Видовой состав бактерий порядка Bacteroidales в микрофлоре кишечника у здоровых людей и характеристика плазмиды, выделенной из B.uniformis

Кулагина, Елена Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Видовой состав бактерий порядка Bacteroidales в микрофлоре кишечника у здоровых людей и характеристика плазмиды, выделенной из B.uniformis
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Видовой состав бактерий порядка Bacteroidales в микрофлоре кишечника у здоровых людей и характеристика плазмиды, выделенной из B.uniformis"

На правах рукописи

КУЛАГИНА ЕЛЕНА ВАЛЕРЬЕВНА

ВИДОВОЙ СОСТАВ БАКТЕРИЙ ПОРЯДКА ВАСТЕЯОЮАЬЕЗЪ МИКРОФЛОРЕ КИШЕЧНИКА У ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПЛАЗМИДЫ, ВЫДЕЛЕННОЙ ИЗ В. ЮМГОШШ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 8 ДЕК 2011

Москва-2011

005006522

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития России

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, лауреат Государственной премии РФ

доктор медицинских наук, профессор

Борис Алексеевич Ефимов Андрей Николаевич Шкопоров

Евгений Петрович Пашков

Вячеслав Михайлович Червинец

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития России.

Защита состоится 2011 годав 14.00 часов на заседании

диссертационного совета Д. 208.040.08 при Первом Московском государственном медицинском университете им. И.М. Сеченова по адресу: 119992, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан ...^.^^р^Г.^гОП года

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.08

доктор медицинских наук, профессор Андрей Юрьевич Миронов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Дистальные отделы кишечника являются средой обитания для

многочисленного и разнообразного сообщества микроорганизмов. Количество бактерий только в одном грамме содержимого толстой кишки достигает 1012 микробных клеток. Преобладающие в количественном отношении в этой экосистеме бактерии принадлежат к порядкам Bacteroidales (тип Bacteroidetes, класс Bacteroidia) и Clostridiales (тип Firinicutes, класс Clostridia) и роду Bifidobacterium (тип Actinobacleria, класс Actinobacieria, порядок Bifidobacteriales) (Hayashi Н. et al., 2002, Qin J. et al., 2010). К порядку Bacteroidales относятся строго анаэробные неспорооб-разующие грамотрицательные палочки. Исследования последнего времени показывают, что, колонизируя кишечник, эти бактерии участвуют в метаболизме сложных полисахаридов, модулируют местный иммунный ответ и препятствуют заселению кишечника патогенными микроорганизмами (Xu J. и Gordon J.I., 2003, Martens Е.С. et al., 2009). С другой стороны, в случае транслокации из кишечника во внутренние, стерильные в норме, среды организма, бактерии этой таксономической группы могут вызывать тяжелые анаэробные инфекции (Wexler Н.М., 2007).

Однако, несмотря на доминирующее положение занимаемое бактериями порядка Bacteroidales в кишечнике человека наши представления о их видовом составе остаются ограниченными. Это, в свою очередь, связано с недостаточной информативностью используемых для решения этой задачи конвенциональных микробиологических методов, которые основаны, прежде всего, на изучении относительно небольшого спектра фенотипических свойств бактериальных штаммов, изолируемых из биологического материала (Song Y.et al., 2005).

Активное внедрение молекулярно-генетических методов в практику микробиологических исследований позволило получить новую информацию о составе и свойствах микроорганизмов колонизирующих различные анатомические области тела человека (Eckbuig P.B. et al., 2005, Tringe S.G. et al., 2008, Woo P.C. et al., 2008, Karls-son F.H. et al., 2011). Так, в последние годы была разработана целая палитра методов, основанных на сравнительном анализе видоспецифичных нукпеотцдных последовательностей геномной ДНК бактерий, позволяющих быстро и достоверно определять таксономическую принадлежность выделяемых микроорганизмов (Olsen G.J. et al.,

1993, Stubbs S.L. et al., 2000, Deng W. et al., 2007).

В этой связи, очевидна аетуальность привлечения методов молекулярно-генетической идентификации для выяснения таксономической принадлежности бактерии порядка Bacteroidales кишечного происховдения.

Отдельным важным направлением исследований бактерий порядка Bacteroidales является изучение их генетических свойств (Salyers S.L. et al., 2000). В частности большой интерес представляют широко распространенные среди Bacteroides spp. разнообразные мобильные генетические элементы (инсерционные последовательности, транспозоны) и плазмиды (Smith C.J. et al., 1998, Soki J. et al., 2010). Поиск и физическое картирование таких элементов на уровне определения нуклеотид-ных последовательностей с их последующим сравнительным анализом и идентификацией генов и си-элементов, ответственных за автономную репликацию, а затем и конструирование на их основе клонирующих векторов позволит создать инструментальную базу, необходимую для дальнейшего изучения генетики бактероидов и манипулирования их свойствами при помощи генно-инженерных методов.

Цель настоящего исследования: изучить видовой состав бактерий порядка Bacteroidales в микрофлоре кишечника у здоровых людей разного возраста, а также провести поиск и анализ плазмидных ДНК у выделенных штаммов бактерий этого порядка.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ качественного и количественного состава бактерий порядка Bacteroidales, колонизирующих кишечник здоровых людей разных возрастных групп с использованием молекулярно-генетических методов.

2. Провести поиск плазмидных ДНК в штаммах бактерий порядка Bacteroidales, выделенных из кишечника здоровых людей.

3. Определить полную нуклеотидную последовательность избранной плазмиды и проанализировать ее методами биоинформатики.

4. Провести поиск генов, гомологичных обнаруженным на изученной плазмиде, среди других штаммов бактерий порядка Bacteroidales, выделенных у здоровых людей.

5. Создать челночный клонирующий вектор E.coli-Bacteroides и оценить его спо-

собносгь к конъюгативному переносу из штамма Е.соИ в штамм Вас1егоШач яр.

Научная новизна. Впервые показано, что кишечник здоровых людей в высокой концентрации колонизируют не только бактерии рода ВааеюМез, но и представители других родов порядка Вас!его1с1а!е5, таких как РагаЪас!егоШез, ВагпЫеНа, 0<1опЬас!ег и Рге\ю1с11а.

Впервые показано, что бактерии недавно охарактеризованного вида Васк'ю'^а ху1ст 'кокет являются доминирующими в кишечнике людей разного возраста. Впервые установлено, что представители рода А!ипрез чаще колонизируют кишечник взрослых людей, чем детей раннего возраста.

Впервые показано, что 40,5% штаммов бактерий порядка Вас1его1с1а!е.ч, выделенных ш кишечника клинически здоровых детей, являются носителями плазмид-ных ДНК. Определена и аннотирована полная нуклеотидная последовательность новой плазмиды рВЦЫ24, выделенной из штамма Васгего 'иЬя ит/огтЬ, которая является первой полностью просеквенированной плазмидой этого вида бактероидов. На основе рВиЫ24 создан челночный клонирующий вектор Е соИ-Вас1егоУе5, способный к автономной репликации в обоих типах хозяйских клеток.

Личный вклад Кулагиной Е.В. в получение научных результатов. Кулагина Е.В. непосредственно участвовала в выполнении всех этапов настоящей работа, в том числе проводила посев исследуемого материала, выделение и идентификацию штаммов бактерий порядка Вас1его'к1а1ез, выделение и анализ плазмидных ДНК, создание челночного клонирующего вектора Е.соИ-ВаШгоМез, а также обработку полученных данных при помощи статистических методов и методов биоинформатики.

Практическая значимость работы. Создана коллекция, содержащая 119 штаммов бактерий порядка Вааеюйакгэ, выделенных из кишечника здоровых людей, включающая 21 вид микроорганизмов этого порядка. Видовая принадлежность полученных штаммов определена при помощи достоверных молекулярно-генетических методов.

Полученные сведения о возрастных особенностях видового состава бактерий порядка ВасЧеюИак^ в кишечнике у человека могут быть использованы в различных областях здравоохранения для оценки микробиологического статуса здоровых

людей или пациентов с различной патологией.

Примененный для видовой идентификации бактерий порядка Bacterodales оригинальный протокол метода ARD RA может быть использован в рутинной практике идентификации анаэробных грамотрицательных споронеобразующих палочковидных бактерий.

Созданный в ходе настоящего исследования челночный клонирующий вектор E.coli-Bacteroides может быть использован в рамках фундаментальных и прикладных исследований, направленных на изучение генетики бактероидов и получение штаммов с заданными свойствами.

Положения, выносимые ня защиту:

1. Наиболее часто в микрофлоре кишечника у здоровых людей разных возрастных

групп среда представителей порядка Bacteroidales встречаются бактерии видов Вас-teroides xylanisolvens, B.vulgatus и B.imiformis. Однако наряду с ними в высокой концентрации выделяются также представители родов Aiistipes, Parabacleroides, Barnesi-ella, Odoribacter и Prevotella.

2. Штаммы бактерий порядка Bacteroidales, колонизирующие кишечник здоровых людей, с частотой 40,5% являются носителями плазмвдных ДНК.

3. Плазмида pBUN24, выделенная из B.uniformis, не имеет охарактеризованных гомологов среди плазмид бактерий порядка Bacteroidales и несет ряд генов, кодирующих белки, обеспечивающие репликацию и мобилизацию плазмиды, а также белки системы токсин-антитоксин.

4. Челночный клонирующий вектор E.coli -Bacteroides, обладает способностью к репликации в обоих типах хозяйских клеток и может быть использован для генетической трансформации B.vulgatus.

Внедрение результатов исследования. Предложенный в настоящей работе протокол метода ARDRA применяется в практической работе на кафедре микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова для видовой идентификации анаэробных бактерий. Штаммы, выделенные в ходе настоящей работы, используются сотрудника»™ кафедры микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова для изучения биологических свойств бактерий порядка Bacteroidales. Сконструированный в ходе настоящей работы челночный клонирующий вектор E.coli-Bacteroides

применяется в работе кафедры микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пи-рогова для изучения генетики бактероидов.

Результаты исследования включены в материалы лекционного курса и практических занятий для студентов 2-3 курсов лечебного и педиатрического факультетов на кафедре микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на заседании научной конференции кафедры микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова 21 апреля 2011 г. протокол №10, на заседаниях секции гнотобиологии Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в 2009 и 2010 гг., а также на VI международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на русском языке, на 147 страницах машинописного текста, состоит га введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Библиография включает 170 наименований работ, 7 отечественных и 163 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 12 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. С целью решения поставленных задач

нами было проведено выделение штаммов бактерий порядка Bacteroidales у 36 клинически здоровых людей обоего пола, из которых 9 детей - в возрасте от 1 года до 5 лет, 17 детей - в возрасте 6-14 лет, и 10 взрослых - в возрасте 18 - 33 лет. У двоих детей исследование было проведено дважды - в возрасте 6-ти и 12-ти лет.

Материалом доя исследования служили фекалии обследованных. Серийные разведения фекалий готовили в физиологическом растворе (от 10"1 до 10"8) и высевали на чашки Петри с селективными питательными средами. Для селективного выделения бактерий порядка Bacleroidales применяли питательные среды Shaedler (bioMerieux) и Columbia (Himedia) с добавлением 5% крови и витамина К (1,5 мг/л). Посевы инкубировали в анаэробных условиях при 37°С в течение 48 часов с исполь-

зованием микроанаэростатов (OXOID), заполненных газовой смесью (85% N2, 10% Н2,5%С02).

