Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Вирус мозаики коровьего гороха как вектор для получения рекомбинантных антигенов вирусов гепатита B и гриппа A в растениях
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Вирус мозаики коровьего гороха как вектор для получения рекомбинантных антигенов вирусов гепатита B и гриппа A в растениях"
На правах рукописи
003470062
Мещерякова Юлия Александровна
Вирус мозаики коровьего гороха как вектор для получения рекомбинантных антигенов вирусов гепатита В и гриппа А в
растениях
03.00.03 - Молекулярная биология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
1 ^ т и..
Москва - 2009
003470062
Работа выполнена в группе гетерологичной экспрессии Центра «Биоинженерия» Российской Академии Наук и в отделе Биохимии Центра Джона Иннеса, Норвич, Великобритания.
Научные руководители:
Кандидат биологических наук Эльдаров Михаил Анатольевич, Профессор
Ломоноссофф Джордж (Lomonossoff George)
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, профессор Кущ Алла Александровна Кандидат биологических наук Каплан Игорь Борисович
Ведущая организация:
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
Защита диссертации состоится 2009 г. в часов на
заседании совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ. НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, Лабораторный корпус А, ауд. 536.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук
[.А. Крашенинников
Актуальность работы Возможность использования растений в качестве биореакторов для получения различных рекомбинантных пептидов и белков является предметом интенсивных исследований на протяжении последних 20-ти лет. Такой интерес обусловлен известными преимуществами растительных экспрессионных систем, такими как безопасность, экономичность, возможность получения значительных объемов биомассы, наличием систем посттрансляционных модификаций целевых белков.
Среди трех основных методов получения рекомбинантных белков в растениях, таких как генетическая трансформация ядерного и хлоропластного генома, особое место занимают транзиентные системы экспрессии, основанные на использовании автономно реплицирующихся вирусных векторов.
Амплификация целевого гена при репликации вирусного вектора в клетке растения в сочетании со способностью многих вирусных векторов вызывать системную инфекцию обеспечивает высокий уровень экспрессии в сравнительно короткий промежуток времени. Генно-инженерные манипуляции относительно просты в силу небольшого размера геномов вирусов растений.
К настоящему моменту создано множество различных векторных систем на основе вирусов растений различных семейств, которые широко используются как в фундаментальных, так и прикладных исследованиях. В то же время, до сих пор отсутствуют четкие критерии выбора оптимальной векторной системы для экспрессии того или иного целевого белка. В этой связи, интересным является сравнение эффективности различных векторных систем для экспрессии одного и того же полипептида, а также изучение влияния инсерции гена целевого белка на характер развития вирусной инфекции. Особый интерес представляет использование растительных вирусных векторов как инструмента для создания «съедобных» растительных вакцин. Способность многих структурных вирусных белков к самосборке в регулярные макромолекулярные структуры приводит к образованию вирусоподобных частиц (ВПЧ), не содержащих вирусных нуклеиновых кислот, но сохраняющих свои антигенные свойства. Разработка кандидатных вакцин, в том числе для «орального» применения, на основе полученных в растениях ВПЧ является привлекательной альтернативой традиционным вакцинам.
Одна из первых и наиболее популярных систем транзиентной экспрессии в растениях основана на использовании вируса мозаики коровьего гороха (Cowpea mosaic virus, или CPMV).
CPMV - типичный представитель семейства комовирусов, содержит две геномных РНК положительной полярности. РНК-1 кодирует белки, обеспечивающие
репликацию обеих РНК и протеолитический процессинг полипротеинов-предшественников, РНК-2 кодирует белок, обеспечивающий межклеточный транспорт вируса и белки оболочки. СРМУ. заражает несколько видов овощных культур, но наибольшего титра достигает, размножаясь в природном хозяине - Vigna ип^кгйша. Вирусная частица содержит по 60 копий большого Ь (37 кДа) и малого Б (23 кДа) белков оболочки, образующих сферический капсид, обладающий икосаэдрической симметрией.
Эффективность СРМУ как вектора для получения как высокоиммуногенных химерных вирусных частиц, несущих эпитопы различных инфекционных агентов человека и животных, так и для экспрессии свободных полипептидов, была неоднократно продемонстрирована. В то же время, многообразные возможности использования векторных систем на основе СРМУ, закономерности формирования химерных иммуногенных частиц СРМУ, влияния различных инсерций на генетическую стабильность и инфекционность химерных вирусов до сих пор остаются недостаточно исследованными. Цели и задачи работы
Целью настоящей работы являлось создание векторных систем на основе СРМУ и X-Вируса Картофеля (Х-ВК) для получения в растениях важных диагностических и протективных антигенов вирусов гепатита В человека и вируса гриппа человека и птиц типа А и исследование их сравнительной эффективности. Для этого в работе решались следующие задачи:
1. Конструирование и сравнительный анализ эффективности векторов экспрессии HBcAg в растениях на основе СРМУ и Х-ВК.
2. Исследование характера развития инфекции, а также способности к самосборке HBcAg в тканях растений при его синтезе СРМУ или Х-ВК векторов.
3. Исследование возможности использования новой векторной системы на основе делеционного варианта РНК-2 СРМУ для оптимизации процедур выделения чистых препаратов ВПЧ HBcAg.
4. Создание системы презентации эпитопов внеклеточного домена М2 белка вируса ТрйпшГА человека и птиц на основе СРМУ!
5. Исследование иммуногенных и протективных свойств внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа А человека в составе частиц СРМУ при иммунизации мышей препаратами химерных вирусных частиц.
Научная новизна
Впервые показано, что экспрессия HBcAg в растениях под контролем СРМУ и Х-ВК сопровождается выраженными отличиями как в уровне экспрессии белка
нуклеокапсида, так и в характере развития вирусной инфекции. Впервые установлено, что обе векторные системы приводят к накоплению в тканях растений HBcAg, сохраняющего способность к самосборке в ВПЧ. Создана генетически безопасная система экспрессии на основе делеционного варианта РНК-2 CPMV, позволяющая эффективно получать препараты ВПЧ HBcAg, свободные от вирусных частиц вектора экспрессии.
Также в настоящей работе впервые была создана система презентации внеклеточного домена матриксного М2 белка вируса гриппа А (М2е) на основе CPMV с целью продукции данного пептида в растениях V.unguiculata в составе химерных вирусных частиц. Антигенные и иммуногенные свойства полученных химерных вирусных частиц были исследованы в опытах по иммунизации мышей и показано, что такие частицы способны индуцировать образование анти-М2е антител и обеспечивать частичную защиту лабораторных животных от инфекции низкими дозами вируса гриппа. В то же время, сниженная инфекционность и слабая иммуногенность полученных химерных вирусов указывают на необходимость дальнейшей оптимизации фитовирусных систем презентации М2е-эпитопов для возможного использования растений в качестве альтернативного источника противогриппозных вакцин. Практическая значимость Разработанные векторные системы экспрессии ВПЧ HBcAg и методы выделения таких частиц позволяют относительно быстро и недорого получать препараты как нативных ВПЧ HBcAg, так и оценивать способность к самосборке различных вариантов химерных ВПЧ на его основе для различных диагностических целей и иммунологических исследований, а также возможного использования в качестве вакцин. Полученные системы могут быть использованы для наработки в тканях растений и выделения в препаративных количествах ВПЧ других вирусов.
Апробация работы и публикации
Материалы диссертации были представлены на 7-ой школе-конференции молодых ученых, «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2003 г.), а также на международной конференции «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2008). По материалам диссертации было опубликовано 3 статьи в российских и зарубежном журналах. Структура и объем работы
Диссертация изложена нг^ЗДгтраницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, разделов «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», выводов и списка цитированной литературы, включающегося/ссылки, ¿таблицы рисунки.
Результаты и обсуждение Получение вирусоподобных частиц' нуклеокапсида (HBcAg) Вируса Гепатита В человека в растениях с помощью вирусных векторов на основе Х-ВК и полноразмерной РНК-2 СРМУ
Выбор именно HBcAg для экспрессии в растениях с помощью вирусных векторов продиктован рядом причин.
Во-первых, HBcAg является высокоиммуногенной полимерной структурой, стимулирует как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ. Во-вторых, при экспрессии в различных системах (дрожжевых, бактериальных и т.д.) НВсА£ способен к самосборке с образованием стабильных вирусоподобных частиц, при этом сами по себе частицы не являются инфекционными. Структура НВсА§ в достаточной степени толерантна к инсерциям пептидов и полноразмерных белков в различных позициях. Как следствие, рекомбинантные ВПЧ на основе НВсА§ находят широкое применение в качестве экспериментальных вакцин против целого ряда заболеваний, в частности, против малярии, гепатита С, гриппа А, а также в качестве компонента альтернативных иммунологических тест-систем для диагностики различных заболеваний (Тзис1а еХ а1., 1998). В-третьих, для выделения и очистки таких вирусоподобных частиц разработаны различные относительно простые методики.
Для получения препаратов рекомбинантного HBcAg были разработаны системы экспрессии на основе Е.соН, дрожжей, клеток животных и трансгенных растений. Однако на момент начала данной работы возможность использования фитовирусных векторов для получения вирусоподобных частиц НВсА§ в растениях не исследовалась. Конструирование векторов экспрессии HBcAg на основе СРМУ и Х-ВК.
В данной работе была использована векторная система экспрессии полипептидов на основе полноразмерной РНК-2 СРМУ, совместимая с методом агроинфильтрации. В полученной конструкции (Рис 1.Б.) ген НВсА§ клонирован «в рамку» с ОРС (открытой рамкой считывания) РНК-2 СРМУ через каталитический 2А-пептид вируса ящура. В данной системе 2А пептид обеспечивает протеолитическое расщепление с эффективностью до 90%. При этом на И-конце белка нуклеокапсида сохраняется один остаток пролина от 2А-пептида (ворта^ е! а1., 2002).
Для создания системы экспрессии НВсА§ на основе Х-ВК был использован
популярный вектор РУХ201, содержащий полную кДНК-копию генома Х-ВК,
клонированную между 35 в промотором вируса мозаики цветной капусты (СаМУ) и
поБ-терминатором (ВаикотЬе е1 а1., 1995). В полученном векторе РУХ201/соге
(Рис.1.А) экспрессия НВсА§ осуществляется под контролем дуплицированного
4
субгеномного промотора гена белка оболочки через синтез и трансляцию дополнительной субгеномной мРНК.
Pol TGB core CP 35S ,-А-% nos «
ЕГ>1 II-UU^^U ф PVX201/core А
Pro Pol
. nos
I m pBlnPS1-NT
Б
VPg
2A
MP LCR SCP I core
35S _ „„„
P^l M pßlnPS2/core
=bcl Ара! SUA Asel
Рисунок 1. Схема векторов экспрессии HBcAg. (А) схема вектора PVX201/core. Положение инсерции (заштриховано) между тройным блоком генов (TGB) и геном белка оболочки (СР). Дуплицированный субгеномный промотор показан стрелками. (Б) Схема векторной системы на основе CPMV, которая состоит из РНК-1 дикого типа и модифицированной РНК-2 (RNA-2/core), содержащей инсерцию гена HBcAg (заштриховано). Также показаны участки генома CPMV, кодирующие кофактор протеиназы (РгоС), хеликазу (Hei), связанный с геномом вирусный белок (VPg), протеиназу (Pro), полимеразу (Pol), транспортный белок (МР), большой (L) и малый (S) белки оболочки. Сайт Apal GGGCCC кодирует дипептид G-P по которому происходит каталитическое расщепление 2А пептида.
Заражение растений Nicotiana benthamiana и Vigna unguiculata полученными векторными конструкциями и характер развития симптомов вирусной инфекции
Характерные симптомы вирусной инфекции на растениях N. benthamiana, механически инокулированных препаратом плазмидной ДНК PVX201/core, появлялись на 10-12- ый день после инокуляции и развивались несколько медленнее, чем на контрольных растениях, зараженных исходным вектором PVX201 (Рис.2).
А
Рисунок 2. Симптомы инфекции на растениях Ы.ЬемИаппапа, инокулированных вектором РУХ201/соге. А- растения, инокулированные вектором РУХ201/соге, Б-растение, инокулированное контрольным вектором РУХ201, В- здоровое растение.
Важно отметить, что вектор РУХ201/соге был способен вызывать системную инфекцию в инокулированных растениях. ОТ-ПЦР анализ препаратов суммарной РНК, выделенной из инокулированных и системных листьев Ы.ЬеШкттапа, подтвердил стабильность инсерции гена HBcAg в составе вируса РУХ201/соге по крайней мере в
Рисунок 3. ОТ-ПЦР анализ стабильности инсерции HBcAg в химерном вирусе PVX201/core Дорожки: 1-препарат РНК из здорового растения, 2- препарат РНК из системного листа, 3- препарат РНК из инокулированного листа, 4- препарат РНК из листа, инокулированного исходным вектором PYX201.
Для заражения растений V. unguiculata использовали метод агроинфильтрации смесью двух культур агробактерий Agrobacterium tumefaciens LBA4404, трансформированных векторной конструкцией pBinPS2NT/core и pBinP-SINT (Liu and Lomonossoff, 2002), содержащей полноразмерную копию РНК-1 CPMY. Из агроинфильтрированных листьев готовили грубый экстракт, который далее использовали для заражения здоровых растений. Первые симптомы инфекции появились к 10-ому дню после инокуляции, однако системная инфекция на неинокулированных верхних листьях не наблюдалась вплоть до 30-ого дня после инокуляции, после чего дальнейшее наблюдение не проводилось.
Дальнейшие исследования систем экспрессии полипротеинов с использованием полноразмерной РНК-2 CPMV, включающие этап агроинфильтрации, показали, что агроинокулированные растения V.unguiculata очень редко проявляют видимые симптомы инфекции. Вероятно, это обусловлено невысокой эффективностью образования функциональных репликонов, и поэтому требуется дополнительный пассаж вирусных частиц, полученных из агроинфильтрированных листьев в виде грубого экстракта, на здоровые растения для получения достаточных количеств материала для дальнейшего исследования.
ОТ-ПЦР анализ суммарной РНК, выделенной из инокулированных листьев, показал наличие инсерции гена белка нуклеокапсида (данные не показаны).
Таким образом, несмотря на отсутствие системной инфекции, этот вирусный вектор может быть использован для серийных пассажей с целью получения достаточного количества материала вирусоподобных частиц HBcAg для дальнейших иммунологических исследований.
ходе одного пассажа (Рис.3).
Ml 2 3 4
Исследование экспрессии белка нуклеокапсида в растениях, инфицированных полученными вирусными векторами
Вестерн-блот анализ препаратов суммарного белка, полученных из листьев растений Ы.ЬешЬат1апа, инфицированных векторной конструкцией РУХ201/соге с использованием aнти-HBcAg поликлональных антител кролика показал накопление белка нуклеокапсида в инфицированных тканях (Рис.4.А).
3_
2 — **1Щ"»
2— " I-»
-НВсАд 21 —
_S-2A-HBcAg?
— НВсАд димер
_НВс Ад-мономер
Рисунок 4. Вестерн-блот анализ экспрессии HBcAg в растениях. А- Растения N.benthamiana, препараты суммарных белков. Дорожки: 1,8 - здоровое растение, 2 -растение, инфицированное вектором PVX20!, 3-7 - растения, инфицированные вектором PVX201/core, 9 - положительный контроль, 400 нг рекомбинантного HBcAg, выделенного из Pichia postons. Б - Растения V.ungiiiculata Дорожки: 1 - препарат частиц CPMV дикого типа, 2,3 - рекомбинантный HBcAg из Pichia pastoris 2,6 мкг и 6,5 мкг соответственно, 4- препарат, очищенный из инфицированных вектором листьев растений коровьего гороха, трансфицированных векторами pBinPS2NT/core и pBinP-S1NT. Показаны положения маркеров мол.веса, димеров и мономеров HBcAg.
Сравнение интенсивности полученных сигналов для разных растений позволило заключить, что уровень экспрессии HBcAg варьирует от 50 до нескольких сотен мкг HBcAg на 1 г листьев. Синтезируемый в данной системе HBcAg не подвергался значительной протеолитической деградации.
Экспрессию HBcAg в растениях V. vnguiculata удалось детектировать только в препаратах, обогащенных с помощью дифференциального центрифугирования экстрактов из инфицированных листьев (Рис.4.Б), что косвенно указывало на его присутствие в форме вирусоподобных частиц. Присутствие в полученных образцах димерных форм HBcAg согласуется с данными о том, что сборка нуклеокапсида происходит через этап димеризации белка нуклеокапсида (Zhou and Standring, 1992). Другие выявленные высокомолекулярные формы нуклеокапсида (Рис.4.Б) вероятнее всего являются продуктами неполного протеолитического расщепления гибридного белка S-2A-core (Gopinath et al., 2000). Выход частично очищенных частиц HBcAg составил приблизительно 10 мкг на 1 г веса свежего листа коровьего гороха.
Идентификация вирусоподобных частиц HBcAg методом иммуносорбентной электронной микроскопии
Способен ли экспрессируемый в растениях белок нуклеокапсида к самосборке с образованием вирусоподобных частиц HBcAg?
Иммуносорбентная электронная микроскопия (КЕМ) препаратов, полученных из растений Н.ЬепМат'шпа и У.ип^сгЛыа, инфицированных полученными конструкциями, показала наличие вирусоподобных частиц, по морфологии сходных с частицами HBcAg из ЛраяГот (Рис.5). В материале, полученном из растений У.ип^киЫа, (Рис.5.В) также обнаруживалось значительное количество частиц СРМУ, выделенных вместе с частицами НВсА§ при дифференциальном центрифугировании.
Таким образом, совокупность полученных нами данных показывает, что белок нуклеокапсида экспрессируется как в составе вектора на основе Х-ВК в растениях N. ЪепАат^апа, так и в составе вектора на основе полноразмерной РНК-2 СРМУ в растениях Умп^асЫма, сохраняя при этом способность к самосборке в вирусоподобные частицы НВсАд.
Уровень экспрессии НВсА§ под контролем Х-ВК вектора оказался выше, чем для вектора на основе СРМУ. Более того, векторная конструкция РУХ201/соге способна вызывать развитие системной инфекции, что указывает на то, что инсерция гена НВсА§ не препятствует процессам и репликации и транспорта рекомбинантного вируса. Инфекция, вызываемая вектором на основе СРМУ, ограничена только инокулированными листьями. Причины отсутствия системного транспорта в данном случае до конца не ясны, но маловероятно, что это напрямую связано с размером инсерции гена НВсАд, поскольку аналогичный вектор на основе СРМУ с инсерцией близкого по размерам гена зеленого флуоресцентного белка (вРР), сохраняет способность к системной инфекции в растениях У.ип^сиЫа (ОортаШ е! а1., 2002).
Несмотря на более высокую эффективность в плане уровня экспрессии НВсА§, Х-ВК как вектор экспрессии имеет ряд недостатков, ограничивающих его применение для получения потенциальных вакцинных пептидов и белков. Во-первых, из-за наличия дуплицйрованного субгеномного промотора в~ таких векторах возможна потеря инсерции в результате гомологичной рекомбинации.
А 200 км Б 200 нм В 200 нм
Рисунок 5. Иммуносорбентная электронная микроскопия препаратов HBcAg. А-рекомбинантный HBcAg из P.pastoris, Б -сок растения, инфицированного вектором PVX20)/core, В - частично очищенный HBcAg из растений V.unguiculata, инфицированных вектором pBinPS2NT/core . Черные стрелки показывают частицы HBcAg, белые-частицы CPMV.
Во-вторых, круг хозяев Х-ВК, и, следовательно, векторов на его основе, ограничен в основном растениями, богатыми токсическими алкалоидами, а это требует дополнительного этапа очистки препаратов получаемых белков перед экспериментами по иммунизации животных. В этом отношении вектора на основе CPMV являются более предпочтительными, т.к. заражают съедобные растения. Кроме того, показано, что химерные вирусы на основе CPMV безопасны при инъекции экспериментальным животным (Lomonossoff and Hamilton, 1999).
В целом же, тот факт, что два различных вирусных вектора могут обеспечивать экспрессию белка нуклеокапсида, способного к самосборке с образованием ВПЧ, позволяет предположить, что для решения подобных задач может быть использован достаточно широкий спектр векторных систем на основе разных вирусов.
Экспрессия HBcAg с помощью векторной системы на основе делеционного варианта РНК-2 CPMV
Общей проблемой векторов на основе полноценных вирусов растений, способных к системному транспорту и образованию инфекционных вирусных частиц, является проблема генетической безопасности, связанная с возможностью попадания рекомбинантных вирусов в окружающую среду. Если задачей является получение чужеродных вирусоподобных частиц, то дополнительным недостатком данной системы оказывается невозможность отделить при центрифугировании вирусоподобные частицы от собственно вирусных частиц CPMV, образующихся в ходе инфекции.
Для преодоления этих проблем на следующем этапе работы была использована новая система экспрессии на основе делеционного варианта РНК-2 CPMV.
Идея создания такой системы основана на данных, что последовательности, необходимые для репликации РНК-2 CPMV, находятся в 5'- и З'-нетранслируемых областях (НТО), большая же часть ОРС может быть удалена без нарушения способности к репликации (Rohll, et al., 1993). Поскольку 5'-участок, отвечающий за репликацию, продолжается за пределы первого AUG-кодона (положение 161), трансляция белка интереса должна инициироваться с AUG в положении 512.
В составе полученного нами вектора экспрессии рВтРДсоге (рис.6.Б) ген HBcAg, помещенный «в рамку» с AUG 512 РНК-2, находится под контролем 5'- и 3'-НТО РНК-2 CPMV, расположенных между 35S промотором и nos-терминатором в составе бинарного вектора pBINPLUS.
Поскольку в таком делеционном векторе отсутствует участок, кодирующий супрессор сайленсинга, расположенный в С-концевой кодирующей последовательности малого белка оболочки, в состав системы экспрессии кроме РНК-1 CPMV необходимо вводить еще один дополнительный компонент - супрессор сайленсинга НсРго из Y-вируса картофеля (Рис.6.В) (Cañizares et al., 2006).
proc Hel Pro Po[ 35S _______ nos
Г"
P.Tcl SlíBspH] A sel
Hcol
35 S HcPro CaMVterm
Pací 161 512 ¿sel
pB¡nPS1-NT A
pBin A core Б
pBin61-HcPro В
pBin P1-GFP
Рисунок 6. Схема конструирования векторной системы экспрессии HBcAg на основе делеционного варианта РНК-2 СРМУ.
Агроинфилы рация растений N.benthamiana и анализ экспрессии HBcAg
Для индукции экспрессии HBcAg растения N.benthamiana инокулировали смесью трех культур агробактерий, трансформированных бинарными векторами рВтРДсоге (Рис.б.Б), pBinP-SINT (Рис.б.А) и pBIN6IHcPro (Рис.б.В), что обеспечивает одновременное введение в растение собственно вектора экспрессии на основе РНК-2, РНК-1 и супрессора сайленсинга НсРго, необходимых для вирусной инфекции. Для мониторинга экспрессии использовали вектор pBinP-1-GFP (Рис.6. Г) на основе делеционного варианта РНК-2 (Cañizares et al., 2006) . Экспрессия GFP в данной системе может быть зафиксирована с использованием УФ источника уже на 2-3 день после агроинфильтрации, и достигала пика на 5-6 день (рис.7).
А Б В
Рисунок 7. Внешний вид растений N. ЬешЬапиапа через 5 дней после агроинфильтрации векторными конструкциями рВтР-ЬОБР (Б) и рВтРДсоге (В). А-лист здорового растения.
Экспрессия рекомбинантного HBcAg была детектирована в препаратах суммарных белков инфильтрированных растений (рис.8.А), но не во фракции растворимых растительных белков (не показано), что могло свидетельствовать о том, что большая часть синтезируемого в растениях HBcAg находится в составе ВПЧ. Вестерн-блот анализ материала, полученного методом дифференциального центрифугирования, выявил присутствие белков, соответствующих по размеру как мономеру HBcAg (21 кДа), так и его димерам (рис 8. Б). Присутствие димеров является косвенным указанием на образование ВПЧ в ходе экспрессии HBcAg в растениях.
1 2 3
1 2 3 4 5
47 47
32 32
25 25
16 16
Рисунок 8. Вестерн-блот анализ экспрессии HBcAg в N. ЬепЛситапа после агроинфильтрации вектором рВтР/Дсоге. А-Суммарные белки. 1 -инфицированное растение, 2 -здоровое растение, 3 -HBcAg из Б- Очистка HBcAg.
1- маркеры мол.веса, 2- HBcAg из Р.рда/ога, 3-экстракт суммарных белков здорового растения, 4-экстракт суммарных белков растения, инфицированного вектором рВтР-1-ОРР, 5-очищенный препарат ВПЧ HBcAg после дифференциального центрифугирования.
Электронно-микроскопическое исследование препаратов частиц HBcAg
Для окончательного подтверждения того, что белок нуклеокапсида способен к самосборке в ВПЧ при экспрессии в данной системе, материал, полученный в результате дифференциального центрифугирования, был исследован методом трансмиссивной электронной микроскопии. Было выявлено присутствие ВПЧ HBcAg, по морфологии сходных с частицами контрольного препарата рекомбинатного HBcAg (рис.9. А).
Высокоочищенный и концентрированный препарат частиц нуклеокапсида был получен методом центрифугирования в градиенте сахарозы (рис.Э.Б).
А юо нм Б юо нм В
Рисунок 9. Электронно-микроскопический анализ препаратов ВПЧ HBcAg А-Препарат после дифференциального ц\ф, Б- После центрифугирования в градиенте сахарозы В- иммуноэлектронная микроскопия с антителами на с/е 1 эпитоп. Стрелками указаны частицы HBcAg.
Иммунологическая аутентичность полученных ВПЧ НВсА§ был показана с помощью иммуноэлектронной микроскопии с использованием моноклональных антител на В-клеточный иммунодоминантный с/е1 эпитоп, экспонированный на поверхности нуклеокапсида (рис.9 В).
Полученные данные позволяют заключить, что образующиеся в растениях вирусоподобные частицы HBcAg корректно собираются в ходе экспрессии и сохраняют иммунологические свойства, характерные для HBcAg.
Таким образом, новая система экспрессии на основе делеционного варианта РНК-2
СРМУ позволяет в достаточно короткие сроки получить ВПЧ HBcAg в растениях
И.ЬеМИат1апа, идентичные по своим иммунологическим свойствам частицам,
полученным в других системах экспрессии. Основное отличие данной системы
экспрессии от ранее использованной системы на основе полноразмерной РНК-2 СРМУ
состоит в том, что в данном случае не происходит образования и транспорта вирусных
частиц СРМУ, т.к. из РНК-2 удалены гены, кодирующие транспортный белок и белки
оболочки. Такая система экспрессии является генетически безопасной, т.к. исключает
12
возможность попадания рекомбинантных частиц CPMV в окружающую среду. Кроме того, с помощью данной системы экспрессии можно получить чистый препарат HBcAg для иммунологических исследований, свободный от примесей частиц CPMV в значительно более короткие сроки, чем при использовании системы на основе полноразмерной РНК-2 CPMV.
Данная система экспрессии открывает возможность исследовать образование в растениях ВПЧ и других вирусов, что особенно важно для тех вирусов, которые невозможно культивировать в лабораторных условиях, оценивать иммунологические и антигенные свойства таких частиц, исследовать влияние различных инсерций на их способность к самосборке.
Система презентации внеклеточного домена М2-белка вируса гриппа А на основе CPMV
Грипп - одно из самых распространенных и заразных вирусных заболеваний человека, поражающее в течение сезонных эпидемий до 10-20% мировой популяции, приводящее к 250-500 тыс. смертей ежегодно. Приблизительно 250 млн. доз противогриппозных вакцин производится ежегодно. Их протективность у детей и взрослых варьирует от 60 до 90 % . Все коммерческие противогриппозные вакцины содержат ГА (гемагглютинин) в качестве протективного антигена и должны обновляться почти каждый год, чтобы соответствовать антигенным изменениям актуального эпидемического штамма вируса.
В связи с этим интенсивно исследовалась возможность создания противогриппозной вакцины широкого спектра действия, содержащей консервативный вирусный антиген. Перспективным кандидатом для создания подобной вакцины является матриксный М2-белок вируса гриппа А. М2 белок присутствует в небольшом количестве в составе вирусных частиц, а на поверхности инфицированных клеток формирует ионные каналы, необходимые для обеспечения важного для последующей репликации вируса гриппа этапа внутриклеточной дезинтеграции вируса. Аминокислотная последовательность наружного домена М2 белка (М2е) является высококонсервативной и практически не изменилась с момента выделения в 1933 году первого вируса гриппа типа А человека. Цель данного этапа работы заключалась в создании системы презентации внеклеточного домена М2-белка вируса гриппа типа А (М2е-пептида) человека и птиц на основе вируса мозаики коровьего гороха, выделении и изучении иммуногенных и протективных свойств химерных вирусных частиц. Эффективность CPMV в качестве носителя чужеродных эпитопов для создания кандидатных вакцин была неоднократно продемонстрирована в ряде исследований (Dalsgaard, et al., 1997; Monger et al., 2006). В случае успеха данная система
презентации эпитопов открыла бы возможность использования растений в качестве недорогого источника противогриппозных вакцин.
Конструирование системы презентации М2е эпитопов
Большинство систем презентации эпитопов на основе CPMV сконструированы таким образом, что последовательность эпитопа расположена между Ala 22 и Рго23 (ÍB-PC петли S-белка оболочки, т.к. данный участок является максимально экспонированным на поверхности вириона. Для наработки химерных вирусных частиц в растениях сконструированы удобные вектора, содержащие полноразмерные кДНК-копии РНК-1 и РНК-2 CPMV между 35 S промотором и nos-терминатором в составе бинарного вектора pBINPLUS, позволяющие использовать метод агроинфильтрации для заражения растений. Данная система презентации (Рис.10) и была использована в настоящей работе для получения химерных частиц CPMV с М2е эпитопами вирусов гриппа человека и птиц и исследования их иммунологических свойств.
Сконструированная плазмида pBinPCP2-M2eH содержит модифицированный ген S-белка CPMV с инсерцией синтетической последовательности М2е эпитопа вируса гриппа человека SLLTEVETPIRNEWESRSNDSSD. В «консенсусной»
последовательности М2е эпитопа вируса гриппа человека остатки цистеинов в положениях 17 и 19 заменены на серины. Плазмида pBinPCP2-M2eA содержит модифицированный ген S-белка CPMV с инсерцией синтетической последовательности М2е эпитопа вируса гриппа птиц SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD. Полученными векторами трансформировали реципиентный штамм A.tumefaciens LBA4404 для проведения агроинфильтрации растений.
Характер развития вирусной инфекции при заражении растений V. unguiculata и стабильность рекомбинантных вирусов
Симптомы вирусной инфекции на растениях V.unguiculata, инокулированных смесью культур агробактерий, трансформированных конструкциями pBinPCP2-M2eH и pBinP-Sl-NT, либо pBinPCP2-M2eA и pBinP-Sl-NT, появлялись на 15-ый день, как и на растениях, повторно зараженных экстрактами, полученными из первично инокулированных растений (рис 11.А).
РгоС Не1 Рго Ро1
ЗбЭ .............._....._. П05
I ■:■:■:■:[=.д, РВтРв1-мт Урд
355 МР 1СР 5СР „„
' Ц ' Ю pBinPS2.NI
Я I. Ь - А 1 АО С Р V С А Е А Э£> ввТТСССвСТ ТвСТТввАвС ТАТАвСАСАА С(ЗАССТвТТТ бТССТвААвС СТСАвАТвТв
НЬе1
У 5 Р С МХА 5 Т Р ТАТАвСССАТ СТАТБАТАвС ТАбСАСТССТ
Р Т Я N Е»Е С Н С ССбАССАвАА АСвАвТССвА АТвТСвТТОС
ТА VI Е О I I N С АСАвСАвТДА СТТТТОАСТТ ААТСААССвС
N'.41 У N Р Р ААХАСбСАСА ТТТАТААТСС ТССА
Р Л Я Ь ЬТЕ V Е Т ССТбСТАбСТ ТССТвАССвА АвТбвААЛСА
АаЬХХ
Я Ю 5 Б Ъ Р ¥ 5 Р V АОТвАТТСвА ЭССАСССАТТ ТТСА5АС6ТС
К I Т Р V • О С N К ААААТААСГС СТ6ТТ<3<ЗТ6А ГбАСААТТвб
\/923
Рисунок 10. Система векторов для получения химерных частиц СРМУ в растениях. А- схемы «кассет экспрессии» геномных РНК-1 и РНК-2 СРМУ в составе бинарных векторов. Обозначены гены структурных и неструктурных белков СРМУ и участок рВ-(ЗС петли 8-белка, используемый для инсерции эпитопов. Б- Участок кодирующей последовательности плазмиды рВтРСР2-М2еА с инсерцией М2е эпитопа (жирный шрифт) вируса гриппа птиц в последовательность Б-белка СРМУ (курсив). Указано положение сайтов клонирования №1е1 и АаШ, и праймеров, использованных для ОТ-ПЦР.
А Б
Рисунок 11. Характер развития симптомов вирусной инфекции после заражения растений V. \mgu\culata экстрактами из растений, агроинфильтрированных векторами рВтРСР2-М2еН и рВтРСР2-М2еА. А-1-здоровое растение, 2-растение
инфицированное СРМУ-^, 3-растение инфицированное рВтРСР2-М2еН, 3- растение, инфицированное рВтРСР2-М2еА. Б-признаки системной инфекции на одном из 5 растений, инфицированном рВтРСР2-М2еН (19 дней после инфекции).
Признаки системной инфекции были выявлены на только одном из пяти растений, зараженных конструкциями рВтРСР2-М2еН и рВтР-51-МТ (рис.11.Б). ОТ-ПЦР анализ препаратов суммарной РНК, выделенных из листьев зараженных растений, показал наличие инсерции М2е-эпитопа в инокулированных листьях, однако в системных листьях растения, зараженного конструкцией рВтРСР2-М2еН, происходит потеря инсерции и реверсия к дикому типу (рис.12.А). Эти данные указывают на то, что конструкция рВтРСР2-М2еН нестабильна уже в первом пассаже и по каким-то причинам происходит нарушение системного транспорта рекомбинантного вируса в случае обеих конструкций.
Выделение и анализ рекомбинантных вирусных частиц
Из растений, инфицированных векторами рВтРСР2-М2еН и рВтРСР2-М2еА, были выделены препараты вирусных частиц. Выход рекомбинантного вируса СРМУ/М2еН составлял 33 мкг на 1 г свежей массы растений, тогда как СРМУ/М2еА-15 мкг на 1 г.
В качестве возможного объяснения такого различия можно предположить, что наличие двух остатков цистеина в последовательности М2е-эпитопа птиц вызывает образование более стойких агрегатов и, как следствие, затрудняет выделение химерного вируса. В целом же низкий выход химерных вирусов связан с отсутствием системного транспорта. Для сравнения укажем, что выход частиц СРМУ\у1 при проведении заражения контрольной конструкцией, содержащей полноразмерную кДНК-копию генома РНК-2 СРМУ дикого типа, составил 1 мг на г листьев.
Электрофоретический анализ препаратов полученных рекомбинантных вирусных частиц в ДСН-ПААГ (Рис.12.А-Б) показал наличие характерного для препаратов нативных и химерных частиц СРМУ набора продуктов протеолиза Э-белка. Дело в том, что в нативных препаратах при непродолжительном хранении Э-белок подвергается протеолизу, происходит отщепление С-концевых а.к.о. 190-213, экспонированных на поверхности вириона, что не приводит к нарушению целостности вирусной частицы.
В составе химерных частиц СРМУ/М2еН и СРМУ/М2еА выявляются как Э-белок оболочки, так и Б'-фрагмент, являющиеся результатом специфического протеолиза между двумя С-концевыми остатками любого чужеродного эпитопа, встроенного между А1а22 и Рго23 Э-белка.
Таким образом, С-коицевая часть химерного Б-белка оболочки (обозначаемая как Б') состоит из последнего а.к.о. эпитопа и 192 С-концевых а.к.о. Э-белка оболочки, тогда как N-концевой участок содержит последовательность эпитопа за исключением последнего а.к.о, связанную с 22 И-концевыми остатками Э-белка оболочки.
Рисунок 12. Анализ РНК и белков химерных вирусных частиц CPMV. А. ОТ-ПЦР анализ препаратов суммарной РНК, выделенной из растений V.unguiculata, инфицированных штаммами агробактерий с векторами pBinPCP2-M2eH+ pBinP-Sl-NT и pBinP-S2NT+pBinP-Sl-NT. Разделение ПЦР-продуктов в 1,5% агарозном геле. 1-дикий тип CPMV, 2-системный лист, 3-инокулированный лист, 4-препарат суммарной РНК для контроля возможной ДНК-контаминации. Б, В. Электрофореграммы разделения белков CPMV/M2eA (Б) и CPMVM/2eH (В) в 15% ДСН-ПААГ. Б:1-маркеры мол.веса 2,3-образцы частиц CPMV/M2eA, 4-CPMVwt. В:1-маркеры мол.веса 2-образец частиц CPMV/M2eH, З-CPMVwt. Указаны положения большого и малого БО (L- и S-соответственно). S'- продукт протеолитического расщепления эпитопа.
Для подтверждения интактности М2еН эпитопа в составе частиц CPMV/M2eH был проведен масс-спектрометрический анализ полученных препаратов CPMV/M2cH и немодифицированных частиц CPMV/wt.
Анализ полученных спектров позволил выявить характерные продукты протеолиза, соответствующие по молекулярной массе ожидаемым N- и С-концевым фрагментам S-белка CPMV с инсерцией эпитопа М2еН (Рис.13), а также минорные фрагменты, образованные, видимо, в результате неспецифического протеолиза при хранении препарата.
Электронно-микроскопический анализ полученных химерных вирусных частиц показал, что инсерция эпитопа не нарушает процесса сборки вирусных частиц и частицы обладают характерной для CPMV морфологией и размером (Рис.14).
4000 5000 8000 10000 12000
Рисунок 13. Масс-спектрометрический анализ белков препарата химерных частиц СРМУ/М2еН. А- интервал 2-12 кДа, Б- интервал 19-25 кДа. Пики 4590.119 (А) и 20881.683 (Б) соответствуют по молекулярной массе Ы- и С-концевым фрагментам, образовавшимся в результате специфического протеолиза Э-белка СРМУ с встроенным эпитопом М2еН (стрелками указаны продукты неспецифического протеолиза).
А Б В
Рисунок 14. Электронно-микроскопический анализ вирусных частиц. А- нативный СРМУ, Б - СРМУ/М2еН, В - СРМУ/М2еА.
Для исследования характера развития инфекции и степени стабильности химерного вируса в серийных пассажах, препараты вирусных частиц СРМУ/М2еН были использованы для заражения здоровых растений коровьего гороха. Симптомы инфекции на инокулированных листьях проявились на 15-ый день после инокуляции. Листья были собраны и использованы для получения препарата химерных вирусных частиц.
Как видно из результатов электрофоретического разделения белков в ДСН-ПААГ (рис. 15.А), во втором пассаже уже в инокулированных листьях наблюдается частичная потеря эпитопа и реверсия к дикому типу, т.к. препарат представляет собой смесь рекомбинантного вируса и вируса дикого типа.
ОТ-ПЦР анализ препарата РНК, полученного из вирусных частиц второго пассажа, также показал наличие двух продуктов, соответствующих по размерам фрагменту с инсерцией М2е-эпитопа и фрагменту, характерному для вируса дикого типа, получаемого при использовании данных праймеров (рис. 15.Б).
Выход химерных вирусных частиц С'РМУ/М2еН во втором пассаже составлял 220 мкг на 1 г листовой ткани, т.е. значительно выше, чем в первом пассаже.
Рисунок 15. Характеристика частиц СРМУ/М2еН «второго пассажа». А. Разделение белков химерных частиц в 15% ДСН-ПААГ. 1-маркеры мол.веса, 2-рекомбинантный СРМУ/М2еН, 3- С?ШЬЛ. ОТ-ПЦР анализ препарата РНК. 1-СРМУ/М2еН, г-СРМУШ, 3-ДНК-маркер
Иммуногенность химерных вирусных частиц СРМУ/М2еН И СРМУ/М2еА
Для оценки способности химерных частиц СРМУ/М2еН и СРМУ/М2еА к индукции специфических антител и выработке сывороточного иммунного ответа проводили подкожную иммунизацию беспородных белых мышей полученными препаратами, а также контрольным препаратом СРМУиЛ. В полученных сыворотках определяли титры специфических антител (^й) к М2е и СРМУ антигенам.
Полученные данные показали, что при подкожной иммунизации СРМУ/М2еН и СРМУ/М2еА эффективно индуцировали антитела против вирусных белков оболочки, однако титры анти-М2е антител были существенно ниже (Таблица 1).
Таблица 1. Титры ^С антител к белкам вирусных частиц и синтетическим пептидам М2е в сыворотках иммунизированных мышей_
Антиген для иммунизации Иммобилизованный антиген
CPMVwt С PMV/M2eH С PMV/M2eA G-18* G-17**
CPMV/M2eH 1:409600 1:409600 1:409600 1:800 1:100
СРМУ/М2еА 1:102400 1:102400 1:102400 1:100 1:100
Плацебо (физраствор) 1:100 1:100 1:100 1:100 1:100
*0-18 - планшеты с иммобилизованным синтетическим пептидом, соответствующим эпитопу М2еН, **С-17 - иммобилизованный пептид, соответствующий эпитету М2еА.
Выявленная таким образом низкая иммуногенность М2е эпитопа в составе химерных частиц СРМУ/М2еН не позволяла рассчитывать на эффективные
12 3 12 3
I ' —I В^^Ш - 200
т» -s' ■
протективные свойства полученного препарата. Эти предположения были подтверждены в опытах по заражению иммунизированных мышей летальными дозами вируса гриппа.
Изучение иротективиого действия препарата CPMV/M2eH на модели летальной гриппозной инфекции
Данные, представленные в таблице 2, показывают, что исследованный образец химерных вирусных частиц CPMV/M2eH после трехкратного подкожного введения обнаружил умеренное протективное действие от летальной гриппозной инфекции, вызванной LD7o патогенного штамма вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1). Количество выживших животных в контрольной группе, иммунизированной диким штаммом CPMV/wt на 14-е сутки после заражения, составила 33,3%, в опытной группе после подкожной иммунизации — 66,6%. После заражения вакцинированных животных вирусом гриппа LD<)0 протективное действие не было обнаружено.
Таблица 2.
Анализ протективности препарата М2е/СРМУ на мышах после заражения LD70
Группы мышей Вводимый препарат Количество выживших мышей на 14-е сутки Выжившие животные, %
Опытная M2e/CPMV 8/12 66,6
Контрольная CPMV/wt 4/12 33,3
Очевидно, что возможные причины негативного влияния встроенных М2е эпитопов на процессы репликации, сборки или транспорта полученных химерных вирусов требуют отдельного изучения. Однако следует отметить, что генетическая нестабильность и сниженная инфекционность - достаточно распространенная проблема при получении рекомбинантов CPMV с гетерологичными эпитопами.
В специальных исследованиях было показано, что как длина инсерции, так и ее заряд оказывают крайне существенное влияние на жизнеспособность и свойства рекомбинантных вирусов. При встраивании чужеродных эпитопов в область ßB-ßC_ петли S-белка оболочки только инсерции длиной не более 30 а.к. и с pi менее 8.0 обеспечивают выход вирусного потомства на уровне вируса дикого типа . Однако даже при соблюдении этих условий некоторые CPMV-химеры, например, с эпитопами ротавируса или вируса ящура, отличаются резко сниженной инфекционностью, или быстро теряют инсерции в серийных пассажах (Porta et al., 1994; Taylor et al., 1999). Аналогичными дефектами обладали и полученные нами вирусы СРМУ/М2еН и
CPMV/M2eA, хотя заряд (pl=4.1) и размер (23-27 а.к.о.) использованных М2е эпитопов находились в «допустимых» пределах.
Другое выявленное нами существенное ограничение CPMV как носителя М2е эпитопов - слабая иммуногенность встроенного М2е пептида и невысокая протективная способность полученных химерных частиц.
Причина слабой иммуногенности М2е-пептида в составе CPMV до конца не ясна, однако можно предположить, что это каким-то образом связано с конформацией, которую принимает данный пептид в результате протеолиза, характерного для систем презентации на основе CPMV (Lin et al., 1996), не приводящей к эффективной индукции иммунного ответа на данный эпитоп. Как показали некоторые исследования, изменение конформации эпитопа в составе CPMV приводит к потере его способности вызывать образование нейтрализующих антител. Протеолитическое расщепление на С-конце пептида в составе химерных частиц CPMV может быть некритично для иммуногенности линейных эпитопов, которые находятся в конформации, близкой к денатурированной, и может значительно нарушать иммуногенность конформационных эпитопов (Taylor et al., 2000).
Важность правильной конформации М2е пептида для обеспечения его иммуногенности была показана во многих работах, посвященных оптимизации системы презентации М2е пептида в составе частиц HBcAg (Jegerlehner et al., 2004).
Таким образом, полученные нами данные ограничивают перспективы использования CPMV для разработки эффективной системы презентации М2е эпитопов. Однако, как показывает недавняя работа по созданию химерных частиц на основе белка оболочки вируса мозаики папайи, несущих М2е эпитопы (Denis et al., 2008), использование других фитовирусных систем с иной архитектурой капсида и метода презентации эпитопов позволяет рассчитывать на более эффективное использование рекомбинантных вирусов растений для разработки альтернативных противогриппозных вакцин.
Выводы:
1. Впервые показана принципиальная возможность использования фитовирусных векторов для получения вирусоподобных частиц нуклеокапсида (HBcAg) вируса гепатита В в растениях N.benthamiana и V.unguicidata, а также разработан метод выделения таких частиц из растений с помощью дифференциального центрифугирования.
2. Создана эффективная и генетически безопасная система экспрессии и очистки HBcAg на основе делеционного варианта РНК-2 вируса мозаики коровьего гороха для получения в растениях препаратов вирусоподобных частиц нуклеокапсида.
3. Разработана система презентации внеклеточного домена М2е-белка вируса гриппа А человека и птиц на основе вируса мозаики коровьего гороха.
4. Инсерция последовательностей М2е эпитопов в область ßB-ßC петли малого белка оболочки CPMV оказывает негативное влияние на генетическую стабильность, репликацию и транспорт химерных вирусов CPMV/M2e.
5. Химерные частицы CPMV, несущие М2е эпитопы вируса гриппа, способны индуцировать образование специфических анти-М2е антител и вызывать частичную защиту лабораторных животных от инфекции низкими дозами вируса гриппа.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи
1. Mechtcheriakova I.A., Eldarov М.А., [Nicholson ~Ц Shanks М, Skryabin K.G., Lomonossoff G.P.(2006) The use of viral vectors to produce hepatitis В virus core particles in plants. J.Virol.Methods, 131,10-15.
2. Мещерякова Ю. А., Эльдаров M. A., Beales L., Скрябин К. Г., Lomonossoff G. P. (2008) Получение вирусоподобных частиц нуклеокапсидного белка вируса гепатита В в растениях с помощью вектора на основе вируса мозаики коровьего гороха . Вопросы Вирусологии, 3, 15-20.
3. Мещерякова Ю.А., Эльдаров М.А., Мигунов А.И, Степанова Л.А., Репко И.А., Киселев О.И., Ломоносов Д.П., Скрябин К.Г. (2009) Химерные частицы вируса мозаики коровьего гороха, несущие внеклеточный домен М2-белка вируса гриппа типа А: получение и характеристика. Молекулярная биология, 43. №4, стр.
Тезисы
1.Мещерякова Ю.А.,Равин Н.В., Позмогова Т.Е., Куприянов В.С, Николаева Л.А., ¡Новиков В.К.|, Эльдаров М.А., Атабеков И.Г.,Скрябин К.Г. (2003). Экспрессия антигенов и эпитопов вирусов гепатита В, С и Е человека в клетках М'сойапа яр. С использованием растительных вирусных векторов. Сборник тезисов 7-ой путинской школы-конференции молодых ученых, с. 117.
2. Мещерякова Ю.А., Эльдаров М.А., Скрябин К.Г., Ломоносов Д. (2008). Получение вирусоподобных частиц нуклеокапсида (НВсА§) вируса гепатита В человека в растениях с помощью векторов экспрессии на основе вирусов растений. Сборник тезисов Конференции "От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине, Судак, сборник тезисов, с.92.
Для заметок
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мещерякова, Юлия Александровна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Типы вирусных векторов для экспрессии пептидов и полипептидов в 8 растениях
1.2. Системы презентации эпитопов
1.2.1.Системы презентации эпитопов на основе палочковидных вирусов
1.2.2.Снстемы презентации эпитопов на основе сферических вирусов 16 1.3 Системы экспрессии полипептидов
1.3.1.Вектора, сконструированные по принципу «замена гена»
1.3.2.Вектора, сконструированные по принципу «дополнительный ген»
1.3.2.1.Системы экспрессии полипептидов на основе палочковидных вирусов
1.3.2.2.Системы экспрессии полипептидов на основе сферических вирусов
1.4. Получение вирусоподобных частиц (ВПЧ) в растениях с помощью вирусных векторов
1.5. Стратегии «full virus» и «deconstructed virus»
1.6. Векторная система на основе делеционного варианта РНК-2 CPMV
1.7. Системы презентации внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа А
1.8. Нуклеокапсид вируса гепатита В (HBcAg) человека как система презентации эпитопов и полипептидов
1.9. Вирусы растений и нанотехнологии 59 1.10 Заключение ^
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Растения и бактериальные штаммы
2.2. Животные
2.3. Штамм вируса гриппа
2.4. Питательные среды и антибиотики
2.5. Ферменты и коммерческие наборы
2.6. Реактивы и буфера
2.7. Синтетические олигопуклеотиды
2.8. Конструирование векторов экспрессии
2.9. Секвенирование ДНК
2.10. Приготовление компетентных клеток A.tumefaciens для электропорации
2.11. Трансформация A. tumefaci$ns и агроннфильтрация растений N. benthamiana и
V. шщшыйМа
2.12. Приготовление глицеринового стока культур АЛите/асгет
2.13. Приготовление грубого экстракта из листьев У.и
§шси1а1а для заражения здоровых растений
2.14. Выделение вирусных частиц СРМУ
2.15. Выделение РНК из вирусных частиц СРМУ для ОТ-ПЦР анализа
2.16. Частичная очистка ВПЧ НВс
§
2.17. Вестерн-блот анализ экспрессии белка нуклеокапсида в растениях Ы.ЬеШЬапиапа и 1т<^И1ск1а1а
2.18. Получение очищенных препаратов ВПЧ НВс
§
2.19. Иммуно-сорбентная электронная микроскопия (ШЕМ)
2.20. Трансмиссивная электронная микроскопия (ТЕМ)
2.21. Иммунологическое мечение золотом
2.22. Исследование нммуногеппых и протективных свойств химерных вирусных частиц СРМУ/М2е
2.22.1.Способ введения препарата, получение эмульсии, дозы и схема 71 иммунизации
2.22.2.Метод анализа специфических антител
2.22.3.Электронная микроскопия
2.22.4.Масс-спектрометрия
2.22.5.Статистический анализ
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение ВПЧ НВс
§ в растениях с помощью векторов на основе Х-ВК и полноразмерной РНК-2 СРМУ
3.1.¡.Конструирование векторов экспрессии НВс
§ на основе Х-ВК и СРМУ 74 3.1.2.Заражение растений Ы.ЬепШатйта и V.ип£шси1а1а и характер развития симптомов вирусной инфекции
ЗЛ.З.Исследование экспрессии белка нуклеокапсида НВУ в растениях
3.1 ^.Идентификация ВПЧ НВс
§ методом 1БЕМ
3.2. Получение ВПЧ НВс
§ с помощью векторной системы на основе делеционного варианта РНК-2 СРМУ
3.2.1.А.Конструирование вектора экспрессии НВс
§ на основе делеционного варианта РНК-2 СРМУ 84 З.2.1.Б. Конструирование вектора экспрессии НВс
§/М2е на основе делеционного варианта РНК-2 СРМУ
3.2.2.Агроинфильтрация растений N.benthamiana векторными конструкциями pBinP/Acore и pBinP/AcoreM2e и анализ экспрессии вариантов HBcAg
3.2.3.Электронно-микроскопическое исследование препаратов ВПЧ HBcAg
3.2.4.Исследование свойств ВПЧ HBcAg методом иммунологического мечения золотом 90 3.3. Система презентации внеклеточного домена М2-белка вируса гриппа А
М2е-эпитопа) человека и птиц на основе CPMV
3.3.1.Конструирование векторов экспрессии внеклеточного домена
М2-белка вируса гриппа А человека и птиц на основе CPMV
3.3.2.3аражение растений V. unguiculata и характер развития вирусной инфекции
3.3.3.Анализ генетической стабильности рекомбинантных вирусов
3.3.4.Выделение и анализ рекомбинантных вирусных частиц
3.3.5.Иммунизацияия мышей химерными вирусными частицами CPMV/M2eH и CPMV/M2eA
3.3.6.Изучение протективного действия препарата CPMV/M2eH на модели летальной гриппозной инфекции 101 ВЫВОДЫ 104 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 105 БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
HBcAg - нуклеокапсид (кор-антиген)
ВПЧ - вирусоподобные частицы
БО - белок оболочки
ОРС - открытая рамка считывания
А.к.о.- аминокислотный остаток
ВИЧ-1-вирус иммунодефицита человека тип pi - изоэлектрическая точка
ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения
НТО - нетранслируемая область
Трис - трис(оксиметил)аминометан
PBS - фосфатный солевой буфер
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ДСН - додецилсульфат натрия
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЭГ - полиэтиленгликоль п.н.- пар нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ОП - оптическая плотность
LD- летальная доза
ИФА - иммуноферментный анализ
ЭТС-эмбриональная телячья сыворотка
ТМБ-тетраметилбензидин
ГМО-генно-модифицированный организм
Введение Диссертация по биологии, на тему "Вирус мозаики коровьего гороха как вектор для получения рекомбинантных антигенов вирусов гепатита B и гриппа A в растениях"
Технология рекомбинантных ДНК открыла широкие возможности для создания систем экспрессии белков как для фундаментальных исследований, так и для практического применения в современной медицине, для получения вакцин, антител, гормонов для заместительной терапии, факторов роста и т.д. Большинство белков в процессе синтеза подвергаются посттрансляционным модификациям, таким как гликозилирование, отщепление сигнальных пептидов, образование дисульфидных связей и, как следствие, в активном состоянии могуг быть получены только в эукариотических системах экспрессии.
Первые эукариотические системы экспрессии были основаны на технологии "клеточных биореакторов" с использованием культур клеток млекопитающих[1], насекомых [2], дрожжей [3]. Однако стоимость рекомбинантных белков, получаемых с помощью данных систем, достаточно высока, а в случае использования клеток животных существует риск наличия в них вирусных патогенов, опасных для человека.
Наиболее перспективными являются системы экспрессии на основе высших живых организмов-трансгенных животных и растений. Если использование трансгенных животных не снимает проблем безопасности, связанных с риском заражения патогенами, то системы экспрессии на основе растений являются привлекательной альтернативой по ряду причин.
Во-первых, системы экспрессии на основе растений дают возможность получить значительные количества биомассы без сравнительно больших энергетических и денежных затрат и специального оборудования для ферментации.
Во-вторых, исключена возможность заражения патогенами, опасными для человека и животных. В-третьих, системы посттрансляционной модификации в растениях обеспечивают синтез функционально активных белков.
В настоящее время существует три основных метода получения рекомбинантных белков в растениях: стабильная генетическая трансформация ядерного генома, генетическая трансформация генома хлоропластов и использование векторов экспрессии на основе вирусов растений.
Генетическая трансформация подразумевает стабильную интеграцию целевого гена в хромосому растения, либо методом агробактериальной трансформации [4], либо с помощью биолистической трансформации [5]. Основным преимуществом данного подхода является то, что интегрированная последовательность стабильно наследуется. Однако, процесс регенерации трансформированных растений довольно длительный и сложный, может занимать от 6 недель до 1 года, в зависимости от вида растения. Экспрессия трансгена подвержена влиянию таких факторов, как число копий трансгена, эффект положения, сайленсинг. Основным же недостатком трансгенных растений в качестве источника рекомбинантных белков является низкий уровень экспрессии.
Трансформация генома хлоропластов позволяет значительно повысить уровень экспрессии целевого белка, в некоторых случаях до 46% от общего количества растворимого белка [6]. Этот метод позволяет избежать таких негативных явлений, как эффект положения и сайленсинг, и кроме того, исключает попадание трансгена в окружающую среду с пыльцой, т.к. хлоропласты у большинства растений наследуются только по материнской линии. Основным недостатком данного метода является отсутствие системы гликозилирования белков в хлоропластах, что значительно ограничивает его использование.
Несмотря на то, что трансгенные растения, полученные с помощью вышеописанных методов, успешно использовались для получения различных белков, длительное время, необходимое для их получения и анализа, является основным недостатком таких систем, особенно в случае, когда необходимо одновременно протестировать несколько различных кассет экспрессии.
Альтернативой генетической трансформации является использование векторов экспрессии на основе вирусов растений. Одним из главных преимуществ данного метода является то, что вирус размножается внутри инфицированной клетки, и, следовательно, ген целевого белка в составе вирусного генома амплифицируется в большом количестве копий, что в сочетании со способностью многих вирусных векторов вызывать системную инфекцию, обеспечивает высокий уровень экспрессии в сравнительно короткий промежуток времени. Генно-инженерные манипуляции с геномами растительных вирусов относительно просты в силу небольшого размера их геномов.
За редким исключением, большинство вирусов растений не интегрирует в геном клетки-хозяина. Таким образом, ген целевого белка не наследуется и не передается через семена. Это с одной стороны является недостатком данной системы экспрессии, но с другой стороны экспрессия не подвержена эффекту положения.
Данная система экспрессии, как и любая другая, не лишена определенных недостатков.
Существуют ограничения по размеру и сложности последовательностей, которые могут экспресспроваться в составе вирусных векторов без нарушения способности вируса к репликации, сборке и транспорту. Основная проблема, связанная с использованием вирусных векторов-проблема генетической стабильности. РНК-содержащие вирусы растений, на основе которых создано большинство существующих векторов экспрессии, мутируют с высокой частотой из-за ошибок, возникающих в процессе синтеза РНК с участием РНК-иолимеразы, вследствие чего ннсерция обычно модифицируется и нередко делегируется в процессе вирусной инфекции. Тем не менее, несмотря на все перечисленные недостатки, системы экспрессии с использованием вирусных векторов являются более предпочтительными в случаях, когда необходимо быстро протестировать большое количество векторных конструкций, получить белок для исследований в максимально короткие сроки, исследовать возможное токсичное воздействие экспрессии белка интереса на рост и развитие растения. Т.к. многие вирусы растений способны инфицировать широкий круг хозяев, одна и та же векторная конструкция может быть использована для изучения влняния эффекта хозяина на экспрессию целевого белка.
К настоящему моменту создано множество различных векторных систем на основе вирусов растений, которые успешно используются как для получения пептидов и полипептидов в растениях, так и в фундаментальных исследованиях для изучения механизмов экспрессии генов. В то же время, до сих пор отсутствуют четкие критерии выбора оптимальной векторной системы для экспрессии того или иного целевого белка. В этой связи, интересным является сравнение эффективности различных векторных систем для экспрессии одного и того же полипептида, а также изучение влияния инсерции гена целевого белка на характер развития вирусной инфекции.
Целью настоящей работы являлось создание векторных систем на основе вируса мозаики коровьего гороха (СРМУ) и Х-Вируса Картофеля (Х-ВК) для получения в растениях важных диагностических и протективных антигенов вирусов гепатита В человека (НВУ) и вируса гриппа человека и птиц типа А и исследование их сравнительной эффективности. Для этого в работе решались следующие задачи:
1. Конструирование и сравнительный анализ эффективности векторов экспрессии белка нуклеокапсида (НВсА§) в растениях на основе СРМУ и Х-ВК.
2. Исследование характера развития инфекции, а также способности к самосборке IIBcAg в тканях растений при его синтезе СРМУ или Х-ВК векторов.
3. Исследование возможности использования новой векторной системы на основе делеционного варианта РНК-2 СРМУ для оптимизации процедур выделения чистых препаратов ВПЧ НВсА§.
4. Создание системы презентации эпитопов внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа А человека и птиц на основе СРМУ.
5. Исследование иммуногенных и протективных свойств внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа А человека в составе частиц СРМУ при иммунизации мышей препаратами химерных вирусных частиц.
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Мещерякова, Юлия Александровна
ВЫВОДЫ:
1. Впервые показана принципиальная возможность использования фитовирусных векторов для получения вирусоподобных частиц нуклеокапсида (HBcAg) вируса гепатита В в растениях N. ЬеМИатгапа и V. иг^шси1Ша, а также разработан метод выделения таких частиц из растений с помощью дифференциального центрифугирования.
2. Создана эффективная и генетически безопасная система экспрессии и очистки HBcAg на основе делеционного варианта РНК-2 вируса мозаики коровьего гороха для получения в растениях препаратов вирусоподобных частиц нуклеокапсида.
3. Разработана система презентации внеклеточного домена М2е-белка вируса гриппа А человека и птиц на основе вируса мозаики коровьего гороха.
4. Инсерция последовательностей М2е эпитопов в область РВ-(ЗС петли малого белка оболочки СРМУ оказывает негативное влияние на генетическую стабильность, репликацию и транспорт химерных вирусов СРМУ/М2е.
5. Химерные частицы СРМУ, несущие М2е эпитопы вируса гриппа, способны индуцировать образование специфических анти-М2е антител и вызывать частичную защиту лабораторных животных от инфекции низкими дозами вируса гриппа.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мещерякова, Юлия Александровна, Москва
1. Hesse, F., Wagner, R. 2000. Developments and improvemenrs in the manufacturing of human therapeutics with mammalian cell cultures.Trends Biotechnol. 18(4): 173-80.
2. Kost, T.A, Condreay, J.P. 1999. Recombinant baculoviruses as expression vectors for insect and mammalian cells. Curr Opin Biotechnol. 10(5):428-33.
3. Eckart, M.R., Bussineau, C.M.1996. Quality and authenticity of heterologous proteins synthesized in yeast. Curr. Opin. Biotechnol. 7(5):525-30.
4. Horsh, R.B., Fry, J.E., Hoffmann, N.L., Eichholtz, D., Rogers, S.G., and Fraley, R.T., 1985. A simple and general method for transferring genes into plants. Science. 227: 1229-1231.
5. Christou, P. 1995. Particle bombardment. Methods cell biol. 50:375-82.
6. De Cosa, B., Moar, W., Lee, S.B., Miller, M., Daniell, H. 2001. Overexpression ofthe Bt cry2A2 operon in chloroplasts leads to formation insecticidal crystals. Nat. Biotechnol. 19(1):71-74.
7. Szeto, W.W, Hamer, D.H, Carlson, P.S, Thomas, C.A Jr. 1977.Cloning of Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) DNA in E. coli. Science. 8:196(4286):210-2.
8. Hull, R. 1978. The possible use of of plant viral DNAs in genetic manipulation in plants. Trends in Biochemical Sciences. 3: 254-256.
9. Porta, C. and G.P.Lomonossoff. 2002. Viruses as vectors for the expression of foreign sequences in plants. Biotechnol. Genet. Eng Rev. 19: 245-291.
10. Siegel, A. 1985. Plant virus-based vectors for gene transfer may be of considerable use despite a presumed high error frequency during RNA synthesis. Plant Molecular Biology. 4: 327-329.
11. Ahlquist, P, and Janda, M. 1984. cDNA cloning and in vitro transcription of the complete brome mosaic virus genome. Molecular and Cellular Biology. 4:2876-2882.'
12. Lomonossoff, G.P. and Johnson, J.E. 1996. Use of macro molecular assemblies as expression systems for peptides and synthetic vaccines. Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 176-182.
13. Dawson, W.O., Lewandowsky, D.J., Hilf, M.E., Bubrick, P., Raffo, A.J., Shaw, J.J., Grantham, G.L., and Desjardins, P.R. 1989. A tobacco mosaic virus-hybrid expresses and loses an added gene. Virology. 172:285-292.
14. Pogue, G.P., Lindbo, J.A., Garger, S.J., and Fitzmaurice W.P. 2002. Making an ally from an Enemy: plant virology and new agriculture. Annu.Rev.Phytopathol. 40:45-74.
15. Takamatsu, N., Watanabe, Y., Yanagi, H., Meshi, T., Shiba, T., and Okada, Y. 1990. Production of enkephalin in tobacco protoplasts using tobacco mosaic virus RNA vector. FEBS Lett. 269:73-76.
16. Turpen, T.H., Reinl, S.J., Charoenvit, Y., Hoffman, S.L., Fallarme, V., and Grill, L.K. 1995. Malarial epitopes expressed on the surface of recombinant tobacco mosaic virus. Biotechnology (NY). 13:53-57.
17. Fitchen, J., Beachy, R.N., and Hein., M.B. 1995. Plant virus expressing hybrid coat protein with added murine epitope elicits autoantibody response. F«ccme.l3:1051-1057.
18. Beachy, R.N., Fitchen, J.H., and Hein, M.B. 1996. Use of plant viruses for delivery of vaccine epitopes. Ann.N. Y. AcadSci. 792:43-49.
19. Bendahmane, M., Koo, M., Karrcr, E., and Beachy, R.N. 1999. Display of epitopes on the surface of tobacco mosaic virus:impact of charge and isoelectric point of the epitope on virus-host interactions. J.Mol.Biol. 290:9-20.
20. Jaspars, E.M. 1985. Interaction of alfalfa virus nucleic acids and protein. In "Molecular Plant Virology", vol.1. (J.W. Davies, Ed.) pp.151-221, CRC Press, Boca raton, Florida.
21. Modelska, A., Dietzschold, B., Sleysh , N., Fu, Z. F., Steplewski, K., Hooper, D.C., Koprowski, H., and Yusibov, V. 1998. Immunization against rabies with plant-derived antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:2481-2485.
22. Smith,G.P. 1985. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228: 1315-1317.
23. Jungbauer,A. and R.Hahn. 2004. Engineering protein A affinity chromatography. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 7: 248-256.
24. Werner, S., S.Marillonnet, G.Hause, V.Klimyuk, and Y.Gleba. 2006. Immunoabsorbent nanoparticles based on a tobamovirus displaying protein A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 103: 17678-17683.
25. Fernandez-Fernandez, M.R., Martinez-Torrecuadrada, J.L., Casal, J.I., and Garcia, J.A. 1998. Development of an antigen presentation system based on plum pox potyvirus. FEBS lett. 427:229235.
26. Fernandez-Fernandez, M.R., J.L.Martinez-Torrecuadrada, F.Roncal, E.Dominguez, and J.A.Garcia. 2002. Identification of immunogenic hot spots within plum pox potyvirus capsid protein for efficient antigen presentation. J. Virol. 16: 12646-12653.
27. Huisman, M.J., Linthorst, H.J., bol, J.F., Cornelissen, J.C.1988. The complete nucleotide sequence of potato virus X and its homologies at the amino acid level with various plus-stranded RNA viruses. J. Gen. Virol.69:1789-98.
28. Chapman, S., Kavanagh, T., and Baulcombe, D. 1992. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant Journal. 2: 549-557.
29. Baulcombe, D., Chapman, S., and Santa Cruz, S. 1995. Jellyfish green fluorescent protein as a reporter for virus infections. Plant Journal. 7: 1045-1053.
30. Santa Cruz, S., Chapman, S., Roberts, A.G., Roberts, I.M., Prior, D.A.M., and Oparka, K.J., 1996. Assembly and movement of a plant virus carrying a green fluorescent protein overcoat. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 6286-6290.
31. Koenig, R. and Torrance, L. 1986. Antigenic analysis of potato virus X by means of monoclonal antibodies./. Gen. Virol. 67:2145-2151.
32. Santa Crus, S., Roberts, A.G., Prior, D.A.M., Chapman, S. and Oparka, K.J. 1998. Cell-to-cell and phloem-mediated transport of potato virus X: the role of virions. Plant Cell. 10: 495-510.
33. Lee, A.G. 2003. Lipid-protein interactions in biological membranes:a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta 1612:1-40.
34. Scholthof, H.B., K.B.Scholthof, and A.O.Jackson. 1996. Plant virus gene vectors for transient expression of foreign proteins in plants. Annu. Rev. Phytopathol. 34: 299-323.
35. Hsu, H.T., Hsu, Y.H., Bi, I.P., Lin, N.S. and Chang. B.Y. 2004. Biological functions of the cytoplasmic TGBp 1 inclusions of bamboo mosaic potexvirus. Arch. Virol. 149: 1027-1035.
36. Yang, C.D., J.T.Liao, C.Y.Lai, M.H.Jong, C.M.Liang, Y.L.Lin, N.S.Lin, Y.H.Hsu, and S.M.Liang. 2007. Induction of protective immunity in swine by recombinant bamboo mosaic virus expressing foot-and-mouth disease virus epitopes. BMC. Biotechnol. 7: 62.
37. Russo, R., Burgyan, J., and Martelli, G.P., 1994. Molecular biology of tombusviridae. In "Advances in virus research", vol.44 (K. Maramorosch et al., eds.), pp. 381-428. Academic Press, New York.
38. Harrison, S.C. 1980. Protein interfaces and intersubunit bonding. The case of tomato bushy stunt virus. Biophys. J. 32: 139-153.
39. Olson, A.J., G.Bricogne, and S.C.Harrison. 1983. Structure of tomato busy stunt virus IV. The virus particle at 2.9 A resolution. J. Mol. Biol. 171: 61-93.
40. Scholthof, H.B., Monis, T .J., and Jackson, A.O., 1993. The capsid protein gene of tomato bushy stunt virus is dispensable for systemic movement and can be replaced for localized expression of foreign genes. Mol. Plant Microbe Interact. 6: 309-322.
41. Joelson, T., L.Akerblom, P.Oxelfelt, B.Strandberg, K.Tomenius, and T.J.Morris. 1997. Presentation of a foreign peptide on the surface of tomato bushy stunt virus. J. Gen. Virol. 78 ( Pt 6): 1213-1217.
42. Usha, R., J.B.Rohll, V.E.Spall, M.Shanks, A.J.Maule, J.E.Johnson, and G.P.Lomonossoff. 1993. Expression of an animal virus antigenic site on the surface of a plant virus particle. Virology 197: 366-374.
43. Porta, C., V.E.Spall, J.Loveland, J.E.Johnson, P.J.Barker, and G.P.Lomonossoff. 1994. Development of cowpea mosaic virus as a high-yielding system for the presentation of foreign peptides. Virology 202: 949-955.
44. Porta, C., V.E.Spall, T.Lin, J.E.Johnson, and G.P.Lomonossoff. 1996. The development of cowpca mosaic virus as a potential source of novel vaccines. Intervirology 39: 79-84.
45. Vos, P., Verver, J., van Wezenbeek, P., van Kämmen, A., Goldbach, R.1984.Study of genetic organization of a plant viral RNA genome by in vitro expression of a full-length DNA copy. EMBOJ. 3(13):3049-53.
46. Lomonossoff, G.P. and J.E.Johnson. 1996. Use of macromolecular assemblies as expression systems for peptides and synthetic vaccines. Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 176-182.
47. Lin, T., C.Porta, G.Lomonossoff, and J.E.Johnson. 1996. Structure-based design of peptide presentation on a viral surface: the crystal structure of a plant/animal virus chimera at 2.8 A resolution. Fold. Des 1: 179-187.
48. Taylor, K.M., Lin, T., Porta, C., A.G.Mosser, H.A.Giesing, G.P.Lomonossoff, and J.E.Johnson. 2000. Influence of three-dimensional structure on the immunogenicity of a peptide expressed on the surface of a plant virus. J. Mol. Recognit. 13: 71-82.
49. Porta, C., V.E.Spall, J.Loveland, J.E.Johnson, P.J.Barker, and G.P.Lomonossoff. 1994. Development of cowpea mosaic virus as a high-yielding system for the presentation of foreign peptides. Virology. 202: 949-955.
50. Taylor, K.M., C.Porta, T.Lin, J.E.Johnson, P.J.Barker, and G.P.Lomonossoff. 1999. Position-dependent processing of peptides presented on the surface of cowpea mosaic virus. Biol. Chem. 380: 387-392.
51. Cleveland, S.M., T.D.Jones, and N.J.Dimmock. 2000. Properties of a neutralizing antibody that recognizes a conformational form of epitope ERDRD in the gp41 C-terminal tail of human immunodeficiency virus type I. J. Gen. Virol. 81: 1251-1260.
52. Rennermalm, A., Y.II.Li, L.Bohaufs, C.Jarstrand, A.Brauner, F.R.Brennan, and J.I.Flock. 2001. Antibodies against a truncated Staphylococcus aureus fibronectin-binding protein protect against dissemination of infection in the rat. Vaccine 19: 3376-3383.
53. French, R., M.Janda, and P.Ahlquist. 1986. Bacterial Gene Inserted in an Engineered RNA virus: Efficient Expression in Monocotyledonous Plant Cells. Science 231: 1294-1297.
54. Mori, M., G.H.Zhang, M.Kaido, T.Okuno, and I.Furusawa. 1993. Efficient production of human gamma interferon in tobacco protoplasts by genetically engineered brome mosaic virus RNAs. J. Gen. Virol. 74 ( Pt 7): 1255-1260.
55. Sacher, R., R.French, and P.Ahlquist. 1988. Hybrid brome mosaic virus RNAs express and are packaged in tobacco mosaic virus coat protein in vivo. Virology 167: 15-24.
56. Takamatsu, N., M.Ishikawa, T.Meshi, and Y.Okada. 1987. Expression of bacterial chloramphenicol acetyltransferase gene in tobacco plants mediated by TMV-RNA. EMBOJ. 6: 307-311.
57. Dorokhov, Y.L., A.A.Sheveleva, O.Y.Frolova, T.V.Komarova, A.S.Zvereva, P.A.Ivanov, and J.G.Atabekov. 2007. Superexprcssion of tuberculosis antigens in plant leaves. Tuberculosis. (Edinb.) 87: 218-224.
58. Dawson, W.O., D.J.Lewandowski, M.E.Hilf, P.Bubrick, A.J.Raffo, J.J.Shaw, G.L.Grantham, and P.R.Desjardins. 1989. A tobacco mosaic virus-hybrid expresses and loses an added gene. Virology 172: 285-292.
59. Donson, J., C.M.Kearney, M.E.Hilf, and W.O.Dawson. 1991. Systemic expression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88: 72047208.
60. Shivprasad, S., Pogue, G., Lewandowski, D. J., Hidalgo, J., Donson, J., Grill, L. K., and Dawson, W. O. 1999. Heterologous sequences greatly affect foreign gene expression in tobacco mosaic vims-based vectors. Virology. 255, 312-323.
61. Verch, T., V.Yusibov, and H.Koprowski. 1998. Expression and assembly of a full-length monoclonal antibody in plants using a plant virus vector. J. Immunol. Methods 220: 69-75.
62. Kumagai, M.H., J.Donson, G.la-Cioppa, and L.K.Grill. 2000. Rapid, high-level expression of glycosylated rice alpha-amylase in transfected plants by an RNA viral vector. Gene 245: 169-174.
63. Yusibov, V., S.Shivprasad, T.H.Turpen, W.Dawson, and H.Koprowski. 1999. Plant viral vectors based on tobamoviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240: 81-94.
64. Grimsley, N., B.Hohn, T.Hohn, and R.Walden. 1986. "Agroinfection," an alternative route for viral infection of plants by using the Ti plasmid. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A S3: 3282-3286.
65. Grimsley, N. 1995. Agroinfection. Methods Mol. Biol 44: 325-342.
66. Marillonnet, S., C.Thoeringer, R.Kandzia, V.Klimyuk, and Y.Gleba. 2005. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nat. Biotechnol. 23: 718-723.
67. Gleba, Y., V.Klimyuk, and S.Marillonnet. 2005. Magnifection-a new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine 23: 2042-2048.
68. Lindbo, J.A. 2007. TRBO: a high-efficiency tobacco mosaic virus RNA-based overexpression vector. Plant Physiol 145: 1232-1240.
69. Chiba, M., J.C.Reed, A.I.Prokhnevsky, E.J.Chapman, M.Mawassi, E.V.Koonin, J.C.Carrington, and V.V.Dolja. 2006. Diverse suppressors of RNA silencing enhance agroinfection by a viral replicon. Virology 346: 7-14.
70. Toth, R.L., G.P.Pogue, and S.Chapman. 2002. Improvement of the movement and host properties of a plant virus vector through DNA shuffling. Plant J. 30: 593-600.
71. Baulcombe, D. 2004. RNA silencing in plants. Nature 431: 356-363.
72. Baulcombe, D.C. 2006. Short silencing RNA: the dark matter of genetics? Cold Sprirz-^ Harb Symp. Quant. Biol. 71: 13-20. ^
73. Baulcombe, D.C. and A.Molnar. 2004. Crystal structure of pl9-a universal suppressor of RNA silencing. Trends Biochem. Sci. 29: 279-281.
74. Hendy, S., Z.C.Chen, H.Barker, C.S.Santa, S.Chapman, L.Torrance, W.Cockburn, and G.C.Whitelam, 1999. Rapid production of single-chain Fv fragments in plants using a potato virus X episomal vector. J. Immunol. Methods 231: 137-146.
75. Franconi, R., Roggero, P., Arias, F.J., Desidero, A. 1999. Functional expression in bacteria and plants of an scFV antibody fragment against tospoviruses. Immunotechnology. 4: 189-20 1
76. O'Brien, G. J., Bryant, C. J., Voogd, C., Greenberg, H. B., Gardner, R C., and Bellamy, A. R 2000. Rotavirus VP6 expressed by PVX vectors in Nicotiana benthamiana coats PVX rocls and also assembles into viruslike particles. Virology. 270: 444-453.
77. Saitoh, H., Kiba, A., Nishihara, M., Yamamura, S., Suzuki, K., Terauchi, R. 2001. Production of antimicrobial defensin in Nicotiana benthamiana with potato virus X vector. Mol. Plarit Microbe Interact. 14:111-115.
78. Smolenska, L., Roberts, I. M., Learmonth, D., Porter, A. J., Harris, W. J., Wilson, T. lyi. and Santa, C. S. 1998. Production of a functional single chain antibody attached to the surface of a plant virus. FEBS lett. 441: 379-382.
79. Scholthof, H.B., Scholthof, K.B.G., and Jackson, A.O. 1995. Identification of tomato bushy stunt virus host-specific symptom determinants by expression of individual genes from a potato virus X vector. Plant Cell. 7: 1157-1172.
80. Sonoda, S., Koiwa, H., Kanda, K., kato, H, Shimono, M., and Nishiguchi, M.2000. The helper component proteinase of sweet potato feathery mottle virus facilitates systemic spread of potato virus X in Ipomoea nil. Phytopathology. 90: 944-50.
81. English, J.J., Mueller, E., and Baulcombe, D. 1996. Suppression of virus accumulation in transgenic plants exhibiting silencing of nuclear genes. Plant cell. 8: 179-188.
82. Brigneti, G., Voinnet, O., Li, W.x., Ji, L.H., Ding, S.W., and baulcombe, D. 1998. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana EMBO Journal. 17: 6739-6746.
83. Burton, R.A., Gibeaut, D.M., Bacic, A., Findlay, K., Roberts, K., Hamilton., A., Baulcombe D.C. and Fincher, G.B. 2000. Virus-induced silencing of a plant cellulose synthase gene. Piant Cell. 12, 691-705.
84. Jones, L., Hamilton, A.J., Voinnet, O., Thomas, C.L., Maule, A.J., Baulcombe, D.C. 1999 RNA-DNA interactions and DNA methylation in post-transcriptioan gene silencing. Plant Cell 11:2291-2301.
85. Wagner, B., Fuchs, H, Adhami, F., Ma, Y., Scheiner, O., and Breiteneder, H. 2004. Plant virus expression systems for transient production of recombinant allergens in Nicotiana benthamiana. Methods. 32:227-234.
86. Guo, H.S., J.J.Lopcz-Moya, and J.A.Garcia. 1998. Susceptibility to recombination rearrangements of a chimeric plum pox potyvirus genome after insertion of a foreign gene. Vims Res. 57 : 183-195.
87. Folimonov, A.S., S.Y.Folimonova, M.Bar-Joseph, and W.O.Dawson. 2007. A stable RNA virus-based vector for citrus trees. Virology 368: 205-216.
88. Karasev, A.V., V.P.Boyko, S.Gowda, O.V.Nikolaeva, M.E.Hilf, E.V.Koonin, C.L.Niblett, K.Cline, D.J.Gumpf, R.F.Lee, and . 1995. Complete sequence of the citrus tristeza virus RNA genome. Virology 208: 511-520.
89. Hilf, M.E., A.V.Karasev, H.R.Pappu, D.J.Gumpf, C.L.Niblett, and S.M.Garnsey. 1995. Characterization of citrus tristeza virus subgenomic RNAs in infected tissue. Virology 208: 576582.
90. Alzhanova, D.V., A.J.Napuli, R.Creamer, and V.V.Dolja. 2001. Cell-to-cell movement and assembly of a plant closterovirus: roles for the capsid proteins and Hsp70 homolog. EMBOJ. 20: 6997-7007.
91. Rohll, J.B., Holness, C.L Lomonossoff, G.P.and Maule, A.J. 1993. 3'-terminal nucleotide sequences important for the accumulation of cowpea mosaic virus M-RNA. Virology 193: 672-679.
92. Dessens, J.T. and G.P.Lomonossoff. 1993. Cauliflower mosaic virus 35S promoter-controlled DNA copies of cowpea mosaic virus RNAs are infectious on plants. J. Gen. Virol. 74 ( Pt 5): 889892.
93. Liu, L. and G.Lomonossoff. 2002. Agroinfection as a rapid method for propagating Cowpea mosaic virus-based constructs. J. Virol. Methods 105: 343-348.
94. Liu, L., M.C.Cañizares, W.Monger, Y.Perrin, E.Tsakiris, C.Porta, N.Shariat, L.Nicholson, and G.P.Lomonossoff. 2005. Cowpea mosaic virus-based systems for the production of antigens and antibodies in plants. Vaccine 23: 1788-1792.
95. Zhang, C., Ghabrial, S.A. 2006. Development of bean pod mottle virus-based vectors for stable protein expression and sequence-specific virus-induced gene silencing in soybean. Virology. 344 (2):401-11.
96. Walmsley, A. M. and Arntzen, C. J. 2000. Plants for delivery of edible vaccines. Curr. Opin.Biotechnol. 11: 126-129.
97. McAleer, W.J., Buynak, E.B., Maigetter, R.Z., Wampler., D.E,. Miller, W.J., Hilleman, M.R. 1984. Human hepatitis B vaccine from recombinant yeast. Afa/i¿n?.307:178-180.
98. Harper, D.M., Franco, E.L., et al. 2004. Efficacy of a bivalent LI virus-like particle vaccine in prevention of infection with human papillomavirus types 16 and 18 in young women: a randimized control trial. Lancet. 364:1757-1765.
99. Kimchy-Sarfaty, C., Arora, M., et al. 2003. High capacity of packaged SV 40 vectors with no SV 40 virus sequences. Human Gene therapy. 14: 167-177.
100. Touze, A., Coursaget. 1998. In vitro gene transfer using human papillomavirus virus-like particlcs. Nucleic Acids res. 26: 1317-1323.
101. Yamada, T., Iwasaki, Y., et al., 2003. Nanoparticles for the delivery of genes and drugs to human hepatocytes. Nat.Biotechnol. 21:885-890.
102. Lee, I.H., Kim, C.II.,Ryu, W.S. 1996. Presentation of the hydrophilic domains of hepatitis C viral E2 envelope glycoprotein on hepatitis B surface antigen particles./.Med. Virol.50:145-151.
103. Schlienger, K., Manchini, M., et al., 1992. Human immunodeficiency virus type 1 major neutralizing determinant exposed on hepatitis B surface antigen particles is highly immunogenic in primates .J. Virol 66:2570-2576.
104. Natilla, A., R.W.Hammond, and L.G.Nemchinov. 2006. Epitope presentation system based on cucumber mosaic virus coat protein expressed from a potato virus X-based vector. Arch. Virol. 151: 1373-1386.
105. Smith, T.J., Chase, E., Schmidt, T, Perry, K.L. 2000. The structure of cucumber mosaic virus and comparison to cowpea chlorotic mottle virus. J. Virol 74: 7578-7586.
106. Palukaitis, P., Roossinck, M.J., Dietzgen, R.G., Francki, R.I.B., 1992. Cucumber Mosaic Virus. Adv. Vims. ites.41:281-348.
107. Zhao, Y. and R.W.Hammond. 2005. Development of a candidate vaccine for Newcastle disease vims by epitope display in the Cucumber mosaic vims capsid protein. Biotechnol. Lett. 27: 375-382.
108. Lot, H., Marrou, J., Quuiot, J.B., Esvan, C., 1972. A contribution to the study on cucumber mosaic vims (CMV). II. Quick method of purification. Ann Phytopath. 4: 25-38.
109. He, X., Liu, S., Perry, K.L., 1998. Identification of epitopes in cucumber mosaic vims using a phage-displayed random peptide library. J. Gen. Virol. 79:3145-3153.
110. Bowman, V.D., Chase, E.s., Franz, A.W., Chipman, P.R., Zhang, X., Perry, K.L., Baker, T.S., Smith, T.J. 2002. An Antibody to the putative aphid recognition site on cucumber mosaic vims recognizes pentons but not hexons. J.Virol. 76:12250-12258.
111. Warzecha, H., Mason, H.S., Lane, C., Tryggvesson, A., Rybicki, E., Williamson, A.L., Clements, J.D., Rose, R.C. 2003. Oral immunogenicity of human papillomavirus-like particles expressed in potato. J. Virol. 77:8702-8711.
112. Varsani, A., A.L.Williamson, D.Stewart, and E.P.Rybicki. 2006. Transient expression of Human papillomavirus type 16 LI protein in Nicotiana benthamiana using an infectious tobamovirus vector. Virus Res. 120: 91-96.
113. Fligge, C., Giroglou, T., Streeck, R.E., Sapp, M. 2001. induction of type specific neutralizing antibodies by capsomeres of human papillomavirus type 33. Virology. 283: 353-357.
114. Giroglou, T., Sapp, M., Lane, C., Fligge, C., Christensen, N.D., Streeck. R.E., Rose, R.C. 2001. Immunological analysis of human papillomavirus capsids. Vaccine. 19: 1783-1793.
115. Labbe, M., Charpilienne, A., Crawford, S.E., Estes., M.K., Cohen, J. 1991. J. Virol. 65(6): 2946-52.
116. Crawford, S.E., Labbe, M., Cohen, J, Burroughs, M.H., Zhou, Y.J., Estes, M.K.1994.Characterization of vims-like particles produced by the expression of rotavirus capsid proteins in insect cells.J F/ro/.68(9):5945-52.
117. Burns, J.W., Siadat-Pajouh, M., Krishnaney, A.A., and Greenberg, H.B., 1996. Protective effect of rotavirus VP6- specific IgA monoclonal antibodies that lack neutralizing activity. Science. 272. 104-107.k
118. Huang, Z., L.Santi, K.LePore, J.Kilbourne, C.J.Arntzen, and H.S.Mason. 2006. Rapid, highlevel production of hepatitis B core antigen in plant leaf and its immunogenicity in mice. Vaccine 24: 2506-2513.
119. Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., kandzia, R., Klimyuk, V., and Gleba, Y. 2004. In planta engineering of viral RNA replicons; efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium. PNAS. 101(18):6852-6857.
120. Glcba Y, Marillonnet S, Klimyuk V.2004. Engineering viral expression vectors for plants: the "full" virus and the "deconstructed" virus strategies. Curr Opin Plant Biol. 7(2): 182-188.
121. Mallory, A.c., Parks, G., Endress, M.W., Baulcombe, D., Bowman, L.H., Prusss, G.J., Vance, V.B.2002. The amplicon-plus system for high-level expression of transgene in plants. Nat. biotechnology. 20: 622-625.
122. Holt C.A. Beachy, R.N., 1991. In vivo complementation of infectious transcripts from mutant tobacco'mosaic virus c DNA in transgenic plants. Virology. 181: 109-117.
123. Werner, S., S.Marillonnet, G.Hause, V.Klimyuk, and Y.Gleba. 2006. Immunoabsorbent nanoparticles based on a tobamovirus displaying protein A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 103: 17678-17683.
124. Komarova TV, Skulachev MV, Zvereva AS, Schwartz AM, Dorokhov YL, Atabekov JG.2006. New viral vector for efficient production of target proteins in plants. Biochemistry (Mosc). 71(8):846-50.
125. Vergunst, AC, Jansen, LE, Hooykaas, PJ. 1998. Site-specific integration of agrobacterium T-DNA in Arabidopsis thaliana mediated by Crc recombinase.Afac/e/c Acids Res. 26(ll):2729-34.
126. Becker, G.W., Hsiung, H.M., 1986. Expression, secretion and folding of human growth hormone in E.coli. purification and cjaracterization. FEBS lett. 204 (1): 145-150.
127. Gils, M., R.Kandzia, S.Marillonnet, V.Klimyuk, and Y.Gleba. 2005. High-yield production of authentic human growth hormone using a plant virus-based expression system. Plant Biotechjiol. J. 3: 613-620.
128. Canizares, M.C., L.Liu, Y.Perrin, E.Tsakiris, and G.P.Lomonossoff. 2006. A bipartite system for the constitutive and inducible expression of high levels of foreign proteins in plants. Plant Biotechnol J. 4: 183-193.
129. Liu, L., J.Grainger, M.C.Canizares, S.M.Angell, and G.P.Lomonossoff. 2004. Cowpea mosaic virus RNA-1 acts as an amplicon whose effects can be counteracted by a RNA-2-encoded suppressor of silencing. Virology 323: 37-48.
130. Canizares, M.C., K.M.Taylor, and G.P.Lomonossoff. 2004. Surface-exposed C-terminal amino acids of the small coat protein of Cowpea mosaic virus are required for suppression of silencing. J. Gen. Virol. 85: 3431-3435.
131. Verch, T., V.Yusibov, and H.Koprowski. 1998. Expression and assembly of a iull-length monoclonal antibody in plants using a plant virus vector. J. Immunol Methods 220: 69-75.
132. Dietrich, C., Mais, E. 2003. Fluorescent labeling reveals spatial separation of potyvirus population in mixed infected Nicotiana benthamiana plants. J. Gen. Virol. 84(ptl0):2871-6.
133. Giritch A, Marillonnet S, Engler C, van Eldik G, Botterman J, Klimyuk V, Gleba Y.2006.Rapid high-level expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectoi s.Proc Natl Acad Sci U S A. 103(40): 14701-6.
134. Sainsbury, F. and G.P.Lomonossoff. 2008. Extremely High-Level and Rapid Transient Protein Production in Plants without the Use of Viral Replication. Plant Physiol 148: 1212-1218.
135. Johnson, N.P., Mueller, J. 2002. Updating the accounts: global mortality of the 1918-1920 "Spanish" influenza pandemic. Bull Hist Med. 6: 105-115.
136. Gerdill, C. 2003. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21: 1776-1779.
137. Cox, N.J., Subbarao, K., 1999. Influenza. Lancet. 354: 1277-82.
138. Zebedee, S.L., and Lamb, R.A., 1989. Nucleotide sequences of influenza A virus RNA segment 7: a comparison of five isolates. Nucleic Acid res. 17: 2870.
139. Ito, T., Corman, O.T., Kawaoka, Y., Bean, W.J., and Webster, R.G. 1991. Evolutionary analysis of the influenza A virus M-gene with comparison of the Ml and M2 proteins. J. Virol. 65: 5492-5498.
140. Sugrue, R.J., and Hay, A. J. 1991. Structural Characteristics of the m2 protein of influenza A viruses: evidence that it forms a tetrameric channel. Virology. 180: 617-624.
141. Zebedee, S.L., and Lamb, R.A., 1988. Influenza virus A M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions. J. Virol. 62: 2762-2772.
142. Treanor, J. J., Tierney, E.L., Zebedee, S.L., Lamb, R.A., and Murphy, B.R. 1990. Passively transferred monoclonal antibodies to the M2 protein inhibits influenza A virus replication in mice. J.Virol. 64: 1375-1377.
143. Black, R.A., Rota, P.A., Gorodkova, N., Klenk, H.D., and Kendal, A.P., Antibody response to the M2 protein of influenza A virus expressed in insect cells. J. Gen. Virol. 74: 143-146.
144. Slepushkin, V.A. et al. 1995. Protection of mice against influenza A virus challenge by vavaccination with baculovirus-expressed M2 protein. Vaccine. 13: 1399-1402.
145. Neirynck, S., Deroo, T., Saelens X., Vanlandschoot, P., Jou, W.M., Fiers W.,1999. A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein. Nat Med. 5:1157-63.
146. Wingfield PT, Stahl SJ, Williams RW, Steven AC.1995. Hepatits core antigen produced in E.coli: subunit composition, conformational analysis, and in vitro capsid assQvs^o\y.Biochemistjy. 34(15):4919-32.
147. Zheng, J., Schodel, F., Peterson, D.L., 1992. The structure of hepadnaviral core antigens. Identification of free thiols and determination of the disulfide bonding pattern. J. Biol.Chem. 267: 9422-94-29.
148. De Filette M, Min Jou W, Birkett A, Lyons K, Schultz B, Tonkyro A, Resch S, Fiers W. 2005. Universal influenza A vaccine: optimization of M2e-based constructs. Virology. 337(1): 149-61.
149. Nemchinov, L.G. and A.Natilla. 2007. Transient expression of the ectodomain of matrix protein 2 (M2e) of avian influenza A virus in plants. Protein Expr. Purif. 56: 153-159.
150. Pumpens, P. and E.Grens. 1999. Hepatitis B core particles as a universal display model: a structure-function basis for development. FEBS lett. 442: 1-6.
151. Scaglioni, P.P., M.Melegari, and J.R. Wands. 1997. Posttranscriptional regulation of hepatitis B virus replication by the precore protein. J. Virol. 71: 345-353.
152. Zhou, S. and D.N.Standring. 1992. Hepatitis B virus capsid particles are assembled from core-protein dimer precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 10046-10050.
153. Wynne, S.A., R.A.Crowther, and A.G.Leslie. 1999. The crystal structure of the human hepatitis B virus capsid. Mo/. Cell 3: 771-780.
154. Kratz, P.A., B.Bottcher, and M.Nassal. 1999. Native display of complete foreign protein domains on the surface of hepatitis B virus capsids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 96: 1915-1920.
155. Bottcher, B., S.A.Wynne, and R.A.Crowther. 1997. Determination of the fold of the core protein of hepatitis B virus by electron cryomicroscopy. Nature 386: 88-91.
156. Milich, D.R., D.L.Peterson, F.Sehodel, J.E.Jones, and J.L.Hughes. 1995. Preferential recognition of hepatitis B nucleocapsid antigens by Thl or Th2 cells is epitope and major histocompatibility complex dependent. J. Virol. 69: 2776-2785.
157. Chen, J.Y. and F.Li. 2006. Development of hepatitis C virus vaccine using hepatitis B core antigen as immuno-carrier. World J. Gastroenterol. 12: 7774-7778.
158. Touze, A., N.Enogat, Y.Buisson, and P.Coursaget. 1999. Baculovirus expression of chimeric hepatitis B virus core particles with hepatitis E virus epitopes and their use in a hepatitis E immunoassay./. Clin. Microbiol. 37: 438-441.
159. Tsuda, S., K.Yoshioka, T.Tanaka, A.Iwata, A.Yoshilcawa, Y.Watanabe, and Y.Okada. 1998. Application of the human hepatitis B virus core antigen from transgenic tobacco plants for serological diagnosis. Vox Sang. 74: 148-155.
160. Wizemann, H., F.Weiland, E.Pfaff, and B.A.von. 2000. Polyhistidine-tagged hepatitis B core particles as carriers of HIV-l/gpl20 epitopes of different HIV-1 subtypes. Biol. Chem. 381: 231243.
161. Burrell, C.J., P.Mackay, P.J.Greenaway, P.H.Hofschneider, and K.Murray. 1979. Expression in Escherichia coli of hepatitis B virus DNA sequences cloned in plasmid pBR322. Nature 279: 4347.
162. Hilditch, C.M., L.J.Rogers, and D.H.Bishop. 1990. Physicochemical analysis ofthe hepatitis B virus core antigen produced by a baculovirus expression vector. J. Gen. Virol. 71 (Pt 11): 27552759.
163. Zhou, S., S.Q.Yang, and D.N.Standring. 1992. Characterization of hepatitis B virus capsid particle assembly in Xenopus oocytes. .7. Virol. 66: 3086-3092.
164. Stcinmetz, N.F., and Evans, D.J.2007. Utilization of plant viruses in bionanotechnology. Org. Biomol. Chem. 5: 2891-2902.
165. Wu, L., L.Jiang, Z.Zhou, J.Fan, Q.Zhang, H.Zhu, Q.Han, and Z.Xu. 2003. Expression of foot-and-mouth disease virus epitopes in tobacco by a tobacco mosaic virus-based vector. Vaccine 21: 4390-4398.
166. Mechtcheriakova, I.A., M.A.Eldarov, L.Nicholson, M.Shanks, K.G.Skryabin, and G.P.Lomonossoff. 2006. The use of viral vectors to produce hepatitis B virus core particles in plants. J. Virol. Methods 131: 10-15.
167. McCormick, A.A., T.A.Corbo, S.Wykoff-Clary, L.V.Nguyen, M.L.Smith, K.E.Palmer, and G.P.Pogue. 2006. TMV-peptide fusion vaccines induce cell-mediated immune responses and tumor protection in two murine models. Vaccine 24: 6414-6423.
168. Kapusta, J., Modelska, A., Figlerowicz, M., Pniewski, T., Letellier, M., Lisowa, O., Yusibov, Koprowski, H., Plucienniczak, A., and Legocki, A.B. 1999. A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus. FASEB J. 13: 1796-1799.
169. Mason, H. S., Ball, J. M., Shi, J. J., Jiang, X., Estes, M. K., and Amtzen, C. J. 1996. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 93: 5335-5340.
170. Mason, H.S., Lam, D.M.K., and Arntzen, C.J. 1992. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants. Proc. Natl. aced. Sci.USA. 89:11745-11749.
171. Richter, L.J., Thanavala, Y., Arntzen, C.J., and mason, H.S. 2000. Production oh hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immunization. Nature Biotechnology. 18: 1167-1171.
172. Smith., M.L., Richter, L., Arntzen, C.J., Shulcr, M.L., and mason, H.S. 2003. Structural characterization of plant-derived hepatitis B surface antigen employed in oral immunization studies. Vaccine.HAQ 11-4021.
173. Ehsani, P., Khabiri, A., and Domansky, N.N. 1997. Polypeptides of hepatitis B surface antigen in transgenic plants. Proc. Natl. Acad. Sei. 190:107-111.
174. Huang, Z., G.Elkin, B.J.Maloney, N.Beuhner, C.J.Arntzen, Y.Thanavala, and H.S.Mason. 2005. Virus-like particle expression and assembly in plants: hepatitis B and Norwalk viruses. Vaccine 23: 1851-1858.
175. Crowther J.R. 2001. The Elisa Guidebook, Methods in Molecular Biology. 149, Clifton, NJ.: Humana Press.
176. Lomonossoff,G.P., and W.D.Hamilton. 1999. Cowpea mosaic virus-based vaccines. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240: 177-189.
177. McLain,L., C.Porta, G.P.Lomonossoff, Z.Durrani, and N.J.Dimmock. 1995. Human immunodeficiency virus type 1-neutralizing antibodies raised to a glycoprotein 41 peptide expressed on the surface of a plant virus. AIDS Res. Hum. Retroviruses 11: 327-334.
178. Pogue, G.P., Lindbo, J.A., Garger, S.J., and Fitzmaurice W.P. 2002. Making an Ally from an Enemy: plant virology and new agriculture. Annu.Rev.Phytopathol.40:45-74.
179. Tonks, A. 2007. A spoonful of antigen. BMJ. 335:180-182.
180. Thanavala, Y., Mahoney, M., Pal, S., Scott, A., Richter, L., Natarajan, N., Goodvin, P., Arntzen, C., and masom, H.S.2005. Immunogenicity in humans of an edible vaccine for hepatitis B. PNAS, 102: 9.3378-3382.
181. Bichko, V. Pushko, P., Dreilina, D., Pumpen, P., Gren, E. 1985. Subtype aywvariant of hepatits B vims DNA primary structure analysis.FEBSlett. 185:208-212.
182. Wellink, J., van Kämmen, A. 1989. Cell-to-cell transport of cowpea mosaic virus requires both the 58/48 K proteins and the capsid proteins. J.Gen. Virol. 70:2279-2286.
183. Ma, S-W., Zhao, D.L., Yin, Z.Q., Mukherjee, R., Singh, B., Qin, H.Y., Stiller, C.R., and jevnikar, A.M. 1997. Transgenic plants expressing autoantigens fed to mice to induce oral immune tolerance. Nature Medicine. 3: 793-796.
184. Nicholson, L., Canizares, C.M., and Lomonossoff, G.P. 2006. Production of vaccines in GM plants. Plant Biotechnology. Edited by Nigel Halford. 164-192.
185. Hershberg, R.M., and Mayer, l.F. 2000. Antigen processing and presentation by intestinal epithelial cells-polarity and complexity. Immunology today.21:123-128.
186. Masuta, C., Yamana, T., Tacahashi, Y.2000. Development of clover yellow vein virus as an efficient, stable gene-expression system for legume species. Plant J. 23: 539-46.
187. MacFarlane, S.A., Popovich, A.H. 2000. Efficient expression of foreign proteins in roots from tobravirus vectors. Virology. 267: 29-35.
188. Choi, I.R., Stenger, D.C., Morris, T.J., French, R. 2000. A plant virus vector for systemic expression of foreign genes in cereals. Plant J. 23: 547-55.
189. Fiers, W. 2006. A universal vaccine against influenza. Bull. Med. Acad. R. Med. Belg. 161, 237-239.
190. Jegerlehner A., Schmitz N., Storni T., Bachmann M.F. 2004. Influenza A vaccine based on the extracellular domain of M2: weak protection mediated via antibody-dependent NK cell activity. J. Immunol. 172, 5598-3605.
191. Silva, M.S., Wellink, J., Goldbach, R.W., van Lent, J.W. 2002. Phloem loading and unloading of cowpea mosaic virus in Vigna unguiculata. J. Gen. Virol. 83:1493-504.
192. Fiers, W., De Filette, M., Birkett, A., Neirynck, S., Min Jou, W. 2004. A "universal" human influenza vaccine. Virus Res. 103 (1-2): 173-6.
193. Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. 2000. Technical focus: a guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends Plant Sci. 5(10):446-51.1. БЛАГОДАРНОСТИ:
-
Мещерякова, Юлия Александровна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2009
-
ВАК 03.00.03
- Экспрессия консервативных антигенов вируса гриппа A в растениях на поверхности химерных частиц ВТМ
- Изучение сферических частиц, образующихся при термической перестройке вируса табачной мозаики, и области их применения
- Конструирование вирусоподобных частиц на основе корового белка вируса гепатита B и M2 белка вируса гриппа как основы новых противогриппозных вакцин
- Вирусоподобные наноразмерные частицы - носители антигенов вирусов гриппа и краснухи
- Разработка средств диагностики высоковирулентного штамма вируса гриппа A подтипа H5N1
