация цветка ы листьев, хлоротичес-кая пятнистость

листьев 30 + - + -

Утонченные цветоносы, несколько изогнутые, хлоротические пятна на листьях 20 +■ -

Хлороткческая исзаика 15 - - + +

Хлоротипеекая мозаика,

пережодяяая в некроз 40 - + + +

*/ -

"V- - вирус обнарунен, -• вирус отсутствует.

Из 400 обследованных сортов и гибридных форы сильнее других цорадалксь вирусом бессемянности сорта хризантемы Грация, Ля Ко-гуй и другье /Матрофднова, 1981, 1992; Соболева, Митрофанова, 1Э35; Митрофанова, йеофилова, Зланко, 198S/.

Акаока данных о характере проявления вирусов на растениях-индикаторах позволил выявить оптимальные растения-дифференциаторы ддя кавдогс вируса,идентифицированного нами на гвоздике /табл. 3/. Среди амйвднкоя сортов цимбвдиума сильно поражались Cyrabiciaun 'Pai pus» , 'Angelica Yellow' И другие.

Таблица 3

рандиацкя основных вирусных болезней гвоздики еортотзша на растениях-индикаторах

п/п

Название болезни у. ее возбудитель

I. Крапчатость -О&А'пгЛЛэч П0141з уХгиа

2. Пряталкоаак крапчатоста -

Сота+Лоп уч1п питЬ^е vi.ru::

3. Кольцевак пятнистость -Сате^ол

С}1сПоро1Лш! бит.пгал^ 1ц о!ог

3

Реакция индикаторных растений на заражение вирусами

?

СЬепоро&ши ^ихтюэ.

^ошрЬхела gioboeа

Зароааг1а \*е.<;саг1и

!

1

Через 4-7 днз.1 многочисленны® аелг-озато-золе-ние некрогчкбс-кае пятна па натертых листьях

Чэреэ 7-12 дней локальный хлороз

Через 4-7 даей Через 7-10 дней Через 10 дней

локальные аелто-зат::в некрозы0 через 21 дехчЬ -системны! хлороз

некрозы с красно- многочисленные

ватт окайклеяи-еы на натертых ластьях

шга ка натертых листьях»через 21 день = галловый хлороз системные хло-ротическло пятна а деформация листьев

Через ь-Ю дней мелкиэ хлороткчес-кие и кэиротячес-кив пятна на па-тзртых листьях к яклках

Через 3-6 дней

ЫН0Г0Ч2&Д6ННЫ0

локалг-ные желто-зэто-зеленне пет ка к кольца, на 1С-й день - системная ьбкропгчео-кая г;о заика модо-дцх листьев

Чнрез

¿-о дней многочисленнее локальные пвкро-эн

Через 5-7 дней кольцевой некроз, гштна на натертых ЛИСТЬЯХ, 011С-темнач крацча-тооть и деформация листьев

Через 3-4 дю* кольца и некротические штна на натертых листьях,дозднаэ системный хуторе з

оз о

Прододпоняэ таблицы 3

Козкта ребухи АгаЫя иоваАс т1гио

5. Лаг^нггаз болезнь -СазтлЗДок х.ьхетЛ тг±гив

б, Яэкротэтвокга пятнистость -Сагпат1ст ыесгс1±с £1еск VI газ

г,\ Кольцевая гравировка •• Сагга^оп

тХгие

Молкло еткальныс /лорстетескке науроза, систем- штна кг затертых нал мозаика яастьях.састекнкэ

хлоротическле пятна на отраеташих даетьях „укорочение междоузлий

- Через 7 дней еш/-

ткэ пятна (3 и Е диаметра) на натер-тах етстъях, через 2 надела - крапча-тость а морщинистость 9чашеобразная дрфордацта отрастающих лсзтьав,задержка, роста

Черьэ 8-12 дной Чэрм 5-7 дпой запоет инокужатий гулькая некротЕчео-некроз и дефор- гсая пятнистость и масти даглзз хлороз шетьер.

Черва 3=€ дней слабые хяорстячес-кие пятна.через 10-14 дней нэкрози на натертых листьях

О

со

Через 10 дней локальные Красине кокцвн-тричиекзе ко;;ь-па,еротемнач штрнховатость и деаораацчя ст-раста^дих листьев

3.3. Вирусы, прачинжадга экономический ущерб цветочным культурам

Иг. числа вдеыткфщерозанщх вирусов зкачигвльннй вконсидчеслсй ущерб газтечзам культурам прнчикяг/х: хркзактэмз - Chryswitheftfja vlnjo В , С too asperny virus ; ГВ03ДКК9 ~ Carnation r:ctt3e "ia-un , Car. voir, aiottie virus, Cea% ¡necrotic ^IsoJc virus , Arabia .топай c. virus /amy/; последний вызывав'; укоренение мвядоузлзй и образовала чрезмерного количества побегов у гвоздики. Часто больше рис -тзния ямают вид кзтла, цветки отсутствуют. Нами зпереке а 197S -1Э77. гг. мозаика отметена как патогэн, вызвавши». элЕфатотяи иснвлс-пия "вецыиных метл" на гвоздике в цветоводовских хозяйствах Кры -ма. Позднее ш наблюдали ато заболевание гвоздика на Украьне, а Беларуси, Литва и Эстонии. Б условиях закрытого грунта сильно ли-рагалтся варуоакя цимбдаум <■• CvmbicLUwi mosaic ylrue . Caontoj-ics-evsa ringspot vlrva ; роза •- Rode moecic yirufi, Hose yeHow .nonuic virus , Prunus necrotic ringspot virus ; ТПЕЬПан •- Tall? oredo.-.ie vir-jo , Tobacco rattle virua . Tobacco necrosis virus ; Л«1ЛИЯ -Смешанная ¡»Секция Еирусов - Idly symptomless virus + Cucumber mosaio «irue {Idly rinespot vi.rus + Tulip brceJd.ag virus , eSiiH л гладиолус - Всм yellow г.сзэ!с viru/; ; гиацинт - Hyao.tr, -thus mosaic virus; гкппенструм - Hypyaastrwi mosaic; siruc ; нарцисс - Narcissus nocaic virua , liaroissua yellow eirip's virun.

Изучение фиsk;o-xn:mчесю»x свойсid вирусов позволило усх^но-ьуть их термостойкость или термотолер^итность. Срэ.ци вирусов хризантемы и гвоэ.гекя наиболее термостойкими оказались два ахрус: : 5-вирус и вирус крапчатости гвоздики.

4 г сравнительная эЗДоктизкость методов терапии цветочны* растений о-r вирусов

4.1. Культура апикальной меристе:л

Испояьзоглииа метода культура пликзядоой меристг»л'д длс ондо-yowwi-im растешь от апрус-но^ инфекции осноззаио иа нркнци.ю с-тууг-сгвлл гюрусннх част.щ в воркутхс; роста растений.

Подтверадание допускаемого явления технически оказалось трудно выполнимо из-за мелких размеров мэрнстемн и низкой концентрации гкрусов в няхс Затруднительно также одну ш ту же меристему одновременно использовать для анализа на присутствие вируса и для регенерации растения.

Мы использовали метод "давленных препаратов" для обнаружения вируса крапчатости гвоздики / Сотку / в аиккалъиой зоне меристемы черенков цветущей гвоздики сорта Пей Sim, зараяенкых зягы вирусом» Во всех 25 кркготовлешт препаратах были обнаружены сфзри-чаские гарусще частим крапчатости гвоздики / ОагЫУ/.

Другим подтверждением локализации вирусов а маристематичеоких исанях являются опыты, проведенные нвш с культурой дамбадмума. В улыратонких срезах апикальной меристемы дамбидиума сорта 'Angelica Yellow1 , зараженной вирусом кольцевой пятнистости одонтоглоссума / оньтг/, при просмотре в электронном микроскопе, м цитоплазма и в вакуолепоцобных структурах были четко видны скопления варионов CRSV о

Таким образом, результаты» полученные нами, и практический опкт ряда мерлстемннж лабораторий Крыма и Российской Федерации показывают„ что из апикальных меристем растений х'воздакИцПоракен-НИ1 вирусами СахШГ и CavVUV,- в условиях in vitya поручаю? ин-фкцированныз мариклонн.

В принципе возможно получение безвирусной апикальной ызристе-мы от больного растения, но при этом риск попадания вирусов в здоровые ткана долиен быть сшген до нуля» Это моаат быть достигнуто специальными приемами, направленными ка сниженьэ скорости репродукции вирусов /аьбл, 4/.

4.2. Термотерапия

Метод термотерапии подразделяется па два способа. Пэрвый -применение горячей воды. Этот способ был изучен ещз в 1936 году / Хиико!, 1336/. В иаикх опытах с погруженном клубне,вуг.овнц гладиолусов в горячую воду перед посадкой, ыря температуре 50°, С>0°С к йкслсэиши 15, 30, 45 минут и контроле положительных результатов получено на было.Количество зараженных вирусом мозаики растений гладиолуса достигало, соответственно, 96,6 и 100%. Причем л

Таблица 4

Сравнительная оценка методов осзобоадекия сортов гвоздики от Carnation mottle virus

Методы

Copt

-)—-гт*^—-1-!—j---

Уайт Сам ¡Артур Сим ¡¿¡ильям СдацРед Сим; Лена Сим

Растений з опыте „ шт.

Культура апикальной меристемы

340 295 231

434 298

Термотерапия 8 недель + культура апикальной меристемы

350 301

377

291 308

Термотерапия 12 недель + культура апикальной меристемы

291 349

413

379 484

Безьарусных растений,

Культура апикальной меристемы

11,9 18,8

9,9 20,0 19,3

Термотерапия 8 недель + культура апикальной меристемы

71,5 56,5 55,4 65,5 67,4

Термотерапия 12 но;;оль t- культура лппкально.'! :.:ер:;с-темч

22,2 98,6 98,8 98,7 99,1

* - Исходная зг.р.-^егпюсть опытных растени.*1 90-100,г' Урогс-пь з::ач.у.:остл Р не превышал 0,05.

вариантах с температурой 50сС ш зкокозкдаэй SÛ-12G инкут, а такае пра температура 60°С е эхсповидаой 15 шнут каблэдажась полкая гк= бель адубнэлукОБИд /Митрофанова, Еасклаеза, 1974/» Второй способ -пршэнеше сухого горячего воздуха - оказался сразндазлько боле® &$фэвтивнш, особенно щш исполъЕогашн взгеткрушда цветочных растений, которнэ определенное время выдергивались в специальных твриокшераз е регулируемой тамнературой 37±1°С<,

Исследованиями установлено„ чт долшз экспозиция термотера= еж а болызЕй прирост растений, там sees гарантия получения безви-русшж верхуЕЭКв В связи с етш успех термотерапии свзточных культур <, nopassKHHX вирусными С-одаэкюдИс правда всего опредаляетск конструкцией термэкамзрн, обеспеченностью es внтяпкой к приточкой взнтняяцкей, термотолэрантностью сортов и культур,, созданием оя?и= м&льных условий для роста растэкий /Oertel , 1977s Hiteephsjaowa , Oer-fe&l , 1881; Митрофанова, ISbS/.

Разрабатывая рззшсг термотерапии цветочных растений, был шЗ-раз опташ&льный вариант с недельной прэдодЕШтельностьи тазадак растэннй,, подготавливаемых к тсрютерадии. Изпытнгакз раэ-si's парамзтра температур, однако болээ ОЕтгшалькой оказалась 2SCG, и sûtsm es ааэднэзкэ пэвкыаш ка 2°Се доводя до 37*1сС, что d£ara= приятно в,еешлэ ка дальнейший процесс тараокк,, Кэ мэкза вадко cos° дать и Еоддэржшата оптЕмакънкй ранга на протянзниа всзго щюцзсс® тераэтораяЕн. Накн разработаны следующие решай s температура 3?5С, освзцакноеть лампами дневного свэта 500Q <ек0 фотопэриэд„в sebsce» кости от культуpu„ 14-16 часов в сутки при относительной ш:апкэо~ .те воздуха в термокамера 90$«

Продолжительность термотерапии воздело зазисит ©? cocrasa вирусов и юс термостойкости» Если дгя гвоздике достаточно 10-12 es« дельного воздействия теплом, то для осзэбзадзюш хризантема от Б^ вируса этот период длится 12 к более нэдель /табл0 5/.Зшечеко,что хризантемы лучзэ Бздерхшваат экстремальные условия тепловой обраба кн. Однако растения цимЗидаума, антуриума Акдрэ и луковичных культу аналогичные условия терапии ке выдерживают. Для этих культур наиболее перспективны термотерапия расташй-регенерантов in vitro В результате многолетних исследований установлена возможность массового получения безвирусного посадочного материала цветочных растет^ с использованием методов термотерапии в сочетании с культурой ышк,J.UHUC меристем.

Та&шр 5

Сравнительная опенка нетодов освобоадония хризактеьш о® еьгушшШешша В -йпу.

Методы

Экспозиция, недель

Культура апикальной

ристеш -

Термотерапия ->■ культура апикальной меристемы 10

То же 12

То ге 16

Термотерапия + укоренение черенков 4

Отбор внешне беесшштоулык растений

Изолировано

апикальных

8£ерасхем5шт.

5000

5000 5000

5000

Растений в опыто »Получоно !■ "растений=рэ=!Адаптнрован=! гэнерантов {ннж 1а г±го !йз 1ШЖ. тщ° 1п -ч-йЛяо, !и ?естщю= Нено бззш-% «валкие ка 5русных„ %

ШЕЗСНоПге^ "

25,0

60,0 00,0 90,0

375 -

3500 4500

500

500

3,8

70,5 95,5 100,0

10,3

2,4

м

<75

Уровень значимости не прэашал 0,05

Кроме тогоо выявлен полохштельный аффект высоких температур /37°С/ на точку роста и процессы морфогенеза гвоздики,хризантема, фроеаш в условиях In vitro . Так, коэффициент дифференциации апикальных меристематических тканей увеличивается на Ь0~60#о Отмечено стимулирующее влияние термообработки ка адаптацию растений-ре-генэрантов после пересадки из пробирок з условия in vive .

При этом резко возрастает выход безвирусных маточных растений, увеличивается в 2-3 раза количество черенков и повышается качество цветочной продукции /длинный устойчивый цветонос, крупный диаметр цветка, интенсивно окрашенные лепестки/»

4.3. Хемотерапия /Химиотерапия/

В связи с увеличением числа синтезированный вироыидов0 расширилось применение метода гемотерапии для оавобоздашш растений от вирусов.

Анализ полученных данных показал эффективность совместного применения хемотерапш и культивирования меркетешюй ткани цимби-даума ж розы» При освобождении цимбидаума от вируса кольцевой пятнистости одонтоглоссума / онз? / и розы от комплексной мозаики, виредад - виразол /рибовирин/ вносили непосредственно в питатель^ ную среду э разных ковдантрадиях /1-60 мг/л /0 с последующим культивированием апикальных меристем,, Виразол /рибовирин/ - ОЕНтети= ческий нукязозид9 противовирусный препарат шрокого спектра действия»

Результаты опытов, представленные в таблице 6, показывают эффективность применения виразола /в концентрации 20 и 50 мг/д / даш ангибарования вируса кольцевой пятнистости одонтоглоссума на пнмбициумэ. Яри положительных результатах освобождения розы от вирусов мозаики /78,2$/ виразол проявил Незначительное фитотокси-«гаское действие: затормаживались процессы дифференциации меристе-матических тканей и пролиферации адвентивных побегов розы.

Таблица 6

Сравнительная оценка методов получения беззирусного посадочного материала цкмбидиума

и розн

8 S О Д Ы

! !

I Шолучеио

¡Изолировано !растений-ре= Культура S апикальных I генэрантов !меристем0што | in vitro

î »

%

Растении в опыте

Адаптирован-! ных in vivo !Из и тестиро- !чено без ванных на !русннх0 :

Культура апикальной мэ= ристемы

Термотерапия растэкай-^еганерангов 5 надеж

Хеиотаралпя + апкхальиой ашриетегш

раетзнкй

Цвибвдщгм 100 Vu 70 1.0

Роза, 320 35 112 30,0

Цшбвдщр 200 80 160 60,0

Роза 125 100 125 81 s2

ЦшбВДВДр» 50 100 50 100,0

Fosa 250 26 45 78,2

Цшбвдауы - _ 100 1,0

Раза - 100 1,6

Урэ&а® §ES®asoQ?s ? hs зревшая 0Л

5. Научзго© ©бооЕСЕакке модели системы освобоадвкжя Еватотаж расианай от вирусов

Езэ зкрусшзе болэыш, обнаруженные на гоэточпшк растениях, передамся с посадочшш материалом. При бесконтрольной его разшо-шеш, ссэбэшэ с Еспольвованнем культуры меристем 0 Еигексавкоеяг разар®о?раеешя возбудителей моаат стать еышз0 чем е природных фа-тоавЕОваг« Разлзгайзе агроприемы /вкекорнеша подаормжа мнхрогл0= ментанн0 бкаетгатескы активными Езщзстзаш,, хкшчэскея борьба © ЕерэиосчижгаШо Егизтеая дезинфекцию покт и субстрата/ гзогут жниь сзшжеь вредоносность болезней,, ограничить скорость распросярака-ши возбудителей о ю не освободить больные растения ©г шруоов0

Разработанная нами на основе многолетних исследований концепция освобовдэшя даеточннх растений от вирусов нредстаЕляез собой систему изтедов и бжотохнологичесхих приемов, объединенных в взде а/здшш /раш. 1/ ш обеспечивающая более высокий уровень гарантаро» ваиноста а ездэеиосты выхода безвирусного посадочного материала по сравнению с раздельным применением зтюс методов. Обязательным® ¿хзавнтада модели язляются 4 взаимодополняющих метода? тестирова» нив» вдриотерыхет» культивирование апикальной меристема /ели других тканей/, тестирование /ретестирование/ растений ка вирусы»

5.1. Тестирование растений на вирусы

Тестирование исходных растений на вирусы предполагает выязлэ шэ внрусов и степень зараженности сортов и культур»

Для тестирования растений ка вирусы в настоящее время чаща всего нслользуэтся иммунологические метода»среди которых наиболее перспективными являются метод виробактериальной агглютинации и им ыунофермэнтный анализ. Главны.1 преимуществом этих методов,по срав ненжв с биологическими, является их высокая чувствительность„ Кро ме того, возможность автоматизации проводимых анализов, что крайне необходимо при массовой проверке растений на отсутствие того ш иного вируса. Однако для проведения такого рода анализов необ ходимо иметь антисыворотки к конкретному вирусу, с высоким титром и специфичность». Иммуноферментный анализ /ЕИвв -тест/ является

щ. ы s

t

:г^ О.

с*: ЕЗ

ÜrSá § a =S'S ras™ s-5 ЕЁ <=г S

е- s: 9> a s? р: й о ¿ öf SI rf> О г» Щ-

SäJ = о •■=» ö

о

■сз га

.S3 ез

О

í-í «5о>г

¿S> J

ЕЗ >■ S §

-- «C —- t^D o- ï

S2 ^ 4' «»

-r. rf =4-0 S "

âf S^IT"I

__ ^ r —J

.Л

Cv &

-<

S:'S cil JyR.

• —A4 » "TT T-S (S J '

ig'áaüüsfl;

? <1? 2? ïial f* l

■ txz О 25 ад Ö «

œ* 2¿ a Si g

S

in y-'^SC!

es S SS gj ¿ Я ¿й

ЯМ

СУ Й

?=> со

г:

>Jj> S

S*

У 5«

Г ) s ir

tri--i

а Pj

<D 55

8 оЭ

2 is:

О <D

x гк t~i S = ü s: CD >s ílpa OUS

ÖÖ

S

■ cO

'O

й ö c- &

¿oñío

f— J<= QJ-S ÍJS [—

1!

ö

наиболзв чувствительным серологическим методом.Он основан на получении конъюгатов, с помодью ряда методов молекулярной биологии, мэоду иммуноглобулинами антисыворотки к белками высокоочищенных ферментов /фосфотаэа, пероксидаза/.

В тех случаях, когда отсутствуют специфические антасыворотки для ИМ, применяли метод двойной диффузии в агар-геле „

Индикаторный метод /метод биологической проверки/ путем механической передачи вируса с соксм больного растения хризантемы на растешш-индикаторн /Chenopodiiaro qulnoa , Pat uni a hybride /, a таюе прививкой на сорта хризантемы, Fanfare и Mistletoe /техника тестирования общепринятая/ более трудоемкий. При отсутствии полного набора необходимых антксывороток к вирусам хризантемы,это? метод может быть применен в сочетании с индикаторным и электронно8 микроскопии. Он предусматривает выявление вирусной инфекции в полученных после терапии растениях-регенерантах спустя 1,5-2 месяца после адаптации о Это позволяет обнаружить случайно сохранившуюся /остаточную/ низкую концентрацию вирусных частиц. Проверка растений ка отсутствие вирусов совпадает с первой прищипкой у гвоздики в хризантемы» Для гарантированного получения безвирусного посадочного материала, выявленные образцы с низким содержанием вирусгщх частиц или в отсутствии вирусов /20% м / возвращают для повторно« прохождения термотерапии»

Из оставшихся безвирусных растений создают маточник безвирусного супер-суперэлитного и суперэлитного материала.

5.2. Терапия вирусных растений

Определены режимы термотерапии вирусных растений: температур. 37°С, продолжительность прогревания 1,5-4 месяца, освещенность 4,5-6 тыс. лк с фотопериодом 12-16 часов, в зависимости от биолоп ческих требований культуры. Она проводилась с полыми растениями или отдельными его частями в культуре in vitro в специализированных термокамерах с приточно-вытяжной вентиляцией. Экспозицию термотерапии устанавливали с учетом состава вирусов, их термостойкости и термотолерантности сорта и культуры. Для растений, проявлявшие повышенную чувствительность к действию высоких температур,

¡роводилась поэтапная преадэлтация к экстрем&шшм условиям ?ермо-■ерашга, Растения, угнетаемьгэ высокими тэ^дературача /розы» да;бх~ шум, аятуриум Авдрэ, лжлги, гиацинт к другие/, подвергалась ~.эш-герапии в згультуре in vitre с вршенешем зироцкдог /зярдооя s ■сониентрацин от 10 до 50 мг/л л цианогуадин/ и ясеолйзоэзлз бэззз-lyciîye клоки путем понска и отбора же среда вирзшшзаемйх :гул&?ур Ошлак, гиааянты, гюшеаструж/«,

При невозможности сроаеденкя термо- иен хемогерагин, а яакав з отсутствии здоровых хлоноз, таана растешй пемещадяс:» з условия la vitro да прохождения термотерапии /актурдум Авдрэ, орхидея» розы/.

5.3. Культура ткани и регг-яврация растений ta. vitro

Продолжительность аульт#варовакия меркотематаческик ?какз§ ели вегетативных почек /роза/ а полугодия растзкгй-рагзнераияоз зависит от фенотеда и дается от 1,5 до 4 агасяцов /гя&здикз, spa« зантемк, пкмбздиум, розы/. Tai:, у гвоздики и хризантемы норнаг&кое разззтаэ растэгагя-регеыэракты формируется з течете 1,5-2 м2Сяспб{ у розы - 4,5 месяца; у лилвн, нгаавнта, гшшгаструмг - 3-4 месяца» Более 1гродслй2тельный период от начала введения эхепланга з культуру in vitro до получения растений - у антуриума Андрэ /8-10 месяцев/»

Выживаемость первичного охспланта на питательной среда сит от его происхождения и размера /табл» ?/„ Чем больио разм&р вьнлекэнной меркстогш или другой ткаш, тан выше гарантия se дифференциации, Поскольку у зараженных вирусами растений, таках как цимбэдиум и гвоздика, нами обнаружены вирусы /0H3V к СагНспГ / в меристема, целесообразно использовать экспланты капшмахьннх раэг меров.

Определены продолжительность, техника и стерилазукодэ агента для конкретных культур. Этанол 70% и гнпохлоркт - 2-3$ дает поли)" дательные результаты при стерилизации екеплантоз хризантемы,геоз-дики, цимбидкума, антуриума с экспозицией до 5-10 улнуг„ Для луао— вичшх /лилия, гиацинт, гнпаиаструм/ увеличиваются э 3-4 раза bZоппозиция и концентрация гшгс&корита, а таете было использовали азаг-иокаслоэ серебре в концентрации 0,08$.

Таблица 7

Огоимаяьнце экохглактк для получена а мцкрогаимпокеагг бсзвкрусчсго лгозядочюкг

материала хщ сточных. культур

Иропсхоздеике э:;сш:анта

_______Р. о л к чи н а з к с п л р. н т а,

! ! ! Г&ацгат, ! Гвоздика ¡Хризантема! Роза !лшлил,Г'Ш~!Цгмби,/шум ___!__ ! __ (чеасттуум ?______

Антургум Аздрэ

Ашка.-шгая мерноте.ма 0,2- 0,3 0,3- 0,5 0,3- 0,4 0,3- 0,5 0,4- 0,8

лП'Ц'алькая часть микро-

поб-.га 10,0-15,0 1,0- 1,5 0,5-10,0 5.С,-10,0 8,0-15,0 10,0-15,0

х--, со

А опальная часть побега

5,0-10,0

^егетатмх-ые почка с ы.ьероиипко:«

,0-10,0

Сегменты чишуЛ

5,0-10,С

Еь'озчст ласта

10,0x10,0

Условия выращивания Експлактов и растэнпй-рогенерантов создаются андаввдуадьио для каздсй культуры: питательные средн. температура, освещенность, продолжительность фотопергида™

Питательные среды составляется соответственно зтанам корфг.гс-неза растений /ди^фэрэнЕащяя, лроляфершдея, органогенез/,.чоторае регулируются определениям для калдой культуры сооткоиэнл«к витаминов, углеводов, оттогорионсз„ Ча^о других сред яояольмзалксь и- ' тательные среды Шг&вЫзз > бкооз /156 2/„ зиуа /1353/ с аиааяш модафаканкямЕ. Особый интерес вызнэают рапрайотаггике три состава питательней ерзди для розы» У дкмбкдаума оптиккэкров&нн процесса индукцкк к пролиферации цротокериоз.. -Яучсше результаты с быстрым увеличением рсстозогс индеаеа протокорьюь достигаются яре одыозрь-иэнним применения з питательной среде сэхаоозы и глюкозы ь концентрациях, соответственно, 4,5 г/л и ¿5,5 г/л /рис.. 2/„ "В о?нозе~ яа углеводов а фзтогормонов выявлено спаауэмруазео даЭс-ля& ка ростозоЗ индекс с интенсивность прсл»5аря;да 1 мг/д БАГ! и 1 «г/л .^"К /табл. 8/.

Те б. липа 8

Зависимость ростового индекса дротокоргов азквлдаткы от

сочетания з питательной среда углеводов к фзтогорюноз

Варианты опыта! /питательные ! среды/....._! Сахароза г/л Глгкоза г/л 5 6-ЗАП ; ; кг/д 5 III 1*1 -ЛУК мг/л • ; Гсст-овоё { индекс, мг

4,5 ¿о 15 5,0. 1,0 И„76 - 2,37

2 4,5 25,5 1,0 1,0 20//& 1,00

о 2,5 5 :шда ± 20Ш

4 4,5 с; 5,0 0 7,45 0,98

5 4,5 } 5 С .5,0 22,-33 ± З325

8 4,5 25,5 1,0 5,0 11,09 % 1,03

К 4,5 25,5 ' 0 0 16,68 4 Зо'Ш

Стшлулирувдеэ действие на рост и количество корней расгаазй-регенерантов дамбидкуча окапывает З^и^долал-масляная кисдота /Му' в данлентродга 0,1 мг/л /рис. 3/.

ПРОЕСЖОРКЫ I (нг/

«Н

/0,0 /Ц,5 /Я.о /15,0 САХАРОЗА (Г/Л)

Рио. 2. Влияние углеводов ка пролиферацию протсжормоь цнмбцпиума сорта МвИиа.

г ю и z2

l ¡0 -19 zq Анаи

шг 3

0,25

см

5-

2 -ID -19 23

2 ю Jig %о дне«

HIT

ЗН

0,5

I Ю 29

2 40 \q -дней

Рис. 3. Влкягае различных концентраций ауксинов на ризоввнеа

Cymbidlum hybridun В УСЛОВИЯХ ill vitro.

Температура воздуха в климатических камерах поддерживается в пределах оптимума требования культуры /обычно 18-20°С для луковичных растений; 22-23°С - гвоздики, хризантемы, розы; 24-25°С -пимбвдкум; 26-28°С - антуриум АкдрэД Освещенность в пределах 2500-5000 лк с фотоперяодом .14-16 часов. Помещение раетений-реге-нерантов в естественные условия требует прохождения периода адаптации „ Для зтого растения высаживаются в перлит или торфо-перлитпую смесь и создаются им условия, близкие к тем, которые они имели в период in vitro . При завершении 3-4-х недельной адаптации растения переносят в строго изолированную теплицу для доращивания, тестирования и ретастированкя.

Выращенные безвирусные растения переводятся /этап сертификации/ в категорию супер-суперзлитн /'MQ/.

На основе рассмотренной модели разработаны специальные технологии получения к размножения безвирусного посадочного материала для конкретных культур.

. 6. Технологии получения и кассового микроразмнокения безвирусного посадочного материала важнейших промышленных цветочных культур

Оптимизация применения бкотехнологкческих приемов оздоровления цветочных культур достигается в том случае, если они увязаны с видовым составом вирусов, их термостойкостью, вредоносностью, а также термотолерантностью культуры и степенью ее поражавмости вирусными болезнями*

Специальные технологии получения и ускоренного размножения бозвкрусного посадочного материала разработаны нами для вегетативно размножаемых цветочных культур,.ча которых обнаружены вирусные заболевания, причиняющие экономический ущерб цветоводству.

Технологическая схема, прздставлекнач на рисует? 4, показывает последовательное выполнение этапов получения безвирусных /супер-суперэлитнкх и суперэлитных/ маточных растений на примере гвоздики и хризантемы.

Экспериментально установлено, что оздоровление высокочувствительных к экстремальным условиям /повышенным темперагурам/ культу

Бис. 4. Технологическая схема получения «ЗезЕирусного посадочного материала гвоздики а хризантемы.

темах как роза, антуриум Андрэ, нимбидиум, необходима замена технологического этапа - термотерапии больных растений - на хеыотера паж или термотерапию первичных эксплактов и растзний-регенерантов в условиях in vitro /табл. 7/.

Наряду с sтим, не исключается возможность поиска и отбора безвирусных растений /лилии, гиацинта, гиппеаструма и других/ с применением для этих целей иммуноферментного анализа и тест-расте ний, с последующим введением меркстематических тканей в культуру in vitro и ускоренного клоналыюго микроразмножения безвирусных клонов. Данный бкотохнелогический прием вдвое сокращает технологи ческий процесс, высвобождая '¿-3 этапа из типовой технологии получения безшрусного посадочного материала хризантемы и гвоздики. Одна!» повсеместная распространенность вирусов е высокая степень зараженности ивэточных культур, ограничивает возможность обнаруже HEfî безвирусных растений.

На основании проведенных исследований разработаны и уточнены технологии получения безвирусного посадочного материала, биотекно логические приемы оздоровления и оригинальные способы клонального микроразмнозизния без вирусного посадочного материала 8 промышлошм цветочных культур /гвоздики, хризантемы, пимбидиума,антуриума Анд рэ, розы, лилии, гиацинта, гияпеаструма//рис. 5/.

Поскольку основные результаты исследований внедрены или Пристли производственную проверку и опубликованы /Митрофанова, Кудряв пев, Ильницкий и др., 1980; Митрофанова, Зленхо, Соболева, 1984 ;

Соболева, Митрофанова, 1985; Митрофанова, 1986, 1938, 1989, 1992/ ниже приводятся технологии и биотехнолог/.чесхие приели, которые отличаится друг от прута существенными особенностями оздоровления и микроразмкожения лезвпруокого посадочного материала: видовым со ставом вирусов, тзраппей, питательными средами, происхождением эксплактов и способами клокальногс ыикроразмножекия.

6.1. Технологии получения и микроразмнохения беявирусного посадочного материала хризантемы

Анализ результатов \г.ноголстнего изучения и разработки технол гии похучсняч 6eôi''.:;;.vc^ о;'о посадочного материала хризгштеш показ

тгсгигодаие »¡я «Ргиотши^&вд-о сгаъим>- дэРсцнсаняг кипении ¡а »¡«о

кость н отсугабие

Рис. 5. Технологическая схезга массового размножения баавирусного посадочного материала луковичных цветочных культур.

вает необходимость последовательного выполнения всех этапов,представленных на схеме /рис. 4/.

Определение сог-.тава вирусов. В Крылу и на Украина на хризантеме распространены ? возбудителей вирусных болезней /аЛитрофанова, Еурдейкый, 1977; Митрофанова, 1981, 1ЭЭ2/; вирус аспермии томатов /Tomato aspermy virus/, вирус слабой мозаики /Chrysanthemum Viru а в/, вирус огуречной мозаики /Cucumber mosaic virus /, вирус бронзовости /Тотatо spotted vilt virus /, вирус розеточности хризантемы /Chrysanthe.nuiE rosette virus /, вирус некроза тебака /Tobacco necrosis v.truu /, вирус мозаики резухи /АгаЪЗ.з racnaic virus /'. Из них наиболее часто обнаруживаются и причиняют экономический ушерб хризантеме - TAV, CBV, CMV, AMV, TNV.

Последнее, три возбудителя / CMV, Aiiv, tny/ обнаруживаются.как правило, в смешанной инфекции на растениях с симптомами созеточнос-ти, карликовости и деформации соцеэтий.

Подготовка растений к термотерапии. Сортовые стандартные черенки хризантемы, снятые с маточных растений, укореняли и высаживали в пластмассовые контейнеры /по 15 шт. в каждый, 60x20x15 см/ с субстратом, обогащенным всеми необходимыми элементами питания /в соответствии с требованиями культуры/. До постановки растений в термокамеру их дважды прищипывали, а спустя 10 дней после второй прищипки помещали в термокамеру.

Адаптация растений к экстремальным условиям тепловой обработки начинается постепенно, с температуры 25°С; ежедневно ее повышают на 2°С в течение 6 дней и доводят до заданной /37+1°С/. Этот период считаем началом термотерапии.

Термотерапия. Важно создать оптимальные условия содержания растений в термокамере. С этой целью термокамеру оборудовали лампами досвечивакия ДДЦ-40 или ДРЛФ-250 с интенсивностью освещения 3500-4000 лк/м2 и с экспозицией фотопериода 14,5 ч/сутки. Отключение ламп в ночное время снижает температуру воздуха с 37+1°С до 26°С, что положительно влияет на растения. Ваякьш условием содержания растений в термокамере является обеспеченность приточной и вытяжной вентиляцией.

Установлено, что продолжительность тепловой обработки находится в прямей зависимости от видового состава вирусов и их термостойкости. Опытным путем нами определена экспозиция термотерапии от 4 до 15 недель. Для большей гарантии освобождения хризантему от ва-

русов eft можно увеличивать до 18 недель, но в этом случае наблю, ется сильное угнетение растений. Хризантемы, пораженные- вируса аспер!лип, можно с большей надежностью оздоровить при 4-недельно1 экспозиции термотерапии / Hollings, Kassanis , 1957/. Растения •■зараженные Б-вмрусом, полностью оздоровить не удается при 10-12-недельной экспозиции к дане в сочетании с культурой меристемы. Учитывая особенности вируса, его термостойкость, лучше результ; освобождения от вирусов точки роста /95,5-100$/ получены увели1 нием продолжительности термотерапии до 16 недель. Гарантирование освобождение растений от вирусов достигается повторной терг/.отер; тшей лс замкнутому циклу.

Установлено положительное влияние тепловой обработки на то1 роста растений и последующие культивирование апикальной меристег что позволяет увеличить размер экспланта до 0,3 мм, а это, в свс очередь, повышает . процент дифферешдиащи до 80% /без термоте ралии пораженных растений он не превышал 25-30',У. Наблюдается сг. мулкруюший эффект приживаемости первичного экспланта, выход pací ниг-регензрантов /с0-905й/ и их лучшая адаптация при пересадке i ггообирок в условия in vivo .

Дезинфекция я вычленение меристемы. Черенки длиной 5-7 см,с росшие за период тепловой обработки, дезинфицировали в 1#-ном рг тзоре гияохлорита натрия с добавлением 2-3 капель детергента /Тi SC/. Продолжительность стерилизации не превышала 5 минут.

Приготовление питательных сред. Установлено, что большой нь ход нормально развитых растений /Эй%/ с еысокой приживаемостью i условиях in vivo /70—805?/ на средах Buys /1956/, Pierik /197t IJovek /1377/ в калюй модификации /табл. 9/.

Культивирование меокстематчческих тканей и получение растеь регензцаптов. Апикальные меристемы культивировали на жидкой /нз беезолыых фильтровальных мостиках/ и агаризованкой средах. J зг екмооти от состава питательной среды, нормально развитое мшшатк ное растете получали в течение 4,5 недель. Из меристемы, через дукцию каллуса и его последующего- культивироватьн на агаризоваш питательной среде /с добавками витаминов и цитокининое/, стиглули Еали больше число адвентивных побегов. В этом случае из одной к риотемы получали более 20 проростков, которые укореняли на питат ной среде с добавкой НУК в концентрации 1-2 мг/л.

Таблица 9

Составы питательных сред для: дифференциации апикальной меристемы,каллусогенеза и получения растений-регензрантов

хризантемы

о м л о н е н т и

Составы питательных сред, иг/л

! индукция ! дкфференциа- !каллуса из ! ция меристе- ¡мористемати-! 1№ и получе- ¡ческах тка- ! ние растений-!ней к пролк»! регенерантов !ферацкя ад- !

! ье'нтивных ! 'ночек__!

иизогенег

I

1

!

4 3 1650 2475 825

.С12»2Н20 440 440 220

°3 1300 1900 950

;304«7Н20 370 370 185

2*4 170 170 ■55

^ЕШШ.

?~И)ТА 37,3 37,3 37,3

¿04.7Н20 27,8 27,8 27,8

во3 6,2 • 6,2 о, 2

Б04ЧН20 22,3 22,3 22,3

зсут^о 8,6 8,6 б!б

0,83 0,83 0,83

С12'бН20 0,025 0,025 0,025

БОГ5Я2О 0,025 0,025 01

2МО04-2Н20 0,25 0,25 0,25

панические вещества

«этиновая кислота 1,0 1,0 '

зидоксин-НС1 0,5 0,5 -

ШШ-НС1 1,0 1,0 -

си н 2,0 2.0 а.

Продолжение таблицы S

1 ! 2 ! 3 ! 4

Мозо-инозит 100 100 10,0

Адешшсульфат 20 5 -

Са-пантотенат 1.0 1,0 -

Цистеин 1,0 - -

Казеин гидролизат 500 500 -

Гибберелловая кислота 0,4 0,5 -

Кинетин 0,5 0,4 0,4

6-БАП - 0,5 -

НУК 1.0 0,25. 1-2

Сахароза 20000 20000 20000

Агар - 7500 7500

В каморе искусственного климата поддерживали постоянную среднесуточную температуру воздуха 22-23°С, освещенность 2500 -3000 лк, фотолериод 14,5 часов.

Большой выход нормально развитых растений отмечен в октябре' ноябре и в апреле-августе. Это прежде всего связано с состоянием маточных растений, с которых были сняты черенки и изолированы г/.е ристеш. Ile мере развития эксплантов осуществляли пассажи на новые среды. Каллус пассировали через каялые 2 недели на свежепр. готовленную среду. Спустя 4 недели формировались проростки, а за тем, спустя 2 недели, появлялись корни.

Адаптапия растений-пегенепантов in vivo . Миниатюрные расте. ица Д10/ с хорошо развитой надземной частью /3-4 см/ vi корневой системой пересаживали из пробирок в почвенный субстрат. Этот эта технологии выполняли е специальном помещении для доращивания ил: в изолированной теплице со стабильными условиям:: температурой 20-22°С, относительной влажностью 70-Ш,Т, освещенностью 30ûCM00i лк в первые lu дней и 5000-7000 лк в последующие, при фотонериод 14-1G часов.

Адаптированные растения пикировали из пробирок в вазсьы объ мом 0,25 л /предварительно продезинфицированные/ со смесь» tojxj-í: /рН 5,0-5,5/ и перлита в соотно'линии 2:1. ^

При соблхщении оптимальных условий пересадки и ухода за растениями приживаемость составляет 8Q-SQ$. Как только растения достигают высоты надземной части 15 см, проводила первую проварку на вирусы„

Тестирование меристамкнх растений на отсутствие пирусоь и сортовую однородность о Одним аз взинейших этапов технологий получения безвируского посадочного материала хризантемы является его тщательнач проверка. Для своевременного выявления заражения; знру-семи меристешых растэкнй Д40/ к репродукции прозерку осуществляли в строго указанные срота. Перауэ проверку М„ проведали з период, когда пересаженные из пробирок растения достигали знсстн 15 см0 что совпадало с первой прищипкой. Зараженные растения выбраковывали „ а здоровые пзрееаживали /вторично/ з болев просторный вазоныо Снятую верхушку после прищипки укореняли а высаливали отдельно для проверки сорта» Второе тестирование вхтяжла тарзд чачалом разкнаязнш,, Разгшояекныэ раотзит ;!То вкрздквазкыг в ял-чествз бэзяируского маточника, такте подвергали тщательной двукратной проверке; перзаз проверка - перед снктгегл черенков к вято-рал - спустя 2-3 месяца после первой» JLrsi тестирования иаполвзоза-дн кзтодн нкмунофэрментного анализа, растениё-иццккатороз и электронной микроскопий /техника тестирования ошсзлы з раздагз 501о/.

Безвирускыэ растения /Н3/» Растения, непосредственно внрггщзк-ныз ез меристемы, принято шэкозата М0 /оригинальна® меристема/, после первой проверки ка зирусы 5х высачдавзли в 2-х литровнэ вазоны со стерильной сззееьэ торфа м перлита з соотношении 3:1.

Вагоны с растениями устанавливали з епэциаяйно предназначенную, строго изолированную теплицу, е оптимальными условиями наращивания о

Формирование матояннх мерзстемшис растений является ответственным моментом технологического процесса. Первую прпщшку растений проводили одновременно с первой проверкой тс на вирусы: и еср-■ т-оьуd однородность . Прищипывали обычно над хорошо сформированным листом, при этом особое внимание обращали на чистоесртность маточных растений. Часть растений /20-ЗС$/ вновь подвергали тепловому возг,ействча о последу идем повторением всех зталов технологии /меристемная культура и т.д./« Это позволяет гарантировать Ю0$-ное освобождение растений от возможного остаточного колдчаоч-ва вирусов и сокращает необходимость массового тестирования.

Создание оупеоэлитного посадочного материала М^. Первое снятие черенков производили после второй проверки на отсутствие виру сов в №0. Черенки снимали регулярно по мере их готовности.

Перед снятием черенков„ за сутки, растения обильно поливали ведой, а рано утром следующего дня черенки снимали» Недопустимо снимать с растения все побеги, так как это гложет резко снизить продуктивность маточного растения.

Черенки укореняются в течение 3-4 недель. Ь оптимальный /майский/ период первые корни появляются через 7 дней. Количестве укорененных черенков, в зависимости от сорта, колеблется от 85 до 10055.

Репродукцию М£ использовали для закладки суперэлитного баз-вирусного маточника и дальнейшего размножения элитного материала.

Ретеотирорание на вирусы растений М^ Повторная проверка рас тений на вирусы не отличается от методов, описанных выше, и провс дится спустя 2-3 месяца после первой проверки.

Вчра'диватае безвирусных маточных растений и размножение поса дочного материала -»п у1уо . Приемы и методы выращивания безвирусных маточников не отличаются от выращивания обычных маточников хризантемы, за исключением более жесткого фитосакитарного контроля.

Каждая репродукция, как в случае с гвоздикой и другими культурами, должна содержаться в отдельных теплицах. Совершенно недопустимо появление в них тлей и трвдеов, являющихся переносчиками ряда вирусов /аспермш и огуречная мозаика/.

Элитным посадочным материалом считаем репродукцию Ид.

Интенсивное размножение элитного материала в условиях производства тшокй предусматривает проведение фитосанитарных мероприятий от возможного повторного заражения и распространения вирусов. Поэтому необходима пространственная изоляция между посадками элит них маточных растений и выращиваемых хризантем на цветение. Химическая берьба с насекомыми-переносчикши вирусов и ежегодная смена участков для борьбы с нематодами повышает декоративность и . качество цветочной продукции.

6„2. Технология получения и клепального шжроразмнсжения безвирусного посадочного материала цгабздиума

Впервые микроклональное размножение димоидиума гибридного на Украине начато з Центральном Республиканском ботаническом саду АН. Однако, в условиях быстро развивающэгося производства ттбядиумэ, усилилась проблема вирусных болезней» Направление исследований, связанное с получением безвируского посадочного материала, полупило развитие в Государственном Никитском ботаническом саду,

Экономический yiuepd выращивании культуры цимоидиума причиняют два возбудителя заболевания - Gyzsbifiium mosaic viras И Odonto-glosstin ringspot virus с

Отбор и тестированийо Отбор здоровых растений проводили путем внешнего осмотра растений„ Проводили ид. тестирование ка вирусы методом кммунофэрментного анализа ш инокуляцией растений-индикаторов Chanopodiisa amaranticalor „ Goaphrsna globosa „ Tstragcniñ expanse. Beta vulgaris , Б случае отсутствия вирусов провереншз растения цимбидаума использовали з размножении in yíxto кап безвируеннй материал,,

Тешо- и хемотерапия. Растения цгшбздаума на Зхгдершсвают высоких температур, поэтому была применена термотерапия растепай-реге-нерантов in vitro „ Колбы с растениями-регекэрантами помещали в термокамеру с режимом температуры 37°С, экспозицией 6 недель,, освещенностью 2000 лк и фотопериодом 16 часов» Затем вычленяли апикальные' меристемы на питательную среду»

Вместо воздействия ка вируса высокими температурами можно использовать метод хемотерапин с применением вироцида - варазола з условиях in vitro о Виразол вводила в питательную среду, а затем помещали меристематическую ткань и лротокермы. Оптимальной концентрацией виразола является 50 иг ка литр среды. Более высокие wшаят-рации отрицательно влияют на ростовые процессы»

Стерилизация и вычленение меоистематической ткани» Ддя стера-лизании тканей применяли различные стерилизующие ггеягл гжохго-риг Са, азотнокислое серебро, хяорашн з до. Лучшим дезкнфакгортг по эффективности и простоте приготовлена является 5/б-ный гкеохш-рит натрия NaOCl .

Питательнее среды. В работе были применены рецепты питательных сред по ЗЕигазМйе , Бкооз /1952/, Кпийаоп /1846/ в четырех оригинальных модификациях: дифференциация меристематических тканей, индукция протокормов, пролиферация протокормов, регенерация проростков, ризогенез /табл. 10/.

Таблица 10

Составы питательных сред для культивирования цймбидиума

Составы питательных срод. мг/л

Компоненты

'дифференциация !меристе-!матичес~ !ких тка-!ней.фор-! мирование !протокор-

пролиферация протокормов

регене-! рация проростков и их развитие

ризогенез

1 ! 2 ! 3 4 ! 5

khgpo^ 250 250 250 250

СеСК03)2ЧН90 (nh4)2s§ 1000 1000 1000 1000

500 250 250 250

MgS04.7H20 250 250 250 250

РО304-7Н?0 27,8 27, Ь 27,ь 27,8

hag-edta 37,3 37,3 37,3 37,3

mhso^°4к?0 н3зо3 25,0 25,0 25,0 25,0

10,0 10,0 10,0 10,0

ZiiS0^»7320 10,0 10,0 10,0 10,0

hagmoo^«2н20 0,25 0,25 0,25 0,25

CUS04.5H20 0,025 0,025 0,025 0,025

Глзшик 2,0 „ _ -

Пкрадоксин-kcl 0,5 - -

Тиамин -HCl 0,4 0,4 0,4 -

Никотиновая :сислота 0,5 0,5 0,5 -

Кипетин 0,4 - „ »

Активированный уголь - 2000 2000 2000

З-индолил-масляная 0,5

кислота - - -

Мезоинозкт 100 100 100

Продолжение таблицы 113

Сахароза 30000 4500 4500 20000

Глюкоза - 25500 255С0

Агао 7500 7500 7500 7500

Условия кулътивировашщ мэркстзматаческих тканей, протокоомов Условиями, отвечающими требованиям культуры, являются; темпзратура 24-250С„ освещенность 1000-2000 лк.фото-лериод 14-15 ?асоз„

Массовое размноаэние растений достигается ежемесячным деланием и пассажа«.® протокормов ка свежеприготовленную средуо Таким образом, о? сдксй безвирусной шристзмн мэяуо получить з течение года десятки п соткк тысяч здоровых растене? /ркс. б/.

?в?М'Ш?!?закиэ. и их репродукций ¡¿а виру-

са» Пэзтэркез ^естарозавиз растений ка вируса проводится с одно-врэмзнкэй проверкой сортоткпа и затастза ссцзэаий. При кассовом лромшвлзшюм гыпусхэ бз8ачрусно?с сссадочкого материала даибздауна главноз авдиаикэ аздхшэ бчтъ сесрэдото^зно на первом тесткрозанкг; стовторноз манко осуществлять выборочно /до 23/,/.

S^ШШЖQ^QШmШSШSJmШШ&JIЯШmí' Безвирусный :.7.ссэ,:;о---ный материал шмбидаума начгааэ? Езцьетать через 3 года после пв-кэровки з естествэкный субстрат» Тахнв растения целесообразно использовать дяя зайладхи матсгнаг посадок к как есходньй матзрнаа дга? кассового тиражирования бэзззрусного глатаршла»

Приемы и метода вцрадавада* бззБнрусшх мазэтазшз шкйвдгука ез отличаются от вкргицнзанЕя обычных маточников. за есклшзвеэм болез строгого фитосанитарного контроляв

Нами освобоздвно о? внругоз 10 сортов дайадиума, когора® в течение 5 лет свобода от вторичной инфекциио Они дваздн за этот период цвели. Ежегодное двукратное тестирование методой И8А пска-эываэт 100$=ноб отсутствие вирусной ¿нфекпжк»

6.3. Технология получения и клонального микроразмшшэния посадочного материала розы

Роза занимают одно из ведущих msct з экономике ароушвенного зэтозодства. Однако их вирициванае соаряяэно о рядом грудпоотей; эраяаекость вирусными болезнями, низкий коэффициент рагшядония* опрос размножения розц в условиях in vitro рассматривался рядом второй /Я.?.Ио+, , 1S70; Davl3 , 1980; Алехко, Высотой, 1S88/.

Ка розе расарсстраиеяы и вредокоокы вирусы, сбъодинекныз а змплекс мозаик /Complex nocale /: Roes mceeic virus Гйзквает ветло-згденне аятна, кольца а линии на листьях, мелкие 8есвизх~ ичные цветки; Hose jellow raosaic virus , Ргипиз necrotic r.lng-po-l Viruu , Applo mccaic virus - ка ЛИСТЬЯХ ПОЯВЛЯЕТСЯ ДуЙОЛИСТ-у.й узор, полукольца к линии, иногда становятся эамэтну язлтцэ и родолгеватце и некротические пятна.

Предлагаемая технолог:« получения п раэшюкютз беззарусвого осадочного катеркала розы декоративной является оригивадьЕОЙ.

регодили по ea-inoS комплексной системе, включая визуальную оцожу сводного материна по киселям признаком болэзаа; баотест на рас™ гниях-индикаторах: Cusuaiic? aativus 'Delikateus' , Yinua гоавь , hsnopofliur. q-jinoa Cli. waaranticolcr, Vigry* ainoaeln ; злоктрок-уто микроскопию к метод т^туноферментного анализа.

Безварусшо растения posa Екжочали з размножение .in vitro с эследуадим фатоЕкрусологическкм контролем /рзтестпроганпз/, зара-згаше определенным вирусом растения цепка* сортсз ззо.цилл в куль-уру in vi-tro л подвергали терапии /терме- ¡uní хсглотерапиЕ/.

::е.З цветоносы /з перяод озеряаиваши бутешв/ и побега с веготатив» ¿ми почками проживала проточной водой. Каддый из них делили ка асти с одной почкой и стерилизовали в течение ганутц в 70^-ком таноле, затек в растворе /0,03$/ азотнокислого серебра /с добаз» энием б первом а во втором случае по 2 ил дэтергэнта sraai -SO/, родслхительность стерилизации от 5 до 10 мапут, в зазисалгоста от ктогеиетическах особенностей исходного г/лтеркала. Поело 4-5-крат-эй промывки ь стерильной дистиллированной тзода материал готов дда

введения в культуру in vitro . Все последующие операции по язвле чениа экспланта и изолированию его на питательную среду осущест] лились в асептических условиях«

Установлено, что оптимальными эксплактами для получения бе: вирусного суперэлиткого материала розы и последующего его размнс жепия елупат меряетематичеекнв ткани и вегетативные почки с шщ «цжгхом здоровых растений о Важно отметить, что мериетематические ткани следует вычленять из вегетативных побегов, а почка с микре щитком - с цветоноса в период окрашвання бутона. Е противном cj чае выращенные in vitro растания-регенвранты могут иметь во вре цветения аномальные отклонения.

Питательные среды. Питательная среда включает: минеральные ли, витамины, углеводы, аминокислоты и регуляторы роста. Нами рг работало 3 оригинальных рецепта для дифференциации тканей, пролк ферации адвентивных почек и ризогенеза0 основу которых составляв питательная среда Мурасиге-Скуг /табл. 11/.

Таблица 11

Составы питательных сред для клонального мккроразмножвиия розы, мг/л

Компоненты

!Дифференциа-!

• ция меряете-Шролифера-•матичеокой !ция и раз-!ткани и на- 'множение !чало проли- ! ¡Ферации !

Ризогенез

Макроэлементы: ин.но,

4 3 КМ03

КЬ.2Г04

СаС12«2Н20

MgSCy7H20

Ре-холлат:

Ыаг-ЕМА

PeSO^.thoo

Микроэлементы:

н3во3

MnSO..2Н„0

4' •

1650 1900 J.70 440 370

37,3 27,8

6,2' 22,3

3

1650 1900 170 440 370

37,3 27,8

6,2 22.3

825 950 85 220 185

37,3 27,8

6,2 22,3

Продолкение таблиш 11

1 ! 2 ! 3 ! 4

8,6 8,6 3,6

л 0,83 0,83 0,63

1а2Мо04«2Н20 гиБО^.Э^О 0,25 0,25 0,25

0,025 0,025 0,023

¡©СИ^б^О 0,025 0,025 0,025

рганические вещества:

якотановая кислота 0,5 0,5

яридсксин=нс1 0,5 0,5 . -

'иашн-нсх 1,0 1,5-2,5

'ибофламш 0,1 0,1

!а=лантотзкат 0,5 » -

,-глютемин 095 - -

¡езоакози? 100 40 -

деккн сзрнокислнЯ 10 - -

&к 0,02 0,25 1,0

1-вддолилмасляная кислота - 1,0

1 БАП 0,5 1,0-1,5 -

Захарова 30000 зоша зшоо

1гар 7000 7000 7000

)Н 5,7

!ййтозшш_айсш[мш?а<> Разздтнэ успешно щк»эз&-ю при температуре 23°С, 14-часовоа фояопзрнодэ о освацваназт&и ЮОО-ЗООО лко

Нздукдия пролиферации адвентавнах побегов дрн умоЕКях

)тэчалась спустя 5 дней от начала введанкя экснлаата яа зузз среду о Наиболее интенсивная пролиферация пазушная лечена у сортов с краской ж розовой окраской даиэстков иэета&о .Соэффициэнт раашюжзшя розы у сортов Звезда 0етября„ Коршшсвнй Сюрприз достигав® 1:7, у других - 1г50

Наш разработан оригинальный способ шкроразышаэжа .ргза а условиях ±п.-И.&ГО /рас» 7/, который позволяет: та одаой, й^гэтаайа^ яой почки получить неограниченное число побегов а расдавк£-р?г<?йе*> рантов.

способы размножения ьезвирусньк i

в условиях. !'il vitro

t-'LA

ft

•ь

ч

Безьирусный цветонос

I -

d

Р\

$4

Jo \

ш

¿Ж-} %

технология клонального никророэмножвния

ш

оригинальный способ шрораэнножения РОЗЫ in vitro

тестироьание w но отсутствие

ВИРУС 06

Рис. 7.

Определявшими факторами культивирования растешй-рагзаерантов являются осзэщзнкость" и температура» Удлинение фотопериода отрицательно сказывается на состоянии многочисленных побегов, Они гслоро-злт, листья осыпаются. Аналогичное изменена^ происходя? щ>2 теюге-ратурном sspsnaia»

Термотерапия.. in TiAro.., В случае размножения ir. rxt-o аара~ • жзнного вирусными болезнями наиболее ценного катерпгла проводится терглотерэлияо

Для термотерапии in vi-irc используются побеги и растэнся-ре-генерантыо долученнне. з культуре из одной почка. Замечено, -:то гшеропобзги poss менее реагируют на экстремальные условия з i-ормо*-камера з течение 5 недель/. После термотерапии добеги пасси-

ровали ка еззжзпригетовленкне среда.

Спустя 4 недоди проводили тестирование на отсутствие .-¿агрусоз по методике0 описанной з раздело 5.1. 'Тестирование исходного материала", Ретестирзвакие проводится через 2 тасяца поело агадтагих растений in tívo о

ЕШЯШМЗ.а» Специфика его заключается ь том а что у од:-ж сортов, кал Клдаеитина, Сэлена» КсраллоааЯ Cupcpzs, для вддукзди не-обхода«.« присутствие з питательной среде одновременно двух аухеи-нова ПУК в концентрации 0,5 глг/л и ШК - 1 иг/л. У других сортов-Звезда Октября, Крм-Кри, Роял Хагнегз - спустя 2-3 надели ноязлязт-ся хорозо развитая корневая система, если з питательную среду вводится один из yi-сазакных ауксинов в концентраций ?. мг/л„ pesorsnes протекал лучпе, если колбы с растениями находилась при бслаэ нхзхкх тзмпзратурах /8°С/ с освещенностью 800-1000 лк* Продолкагаяькость развития •растекий-рзгзнерантов - 3-4 месяца,,

тенкя-рох'знзран-

ты шшфовага в вазона 0,25 л, паполнешше смесью торфа к перлита в соотношении 1:1. Затем их помещали под плзкочнне узрнткя :-:а 1012 дней, В период'адаптации поддергивали темтратуру 23-25°С5 совете нисеть 2000-3000 ж, фотопериод 16 часов» 3 течения 3-4 недель растения адаптируются.

Репетирование растений. Проварка на отсутствия кгрусол осу-'"" щестзлялась по общепринятой схеме, Ретостирование проводятся через 2 месяца после адаптации растепий-регензрантоВс,-В наших условиях все полученные и размноженные растенья билн здоровыми«,

От момента изолировавля ткани исходного растения до лояуезннл

кондиционного безвирусного посадочного материала проходит, в зав семости от времени года и сортовых особенностей, 6-7 месяцев. Та кие растения вскоре зацветают. -Растения и цветы обладают высокими качественными показателями.

7. Защита безвирусных цветочных растений от повторного заражения

Эффективная защита растений от вирусных инфекций, в том чис ле и реынфекций, включает в себя комплекс мероприятий, направлен шх главным образом на ограничение распространения вирусов и 605 бу о переносчиками /Мэтьюз, 1973; Власов, 1974; Митрофанова, Про Еенко, 1975; Митрофанова, Кольцова, 1978; Макутенайте-Навалинске на, 1981; Кеглер, Кляйнхемпель, Эртель и др»,, 1986/.

Переносчиками вирусов хризантемы /tav , cbv , tsvvv , tnv , AMY „ СMV /, гвоздики / CarVMV, CarERV , CarRSV, CarNFV , CarLV amv /, гиплеаструма /cmv /, гиацинта /нуkv , trv /, лшши / lsv, lrs7 , cmv , tbv / и ряда других культур являются в основном тля Ш нематоды /Schmelzer , Schmidt , Wolf, 1977; Глтрофанова, Зле!; ко, 1881; Strider , 1985; Власов, Теплоухова, Ларина и др., 199С на антуриуме Андрэ /Anthurium mosaic virus / - белокрылкн /Herol 1957/,

В борьбе с насекомыми, повреждающим растения, применяются различные инсектициды. Чтобы уничтожить насекомых, причиняющих * кой-лкбо культуре прямой ущерб, необходимо снизить численность к популяции до порогового уровня вредоносности,при котором этот ущерб уже на будет иметь экономического значения. Гораздо более сложной прсблэмой является борьба с насекомыми-переносчиками buj сов, так как для распространения вируса достаточно, даже минимал! ного числа особей /Кэтьюз, 1973/.

Поэтому при выращивании каждой репродукции /iaq, \lj бе; вирусных меристбмных растений гвоздики, хризантем, розы, антуриума Авдрз и других культур открытого и закрытого грунта не допустимо наличие фитофагов-переносчиков вирусов.

Исходные безвирусные маточные растения должны выращиваться отдельных вазонах /контейнерах/ и в изолированных от переносчикс

зплицах или сооружениях, оборудованных специальной сеткой или леночными укрытиями. Сточные растения супер-суперэлиты л супер-литн используются а течение года, в зависимости от биология раз-ития культуры, ео продуктивности.

Систематический фитовирусологический контроль за состоянием астений позволяет своевременно обнаружить возможную резнфехцию, спользуя экспресс-методы тестирования, и удалить больше расте-яя, а также провести анализ на наличие в почве нематод рода Ьоп-;id.orus К Xiphir.ema о

Одним из первоочередных мероприятий от вторичной янфекщш зи-усов безвирусных растений язляется уничтожение сорняков-рэзерва-оров вирусов, как поблизости от теплиц к питомников, так и в са-шс посадкахо Особенно опасна мокрица /stcllaria media /, виды хе-оподиевых /Chanopodium ар» /' и другие дикорастущие сорные расте-ая„ которые могут быть растениями-хозяевами для многих вирусов веточных культур.

В борьбе с насоко[иш1-переносчика.мк вирусов не реже двух раз месяц, с учетом продолжительности действия препарата, проводят прнскивание внутри и вокруг теплил и питомников. Испэльзукт так-э биопрепараты /См. список инсектицидов и биопрепаратов, опубли-:заяный в журнале "Защита растений", 1992, & 4/,

Для борьбы с нематодами в теплицах почву обеззараживают да-эм, прогретым до 95-100°С, а в открытом грунте используют фуми-злты и нематициды, разрешенные к применению /См. список...» яур-ал "Защита растений", 1992, $ 4/.

Интенсивное размножение элитного материала цветочных культур условиях производства также предусматривает проведение фатосаяи-грных мероприятий от возможного повторного заражэнЕя и расщ>ост~ анения вирусов. Поэтому необходима пространственная изоляция ;лэа~ j посадками элитных маточных растений и шращивавшх культур vs. зетение. Химическая борьба с тасексч/шш-переносчикеш вирусов я кегоднач смена участков для борьбы с нематодами"повышает декора™ 1вность а ¡сачастзо цветочной продукции.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. В результате исследований.проведенных в течении 1974-1991 выявлены в идентифицированы 33 возбудителя вирусных болезней важнейших зрошшленных цветочных культур, 14 из которых ранее неизвестны или малоизвестны на Украине и в Крыму: CarERV , CarLV , СагйЗУ с CarNî'V 0 BYMY , CEV , Chrysanthemum rosette virus , An-thurivms mosaic virus, RYMV , HSV , LRSV , LSV , ORSV , СybiTV .

2„ Установлены новые растения-хозяева неспецифических вирусов: AMV /хризантема, гвоздика, роза, тюльпан/, tnv /тюльпан, хризантема/, srv/гиацинт, тюльпан/,cmv /антуриум Андрэ, хризантема,, гапаеаструм/.

Зо Выявлены вирусы, причиняющие значительный экономический ущерб вегетативно размножаемым цветочным культурам,вызывая потери иж декоративных качеств, снижение урожая цветочной нродукции / от 50 до 70%/ и выревдение сортов.

4. Экспериментально подтверждено наличие вирионов в меристе-матических тланях больных растений гвоздики /С&mv / и цимбидиума /OHSV/'» что доказывает их инфекциоиность.

5. Изучены и определены оптимальные режимы термотерапии растений в зависимости от видового состава вирусов, их термостойкости и термотолерантности культуры: температура 37°С, экспозиция 1,5-4 месяца, освоенность - 4-6 тыс. лк, фотопериод 14-16 часов. Ятя культур,, чувствительных к повышенным температурам /угнетение роста растений/, щюбодвтся термотерапия in vitro.

6. Показана эффективность применения хемотершши /виразол в концентрации 20-50 иг/л / для ингибирования вируса кольцевой пятнистости одонтоглоссума в меристематической ткани цкмбидиума in vitro /100$/ и оздоровлонля вегетативных почек розы в условиях in vitro , зараженных вирусами мозаики /72,8^/.

V. Аьачиз результатов сравнительной оценки методов оздоровлений цветочных растений показал, что раздельное применение меристег ной культуры, термотерапии, хемотерапии не позволяет достичь удовлетворительного уровня освобождения растиний от ьирусных инфекций Более того, способствует их распространению /культивирование али-кальной меристемы, изолированной с больного растения/.

8. Разработаны оригинальные биотехнологичеекпе приемы мккро-размножония безвирусной розы, хризантемы, гвоздики, глппеаструма /принципы отбора гкеплантов - происхождение, размер, сроки вычлеш

тя; синтетические питательные среды для индукции морфогенеза; veno вия содержания растений-регенерантоз ж их адаптация in vivo Л обеспечивающие высокий коэффициент размножения генетически однородного материма /можно получить сотни и тысячи расгенЕЙ-регэнзриктов/.

9. Определена продолжительность культивирования тканей к получения растениЯ-регенерантов: у гвоздики и хризантемы •• 1,5-2 ыэ-гяца; розы - 4,5 месяца; лилии, гиацинта, гиппээструма - 3-4 месяца и у антуриума Андрэ - 3-10 месяцев,

10. Разработаны 3 оригинальных состава питательной среды для получения и размножения in vi-tro 20 сортов розы /Климзктина,, Сурок, Коралловый Сюрприз, Куии Элизабет & др./ и 2 - для клонально-го мщфоразмножения безвирусной хризантемы /Аксилял, Арден и др0/»

11. Установлена зависимость увеличения ростового индекса протоке рмо в цимбидиума от сочетаний углеводов /24,5 г/л глюкозы

4,5 г/л сахарозы/ и фитогормонов / 1 иг/л КАП + 1 иг/л Ю'К / в питательной среде MS и Knudson "О" в напей модаб^кацин.Стимулирующее действие на рост корней цимбидиума окэзала 3-ивдголил=масляная кислота в концентрации 0,1 мг/л, на ризогеиез розы - совмзсзксэ применение НУК.и ИМК в равных соотнсшнкях /1:1/, обэепв'шзагцйе высокий коэффициент размножения генетически однородного матарашш.

120 Впервые теоретически обоснована и практически установлена возможность гарантированного освобоядешш цветочных растений о? вирусов на основе разработанной концептуальной модели системы,, состоящей из блоков-мзтодов: тестирования растений на вирусы, тормо° или хемотерапии в условиях in vi-tro или in vivo „ культуры ткани и регенерации растений„ адаптации растешзй~рэгенэрантов in vivo, ретестирования адаптированных растений, сертификата бэзвирускык растений /супер-суперэлмта, суперэлита, элита/, цредсхавлязлих единый бмотехнологичвекий процесс,

13. Разработаны, усовершенствованы и внедрены технологии колу-чения ббзвируского посадочного материала и его клоналького шкрЬ= размножения 8 экономически ваннше цветочных культур /гвоздика, хризантема, щшбидаум, роза, антуриум,Андрэ, лилия, гиащга, гип-пеаструм/. Уровень рентабельности от внедрония технологий а производство составляет 70-110$«

По данным базовых хозяйстб •• Акционерного общества яЗлата" /бывший совхоз "Ораняерейшй ксмилекс" Московской области/ ц Рао~ публиканскогс концерна "Крымзеленстрой" /г. Симферополь/ - чксгыЭ

доход от внедрения технологий составил более 1 млн. руб. в каждом кг них, в ценах 1990 года.

РЕКОМЕНДАЦИЙ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Методические указания по ограничению распространения вирусных болезней луковичных и клуйнелукоЕичных цветочных культур /Митрофанова О.Б., Пропенко А.2. - Ялта: ГНБС, 1975/.

2. Методические, указания по диагностике болезней цветочных культур и мерам борьбы с ними /¡Митрофанова О.В„, Кольцова A.C. -Ялта, 1977/.

3. Методические рекомендации по размножению безвируснсго посадочного материала гвоздики сэдоеой группы СИМ /Утверждены \'лн-комхозом Украины / /Митрофанова 0.3., Кудрявцев И.П., Швец A.B., Ильннцкий O.A. и др./ - Ялта: ГНБС, 1980.

4. Методические рекомендации по диагностике болезней гвоздики и мерам борьбы с ними /Митрофанова О.В., Зленко И .Л. - Ялта, 1981/

5„Технология получения и псаневого размножения безвирусного антуриума Апдрэ /Митрофанова О.В., Иванова H.H. и др. - Экспресс информация ЦБНТИ Минкидкомхоаа РСФСР, 1985/.

в. Рекомендации по получению исходного оезвирусного посадочного материала хризантемы /Утверждены НТО Госагропрома ссср/ /Митрофанова О.В., Соболева Л.Е.» Феофилова Г.Ф. и др. - 1/ахарад-зе-Анасеули, 1987/.

СГШСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Митрофанова О.В., Васильева Л.И. Вирусная мозаика гладиолусов в Крыму // Еюлл.Гос.Никит.ботан.сада.-1374.-Вып.3 /25/0-

С.<35-48.

2. Митрофанова О.В, Болезни гвоздики и меры борьбы с ними // Цветоводство.-19753.-0.17.

3. ¡Литрофанэна О.В. Яоракаемость тюльпанов вирусной мозаикой

е Крыму // Тез .докл. У1 Зсесоэтз.совещания до иммунитету сельскохозяйственных растений. - 'п., 1.975.-С.311-312.

<1. Митрофанова О.В., Бурдзйный A.A. Вирусные болезни декоративных растений // Сб. материалов Ol координационного совет, пс залшге декоративных растений от вредителей, болезней и сорчякоь в ботанических садах СССР. - Киев: Наукова думка,1977.-С.44-4G.

5. Митрофанова О.В., Бурдейная В.И. О технологии получения беэвирусной гбоздики садовой группы "Сим" // Выращивании цветочных культур меристеыным способом: Ннуч.-практич.конф. - Рига, 1Э77. -0.21-2?.

6. Митрофанова О.В. и др. Разработка технологии колучеши боз-вирусной гвоздики сортотипа Сим /Митрофанова О.В., Ангиликаторо-

ва И.В., Смирнова Т.А., Куклина О.В. // Еюлл.Никит.ботап.сада.-1977.-Вып.3 /34/.-С.36-40.

7. Митрофанова О.В., Смирнова Т.А., Ильницкий O.A. Термотерапия плюс меристекная культура // Цветоводство.-197o.--J? З.-с.31-12.

Ь. Митрофанова О.В. Зашита цветочных растопил от Селезней и вредителей // Цвет для вашего сада. - Симферополь: Такрля, 1970,-С.137-154.

9. '.'itrophanova O.V., Oertel С. Ernte schritte чиГ аетп У.'э^с einer Zuüammer.arbeit der ViruefreimHChung von Zierpflanzen Nikitzki Botanischen Garten Jalta. - Forschungslabor fiii Viruskraakh^iten bei Zierpflenzen in VbB i'AC - Jungpflauzen Dresden // Gartenbau.-iyai.-Bd.28, H.1.-S.29-30.

10. Митрофанова О.В. Диагностика вирусных болезней хриз^нтеуы // Сб.нг.уч.тр. ПЪС "Интродукция, биология и селссшл цветочных растений". - Ялта, 1981.-С.122-133.

11. Митрофанова O.D.. Смирнова I.A. Вирусные болезни гвоздики сортотипа Сим и получение безяирусного посадочного материала //Эффективность защиты иьтродуцированных растений о: вредных организмов. - Киев: Нг-укова ду;л:а, .-С.63-ьо.

12. Митрофанова О.Й., Кольцова A.C., ¡'канона L..I. Методические гекэмеидолы: по культуре тюльпана г Крыму. - ллтаЛЗоЬ.-чо с.

1С. '.'о.тчанов E.'i>., Соболева Л..-J., Хларсфакои.-г О.В. Мпкрораэ-у.ноженио гадких декоративных растении // 11о0ТС130Д0Т1Ю.-15->\.-№ О.--С.13-14.

14. Митрофанова О.В., Соболева Л.л. Роле с ни и пути оздоровление герберн в Крчму //То,'.докл. 1 ?».с:-рсc:i,\е.".со. и:;, 1(y. 'Мьгрэдуми'Я и техноло.г.'л Быр;.1!и1!за1-и.ч горбеоы". - Гнггг. о::::;, vi-i., 1Л|4 .-С .3l>-37.

ij. Мптрифановг; О.В. и ар. Т, >:но."ог :.-: по.-уени;- ооя&'руского

материала хризантем /Митрофанова Q.B., 3ji3Hko И0Л.„ Воронова И„В., Соболева Л.Е. // Экспресс информация ЦБНТИ Миняилкомхоза РСФСР,-1S34.-» 14, syiicS,™1S с.

16. Соболева Л0Е.„ Митрофанова О.В. Методические рекомэнда-шга: по размкснзшш цветочных растений /гвоздики, хризантемы, фре-езгар бромелий/ in -/i-cro . - Ялта; изд-ео ГНБС„ 1985. - с.

17. Митрофанова 0оВ. в др. Диагностика вредителей и болезней иадашуеов к борьба с ними /Митрофанова 0«Бо, Ыатрофанов В.К„, Тка^ж ВоК.» Соболева Л.Е. // Экспресс информация ЦБНТИ Миюкил-аожога РСФСР.12 13 с,

18« Митрофанова 0„В. р др« Получение баззирусного посадочного материала хризантем« Д^трофанова О.В., Зленко И„Л., Феофиловз Г„Ф., Соболева Л.Е. //Цвзто£одстзо0-1385.-й 4,-С.11-12.

1S« Митрофанова G«B.р Мустефин А.М. Технологии выращивания oessïpycHCvc антуриума Андрэ // Тр ЛЬпмт .бота::.саца.-1£85.-Т.97.-Со115-124.

20. Митрофанова О.В. Производство на безвирусную сснову // Цветоводство.-1986.1„-С.15-16.

21. Митрофанова О.Б., Иванова H.H. Микроразмножекие бегонии Элатнор // Цветоводство .-1386 ,,-fê 60-С.12-13.

22. Митрофанова Goß» Разработка биотехнологии ускоренного размножения в стерильной культуре цветочных растений на безвирус-яой основе // Всесокз.конф. "Состояние и перспективы развития сельскохозяйственной биотехнологии". ВАСХНИЛ: Материалы докл. -Д., 198G о =С »101-104.

23. Митрофанова 0,В.: Иванова H.H. Получение безвирусных клонов луковичных цветочных культур // Бюлл.Никит.ботан.сада.-1937.-йш.62.-С „37=41.

24. Митрофанова О.В.,, Ткачук Д.К„ Защита цветочных и декоративных растений от болезней и вредителей // Цветы в вашем саду.-Симферополь: Таврия, 1588»-С.175-183.

25. Митрофанова O.E. Гарантия успеха - здоровый посадочный материал // Цветоводство„-1988„-й 1.-0.13.

26. Митрофанова 0оВ. Безвирусшэ луковицы tn vitre .//Цветоводе хво.-138Э.-Je 2о

27. Митрофанова 0оВ. Вирусные болезы* и пути оздоровления декоративных растений-интродуцонтов // Роль ботанических са;;св в охране и обогащении растительного-мара: Тез.докл. •- Киев, 1939.-

Г.2.-С J 57=158 о

28» Митрофанова O.S. к ду. Методические рекомендации пэ комплексной защите клематисоа от предателей к болезней /Митрофанове. О,ВЧ Зегдина СоН.0 Митрофанов В.И.. Бескаравайнэь. М.А., Ткачук В.К., До-«такина Е.Л, - Ялта, 1990. - 33 с.

29. Шевелуха Б.О., Митрофанов Boll., Митрофанова О.В. Регул«-хия устойчивости агродендроценозов в связи с экологической безопасностью // Сельскохозяйственная биология»-1991.-й 5.-0.130-146.

30. Mitrophanova O.Vo0A modal ci a zjatsr? fer eonvarsion eS .?Iorloulture to the virus-free basis Ii Int.Syrap0 "Згоэй±пз,propagation, Dis3a.se control of Giaasfceusa ílowsre arid othsr 0:жэ;глг-tai Plantas Thessfio-Salaspile, LatvJa.-1991 .-?°50=-51 a

31. Mitrophanova 0„V. Theoretische Bsgrita&jn®; ¿as1 M?¿re±tmg 2ierpílanzan von Virsn // Thssaa der sraisn gessastdawtschsn Tagung der Arbeitslsraijss íílanzsmrlroiogy iu Bresdsn-ïillsita«-1991.-S„12=13o

32. Мзтрофачоза С0Во„ Митрофанова II.В., Иванова H.K» Об уело-зшх пролиферации лрзтехормов цембздаута // Бюлл.&лгет.бо^аы.еэда.-L991. -Bti п „ 71 .-€„44=48.

33. Митрофанова 0<,В„ Вирусные болезни промнгаланнш: «ультур н биотагкологЕ^эсйнеприема оздоровления. - М.: №ЗШ, I.S92.- Дза. В 1729-Ю2. - 20S с.