Первичный скрининг штаммов проводили на основании изучения морфологических свойств выросших колоний и окраски материала из них по методу Грама. Изоляты, которые при микроскопии имели морфологию, позволяющую заподозрить принадлежность к порядку Bacteroidales (анаэробные споронеобразующие грамот-рицательные палочки), отсевали для получения чистой культуры и приготовления лиофилизированных стоков.

Геномную ДНК выделяли путем 5-минутного кипячения бактериальной суспензии в 50 мкл 1х ТЕ буфера (ЮмМ TrisHCl, рН8.0, 1мМ ЭДГА) и последующего центрифугирования лизата клеток. Супернатант использовали в качестве образцов ДНКвПЦР.

Видовую идентификацию штаммов бактерий порядка Bacteroidales проводили с помощью метода ARDRA и путем секвенирования фрагментов генов 16S рРНК. Метод ARDRA представляет собой обработку продукта амплификации 16S рДНК набором эндонуклеаз рестрикции и последующий анализ полученных фрагментов. Амплифицированную 16S рДНК из штаммов бактерий порядка Bacteroidales получали при помощи ПЦР с доменспецифичными праймерами Bact-8F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и Bact-1391R (5'-GACGGGCGGTGTGTRCA-3'), комплементарных фрагменту последовательности гена 16S рРНК. Сразу же после завершения амплификации в ПЦР смесь добавляли эндонуклеазы рестрикции Taq\, Kio9\ и A lid (Сибэнзим). Продукты ПЦР и рестрикционные фрагменты были визуализированы при помощи гель-элеетрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

Образцы дая секвенирования получали при помощи амплификации 16S рДНК при проведении ПЦР с использованием описанной выше пары доменспецифичных праймеров Bact-8F и Bact-1391R. С помощью программы CLUSTAL W (Thompson J.D. et al., 1994) на основе множественного выравнивания полученных нуклеотидных последовательностей была построена фипограмма.

Плазмидные ДНК выделяли из 37 штаммов бактерий порядка Bacteroidales, полученных от 7 детей в возрасте 6-ти лет, с применением щелочного метода (Birnboim

H.С.и Doly J., 1979). Плазмидные ДНК визуализировали при помощи электрофорети-ческого разделения образцов в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

С целью секвенирования плазмиды pBUN24, первоначально была проведена обработка плазмидной ДНК эндонуклеазой рестрикции H'mDIII. Продукты рестрикции были клонированы в вектор pBluescriptllKS- E.coli. Реакции секвенирования были выполнены с использованием стандартных праймеров М13-20 forward и М13-20 reverse, комплементарных фрагментам полилинкера pBluescriptll, а также с помощью метода "праймер-опосредованной прогулки" (Sambrook J. и Rüssel D.W., 2001) с праймерами, синтезированными по мере определения последовательности вглубь ДНК.

Компьютерный анализ последовательности проводили в приложенях Vector NTI 9.0, CLC Sequence Viewer, а также сетевых приложениях BLASTN, Conserved Domain Database, TMPred, PredictProtein, Einverted, Etandem, BPROM, ViennaRNA

I.8.4:RNAduplex, HTH, SignalP, LipoP и TMHMM.

Поиск открыть« рамок считывания, обнаруженных на плазмиде pBUN24, среди других штаммов бактерий порядка Bacteroülales, выделенных в ходе настоящей работы, проводили с помощью ПЦР с использованием праймеров, комплементарных последовательностям избранных для анализа открытых рамок считывания.

Для анализа экспрессии открытых рамок считывания плазмиды pBUN24 применяли ПЦР в реальном времени , совмещенную с обратной транскрипцией, с использованием готовых 2,5Х ПЦР-смесей (Синтол), содержащих интеркалирующий краситель EvaGreen. Обратную транскрипцию проводили с использованием случайного гексапраймера и ревергазы "RevertAid Н-" (Fermentas).

Конструирование челночного клонирующего вектора E.coli-Bacteroides проводили с использованием общепринятых методов (Sambrook J. и Rüssel D.W., 2001). Последовательности генов герА (вместе с си-элементом) и telQ были амплифициро-ваны при помощи ПЦР на матрице плазмидной ДНК pBUN24 и геномной ДНК штамма B.tmiformis 2-4 соответственно и клонированы в веетор pK18mob2 E.coli. Результирующая конструкция была названа pKSH24. Трансформацию штаммов кишечной палочки осуществляли с использованием химического метода получения компетентных клеток (Cohen S.N. et al., 1972). Для доставки полученного вектора в

штамм B.vulgatus проводили конъюгацию со штаммом E.coli S17-1 [pKSH24] по протоколу, аналогичному описанному ранее (Simon et al., 1983). Подтверждение присутствия векторной ДНК в штамме B.vulgatus проводили при помощи ПЦР с праймера-ми, комплементарными последовательностям генов tetQ и repА и путем выделения плазмидной ДНК.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением программ "Microsoft Excel" и "Primer of biostatistics". Для проведения статистического анализа полученные значения концентрации микроорганизмов представляли в lg числа микробов на 1 г исследуемого материала. Определение достоверности различий в качественных и количественных показателях микроорганизмов между различными возрастными группами проводили с использованием х2-критерия и точного критерия Фишера, а также критериев Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса (Гланц С., 1998). Во всех случаях различия считали достоверными при р<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Особенности видового состава бактерий порядка Bacteroidales у людей различного возраста

В результате первичного скрининга чашек с посевами от 36 человек суммарно было выделено 172 изолята бактерий, по морфологическим свойствам отнесенных к грамотрицательным споронеобразующим палочкам, подозрительным на принадлежность к порядку Bacteroidales. Бактерии этой морфологической группы были обнаружены у всех обследуемых. Для дальнейшей видовой идентификации этой группы микроорганизмов была применена комбинация двух методов - оригинальный протокол ARDRA и секвенирование фрагмента последовательности гена 16S рРНК. В результате расщепления продуктов амплификации при помощи Kzo91 было получено 8 наборов рестрикционных фрагментов, а после расщепления Ahil и Taql - 14 и 10 соответственно (рис. 1). Наборы рестрикционных фрагментов, полученные с применением разных ферментов, встречались в различных комбинациях. Поэтому штаммы, в ходе рестрикции 16S рДНК которых образовывались одинаковые наборы фрагментов, были объединены в риботипы (табл. 1).

Рис. 1. Наборы фрагментов после обработки 168 рДНК штаммов бактерий порядка Иас1сго'и1а1ех рестриктазами. Цифрами обозначены типы наборов фрагментов после обработки соответствующим ферментом. М- маркер молекулярных масс. А. Расщепление с помощью Кю9\. Б. Расщепление с помощью Taq\. В .Расщепление с помощью А1и\.

Таблица 1. Таксономическая принадлежность штаммов бактерий порядка Вас/егЫс1а1ея, определенная при помощи метода АКРКА и секвенирования гена 163 рРНК._

№ рибо- Наборы фрагментов, вхо- Количество Видовая принадлежность, % совпаде-

типа дящие в рнботип, полученные после обработки штаммов, отнесенных к рибо- ния нуклеотидных последовательностей 16S рДНК выделенных штаммов

16Э рДНК К:о91, АЫ и типу с последовательностями типовых

Тщ\ штаммов данного вида из базы данных GenBank

1 1, 1,1 29 Bacteroides vulgatus 99%

2 1.3,2 13 Bacteroides umformte 99%

3 2,2,4 22 Bacteroides xylanisolvens 99%

4 1,13,2 2 Bacteroides uniformis 100%

5 4,4,3 3 Aliitipes putredinis 98%

6 3,5,5 1 Odoribacter splanchnicus 98%

7 3,2,6 4 Bacteroides coprocola 99%

8 5,6,3 3 Parabacteroides merdae 100%

9 3,7,7 4 Barnesiella intestinihominis 99%

10 6,8,8 7 Bacteroides dorei 100%

11 4,9,3 4 Alistipes fmegoldii 99%

12 2,12,4 12 Bacteroides caccae 98%

13 5,10, 9 2 Parabacteroides merdae 100%

14 8,11,3 3 Alistipes shahii 99%

15 7,2, 10 3 Bacteroides fmegoldii 99%

16 2,4, 10 5 Bacteroides fragilis 99%

17 -Л 5 8 Parabacteroides distasonis 99%

18 -, 7, 4 4 Bacteroides ovatus 99%

19 -Л, 1 3 Bacteroides thetaiotaomicron 98%

20 -, 7, 3 4 Alistipes onderdonkii 99%

21 -, 9, 8 1 Prevotella copri 98%

22 -,12,2 2 Bacteroides uniformis 99%

Для того, чтобы установить таксономическую принадлежность штаммов, отнесенных к разньм риботипам, по крайней мере одна последовательность 16S рДНК каждого из них была секвенирована. Полученные нукпеотидные последовательности были помещены в базу данных GenBank под номерами EF608189-EF608211 и JF298871-JF298897.

Видовую принадлежность штаммов определяли путем сравнения последовательности их 16S рДНК с последовательностями типовых штаммов известных видов из базы данных GenBank. Видовая принадлежность устанавливалась в том случае, если они имели > 98% гомологии между собой (табл. 1). По результатам идентификации 139 штаммов принадлежали порядку Bacteroidales, а 15, которые были ошибочно приняты за его представителей на первом этапе исследования вследствие сходства их морфологических характеристик, принадлежали родам Clostridium, Еи-bacterium, Desulfovibrio, Veillonella, Bifidobacterium, Coriobacterium, Ruminococais, Megamonas и Sutterella.

Суммарное количество бактерий порядка Bacteroidales среди обследуемых людей было стабильно высоким и составляло порядка Ю10 КОЕ/г во всех группах обследуемых (табл. 2). Количество видов бактерий порядка Bacteroidales у одного человека в среднем составляло 3,0±1,4, 3,2±1,8 и 3,1±1,3 в трех группах соответственно.

У детей до 5 лет доминирующими видами были Bacteroides xylanisolvens, Вас-teroides vulgatus, Bacteroides dorei, Bacteroides uniformis и Bacteroides caccae. У детей 6-14 лет также как и в первой группе, преобладали Bacteroides vulgatus, Bacteroides xylanisolvens, Bacteroides uniformis и Bacteroides caccae.

У взрослых помимо Bacteroides vulgatus, Bacteroides uniformis и Bacteroides xylanisolvens, часто (40%) также обнаруживались бактерии вида A listipes onderdonkii.

Хотя частоты встречаемости и количество различных видов бактерий порядка Bacteroidales у людей разного возраста отличались, статистически значимые отличия были выявлены только в случае бактерий рода Alistipes. Их частота встречаемости статистически значимо увеличивалась с возрастом от 0% у детей до 5 лег до 35,3% у детей 6-14 лет и 70% у взрослых (р<0,05 по сравнению с первой группой).

Таблица 2. Качественный и количественный состав бактерий порядка ВааегокЫеь в кишечнике у здоровых людей.

1 - 5 лет (n=9) 6-14 лет(п=17) 18-33 лет (п=10)

Наименование видов Число обна-ружений/% c+co Число обнаружений /% с±со Число обнаружений /% с±со

Bacteroidales 9/100 10.4±0.2 17/100 10.1 ±0.4 10/100 10±0.6

Bacteroides vulgatus 4/44.4 9.7±0.4 9/53 9.6±0.4 6/60 9.6±0.6

Bacteroides vniformis 3/33.3 9.7±0.4 6/353 9.4±0.7 5/50 9.6±0.4

Bacteroides xylanisolvens 4/44.4 9.8±0.5 8/47 9.3±0.7 4/40 8.8±0.8

Bactemides caccae 3/33.3 9.3±0.7 6/353 9.2±0.2

Bacteroides dorei 4/44.4 9.5±0.3 2/11.7 9.8

Bacteroides coprocola 1/11.1 8.5 2/11.7 9.1±0.3 1/10 9.7

Bactemides ovattis 2/22.2 9.5±0.9 1/5.9 8.3

Bacteroides thetaiotaomicron 1/11.1 9.6 1/5.9 9.5 1/10 9.3

Bacteroides fragilis 2/22.2 9.9±0.2 2/11.7 9.7±0.5

Bacteroides finegoldii 1/11.1 9.3 2/11.7 9.0

Bacteroides intestinalis 1/5.9 8.7

Bacteroides stercoris 1/10 9.0

Parabacteroides merdae 1/5.9 9.0 3/30 9.3±0.6

Parabacteroides distasonis 1/11.1 9.6 3/17.7 9.2±0.2 3/30 8.3±0.6

Alistipes fmegoldii 3/17.7 9.8±0.1

Alistipes shahii 2/11.7 9.5±0.2 1/10 9.0

Alistipes onderdonkii 4/40 9.1 ±0.9

Alistipes piaredinis 1/5.8 9.4 2/20 9.9±0.6

Alistipes 6/35.3 9.6±0.2 7/70* 93±0.7

Prevotella copri 1/5.9 9.9

Odoribacter splanchniats 1/5.9 8.5

Barnesiella intestinihominis 4/23.5 9.6±0.3

п- количество человек в группе, С- среднее значение концентрации в ^ КОЕ/г, СО - стандартное отклоните, *- статистически значимые отличия (р<0,05) по сравнению со значением в первой группе.

У двоих детей исследование видового состава было проведено дважды - в возрасте 6-ти и 12-ти лет. При повторном посеве было обнаружено, что произошла частичная смена доминирующих видов бактерий порядка ВааегоЫаШ (табл. 3)

Таблица 3. Сравнительный анализ видового состава бактерий порядка Вас1егок!а!е.1, колонизирующих кишечник у детей в возрасте 6-ти и 12-ти лет.

В возрасте 6-ш лет В возрасте 12-ти лет

Ребенок Р. B-xylanisolvens, B.uniformis, B.vulgatus, Alistipesputredinis Bjcylanisolvens, B.uniformis, B.caccae, B.thetaiotaomicron

Ребенок С. B.vulgatus, B.uniformis, Odoribacter splanchnicus, Alistipes flnegoldii В. vulgatus, B.uniformis, B.xylanisolvens, B.intestinalis, Parabacteroides distasonis, Bamesiella inteslimhominis

Примечание: Жирным шрифтом отмечены виды, которые были выделены повторно.

Таким образом, микрофлора кишечника здоровых людей характеризуется стабильно высоким количественным содержанием облигатно анаэробных грамотрица-тельных палочковидных бактерий при неизменно высокой частоте встречаемости. У здоровых людей разного возраста среди бактерий порядка Bacteroidales в кишечнике доминируют представители рода Bacteroides, а именно Bacteroides xylanisolvens, B.vulgatus и B.uniformis. Впервые показано, что недавно охарактеризованные виды, такие как Bacteroides xylanisolvens, B.dorei, B.stercoris, B.coprocola, B.flnegoldii, B.intestinalis, Parabacteroides merdae, P.distasonis, Alistipes flnegoldii, A.shahii, A.onderdonkii, A.putredinis, Prevotella copri и Bamesiella intestinihominis могут составлять значительную часть нормальной микрофлоры кишечника человека. Кроме того, с возрастом в кишечнике может происходить частичная смена доминирующих видов бактерий порядка Bacteroidales.

На основе множественного выравнивания полученных нуклеотидных последовательностей 16S рДНК и последовательностей типовых штаммов при помощи программы CLUSTAL W была построена филограмма, отражающая эволюционные взаимоотношения между обнаруженными видами бактерий порядка Bacteroidales (рис. 2).

Рисунок 2. Филограмма, построенная на основе выравнивания последовательностей 168 рДНК штаммов бактерий порядка Нас1еггшЫа, выделенных в настоящей работе, и типовых штаммов. Филограмма построена методом ближайшего соседа при помощи программы СКшЫ \¥. Цифрами указана частота появления топологии при проведении ЫхЛйгар-анализа. Последовательность СЫоюЬшт х-Яятфгте использована как внешняя группа при укоренении дерева. Масштаб-0.1 замена на одну нукяеспидную позицию.

Поиск плазмидных ДНК в штаммах бактерий порядка Вис1спУи!а!сх

В качестве материала для поиска резидентных плазмид в штаммах бактерий BacteroidaI.es была использована коллекция из 37 штаммов, выделенных от семи детей в возрасте 6-ти лет в ходе настоящей работы. Всего среди исследуемых изолятов было обнаружено 15 штаммов-носителей плазмид (40,5 %) (рис.3). Их видовое распределение было следующим: 6 принадлежало к виду Bactcroides та/^айк, 3 относилось к виду В.ху1атзо1ует, и по одному к видам В. итргт'я, В. сассае, В. finegoШ, В. dorei.B. и АШИрея ¡ИаЬИ. В штаммах, принадлежащих видам АИМреэ

putredinis, A.finegoldii, Odoribacter splanchnicus, Parabacteroides merdae, Barnesiella intestinihominis и Bacteroides coprocola, плазмидные ДНК обнаружены не были. В целом, наблюдаемая частота встречаемости плазмидных ДНК у бактероидов находится в согласии с ранее полученными данными и свидетельствует в пользу гипотезы о широком распространении плазмид в популяции бактерий нормальной микрофлоры кишечника человека (Smith С. J., 1998).

Рис. 3. Выделение плазмидных ДНК из штаммов бактероидов. Дорожки с 1 по 8 - плазмидные ДНК, выделенные из штаммов бактероидов, т.п.н. - тысяча пар нуклеогидов. 1 -B.fragilis 7-23, 2 - В.сассае 6-24,3 -B.xylanisohens 7-25,4-B.vulgatus 4-16,5-B.vulgatus 4-5, 6 - B.vulgatus 3-16, 7 - B.uniformis 2-4, 8 - B.finegoldii 6-28. М- маркер молекулярных масс Supercoiled DNA ladder (Invitrogen).

Анализ нуклеотидной последовательности плазмиды pBUN24

Для дальнейшего изучения была выбрана плазмида, выделенная из штамма B.uniformis, которая была названа pBUN24. В результате гидролиза pBUN24 эндо-нуклеазой рестрикции HinDXll было получено три фрагмента с приблизительными размерами 1, 3 и 5 т. п. н., которые были клонированы в вектор pBluescriptlIKS-. В результате чего были созданы рекомбинантные плазмиды pB2KS::BUN24-l и pB2KS::BUN24-4. Один из фрагментов клонировать не удалось, он был секвениро-ван при помощи метода "праймер-опосредованной прогулки" с праймерами, синтезированными по мере определения последовательности вглубь ДНК. Реакции секве-нирования были выполнены с использованием стандартных праймеров M13-20 forward и М13-20 reverse, комплементарных фрагментам полилинкера pBluescriptll. Полная нуклеотидная последовательность плазмиды pBUN24 представлена в базе данных GenBank под идентификационным номером EU818711.

Анализ полной нуклеотидной последовательности pBUN24 показал, что она

2345678М

представляет собой кольцевую молекулу длиной 8944 п.н. и не имеет гомологов в базе данных GenBank. При помощи пакета CLC Sequence viewer на плазмиде было обнаружено 12 открытых рамок считывания (рис. 4).

rHinD\\ 1(1)

.ORF 2

- Hinim (944)

ORF 9

/VI (7498; ORF 8

ORF 7

~ ORF 12 (repA) Repeat Region ORF 3 ORF 4

EcoRl (2444)

RF5 ORF 6

ORF 10 (mobA)

ORF 11 (mobil)

Hin DIU (4219)

Рисунок 4. Карта плазмиды pBUN24. repA - ген репликазы, mobA, тоЬВ - гены, кодирующие белки, участвующие в мобилизации. Цифрами в скобках указано расположение на плазмиде (п.н.).

Открытая рамка считывания ORF 12 (rep А) кодирует белок RepA. В промотор-ной области rep А обнаружена последовательность, содержащая прямые (длиной 21 п.н.) и инвертированные повторы, а также АТ-богатая область (75% АТ-пар) длиной 64 п.н. Инвертированные повторы располагаются в непосредственной близости от предполагаемых -35 (ТАТСТ) и -10 (ССАТАТАТТ) регуляторных элементов. Кроме того, вблизи старт кодона предсказаны 2 сайта связывания рибосом (CGAAAA,AG— 2,0 и TGAAAT.AG—l^ ккал/моль) (Kuwahara Т. et al., 2004). В 3'-направлении от области прямых повторов располагаются DnaA боксы и сайты связывания IHF (рис.5). В целом, организация eis-элемента гена repA имеет черты, характерные для ек-элементов генов, кодирующих белки-инициаторы репликации по 0-механизму (del Solar G., 1998).

IHF

DR«

IRII-2 IHF —>

IRII-2

Лф.-)-)-

■ШЕф-ATG RBS СтаРт-

Dllärt

OnaA

КОДОН

-10 -35

Рисунок 5. Организация промоторной области гена rep А. DR-прямые повторы, ¡R -инвертированные повторы, RBS-сайт связывания рибосом, -10 и -35 - бокс Прибнова (-10) и -35 элемент, IHF - сайты связывания IHF (lntegron Host Factor), DnaA -DnaA боксы.

Белок RepA состоит из 325 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 38.9 кДа(табл. 4). В его составе обнаружен консервативный домен белкового суперсемейства Rep3. Белки, входящие в состав этого суперсемейства, принимают участие в инициации репликации, связываясь с ДНК-повторами c'ß'-элемента rep А. В составе RepA обнаружен консервативный мотив Winged Helix-Turn-Helix, который имеет в своем составе 3 а-спирали, 3 ß-слоя и 2 т.н. "крыла", чередующихся между собой (H1-S1-H2-H3-S2-W1-S3-W2). Белки, имеющие в своем составе такой мотив, обладают ДНК-связывающей способностью и могут выполнять различные функции, в том числе участвовать в регуляции транскрипции. Некоторые из них могут принимать участие в белок-белковых взаимодействиях (Gajiwala K.S., 2000).

Открытые рамки считывания ORF 10 и ORF 11, по-видимому, объединены в оперон, и кодируют белки мобилизации МоЬА (23.2 кДа) и МоЪВ (33.9 кДа) соответственно. В промоторной области предсказаны -10 (GGTTAAAAT) и -35 (TCGCAA) последовательности. Сайт связывания рибосом - GAAAAGA (AG=-4,3 ккал/моль) был определен только для ORF 11. Небольшой участок аминокислотной последовательности белка МоЬА перекрывается с последовательностью белков суперсемейства RHH_1, которые представляют собой самые короткие репрессорные белки, найденные на плазмидах, и имеют в своем составе домен Ribbon-Helix-Helix (лента-спираль-спираль). Белковые RHH-домены аналогичны по строению НТН-доменам, однако не принимают участие в связывании ДНК в отличие от них.

Открытые рамки считывания ORF 2 и ORF 3 также предположительно входят в состав одного оперона. В его промоторной области обнаружены -10

(AGGTATGAT), -35 (TTAAAT) регуляторные элементы. Также определены сайты связывания рибосом - CGGA (AG=-1,8 ккал/моль) и TAGAAAA (AG=-2,3 ккал/моль) для ORF 2 и ORF 3 соответственно. Белки, кодируемые открытыми рамками считывания ORF 2 (11,7 кДА) и ORF 3 (15,5 кДА) являются компонентами системы токсин-антитоксин, широко распространенной в популяции бактерий, принимающей участие в ответе на стрессорные воздействия и участвующей в поддержании числа копий плазмид в бактериальной клетке.

Название Длина белка, АО. Масса (кДа) Наличие консервативных доменов (номенклатура Pfam) Предполагаемые функции белка

ORF 1 89 10,4 нет Гипотетический белок

ORF 2 104 11,7 HTH_XRE_ superfamily Антитоксический компонент системы токсин-антитоксин

ORF3 129 15,5 Gp49_superfamily Токсический компонент системы токсин-антитоксин

ORF 4 88 10,0 нет Гипотетический секретируемый белок

ORF 5 551 59,6 нет Гипотегаческий консервативный белок, липопротеин

ORF 6 365 41,8 АгаС EPS sugtrans Регулятор транскрипции

ORF 7 114 12,5 GAT_1 superfamily Гипотетический консервативный белок

ORF 8 173 19,8 нет Гипотетический консервативный белок

ORF 9 60 6,4 нет Гипотетический белок

ORF 10 201 23,2 RHH_1 superfamily Участие в мобилизации

ORF 11 292 33,9 нет Участие в мобилизации

ORF 12 325 38,9 Rep3_superfamily Белок инициатор репликации

Белок, кодируемый ORF 2, является антитоксическим компонентом и предположительно обладает ДНК-связывакнцей функцией. В его состав входит белковый домен консервативного суперсемейства HTH_XRE. Белки, входящие в состав этого суперсемейства принимают участие в регуляции транскрипции.

Белок, кодируемый ORF 3, является токсическим компонентом этой системы и имеет гомологию с белком-токсином аналогичной системы семейства RelE/B, белки которого встречаются у представителей Bacteroides spp. и Prevotella spp.

Антитоксин может репрессировать сильный промотор RelE-компонента (токсин), кроме того, он напрямую взаимодействует с компонентом RelE, тем самым подавляя его активность. Токсическая активность RelE заключается в расщеплении мРНК в А-сайте рибосомы (Christensen SJC et aL, 2003). Аналогичные системы токсин-антитоксин (mazE/F) были ранее описаны в составе плазмид у бактероидов {Scäci J.et aL, 2010).

ORF 6 кодирует белок массой 41,8 кДА, который имеет в своем составе 7 трансмембранных доменов. Кроме того, он содержит домены консервативных семейств Ага_С и EPS_sugtans. Белки семейства Ага_С принимают участие в процессах регуляции транскрипции в ходе метаболизма арабинозы. В состав семейства EPS_sugtrans входят белки, отвечающие за метаболизм экзополисахаридов. Белковый продукт ORF 6 имеет черты сходства с регуляторными белками гибридной двухкомпонентной системы (HTCS) (Sonnenburg F.D. et al., 2006).

ORF 7 кодирует гипотетический белок массой 12,5 кДА и содержит в своем составе домен консервативного суперсемейства GAT_1, в состав которого входят глутаминамидотрансферазы. Белок, кодируемый ORF 5, предположительно содержит сигнальный пептид, характерный для липопротеинов. Остальные открытые рамки считывания, расположенные на плазмиде pBUN24, кодируют гипотетические белки, которые не имеют четко охарактеризованных гомологов в базе данных.

Поиск открытых рамок считывания плазмиды pBUN24 среди штаммов бактерий порядка Bacteroidales

Было решено проскринировать штаммы бактерий порядка Bacteroidales, выделенные в ходе настоящей работы, на наличие гомологичных охарактеризованным на pBUN24 открытых рамок считывания. Всего протестировано 118 штаммов. Для анализа были выбраны ORF2, ORF3, ORFIO, ORF11, ORF12 (гсрА) и ORF6 (табл.4).

Было установлено, что все вместе изучаемые открытые рамки считывания встречались у 8 штаммов (6,7%), три из которых принадлежали виду B.uniformis, два - B.xylanisohens, и по одному B.finegoldii, B.coprocola и В.сассае. Кроме того, разные ORF с высокой частотой обнаруживались совместно в штаммах различных видов бактерий порядка Bacteroidales.

Таким образом, было показано, что штаммы различных видов бактерий порядка Bacteroidales, выделенные из кишечника здоровых людей, могут являться носителями ORF, гомологичных открытым рамкам считывания плазмиды pBUN24 из

B.uniformis. Это может быть обусловлено широким распространением pBUN24 или гомологичных ей плазмид среди бактерий порядка Bacteroidales.

Повторное выделение плазм иды pBUN24

Плазмида pBUN24 была впервые выделена из штамма Bacteroides tmifonnis от ребенка С. в возрасте 6-ти лег. Через 6 лег она была повторно обнаружена в штамме B.uniformis, выделенном от этого ребенка. Помимо B.uniformis в 12-летнем возрасте от ребенка С. были выделены штаммы B.intestinalis, Parabacteroides distasonis и B.vulgatus, которые также были носителями этой плазмидной ДНК Однако в возрасте 1 года у ребенка С. присутствие pBUN24 или гомологичной ей плазмиды в тотальной ДНК, выделенной из фекалий, обнаружено не было.

Таким образом, показана возможность длительной персистенции плазмиды

pBUN24 в хозяйском штамме, а также возможность ее горизонтального переноса

между разными видами бактерий порядка Bacleroidales.

Экспрессия открытых рамок считывания плазмиды pBUN24 в штаммах Bacteroides vulgatus и Parabacteroides distasonis

В штаммах Bacteroides vulgatus и Parabacteroides distasonis, выделенных от

ребенка С. в возрасте 12 лег, было решено провести анализ экпрессии ORF 2,6,7,5 и 11 {тоЬВ) при помощи ПЦР в реальном времени, совмещенной с обратной транскрипцией. Из штаммов Bacteroides vulgatus и Parabacteroides distasonis была выделена тотальная РНК, затем была проведена обратная транскрипция при помощи случайного гексапраймера и ревертазы "RevertAid Н-" (Fermentas) с целью получения кДНК. ПЦР проводили с использованием готовых 2,5Х ПЦР-смесей (Синтол), содержащих интеркалирующий краситель EvaGreen. Показателем наличия мРНК в исследуемых образцах служила разница в значениях пороговых циклов ПЦР РВ при постановке реакции с препаратом РНК и препаратом кДНК. Положительным результатом считалась разница более чем в 1 цикл.

Показано, что ORF 2, 5 и 7 экспрессируются в обоих изучаемых штаммах, а ORF 6 только в штамме P.distasonis. Открытая рамка считывания тоЬВ не экспрес-сируется ни в одном из штаммов (рис. 6).

-1 ORF 2 ORF 6 ORF 7 ORF S mobB j ЕЗДасдвга^ввз vidfiaUtr aParabu<4eroIiIvs distasoni.i j

Рисунок 6. Экпрессия открытых рамок считывания плазмиды pBUN24 в штаммах B.vulgatus и Parabacteroides distusonis.

Конструирование челночного клонирующего вектора Е.соН-Вас1его1(1е$

С целью подтвердить функции белка КерА в качестве белка, принимающего участие в репликации плазмиды, а также создать инструмент, позволяющий осуществлять генетические манипуляции с бактероидами, было решено сконструировать челночный клонирующий вектор Е.соИ-Вас1ею1с/ез.

Ген герА совместно с си-элементом плазмиды рВ1Ж24 был амплифицирован на матрице плазмидной ДНК штамма В.ипфгтк 2-4. Использованный в качестве селективного маркера ген резистентности к тетрациклину был амплифицирован на матрице тотальной ДНК штамма Дми^огтк 2-4. Полученные фрагменты были клонированы соответственно в ВатЯ! и РяА сайты вектора рК 18тоЬ2, содержащего сайт репликативного переноса из Е.соП в другие виды бактерий. Результирующая конструкция была названа рКБН24 (рис. 7).

Полученным вектором рК8Н24 трансформировали сначала штамм Е.соП ХЬ-1. Колонии трансформантов были отобраны с помощью сине-белого теста и проверены при помощи ПЦР на наличие генов герА и (еК). Затем клоны, которые были положительными по результатам ПЦР, пересевали в чистую культуру и выделяли из них плазмидную ДНК.

Полученным препаратом трансформировали штамм Е.соП 817-1. Колонии трансформантов отбирали на чашках ЬВ с тетрациклином по способности расти на среде с антибиотиком. Присутствие плазмиды также подтверждали при помощи ПЦР на наличие генов герА и (еф.

Рисунок 7. Строение челночного клонирующего вектора pKSH24 E.coli-Hacteroiilcs. lelQ-ген резистентности к тетрациклину, гс/>А-ген репликазы pBUN24, aph-тен резистентности к канамицину, Rep_Origm_l-opmw<HH репликации плазмидырК18тоЬ2.

Затем проводили конъюгацию по протоколу, аналогичному описанному ранее

(Simon et al., 1983), в которой в качестве донора выступал штамм E.coli S17-1, содержащий плазмиду pKSH24, а в качестве реципиента - штамм B.vulgalus 2-11, выделенный ранее в ходе настоящей работы. Отбор колоний проводили на чашках Shaedler-agar (Himedia) с тетрациклином и налидиксовой кислотой, которые инкубировали в анаэробных условиях в течение 48 часов. Появление трансконъюгантов подтверждалось при помощи ПЦР с праймерами, комплементарными последовательностям генов герА и te(Q, а также путем выделения рекомбинантных плазмид из полученных после конъюгации клонов (рис. 8). Вектор pKSH24 продемонстрировал способность передаваться в процессе конъюгации штамму B.vulgatus 2-11 с появлением соответствующих антибиотикорезистентных клонов с частотой 10-1СГ КОЕ/мкг ДНК.

А'1 г 3 4 6 6 В' 1 2 3 4 5

Б.

1 2 3 4 5 6

Рисунок 8. Подтверждение появления трансконъюгантов после скрещивания штамма Нлч/^Ших 2-11 со штаммом Е.соИ 817-1 |рК8Н24]. А - ПЦР-анализ присутствия герА в клонах Я \vlgatm после конъюгации (дорожки 2-6); дорожка 1 -штамм В.уи^аШ!, не участвовавший в конъюгации. Б - ПЦР-анализ присутствия 1с1() в клонах В.уи1^а1и5 после конъюгации (дорожки 1-5); дорожка 6 -штамм Вли^Мич, не участвовавший в конъюгации. В -выделение плазмид из клонов штамма Вуи^Шш после конъюгации.

ВЫВОДЫ:

1.В микрофлоре кишечника у здоровых людей наиболее часто встречающимися видами бактерий порядка Bacleroidales являются Bacteroides xylanisolvens, Bacteroides vulgatus и Bacteroides uniformis. Кроме того, в высокой концентрации выделяются представители родов Alistipes, Parabacteroides, Bamesiella, Odoribacter и Prevotella. Бактерии рода Alistipes чаще колонизируют кишечник взрослых людей по сравнению с детьми раннего возраста.

2.Штаммы бактерий порядка Bacleroidales с частотой 40,5% являются носителями плазмидных ДНК.

3.Плазмида pBUN24, выделенная из штамма B.uniformis, не имеет охарактеризованных гомологов среди плазмид бактерий порядка Bacleroidales и предположительно несет 12 открытых рамок считывания, в том числе кодирующих синтез белков репликации и мобилизации, а также белков системы токсин-антитоксин.

4.Штаммы других видов бактерий порядка Bacleroidales могут являться носителями генов, гомологичных обнаруженным на плазмиде pBUN24.

5.Сконструированный челночный клонирующий вектор pKSH24 обладает способностью реплицироваться в штаммах E.coli и Bacteroides vulgatus и может был. использован для генетической трансформации B.vulgatus.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Полученные данные о составе анаэробной грамотрицательной кишечной микрофлоры у здоровых людей свидетельствуют о необходимости внедрения в практику микробиологических исследований микробиоценоза кишечника молекулярно-генсгических методов для определения видового состава бактерий порядка Bacleroidales. При этом идентификация бактерий порядка Bacteroidales может быть осуществлена с использованием методов ARDRA и секвенирования фрагментов гена 16S рРНК быстро и прецизионно, обеспечивая экономичность исследования.

Обнаружение в кишечнике здоровых людей бактерий порядка Baderoidaks, которые ранее не выделялись с применением исключительно классических культуральных методов, позволяет в будущем развивать направление исследований, целью которого должно стать дальнейшее изучение грамолрицательной анаэробной микрофлоры кишечника и ее возраст

ных отличий с целью понимания значения этих микроорганизмов для здоровья человека.

Челночный клонирующий вектор pKSH24 может бьпь использован в рамках прикладных исследованиях, направленных на изучение биологии бактероидов и получение штаммов с необходимыми свойствами.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ефимов Б А, Шкопоров А.Н., Хохлова Е.В., Афанасьев С.С., Кулагина Е.В., Кафарская Л.И. Плазмиды бифидобакгерий и их использование в генетической инженерии. // Журнал «Вестник РАМН», 2008, № 2. С. 16-21.

2. Shkoporov A.N., Khokhlova E.V., Kulagjna E.V., Smeianov V.V., Kafarskaia L.I. Efimov B.A. Application of several molecular techniques to study numerically predominant Bifidobacterium spp. and Bacteroidales order strains in the feces of healthy children. // Журнал «Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry», 2008, № 72:3- P. 742-748.

3. Кулагина E.B., Шкопоров A.H., Кафарская Л.И., Хохлова Е.В., Володин H.H., Донских Е.Е., Коршунова О.В., Ефимов Б.А. Изучение видового и штаммового разнообразия в популяциях бифидобакгерий кишечной микрофлоры матерей и детей грудного возраста с помощью молекулярно-генетических методов. // Журнал «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», 2010, том 150, № 7. С. 70-73.

4. Кулагина Е.В., Ефимов Б.А., Шкопоров А.Н. Изучение видового состава бактерий порядка Bacteroidales в кишечнике у здоровых людей с применением молекулярно-генетических методов исследования. // Сборник тезисов докладов к VI международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, «Вестник Российского Государственного Медицинского Университета», Дополнение к специальному выпуску №1,2011, С.15.

Список сокращений:

1. КОЕ - колониеобразующая единица

2. С-среднее значение величин

3. СО - стандартное отклонение

4. п-количество образцов

5. ПЦР - полимеразная цепная реакция

6. ARDRA - Amplified Ribosomal DNA Restriction Analyses (рестрикци-онный анализ амплифицированой рибосомальной ДНК)

7. рРНК - рибосомальная РНК

8. рДНК - рибосомальная ДНК

9. А.О. - аминокислотный остаток

10. ПЦР РВ - ПЦР в реальном времени

11. ORF - Open Reading Frame (открытая рамка считывания)

Подписано в печать: 17.11.11

Объем: 1,.5усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 784 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Кулагина, Елена Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Введение.

1.2 Значение бактерий порядка Bacteroidales в микробноценозе кишечника.

1.3 Изучение видового состава бактерий порядка Bacteroidales в микрофлоре кишечника.

1.4 Плазмиды у бактероидов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Объекты исследования.

2.2 Бактериологические и молекулярно-генетические методы, примененные для изучения видового состава бактерий порядка Bacteroidales.

2.2.1 Культуральные методы.

2.2.2 Выделение тотальной ДНК из штаммов бактероидов.

2.2.3 Рестрикционный анализ амплифицированной рибосомальной ДНК (ARDRA, Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis).

2.2.4 Секвенирование фрагмента гена 16S рРНК.

2.3 Молекулярно-биологические и биохимические методы, примененные для выделения и изучения плазмид у бактероидов.

2.3.1 Культивирование бактерий.

2.3.2 Полимеразная цепная реакция.

2.3.3 Обработка ДНК ферментами нуклеинового обмена.

2.3.4 Синтез ДНК-олигонуклеотидов.

2.3.5 Трансформация бактериальных штаммов.

2.3.6 Конъюгация.

2.3.7 Выделение плазмидных ДНК.

2.3.8 Секвенирование плазмиды.

2.3.9 Выделение тотальной РНК.

2.3.10 ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

2.3.11 Определение антибиотикорезистентности методом бумажных дисков и поиск гена tetQ

2.4 Методы биоииформатики и компьютерной обработки данных.

2.4.1 Методы биоинформатики.

2.4.2 Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Изучение качественного и количественного состава микрофлоры кишечника.

3.2. Особенности видового состава представителей порядка Bacteroidales.

3.3. Поиск плазмидных ДНК в штаммах бактерий порядка Bacteroidales.

3.4 Определение полной нуклеотидной последовательности плазмиды pBUN24.

3.5 Анализ полной нуклеотидной последовательности плазмиды pBUN24.

3.6 Поиск открытых рамок считывания плазмиды pBUN24 среди других штаммов бактерий порядка Bacteroidales.

3.7 Повторое выделение плазмиды pBUN24.104

3.8 Экспрессия открытых рамок считывания плазмиды pBUN24 в штаммах Bacteroides vulgatus и Parabacteroides distasonis.

3.9 Определение чувствительности к антибактериальным препаратам.

3.10 Конструирование челночного клонирующего вектора E.coli-Bacteroides.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ:.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Видовой состав бактерий порядка Bacteroidales в микрофлоре кишечника у здоровых людей и характеристика плазмиды, выделенной из B.uniformis"

Актуальность. Дистальные отделы кишечника являются средой обитания для многочисленного и разнообразного сообщества микроорганизмов. Количество бактерий только в одном грамме

10 содержимого толстой кишки достигает 10 микробных клеток. Преобладающие в количественном отношении в этой экосистеме бактерии принадлежат к порядкам Bacteroidales (тип Bacteroidetes, класс Bacteroidia) и Clostridials (тип Firmicutes, класс Clostridia) и роду Bifidobacterium (тип Actinobacteria, класс Actinobacteria, порядок Bifidobacteriales) [Hayashi Н. et al., 2002, Qin J. et al., 2010]. К порядку Bacteroidales относятся строго анаэробные неспорообразующие грамотрицательные палочки. Исследования последнего времени показывают, что, колонизируя кишечник, эти бактерии участвуют в метаболизме сложных полисахаридов, модулируют местный иммунный ответ и препятствуют заселению кишечника патогенными микроорганизмами [Xu J. и Gordon J.I., 2003, Martens Е.С. et al., 2009]. С другой стороны, в случае транслокации из кишечника во внутренние, стерильные в норме, среды организма, бактерии этой таксономической группы могут вызывать тяжелые анаэробные инфекции [WexlerH.M., 2007].

Активное внедрение молекулярно-генетических методов в практику микробиологических исследований позволило получить новую информацию о составе и свойствах микроорганизмов колонизирующих различные анатомические области тела человека [Eckburg Р.В. et al., 2005, Tringe S.G. et al., 2008, Woo P.C. et al., 2008, Karlsson F.H. et al., 2011]. Так, в последние годы была разработана целая палитра методов, основанных на сравнительном анализе видоспецифичных нуклеотидных последовательностей геномной ДНК бактерий, позволяющих быстро и достоверно определять таксономическую принадлежность выделяемых микроорганизмов [Olsen G.J. et al., 1993, Stubbs S.L. et al., 2000, Deng W. et al., 2007].

В этой связи, очевидна актуальность привлечения методов молекулярно-генетической идентификации для выяснения таксономической принадлежности бактерии порядка Bacteroidales кишечного происхождения.

Отдельным важным направлением исследований бактерий порядка Bacteroidales является изучение их генетических свойств [Salyers S.L. et al., 2000]. В частности большой интерес представляют широко распространенные среди Bacteroides spp. разнообразные мобильные генетические элементы (инсерционные последовательности, транспозоны) и плазмиды [Smith C.J. et al., 1998, Soki J. et al., 2010]. Поиск и физическое картирование таких элементов на уровне определения нуклеотидных последовательностей с их последующим сравнительным анализом и идентификацией генов и cw-элементов, ответственных за автономную репликацию, а затем и конструирование на их основе клонирующих векторов позволит создать инструментальную базу, необходимую для дальнейшего изучения генетики бактероидов и манипулирования их свойствами при помощи генно-инженерных методов.

Задачи исследования:

2. Провести поиск плазмидных ДНК в штаммах бактерий порядка Bacteroidales, выделенных из кишечника здоровых людей.

5. Создать челночный клонирующий вектор E.coli-Bacteroides и оценить его способность к конъюгативному переносу из штамма E.coli в штамм Bacteroides sp.

Научная новизна. Впервые показано, что кишечник здоровых людей в высокой концентрации колонизируют не4 только бактерии рода Bacteroides, но и представители других родов порядка Bacteroidales, таких как Alistipes, Parabacteroides, Barnesiella, Odoribacter и Prevotella.

Впервые показано, что, бактерии недавно охарактеризованного вида Bacteroides xylanisolvens являются доминирующими в кишечнике людей разного возраста. Впервые установлено, что представители рода Alistipes чаще колонизируют кишечник взрослых людей, чем детей раннего возраста.

Впервые показано, что 40,5% штаммов бактерий порядка Bacteroidales, выделенных из кишечника клинически здоровых детей, являются носителями плазмидных ДНК. Определена и аннотирована полная нуклеотидная последовательность новой плазмиды рВЦЫ24, выделенной из штамма Вас1его1с1е$ ит/огтгз, которая является первой полностью просеквенированной плазмидой этого вида бактероидов. На основе рВ1Ж24 создан челночный клонирующий вектор Е соН— Вас1егогс1ез, способный к автономной репликации в обоих типах хозяйских клеток.

Личный вклад Кулагиной Е.В. в получение научных результатов. Кулагина Е.В. непосредственно участвовала в выполнении всех этапов настоящей работы, в том числе проводила посев исследуемого материала, выделение и идентификацию штаммов бактерий порядка ВаМего1с1а1е$, выделение и анализ плазмидных ДНК, создание челночного клонирующего вектора Е.соИ—Bacteroid.es, а также обработку полученных данных при помощи статистических методов и методов биоинформатики.

Практическая значимость работы. Создана коллекция, содержащая 119 штаммов бактерий порядка Ва&егос1а1е8, выделенных из кишечника здоровых людей, включающая 21 вид микроорганизмов этого порядка. Видовая принадлежность полученных штаммов определена при помощи достоверных молекулярно-генетических методов.

Полученные сведения о возрастных особенностях видового состава бактерий порядка Ва&его\(1а1е8 в кишечнике у человека могут быть использованы в различных областях здравоохранения для оценки микробиологического статуса здоровых людей или пациентов с различной патологией.

Примененный для видовой идентификации бактерий порядка Вас1егос1а1е8 оригинальный протокол метода АМЖА может быть использован в рутинной практике идентификации анаэробных грамотрицательных споронеобразующих палочковидных бактерий.

Положения, выносимые на защиту:

1. Наиболее часто в микрофлоре кишечника у здоровых людей разных возрастных групп среди представителей порядка Bacteroidales встречаются бактерии видов Bacteroides xylanisolvens, B.vulgatus и B.uniformis. Однако наряду с ними в высокой концентрации выделяются также представители родов Alistipes, Parabacteroides, Barnesiella, Odoribacter и Prevotella.

2. Штаммы бактерий порядка Bacteroidales, колонизирующие кишечник здоровых людей, с частотой 40,5% являются носителями плазмидных ДНК.

4. Челночный клонирующий вектор E.coli —Bacteroides, обладает способностью к репликации в обоих типах хозяйских клеток и может быть использован для генетической трансформации B.vulgatus.

Внедрение результатов исследования. Предложенный в настоящей работе протокол метода ARDRA применяется в практической работе на кафедре микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова для видовой идентификации анаэробнь1х бактерий. Штаммы, выделенные в ходе настоящей работы, используются сотрудниками кафедры микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова для изучения биологических свойств бактерий порядка Bacteroidales. Сконструированный в ходе настоящей работы челночный клонирующий вектор E.coli-Bacteroides применяется в работе кафедры микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова для изучения генетики бактероидов.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на русском языке, на 147 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Библиография включает 170 наименований работ, 7 отечественных и 163 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 12 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Кулагина, Елена Валерьевна

ВЫВОДЫ:

1 .В микрофлоре кишечника у здоровых людей наиболее часто встречающимися видами бактерий порядка Bacteroidales являются Bacteroides xylanisolvens, Bacteroides vulgatus и Bacteroides uniformis. Кроме того, в высокой концентрации выделяются представители родов Alistipes, Parabacteroides, Barnesiella, Odoribacter и Prevotella. Бактерии рода Alistipes чаще колонизируют кишечник взрослых людей по сравнению с детьми раннего возраста.

2.Штаммы бактерий порядка Bacteroidales с частотой 40,5% являются носителями плазмидных ДНК.

3.Плазмида pBUN24, выделенная из штамма В.uniformis, не имеет охарактеризованных гомологов среди плазмид бактерий порядка Bacteroidales и предположительно несет 12 открытых рамок считывания, в том числе кодирующих синтез белков репликации и мобилизации, а также белков системы токсин-антитоксин.

4.Штаммы других видов бактерий порядка Bacteroidales могут являться носителями генов, гомологичных обнаруженным на плазмиде pBUN24.

5.Сконструированный челночный клонирующий вектор pKSH24 обладает способностью реплицироваться в штаммах Е. coli и Bacteroides vulgatus и может быть использован для генетической трансформации В. vulgatus.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные данные о составе анаэробной грамотрицательной кишечной микрофлоры у здоровых людей свидетельствуют о необходимости внедрения в практику микробиологических исследований микробиоценоза кишечника молекулярно-генетических методов для определения видового состава бактерий порядка Ва&его1с1а1е$. При этом идентификация бактерий порядка Вас1его\с1а1е$ может быть осуществлена с использованием методов АЗДОКА и секвенирования фрагментов гена 168 рРНК быстро и прецизионно, обеспечивая экономичность исследования.

Обнаружение в кишечнике здоровых людей бактерий порядка Ва&его1с1а1ез, которые ранее не выделялись с применением исключительно классических культуральных методов, а также выявление отличий в видовом составе этих бактерий в различные периоды жизни человека, позволяет в будущем развивать научно-практическое направление исследований, целью которого должно стать дальнейшее изучение грамотрицательной анаэробной микрофлоры кишечника и ее возрастных отличий с целью понимания значения этих микроорганизмов для здоровья человека.

Челночный клонирующий вектор рК8Н24 может быть использован в рамках прикладных исследованиях, направленных на изучение биологии бактероидов и получение штаммов с необходимыми свойствами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Кулагина, Елена Валерьевна, Москва

1. Гланц С. Медико-биологическая статистика. — Практика — 1998, С.459.

2. Дурбин Р., Эдди Ш., Крог А., Митчисон Г. Анализ биологических последовательностей. РХД - 2006, С.600.

3. Ефимов Б.А. Микроэкология кишечника человека, коррекция микрофлоры при дисбиотических состояниях. — Дисс. докт. мед. наук. Москва, 2005.

4. Коршунов В. М., Смеянов В. В., Ефимов Б. А. Рациональные подходы к проблеме коррекции микрофлоры кишечника. Вестник Российской академии медицинских наук. 1996, № 2, 60-64.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Мир-1984. С. 479.

6. Altschul S.F., Gish W., Myers E.W., Lipman DJ. Basic Local Alignment Search Tool. J. Mol. Biol. 1990. 215: 403-410.

7. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 1997. 25: 33893402.

8. Aman R. I., Ludwig W. et al.W., Schleifer K.H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol Rev. 1995. Mar;59l.: 143-69.

9. Aravind L., Anantharaman V., Balaji S., Babu M.M., Iyer L.M. The many faces of the helix-turn-helix domain: transcription regulation and beyond. FEMS Microbiol Rev. 2005 Apr;292.:231-62.

10. Backhed F., Ley R.E et al.R.E., Sonnenburg J.L., Peterson D.A., Gordon J.I. Host-bacterial mutualism in the human1 intestine. Science. -2005. 307571-7., 1915-1920.

11. Bakir M.A., Kitahara M. et al. M., Sakamoto Mi, Matsumoto M., Benno Y. Bacteroides finegoldii sp. nov., isolated from human faeces. Int J Syst Evol Microbiol. 2006. May;56Pt 5.:931-5.

12. Bakir M.A., Sakamoto M., Kitahara M. et al. M., Matsumoto M., Benno Y. Bacteroides dorei sp. nov., isolated from human faeces. Int J Syst Evöl Microbiol. 2006. Jul;56Pt 7.:1639-43.

13. Balamurugan R., Janardhan H.P., George S., Chittaranjan S.P., Ramakrishna B.S. Bacterial succession in the colon during childhood and adolescence: molecular studies in a southern Indian village. Am J' Clin Nutr. 2008. Dec;886.:1643-7.

14. Bamba T., Matsuda H., Endo M., and Fujiyama Y. The pathogenic role of Bacteroides vulgatus in patients with ulcerative colitis. J. Gastroenterol. 1995. 30Suppl. 8.:45-47.

15. Bennion R. S., Baron E. J., Thompson J. E., Downes Jr. J., Summanen P., Talan D. A., and Finegold S. M. The bacteriology of gangrenous and perforated appendicitis—revisited. Ann. Surg. 1990. 211:165-171.

16. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., D. J. Lipman D. J., Ostell J., Rapp B. A., and Wheeler D. L. 2002. GenBank. Nucleic Acids Res. 30:17-20.

17. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res.- 1979, Nov 24;76.:1513-23.

18. Bocci V. The neglected organ: bacterial flora has a crucial immunostimulatory role. Perspect. Biol. Med. - 1992. 35, 251-260.

19. Brook I. Microbiology and management of post-surgical wounds infection in children. Pediatr. Rehabil. 2002. 5:171-176.

20. Bruce J., Paster J., Floyd E. Dewhirst, Ingar Olsen, Gayle J. Fraster. Phylogeny of Bacteroides, Prevotella, and Porphyromonas spp. and related bacteria. J. Bacteriol. 1994. Feb, 725-732.

21. Callihan D.R., Young F.E., Clark V.L. Identification of three homology classes of small, cryptic plasmids in intestinal Bacteroides species. Plasmid. 1983 Jan;9l.:17-30.

22. Carlier J.P., Bedora-Faure M., K'ouas G., Alauzet C., Mory F. Proposal to unify Clostridium orbiscindens Winter et al. 1991 and

23. Carter B., Jones C., Alter R., Creadick R., Thomas W. Bacteriodes infections in obstetrics and gynecology. Obstet Gynecol. 1953. May;l5.:491-510.

24. Cash H.L., Whitham C.V., Behrendt C.L., Hooper L.V. et al.L.V. Symbiotic bacteria direct expression of an intestinal bactericidal lectin. Science. 2006 .Aug 25;3135790.: 1126-30.

25. Chassard C., Delmas E., Lawson P.A., Bernalier-Donadille A. Bacteroides xylanisolvens sp. nov., a xylan-degrading bacterium isolated from human faeces.- Int J Syst Evol Microbiol. -2008. Apr;58Pt 4.:1008-13.

26. Christensen S.K., Gerdes K. et al. K. RelE toxins from bacteria and Archaea cleave mRNAs on translating ribosomes, which are rescued by tmRNA. Mol Microbiol. 2003. Jun;485.:1389-400.

27. Cohen S.N., Chang A.C., Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1972. Aug;698.:2110-4.

28. Davies J., Jacob F. Genetic mapping of the regulator and operator genes of the lac operon. J Mol Biol. 1968. Sep 28;363.:413-7.

29. Del Solar G., Giraldo R., Ruis-Echevarria M.J., Espinosa M., Dias-Orejas R. 1998. Replication and control of circular bacterial plasmids. Microbiol Mol Biol Rev June, 622.: 434-464

30. Deng W., Xi D., Mao H., Wanapat M. The use of molecular techniques based on ribosomal RNA and DNA for rumen microbial ecosystem studies: a review. Mol Biol Rep. 2008 Jun;352.:265-74. Epub 2007. May 5.

31. Eckburg P.B., Bik E.M., Bernstein C.N., Purdom E., Sargent M., Gill S.R. et al. S.R., Nelson K.E., Relman D.A. Divercity of the human intestinal microbial flora. Science. 2005. 308, 1635-1638.

32. Eggerth A.H., Gagnon B.H. The Bacteroides of Human Feces. J Bacteriol. 1933. Apr;254.:389-413.

33. Enck P., Zimmermann K., Rusch K., Schwiertz A., Klosterhalfen S., Frick J.S. The effects of maturation on the colonic microflora in infancy and childhood. Gastroenterol Res Pract. 2009;2 009:752401. Epub 2009. Sep 16.

34. Fenner L., Roux V., Ananian P., Raoult D. Alistipes finegoldii in blood cultures from colon cancer patients. Emerg Infect Dis. 2007. Aug; 13 8.: 1260-2.

35. Franco A.A. The Bacteroides fragilis pathogenicity island is contained in a putative novel conjugative transposon. J Bacteriol. 2004. Sep;18618.:6077-92.

36. Freitas M., Tavan E., Cayuela C., Diop L., Sapin C., Trugnan G. Host-pathogens cross-talk. Indigenous bacteria and probiotics also play the game. Biol Cell. 2003. Nov;958.:503-6.

37. Gajiwala K.S., BurLey R.E et al.S.K. Winged helix proteins. Curr Opin Struct Biol. 2000 Feb;10l.:l 10-6.

38. Gerdes K., Christensen S.K. et al. S.K., L0bner-Olesen A. Prokaryotic toxin-antitoxin stress response loci. Nat Rev Microbiol. 2005. May;35.:371-82.

39. Gill S.R., Pop M., Deboy R.T., Eckburg P.B. et al. P.B., Turnbaugh P.J., Samuel B.S., Gordon J.I., Relman D.A., Fraser-Liggett C.M., Nelson K.E. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 2006. Jun 2;3125778.:1355-9.

40. Gilmore M.S., Ferretti J.J. Microbiology. The thin line between gut commensal and pathogen. Science. 2003. Mar 28;2995615.¡1999-2002.

41. Goodacre R. Metabolomics of a superorganism. J Nutr. 2007. Jan;137l Suppl.:259S-266S.

42. Grimont F. et al. F., Grimont F. et al. P.A. Ribosomal ribonucleic acid gene restriction patterns as potential taxonomic tools. Ann Inst Pasteur Microbiol. 1986. Sep-Oct;137B2.: 165-75.

43. Gronlung M.M., Arvilommi H., Kero P. Importance of intestinal colonisation in the maturation of humoral immunity in early infancy: a prospective follow up study of healthy infants aged O 6 months. Arch. Dis Child Fetal Neonatal Ed. - 2000 83, 186-192.

44. Gunn A.A. Bacteroides infection in the surgery of childhood. Arch Dis Child. 1957. Dec;32166.:523-9.

45. Gurtler V., Wilson V.A., Mayall B.C. Classification of medically important Clostridia using restriction endonuclease site differences of PCR-amplified 16S rDNA. J Gen Microbiol. 1991. Nov;137l l.:2673-9.

46. Haggoud A.A., Trinh S., Moumni M., Reysset G. Genetic analysis of the minimal replicon of plasmid pIP417 and comparison with the other encoding 5-nitroimidazole resistance plasmids from Bacteroides spp. Plasmid. 1995. Sep;342.:132-43.

47. Hayashi H., Sakamoto M., Benno Y. Phylogenetic analysis of the human gut microbiota using 16S rDNA clone libraries and strictly anaerobic culturebased methods. — 2002. 46, 535-538.

48. Hayashi H., Shibata K., Sakamoto M., Tomita S., Benno Y. Prevotella copri sp. nov. and Prevotella stercorea sp. nov., isolated from human faeces. Int J Syst Evol Microbiol. 2007. May;57Pt 5.:941-6.

49. Hooper L.V., Wong M.H., Thelin A., Hansson L., Falk P.G., Gordon J.I. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. Science. 2001 Feb 2;291 5505.:881-4.

50. Hopkins M.J., Macfarlane G.T. Changes in predominant bacterial populations in human faeces with age and with Clostridium difficile infection. J Med Microbiol. 2002. May;515.:448-54.

51. Hopkins M.J., Macfarlane G.T., Furrie E., Fite A., Macfarlane S. Characterisation of intestinal bacteria in infant stools using real-time PCR and northern hybridisation analyses. FEMS Microbiol Ecol. 2005. Sep l;54l.:77-85

52. Hopkins M.J., Sharp R., Macfarlane G.T. Age and disease related changes in intestinal bacterial populations assessed by cell culture, 16S rRNA abundance, and community cellular fatty acid profiles. Gut. 2001. Feb;48 2.: 198-205.

53. Igarashi E., Kamaguchi A., Fujita M., Miyakawa H., Nakazawa F. Identification of oral species of the genus Veillonella by polymerase chain reaction. Oral Microbiol Immunol. 2009. Aug;244.:310-3.

54. Johnson J.L., Harich B. Ribosomal riboucleic acid homology amoung species of the genus Bacteroides. Int. J. of syst. Bacteriology, Jan. 1986, p. 71-79

55. Karlsson F.H., Ussery D.W., Nielsen J., Nookaew I. A Closer Look at Bacteroides: Phylogenetic Relationship and Genomic Implications of a Life in the Human Gut. Microb Ecol. 2011. Jan 11. Epub ahead of print.

56. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J MolEvol. 1980. Dec;162.:l 11-20.

57. Kitahara M., Sakamoto M., Ike M., Sakata S., Benno Y. Bacteroides plebeius sp. nov. and Bacteroides coprocola sp. nov., isolated from human faeces. Int J SystEvol Microbiol. 2005. Sep;55Pt 5.:2143-7.

58. Kling J.J., Wright R.L., Moncrief J.S., Wilkins T.D. Cloning .and characterization of the gene for the metalloprotease enterotoxin of Bacteroides fragilis. FEMS Microbiol Lett. 1997. Jan 15;1462.:279-84.

59. Korch S.B., Contreras H., Clark-Curtiss J.E. Three Mycobacterium tuberculosis Rel toxin-antitoxin modules inhibit mycobacterial growth and are expressed in infected human macrophages. J Bacteriol. 2009. Mar; 191 5.: 1618-30. Epub 2008. Dec 29.

60. Krinos C.M., Coyne M.J., Weinacht K.G., Tzianabos A.O., Kasper D.L., Comstock L.E. Extensive surface diversity of a commensal microorganism by multiple DNA inversions. Nature. 2001 Nov 29;4146863.:555-8.

61. Lassman B., Gustafson D.R., Wood C. M., and Rosenblatt J. E. Reemergence of anaerobic bacteremia. Clin. Infect. Dis. 2007. 44:895-900.

62. Ley R.E. Obesity and the human microbiome. Curr Opin Gastroenterol. 2010. Jan;26l.:5-11.

63. Lofmark S., Edlund C., Nord C.E. Metronidazole is still the drug of choice for treatment of anaerobic infections. Clin Infect Dis. 2010. Jan 1;50 Suppl l:S16-23.

64. Lofmark S., Jernberg C., Jansson J.K., Edlund C. Clindamycin-induced enrichment and long-term persistence of resistant Bacteroides spp. and resistance genes. J Antimicrob Chemother. 2006 Dec;586.:l 160-7. Epub 2006 Oct 17.

65. Ludwig W., Schleifer K.H. Bacterial phylogeny based on 16S and 23S rRNA sequence analysis. FEMS Microbiol Rev. 1994. Oct; 15 2-3.:155-73.

66. Manson J.M., Rauch M., Gilmore M.S. et al. M.S. The commensal microbiology of the gastrointestinal tract. Adv Exp Med Biol. 2008. 635:15-28.

67. Mariat D., Firmesse O., Levenez F., Guimaráes V., Sokol H., Doré J., Corthier G., Furet J.P. The Firmicutes/Bacteroidetes ratio of the human microbiota changes with age. BMC Microbiol. 2009. Jun 9;9:123.

68. Martens E.C., Roth R., Heuser J.E., Gordon J.I. Coordinate regulation of glycan degradation and polysaccharide capsule biosynthesis by a prominent human gut symbiont. J Biol Chem. 2009 Jul 3;28427.: 18445-57. Epub 2009 Apr 29.

69. Matsuki T., Watanabe K., Fujimoto J., Takada T., Tanaka R. Use of 16S rRNA gene-targeted group-specific primers for real-time PCR analysis of predominant bacteria in human feces. Appl. Environ. Microbiol. — 2004. 7012., 7220-7228.

70. Mazmanian S.K., Liu C.H., Tzianabos A.O., Kasper D.L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 2005. Jul 15; 1221.: 107-18.

71. Moon K., Shoemaker N.B., Gardner J.F., Salyers A.A. Regulation of excision genes of the Bacteroides conjugative transposon CTnDOT. J Bacteriol. 2005. Aug;18716.:5732-41.

72. Morgan R.M., Macrina F.L. bet A: a novel pBF4 gene necessary for conjugal transfer in Bacteroides spp. Microbiology. 1997 Jul; 143 Pt 7.:2155-65.

73. Morotomi M., Nagai F., Sakon H., Tanaka R. Dialister succinatiphilus sp. nov. and Barnesiella intestinihominis sp. nov., isolated from human faeces. Int J Syst Evol Microbiol. 2008. Dec;58Pt 12.:2716-20.

74. Novicki T.J., Hecht D.W. et al. D.W. Characterization and DNA sequence of the mobilization region of pLV22a from Bacteroides fragilis. J Bacteriol. 1995. Aug;17715.:4466-73.

75. O'Hara A.M, Shanahan F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Rep. 2006. Jul;77.:688-93.

76. Olsen G.J., Woese C.R. Ribosomal RNA: a key to phylogeny. FASEB J. 1993. Jan;7l.: 113-23

77. O'Sullivan D.J. Methods for analysis of the intestinal microflora. Curr Issues Intest Microbiol. 2000 Sep;l2.:39-50.

78. Overgaard M., Borch J., Gerdes K. et al. K. RelB and RelE of Escherichia coli form a tight complex that represses transcription via the ribbon-helix-helix motif in RelB. J Mol Biol. 2009 Nov 27;3942.:183-96. Epub 2009 Sep 8.

79. Palys T., Nakamura L.K., Cohan F.M. Discovery and classification of ecological diversity in the bacterial world: the role of DNA sequence data. Int J Syst Bacteriol. 1997. Oct;474.:l 145-56.

80. Pantosti A., Tzianabos A.O., Reinap B.G., Onderdonk A.B., Kasper D.L. Bacteroides fragilis strains express multiple capsular polysaccharides. J Clin Microbiol. 1993. Jul;317.:1850-5.

81. Paster B.J., Dewhirst F.E., Olsen I., Fräser G.J. Phylogeny of Bacteroides, Prevotella and Porphyromonas spp. and related bacteria. J Bacteriol. 1994. Feb;1763.:725-32

82. Penders J., Thijs C., Vink C., Stelma F.F., Snijders B., Kummeling I., van den Brandt P.A., Stobberingh E.E. Factors influencing the composition of the intestinal microbiota in early infancy. Pediatrics. 2006. Aug;l 182.:511-21

83. Pumbwe L., Wareham D.W., Aduse-Opoku J., Brazier J.S., Wexler H.M. H.M. Genetic analysis of mechanisms of multidrug resistance in a clinical isolate of Bacteroid.es fragilis. Clin Microbiol Infect. 2007. Feb;132.:183-9.

84. Raghavan V., Groisman EA. Orphan and hybrid two-component system proteins in health and disease. Curr Opin Microbiol. 2010 Apr;132.:226-31. Epub 2010 Jan 19.

85. Rasmussen B.A., Bush K., Tally F.P. Antimicrobial resistance in Bacteroides. Clin Infect Dis. 1993. Suppl 4:S390-400.

86. Reid G., Burton J., Hammond J.A., Bruce J. et al. A.W. Nucleic acid-based diagnosis of bacterial vaginosis and improved management using probiotic lactobacilli. J Med Food. 2004. Summer;72.:223-8.

87. Reysset G., Haggoud A. et al. A., Su W.J., Sebald M. Genetic and molecular analysis of pIP417 and pIP419: Bacteroides plasmids encoding 5-nitroimidazole resistance. Plasmid. 1992. May;273.:181-90.

88. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 1987. 4, 406-425.

89. Sakamoto M., Lan P.T., Benno Y. Barnesiella viscericola gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Porphyromonadaceae isolated from chicken caecum. Int J Syst Evol Microbiol. 2007. Feb;57Pt 2.:342-6.

90. Saldanha A.J. Java Treeview-extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 2004. Nov 22;2017.:3246-8. Epub 2004 Jun 4.

91. Salyers A. A., Gupta A., and Wang Y. Human intestinal bacteria as reservoirs for antibiotic resistance genes. Trends Microbiol. 2004. 12:412416.

92. Salyers A.A., and C. F. Amabile-Cuevas. Why are antibiotic resistance genes so resistant to elimination? Antimicrob. Agents Chemother. 1997.41:2321-2325.

93. Salyers A.A., Bonheyo G., Shoemaker N.B. Starting a new genetic system: lessons from bacteroides. Methods. 2000. Jan;20l.:35-46.

94. Salyers A.A., Shoemaker N.B. Resistance gene transfer in anaerobes: new insights, new problems. Clin Infect Dis. 1996. Suppl l:S36-43.

95. Salyers A.A., Shoemaker N.B., Stevens A.M. and Lhing-Yew. Conjugative Transposons: an Unusual and Diverse Set of Integrated Gene Transfer Elements. Microbiological reviewes, Dec. 1995, p. 579-590 Vol. 59, No. 4

96. SamBrook I. et al. J., Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory manual. 2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

97. San Joaquin V., Griffis J. C., Lee C., and Sears C. L. Association of Bacteroides fragilis with childhood diarrhea. Scand. J. Infect. Dis. 1995. 27:211-215.

98. Sasaki E., Osawa R., Nishitani Y., WhiLey R.E et al.R.A. ARDRA and RAPD analyses of human and animal isolates of Streptococcus gallolyticus. J Vet Med Sei. 2004. Nov;66l 1.: 1467-70.

99. Sears C.L. Enterotoxigenic Bacteroides fragilis: a rogue among symbiotes. Clin Microbiol Rev. 2009. Apr;222.:349-69.

100. Sears C.L. The toxins of Bacteroides fragilis. Toxicon. 2001 Nov;39l 1.: 1737-46.

101. Shah H. N. & Collins M. D. Prevotella, a new genus to include Bacteroides melaninogenicus and related species formerly classified in the genus Bacteroides. Inf J Syst Bacteriol. 1990. 40, 205-20

102. Shah H. N. & Collins M. D. Proposal to restrict the genus Bacteroides Castellani and Chalmers. to Bacteroides fragilis and closely related species. Int J Syst Bacteriol. 1989. 39, 85-87.

103. Shah H.N. & Collins M.D. Proposal for reclassification of Bacteroides asaccharolyticus, Bacteroides gingivalis, and Bacteroides endodontalis in a new genus, Porphyromonas. 1988. Int J Syst Bacteriol 38, 128-131.

104. Shah H.N., Olsen I., Bernard K., Finegold S.M., Gharbia S., Gupta R.S. Approaches to the study of the systematics of anaerobic, gramnegative, non-sporeforming rods: current status and perspectives. Anaerobe. 2009. Oct; 155.: 179-94. Epub 2009 Aug 18.

105. Shanahan F. Gut microbes: from bugs to drugs. Am J Gastroenterol. 2010 Feb;1052.:275-9. Epub 2010. Jan 12.

106. Shoemaker N.B., Vlamakis H., Hayes K., Salyers A.A. Evidence for extensive resistance gene transfer among Bacteroides spp. and among Bacteroides and other genera in the human colon. Appl Environ Microbiol. 2001. Feb;672.:561-8.

107. Simon V., Schumann W. In vivo formation of gene fusions in Pseudomonas putida and construction of versatile broad-host-range vectors for direct subcloning of Mu dl and Mu d2 fusions. Appl Environ Microbiol. 1987. Jul;53(7):1649-54.

108. Sitailo L.A., Zagariya A.M., Arnold P.J., Vedantam G., Hecht D.W. et al. D.W. The Bacteroides fragilis BtgA mobilization protein binds to the oriT region of pBFTMlO. J Bacteriol. 1998. Sep;18018.:4922-8

109. Sklarz M.Y., Angel R., Gill S.R. et al.or O., Soares M.I. Evaluating amplified rDNA restriction analysis assay for identification of bacterial communities. Antonie Van Leeuwenhoek. 2009. Nov;964.:659-64.

110. Smith C.J. Development and use of cloning systems for Bacteroides fragilis: cloning of a plasmid-encoded clindamycin resistance determinant. J Bacteriol. 1985. 0ct;164l.:294-301.

111. Smith C.J., Rollins L.A., Parker A.C. Nucleotide sequence determination and genetic analysis of the Bacteroides plasmid, pBI143. Plasmid. 1995. Nov;343.:211-22

112. Smith C.J., Tribble G.D., BayLey R.E et al.D.P. Genetic elements of Bacteroides species: a moving story. Plasmid. 1998. Jul;40l.:12-29.

113. Sôki J., Gal M., Brazier J.S., Rotimi V.O., Urban E., Nagy E., Duerden B.I. Molecular investigation of genetic elements contributing to metronidazole resistance in Bacteroides strains. J Antimicrob Chemother. 2006. Feb;572.:212-20. Epub 2005 Dec 7.

114. Soki J., Szôke I., Nagy E. Characterisation of a 5.5-kb cryptic plasmid present in different isolates of Bacteroides spp. originating from Hungary. J Med Microbiol. 1999 Jan;48l.:25-31.

115. Song Y., Kônônen E., Rautio M., Liu C., Bryk A., Eerola E., Finegold S.M. Alistipes onderdonkii sp. nov. and Alistipes shahii sp. nov., of human origin. Int J Syst Evol Microbiol. 2006. Aug;56Pt 8.: 1985-90.

116. Song Y., Liu C., Bolanos M., Lee J., McTeague M. & Finegold S.M. Evaluation of 16S rRNA sequencing and réévaluation of a shortbiochemical scheme for identification of clinically significant Bacteroides species. J Clin Microbiol. 2005. 43, 1531-1537

117. Song Y., Liu C., Molitoris D., Tomzynski T.J., Mc Teague M., Read E., Finegold S.M. Use of 16S-23S rRNA spacer-region SR.-PCR for identification of intestinal Clostridia. Syst Appl Microbiol. 2002. Dec;25[4]:528-35.

118. Speer B.S., Shoemaker N.B., Salyers A.A. Bacterial resistance to tetracycline: mechanisms, transfer, and clinical significance. Clin Microbiol Rev. 1992. 5:387-99.

119. Stephen A., Cummings G. The microbial contribution to human fecal mass. J. Med. Microbiol. 1980.13, 45-51.

120. Stock A.M., Robinson V.L., Goudreau P.N. Two-component signal transduction. Annu Rev Biochem. 2000. 69:183-215.

121. Strober W., Fuss I., and Mannon P. The fundamental basis of inflammatory bowel disease. J. Clin. Investig. 2007.117:514-521.

122. Stubbs S.L., Brazier J.S., Talbot P.R., Duerden B.I. PCR-restriction fragment length polymorphism analysis for identification of Bacteroides spp. and characterization of nitroimidazole resistance genes. J Clin Microbiol. 2000. Sep;389.:3209-13.

123. Tannock G.W. Analysis of the intestinal microflora: a renaissance. Antonie Van Leeuwenhoek. 1999. Jul-Nov;76l-4.:265-78.

124. Tringe S.G., Hugenholtz P. A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene. Curr Opin Microbiol. 2008 Oct;l l5.:442-6. Epub 2008 Oct 8.

125. Trinh S., Reysset G. Identification and DNA sequence of the mobilization region of the 5-nitroimidazole resistance plasmid pIP421 from Bacteroides fragilis. J Bacteriol. 1997. Jun; 17912. :4071-4.

126. Turnbaugh P.J., Ley R.E et al.R.E., Mahowald M.A., Magrini V., Mardis E.R., Gordon J.I. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 2006. Dec 21 ;4447122.: 1027-31.

127. Tzianabos A.O., Onderdonk A.B., Rosner B., Cisneros R.L., Kasper D.L. Structural features of polysaccharides that induce intra-abdominal abscesses. Science. 1993 Oct 15;2625132.:416-9.

128. Vaneechoutte M., De Beenhouwer H., Claeys G., Verschraegen G., De Rouck A., Paepe N., Elaichouni A., Portaels F. Identification of Mycobacterium species by using amplified ribosomal DNA restriction analysis. J Clin Microbiol. 1993. Aug; 318.:2061-5.

129. Ventura M., Casas I.A., Morelli L., Callegari M.L. Rapid amplified ribosomal DNA restriction analysis ARDRA. identification of Lactobacillus spp. isolated from fecal and vaginal samples. Syst Appl Microbiol. 2000. Dec;23[4]:504-9.

130. Wang X., Heazlewood S.P., Krause D.O., Florin T.H. Molecular characterization of the microbial species that colonize human ileal and colonic mucosa by using 16S rDNA sequence analysis. J Appl Microbiol. 2003. 953.:508-20

131. Wexler H.M. Bacteroides: the good, the bad, and the nitty-gritty. Clin Microbiol Rev. 2007. Oct; 204.:593-621.

132. Woo P.C., Lau S.K., Teng J.L., Tse H., Yuen K.Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clin Microbiol Infect. 2008 Oct; 1410.:908-34.

133. Woodmansey E.J. Intestinal bacteria and ageing. J Appl Microbiol. 2007. May;1025.:l 178-86.

134. Wu S., Lim K.C., Huang J., Saidi R.F., Sears C.L. Bacteroides fragilis enterotoxin cleaves the zonula adherens protein, E-cadherin. Proc Natl Acad Sci USA. 1998. Dec 8;9525.:14979-84.

135. Xu J., Bjursell M. K. et al. M.K., Himrod J., Deng W. et al. S., Carmichael L.K., Chiang H.C., Hooper L.V. et al.L.V., Gordon J.I. A genomic view of the hum&n-Bacteroides thetaiotaomicron symbiosis. -Science. 2003 Mar 28;299 5615.:2074-6.

136. Xu J., Gordon J.I. Honor thy symbionts. Proc Natl Acad Sci USA. 2003. Sep 2;10018.:10452-9. Epub 2003 Aug 15.

137. Yamaoka K., Watanabe K., Muto Y., Katoh N., Ueno K., Tally F.P. R-plasmid mediated transfer of beta-lactam resistance in Bacteroides fragilis. J Antibiot Tokyo. 1990. Qct;43[10]:1302-6.

Информация о работе

Кулагина, Елена Валерьевна
кандидата медицинских наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Видовой состав бактерий порядка Bacteroidales в микрофлоре кишечника у здоровых людей и характеристика плазмиды, выделенной из B.uniformis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы