Вироид веретеновидности клубней картофеля

Гирсова, Наталья Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Вироид веретеновидности клубней картофеля
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Вироид веретеновидности клубней картофеля"

Российская академия сельскохозяйственных наук Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии

На правах рукописи

Гирсова Наталья Викторовна

Вироид веретеновидности клубней картофеля: диагностика, сохранение инфекционности и особенности передачи патогена

Специальность 06.01.11 - защита растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Большие Вяземы - 2003

Диссертация выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте фитопатологии в 1998 - 2002 гг.

Научный руководитель:

кандидат сельскохозяйственных наук К. А. Можаева

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук,

профессор

Ю. И. Помазков

кандидат биологических наук В. П. Князева

Ведущая организация: Всероссийский научно-

исследовательский институт картофельного хозяйства им. А. Г. Лорха

Защита диссертации состоится «1Я т>ил,аМл 2003 г. в /О часов на заседании диссертационного совета К-006-О64-01 при Всероссийском научно-исследовательском институте фитопатологии по адресу: 143050, Московская обл., Одинцовский район, п/о Б. Вяземы, ВНИИФ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан » 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

И. Н. Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Картофель - ценная продовольственная, техническая и кормовая

культура. Вегетативный способ размножения картофеля способствует

резервации и накоплению в нем различных патогенов. Среди болезней,

поражающих эту культуру, особое место занимают болезни, вызываемые

вироидами - уникальным классом патогенов, состоящих из одной

низкомолекулярной РНК, - инфицирование которыми может приводить к

потерям урожая до 70 - 90%.

Картофель может поражаться несколькими вироидами, но наиболее

опасным является вироид веретеновидности клубней картофеля (ВВКК). В

России это заболевание под названием «готика» было известно с начала 40-х

годов. Однако экономически значимые потери от него отмечались только в

Поволжье. Положение изменилось, когда в стране было налажено массовое

производство безвирусного картофеля, технология получения которого не

предусматривала проверки исходного материала на наличие ВВКК и

освобождения картофеля от этого вироида. В результате во многих регионах

посадочный материал оказался инфицирован этом патогеном, а производящие

его учреждения стали источниками инфекции. В настоящее время

семеноводческие хозяйства не только несут большие потери от вызванного

заражением вироидом резкого снижения урожая, но и являются

распространителями ВВКК в другие регионы (Можаева и др., 1994, 1997;

Козлов, Крайн, 1995; Дрыгин и др., 2000; Мусин и др., 2001). Кроме картофеля

ВВКК поражаются и другие растения сем. пасленовых, в частности томаты.

Растения сем. пасленовых инфицируются и другими вироидами, например,

вироидом экзокортиса цитрусовых (ВЭЦ), «планто мачо» томата. Вироиды

обладают высокой устойчивостью к действию различных химических

соединений и факторов окружающей среды, что исключает возможность

излечения пораженных ими растений. Поэтому основные меры защиты должны

быть направлены на исключение возможности заражения растений при

селекции и промышленном семеноводстве.

В этой связи необходимо продолжать изучение свойств вироида,

способов его передачи, а также влияния вироида на урожай и структуру урожая

различных сортов картофеля. Кроме того,- необходимо—усовершенствовать

. " ЦлоНАЛЬНАЯ • ЬИЬЛИОТЕКА | | С. Петербург Г «

1 < оэ щ)

г77

методы выделения и диагностики с целью более быстрого и надежного выявления патогена.

Цель и задачи исследований

Цель исследований - изучение свойств ВВКК, распространения и сохранения патогена в различных условиях. Задачи исследований:

1. Усовершенствование методов выделения и диагностики вироида.

2. Исследование стабильности вироида при хранении in vivo и in vitro.

3. Изучение распространения и сохранения ВВКК в водной среде и в почве.

4. Изучение влияния ВВКК на продуктивность различных сортов картофеля и томатов.

Научная новизна исследований

Усовершенствована методика получения препаратов ВВКК, используемых при диагностике патогена.

Впервые получено изображение вироидной РНК с помощью нанотехнологической установки «Луч-2».

Изучена продолжительность сохранения инфекционное™ ВВКК и ВЭЦ в растворах РНК и в высушенных листьях.

Установлен срок сохранения вироидов в семенах томатов.

Изучена возможность передачи ВВКК с растительными остатками в почве и с питательным раствором.

Получены новые данные по пораженности, потерям урожая картофеля от ВВКК в зависимости от метеоусловий года, сорта картофеля и количества лет после инфицирования при искусственном заражении.

Практическая значимость работы

Для диагностики ВВКК отработан метод возвратного электрофореза.

Подобраны сорта томатов, которые могут быть использованы в качестве растений-индикаторов.

Установлено, что передача ВВКК с питательным раствором является серьезной проблемой при выращивании растений на гидропонных установках.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены на совещании «Совершенствование методов фитосанитарного мониторинга вирусных болезней растеинй и методов учета сорняков - носителей вирусов», проходившем в ВИЗР 19-21 апреля 2000 г.; научной конференции молодых ученых и специалистов ТСХА в июне 2000 г.; Всероссийской конференции «Болезни основных сельскохозяйственных культур, вызывающие чрезвычайные ситуации: Мониторинг, прогноз, система защиты», проходившей во ВНИИФ в 2001 г.; «Vlll-м Международном Симпозиуме по эпидемиологии вирусных болезней», проходившем в Германии в г. Ашерслебене 12-17 мая 2002 г.

По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части {4 главы), выводов и списка литературы. Материал изложен на страницах машинописного текста, содержит

7 таблиц, 22 рисункй. и Ю приложений. Список литературы включает 23 У работ, из которых /57 на иностранном языке.

Автор выражает благодарность старшим научным сотрудникам ВНИИФ кандидатам биологических наук Т.Б. Кастальевой и Л.А. Щербаковой; сотрудникам Московского института нанотехнологий Международного фонда конверсии В.И. Кузькину, H.H. Балану; сотруднику кафедры сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева Ю.М. Тикунову; сотруднику МГУ O.A. Кондаковой за помощь, оказанную в процессе выполнения работы.

• СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

В диссертации обобщены литературные данные по изучаемому объекту, освещено современное состояние проблем диагностики, распространения, сохранения и вредоносности ВВКК.

Глава 2. Объект и методы исследования

Работа выполнена в 1998-2002 гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте фитопатологии, а также на кафедре

сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева и в Московском институте нанотехнологий Международного фонда конверсии.

Объект исследования - вироид веретеновидности клубней картофеля (Potato spindle tuber viroid).

Для инфицирования растений использовали Поволжский и Канадский изоляты ВВКК и ВЭЦ из коллекции ВНИИФ.

Накопление ВВКК проводили в растениях томатов сорта Rutgers, которые заражали ВВКК на стадии двух-четырех настоящих листьев. Томаты выращивали в летней теплице и в лаборатории искусственного климата.

Для выделения вироида брали растения, имевшие типичные симптомы поражения. Концентрацию суммарной РНК в полученных препаратах рассчитывали по величине поглощения при 260 нм. Качество очистки РНК оценивали по величине отношения поглощения: Агк/Агво и Amax/Amin- Наличие вироидов в растворах РНК определяли с помощью электрофореза в ПААГ.

Безвирусный картофель сортов Луговской и Невский, был получен из АО «Дока - Генные технологии», картофель сортов Прибрежный и Утенок - из коллекции ВНИИФ.

Для определения вирусов картофеля (ХВК, YBK, ВСЛК) использовали диагностические наборы Международного картофельного центра (CIP).

Картофель выращивали в ОПХ ВНИИФ «Раменская горка», используя принятую в Московской области агротехнику. В полевых условиях опыты закладывали в массиве картофеля. Метеорологические условия отслеживали во все годы проведения опыта.

Статистическую обработку результатов проводили методом дисперсионного анализа (Доспехов Б. А., 1985).

Наиболее часто употребляемые сокращения: ХВК - X вирус картофеля YBK - Y вирус картофеля ВСЛК - вирус скручивания листьев картофеля ПААГ - полиакриламидный гель

TBE - (Tris-Borate-EDTA) трис-боратный буферный раствор для электрофореза ТКМ - трис-калий-магниевый буферный раствор для растворения РНК ЦТМАБ - цетилтриметиламмоний бромистый

ГФНН - глицин-натрий-фосфатно-солевой буферный раствор для экстракции

Глава 3. Совершенствование методов выделения и диагностики вироидов

Из используемых на практике методов диагностики ВВКК наиболее распространенным и надежным является электрофорез в ПААГ. Однако из-за низкого содержания вироида в растении необходимо предварительно проводить выделение нуклеиновых кислот из растительных экстрактов, чтобы получить фракцию РНК, обогащенную ВВКК.

Наиболее известен метод выделения ВВКК, предложенный Т. Morris и N. Wright (1975). Во ВНИИФ была разработана и в течение нескольких лет успешно применялась модификация этого метода (Кастальева, Можаева, 1988; Методические указания, 1999). Однако согласно этой методике для экстрагирования, как правило, используется от 15 до 60 г растительного материала, что позволяет за один цикл проводить выделение нуклеиновых кислот только из двух-четырех образцов одновременно. Необходимость анализа большого количества образцов в нашей работе заставила пересмотреть схему выделения РНК.

С целью выбора наиболее оптимальной методики, позволяющей проводить выделение РНК из большого количества образцов одновременно при сохранении качества полученной РНК и сокращения времени ее выделения, нами было проведено сравнение различных вариантов экстрагирования и депротеинизации:

1. Растительные экстракты обрабатывались сначала смесью бутанол : хлороформ, а затем депротеинизировались фенолом и смесью хлороформ : изоамиловый спирт (методика, применяемая во ВНИИФ).

2. Растительные экстракты сразу же депротеинизировались воднонасыщенным фенолом, а затем смесью хлороформ : изоамиловый спирт.

3. Экстракты обрабатывались 6 М раствором гуанидин-тиоцианата, а затем депротеинизировались фенолом.

4. Экстракты обрабатывались 6 М раствором гуанидин-тиоцианата, а затем депротеинизировались хлороформом.

Для экстрагирования брали по 3 г растительного материала, что позволило одновременно выделять РНК из 16 образцов. Это в 3 - 4 раза сократило время выделения в пересчете на один образец.

Спекгрофотометрические характеристики выделенной РНК представлены в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика РНК, выделенной с использованием различных методик

Методика выделения Концентрация РНК, мг/мл Объем образца, мл Количество РНК в образце, мг Агео/Агда Amax/Amin

1 1,462 0,09 0,52 2,0 2,3

2 1,377 0,11 0,60 1,9 2,3

3 0,815 0,07 0,23 2,1 2,4

4 0,553 0,09 0,20 2,1 2,5

Наиболее высокий выход РНК был получен при использовании первого и второго вариантов экстрагирования. Однако более высокое отношение величины поглощения АгвсМгво, которое характеризует относительное содержание нуклеиновых кислот в пробе, в первом, третьем и четвертом вариантах свидетельствовало о более высокой степени очистки этих образцов от примеси белков. Отказавшись от применения фенола в четвертом варианте, мы получили образец, в котором качество очистки не уступало предыдущим вариантам, но концентрация РНК была значительно ниже.

Таким образом, все четыре варианта можно с успехом использовать для выделения суммарной низкомолекулярной РНК и выбор метода выделения зависит от того, как в дальнейшем будет использоваться полученный образец.

3.1. Диагностика ВВКК методом возвратного электрофореза

Наряду с общепринятым методом электрофореза НК, для обнаружения вироидов стал широко применяться метод возвратного электрофореза, разработанный Schumacher (Schumacher et al., 1983) и модифицированный другими авторами (Singh and Boucher, 1987).

Эта часть работы была выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА им. К.А. Тимирязева, располагавшей необходимым оборудованием. Электрофорез проводили в 5%-ом ПААГ, размер геля 15x14x1 мм.

Образцы, содержащие вироидную РНК, смешивали с растворами 0,1%-го бромфенолового синего и 5 М мочевины, наносили на гель, установленный в прибор «Macrophor» фирмы "Pharmacia". В первую ячейку наносили 10 мкл образца без разбавления, а в остальные ячейки • образец, разбавленный в 2,

4, 8 раз, что составляло примерно 240, 120, 60, 30 нг вироидной РНК соответственно. Электрофорез проводили в ТВЕ-буфере с температурой 15°С 10 мин при 200 V, затем при 450 V. После достижения бромфенолом нижнего края геля меняли полюса и проводили электрофорез в обратном направлении без замены буфера в термостате при 60ВС и напряжении 450 V до тех пор, пока краситель не доходил до верхней границы пластины геля.

Для окрашивания гелей использовали бромистый этидий и нитрат серебра. Гели, окрашенные бромистым этидием, просматривали в УФ. Окрашенные гели фотографировали фотоаппаратом «Зенит-E». При проведении электрофореза в денатурирующих условиях при 60SC клеточные РНК опережали вироидную РНК, что способствовало четкому выявлению последней после окрашивания (рис.1). Этим методом нам удалось выявить примерно 60 нг ВВКК в пробе. Оба метода окрашивания показали примерно одинаковый уровень чувствительности. Разрешающая способность обычного метода электрофореза в ПААГ составляет 400 - 600 нг (Кастальева, Можаева, 1988).

Рис.1. Электрофореграммы нуклеиновых кислот после возвратного электрофореза. Линия 1 - положительный контроль; 6 - отрицательный контроль; 2 - образец без разбавления; с 3 по 5 - разбавление в 2,4, 8 раз; а - окрашивание серебром б - окрашивание бромистым этидием.

Таким образом, метод возвратного электрофореза является более надежным и чувствительным по сравнению с общепринятым методом электрофореза в полиакриламидном геле.

3. 2. Исследование вироидной РНК с помощью сканирующего туннельного микроскопа

Одно из направлений в развитии нанотехнологии с применением сканирующего туннельного микроскопа (СТМ) с нанометровой разрешающей способностью - быстродействующая диагностика биологических объектов.

Работу проводили в Московском институте нанотехнологий Международного фонда конверсии.

Для получения высокоочищенного препарата ВВКК из растений томатов сорта Rutgers выделяли суммарную низкомолекулярную РНК, обогащенную ВВКК, и подвергали препаративному электрофорезу в 7,5%-ом ПААГ. Полосу геля, содержащую ВВКК, вырезали и вироид элюировали ТКМ-буфером. РНК осаждали 2%-м ЦТМАБ, а затем переводили в натриевую соль и растворяли в 10 мМ ацетате аммония. 2 мкл раствора, содержащего около 1 мкг ВВКК, наносили на подложку, которая представляла собой поликоровую пластинку размером 20 х 10 мм с нанесенной ионно-лучевым распылением пленкой золота толщиной 0,5 мкм.

Исследование полученных образцов проводили на нанотехнологической установке «Луч - 2» в режиме нормального сканирования и в режиме определения работы выхода электрона (так называемой туннельной спектроскопии). Размер поля сканирования 500x500 нм. На фото, полученном в режиме определения работы выхода электрона, видны линейные и кольцевые молекулы ВВКК (рис.2). Их размеры совпадают с размерами, указанными в литературе. Так, размер денатурированной кольцевой молекулы равен 140 ± 10 нм, а ее линейной формы 110 ± 10 нм (McClements and Kaesberg, 1977).

Рис.2. Изображение линейной и кольцевой молекул ВВКК (—►). * Длина масштабного отрезка 100 нм.

3.3. Использование томата в качестве растения-индикатора

Несмотря на то, что в последнее время появились новые методы идентификации вироидов, обладающие высокой чувствительностью, метод растений-индикаторов остается одним из наиболее доступных и легко осуществимых. По чувствительности он не уступает современным молекулярным методам. Известно, что различные сорта томатов по-разному отвечают на заражение ВВКК: одни имеют ярко выраженные симптомы заболевания, у других симптомы едва выражены (Леонтьева, 1980; Singh, et а!., 1970). Традиционно в качестве растений-индикаторов используют томаты сорта Rutgers. Однако и другие сорта томатов, в том числе отечественные, могли бы быть использованы для этой цели.

Четыре сорта томатов - Сибирский скороспелый, Сонато, Волгоградский 5/95, Эчмиадзинский - наряду с сортом Rutgers были инокулированы РНК, содержащей ВВКК, и выращивались в условиях теплицы. Через каждые семь дней после заражения измеряли высоту растений и наблюдали за появлением симптомов заболевания. Степень проявления симптомов сравнивали с симптомами на растениях сорта Rutgers. Дневная температура в теплице во время проведения опыта была выше + 30fiC, что способствовало накоплению вироида и проявлению симптомов на растениях.

@Сонато ШСибирский □ Волгоградский ■Эчмиадзинский □ Rutgers

Рис. 3. Высота растений через 21, 36, 50 дней после заражения (% к контролю).

Первые симптомы поражения ВВКК появились на сорте Волгоградский 5/95 уже через 14 дней после заражения. На 21 день после заражения

оценивали степень проявления симптомов на инокулированных растениях. Наиболее ярко симптомы проявились на растениях сорта Волгоградский 5/95. У растений этого сорта была отмечена деформация листьев, укорачивание междоузлий, кустистость верхушки, наблюдалось наиболее выраженное отставание в росте (рис. 3). Более слабые симптомы по сравнению с сортом Rutgers отмечены на растениях сортов Соната и Эчмиадзинский. На растениях этих сортов кроме угнетения роста, отмечалась лишь незначительная деформация листьев.

Таким образом, сорт томата Волгоградский 5/95 может быть использован в качестве растения-индикатора, поскольку симптомы поражения на нем появляются раньше, а отставание в росте более выражено, чем на томате сорта Rutgers, традиционно используемом как растение-индикатор ВВКК.

Глава 4. Сохранение нативности вироидной РНК во время хранения /п vivo и in vitro

Молекула вироида имеет до 70% спаренных оснований, что придает ей устойчивость к действию различных химических веществ. Вероятно, поэтому она способна сохранять инфекционность длительное время. Так, было показано, что вироид остается инфекционным при хранении в течение четырех лет при -20QC в составе препарата частично очищенной низкомолекулярной РНК (Васильева, 1984) и до шести лет в лиофилизированных листьях (Singh, et al., 1977). У нас была возможность проверить, может ли вироид сохраняться более продолжительное время.

4.1. Сохранение инфекционности вироида в препаратах суммарной низкомолекулярной РНК

Инфекционность водного раствора суммарной низкомолекулярной РНК, обогащенной ВВКК или ВЭЦ, проверяли после хранения ее в течение 18 - 22 лет при температуре - 20ВС. Было проверено четыре образца: три из них содержали различные изоляты ВВКК и хранились 18, 20 и 22 года, один -вироид экзокортиса цитрусовых, который хранился 18 лет.

Для проверки инфекционности был выбран метод растений-индикаторов. Для выявления вироидов потребовалось два цикла заражения растений томатов сорта Rutgers. На первом этапе растения, после инфицирования на стадии трех-четырех листьев и выращивания в теплице в течение месяца, симптомов болезни не обнаруживали. Из собранных с них листьев выделили

низкомолекулярную РНК, которой инокулировали новую партию растений томатов (также на стадии трех-четырех листьев). Через месяц выращивания в теплице симптомы появились на всех инфицированных растениях. Во всех образцах выделенной из этих растений суммарной РНК методом электрофореза в ПААГ была обнаружена вироидная фракция (табл. 2).

Таблица 2

Сохранение инфекционное™ вироидов при длительном хранении.

Название Срок Первое заражение Второе заражение

вироида. хранения, Симптомы Наличие Симптомы Наличие

изолята годы на томате* фракции на томате* фракции

ВВКК в геле" ВВКК в геле"

ВВКК:

Из Поволжья 22 Нет +? Сильные +

Из Канады 20 Нет - Средние +

Из Армении 18 Нет - Средние +

ВЭЦ:

Из США 18 Нет +? Сильные +

* симптомы на томате сорта Rutgers: нет — симптомы отсутствуют, растения внешне здоровые; средние - слабая карликовость, эпинастия листьев; сильные - карликовость, эпинастия и морщинистость листьев, некрозы на стебле и жилках листа.

" наличие фракции вироида в геле при электрофорезе в ПААГ: (-) - отсутствует; (+?) - неявное; (+) - хорошо выраженное.

Несмотря на то, что после первого инфицирования растений-индикаторов симптомов заражения вироидом не наблюдалось, а вироидная фракция в выделенном препарате РНК после электрофореза в ПААГ не просматривалась, или наличие вироида было под сомнением, репликация вироида имела место. При последующем. заражении растений томатов этой РНК произошло накопление вироида в количестве, достаточном для его определения методом электрофореза в ПААГ. Повышенная температура в теплице (>30=С), наблюдавшаяся после повторного заражения, способствовала проявлению симптомов.

Таким образом, ВВКК и ВЗЦ способны в течение длительного времени, по крайней мере двадцать два года, сохранять свою инфекционность после хранения в водном растворе суммарной низкомолекулярной РНК при низкой температуре (- 20еС).

4.2. Сохранение инфекционности ВВКК в сухих листьях

ВВКК выделяли из лиофильно высушенных и хранившихся 13 лет при -20е С листьев инфицированных томатов, а также из листьев, высушенных

при комнатной температуре и хранившихся в течение одного или двух лет при комнатной температуре. Перед выделением суммарной РНК листья предварительно выдерживали в течение ночи в буферном растворе ГФНН (1 : 10) при +4В С. Выделенной низкомолекулярной РНК инокулировали растения томатов, которые затем в течение месяца выращивали в теплице, после чего из листьев выделяли суммарную низкомолекулярную РНК и проводили электрофорез в ПААГ. Во всех образцах был обнаружен вироид, а на зараженных растениях наблюдались симптомы вироидного поражения (табл. 3).

Таблица 3

Сохранение инфекционности ВВКК в листьях томатов_

Способ хранения Срок хранения, годы Симптомы на растениях-индикаторах" Результаты электрофореза в ПААГ™

Лиофилизированные листья, - 20° С 13 Средние +

Сухие листья, комнатная температура 1 Средние +

2 Средние +

" - листья высушены при комнатной температуре;

"симптомы на томатах сорта Rutgers: средние - слабая карликовость, эпинастия листьев; "'наличие фракции вироидной РНК в геле: + - хорошо выраженное.

Таким образом, ВВКК способен сохранять свою инфекционность в высушенных листьях, хранящихся в комнатных условиях, по крайней мере, два года, а в лиофильно высушенных листьях при температуре - 20® С - до 13 лет

4. 3. Возможность сохранения и передачи ВВКК через почву и с растительными остатками

Данные о том, что вироид не распространяется через почву, получены в 30-х годах XX века. Растения, выращенные в почве на месте инфицированных ВВКК, не имели симптомов поражения этим вироидом (Ооэз, 1931). Однако, учитывая, что ВВКК обладает способностью длительное время сохраняться в высушенных листьях, представлялась вероятной возможность его сохранения в почве и передачи инфекции на здоровые растения. Для того, чтобы проверить эту возможность, нужно было выбрать наиболее чувствительный метод обнаружения ВВКК. Применение двух циклов накопления вироида в растениях-индикаторах, а также использование для обнаружения ВВКК возвратного электрофореза в ПААГ вполне могло обеспечить такую чувствительность.

Для изучения возможности передачи ВВКК через почву, заведомо больные растения картофеля сортов Утенок, Невский, Кинельская роза, Луговской, Бронницкий, Волжанин, Ресурс выращивали в вазонах в условиях теплицы. В каждый вазон высаживали по 2 - 3 клубня. В качестве отрицательного контроля использовали здоровый картофель сортов Луговской и Невский. В конце вегетационного периода все вазоны были разделены на две равные группы. В 1 -й группе растения были удалены из вазонов, во 2-й группе ботву и корни выросших в них растений смешивали с почвой из этих же вазонов. Все вазоны на осенне-зимний период были оставлены в естественных условиях под открытым небом. Через 4 месяца (в конце января), в половину вазонов первой и половину вазонов второй групп были высажены растения-индикаторы (томаты сорта Rutgers) в стадии трех - четырех настоящих листьев, которые затем выращивали в лаборатории искусственного климата в течение месяца (температура дневная 25в С, ночная - 22s С, влажность 70 %, длина дня 16 часов). Через 8 месяцев после закладки опыта (в мае) в оставшиеся вазоны были высажены растения томатов, которые затем продолжали выращивать в условиях теплицы. Через месяц после посадки у каждой группы растений были взяты образцы листьев, из которых выделили суммарную низкомолекулярную РНК. Выделенной РНК заражали растения-индикаторы, которые выращивали в новой почве. Через месяц вегетации в условиях теплицы вновь отбирали образцы листьев и выделяли низкомолекулярную РНК. Наличие в ней вироидной РНК определяли с помощью метода возвратного электрофореза в 5% ПААГ.

Во всех вариантах опыта, не зависимо от времени нахождения в почве инфицированных ВВКК корней и ботвы картофеля, ВВКК не был обнаружен. Таким образом, используя такие методы диагностики, как растения-индикаторы и возвратный электрофорез, нам не удалось установить возможности сохранения и передачи ВВКК через почву и с растительными остатками.

4.4. Сохранение вироида в питательном растворе

Являясь высоко устойчивым и контагиозным патогеном, ВВКК способен распространяться с водой и питательным раствором. В литературе имеются данные о том, что томаты могут заражаться ВВКК через корневую систему при совместном выращивании больных и здоровых растений в гидропонной культуре (Можаева и др., 1996).

Целью нашей работы было установить минимальный промежуток времени, необходимый для заражения, а также влияние возраста растения на скорость заражения при совместном выращивании больных и здоровых растений в питательном растворе.

Растения томатов сорта Rutgers выращивали в почве в теплице. В соответствии со схемой опыта одну группу растений заражали ВВКК, другая группа растений оставалась неинокулированной. Через два месяца растения извлекали из почвы, промывали корни и помещали в сосуды с питательным раствором Бентли (Бентли, 1965). В каждый сосуд помещали по два инокулированных, по два здоровых растения и по десять черенков, взятых со здоровых растений. В качестве отрицательного контроля использовали незараженные ВВКК растения и черенки томатов, которые находились в изолированном боксе. Стебли и листья здоровых и больных растений были изолированы друг от друга, но их корни свободно соприкасались в растворе. Черенки и растения удаляли из питательного раствора через 1-15 суток, из их листьев выделяли суммарную низкомолекулярную РНК, которую затем использовали для инокуляции томатов. Через два месяца из листьев последних выделяли суммарную РНК и определяли наличие вироида с помощью электрофореза в ПААГ.

Таблица 4

Заражение растений ВВКК при совместном выращивании в питательном

растворе больных и здоровых растений

Время контакта (сутки) Результаты обнаружения ВВКК электрофорезом в ПААГ'

растения черенки

1 3 5 + + +

10 + +

15 + +

* наличие фракции вироида в геле при электрофорезе в ПААГ: (-) - отсутствует; (+) - хорошо выраженное. •

При контакте корневых систем больных и здоровых растений через питательный раствор заражение растений ВВКК происходило через 5 суток, а черенков - через трое суток (табл. 4). Образцы листьев с контрольных растений не содержали ВВКК.

Для выяснения сохранности вироида в растворе после удаления инфицированных ВВКК растений был поставлен специальный опыт. .

Растения, зараженные ВВКК, после выдерживания их 15 суток в питательном растворе удаляли и на их место помещали 10 черенков от-здоровых растений. Через трое суток из листьев черенков выделяли суммарную РНК, которой инокулировали томаты, при этом каждый черенок был отдельным образцом. Через два месяца из зараженных растений выделяли суммарную РНК и проверяли наличие в ней ВВКК с помощью электрофореза в ПААГ. ВВКК был обнаружен в 60% образцов.

Таким образом, растения томата заразились ВВКК на пятые сутки после того, как в сосуд с питательным раствором помещали больное растение, а черенки, имеющие большую раневую поверхность и более молодой возраст, заражались вироидом уже на третьи сутки. После удаления из питательного раствора больного растения инфекционность вироида сохранялась в растворе трое суток.

5.5. Возможность длительного сохранения инфекционности вироидов в семенах

Известно, что вироиды могут длительное время сохраняться в настоящих семенах растений. Так, Singh с соавторами показали наличие ВВКК в семенах картофеля, хранившихся при комнатной температуре в течение 21 года (Singh et al., 1991). Сведений о столь длительном сохранении вироида в семенах других растений, в частности томатов, не имеется. В то же время для томата такая информация имеет практическое значение, поскольку его размножение осуществляется посредством настоящих семян, которые могут быть носителями вироидной инфекции, если получены с зараженных растений.

Нами были проведены опыты по выяснению срока сохранения ВВКК и ВЭЦ в семенах томата.

Образцы семян, собранных с растений томата с. Rutgers, зараженных различными изолятами ВВКК и ВЭЦ, хранились от одного до двадцати трех лет при комнатной температуре в бумажных пакетах. Семена высевали в теплице (в каждом варианте по 30 семян) и наблюдали за ростом и развитием растений в течение 45 дней. Наличие вироидов (ВВКК и ВЭЦ) в растениях определяли методом электрофореза в ПААГ выделенной из них низкомолекулярной РНК. Результаты представлены в таблице 5.

Всходы были неравномерными. Семена, хранившиеся в течение 1-3 лет, начали прорастать через 6-7 дней после посева, а всходы у семян,

хранившихся 23 года, начали появляться только через 25 дней. Процесс прорастания семян был растянут во времени, так, в образце №19 последние семена проросли через 20 дней после появления первых всходов (табл.5).

Таблица 5

Сохранение инфекционносги вироидов в семенах томата с. Rutgers

№ образца Срок хранения, количество лет Масса 1000 семян, г Всходы, дни после посева Всхожесть, % Результаты электрофореза* Примечание

Контроль, семена от здоровых растений

1. 1 3,142 6 73,3 -

2. 3 3,142 12 50,0 -

3. 7 3,153 12 40,0

4. 21 1,956 19 6,7 - Очень слабые всходы

5. 23 1,956 0

6. 25 1,956 0

ВВКК, Поволжский изолят

7. 19 1,690 15 6,7 Через 5 дней всходы погибли

8. 22 1,777 0

9. 22 0,993 20 3,3 +

10. 23 1,978 25 16,7 +

ВВКК, Канадский изолят

11. 20 0,848 14 6,7 +

12. 22 0,848 0

13. 23 0,976 0

ВВКК, Армянский изолят

14. 18 1,662 0

15. 19 1,560 0

Вироид экзокортиса цитрусовых

16. 19 1,368 14 5,2 + 2 растения погибли после всходов

ВВКК, смесь изолятов

17. 1 • 1,565 6 66,7 +

18. 3 1,565 8 26,7 +

19. 7 2,619 15 20,0 +

- наличие фракции вироида в геле при электрофорезе в ПААГ: (-) - отсутствует; (+) - хорошо выраженное.

Следует отметить, что всхожесть семян, полученных как от здоровых растений, так и от зараженных ВВКК, снижалась в зависимости от длительности хранения, и через 19-23 года всхожими оставалось не более 3 -17%. Средняя масса семян, полученных от инфицированных растений, была в 1,5-2 раза меньше массы семян здоровых растений (табл. 5). Например, после хранения в

течение трех лет масса 1000 семян здоровых растений была 3,14 г, а инфицированных -1,56 г.

4.5.1. Возможность сохранения вироида в семенах, утративших

всхожесть

Семена, полученные с растений томатов с. Rutgers, зараженных Канадским изолятом ВВКК, хранившиеся 24 года при комнатной температуре и утратившие всхожесть, растирали в жидком азоте. Полученный порошок делили на две равные части. Из одной части выделяли суммарную низкомолекулярную РНК, а другую часть экстрагировали 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,0 в течение ночи при + 4е С. Выделенную РНК и экстракт размолотых семян использовали как инокулюм для заражения томатов. Инокулированные растения выращивали в теплице в течение одного месяца, затем листья собирали и выделяли из них суммарную РНК. Наличие вироида определяли электрофорезом в ПААГ, а также методом молекулярной гибридизации с использованием диен-И-метки. В инокулированных растениях томатов ВВКК не был обнаружен при использовании- - обоих методов идентификации вироида.

Таким образом, ВВКК и ВЭЦ сохраняются в семенах томата, собранных с зараженных растений, пока семена сохраняют свою всхожесть. Нам удалось обнаружить ВВКК в растениях, выросших из семян, которые хранились 23 года, а ВЭЦ - в растениях, выросших из семян хранившихся 19 лет. В семенах, утративших всхожесть, вироид не был обнаружен.

Глава 5. Влияние ВВКК на растения картофеля 5.1. Особенности первичного заражения картофеля ВВКК

Для вироида наиболее характерен механический способ передачи инфекции. Патоген внедряется через поврежденные участки на поверхности растений, а затем распространяется и накапливается в разных органах и тканях. В первый год после механического заражения листьев картофеля ВВКК симптомы вироидного поражения на клубнях, как правило, не обнаруживаются (Weidemann, 1987; Можаева и др., 1998). Однако именно клубневая инфекция имеет наибольшее значение для сохранения и распространения патогена.

Одной из задач нашей работы было выяснение, все ли клубни, полученные с больного куста, заражены вироидом и происходит ли сохранение инфекции в течение двух лет, следующих за годом инфицирования.

В первый год в поле было высажено по 8 клубней картофеля сортов Луговской и Утенок, отобранных с кустов, инфицированных вироидом в предыдущем году, из которых 4 клубня каждого сорта имели симптомы, а 4 не имели. Через 50 дней после посадки с каждого куста отбирали листья, выделяли суммарную РНК и проверяли наличие в ней вироида методом электрофореза в ПААГ. Вироид был обнаружен во всех образцах (табл. 6). На хранение для продолжения эксперимента в следующем году были заложены клубни, полученные с кустов, имевших симптомы вироидного поражения (угнетение роста, вытянутость и прямостоячесть ботвы), при этом только часть клубней имела симптомы вироидного поражения. Весной следующего года все эти клубни были высажены в торфяные горшочки в теплице, а через 30 дней после посадки с них собраны образцы листьев для проверки наличия вироида методом электрофореза в ПААГ. Вироид был обнаружен во всех образцах (табл.6).

Таблица 6

Тестирование ВВКК в листьях картофеля в период вегетации

сорт 1-й год 2-й год

Визуальная оценка Электрофорез Визуальная оценка Электрофорез

Луговской 3/8' 8/8" 2/8' 8/8"

Утенок 2/8 8/8 5/10 10/10

* в числителе - количество растений с симптомами в знаменателе - общее количество растений;

в числителе - количество растений с положительной реакцией при электрофорезе в знаменателе - общее количество протестированных растений

Наблюдение за развитием зараженных растений в течение двух лет позволяет сделать вывод о том, что наличие симптомов вироидного поражения на ботве не означает, что и на клубнях будут симптомы. Однако клубни, не имеющие симптомов заболевания ВВКК, могут бьггь носителями вироидной инфекции. Таким образом, выбраковка больных растений только на основе визуального метода диагностики не может бьггь эффективной.

5. 2. Влияние ВВКК на рост и продуктивность различных сортов

картофеля

Снижение урожая картофеля, пораженного ВВКК, зависит от штамма возбудителя, а также от сорта и условий выращивания картофеля (Diener, 1979; Леонтьева, 1971; Можаева и др., 1982,1998; Singh et al., 1991 ;Salazar, 1996).

Наша задача заключалась в том, чтобы выяснить, как влияет ВВКК на развитие и урожайность растений картофеля различных сортов в течение

нескольких лет после заражения.

Опыт проводили в 1998 - 2002 годах с четырьмя сортами картофеля: ^ Луговской (среднеспелый), Невский (среднеранний), Прибрежный

(среднеспелый), Утенок (ранний). Эти сорта были районированы в Подмосковье. В опыте было два варианта: здоровые растения (контроль) и зараженные ВВКК.

В 1998 году в каждом варианте было высажено по 5 растений этих сортов. На пятидесятый день после посадки растения картофеля заражали суммарной низкомолекулярной РНК, содержащей вироид. Через месяц после заражения вироидом все растения были проанализированы на наличие ВВКК. Во всех растениях, которые заражали, был обнаружен вироид. В контрольных растениях ВВКК не было. В течение вегетационного сезона проводили фенологические наблюдения за ростом и развитием картофеля. При уборке учитывали величину и структуру урожая. Наличие ВВКК в растениях определяли с помощью электрофореза в ПААГ. Со второго года исследований с помощью иммунофёрментного анализа, ежегодно определяли пораженность растений вирусами ХВК, УВК, ВСЛК. Пораженные вирусами растения выбраковывались.

В последующие годы в опытном варианте для посадки использовали только клубни с характерными симптомами поражения ВВКК, которые были w собраны с растений, имевших симптомы вироидного поражения.

Было замечено, что клубни, зараженные ВВКК, выходят из состояния покоя на 2 - 3 недели раньше, чем здоровые клубни. Однако, если в начале вегетации в почве наблюдался недостаток влаги, то всходы у картофеля, зараженного ВВКК, появлялись позднее, чем у здоровых растений. Например, в 1999 г., когда во время посадки и в течение нескольких недель после нее стояла жаркая и сухая погода, всходы зараженных растений появились значительно позднее, чем у здоровых. Через 30 дней после посадки взошло

33% зараженных растений сорта Луговской, 28% сорта Невский, 50% сорта Прибрежный, 60% сорта Утенок. В контроле у всех сортов всхожесть к этому времени составила 100%. Дожди, прошедшие во второй декаде июня, способствовали дальнейшему появлению всходов, однако 100% всхожесть была только у картофеля сорта Прибрежный. Через 69 дней после посадки, у сорта Луговской всхожесть составила 85%, у сорта Невский - 88%, у сорта Утенок - 90%. Такая же тенденция наблюдалась и в другие годы исследований, но различия по всхожести растений между здоровыми и зараженными растениями не были столь существенными.

При наблюдении за ростом и развитием растений, зараженных ВВКК, были выявлены некоторые закономерности. У- картофеля, пораженного ВВКК, раньше заканчивается рост стеблей и листьев, быстрее проходят фазы бутонизации, цветения и, как следствие, отмечается более раннее отмирание ботвы. Растения картофеля, сильно пораженные ВВКК, могут вообще не образовывать репродуктивные органы. Симптомы поражения вироидом на ботве инфицированного картофеля (готичность, отставание в росте), появляются уже через год после заражения и усиливаются в последующие годы. Картофель, инфицированный ВВКК, при уборке имеет большее число клубней пораженных различными видами гнилей (от 3 до 15%), чем здоровый (от 1 до 3%). Инфицированные ВВКК клубни хуже хранятся. Например, в сезон хранения 2000 - 2001 гг., за 7 месяцев хранения было поражено гнилями 40 -62% клубней, полученных с больных растений, и только 1 - 4% клубней, собранных со здоровых растений.

Наиболее характерный признак зараженных вироидом растений -карликовость. Степень угнетения роста растения зависит от штамма ВВКК, погодных условий, а также сорта картофеля. На рисунке представлены значения высоты растений в среднем за четыре года (1998,1999, 2001, 2002) и в 2000 году. Результаты 2000 года помещены отдельно для того, чтобы продемонстрировать влияние благоприятных погодных условий на рост как здоровых, так и инфицированных растений. Погодные условия того года отличались от остальных лет теплым летом и достаточным увлажнением, особенно в начале вегетации. В 2000 году наибольшая разница по высоте между зараженными и здоровыми растениями была у сорта Прибрежный, а наименьшая у сортов Луговской и Утенок (рис.4).

Луговской Невский Прибрежный Утенок

[□контроль И ВВКК 02000« □2000ВВКК |

Рис.4. Высота контрольных и зараженных ВВКК растений картофеля в среднем за 4 года (1998,1999, 2001, 2002) и в 2000 году.

В год заражения наблюдалось незначительное снижение продуктивности у картофеля сортов Луговской и Невский, и более значительное у картофеля сортов Прибрежный, Утенок. На пятый год после заражения наибольшее снижение продуктивности было отмечено у сорта Невский - 46,9%, менее всего продуктивность снизилась у сорта Утенок - 18,1%. У сортов Луговской и Прибрежный отмечалось снижение продуктивности на 36,4 и 35,6% соответственно (рис. 5).

Г---- ____

4 N \ № 5

—1— 1,

Луговской

Невский

Прибрежный

Утенок

ШШ контроль СЗВВКК —♦—% к контролю

Рис. 5. Продуктивность различных сортов картофеля в контроле и при заражении ВВКК на пятый год после заражения.

Сравнение продуктивности картофеля в различные по погодным условиям годы показало, что в благоприятные годы наблюдаются большие различия между здоровыми и инфицированными ВВКК растениями не зависимо от сорта. В благоприятный для развития растений год (рис. 6) разница в продуктивности между зараженными и здоровыми растениями увеличилась в несколько раз. Это особенно характерно для сорта Невский. Менее всего

погодные условия повлияли на растения сорта Утенок. Зараженные растения картофеля сортов Невский и Прибрежный слабее других реагировали на улучшение погодных условий при выращивании.

Луговской

Невский

Прибрежный

Утенок

В контроль, среднее за 4 года □ ВВКК, среднее за 4 года И контроль, благоприятный год И ВВКК, благоприятный год

Рис. 6. Продуктивность различных сортов картофеля в контроле и при заражении ВВКК в среднем за 4 года и в благоприятный год.

□ контроль, среднее за 4 года □ ВВКК, среднее за 4 года Ш контроль, благоприятный год ШВВКК, благоприятный год

Рис. 7. Масса одного клубня в контроле и при заражении ВВКК в среднем за 4 года и в благоприятный год.

Анализ структуры урожая показал, что уменьшение продуктивности растений под влиянием ВВКК происходит за счет уменьшения массы одного клубня и уменьшения количества клубней на одном растении. У сортов Луговской, Невский, Утенок на протяжении всех лет опыта уменьшение продуктивности напрямую зависело от уменьшения массы одного клубня (рис. 7).

Результаты экспериментов показали, что число клубней с растения подвержено относительно меньшему изменению, чем другие показатели величины и структуры урожая. Количество клубней с одного куста на пятый год

после заражения незначительно снизилось у картофеля с. Невский (на 7,9% от контроля) и Луговской (8,6%); у сортов Прибрежный и Утенок снижение составило 15,6%, 16,9% соответственно (рис. 8).

Луговской Невский Прибрежный Утенок

контроль: ■ всего Штоварных

заражен.ВВКК: В всего □ товарных

Рис. 8. Количество-клубней с одного куста в контроле и при заражении ВВКК у различных сортов картофеля на пятый год после заражения.

Под влиянием ВВКК снижалось количество товарных клубней. Так, у растений картофеля сорта Луговской на пятый год после заражения (в 2002 году) все образовавшиеся кпубни были нетоварными.

Таким образом, анализ изменения величины и структуры урожая картофеля четырех сортов, пораженных ВВКК, в течение 1998 - 2002 гг. выявил следующие закономерности:

1. Под влиянием ВВКК происходит снижение продуктивности картофеля в результате уменьшения массы одного клубня и количества клубней на одно растение. Как следствие, уменьшается количество товарных клубней. Однако структура урожая изменяется в меньшей степени, чем его величина.

2. Продуктивность картофеля, зараженного ВВКК, как правило, снижается, начиная со следующего после инокуляции года. Степень снижения продуктивности больного растения в последующие годы зависит от погодных условий и имеет сортовые различия.

Выводы

1. Оптимизация метода выделения суммарной РНК, содержащей ВВКК, сократила время ее выделения в пересчете на один образец. Применение

1 возвратного электрофореза для диагностики ВВКК позволило четко выявлять

вироидную РНК, поскольку этот метод более чувствителен, чем обычно используемый электрофорез в полиакриламидном геле.

2. Впервые получено изображение кольцевой и линейной молекул ВВКК на изготовленной в Институте нанотехнологий Международного фонда конверсий установке «Луч-2»

3. Сорт томата Волгоградский 5/95 может быть использован в качестве растения-индикатора, поскольку симптомы поражения на нем появляются раньше, а отставание в росте более выражено, чем у томата сорта Rutgers, традиционно используемого как растение-индикатор ВВКК.

4. ВВКК способен к длительному сохранению инфекционное™ как in vivo, так и in vitro:

а) в водном растворе в составе низкомолекулярной РНК при -20®С, по крайней мере, 22 года;

б) в лиофильно высушенных листьях при температуре - 20ВС -13 лет;

в) в высушенных и хранящихся при комнатной температуре листьях - 2 года;

г) во всхожих семенах томатов-до 23 лет;

д) в семенах, утративших всхожесть, вироид не был обнаружен.

5. При выращивании в питательном растворе здоровые растения томата заражаются вироидом уже через пять суток после того, как в раствор попадают больные растения. В этих же условиях черенки, имеющие большую раневую поверхность, заражаются вироидом на третьи сутки.

6. Несмотря на высокую стабильность молекулы ВВКК и контагиозность этого патогена, возможность передачи его через почву и с растительными остатками при использовании для диагностики методов растений-индикаторов и возвратного электрофореза в ПААГ установить не удалось.

7. При первичном заражении картофеля ВВКК симптомы вироидного поражения на ботве наблюдались не на всех растениях, а клубни могли не иметь симптомов даже на следующий после инфицирования год. Однако все клубни, полученные от инфицированных растений, являлись носителями инфекции.

8. При заражении ВВКК продуктивность картофеля, как правило, снижалась, начиная со следующего после заражения года. Снижение продуктивности происходило в результате уменьшения массы одного клубня и количества клубней на одно растение. Степень снижения продуктивности больного растения в последующие годы зависит от изолята ВВКК, продолжительности инфицирования, сорта картофеля, а также от погодных условий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кинчарова М. Н., Гирсова Н. В. Влияние вироида веретеновидности клубней на продуктивность картофеля// Тезисы докладов 46 научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава, сотрудников и аспирантов. Самарская ГСХА, Самара, 1999, с. 53.

2. Кастальева Т. Б., Гирсова Н. В. Модификация метода выделения вироидной РНК/ Депонированная рукопись (рукопись депонирована во ВНИИТЭИ-Агропром, рег.№ 152/9 ВС - 2000// Труды научной конференции молодых ученых и специалистов ТСХА, 6-7 июня 2000 г.,

' М„ 2000.

3. Гирсова Н. В. Семена как источник распространения ВВШ Депонированная рукопись (рукопись депонирована во ВНИИТЭИ-Агропром, рег.№ 152/3 ВС - 2000// Труды научной конференции молодых ученых и специалистов ТСХА, 6-7 июня 2000 г., М., 2000.

4. Балан Н. Н., Гирсова Н. В., Кузькин В. И. Исследование вироидной РНК с помощью нанотехнологической установки «Луч-2»// Научная сессия МИФИ-2001, Сборник научных трудов, 2001, т. 4, с. 181 -182.

5. Гирсова Н. В., Тикунов Ю. М., Карлов Г. И. Использование возвратного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГе) для проверки возможности сохранения и передачи вироида (ВВКК) через почву и с растительными остатками// Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы. М., 2001, т. 2, с. 305 - 310.

6. Гирсова Н. В., Можаева К. А. Длительность сохранения вироидов в биологических объектах// Вестник защиты растений, 2002, №1, с. 72 - 74.

7. Mozhaeva К. A., Girsova N. V., Kastalyeva Т. В. Main causes of potato spindle tuber viroid (PSTV) distribution in seed potato within Russia in the

i. early of nineties// Abstracts of VIII th International Plant Virus Epidemiology

Symposium. Aschersleben, Germany, 12-17 May, 2002, p. 106.

8. Mozhaeva K. A., Girsova N. V., Kastalyeva Т. B. Main causes of potato spindle tuber viroid distribution in seed potato in Russia in 1990's//Journal of Russian Phytopathological Society, 2002, vol. 3, p. 39 - 41.

)

[éZf/ Ф 10 29 7

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гирсова, Наталья Викторовна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. История открытия возбудителя, вызывающего веретеновидность клубней картофеля. Географическое распространение ВВКК.

1.2. Основные свойства ВВКК.

1.3. Симптомы поражения и влияние вироидов на растения, штаммы ВВКК, круг растений-хозяев.

1.4. Методы диагностики ВВКК.

1.5. Способы распространения и сохранения патогена в природе. Транспорт в растении.

1.6. Влияние ВВКК на урожайность картофеля и томатов.

1.7. Способы инактивации ВВКК и меры борьбы с заболеванием.

Глава 2. Объект и методы исследования

2.1. Объект и материалы исследования.

2.2. Метод инокуляции растений.

2.3. Методы препаративного выделения ВВККГ

2.3.1. Выделение суммарной низкомолекулярной РНК.

2.3.2. Фракционирование суммарной РНК методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ).

2.3.3. Методика выделения ВВКК из полиакриламидного геля.

Глава 3. Совершенствование методов выделения и диагностики вироидов.

3.1. Диагностика ВВКК методом возвратного электрофореза.

3.2. Исследование вироидной РНК с помощью сканирующего туннельного микроскопа (СТМ).

3.3. Использование томатов в качестве растений-индикаторов ВВКК.

Глава 4. Сохранение нативности вироидной РНК во время хранения in vivo и in vitro

4.1. Сохранение инфекционности вироида в препаратах суммарной низкомолекулярной РНК.

4.2. Сохранение инфекционности ВВКК в сухих листьях.

4.3. Возможность сохранения и передачи вироида через почву и с растительными остатками.

4.4. Сохранение вироида в питательном растворе

4.4.1. Влияние возраста растений на скорость заражения их вироидом.

4.4.2. Способность вироида сохраняться в питательном растворе после удаления из него больных растений.

4.5. Возможность длительного сохранения вироидов в семенах.

4.5.1. Возможность сохранения вироида в семенах, утративших всхожесть.

Глава S. Влияние ВВКК на растения картофеля

5.1. Особенности первичного заражения картофеля вироидом.

5.2. Влияние ВВКК на рост и продуктивность различных сортов картофеля.

Выводы.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Вироид веретеновидности клубней картофеля"

Картофель является ценной продовольственной, технической и кормовой культурой. Вместе с тем, его производство в нашей стране носит пока экстенсивный характер. Среди множества патогенов, вызывающих болезни картофеля, в последние годы выделяются вироиды, - особый класс патогенов, представленных одной низкомолекулярной РНК, - инфицирование которыми может приводить к снижению урожая до 70 - 90%.

Картофель может поражаться несколькими вироидами, но наиболее опасным является вироид веретеновидности клубней картофеля (ВВКК). В России это заболевание под названием «готика» известно с начала 40-х годов. Однако экономически значимые потери от него отмечались только в Поволжье. Такое положение изменилось, когда в стране было налажено массовое производство безвирусного картофеля, технология получения которого не предусматривала идентификации и освобождения картофеля от ВВКК. В результате во многих регионах посадочный материал оказался инфицирован этим патогеном. В настоящее время семеноводческие хозяйства не только несут большие потери от связанного с вироидом резкого снижения урожая, но и являются распространителями ВВКК в другие регионы (Можаева и др., 1994, 1997; Козлов, Крайн, 1995; Дрыгин и др., 2000; Мусин и др., 2001). Кроме картофеля ВВКК поражаются и другие растения сем. пасленовых, в частности томаты. Растения сем. пасленовых инфицируются и другими вироидами, например, вироидом экзокортиса цитрусовых (ВЭЦ), «планто мачо» томата. Вироиды обладают высокой устойчивостью к действию различных химических соединений и факторов окружающей среды, что исключает возможность излечения пораженных ими растений. Поэтому основные меры защиты должны быть направлены на исключение возможности заражения растений при селекции и промышленном семеноводстве.

В этой связи необходимо продолжить изучение свойств вироида, способов его передачи, а также влияния вироида на урожай и его структуру у различных сортов картофеля. Кроме того, необходимо усовершенствовать методы выделения и диагностики с целью более быстрого и надежного определения патогена.

Цель и задачи исследований

1. Усовершенствование методов выделения и диагностики вироида.

2. Исследование стабильности вироида при хранении in vivo и in vitro.

3. Изучение распространения и сохранения ВВКК в водной среде и в почве.

4. Изучение влияния ВВКК на продуктивность различных сортов картофеля и томатов.

Научная новизна исследований

Усовершенствована методика получения препаратов ВВКК, используемых при диагностике патогена.

Впервые получено изображение вироидной РНК с помощью нанотехнологической установки «Луч - 2».

Изучена продолжительность сохранения инфекционности ВВКК и ВЭЦ в растворах РНК и в высушенных листьях.

Установлен срок сохранения вироидов в семенах томатов.

Изучена возможность передачи ВВКК с растительными остатками в почве и с питательным раствором.

Практическая значимость работы

Для диагностики ВВКК отработан метод возвратного электрофореза. Подобраны сорта томатов, которые могут быть использованы в качестве растений-индикаторов.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены на совещании «Совершенствование методов фитосанитарного мониторинга вирусных болезней растеинй и методов учета сорняков - носителей вирусов», проходившем в ВИЗР 19-21 апреля 2000 г.; научной конференции молодых ученых и специалистов ТСХА в июне 2000 г.; Всероссийской конференции «Болезни основных сельскохозяйственных культур, вызывающие чрезвычайные ситуации: Мониторинг, прогноз, система защиты», проходившей во ВНИИФ в 2001 г.; «VHI-m Международном Симпозиуме по эпидемиологии вирусных болезней», проходившем в Германии в г. Ашерслебене 12-17 мая 2002 г.

По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4 главы), выводов и списка литературы.

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Гирсова, Наталья Викторовна

Выводы

1. Оптимизация метода выделения суммарной РНК, содержащей ВВКК, сократила время ее выделения в пересчете на один образец. Применение возвратного электрофореза для диагностики ВВКК позволило четко выявлять вироидную РНК, поскольку этот метод более чувствителен, чем обычно используемый электрофорез в полиакриламидном геле.

4. ВВКК способен к длительному сохранению инфекционности как in vivo, так и in vitro: а) в водном растворе в составе низкомолекулярной РНК при -20°С, по крайней мере, 22 года; б) в лиофильно высушенных листьях при температуре - 20°С - 13 лет; в) в высушенных и хранящихся при комнатной температуре листьях - 2 года; г) во всхожих семенах томатов - до 23 лет; д) в семенах, утративших всхожесть, вироид не был обнаружен.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Гирсова, Наталья Викторовна, Большие Вяземы

1. Анализ генома. Методы. 1990// Под. ред. К. Дейвиса. М.: Мир, 246 с.

2. Анисимов Б.В. 2001. Сортовые ресурсы и качество семенного картофеля//М., 117 с.

3. Баранов В.И., Дынник В.В. 2000. ПЦР-диагностика вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) на основе нового поколения отечественных технологий// Картофель и овощи, № 3, с. 16 17.

4. Бахтизин Р.З. 2000. Сканирующая туннельная микроскопия новый метод изучения поверхности твердых тел// Соросовский образовательный журнал, том 6, № 11, с. 83 - 89.

5. Безвирусное семеноводство картофеля (рекомендации). 1990// М.: ВО «Агропромиздат», 33 с.

6. Бентли М. 1965. Промышленная гидропоника// М.: Колос, 376 с,

7. Берлинчик Е.Е. 1997. Диагностика ВВКК визуальным и индикаторным методами// Весщ академи навук Беларуси сер. Б1ялапчных навук, № 3, с. 50 53.

8. Васильева Т.Я. 1985. Изучение свойств вироида веретеновидности клубней картофеля//Автореф. дис, .канд. биол. наук. М., 23 с.

9. Васильева Т.Я., МожаеваК.А. 1984. Устойчивость вироида веретеновидности клубней картофеля к некоторым физическим факторам// Биологические науки, № 3, с. 15-21.

10. Вредные организмы, имеющие карантинное значение для Европы. 1996//М., Колос, 912 с.

11. Вершинин Б.М., Лялько Р.В., Савин А.И. 2001. Центр безвирусного семеноводства картофеля на Ставрополье// Опыт выращивания оздоровленного семенного картофеля в ООО ЭТК «Меристемные культуры». Практические рекомендации. М., с. 6 13.

12. Галлямов М.О., Яминский И.В. 1998. Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот// М.; МГУ, физ.фак, 17 с.

13. Горюшин В.А. 1963. Природа готики картофеля, распространенной на Украине// В кн.: Материалы научной конференции «Семеноводство и меры борьбы с болезнями вырождения картофеля на Дальнем Востоке», Владивосток, с. 37 39.

14. Горюшин В.А. 1966. Серологическое и электронно-микроскопическое изучение вирусов, обнаруженных в картофеле, пораженном готикой// В кн.: Вирусные болезни с/х растений и меры борьбы с ними. Киев, с. 211 -228.

15. Грама Д.П. 1969. Изучение готики картофеля на Украине// Автореф. .канд. дис. Киев. 18 с.

16. Грама Д.П. 1972.1дентификация ßipycy, видшенного з уражених готикою рослин картоши сорту Лорх// М1кробюл, журнал, т. 34, № 5, с. 625 629.

17. Гросс Г.И. 1987. Вироиды: инфекционные нуклеиновые кислоты, как возбудители болезней растений// Молекулярная биология, т. 21, вып. 6, с. 1480 1485.

18. Доспехов Б.А. 1985. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований)// М.: Агропромиздат, 351 с.

19. Друка А.Я. 1989. Диагностика вироидных заболеваний картофеля и хризантем// Автореф. .канд. дис. Рига, 19 с.

20. Дрыгин Ю.Ф., Кондакова O.A., Атабеков И.Г., Мусин С.М., Бойко В. В., Бабоша A.B. 2000. Проблема вироида в семеноводстве картофеля: диагностика, формирование генобанка, производство исходного материала// Картофель и овощи, № 2, с. 38 40.

21. Дрыгин Ю.Ф., Мусин С.М., Кондакова O.A., Савенков Е.И., Соломатин C.B., Можаева К.А., Атабеков И.Г. 1996. Молекулярная диагностика зараженности оздоровленных сортообразцов картофеля вироидом веретеновидности клубней// Доклады РАСХН, № 6, с. 24 -25.

22. Дынник В.В. 1998. Опыт освоения современных технологий безвирусного семеноводства картофеля// Новые сорта и передовой опыт семеноводства картофеля. Материалы семинара, Ленинградская область, агрофирма «ОНЕГА», август 1998 года, с. 24.

23. Кастальева Т.Б., Можаева К.А. 1988. Фракционирование цетавлоном нуклеиновых кислот из растений, пораженных вироидом веретеновидности клубней картофеля// Биологические науки, № 10, с. 101 105.

24. Кастальева Т.Б., Можаева К.А. 1991. Изучение возможности оценки устойчивости томатов к ВВКК по накоплению патогенеззависимых белков// IX Всесоюзное совещание по иммунитету растений к болезням и вредителям. Тезисы докладов. Минск, с. 231 232.

25. Кастальева Т.Б., Можаева К.А., Писецкая Н.Ф., Романова С.А., Трофимец Л.Н. 1992. Вироид веретеновидности клубней и оздоровление картофеля// Вестник Росийской академии с.-хоз. наук, № 3, с. 22 24.

26. Кинчарова М.Н. 1999. Влияние сорта, регуляторов роста и биопрепаратов на устойчивость картофеля к вироиду веретеновидности клубней в условиях Среднего Поволжья// Автореф. дис. .канд. с-хоз. наук. Курган, 20 с.

27. Кинчарова М.Н., Макеева А.М., Кагарлицкая A.C. 1998. Влияние регуляторов роста и биопрепаратов на устойчивость картофеля квироидно-вирусной инфекции и урожайность клубней// Проблемы повышения продуктивности полевых культур. Самара, с. 121 123.

28. Козлов Л.П. 1997. Стратегия и тактика борьбы с вироидом веретеновидностиклубней картофеля// Arpo XXI, №2, с. 10-11.

29. Козлов Л.П., Крайн A.B. 1995. Проблемы сертификации картофеля на вироидную инфекцию// Защита растений в условиях агропромышленного комплекса: экономика, эффективность,экологичность. Тезисы докладов. Санкт-Петербург, с. 12-13.

30. Колобаев В.А. 1964. Изучение инфекционности готики картофеля// В кн.: Вирусные болезни с/х растений и меры борьбы с ними. М., с. 127 -133.

31. Кокина Т.П., Анисимов Б.В. 2001. Контроль качества и сертификация семенного картофеля// Картофель и овощи, № 2, с. 6 — 8.

32. Комаров С.М. 2000. Искусственные объекты наномира// Химия и жизнь XXI век, №5, с. 10 - 17.

33. Леонтьева Ю.А. 1962. Инфекционность вирусных болезней (картофеля)// Картофель и овощи, № 1, с. 24 25.

34. Леонтьева Ю. А. 1964. О готике картофеля// В кн.: Вирусные болезни с.-х. растений и меры борьбы с ними. М., стр. 115 122.

35. Леонтьева Ю.А. 1966а. Идентификация готики картофеля// Труды Куйбышевского СХИ, 14, с. 279 286.

36. Леонтьева Ю.А. 19666. Эффективность летних посадок и ранних сроков уборки картофеля в борьбе с веретеновидностью клубней и вирусом Y// Научные Труды Харьковского СХИ, т. 56, с. 109 118.

37. Леонтьева Ю.А. 1971. Веретеновидность клубней (готика) одно из основных заболеваний картофеля в Поволжье// Автореф. дис. . докт. биол. наук. Пушкин, 43с.

38. Леонтьева Ю.А. 1977. О штаммах вируса (вироида) веретеновидности клубней картофеля// В кн.: Штаммы вирусов растений. Владивосток, с. 180- 187.

39. Леонтьева Ю. А. 1980. Томаты и вироид веретеновидности клубней картофеля// Защита растений, № 8, с. 22.

40. Лысенко Н.Ю., Калягина Л.Г., Можаева К.А. 1997. Влияние вироида веретеновидности клубней картофеля на развитие и продуктивность безвирусного картофеля// Вестник Росийской академии с.-хоз. наук, № 6, с. 42 44.

41. Марковская Г.К. 1983. Анатомо-физиологические изменения растений картофеля и томатов под влиянием вироидной инфекции// Автореф. дис. .канд. биол. наук. М., 14 с.

42. Маурер Г. 1971. Диск электрофорез// М., 247 с.

43. Методические указания по диагностике вироида веретеновидности клубней картофеля. 1999// РАСХН., М., 24 с.

44. Методические указания по диагностике и идентификации вироидов веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) и карликовости хризантем (ВКХр). 1988// ВАСХНИЛ. М., 43 с.

45. Методы оценки оздоровленных сортов и меристемных линий в элитном семеноводстве картофеля. 1991// НИИКХ, М., 40 с.

46. Можаева К.А., Васильева Т.Я. 1982. Некоторые причины, препятствующие распространению вироида веретеновидности клубней в посадках картофеля// Биологические науки, № 11, с. 26 30.

47. Можаева К.А., Васильева Т.Я. 1990. Изучение действия веществ белково пептидной природы на ВТМ и ВВКК// Тезисы докладов научно - технической конференции «Создание перспективных пестицидов и сырья для их производства». Уфа, с. 56.

48. Можаева К.А., Васильева Т.Я. 1991. Изучение веществ возможных ингибиторов вироидной инфекции// Биологические науки, № И, с. 31 — 35.

49. Можаева К.А., Васильева Т.Я. 1992. Поиск новых средств защиты растений от вирусных и вироидных инфекций. II. Изучение антивироидной активности РНК-полимераз//Биологические науки, № 7, с. 61 65.

50. Можаева К. А., Васильева Т. Я., Кастальева Т. Б. 1994. Опасность распространения вироида с безвирусным картофелем// Картофель и овощи, №2, с. 28 29.

51. Можаева К. А., Васильева Т. Я., Кастальева Т. Б. 1996. Заражение томатов вироидом веретеновидности// Вестник РАСХН, №3, с. 57 -58.

52. Можаева К. А., Васильева Т. Я., Кастальева Т. Б. 1997. Вироид ВКК передается через корневую систему// Картофель и овощи, №2, с. 28.

53. Можаева К. А., Васильева Т. Я., Кастальева Т. Б. 1998. Влияние вироида веретеновидности картофеля на его продуктивность// Вестник РАСХН, №3, с. 42-44.

54. Можаева К. А., Васильева Т. Я., Налевина Т. Н. 1980. Выделение и фракционирование РНК из растений, пораженных вироидом веретеновидности клубней картофеля (ВВКК)// В кн.: Вирусные болезни растений и меры борьбы с ними. Владивосток, с. 33 39.

55. Можаева К. А., Грачева Н. К., Тер-Сааков А. А. 19866. Об элементном составе клубней картофеля, пораженного вироидом веретеновидности клубней картофеля// Биологические науки, № 6, с. 23 25.

56. Можаева К.А., Мелдрайс Я.А., Друка А.Я., Кастальева Т.Б., Лине И.Э., Васильева Т.Я. 1989. Сравнительное изучение различных методов диагностики вироида веретеновидности клубней картофеля// Биологические науки, №7, с. 104-110.

57. Мусин С.М., 1997. Проблемы биотехнологии картофеля в России// Arpo XXI, №4, с. 6-7.

58. Мусин С. М., Бабоша А. В., Кондакова O.A., Дрыгин Ю. Ф., Атабеков И. Г. 2001. Диагностика и контроль вироида веретеновидности клубней картофеля// Защита и карантин растений, №10, с. 22 23.

59. Мусин С. М., Бойко В. В., Бабоша А. В. 1998. Получение новых оздоровленных меристемных линий и сортов картофеля// Arpo XXI, №11, с. 20-21.

60. Мусин С. М., Бойко В. В., Усков А. И. 1995. Диагностика и терапия вироида веретеновидности клубней картофеля// Защита растений вусловиях агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность. Тезисы докладов. Санкт-Петербург, с. 348.

61. Остерман Л.А. 1981. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование/ М.: Наука, 288 с.

62. Пантелеймонов И.А. 1998. Межрегиональная ассоциация по семеноводству картофеля «Северсемкартофель»// Новые сорта и передовой опыт семеноводства картофеля. Материалы семинара, Ленинградская область, агрофирма «ОНЕГА», август 1998 года, с. 15 -16.

63. Пересыпкин В. Ф., Лопатин В. М., Дробницкая О. А. 1966. К вопросу приготовления антисыворотки к вирусу готики картофеля// В кн.: Вирусные болезни с/х растений и меры борьбы с ними. Киев, с. 188 -196.

64. Рожалин Л. В., Белова О. Д. 1948. К вопросу о готике или веретеновидности картофеля// Агробиология, №6, с. 83 96.

65. Романова С. А. 2002. Итоги изучения вирусных, вироидных и микоплазменных болезней картофеля на Дальнем Востоке России// В кн. . Становление и развитие фитовирусологии на Дальнем Востоке России, с. 175 193.

66. Романова С. А., Можаева К. А., Рейфман В. Г., Леднева В. А. 1996. Вироид веретеновидности клубней картофеля на Дальнем Востоке// В кн.: Проблемы фитовирусологии на Дальнем Востоке, с. 41 47.

67. Сибирякова И.И., Коротаева С.Г., Романова С.А., Гнутова Р.В. 1999. Электрофоретическое выявление вироида веретеновидности клубней картофеля// С-хоз. биология, №5, с. 88 90.

68. Терещенко ОТ. 1937. Нова хвороба картопл1// Сад та огород, № 10, с. 13-17.

69. Терещенко А. И. 1941. Удобрения и вирусные болезни картофеля// В кн.: Вирусные болезни растений и меры борьбы с ними. М.-Л., с. 321 -325.

70. Трофимец Л.Н. 1990. Вирусные болезни картофеля// М., ВО «Агропромиздат», 79 с.

71. Усков А. И., Бойко Ю. П., Бойко В. В. 2000. Организация воспроизводства оздоровленного исходного материала// Картофель и овощи, №2, с. 42.

72. Усков А.И., Симаков Е.А. 2001. Система воспризводства оздоровленного исходного материала// Картофель и овощи, № 3, с. 15 -16.

73. Фомюк М. К. 1953. О готике картофеля// Научные труды ин-та энтомологии и фитопатологии АН УССР, т.4, с. 62.

74. Фомюк М- К. 1954. Готика картофеля и обоснование мероприятий по борьбе с нею// Автореф. .канд. дис. Киев, 20 с.

75. Фомюк М.К. 1966. Вопросы диагностики готики картофеля// В кн: Вирусные болезни сельскохозяйственных растений и меры борьбы с ними. Киев, с. 205 210.

76. Яшина И. М., Склярова Н. П. 2000. Картофель//М.: ЗАО «Фитон + », 128 с.

77. Altenburg Е. 1946. The "viroid theory" in relation to plasmagenes, viruses, cancer and plastids//Amer. Naturalist, vol. 80, №794, p. 559 - 567.

78. Bagnall R. H. 1967. Serology of the potato spindle tuber virus// Phytopathology, vol. 57, №5, p. 533 534.

79. Benson A. P., Salama F. M., Singh R. P. 1964. Concentration and characterization of potato spindle tuber virus// Amer. Potato J., vol. 41, №9, p. 293.

80. Biao Ding, Kwou M.-O., Hammond S., Owens R. 1997. Cell to - cell movement of potato spindle tuber viroid// The Plant Journal, vol. 12, №4, p. 931 -936.

81. Bonde R., Merriam D. 1951. Studies on the dissemination of the potato spindle tuber virus by mechanical inoculation// Amer. Potato J., vol. 28, №3, p. 558 560.

82. Branch A. D., Robertson H. D. 1984. A replication cycle for viroids and other small infectious RNA's// Science, vol. 223, p. 450 455.

83. Camacho Henriquez A., Sanger, H. L. 1982. Analysis of acid extractable tomato leaf proteins after infection with a viroid, two viruses and a fungus and partial purification of the pathogenesis related protein P14// Arch. Virol., vol. 74, p. 181 - 193.

84. Candresse Т., Macquaire G., Brault V., Monsion M., Dunez J. 1990.32P-and biotin labeled in vitro transcribed cRNA probes for the detection of potato spindle tuber viroid and chrysanthemum stunt viroid// Res. Virol., vol. 141, p. 97- 107.

85. Da Graca J. V., Martin M. M. 1981. Ultrastructural changes in avocado leaf tissue infected with avocado sunblotch// J. Phytopathology, vol. 102, p. 185 194.

86. Davies, J. W., Kaesberg, P., Diener, Т. O. 1974. Potato spindle tuber viroid. XII. An investigation of viroid RNA as a messenger for protein synthesis// Virology, vol. 61, p. 281 286.

87. De Bokx J. A., Piron P. G. M. 1981. Transmission of potato spindle tuber viroid by aphids// Neth. J. Plant Pathol., vol. 87, p. 31 34.

88. Diener Т. O. 1971a. A plant virus with properties of a free ribonucleic acid: potato spindle tuber virus//In: Comparative Virology. New York and London, Acad. Press, chap. 14, p. 433 478.

89. Diener Т. O. 1971b. Potato spindle tuber virus: A plant virus with properties of a free nucleic acid. III. Subcellular location of PSTV-RNA and the question of whether visions exist in extracts or in situII Virology, vol. 43, №1, p. 75 -89.

90. Diener Т. O. 1979. Viroid and viroid diseases// A Wiley Interscience Publication. N. - Y., Toronto, 245 p.

91. Diener Т. O., Hadidi A., Owens R. A. 1977. Methods for studing viroids// In: Methods in Virology, Maramorosch K, and Koprowski, H., Eds., Academic Press, New York, vol. 6, p. 185 217.

92. Diener T. O., Raymer W. B. 1967. Potato spindle tuber virus: a plant virus with properties of a free nucleic acid// Science, vol. 158, №3799, p. 378-381.

93. Diener T.O., Owens R.A., Hammond R.W. 1993. Viroids: the smallest and simplest agents of infectious disease. How do they make plants sick?// Intervirology, vol. 35, p. 186 195.

94. Fernow K. C., Peterson L. C., Plaisted R. L. 1969. The tomato test for eliminating spindle tuber from potato planting stock// American Potato Journal, vol. 46, № 11, p. 424 430.

95. Fernow K. H. 1967. Tomato as a test plant for detecting mild strains of potato spindle tuber viroid// Phytopathology, vol. 57, № 11, p. 1347 -1352.

96. Fernow K. H., Peterson L. C., Plaisted R. L. 1970. Spindle tuber virus in seed and pollen of infected potato plants// American Potato Journal, vol. 47, №3, p. 75-81.

97. Forster A. C., Jeffries A. C., Sheldon C. C., Symons R. H. 1987. Structural and ionic requirements for self-cleavage of virusoid RNA and trans self-cleavage of viroid RNAII Cold Sprig Harbor Symp. Quant. Biol., vol. 52, p. 249 259.

98. Forster A. C., Symons R. H. 1987. Self-cleavage of plus and minus RNAs of a virusoid and a structural model for the active site// Cell, vol. 49, p. 211 -220.

99. Garnsey S. M., Randies J. W. 1987. Biological interactions and agricultural implications of viroids// In: Viroids and Viroid like Pathogens. J. S. Semancik, ed. CRC Press, Boca Raton, Florida., p. 127 160.

100. Garnsey S. M., Whidden R. 1971. Decontamination treatments to reduce the spread of citrus exocortis virus (CEV) by contaminated tools// Proc. Ha. State Hort. Soc., vol. 84, p. 63 67.

101. Goss R. W. 1926. Transmission of potato spindle tuber by cutting knives and seed piece contact// Phytopathology, vol. 16, p. 299 - 304.

102. Goss R. W. 1928. Transmission of potato spindle tuber by grasshoppers (Locustidae)ll Phytopathology, vol. 18, p. 445 448.

103. Goss R. W. 1930. Insect transmission of potato virus diseases// Phytopathology, vol. 20, p. 136.

104. Goss R. W. 1931. Infection experiments with spindle tuber and unmottled curly dwarf of the potato// Univ. Nebraska Agr. Exp. Sta. Res. Bull., vol. 53, 36 p.

105. Grasmic M. E., Slack S. A. 1986. Effect of potato spindle tuber viroid on sexual reproduction and viroid transmission in true potato seed// Canadian Journal of Botany, vol. 64, №2, p. 336 340.

106. Hadidi A. 1988. Synthesis of disease associated proteins in viroid -infected tomato leaves and binding of viroid to host proteins// Phytopathology, vol. 78, p. 575 - 578.

107. Hadidi A., Diener T. O. 1977. De novo synthesis of potato spindle tuber viroid as measured by incorporation of P// Virology, vol. 78, p. 99.

108. Hadidi A., Levy L., Podleckis E.V. 1995. Polymerase chain reaction technology in Plant Pathology// In: Molecular Methods in Plant Pathology. R.P. Singh, U.S. Singh, eds. CRC Press, Boca Raton, USA, ch. 13.

109. Hanold D., Randies J. W. 1991. Coconut cadang cadang disease and its viroid agent// Plant Dis., vol. 75, p. 330 - 335.

110. Harders, J., Lukacs, N., Robert-Nicoud, D., Jovin, T. M., Riesner, D. 1989. Imaging of viroids in nuclei from tomato leaf tissue by in situ hybridization and confocal laser scanning microscopy// The EMBO Journal, vol. 8, №13, p. 3941 -3949.

111. Hari V. 1980. Ultrastructure of potato spindle tuber viroid-infected tomato leaf tissue// Phytopathology, vol. 70, p. 385 387.

112. Haseloff J., Mohamed N. A., Symons R. H. 1982. Viroid RNAs of cadang cadang disease of coconuts// Nature (London), vol. 299, p. 316.

113. Hollings M., Stone O. M. 1973. Some properties of chrysanthenum stunt, a virus with the characteristics of an uncoated ribonucleic acid// Ann. Appl. Biol., vol. 74, №3, p. 333 348.

114. Howell S.H. 1984. Physical structure and genetic organization of the genome of maize streak virus (Kenyan isolate)// Nucleic Acids Res., vol. 12, p. 7359 7370.

115. Hunter D. E., Darling D. H., Beale W. L. 1969. Seed transmission of potato spindle tuber virus// Am. Potato J, vol. 46, №7, p. 247 250.

116. Huttinga H., Mosch W. H. M., Treur A. 1987. Comparison of bidirectional electrophoresis and molecular hybridization methods to detect potato spindle tuber viroid and chrysanthemum stunt viroid// Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, vol. 17, p. 37 43.

117. Ishikawa M., Meshi T., Ohano T„ Okada Y., Sano T., Uyeda I., Shikata E. 1984. A revised replication cycles for viroids: the role of longer than unit length RNA in viroid replication// Mol. Gen. Genet., vol. 196, p. 421-428.

118. Kaczmarek U. 1989. The effect of various inoculation procedures on potato plants infection with PSTV and viroid detectability// Virus disease of plants. Warczawa, p. 41 53.

119. Kamen R. I. 1975. Structure and function of the Q replicase// In: RNA Phage. N. D. Zinder, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., p. 203 234.

120. Keese P., Symons R. H. 1985. Domains in viroids: Evidence of intermolecular RNA rearrangements and their contribution to viroid evolution// Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., vol. 82, p. 4582 4586.

121. Keese P., Symons R. H. 1987. The structure of viroids and virusoids// In: Viroid and Viroid Like Pathogens. J. S. Semancik, ed. CRC Press, Boca Raton, Florida, p. 1 - 48.

122. Keller D., Bustamante C., Keller R.W. 1989. Imaging of single uncoated DNA molecules by scanning tunneling microscopy// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, № 14, p. 5356 5360.

123. Kojima M., Murai M., Shikata E. 1983. Cytopathic changes in viroid-infected leaf tissue, cucumbers, tomatoes// J. Fac. Agr. Hokkaido Univ., vol. 61, p. 219-224.

124. Koltunow A. M., Rezaian M. A. 1989. A scheme for viroid classification// Intervirology, vol. 30, p. 194.

125. Kowalska Noordam A., Chrzanowska M., Skrzeczkowska S. 1987. Reaction of ten polish potato cultivars to severe and mild strains of potato spindle tuber viroid// Ziemniak, 1986 - 1987, Poznan, p. 71 - 92.

126. Kryczynski S., Stawiszynska A., Abuhliga T. A. 1995. The reaction of field grown tomato cultivars to infection with potato spindle tuber viroid (PSTV)// Phytopathologia Polonica, 10 (XXII), p. 85-91.

127. Kryczynski S., Stawiszynska A., Abuhliga T. A. 1999. Translocation and distribution of potato spindle tuber viroid in infected plants// Phytopathologia Polonica, p. 61 -71.

128. Kryczynski S., Stawiszynska A., Skrzeckowska St. 1991. Detection of potato spindle tuber viroid in composite plant samples// Phytopathologia Polonica XII, 19-20 Sept., p. 29 32.

129. Lawson R. H. 1987. Chrysanthemum stunt// In: The Viroid. Т. O. Diener, ed. Plenum Press, N.-Y., p. 247 259.

130. LeClerg, E. L., Lombard, P. M., Eddins, A. H., Cook, H. T., Campbell, J. C. 1944. Effect of different amount of spindle tuder and leaf roll on yield of Irish potatoes/Am. Potato J., vol. 21, p. 60-71.

131. Lewin B. 1997. Genes VI// Oxford, New York, Tokyo. Oxford University Press. 1260 p.

132. Lizarraga R. E., Salazar L. F., Roca W. M., Schilde-Rentschler L. 1980. Elimination of potato spindle tuber viroid by low temperature and meristem culture// Phytopathology, vol. 70, №8, p. 754 755.

133. Macquaire G., Monsion M., Dunez J. 1987. Etude des possibilities de detection précoce du viroide des tubercules fusiformes de la pomme de terre// Agronomie, vol. 7, №8, p. 639 645.

134. Macquaire G., Monsion M., Mouches C., Cadresse T., Dunez J. 1984. Spot hybridization: application to viroid identification// Annales de Virologie, vol. 135E, №2, p. 219 230.

135. Manzer F. E., Merriam D. 1961. Field transmission of the potato spindle tuber and virus X by cultivating and hillihg equipment// Amer. Potato J., vol. 38, № 10, p. 346 352.

136. Martin W.H. 1922. "Spindle tuber", a new potato trouble// Hints to potato growers. New Jersey State Potato Assoc., 3, № 8 , 4 pp.

137. MatouSek J., Rakousky S. 1993. Antisense DNA inhibits infection of potato spindle tuber viroid// Folia Biologica, vol. 39, p. 87 100.

138. MatouSek J., Trnena L., Rakousky S., Riesner D. 1994. Inhibition of potato spindle tuber viroid (PSTVd) infectivity with antisense RNA transcripts// J. Phytopathol., vol. 141, № 1, p. 10 24.

139. McClean A. P. D. 1948. Bunchy top disease of the tomato: additional host plants and the transmission of the virus through the seed of infected plants// Sci. Bull. Dept. Agrio. South. Afric., vol. 256, 28 p.

140. McClements W. L., Kaesberg P. 1977. Size and secondary structure of potato spindle tuber viroid// Virology, vol. 76, №2, p. 477 484.

141. McKay M. B., Dykstra T. P. 1932. Potato virus diseases// Oregon State Coll. Agric. Exp. Sta. Bull., p. 294.

142. Merriam D., Bonde R. 1954. Dissemination of spindle tuber by contaminated tractor wheels and by foliage contact with diseased potato plants// Phytopathology, vol. 44, p. 111.

143. Mink G. L. 1993. Pollen- and seed-transmitted viruses and viroids// Annu. Rev. Phytopathol., vol. 31, p. 375 402.

144. Morris T., Wright N. 1975. Detection on PAAG of a diagnostic nucleic acid from tissue infected with potato tuber virus// Am. Potato J., vol. 52, №2, p. 57 63.

145. Miihlbach H.-P., Sanger H.L. 1978. Viroid replication is inhibited by a-amanitin// Nature, vol. 278, № 5700, p. 185 188.

146. Nakahara Kenji, Hataya Tatsuji, Uyeda Ichiro. 1999. A simple, rapid method of nucleic acid extraction without tissue homogenization for detecting viroids by hybridization and RT-PCR// J. Virol. Methods, vol. 77, № l,p. 47-58.

147. Niblett, C. L., Dickson, E., Horst, R. K., and Romaine, C. P. 1980. Additional hosts and an efficient purification procedure for four viroids // Phytopathology, vol. 70, p. 610.

148. O'Brien M. J., Raymer W. B. 1963. Symptomless host of the potato spindle tuber vims (PSTV)// Phytopathology, vol. 53, №8, p. 884.

149. Owens R. A., Diener T. O. 1982. RNA intermediates in potato spindle tuber viroid replication// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 79, p. 113-117.

150. Owens R. A., Steger G., Hu Y„ Fels A., Hammond R. W., Riesner D. 1997. RNA structural features responsible for potato spindle tuber viroid (PSTVd) pathogenicity// Phytoparasitica, vol. 25, №1, p. 73.

151. Paduch-Cichal E., Kryszynski S. 1987. A low temperature therapy and meristem tip culture for eliminating four viroids from infected plants// J. Phytopathol., vol. 118, p. 341 - 346.

152. Palukaitis P., Zaitlin M. 1987. The nature and biological significance of linear potato spindle tuber viroid molecules// Virology, vol. 157, № 1, p. 199-210.

153. Pfannenstiel M. A,, Slack S. A., Lane L. C. 1980. Detection of potato spindle tuber viroid in field-grown potatoes by an improved electrophoretic assay// Phytopathology, vol. 70, p. 1015.

154. Pospieszny H. 1997. Antiviroid activity of chitosan// Crop. Protection., vol. 16, №2, p. 105 106.

155. Querci M., Owens R. A., Bartolini I., Lazarte V., Salazar L. F. 1997. Evidence for heterologous encapsidation of potato spindle tuber viroid in particles of potato leafroll virus// J. Gen. Virol., vol. 78, №6, p. 1207 1211.

156. Querci M., Owens R. A., Vargas C., Salazar L. F. 1995. Detection of potato spindle tuber viroid in avocado growing in Peru// Plant Disease, vol. 79, №2, p. 196-202.

157. Raymer W. B., Diener T. O. 1969. Potato spindle tuber virus: a plant virus with properties of a free nucleic acid. I. Assay, extraction and concentration// Virology, vol. 37, №3, p. 343 350.

158. Riesner D. 1990. Structure of viroids and their replication intermediates. Are thermodynamic domains also functional domains?// Seminars in Virol. 1, p. 83 99.

159. Riesner D., Gross H. J. 1985. Viroid// Annu. Rev. Biochem., vol. 54, p. 531 -564.

160. Riesner D., Henco K., Rokohl U., Klotz G., Kleinschmidt A. K., Domdey H., Jank P., Gross H. J., Sanger H. L. 1979. Structure and structure formation of viroids// J. Mol. Biol., vol. 133, №1, p. 85 115.

161. Robertson H. D., Branch A. D. 1987. The viroid replication process// In: Viroids and Viroid Like Pathogens. Semancik J. S., ed. CRC Press, FL„ p. 49 - 69.

162. Robertson H. D., Rosen D. L., Branch A. D. 1985. Cell free synthesis and processing of an infectious dimeric transcript of potato spindle tuber viroid RNA// Virology, vol. 142, p. 441.

163. Roistacher C. N., Calavan E. C., Blue R. L. 1969. Citrus exocortis virus chemical inactivation on tools, tolerance to heat and separation of isolates// Plant Dis. Reptr., vol. 53, p. 333 - 336.

164. Romaine C. P., Horst R. K. 1975. Suggested viroid etiology for chrysanthemum chlorotic mottle disease// Virology, vol. 64, №1, p. 86 95.

165. Rudzinska-Langwald A. 1999. Cytopathological changes is nucleus of Lycopersicon esculentum cult. Rutgers plants infected with potato spindletuber viroid (PSTVd)// Annals of Warsaw Agr. Univ. SGGW. Agr. №35, p. 3- 13.

166. Salazar L. F. 1996. Potato viruses and their control// Lima. Peru: CIP, 214 p.

167. Salazar L. F., Querci M., Bartolini I., Lazarte V. 1995. Transmission of potato spindle tuber viroid by aphids assisted by potato leafroll virus// Fitopatología, vol. 30, №1, p. 56 58.

168. Sänger H. L. 1987. Viroid function: viroid replication// In: The Viroid. T. O. Diener, ed. Plenum Press, N. Y., p. 117 166.

169. Schmitz A., Riesner D. 1998. Correlation between bending of the VM region and pathogenicity of different potato tuber viroid strains// RNA, vol. 4, № 10, p. 1295- 1303.

170. Schroeder M., Weidemann H.-L. 1989. Simplified application of return gel electrophoresis for the routine detection of PSTVd// Bulletin OEPP/ EPPO Bulletin, vol. 19, № 4, p. 661 665.

171. Schultz E. S., Folsom D. 1923a. Spindling tuber and other degeneration diseases of Irish potatoes// Phytopatology, vol. 13, p. 40.

172. Schultz E. S., Folsom D. 1923b. Transmission, variation, and control of certain degeneration diseases of Irish potatoes// J. Agr. Res., vol. 25, p. 43 117.

173. Schumacher J., Meyer N., Riesner D., Weidemann H. L. 1986. Diagnostic procedure for detection of viroids and viruses with circular RNAs by "return" gel electrophoresis// J. Phytopathol., vol. 115, p. 332 -343.

174. Schumacher J., Randies J. E., Riesner D. 1983a. A two dimensional electrophoretic technique for detection of circular viroids and virusoids// Anal. Biochem., vol. 135, p. 228 - 295.

175. Schumacher J., Sänger H. L., Riesner D. 1983b. Subcellular localization of viroids in highly purified nuclei from tomato leaf tissue// The EMBO Journal, vol. 2, №9, p. 1549 1555.

176. Semancik J. K., Weather L. G. 1972. Exocortis virus: an infectious free-nucleic acid plant virus with unusual properties// Virology, vol. 47, №2, p. 456 466.

177. Semancik J. S., Morris T. J., Weathers L. G., Rodorf B. F., Kearns D. R. 1975. Physical properties of a minimal infectious RNA (viroid) associated with the exocortis disease// Virology, vol. 63, №1, p. 160 167.

178. Semancik J. S., Vanderwoude W. J. 1976. Exocortis viroid: cytopathic effects at the plasma membrane in association with pathogenic RNA// Virology, vol. 69, p. 719 726.

179. Singh A., Sänger H. L. 1980. A simple and rapid method for partial purification of viroid and other cellular ribonucleic acids of higher secondary structure// Cell. Mol. Biol., vol. 25, p. 291.

180. Singh R. P. 1970. Seed transmission of potato spindle tuber virus in tomato and potato// Am. Potato J., vol. 47, p. 225 227.

181. Singh R. P. 1971. A local lesion host for potato spindle tuber virus// Phytopathology, vol. 61, p. 1034- 1035.

182. Singh R. P. 1973. Experimental host range of the potato spindle tuber "virus"// Am. Potato J., vol. 50, p. 111 123.

183. Singh R. P. 1977. Piperonyl butoxide as a protectant against potato spindle tuber viroid infection// Phytopathology, vol. 67, p. 933 935.

184. Singh R. P. 1983. Viroids and their potential danger to potatoes in hot climates// Can. Plant Dis. Surv., vol. 63, p. 13-18.

185. Singh R. P. 1984. Solanum x berthaultii, a sensitive host for indexing potato tuber viroid from dormant tubers// Potato Research, vol. 27, №2, p. 163- 172.

186. Singh R. P. 1985. Clones of Solanum berthaultii resistant to potato spindle tuber viroid// Phytopathology, vol. 75, p. 1432 1434.

187. Singh R. P. 1991. Return Polyacrylamide gel electrophoresis for the detection of viroids// In: Viroids and Satellites: Molecular Parasites at the frontier of Life. K. Maramorsch, ed. CRC Press, Boca Raton, Florida, p. 89 - 118.

188. Singh R. P., Bagnall R. H. 1968a. Infectious nucleic acid from host tissues infected with the potato spindle tuber virus// Phytopathology, vol. 58, №5, p. 696-699.

189. Singh R. P., Bagnall R. H. 1968b. Solanum rostratum Dunal, a new test plant for the potato spindle tuber virus// Amer. Potato J., vol. 45, №9, p. 335 -336.

190. Singh R. P., Boucher A. 1987. Electrophoretic separation of a severe from mild strains of potato spindle tuber viroid// Phytopathology, vol. 77, №11, p. 1588- 1591.

191. Singh R. P., Boucher A. 1988. Comparative detection of mild strains of potato spindle tuber viroid from the dormant potato tubers by return -Polyacrylamide gel electrophoresis and nucleic acid hybridization// Potato Research, vol. 31, p. 159- 166.

192. Singh R. P., Boucher A., Seabrook J. E. A. 1988. Detection of the mild strains of potato spindle tuber viroid from single true potato seed by return electrophoresis// Phytopathology, vol. 78, p. 663 667.

193. Singh R. P., Boucher A., Singh A. 1991a. High incidence of transmission and occurrence of a viroid in commercial seeds of Coleus in Canada// Plant Dis., vol. 75, p. 184 187.

194. Singh R. P., Boucher A., Somerville T. 1989. Evaluation of chemicals for disinfection of laboratory equipment exposed to potato spindle tuber viroid// Am. Potato J., vol. 66, p. 239 246.

195. Singh R. P., Boucher A., Somerville Т. H. 1993. Interaction between a mild and severe strain of potato spindle tuber viroid in doubly infected potato plants// American Potato Journal, vol. 70, №2, p. 85 92.

196. Singh R. P., Boucher A., Wang R. G. 1991b. Detection, distribution and long term persistence of potato spindle tuber viroid in true potato seed from Heilongjiang, China// Am. Potato J., vol. 68, p. 65 - 74.

197. Singh R. P., Finnie R. E. 1973. Seed transmission of potato spindle tuber metavirus through the ovules of Scopolia sinensis// Can. Plant Dis. Surv., vol. 53, p. 153- 154.

198. Singh R. P., Finnie R. E. 1977. Stability of potato spindle tuber viroid in freeze-dried leaf powder// Phytopathology, vol. 67, p. 283 286.

199. Singh R. P., Finnie R. E., Bagnall R. H. 1971. Losses due to the potato spindle tuber virus// Am. Potato J., vol. 48, p. 262 267.

200. Singh R. P., Michniewiuz J. J., Narang S. A. 1975. Piperonyl butoxide, a potent inhibitor of potato spindle tuber viroid in Scopolia sinensis// Can. J. Biochem., vol. 53, p. 1130- 1132.

201. Singh R. P., O'Brien M. J. 1970. Additional indicator plants for potato spindle tuber virus// Amer. Potato J., vol. 47, №10, p. 367 371.

202. Singh R. P., Slack S. A. 1984. Reactions of tuber bearing Solanum species to infection with potato spindle tuber viroid// Plant Dis., vol. 68, p. 784-787.

203. Singh R. P., Somerville Т. H. 1987. New disease symptoms observed on field grown potato plants with potato spindle tuber viroid and potato virus Y infectious// Potato Res., vol. 30, p. 127 - 132.

204. Singh R.P., Boucher A., Somerville Т.Н. 1992. Detection of potato spindle tuber viroid in the pollen and various parts of potato plant pollinated with viroid infected pollen// Plant Dis., vol.,76, № 9, p. 951 - 953.

205. Singh R.P., Dhar A.K. 1998. Detection and management of plant viroids// In: Plant virus disease control. Hadidi A., Khetarpal R.K., Koganezawa H., eds. APS PRESS, The American Phytopathological Society, St. Paul, Minnesota, p. 428 448.

206. Skrzeczkowski L. J., Howell W. E., Mink G. I. 1993. Correlation between leaf epinasty symptoms on two apple cultivars and results of cDNA hybridization for detection of apple scar skin viroid// Plant Dis., vol. 77, p. 919-921.

207. Sogo J. M., Koller Т. H., Diener Т. O. 1973. Potato spindle tuber viroid: X. Vizualization and size determination by electron microscopy// Virology, vol. 55, №1, p. 70 80.

208. Spieker R. L., Haas В., Charng Y.-C., Freimuller K., Sanger H. L. 1990. Primary and secondary structure of a new viroid 'species' (CbVd 1) present in the Coleus blumei cultivar 'Bienvenue'// Nucl. Acids Res., vol. 18, p. 3998.

209. Stark-Lorenzen P., Guitton M.-C., Werner R., MUhlbach H.-P. 1997. Detection and tissue distribution of potato spindle tuber viroid in infectedtomato plants by tissue print hybridization// Arch. Virol., vol. 142, №7, p. 1289- 1296.

210. Stöcker S., Guittons M. C., Barth A., Mühlbach H. P. 1993. Photosynthetically active suspension cultures of potato spindle tuber viroid infected tomato cells as tools for studing viroid-host cell interaction// Plant Cell Reports, vol. 12, p. 597 602.

211. Syller J., Marczewski W. 2001. Potato leafroll virus assisted aphid transmission of potato spindle tuber viroid to potato leafroll virus - resistant potato// J. Phytopathol., vol. 149, № 3 - 4, p. 195 - 201.

212. Syller J., Marczewski W., Pawlowicz J. 1997. Transmission by aphids of potato spindle tuber viroid encapsidated by potato leafroll luteovirus particles// European Journal of Plant Pathology, vol. 103, p. 285 289.

213. Van Loon L.C. 1985. Pathogenesis related proteins// Plant Mol. Biol., vol. 4, p. 111-116.

214. Weidemann H.-L. 1987. The distribution of potato spindle tuber viroid in potato plants and tubers// Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, vol. 17, p. 45 -50.

215. Weidemann H.-L., Buchta U. 1998. A simple and rapid method for the detection of potato spindle tuber viroid (PSTVd) by RT-PCR// Potato Res., vol. 41, № l,p. 1-8.

216. Xu H., Nie J., Ward L. J., De Boer S. H. 1999. Comparison of techniques for detection of potato spindle tuber viroid in dormant potato tubers: Abstr. Can. Phytopathol. Soc., Annu. Meet., Montreal//Can. J. Plant Pathol., vol. 21,№ 2, p. 206.

217. Yamamoto H., Kagani Y., Jurokawa M., Nishimura S., Ukawa S., Kubo S. 1973. Studies on hop stunt disease in Japan// Rept. Res. Lab. Kirin Brewery Co. Ltd., vol. 16, p. 49 62.

218. Yang Xicai, Kang Liangyi, Tien Po. 1997. Resistance of tomato infected with cucumber mosaic virus satellite RNA to potato spindle tuber viroid// Ann. Appl. Biol., vol. 130, № 1, p. 207 215.

219. Zaitlin M., Hariharasubramanian V. 1972. A gel electrophoretic analysis of protein from plants infected with tobacco mosaic and potato spindle tuber viruses// Virology, vol. 47, p. 296 305.

220. Состав питательных растворов, использованных в опыте1. Бентли,1965)1. Раствор № 30

221. Магний сернокислый 5,37 г Кальций азотнокислый 16,88 г Монокалий фосфат 3,5 г Калий сернокислый 1,5 г Раствор микроэлементов 1,56 мл Вода до 10 литров1. Раствор микроэлементов

222. Железо сернокислое закисное 14,1 г Борная кислота 1,963 г Марганец сернокислый 1,4 г Цинк сернокислый 0,141 г Медь сернокислая 0,141 г Серная кислота 0,625 г Вода до 100 мл

Информация о работе

Гирсова, Наталья Викторовна
кандидата биологических наук
Большие Вяземы, 2003
ВАК 06.01.11

Диссертация

Вироид веретеновидности клубней картофеля - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы