Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Векторные системы для архебактерии на основе генов рибосомных ГНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Векторные системы для архебактерии на основе генов рибосомных ГНК"

\г .1 о 5.9 Д

МОСКОВСКИЙ Т'ОСУДЛГСТНКШШ УНИВКГСИТЕГ им. М.В..П',!м'л1оссря

Рио ло г и ■ I п г к и Я Фак у л ь т о т

На иртт рукописи •УДК 577.113. г.7[,

КАГРАМАИОВА Вере Константиновна

ВЕКТОПШ СИСТЕМЫ ДЛЯ АРХКБАКТКРИИ НА ОСНОВЕ ГЕНОВ ГИБОСОМШ ПИ

ОПЙЦИЯЛЫЮСТЬ - 03.CXj.03 Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискпнио ученой степени доктора биологических нпук в форме научного докладч

Москва - 1992

l'tioovsi вшюлнона в Институте фиаико хнмичаской биологии им. А.Н.ИвЛиЗйрского МГУ им. М.В.Ломоносов«

_ (^ицнайише оыьшшиы:

Цлч^р Онилигичиоких наук, профосоор Рьоэдьь В.А.

/iGK'lop 01»ОЛОГ11ЧоО(\ИХ наук, профессор Мылка C.B.

Догамр OHOJioi'H'kJCluix nayti, ujxiijwcoup Лаьрик О.И.

linjyiiia» организации; Институт иолекудярной биологии

ии. В.А.Эагельгардта

ЙищИ'Ш LÎAîTullfCri " QifaM Jk-Jh/î Ы 1'. и чиц. ни ииседаияи Сницнплйларотшь.нч! О^ьоти {[.053.05.70 но аыцить диосорхаций на о.оиокыма ученой огыичш доктора наук при М.яжонском 1'осулароаьо1Шом Унипьронюто им. Ы,Н Ломоиоооьа по адресуî I19«>J ГИО, MockIiîi, JlûlbutoKUa j'Opu, Ml'У, КиолотческиЯ факультет.

О материалами дм^сиртшиш мкмо оышиоиитьед й

ОиОлиотькн Ьиологичосього факуль'тита МГУ. ■

AKiOpo'pipar ptuocjiHii »¡¡^

V.

Учаный секретарь / / //

i:iiuUiiajii'.:jiifK>uaiiaù]'o OuBo'ia / 1(кицицат химичаоки* паук

b.H.KAl'PAMAHob

1 ГвгТ^г",

I Я"л. ,,

овдая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Нополмоюнго* "гкрмт* п |'/-v vor.',' u»»j» • с'гпа ирхчОпктеркй, но статусу рапного uafcxmiM ауъгкщкЯ (то есть истинных оагтеркй) и эукаркот. сразу сдила-ю орхлбчктврав объектом пристального и рачностор.>шк'!1) внимания игсл-д-чачгч • леС1.

С точки зрения ^ундоментал-них я-vk изучит*" :>тих 1мьр<г -. организмов представляет Соль;;;оГ, иптмрос вслздстеж- то!'"', что архпбактчрии, обладая чкртпии, гфисуг.ими как !>у.1акг.>риш, так и эукчркотам. проявляю г тгиою весьма нмтчгчцио к cnuun-ím«-скив свойства, и виленеиил »«шшда.в iva глитспих процессов может дать дополнительную инфрмашш об í»i».»j».|уя« kukix организмов вообще и путем проведения сравните и<>го анализу <г;яь!ть черты, характерные для их обцаго пр*;ямстиитикп.

ПремншнниыЯ потенциал архвбактирай тяга» «роавич&йвл висок,, но находится едва ли не у самих истоков све»го иамль-зопония. Тем не менее, кувмстшш ут> на ссгоплотний л«;», дяннме дают ил-моииость прогкоэг- . пть в сомом•ннлвлекоч д.'ду-И10М вакнуп ирикладну» роль рига архе'актерпй в развитии различных иародю-хозяЛствешздх областей.

В соответствии с современной кд&сси^чякиеЛ домен «рх»ч1ик-терий обрадует группа- организмов, юслотвжия н качестве основных представителей якстрэмальнке галобактер;ш, метздоген-иы« прхеськтерии и сэротпююикмо термофила. Среди irax галтфилыив архебактярии затааш»? исключительнее пояокоии®, обладая целим рядом уникальных свойств. Они обитают а среде с очень ВЫСОКОЙ концентрацией СОЛЛ (ДО 4,5 М), К КЛ'ОрО,1 адаптировались за счет высокого внутрмклеточного содерканля солей (В ОСНОВНОМ, KCl). В СВЯЗИ С этим ИХ молекулярные, биохимически» и физиологические свойства, а также реализация клеточных механизмов должны судествяшшм образом отличаться от тех, которпчи располагают другие организмы. Весьма необычным свойством н»котс- гало'1'илов является снособяост- к синтезу родоиачюв (бакт ; 'родопешча, гало;х>дсисина и сенсорных родопсинов >. пр»Л' • чвляняих интерес для биофизических иссле-дсьаш'.Я. Многие галобяктчрид отличаются чр©?вьп«й1Ю высокой

h4«u.0nJiiiK><-u-»i i'Miidi'i]'!B.;tioi'o MtiTopiuiJia, связанной как с ьи-СОКиР Ч!иЛл>'"чА ВОУНШиЮП'лШЛ ТОЧИЧНЫХ мутицип, 'Гак И С П6|х;Мо-

цониом <Vou.oiv числа иодышшх типических шюмянтов. Нако-

Uoll, Ним» ИрОДиТЬЬЙТИЛИ ГиЛоОаКТнрИаЛЬМОЙ ввтьи

отлткл.м от Лидшииетна upmautjoa том, что содержат в сьоом ГоЦ'.Ь'ч J:H':;:> од w ;TU"HlttJfl ylWpt.ll pnrtv»i*C:MilUX И1К , ЧТО irpD.iiiiwjiai'i.ii'i чроаа^Ы'.аую цошюать утих гапоОактириП дли илу-4«nii!»i •;y:«.:1:t.--uriJii.;H.{l р..л» |iH!K <•■ •{<■.!. >.t|«y>i »и» кт-катий

(r'.iN t) 1 ; «АПНО il.'.it;. l,l<!<;To llp.l ЫмйуН.Ш Ь 1Ч.11Ы pi'Hii IHipr&j.'MmUX мутаций ) , а ГОМОГНИИМЙ ИОИУЛНЦМСЙ pllOwCwM.

(i.Uii-:;4 иааааиьа к даьаому м.л/.еачу иа^ормациа о toj.<ua;rjMaX bai 'l I.HICJ.t'l\.'i!|UX IIW-IWCiJOH.O структура ptl.na Ы11МШХ rtUlUOilKTupU-hj'.U:JX rfil./h (И Пориуь ОЧ1.'[ч.,ДЬ, I'bliJb рИ1К и p-ria.'IKOb) Ч ИХ ]>jry.':«.iibi сила получиаа на молекулярном урона» аутом их. кл>ла:;кчи::п;>1 и |1аучинан a ауоактирпадьн^х сиатимах.. Но килпа на-; ум-ci ьтать досачпнютии п зиаччшш ц.-л-олию ризриЛотшишх. а./Оак1; сраалипп raaa.)-vuiKuiiopaax конструкции, следу от, Т«м На окпсать, что «нтимильиш шимится npui«/i«iwo таких Iонатичиоких наелидоаааий ьыморадстызнно и самих I•uX-Oi.nTwpUWlbHUX KJluTKaX . 1.ДЦП на ОСЮМ1ЫХ ШДХОДОЬ к ЬТ(.МУ -соадыш« так называемых каттл-иукторши* • еиатьм, и, а чагть■ii.-i.i, лщ<утип<.ны1ышх алаамлд, споаооаах суадв(;ти'>ьоть ь дьух различии* организмах ia дана^м случаа ь галобактормйх и в. ".'И) и I' -.i-b гнЛйтичиские дотормпнаши, ооосипчииамци» ьозкогаь.огь селекции чрансформиатоа o<4)ux ориашамоь. Такие копсчрукцк.! а принципа иизьолнют на только осущооталать клинироьгаы», научанпа структуры и шдолкНИО в значитвлышх количествах чуки{©дной ДШС а кпнткил Н. <-оч, но и детально исслодоь&ть михааизмц акснриосии шдоркавдися ь най гансш а их природной енотами.

Одной па аирюзних проблем при конструировании uiurTJi-bhK гирла дли галор.иц.нах арх.^актврий аыаютса

•Торшп "шаттл at'K'iop" и ироизаодаии v. г uui\> исиоли>укт-.и а иастоаща!) ра(5ота но аналогии а обаа-ирияятим н нарубана. >й литератур.; 'юрмаа^м ".i.utw.: vi ctor" (аа. л. i, го иста '¡о пцпчний нектар.

ц»п"С'г*.!ч.к jr.it ищи <*>:.'• ктйычл «ну».> >••». ¡>. ••(*уч п, • • ■

чМ'Ч'таннчй '>|Лм{. гап^л-'с | (>е%> '!м> ...... г,

И'ггк.'дьку ПШ ИОЧУ'К П«ИТМ|."Ч к "олти иу ты*. > • ::: ■. ■ ■; •

»< грн]1'! щ|ч..1,-5.ц--й практик" •• ь'.-л'ч' ч

¡»уияристич-чки* атткп№>•!«. Лтеь грялш м'.л.г- ц(>,;:>(•!.•• о л.*

' Лу'ЛИКЛ'аПЧ ' • I';-Л ¡1 Г '•'■!!>! Л.'ЛЛ'" ■ Л'а.' г л л

1'-)Л'10'1КТ'|Ч1!1!11.1!ич МаТТ.Л Л-КГ 'рЛ-, 1' К'.Л.рих '! !'•': снЛ'МПН'чНих Л"'1";.м>!ИЯ!!Т ЬГ'1/."-г 11 1 ;"!.:■!.;' 1лч :. <л

рл<И'тгчсгнлгш к м-ж.шоличу с ¡л», I »..I ?"!••, !• >.»>> и

ИЛ(<л'1'0Л'чу I1! -Л;Л л , г■»■ -• - * _ лпл'л Л1 Л7Л>л

ГисГ'К-Ш ТЮТСЛЛ !!■ Л'-< Т.и;;;; С'ЛНТЛ:!,!./. I ':: ' !-и-: "Г1 ■'! .■: Ч ¡'!М гштегкотикам мутант.¡Г!, ма.лн м;("г,:;ч- 'Гг. «••¡•От'.ынп и

К'л-чишялымя тсс'и'с 1), »гт.-'и-.-.-т*..-» ття гь 1»я

|ИК< ПКЛ\Н ••1ЦИ01И1«е :!р>.'Ц1'С'.,Ь> !'!-'■' Г;>'!МГ I!'- 1 1' г';

'"г.ипгь и. Ил - ,ч;я.;• л " ■■ -и.» к 'И -¡л 1! п

ГПГИМЧЧЫШМЯ К ЛКТКТ ЛП ЛЛ!ЛЛ: п..И. -п „ { УП'.Х I >;),-'П:-;ф,!'Т<

и л-лланг» аллллал;ы!';х л ; ^лх г .

Цель и йзцячи иссл*,ио»81шя. кк.-Р ц-али ; ч?. и; «члн»! ля лллатл полхолоп к ул/лал и г..,.': >,.','ли м 'Л >:.Ч'ИИ

;фхо.лп1стер'.!1, исслолопшгню гглЯ.лп г.» тра >л, лларята

и функция раЯосомных П.К. Ксн:-:р"Т!1-Л з*\ч*ччй дятгнч» ис.'Л'.'Л рання янн.чось н -и • ц. ■ \-r-a--Т'.»; >п - к - гало-

оактнрп.чллшх. шаттл ьлаерт;* гдлп-м ¡¡а ос'.иллрл.л рГ:'К •.'К^ГрА'ЛДЬНУ ГЧЛС»5ЯДЫ1'»Я <•-<" Рч1о«с'. '' "Н!П 'пИМчч,

«ягос-Оквх с""> л^ллгь ^^¡"ктгыг.'А С1 трипсин мздгош и

трнч'.: мани»' :лл:лак1л; и Л.

Ь нтлллсо 'лЛ'П! '"л-": рл:л1 р>!Л гллли/х. ¡л ллл'плк.и '«ллч: 1. На (лнлл 01ЛрЛ|а р'ЦК Ич. 1 ''¡ля р-глра'чялпа

•ЛЛЛ'Ма ЛЛеКЛЛ, I!' "'I " Л ¡. Л -Л ■■'?>'•-Т. Т 1< 7П Ь Г-М-'ГТИг.'и;; р

тр/.лн>1>Ч! а/, 1 зк'!р;!-1 'ч-ы.V лл-лк.

Л. '■":>■: Ч':Ч"Н.ч аь'Г'ЛГ'.'¡г.н и

1. '"ллачшп 1—к7>" к .чот; ','а;:л? ло^а.'л;' рал; ¡-т'-;-;, г:рщ "Л'П;-> тпч I.." п/р ^-п;:.-! .ур-,; '/-с Лрал'-лгл; Л»1'" ."'лп'ч

iitj. hjtvbiim, получена серия векторов, содержащих различные : iipoMoTu^u, чао потенциально монет оказаться пригодным для клонирования и ькспрессии других галобактериалышх генов. Научная новизна работы. В работе впервые получен И охарактеризован ".ДВОЙНОЙ" мутант аь. KaloMiwiHiOUlU, устойчивый одновременно к двум ингибиторам бежевого синтеза -антибиотикам анизомицшу и тиострептону. Подтвемдено," что • устойчивость мутанта к анизомицину и тиострентону обусловлена наличием ючо'пшх ну1Слеотидиих заман 0->-Т и A.-—Q в позициях 2471 u 1159 гена 23S pPtfli, соответственно (нумерация нуклиотидов приводи гея в соответствии с нумерацией нуклеотидов

В 2JS pHIK hb. UulobliMt).

lia основе мушиного onepoua pPHK нь. h^iotium впервые получена серия шаттл-векторных плазмид, способных автономно реплицироваться и стабильно наследоваться в клэтна1' как в. ooii, так и но. ланьим.).

В хо до работ но выбору галобактериального репликатора били детально исследованы природные мультшсопиЯше плазмиды из штаммов liaiot.juuria SB3. UHB и GN101. Впервые определены полные нуклеотидиыо последовательности плазмид рНВВ из штамма Ualtitajiiîi-iurt SB3.

(>TK])iiTo уникальное явление гетерогенности популяции этих плазмы« и сосуществования в пределах одной клетки выоокогоыолигичних шшльшдних вариантов.

В прчмоториом районе опарона pPllK вь. ha.iobiimi обнаружены последовательности, ответственные за автономную репликации и наследование содержащих их плазмид галобактериаль-1шш клетками. Локализован район, пригодный для клонирования дополнительных последовательностей ДШС без нарушения репликмиышх функций плазмид, что позволяет использовать их в качестве векторов для изучения других галобактериалышх генов. *

В результате проведения сравнительного анализа выявлена шоокал степень гомологии предполагаемого OeiiKa, кодируемого рьаом, локализованным в промоторном районе опорола , вь. nuioi/tu-л и ко транскрибирующегося'совместно с генами pPliK, с ИШ-свазыващиш) белками ряда MuTauortjpiiux

археОактприй, Получен продуцент сиответствущего

галобактериаяьного бедка и подтверждена спосо^иогть :чггс-белка к комплексообразовягого с промоторннм районом олп|.<<тия рРНК, на основании чего высказана гипотеза о отэ ккч/пет-'м участии в регуляции экспрессии го поп рП(К п реплтсании хромосомы галобактериЯ.

Установлено, что введшие в векторные конструкция плаэмидн pHSBi, являющейся одним из вариантов природной мультикоггайной плазмшш pHSB Halobaotirtum ПОЗ. Нарушает способность вектора к автономной репликации, но позволяет отбирать клетки, в которых произошла интеграция с».п1>ктинных маркеров в галобвктериальную хромосому. Такая конструкция может быть использована для проведения напрщ\ энного сайт-мутагенеза соответствующих хромосомных г?нон рШК галофильной архебактерии.

Часть результатов диссертации была шлуч«нч при сотрудничестве с Институтом генетики и микробиологии (Университет Париж IX, Франция) и Институтом биологической химии Копенгагенского университета (Дания). Практическая ценность. Сконструированные в на* тоэтпП работе эубактериальные - архебактериальные ,таттл-воктертм нлпэмидч используются в настоящее время для внясп'чгнл влияния нуклеотидных замен, инсерций и дэлеций в генах рП!К вь. HatcMum па функционирование рибосомы. Работа открывает возмошость детального изучения структур« и функция локализовании* в промоторном районе последов.чтечмюстеЯ, ответственных за • наследование штзмиднмх конструкция галобактериальннми клетками. Долучешшй оубгпсгертлытЯ продуцент Оелка, кодируемого геном, котранскрчоирумнм с опороном рГШ, может быть использован для разностороннего исследования структуры и роли этого белка в жириодолтельпости галобактериальной клетки.

Разработанные в данной работе подхода к созданию шаттл-векторных конструкций могут бить применены как. инструментальные приемы при изучении организации и мехини^моп

.к, i ;: . .i, ,,iu>. rni!..,¡j и .л¡i/1к v|if:.im.!Mus, '¡ahiu-i

.. .. ; •.....ь »¡.•••ах-- (à*» ».v>i"tbt>i:!i.i3 híi.*.i(i ыи>: i <ш.>ь,

• J.U.¡ ¡i, !■ :3 >.■ r!,'il,Mj;i,!ii, 11-pM< фШ 1Ш tlp*<'>)ci:>ir<p»<>IX ,

r'iiii¡..i''.,u'j4 uuOuiij. ;.'.a;'M¡,HaJ!!J ра.Ъп; 0:jj..i ,u.'k-íkiIiU vi u0,;\.уцинц

í: i ¡- •• : :,,¡ ,?. i..ii¡.>¡4>iintni "IViiaurf « t,.f.>.r.¡4ii.»i клюичрн»"

. , i; им У.-кадна;.! ;.шь ,м v.-iiuh. >;i»y:*i i к» ммюнул^ный г,,: i:.! л-.o.-iic :; .¡(:i.i:.i;.i, i'i'.i, i- ■ [ li,i, r.iw", >; ha 'i../.:.-"^ 'i«i¡«m cmmi!.). »iy:*> ">.'.•'! • Irj' ii., ч ¡••»kvi.-cwtu i Иркутск,

: j'-/.' -, ni. I,i, ¡.»ип-л; ri::,vi,r, j i't- Ii í"A¡ x■ ■ rл-: J'• ■ ^ »!" ,'.;>* , ич Мола/а'ижЛ^'й К. >!i !«>]». hl ШИ fcJJisw. rKb-,, 1 ('!■

jí-ü.-i.i i; K'hiii;.;:. r;\iii,'íni ¡,;:i " t l'.rjj).

Hi;i¡,>)ÍL;j'l:,'jliiliJt) Сй1фс)14г;|Щ((. V '¡ 'Г - ( )Tk[tiT;ijl pclMKH 'I ||.'|.'¡..-N>I!UÍ¿1 ¡ í> 1).;.>;>ч| üliüjjUÜ },:':íi:¡ At, i - UütUM .fertliUll; Tí.» - 'M'»-. I |4>ll ¡Vil j Ci.i - ¡í..),r!¡i;t;,t¡/)i;Mit(j.ii¡ aii - импиц'.1.и.1!,!Н ; лш^', Th.s", <:¡:i'v, A|i" -yiH->?-i,t i Pi'ii К c.»<ïiiu r<.ïi»j'i4';:tii tohU.-tucmm..«-;

т.i¡.o. • 'j'Wííi-i,; Ii::;-, c.i,tv:.i.r«iaB, }<■ 1 i |.>u> mau - ¡ящ. .и/клий.и.

¡«jcip.t»v!¡.:vi Vi, i! 'i.)i. ~ u¡' i!.*,, i|'j];;i i' ont'[;, ata.

Ale; - i,l! ;. .11-,I.-±Í-J [,,'•!!.!:,linl'J,.,>i i U). : J,i > Ц. nui ¡ » Jl t.u : ICTU .

t'U'jJ.'ib-l-AlTi И И ОьОУгДЕНЛИ'.

I. Гл'Л'АЬоТКА IStCTlMi СККнКЦИИ WAIliXWl'MAJITOH ГАЛМИЛЫЮЙ /.РХККАК'Ш'Ш и •<!.■. п.,1.,1 uw; ¡и, OCtMHAHííi'Ü НА ШдШЬйОН&НКИ HV'i'Ali'llK'J'O 0ИЙИ41Л риш.

■. i.ou:;íik ruM'iiiviioi откипи! и r.fwi5.;rna oíimuha рим

r,-i!U;u ними y ni i, - ь.л-; il m и >"ii:ti,i '..ирыгшни oTpyiU ура

'i ¡j.i hll-'í h l'i'.iVri. :1b. .(.tí .1 (1,4 '",',¡,1,11,1 |,i tiltil П.-ОЛ».Ю>1>ЫШ »141 »»Kl'IIJloíV.bl , l: ¡,,;ay'Jlb ¡"l M 'I'll',) f«J.»l Ií,-i|i'b1ji4liaillj T')4KU смрч'а и 'i i-uiiinaiuu', i¡:; n.i,:¡,,'., r»)i !>;:'&. ii¡» ai,к'слнга iys!i.:i»p.::.voii ¡ i Mi." и iu>Tpt«i.!i.|n-'';!pVMw»Cíi ниш r.uiu. Гьни

pllOoilCMlIn* ['[.,{ i; U'.nrl ¡i К il Cl 1:111 ,'>'-: I i i, П ! "il 'i К. <».' • I iij Ii ! I-, | ,1 Цг'у It.,¿i - ?-|s - 'К. Их i [iath'li|,lliiil,l,l nil/.,íIh'.í1,:>i Ii ill. |,i:li rplii.'.M OuMll

"iiHu LuiHX " ii,., -M , i, i|. ,¡i, |>.|.-ii .Mok'-iiiiux и. (»i» i»» '.i ' >..'; lililí, il

0,nli n\i "l.iiy 1 |.i:l,ii'.l',П|ч.!|»>|'(|[1!|, JI>>n<.;,H.)"l>.i!ill •> II i:il'.'!\ :u| m

иявду генптт »вп и рГНК (рпс.1 ). Вягкяияпа гяпптпгп о том.

СГТ hrcp ms рПК г ПК 23S Н1К 5S тПК

гч г? гз PJ pi пе г? г'

>ис.1. Схематическая карта оперона рРШС яaiobict.vrtm hnicbtun' : котранскриОнруппиииися с ним генами. Г1-Р7 и PI - промоторы >-оперонэ; ОРТ hrop - открытая речка трансляции фадаолагвеиого коэкспресснруицягося с р-оияроиои <5влкв.

¡то "внутренний" промотор принимает участие в дополнительной кпрессии листально расположенных reno« оперона рРНК, оддорюгеая сбалансировании^ уровень синтеза 16Я, РЗЗ и 59 ■РНК. Совместно с тенями рРШ транскрибируются два геня ранспорттгх ГНК - алшшговой и серияопой. Первый ид них аходится в спойсере между генами 16S и рРИК, а второй -а геном 5S рРНК. Метлу промоторами Р1 n V2 р-оперона бнарукона открытая рамка трансляции, ОРТ hrtp (о? ИГЛ. halophillo rRíJA oo-Pxpre«Red protein), ТЯ1ше ^транскрибирующаяся с ним и кодируядяя белок, содери^ция II3 ■«шокислстннх остатка. H связи с тем, что р-оперон яь. iiobtun предполагали' использовать при конструировании /бактериальных - галобактеринльных шаттл-плазмид, было эедпрннято болов детальное исследование области мобактериапьной ЛИК, предшествующей премоТорному району тарона pPHJC и самого промоторного района. СоквеПнровэнде того участка позволило построить полную рестргашионную карту сой области, что бнло затем использовано для получения 13нообраэных векторных конструкций.

ПромоторниЯ район оперона рРНК нь. ьоХоыыт По своей 'руктурной организации удивительно похож на спойсирнне района, шделящие тандемно повторяющиеся мнокествешгне onepr»m" рРНК 'кэриот. У эукариот транскрипция гонов рРНК, как правило, шцшруется на нескольких дуплицировашшх спейсерннх юмоторах, которые имеют гомологи» с собственно "генным юмотором" рРШ. При этом гранскриитн, инициировчшне на этих

црлшторах. терминируются парад гшишы промоторы, на которой происходит рьшшциицця -гриаскршщии (Render, 1990). Иолсмиая ситуации, по-Ы1Аимому, роализуатся в в галобактерша. Так, нами ошю показано, что пять иа сома шошшх иримлороа р-oiupoaa lit., taijbtuu. находятся в нро'гякошшх прншх ноаторах (Uaiiitin & Kttgraauiiova. 1'JOii). Получииц таккй предваритилиш лапша о том, что аналогичная букариотичаской Т0}маявц11а/реш1ициация транскршщщ ыонат иыоть масто и и иь.

(Uaukin, Wo). Ojbs тордшащш транскршпоь, нниниироьамшх на шюваотвашпи промоторах онорона р1'Ш, долшю образовываться большое количество коротких фрагыиитоз И1К, которые ь ирашишо могут служить в качоетьа "затраьок" lip« ишшишиш рошшкации и этом районе.

Чрезвычайно иатараошм нредстааллатся локализация ь щюыоторной области одвроиа рРШ иь. па'юьи«^ открытой раьжи трансляции »irop. Анализ «а продиолагасшого белкового продукта доказал. что оц то ет высокую ст аиъиь гоиолагиа о ДШ{-ciwзиьаадими Оелкаым штшогьаша архвбактержа (рве.2).С цблыо взучииия сюасть отого белка OFT la-op била клошрованы о

---- ......1 I.. : Ц ... 1. . I Ми. I Л»

| «rffANiVLUti. J*■ Г*ЛИК-----ч» J: II...I . .

HTbAblLitL.Vt -----ил » "i. 1.1. lit LMJ-l.nf П, m j^n.+ l

■* - • -wi-T.....| ■ UUt**4lh»V[tir iLtlAVaVLlUrlL'iAilrtHi.jSLNkK.Vki.S.uljau

■pJtlftMf il*i.*fc.i:*i.)Vr -----Ы »----1

Рай.г.Срааивща ааднокисдотши тюле Аоьа?б.кьиос»««а

АНК-сеязивакри балкон иатайогеиных »рхабактериЭ в белка, Нодаруеиого ОМ hrop аь. haiotiim. Ззаздочжыы ошзчаш КОЕСврЕОЯШНиа ¿UttiSOSacJIOTU. Ub -KethonobaroHuj ЬагкюгС, UOHTI 55 ~ thitnoear J <tia up. OHTI 55 i Msa _ lie t/югю i/irfi acan^tni i ,

Й4ДОЙ ai Uub - Uothanothrlx аовщенЦ^ бвАОК Ь; Цво -l!»tha»toihri»- «otiijtentt, СвДОК OJ Hh - H«luLoot«riu<» h-ilobtu»i,

В составе фрагмента K001-N00I (822 и.о.)_ галооактариалькоа ДНК в sKcirpoccnoimyit вактор \>Ti- . Полученная в результате

а

отого р^кечбинпнтлая плпзг'пдп, piTPïS, 'ч-тя сиспрпссярпттт я телоткох в.colt В7Й1 .что приголо к суиорпродуктт ««лка, coot-глтетг.угпого по мол, ячсся (около 12 я Л а) продукту, кодируемо »«у OIT tirop (рис.Э).

л;

■Л» Г!

Гас. 3. Эя^ятро^рпгрекия ерт'гряа бэхжоз,. гч'.олзгамх. яз пптеп Я.roll !>!П ,тргпс5<?р-гтрог:-гпг7.11 j-t7 ■ jvï*] (к) я plulyb (0), par.-- !- 3 XCS-JIOÎt П'ЛГ t» бу^рисЯ Лмгдся (T/tr.-'nl 1,

1470). уп в кДА ris

их 0я-¡ton.

Енля прорядега якспорпмонтн по тупего способности Оалта, выделенного ira клеток продуцента, к ксп'.'лкссюбразова-пга о фрагментом галобакторчальноЗ Д15К прспоторноП оСластя р-огорона, посла чего ггроводн-тя анализ продуктов, образупохся пря в-штчодойствки ЛИ я белка методом' элоктроТороза в нодепатур:групчих условиАх. Как следует из электрофореграмгга, представленной на рис.4, в присутствии белка,кодируемого ОРТ hrop и експросснрованного в штамме в. оои. наблюдвотся ааметноа уюньсогате элоктрофоретическоЯ подвиздостА фрагмента

12 3 4

Рпс.4.Элйктрофорвгра1Э1а, полученная Крч разделении фроготнтов ДНК Hooi-ftooi (вга т.п.о. ) г". ' лэ промсгорчого рзЗОН» ЯЬ. hi ichm а

, „. Hiniilll-Xrml (835 т.п.о.) алвк-сга pUQi<j п прз-' : ■ сутствет сутешрного белка ïuîbtok в. eau bi21, ,>0\ трапсформфовашгих плвя.«71доЯ рКПУВ (1, 4) я г» ■ , его отсутствия (2.3).

I '.Ц!

К ■<

i / ': >■)

?

У*) »

nip ■

ГицкО&к.теривльиоЙ ДНК. в то ьромл как иодышюстъ фрашанта р1101У I) контрольном ЗКШарИМоНТа НУ манивтсй. Ото позволяет сдилать вывод о том, что овлковий продукт 01'1' Кгор действительно сносооен к связыванию с нроыоторшм районом р-оиорона и, ьозноазю, пршйыаат участии ь транскрипции гонов рР11К.

Иавьстн )( что хромосомные балки оакторий (Налримор, билик 1Ш оси) могут участвовать ь щчл;оС(зал. регуляции ришшкьции транскрипции. Ъооьма верояпю, что присутствий шла такого Оилка нешсрьдогввшю вблизи уникального ь ганомо яь. ыиоыим оцарона рРНК таити моьвт бить связано с участием атсго белка в регуляции ршишкшцш и транскрипции в галобактариальной

КЛвТКо.

ьг.разрашаиа систеш с&шсции на оснобв цугаитнох'о

оийрона рш£ 1аг1ит Ка1с,Ыиы.

Ь основу разработанной в л^зтопщаи исслидовыш! сисями сзлекцим трансформированных плазмидшш конструкция),ш галобакториильшх клеток била иолошио использовании мутантов яь. ы*1аыит, устойчивих к риооссмнш антибиотикам ьш!иа,ищину, тиострептону и хлорам^ениколу, получашшх и охкрачтсзрпз овинних ршше (Ымю1 & Ьоок; 1 ув?; 1 ува; ЫилЫн & Оаггои, 1991). Причиной устойчивости к этим антибиотикам йвли>л-ся спонтаннш точй'шыо мутации о-♦и1, а ■•►о и а—о в позициях ¿171, 11Ь9 и 20й8, иоответстьашм, в Гана ¿)Ь рРНК единственного а хромосоме! нь. ПиЮЫи*' опорона рРНК. В сьиаи о тем, что такма шентаинна мутации в указанном локуси происходит с довольно высокой частотой ю"в), душ

КОБшюния ьйьктивности селекции трансформантов в качестве иэлвнтивнчго маркера било прадложано использовать оаирои рРНК иь. содзржалий одновромонно две мутации в гена ¿.¡а

рРНК, обосяьчийьмцио резистентность к анизочищшу и тиострыптону , что позволило существенно снизиаь фон спонтанно образувдихся мутантов. Для втого специально бил получен мутант ЬЦ>, УСТОЙЧИВИЙ ОДНОВрбМЪННО к тиострептину ' и

ьиизоювдлу. Клогки дикого штамма кь. птиЫиы Н1,

Ю

[увствитольнно к дяПстрию этих антиОиотикоп, внпавяди' на чпают ;о средой (Cline at.al.,1989). содержащей 5-10 [кг/мл аниэогадана. Полученные поело инкубации п тпчппиа 10-1Я

м R

:н«й Ani колонии переносили на чашки, содврждаа укв бп антибиотика, анизомишш и тиострептон, Ft концентрации Ь-Ю 3-5 мкг/мл, соотв9тсгвон1ю. АпЛвр11 колоши! образовывались' эрез недолю поело инкубации при 37°с. Скорость росте обученного таким образом "двойного" мутанта соответствовала короста роста исходного штамма н. haaobium ш в елдутствии нтибиотиков. Наличие соответствующих нуклеотишшх замен и озициях 1159 и 2 471 233 pFHK (рис.5) было подтверждено путем

'/Од, '

л "'в г

TbpR V^vA**?

■

i-IJ

i

к k

"u

v

"7

•"0g6oaaoco

• I • I I I •

,ucu. uto

A

/

VI r'AC.'/ouc*a':(3 n- i 11111 i

a„|b да,,mono

t

А e'xV^Xa 0 . U0'/'

и '

—t-S

5 u

- Si

С I.'

i-l '

A - J

AKCC U0CI.C3U К I'll I I I I I I • >)„ „It I иОООдДСОГ|Г.СО A A

0-2

C.5. ФрВГ"9нты 233 рРЩ мутанта НЬ. haloblun тсило, держащие а 'леотидныч эвиенн, оЛгспечивяшиа устойчивость я острептоН)" и ашземидану. Сплошной чертой отиачеки следоватальности, от ' комплеиентврнлт К котором игонуклеотидных праймеров проводили ссквениросание J3S pFHK.

¿í i "

„0;:'.ii«': iíví; ;..,ií)Ti)!inJi. i'tü..

К

.'JÀJ Лс-i:

.1 i-

.VÎII. -

iif

! ¿ : L..,

il^bti:,.

iSj-ïi^ïl-J. . Oü.jl. !,'. í.!/ - r. i ..-Ы •

;.ttl> .:.('. al!^.Llí U'.'. IjtLüilnl., ¡U. jijSôi..^ .и i: ■ i'-tiii-.b pí'iiíi H :¡íj.

!:..'.:.'-i.Li'.y i;!,:, С 1 U:: bblU. -."Л-) и ü ); t.ü.Л.<'■;., J ОГО,

¡4vííÍ. ..: ..h l^i ii ^ 1-

uvCJU. ц «u'iилт-.ч;i ú, iMurtaiAúyj íipu.'Ji up.-uK i» ;jp;,iJi¡:.iOjjíi]iüb:.

ptw..íu(, b lí-iairtíuato liloalll Iígll

|!CJ;.Í >|» hi il 7.U.O., ClktiSJi'MJi) ДИК Uï'i'tüilLi UV Uloblu

itlMUö rüMivjttbMLitM yKuMHUuiiiü Mil.» peCtyiUriiSKUt, íЦ/ííUIJíÉ.J 'lu j.cbiicjui'.ii JJ.V ;.'i¡AKÍi¡jAJó'.;rj и ьц'цоайси I'UJIJ И 1,].аызнт

¡laJf.vjjXal Hi I.í I.¡¡.O, JiarupoLiLuiS С илиьиМмЬ Vbíi.ítt! В. colt

гйцрилиз«еыг.»йй «Дал ill и BuUli. 1Ы1уч«аау

акодлотоку UJ;.j¡ivj!, cKpHiUi'íMiuuiú гко^вдиаецииа с 'Щ'-.ичмтз jd'liK Hb. к Jia;¡,i4iid и отиОрышиг клинал juiads-sí, сод,;

i.t'44iU дыри» рГШ'.. lUA'ibuiwtwßi путем {мсгрикциошюго laiaJü'.L и гйсрлдиалиы но Сауавриу íi,i»utt.<im, 1975). В ра^ультм проьидьий« a ru/, юшю шшлшриих шшрициа ошю получи pii.o:aöcii<uiiutui шкишда ¡лии, содлрхыцая едтшишй окьгкш рЬ lit. лай.t.ни. С tíí'u oôJ(uuïHaa и карьеры

yoivj4ü¿.jo't't к TfcocrpôHi-oay и ш^зо.мтциц' - к час" tiDOto^ojjttTt íJLh.jciи ршигг ({шо. 6).

>.-', („1 . J2Í

/V

(■

Y:,

\

С-) и

U.S Т. 1..

С*е»кл",вчам1ея кьр

ШШШОДЛ VÜR2. Укеамш CiCftl К

uapoi^i^i, x'tixi

pPlÜi к aysíMOKWiixi stiibii) I'D uí¡ ¿3¡3 pKEl.

A-!6

írj®

... , .. .. ,. • ; ->; гг'!"'. . ■ ■ ■ , ■

ГС "Г" с: ."-"Л" г',!""!1 ."'!' . : •..•гг.чу

: г; '""лТ"': ■ ." - : - • ' •

?3>; "'-■-~.Г>Г) Г.1 п; , . - ■ ; у.

'рлтэсс'.л ^¡тл: -с™ соу"...... •• -V ■• г'.;: . ■ ■ •

-Лу'УПЯГ. V V?' у......................г-,-^; ■ п о;;,-,!: - •

Т'ЧЮСртЛ" • Г"ГО~.» ' .'Гч ^(¡а: М:- • ■!

.'"'ОГГТ'.-У'. V" ; 1 1, ' >■'•. ' ¡:. ' •

>скоз&г;г таго г,тс1'с л.-,'?-"::1!". г^1;, г1 г;4-.....: ' г--;'-

фэтгстч- - ? (около <1 г,п.о.: уч?<;то« - •. " сткугт *.' 1-спэрсп •, тис"; копт! соя;{~тгь «оодадотт».':'':: •• . «кк,ос>ч:> пттягптрсл ¡ть по автоиссгуя ¡."-"г-т-кют п ст-.-чт• з гэлобактерчаадш. вгоиспп. Тем пе |«>яеэ. в«м лрлстпнглжкя. Кипсообрчгныч, парад' с рцясцплн»п статуса лмкпял! зЯЛ2, создать на ее. основе кснструктоп, ^эр^гля сол*>р»этуг гарвдо легаша галобвптеряялытиа репликатор, с 'эюЗ ноль а Зало предпринято попеквв неболыпк мул>тгтетгпп!гх трярешшх плазгтд трех родственных пта'лчов - гл1о? евз

Та1оЬао«аг(ия СИВ П ЯаХаЪаагегОт СЯ101.

И.ХАРАКШГтКД ОТЛЬШСИЗЙШ ПЯАГ.ЯД КЗ ГАЯОВМИМЯАЛШЯ

№!"?03 БВЗ. 0ЯЮ1 И ОРВ. 1Те<5олышв но размеру мультвкопяйян'? плаягалы галсбактпркЯ трэдставляотся очень привдекателышми в качестве нотетталыт 1адвдптов в репликатор* ганобакторкммшх яемертнх систем, 'ч доследовали мультакоргВннэ таятт размэроч около ' ,7

сфтсас.

ACACGTGCCÍIATGGCAAAACGGCACGGGATGGAACTGCGCGATGAACTGACGTTCGACAC

¡'¡•cccaccraccag/.rTrCCATCATrCGAAUAG'í'GTGTGATTTCCATGGAGXGTAGCCACC 6 'igaaccggggtcgcücl-,TGTrACCCTTGACGCGAÚGAGGATTTGACCGTCAATTGACGGC 12 1aaa atttgacgcgctaa.AGCTTGCXAATCGTAGCAGGT ACTGAI'XT fTGACATAAATGC 18 U'AATCACCGACCAATAAC'JGTCAACCACGÜCAGAACGACl'AAGAACCCGGGGACACGACG 2 4 GfGGAGCAACAGGrACGCAACGTGACTGAGTGCCCCGGAGAAGGCCGGGGGCACAACCGA 3 0 GTGCGGTCGX'TGGCTCGACCACACCGGAAAGGAACrGTGACCCGGTTCCGTGCCTCCCCC 3 6 ttc1gcgtccg fcacaAU'cag ITTAACGCTCCCTGTGACGGCAGGTTGGTCTTCCCCTrG 4 2 CGAAAGCCCGTOAGCGCCGCATACGCGOCÜCTCACCGGAACGTGGAGGTGGGTGGGGAGT 4 8 TCTCGGAGGTGTTCTGGCCGCCCCCCGGCGGGGGGCGGTAATCGTGTGCGGGGGGGTGGC 54 GGTCGTGAGTAAGACGCCGACAAAACTGGGTGAGTCGGCCGACCGGCCTGCAAATTCGGG 6 С CÜG'ÍTCTCGaCAGCC'JTTCAGTAACCGTGCAGGCCCGGAGAACGACGGCCTTAGCGCCTC 6t

72

76 84 9C 9í 102 10£ 114 12C 12Í

i з;

13t 144 15 С 15t 16;

GAGCCGCGCCGTGAAGGCCGTGACG1 GGGACGAGGGCAl'CGACCGCTTCCAGAGCTGGTA CGACGACCAGCGCGGAACCCAGATCGTCGTCGAGAACGAGCTGGGCGAGACGGTCGGCTT CGAGACGCCGAACCGCTTCACCCCGGAGTACCGCGAGATGCTGTATGCGAAGGCGCAGAG CCTCGAACGCGGCCTTCGAGAGCGGTGGGGGAAGCTCCTGCACACGTCGATGG l'GACGCT CGCGGCGTCCTCGACCGACGAGGACGGCCGCCCACGCCCACCGCTCGAACACCTCGAAGA CCTGCTATCGTCGTGGGAGGCCGTCAGGCGCGCGCTGTACCGAGTTCTGGACGGCCGAGA GTGGGAGTACCTCGCCATCC.TCGAACCGCACGAGAGCGGGTACGTACACATCCACCTCGG CÜTGTTCGTGAAGGGGCCGGTCGTCGCGGAGCAGCTCCAGCCGÜTACTGGACGCGCACCT CGACAACIGCCCGACAGCGGGCCAGGACGCTCACCAGATACTCGATGAGGACGGCGACCA GGACGCGGTGCGGGTGCGTCGGTCGTCGCACCCGTCGCGCAGCGGCGGCGTCGAGAACCT CGGTGCGXACCTCGCGGCGrACATGGCGGGTGAGTACGGCGCl'GAACCGGGCGAGATGCC GGCTCACGTCCGTCCGTTC'rACGCGACGATGTGGGCGAG I'GGGCGGCAGTGGTTCCGÍCC GAGCAACGGCGCACAGGAGTTGATGCAGCCGGACAGCGACGACGAGGAGGAGAGCGTCGA GGAüTGGGAGA'I'GGTAGGCATCGCGCCGGñCGGCGACCTCGGGGACGTCG'lGGAGGTAGA TGCAGAAGCGCCGGGGCGGCGTCTGTACAGGGAACTGCGAACGCCGCC ACCGGGTGGGTA a|»ACGCTCAGACGGCGGTCTGCCTTCCCACGGAGGTGGGTTCGAAGAAGTGGGTCGGAGA l£t GCGGAGGCGATGAGACTGCTGTCGGTGrGCCACAGCCTGl'TGAGArATAGATGAG'r 17;

Fue. 7. А. Полная кукльоткдщя послидоамблыюсгь плазиида

ЫТИЫма Halobaot^riu.» £3133. ОТМИЧЬНЫ ОбрЬЩациив IlOtttOpu к обведьна открытая рамка трансляции.

Ы

вТС(?ЛССТЙССА<5АТТТС<?ОЛТАТТСТАЛС!Л«Т<гТбТЯЛТПСОЛТ'3<:Я':Таз!»С'.т»сС «о

TOA^cт'5(;GOTI:ßC(îTO^aт^oпг.Gтr(•.AC!^тлRгt«c?;»тттl•.A(•Rri•I^•.^.^ттGC^^'.5^c s i">

Талтатттяаталостатас'-сяо':-!лдт(•<;гл<^глпс.тл':"!";,.тгтст,:\г,'»т''.1''- -s.?«, i»« CCA лтяАТ'5езАосААТАстпсгтс;гА'"'':'"'.,лсллстлАТЛЛггг1;с:лтл(Тст':ААТ(;лг;';';

тсслетАдсАпстлсасллмтяллпаптассссотлялАО'^сггс-гпяедг aaccî=;A* ?ГТ

0Gcccc<JTACCCcc'3cccT<5<,AAcc>4.';e.4AACGAÄccAccTr^ci'ic';'Tin,nrA':Tr'! з«->

ОСССТТСТТСЯТССбТССЯСТТАСЧТГЛЧ ГССС0АССЗГ'.: АП N C'IGC rrtQTATAl •îTGCC i je

ccacsgtccctctcacgßgccecaacarfodoragocgcrromclfrccr.trtctcircra'jc «*г

ATCCCCCCAOTCAAGGGATCCGTeAAAGCCaS'JAACGGGCC-'JC-nrA'IcßGrco'SrArtrco Sil

OOAACACAOCCCSCAACGCS'ÎCCOTCCTCejTTCCCGaAACG'îACGGGTTfC'îÇTGAGCAC «м

ACCTAATCACCCOCQTGAACCOCCCOACCGGCCTGCCAACÎC'JOOCOCl ГСТГ<}«С»АСС в «O

TTrGAATAACCGTGCAGGCCCOGAOAACGACAGCCTCA'îfOCCTCACAC'îrtîCC'^T-RC >!<!

GAAACGAGACGGGATGAAACTGrGeGA1GAACTGACCTTCGA?ACG*GCCGGGrC'-.T''A* 7 ГО

GGCGGTGTCCTGGGGGGAÇSGCCA'rCGACCCÎCTTCCAGAGcnGTACGACOACC^'îr.'CrnG П10

AACCCAGATCCTCGTCGAGAACC¡AGCTGGf3C'GAGACC(»rGfíGrTTTGArATGCC'»A*fcCCG »00

CTTCACGCCGGAGTACCCCOG.MGCTGTACGCG.VAGr-CCCTVGAGCCTrGA.'iCGr.oOCOr 4 50

TCGGGAGCCGTGGeirGAGCCrtCTCCACAC5'!CGATG'3TGACTCTCACG';C')TC';AGr\!: m?0

eGACRACOAGGGACßSCTCJCGGCCTCCGCT'JGAACACTTCGAeOACCTGCrGOAiilCGTC ЮЯО

GGAGGCTGTTAGGCGSGCGCTGGCGCGAOTrrrGGAGGG'i AGAG.V'.T ¡'¡ЗАПТАГГТ'-ОГ П«"

CATCCATGAACCOCACGACAOCGGíTACGTACACATCCATCTTOftr. TirTTTGICAOC-GG \J«o

GCCGGTGGTCGCCGAGCAGTTCGAGCCGGIOCTGGACGCGCACC'rcCGíAACTG'.'CCGAC J?n«5

GGCGGGCGAGGACGCCCATGAGGTGTTCGACGAGAACGOCGACGMïGACGCGGTGAC.'VOT n?o

TCGGCGCTCGTCGCACCCGTCGCGCAGCGGTGGCGTCGAGAACCTCGGCGCGTACO fGG<~ 1 lee

ggcgtacatggccggcgagtacggctcagagccctctgagatgcctgagaacgtocotgc hc; attcxacgcgacgatgtgggcgagtogtcggcagtggttccgtgtoagcaacgocgcaca 1 v>0 ggagctgatgcaaccggaggaggacgacgagggcgacagcatcgaggactgogagatggt j««0

GGGCATCGCGCCGGAGGGGGATCrCGGGGAC.ATCATCG^GGTGGACCCGrCGG.agcc'cg 1 ? j л GAGCGACCCGTACAGGAGGTTGCGAACGCrGCCACCGGGTGGT'rAí^ACGCrCAGACGGC aGTCTCGCCTTaccCACGGAGTGGGTTGAAGAAGTC.G0TCGTACAGCGC,.\I,GC'"-AT'.4.AGA 5-7te OCOATflTAOOTOAQCTACAGCAGATTOGGATGTCGATGAGT m i

Fue. 7. В. Полная irnmeoT!угнал последовательность пля.-пм.гц pü;'p.

штоммп ïïaJabnatertun SíO. Отшчеви оСрвиенлич поптерч я обведена открытая pwRs грвнепдцда?.

¡hJí¡,;)bu:il'.Lii галобы Л'ирииЛьНиХ ШТЬМмов Ü11J. 0 HB И г.ин'.1, is/oiu.'i'iihjitiimijx L X ¡ i JK j o u¡i4' ti 11 im JU. i h j "X клотках в колнчаство Ц-J M.ÍH! iv.'ili'.il nú Г(.ци«д l! M0M4UX U0*Wf собой ДОЬОЛЬНО bücojtyw Г..'.! i 11..I'll..! i. !:twi..;l I с. t ul . , 1 УМУ > .

¡ииро.'то нами Сила Woy-luaa llJlaUfcUwa штамма tiiiot.^.hiiwii ог.Ч, 1.1ШБ- ЬШ:0 уС'пПкшЛЬКи.ЧТО ПоауднКМй 8 ТОЙ плммии ч i «. i kjîoïkô гетч[юги1ша, то есть

IIJ4»«Jla!.-.Jil« «laV<J<UI l-UlJm'.iy.n. fiiS«U4!IM»tXl!rt моиду СООСВ как длин >Й. >яь il in'bJ:-o'jj),mio2 iKii:jhj;;.JtkiTo.:;biioo¡т.л. При атиы оыло OOUhpJV.Jh';, au: tíiyiV КОС tu Дао Tillin l-trtop.H'uUHOCTU, KOTupUo UU wa.>»:-j.':n MuUj».'»- ¡I KUnfOi'u lupuívitiu-JTL»).

Mm-.J'oi'uтрогштооть liuiij-Jiiii'.iiii галопаь.туриалышх плазмнд ci;на bi!v>|;ji;.> -ia.'.!u4jHd i:a уровни рчотринциошиго анализа. l'iUi|bU,.ij ¡.j.u.i;bii(; i-Ilüs j4j«T¡.iui:t¿j;<a íiuu.U приводил к luiihjiuiuuu ЛИМойИчй it»»j.:iu одаого из ooHüaHUX lmutMuKiuib Bhpvuuu\.a (i-НЗЫ , 1,7 ч . i !. о. ) в то b'.ui.i,! как друюа вариант (i.Hsb3) р«|.!ци|ишлса i>ictí puorpiuí'iíío-K на ipil ^раи.юнта, суша длин

KOlOOliÄ TöiifcJ COO'ií«0Jí)Uí':í ОКиЛО I ,7 T.И.о. lioOTHOlliöiilld НЛаЗМИД

j'iutil и (hu;h¿ , суд»» íj'J ¡uitoujHhiiocT.i соигьи-ссгьуикри зон пчела нГарсзнчто i-иян атиднй.Цюм'нлом, panno 2,î> : i. Цианины j.ip>ai в сила клошфкыыш ne, уникальному в lu

иосДЛАчИЦ 1ЫМК»ЛК Сайту poOïpnKTii.-.U Ûatl а ЬиНТор jiU«t& il №kbsiutp»bhtiU. ПОЛуЧгЛШВЬ 1!,)Ц blou (4>.<yjUTbiU ИОД'ГЬирДЙЛЯ AuWiJù Cl tUIU!..lJU (рис./ );■ illicib.MilUa I.ilLïbl

ÍWAopeiJV Oi,llH Cî»a-i раСцоЦЛоипЯ риОГрИКТНооЗ $3uu'M U ItUuüT длину i/'ic п.и., a ).ttt¿U¿ иыииí три сайта • ршдошмим р»вг|.шлч....-а óía.ua ¿i длину iva i и.о. ií pui'.'ítj ч\ло, a' la аиаамиди раздичикпт.и и»<:ду собой imOojiuiumii вставками п даЛоцинмм, СиСроДОТОЧиНиь;.!.!, а ОСНОВНОМ, в райо.ю ОТ ООО ДО iiu fu ИУКЛоОТИЦЦ (U СООТВЕТСТВИИ С НуиираЦйОЙ i.HHlil). Однако. HocMorpiï ¡¡а вти раолпчпн, ctuUuijl at гомологии (около вШ) йчииь ысола, о чом свцдоталъстьуот д-Jt матрица сравнония нуюуотидиих иосладоватслыкютай (рис. .в). Наи^олвв

KOHO»piihTUßJKiä Частью ПЛаЗМИД HBJÍUL44.J1 lij*>TiUkúHUa,i открыта« рамка трансляции, нодирушан ou док длиной в л 6 CMiiHOitiicjioTHiiX остатков и иачинащапон h позиции 671 ([.Нзв! )

HJU1 и ПОЗИЦИИ Vlá (¡¡H3HJ). V'lHTOpuCHO, ЧГО из ну нуклйотнцаих

la

яамяц, И№>НКПГ.СЯ 14 PKI* ''Я', Ç - Rf.'"!4 ntn ЧЧ1'!ИЧ»«Л'И,

а 15 - коисорчятныги'.м

» .

.'О

Гнс.«. Лет П.чтрчцр иркмтппмя

1V>> ||у!<Л00'ГЧ.Г,И)Л* ПСС.""!ч;Г"П ••■ 'V Ч'-.'-Го^

нлйэкид vtmiu •• if:."!;:'.

Н .о ,

(ТО ОСТЬ Приходят К 0ЯМ.Л!ПМ Апр ЧЦ", I.yti -AVK, Y-»l •• t W>». î)TO говорит Б ИОЛЬРу TOPO, 'ПО H Iipciw-'OH JH-T'/pi РПЦЧП 1' "'V-.MlVi'l рНЯВ отбор Ш!<1Я»ИДНИХ В!ЦЧ'ЧНТОН лрлисхилвч 1П 0n»(.wwP0 равного для плчзгидч .та. Преди-н/п «ч-лй *>irw, г«н которого тиигпаот 5'М плч-шлиой луююлтндяоЯ ше.тедоют«лмгосги, с!со[.«?е »c«ro, ifr'i'flmwiv ;r::i рпчпФтг! илагмид и/или подвгркяяия л* 0.,я)«,'я.п.<1>!к,й K'»'ï:îijicip в

гплобактвриальноЯ клотке. В пользу этого яде гон^р-дт

то, что ЯНК гапобйктвряплыя« ¡'"г^.'.моя, в wreopiix стгутгтпупг ЭТИ нульпшоиипянч ПЛЙ5У1Ш1, Й1> 00№»РУКЯ1»ПГТ С1»<я» R>- »И<*.у."Ь зямнтнай гомологии с иуклчотядпым:! П'>сл(.,л,!1»л»л*-Н')стл?«п

гтзэдд Ublolfott al., V34J).

Фонт, что плпэмиччио papïiwmi piiSBt ч »•»«w били сбнпрудонч ними в клзт кик. получении* но г»чл»рилуплмт колония, свидетельствует о том, что, по iiсой кр-чт'оспт, ^ти плдоодо сосупюотаукт р кр^дилпх онн'>Й кл'пг,-, Тчкян образом, несмотря ни ш*ску» степей»» геи? nern« '.¡«ркзчтп структур, р!;гш и рНОК» ярлистся лзСо (•.-.вместт.:';'. либо ia согрегшщя конкурируй? с пр-г^ссми, ¡г. чу »г ^р.-'по'ь-и

COCyPt^CTrOPSHW обои* ПЛЖЧМЯПНА Кнрудчт» (m.!!p.!W-»J\ п

культуре Ю'тх.ч ичм-ет кссто оСмг-н ил»»?мия'и.ч1).

Fi результат,-' П!х:вс.Ц";!;'я скгиншча '.тллг-чзд ;:<r-:'.'"<i гуai)jiè>}a!ux va 0- >гл;"пго часяч i'.x:v:' .'"уитпик клино*». япч но удчлось оОнасуяп'ь роксиС.Ч! 1.т;чп.1'? г^п'-;:"; гч-щ

„1-ШВ

¡у» |rWj К.«)

ú ¡aat^:. bouwuiuij, J l u сьлзодй с 1шуото£чиьостьЪ OûOïboî'ùïbyu-ЩИ I 1ИС[ШД0Ь.

l'uïujioI'omiuiiTL илазцзд jiiiyb Uu ОГрЫШЧйВаатса

cyinucïaoaaaur.ji.1 bupiiaaivt) pílSín и i>Uat!¿. llj/11 poCTpUrauJüluiai! ааиллаи иоллаышн рекйыйшиан'шх им&ашд lUUiftl/pUül*

ttJll'jJlLUObalUJoM püCTptlKTtlJ l'ttql il tíaiJ I , 14MùiÙK>lï UilüÜJо 1 bulUiUc üuü'iiJ pucutuliluliila i I ( 11 ¿ü. COüTbui'CTBolüiu) OULD OÖUilpyxiuH Другой тиа ьарпайадаииати иаршча.'З структуры, tí то ьриыа, как щи-апории Uci tn-iix рокиг.Юилшмтшх плазиид раищышиыиь по ьсои сайтам, ь других но происходило расщйидвына но сайту Tuiji ц иаа^Цйи л;, и/или по сайту üojil ь позшши 3-13. Этот цала:.м[«1и1аь4 poCTpiUauwiuiui сайтов шз льлиэт'ся льтат^и icjiuuiijiotjuinin ь ciiüToMt) ti. un ti, поскольку оиньаццройшша асиаиало, 4i»j а укааьшшх виши иииицилх ноизториа ьармаиш илаакшды iiit-ni uuuwr зошни т »-и в о-И! .что приводит к утрате uuOTtiuTCTbyniuu сайтом риотрцкидш.

Слодуиг ашитить, что аналогичная гатирогишюст! шшудгции ьйОиДШШ иультиноии&шх идиамйд оьойстьиииа hu тидыи> uiT¿.¡vtay вьч. Готбрслашюать TuiùdX алазшд ми оомаруюш! ш;«и> ь диух других (»одстъашщх галобыл-ириалыш! ытш^ах -

lial^tujUrlij,. (IHtí и liuljLaü itriua iltílOl.

lulMMiäti оосущастьаьышн отель близких минду coöoü шаишщ в ujyuû иле гко иилаотсп униколыил. u m ндооотии на .для одной ли да йлж тор иаучошшх ауошторйалышх шшзмид. 1Ь изиасты так»), *iiptuiTopna ла гихороганшить дли больших r¿UMObUU)plí:u)lí.HUX lUajMil.Ü И ЫоЪиТ ли она нозискагь 11 популяции •попучиииих иикусспмшю ьакторнии илизаид, исиольауашх для Tpuiiatfopiiuunb гилобактарИИ. Ьоймошэ, &'fü ньлании свлзаао о иьличшц itai.nv то ииооичш» оьойств у ноОилших мультиканншшх ишамвд. jailvt ana отраишвт наше остов чарти гмымшского ьшшрата га.'.оОиктирма ь целом.

Цназмидь pltaBi била iiuiípaiia uawj для исиолыЬиьаиин ь w-íuuTUij ри.ишштора при конструираьашш syüaitTopiiíuii.horo -ГЫЛОвйКТорИаЛиЮГО ИШТТЛ-ЬоКТорЬ.

i i i. lUioiuü-oiuiiiiK гицащди i.ibüi ь IIMMM»1 цикк. и кцаастио гилооактариаяиюго ршшшатори ha диух

Iii

основных вариантов мультикопийной плазмидн штрамя

Balabaoterlim SB3 бЫЛП ВИбрПНа ШШЗМИПа pHSBl , поскольку 80

количество в галобактериалышх клетках в 2,5 разя провшпяет количество плазмиды рнввг, что позволяло рассчитывать на достаточно эфХективпую репликация и содержащей ее рекомбинаятной плазмиды. Источником галобактериальной плазмиды послужила одна из рекомбинантннх плазмид полученной нами библиотеки, содержащей штзмиду рНЗВ1, клонированную в полноразмерной форме в воктор puci9 к. оои по сайту рестриктазы Hin diu. Линеаризация плазмиды pHSBl по этому, уникальному в ев последовательности, сайту не нврутаает колируемую ею ОРТ, белковый продукт которой, как ин полагали, может быть важен для репликации и поддержания плазмидн pHSBl я ве производных в галобпктериальной клетке. Последовательность плазкидн pHSBl из рекснбилантноЯ плазмиды piiSBi/piJCig блла Клонирована в уникальный в pHRZ сайт рестриктазы HindiXI. В . Полученной в результате клонирования конструкции направление транскрипции ОРТ, содержащейся в pHSBl, и ошрона pFHK совпадали. Эта конструкция, pllRZH (рис.9), характеризуется наличием трех основных структурных участков: я) Фрагментом Геномной ЛШ Halobaaterlun На1оЫит, СОДАржШПИЧ (ТОЛННЙ ОПераН pFHK с флапкирущиш его участками и мутациями А—G и 0--Т в йозиштях 1159 и 2471 гена 233 рРНК; б) фрагментом плазмиды рВП322, обесшчлваотим репликацию в клетках л. оон и солеюиго соответствующих трансформннтов по устойчивости к пмшщилляну к в) нуклеотидяой последовательности галобактериальной плазыядя pHSBl ИЗ Hotobaotertusn SB3.

Рвс.Э. схематическая ¡г»р»а шмзяяян .pHRZH. Указяпи сайт клотафоввкил! отолчена последовательности плазнид PBR322, pHSBl, гены р-опэрояй ЯЬ. halobtun п пукдзотядгаэ зеагакы в тт язв рИИ.

ív.muoauiwanHji ixiutiu« шиэщдши

pHHZ И püflZH.

i ¡)í..iiC¡¡i.<pU;:).ilrj илитчн iiulubuJtertим (ul.vLIi« ПЛайМИаг.Ш

jннг и рнкгн пр. до дом по стандартной м»тодикв (оline i¡ l'ooimin, 1W«, знкли í:imhuí!<jií h получении сДОраилаитсю и обработке -,u üi.Lortüiii'.',! jfUtet а присутствии иоли&тшшнгликоля. Салаыиш •»•piúictt^j'.wíirt-foa осуодвсть'ЛА»» путам последовательного иисован.ш vptiiic.'l^i.Miij'oümaöiK клеток на чашки, содержащие мшзоупщш, o'jooj-i колоний, щнсоиыиш их и* чащи,

сод&ркыцие однйьр|,т4-!лна о Г; а антибиотика - ытаом'.'.цин в тпострептсн. Кондлн'ра!'«« ашибиотиков в срадах составляла 6-10 U 3-6 UKtVWJi, OOO'IiwíCTbbhliO, bí"l*)KTUIiHÜCTb Трансформации - lu'^-IO'1 тры1«Н>иа>|ГОй на i мкг яхаог&шюП ДНК. Ь результата

Р к

проведения агн i ow.pusia Оигм полу чины ¿ai тпз колонии. Ич м колонии 4jiljri.ir;(;::uiJ иродсгшмыдя ийОсЯ истинные трансформации, пьскои.ку но о^разисшилпсь в отсутствии ДНК илаамцд vuiiz и ¡.¡ü^i;. píúí из трннсодхлирсьатшх клеток секпиодрсиаод и при ачш и 2 ja рН'К били обнаружена нуклоотйлпие ааманы, иочтьетстнуище мутадаям, введенным в ее ЮшэмнАкиЯ гаи, Tpaiiut'-Jj■;.ишги, г.олучашшо при испольаовынм и той, и другой плагин:;:.;, подвергали анализу.

Гозудьтат кр»лнцд14сяьнс:ч> анокваа по Оауаорну (Quuthani, W5) суммарной Д>'.,< AiiiSae'1 кл< нов,' полученных rip.i ipwnsjopaauw клан»; ьь. к.ачЬ{и>, ы плаочидами ринг и ¡iIIkzíí i:..ifíi:¡(.:( на piic. Hl i. !!j b'liu Даниил следует, что нлазмиди pUHZ и р11й2Н ьодт сив» в j'öjk .бактериальных к.шткаг Но-р>и;'ЛЫ.-.у. ■ nd¡.ü.j,..f.£i рНН/.Н утрачивается клеткам, трШ11>1«чриа.чю>», поскольку в iv^ipojuioaítu их ДНК отсуутсвум гизрадеэумюосй о шчоншш аоидом зон ¡i, соотвотствумцка ато( плышшу, плазмши а.к pl¡H2, нащютиа, вероятно, имеется i КЛ1ТКЙХ ГршЮфи^аИГОВ В аВТиКОМИОЙ .{»JpMd, посьильку, номим. фрах-иоиуаа, со^тиьтствуадих р-олерчну хромосомной JÜU (риО. К) Б), иололктелышй сигнал гибридизации диет фрагменты размер которых соответствует размеру фрагментов, образу нцме. При rn.np-ojL.ije плызмиди í'ilHZ. (рис. 10 Ь).

¿о

A Mriní7it, ii:tt

■ ; i¿ it$ » M <v»

fib-

X л*

v ')* к, '

b.v-:»

4.í3-f,í4<M —

В

___j I_____твжтяаь.. ич<««в11«!МД! M _ ¡f—

! ________ r? - ----- I - í.y

К Е Я

Flic .10. А, Анализ no С«узеу»г/ суммарной ЦНК riohoïi,

тр8нС'К>рммровяшп)х илагаддага ;iim",H (I), pHHZ (2) n

ршвютшггного птыша Vjlo'ii-n. l'es проби пуро'изовчлк

ростриктйРоЧ Fco Til. Sí - мар:м;)1>ме ¡ípani'-irru Д11К, il качоэткч

i?

гяОрядиз?тюнпого зонда вспользопялл Р-нэчштуи jumswvty

;:!IHZ.

В и В - схема росв'.анлтшя рвстрккть-'сй К^с> г" ipcuoccwi'oro onepona pHfit шь. hntnu'.i.-r, и пл-чзкте* ринг,, соотеитстьепио. Прнведош pesvepu ¿'рятонтоо ,;¿fú в т.п.о.

IV. 1 .АНАЛИЗ ТРЛиСФиИШГГОВ, ПОЛУЧШШ ПРИ шюльзовшш

шизшди рНКХН.

Вил проьодон детальный анализ ДНК, выделенной из ряда полученных АпЛпин траноформантов гибридизацией по Саузерну. Дяя этого суммарную ДНК из трансформированных и исходных (реципиинтных.) клеток, гидролизовалм рядом различных реетрилтаз, гидролизаты фракционировали электрофорезом в агарозноы геле и гибридизовали с гомогенно мочонной ДНК плазмидц рнкг. Как следует из радиоавтографа, приведенного-на рис.11, набор гибридизущихся зон в гидролизатах не трансформированных клеток и тЛпь" трансформантов абсолютна идентичен в случае всех, •использованных нами рестриктаз. Этот результат свидетельствует о том, что:

a) плаэмида рШШ как автономно ре олициру щ&я с я единица отсутствует в трансформированных гаюбактериальных клетках:

0} трансформированные хпАпа11 галобактериальше клетки «одержат, как и реципиентные клетки, лишь одну копию оперона рРНК в геноме, который однако приобрел мутации, обеспечивающие устойчивость к соответствуйте антибиотикам;

b) в процессе трансформации не происходит интеграции в хромосому нь. на1оЫшв нуклеотидной последовательности ни илазмиды рВН322, 1Ш 1)НЗВ1. (Это било такке подтверждено в независимых. экспериментах но дот-гибридизации АпЛьв" колоний, полученных в результате трансформации, с ^Р-мбчвщшм» альзмидьми рвнзгг и р1ШВ1, давших отрицательные результаты.)

На основании атого был сделан ьиьод, что при трансформации клеток нь. па(оЫш» шшзмидой рШ'Ш мутации, Обесшчиваюише резистентность гапоОактериальти. клеток к внизомицину и тиострептону, по-видимому, переносятся из . олазмиды и 1[оыосошшЙ оперой, а сама илазмида рннш при атом утрачивается. Таким образом, трансформация Ап1вМшв штамма аь. Ги*\иЫип ш в хпАио1* мутант- яалиетси результатом рекомбинациошшх процессов, происходящих между шшзмидной и »роыосомюй Д1И.

Нуклеотиднне замены, ответственный аа резистентность клеток

к енизомацину и тнострептону, находятся а гене на рИШ на

»»»> »•< »•» »••*!

• i

к •

Рис. II. Анализ ii«j йвуйврну cjrkj мерной ДНК рецитшитвого (Р) и трансформированного (í> luaawi ДОЯ pHRZH ЯТЬШИ НЬ. Пл1сЬ(ит. Указини положение иа эдактрофо-рвгридо и размер (т.а.о.) и»р-керши фрагментов ДНК.

X

i.r

№

i

1.1

расстоянии 1312 п.о. Для того, чтобы выяснить, действительно ли весь участок онерона, расположенного на штзмдде я имение го нуклвотидные замены в позициях 1159 и 2471 . переносится из одазшщы в хромосому, ми использовала в качестве реципиент и для трансформации штзмидой pHRZH 0шй мутант нь. ьыоыч* RUO (Hankin i Oarrett, 1991). Устойчивость этого мутанта к хлораыфениколу была связана с наличием точечной н/клеотидной замены А-*о в позиции 208в гена 23S рРНК, расположенной между мутациями, обеспечивающими устойчивость галобактерий к анизомицину и тиострептону. В результате проведении трансформации были получены клони, устойчивые к анизомицину и твостраптону, анализ которых по Саузерну подтвердил наличие ь их réiioua единственного онерона рРНК. Из этих клонов била выделена суммарная РНК, и три участка 23S рИШ, соответствующие локусам • резистентности к анизомицину, тиострептону и хлораь»1е николу, били секвенировани Как следует ИЗ рис.12 А, приобретение трансформированными клетками замен А-»0 и О—U, онределяицих их устойчивость к ашзомшишу и тиострептону, сопровождается утратой мутации А-*-о, имевшей место в рецшшентном штамме. Поскольку в атих экспериментах ко проводилось специальной селекции на поддержку или для ликвидации этой мутации, эз утрату следует,

2Э

fin пилю*w ,о0м«иить зансщ«ничм части хромосомного операнв рГИК, окл^чямдпй, как минимум, позиции всех трех нуклеотидных замен, на соответструмцут последовательность илвзмиды pHRZH (рич.1? В).

j'HJOifJüír tpihctonuht

-1

^ ' С 1 * O

ifí* Г' ^

Л] Ц™ I ¿y °

fe-I "C. iíi ==

с т * o ci*o

* К

<f s ejs ;s

д — г C-T

'i -' 71

----ЮПИ__ммкйяюхомияйчнш.я___

| ТГАИЯОГЧШИЯ д- c~r

.......n P-«"P°" »р.^^т.

165 zj6 53

Рис.1г.А. Нунлеотидная последовательность трех участков 238 рГШ ртцщшрнтного CmR мутвнтв Hb. Iialobium. R1A0 и AnlRTheH тр^исфорывнта. Б. Условная схема рекомбинации между плазмиднны И хрОМОСОМШМ опорон*«т рПШ.

Причина неспособности нлаэмидн pHRZH существовать в гялсбакториалъноВ клетке в автономно реплицирующейся (1юрме в настоящее время не ясна. В связи с тем, что, как будет ínimnena далее, нлазмида pHRZ, не содеркащая п"сл"Д'.>потрльн')сти галопакториальной нлазмшш }>НЗВ1, способна автономно (к'илииир.'ваться и поддерживаться в клетках ль. 1 jichi.!.-., логично нрецпелокить, что именно наличие ллвзкиды

pHSÍ)1 Ь конструкции 1ЛИШ1 ИИЛ/ЮТСи Причиной illlTul'pliHIll) пльзмидиой посльдоватальносш oiiapuiu jjI litt u ijk» .г».цу.

ХОТЯ, КЬК Ш У*С) ОТМаЧИЛИ bullid, ЬшХЫШам p.-IIJ.liMlHtirt

lijiíijxjjuiuit мульъшшийпик rttJuiöHiiiupitaniiHus нлаз.чид .ди i-ti bum но и'аучон, надавно било Накаиыю,. что кмитки мт«ши u.«u-.t..ibicr»i а (ЖВ. параду с дьуниипочйчш.а фирмой ила^миди раки, i;.>u'и

ôâ ОДНОЦвНОЧеЧНуй ЦйК-'1ИЧв(:куи 1>>рму (üioml et til., ! Jtiíi ). ИЭВЬСПЮ, ЧТО р(1Д калих Ш1.Ч,;|,иЩ ЬубаьТОрИЙ IU.4 Пив üi.PIHuä il ätitphvlooDocua aureus. Тапж-З ПрНсуТП иупвии b HnriïKiiI XO'dfldB OAtlOUpC'MdHHO В ЦВуХ И оаноценмчичн'.й <I>;pt.iítA, реплицируется по Mes aiiii.'it.iy "ып-Ыциго.-н к.ип.ци", t¡ одницоночачиа.-) .fcopt.ia служит при ит. ришшка-юыши ннтирмедиатом (К1а]в, 1yt"itj). Ьосьма ¡ъртшы, чтп ехоцнии механизм ими ut миг,то н при риплпкацпн iijimumhuij piiim. а гшчт.ч [ЮДСТВЙШЫХ ЧЙ мультиксишйти llJia'jUliK ДрУ) ИЛ rtlliOÖtJli'rujjVI•uSil.fltlX ШТаММОВ, В ТОМ 4I1CJIÖ И штамма fi.»U;b;jü tari tita ÜU'j. fi атом случ^ь MOKltó предположить, ЧТО наличии НУКЛоОЧИДНОЙ llOCJlO.UOljüVUJÜ.IIOi; i Ц

pHdB1 Ь НЛЧЗМИДО 1>ШШ1 Í.IOKÜT Ь ПроЦОСОО репликации llpm:(J,¡Ul'¡b к ВроЫйПНиМу 1ЮИШ10Н1Ш ОДШИоПОЧаЧНОЙ {ирМЦ lim; РшдиЬй, ЧТО, И СВОИ ОЧораЦЬ, МОЖоТ увиличшъ ЬириЛТНООТЬ ракомйтшцшчших

события мажду гомологичпими по^лвДоимвльмчиТлми шшзмиди и хромосома. D налом ¡но, получышио b настоящая part, по

результаты грыкодмыиш га« «Зьктериьльмых тмгок инициала-jí

КоНСТруКЦНиЙ I>UH2H ОВИ.ДиТоЛЬСТЬуЬ'Т О TU.I, ЧТО Oll» lihJI/In ! i:Il удобно Й I! ЬоСЬМИ ¡KptvHlklilloii <jln;füM'..ii дна tiHailuiflM

Напраьлонаик мутаций ныюс^юдсгвошю и уннкалышА иримчо.мннй

OíídpOH рРНМ Hb. >i.»lüMt.H, In Kit..-/. O'lKpUüítoT llilipi.t.iid

ВОЗМОЖНОСТИ ДНЯ MOCJItlAuliUhHil |[ункцн01п1л1.пой оначиичс-! U КОИКрбТНЩ учас'1'iiob рНГЬсОиШХ l'lllí » Чр&ВСЛЛЩИШИШ lipuUmX'Hi Галобактарпалымй iuio'íkh. ИчТьнпиап шшын-аовнаия Такчй енотами но ограничипаш-ил ыимокиостьи ььидоииа лишь тичочши

ну К.Ч00ЧЧ1 UHUÏ З'лНиН b рибчСОМиио Ганы. Kalt OllJIO НаДвЫЮ upo.Ht)Moiii:Tpnp4iinHvi А.О.М&ничшнм (Uaiikl«, lyyij, t»i(i-u|i pliiu.ii MOKiuT бить IK:lk<jIi..^ititiii дли bouAuilitd и ГоН 'äjd pl Uli boiaboi; из Нескольких пук iiotj ги.ЦоВ. Принципиальна!) ми мимцчлогил läKui'o полюцн к ,v.)VbJiti¡ot.iy и'аучшнпи uósaiiitaua риОчТи u НОаМОКНиИ liyi-ой ЬВ. hihi Util ТрйНОН/ЩНчЦПОГО uHllapai'ö u.ilbu'l <Wl,

распространена и па другие организмы, также имепгще вдинствчннь'й набор генов рРИК в хромосоме, например, на некоторые гнпертермофильныэ архебактерии и микоплазмн. Основным премуществом такой системы, позволяющей направленно изучать функциональную роль тех или иных участков рРНК в трансляции, является то, что она дает возможность работать с гомогенной популяцией мутантных рибосом посредством введения еоответствуших мутаций непосредственно в хромосомные гены рГНК.

П.г.АНЛЖЗ.ТРАНСМРШЛТОВ, полгчтш ГО* ИСПОЛЬЗОВАНИИ плАЗшшы pimz.

Как уже было указано выше, предварительный анализ трэнсформаптов, полученных при использовании плазмиды рНМ, цояеюлил предположить, что эта плазмида, в отличие^ от плазмиды pHltZH.no всей вероятности, способна автономно реплицироваться в галобактериальных клетках. В связи с этим было предпринято детальное выяснения ее статуса в галобактериальных системах.

Поскольку известно, что представители рода нь. haiobitm чрезвычайно богаты разнообразными по величине и копийности плазмидачи. непосредственное выделение плазмиды pHRZ из галобактериальных клеток для гчльнейтего анализа ' представлялось весьма затруднительным. Ыы воспользовались тем, . что в общем пуле плазмид в клетках Ап1втивк галобактериальных трансфорыпнтов плазмида pHFZ должна быть единствегагоВ, способной к репликации в клетках в. call, и использовали суммарную ДНК, выделенную из АпЛъв^ трансформанта, для трансформации в. со и. Из полученных в результате такой трансформации колоний, устойчивых к ампициллину, были, в своп очередь, выделены плазмида и подвергнуты рострикционному анализу. Результаты этого анализа показали что во всех случаях штзмидиая ДНК ApR клонов была абсолютно идентична исходной штзмиде pHRZ, использованной для трансформации галобвктерий. Это позволило заключить, что плазмида' pHRZ действительно находится в галобактериальных клетках в автономной форме и, следовательно, содержит последовательность, отвечапцую за '89

А

рашткации. Поскольку до настоящего ьройани яршпичьсаи ннкто нэ известно 1Ш о локализации хроыисомши учиаткав шшиааа«« ршицкацил, ии о структура участков инициации рышшищии акстрахромосоишк иламентоь у гало^млишк архабактприй, i.«i поставили задачу локализовать зту иосдвдоьа!ельиость а нлазмицо 1.1Ш2.

л vriort нельзя било исключить, что репликация i-liu/. i> галоОакториалиюй клатке осуществляется за счет наличии нуклаотидной последовательности, имаидой оХоцстоо о ииициитириым участком раплшшши галобактарий, и циазмицн |jbK322. Длл того, Ч'ГОбЦ биясцить, так ЛИ это. оила ИиЛуЧоНи щшзмада, j.iiiiZ а i.M<, в которой далотироьана нуклйитидтш коследоватолыюсть, соотьитствуицая рВНЭ22. Для atovo пльзмиду рНКг гидролазиьали рестриктазой Noti, иманцай а ' галоСактерияльной части ДНК илазмшш два сайта рестрикции, что позволило вида лить иолиоразмарццй оперон рРИК с флаикирушинш а го районами ¿тот фрагмонт циклизоаали с номощьи лигази, гюило чаго лш-ьзной емасыо трансформировали клонш ио. ыиоыим. ii .результат« такой трансформации Оили нолучыш колонии, устойчивый в аниземшшну и тиост ротону. Суммарную ДШС а ни колоний гидримэовали рветриктазой Koolti и аналиаировыш

ГИбрИДИЗиЦИой С ^2Р-Ы0ЧйШЮЙ ШЮаЫИДОЙ yllhü по Оьуаорну. Цвк показано ни рис.1Э, иа радиоавтографа ь Д11К еоитвитствуицорч tiiiR,xiiün г'раиоф^ман'гй присутствует фрагмент, даиаий положи

Рис.13. Ааалаз по Сауаьрпу дня

КЛОНа НО. hutoblun Iii ,ТраПС<1>ирй11

ровашюго лнгазиой сиасьа, содар иащай плазывду pimz д рБй. Вс& проби шдролизоьыш рестриктазой EooRi .1 •• ДНК клона, трансЛорш-9 5 роьанмого pHRi, 2 и 3 - ДИК ра' Ципивнтного втаииа К1. t - ДШ клона, трансформированного ли газней сиасьь.содьржацой плазин-ду pHRZftpER. 1казани длиш1 фраг-иантов (т.п.о.).

! 2 3 4

П -

5. J-K*

г в-

t

а cv*

5

т".;пчч(! mi im л при гибридизации и равный по размеру лСрг»чу»<1"!1ея При ПШр>ЛИЭе pOCTpHKWofl ВсоШ ЛИИОЙЯОЙ фОрМО плэчмя» ни« лpw (ок'.'яо я,б т.Ii.о.). Следовательно, гятч-чща гнпг, л V'-" способна автономно поддерживаться в

•■' ч-о п('1нлн1их кл»тклх, то сеть последовотельность, ■ И'г;';г1Ь"1ппм рти, локализована п галобакторнальной части ü'i^'cv.vsu vi"'-*.

.Ичлытйга"» шргирсвамга отоЯ - последовательности ьр "'т.сл.'сь путем д»f-тирювэнйя участков ДИК. находящихся в

[С\'П"П!, H|»w>t:i i-ym'-fl промоторнсму району оперена рРНК. Из иг« -iwrw jHit?, ou.v.i дедетироваш фрагмента И1п<ШТ-Вп\еИ, lllivll М U"I.| , II lull I!. Asut1, Hindi Il-r.nU И НЫ1Н- Nee I . I!c!'V'i"4üuo в р<'?у.г,ь'пчс этого нлазмиды, маркированные, f'VI-i »TOTi.'.'Hll'\ yHRZ«'?™», vHR?eHot, pllli?,fiAau, pHRZüSal И

pniT-it;(|ч'.г..н А), использовали лелее для трансформации

клетик кь. i^iobiv«. В результате трансформации всеми, yi-'ич сними iw, ran: липам« били подучены Ал1 <The" клонн и путем анализа еумморн.'й Л IK этих клонов, гидролизованной jK;crp!iurnc"ll r."V>f»i, но Сауперну (в качестве зонда использовали

м®ч':пиуп ияз:>чвд? für?. ) была подтвокдеяа идентичность одер«; «'ШХ' Ч в них плаомид плаэмидам, испольэоватшм для трпн ;-:р>«Ш!!! (рис.и Б). Пхот (Jena означает, что фрагмент галобчп-ерт! и»й .-'ПК HlndlXJ-Hoel, предшествуппий прочок.рмему р!>(1оцу оноjxта pFHK иь. hn.ioMu.ra, но является пгдля автономней ренлшишии нлазмчды pllRZ в клетках 1 плоСяитериЯ.

П.:')<ск последовательности, ответственной эа решшациг ню:''.'./,'¡u füi'.z я укя'стпчх. кию производит от нее нлазиид t I лет!!'!>, I •..ииш.ннк ирчрбактлрпГ, в нромлторном районе оперопе рШ? !ьмс:г;р''Д''.тнстю в самой плазмидо ИГО.?. но предстевлялсг , li'M но.и г,у делении в этом участка могли привести I н'ччт'-ним экспрессии нл'пмидннх гонов рГНК, и в частности, Г'М!С1 Г ir; pU!K, !'"Cyii;el'0 Морчерн устойчивости к пнизомишшу 1 TR'.4'T|wir«;iy, iio-'^jcniw»') для селпкшм трансформантов. Поэтом] "тп часть ра<\лн била выноллеиа путем использования ,друп>1 нлт.'П'я;», си >'.с!'ч«"Ч 1 р-чнефчрмирогать галобакториалмше клетки

pUbp¡: (pua. IS) i подучашюй и jiuJüum ироДо.^илоть и шт

„[.h и ¿(.пи а

. pHI'.íüNol

Hg 11 [ ''ílamtll-Hutl

^Jotl- •

|.HH¿., ti'.»

1 pu i i

12 T.ll.ut t¡J tfc» Ôi feÜHil^

o

ly* «M

ц.э í.ii.o.^ — «- »■■»

Ыс .11. 4. СхаиатнччСина кар-ru iDiaauu о .ци штлриьашии участкам в района, нрадашитвущаи прсиотораи р- омироии ¡¡ь. halcbium. В. Анализ но Саузерну Д!Ш »ран^иринроаышиж плазшиашс юююк. Вси ир&ои Ои.м ми^юдиаоимш ресгриитазой EooRt. I - ИИ pâiïfflniaHïa П1. 2-7 - ДНК транс^пианяив ПЛаЭШ1ДЬ»Ы billiZ, [lilRZ fiina, plIKí, Hot. pIlKZ ídU. plffs/, Sal U plinz Nae¡ 8-Ï3 ДШ соотьитству«^1к исходник паыодд, иаьа-СйЮМХ В full te порядка.

e (Институт Япкся -ПЛЯ1Ж8, Т'СрМОГОШ) . Ятя ПЛПП1ЛТЛ"

Fhc.JS, Схеыятическгч ksjts шазнндм ривгг. Откечашг районы, ссдеряэгла участки mmmmiaii! репликации п к.coït, маркер резистентности к usds-Полину и последовательность плп-зкиди р!П<9 •

■::"п1рг)п i.i"Kiop t>ТпIз 1 к. «.и, участок галобакториольяой 11»;<-унпл piiii?, пнпситлкшй Функцию гялоОакториальяого и мяркср устойчироств к антибиотику ыотиюляпу, (''ru'rîHp.vnFvy рост гояобактериалыпю клоток (Cabrera et al.. » о^чг, >. iivT-м нропелепия последовательных гошю-инженергах "Нер-тиЧ ич плпзмицн ривгг бил удален участок плпзмиди р'-ШЭ и l'crpoenri |цх1чоторнея область гапобяктериольного онероно рПК,, " р^зудьтм«? чего била получоп илозмяда puLK, ягпнльяов'чтчя яэми для трансформации клеток яь. tомi«n. Пр.' Г тем ОНЛП ПСЛУЧ01Ш клони, устойчивно к мевшюлииу и ! V. идилущн^ся с пдвзмидой piRiji. Дно лип лик о тих клоноп п.ч'лзел, что по рсйх из них присутствует плазмидя ршл. О.-^доротольно. последовательность, откпчашпя за автономную ¡»чпликвш'» в гэдобчктериалышх клоткех плазмидн рШЛ, о пи-Пит. н гЯРй, расположена непосредственно в промоторном. рпЯ ч*е онеропп рПП! 1<ь. h«icMun.

Г. ц<-»лы) болео детальной локализации этой к'ч'лолтятслмюпи различные фрагмента промоторного районе уус пировали р ErîoRi-свйт плязмидн pUBP2, лишенней последовательнос ги puu?, п получетмш илаэмилами Тр?!,0ф'.,ртЧ1СВ-'1ЛИ клетки НЪ. halo M («п. КЛОНИ(ЮГ1ШШНО

yfj^tkh щсмоториото района и соответствугашо плазмиды

РогЛ!

показаны на рис. 16. Полученные в результате г^анс^мтт клеток но. fu»ioB<um uevR колоши гибридизовали с 'Н' Меченной

f r^TS^y^r^'^ ( j * С [ [""___[ "____

И ft •) »4 »1 >1 ft

t t I I HI I

во-. i

Puc.16. Схематическая карта проиоторного района онерона рИМ нь. haiubium. Показаны участки, тестировашше на способность поддерживать репликацию содержащих их плаэмвд. Названии соотватстауших плазмвд приведены справа.

нлазмадой р1Ш31, последовательность которой должна заьадоыо отсутствовать ъ нвтрансф^мироиатшх клетках. При атом для всех, использовании* при трансформации, шшзмид пыли нолучонн клоны, дающие полокителишй сигнал при гибридизации. Однако при трансформации плазмидами ponsr, ри.мн. ронн и гонск, содертцих лишь непосредственно прилогащую к гену lOti pilU область размером около 0,5 т.п.о., гибридизунцихся с плазмидоИ р1ВХЭ1 клонов образовывалось существенно меньше, покали при трансформации остальными плазмидами.

Для 'того, чтобы выяснить, присутствуит ли использчвашше при трансформации плазмиды a Wov клонах в автономной фо(.мо, из зтих клонов выделяли суммарную jUM, которую затем использовали для трансформации клеток е. outi. Во всех случаях, за исключением плазмиды ромвн. была получо-ни клопы, устойчивые u ампициллину. Нлазмициую ДНК. виде ленную из таких клонов, тестировали рою'фикцаошши анализом (рис. 17). I) качестве контрим использовали вналогичлце гидролиза ш соотвбтстьуицик плазмщ. 1Ч)зульта'Ш этого анализа показала.

; • г.— г tn?:r.'. р'ЛШ. рО!ГГ. Г" ! i > Р . !<

>"••''-"!!' ч an чпп'шн Kvwtviv, ') j;.rr,r.r.:;ij;;: г;/.:

•Г ' . i-smri ЛОСЛ^Л''^!: IK' i, '

'■ ' » \. ?"•') i:o.r,:"]."ü"T тг.л ■■ 1.. fi' •

•V Ё | Я 5 N I

к, о о с с о о о о о с

М £*. л с. е<- в jt. jj- ca. ix Г-.

" а я Аз>, . у X/'. я.''-:i-t i'-? .....

i ;Ь ^uJüJxUlLÜiibl Öl

i • г

j. r|

.. , . j

i ■ - ■ ■-»—1.U

; t i.

-6,c

Гм«.17. Рю-титципшнЯ анпгаз п'тквд. содор;.:;.;,,гс: liptiSi'Ol opnoi о РАЙОНЕ p-oiiepouo Hb. halobtum (б) Г. КВгСГЛГ.,

г.довотэк нэ клеток e. Mit, трс;;с\;ор^:грлакс;гл ГАКС.-ттерявлыиих клеток nowre траасфориохдз: rz st.:;r: плр-(в), пл»%г.у?л укззгю сгзрх?..

за надтешем четырех последних способна стабя.тыю надтржчрат? оя гллобактериалымми клетками в алтоюдао j! 'пг'.щирутасЯсл форгио. Особого ВШ1МЧШИ заслуетвоат тот фачт, ЧТО HJftOTOpü« КЗ ЭТИК ИЛаЗНИД, и частности, pOUi, р04Н 11 роет, содержат ртдичино к непарэкрывавдиосл мевду собой учясткг нрдаоторпоЯ области. По-шдгалому. прскоториэл область опороис ргик Hb. кпюмшя солорзшт по одну, а насколько г >сдод'-тятолыюстей. обеспечиваниях автономную роидякоии» t га.иОактернальиия клетках содержащих иг плазмид.

Гозультатн реотргаешкчшего аняхилч плазми, выдвле?ганх яз клонов б. coli, гтолучвшвд при использовании ДЛЙ тр.чн'.^\1{«зиии ДНК КЛОНОВ ЯЪ. fnitoblum. ПроДВОрИТвЛЫЮ Tp;WCiJ«pMIIJ>onmiH4X 11ЛЭЗМИД8Ш pONCR и pOHR, српдотельствуют о том, что oira отличаются от исходных (рис.17). Путем частичного (."•¡'.р^нироронил производной плагшщн ропта, внделотшй из мет-.« к. -„ц, било установлено, что при трансформации мсП naa-wiwnfl клеток яъ. на1оЫил происходит замена участка

: ■■'■г/1 ■ -'Viui на учисгч,к Wfc't -3771, ь рьзу.н.тата »isiv i> .. -v .'гяачизпюся начало гена lt>s (ЛИК a up j*»h.j> iV. а» ■ .'трздпазтгн oOjiuCTL, содержащая uuo .хльлыи,'* щ r> ; u -опьрона. Lbpoatao, именно этим оогясниотоа cnocuCn.».:i'i, va*;*.e ::•.'.!:.■;.! поддергиваться n галобикторцалиюй клугку. Д»..^« i;ufl 1ЙЙАИЗ ПЛаа^ИЦ, образовавшихся О реЗУАЫаЮ '.v.rrou ii. „„и суммарной ДНК гаяс-Оик-мpua.-.i.jiut к«>пыь, •;paac^>^ati>oe»nHUt плазмидаш речи и ронн. но ир-лодав..«, разно как а на изучали судьбу шодьшдо ь

ГНЯООантериалышх клыках, ш исключено, что и а »тих «лу иш -.-.ас? (tJCTo какие-то ре комбинационные ссоигия, upatwiv.'-uw »sioo ■л заченв "дефектных" для инициации репликации участкоп на ."•pyrua, ШЮСОбВИв ЫШОДВЯ'ГЪ 3?у фушЦЯй, лап О К ЮГТйГраШШ цказмиан (ила какой-то ее часта) в галобиитирнальнуи хро:«осом.у. однако их оосутдвшю ч-ребует проьогышя сиоцяьлишх аьедддовакцй, что не входит в задачу данной раОоти.

Полученные в настоящей разделе работы результаты елуаы одиоэиачкш доказательством того, что фрагменты ДШС, со,цэpsauyia определенные учаоткл просторного района опарюни рРШ пь. ha lobluu ИЛИ весь промоторный рвЗоП, oOooIlcVUlBaW . ооответотьущпм шшзмадаым конструкциям сиосооиослъ автономно реплицироваться в галобактериальных клетках. Наиболее вероятным объяснением етого факта, с нашей тошси зрания, является наличие, в цромоториом районе оперена рРНК хромосомного участка' швщнации репликации или автономно ренлшшру»адхсн последовательностей, ARS, способшх инициировать репликация, по крайней маре, находясь в составе нлазмид. Последняя оговорка необходима, поскольку AR3, обеспечивающие репликацию оч/врка»« нк плазмид, далеко не всегда функционируют в самой хромосома (кик ато, например, показано для рада автономно реплшшр.у«иихся последовательностей дроааей (Snucai- at »1., vjasi Daley et ai., 1991)'). Нельзя также исключить, что в галоОактераалыгай хромосоме имеются и другие последовательности, способные более эффективно осуществлять инициацию репликации, нежали локализованный в настоящей работа р«йон. Таи ае менее, ш считаем корректным привести ряд косво.чнах аргументов, говорящих о тон, что шяв.шшша нами в

щюм-iTopnoM районе one рои a pFllK иь. haioh iu<- л ns могут также участвовать и в инициации репликации галобпктериальной хромосомы. как ухо отмечалось в разделах 1.1 и 1.2 (стр.8 и Ю) локализация хромосомного участка юшцнапии репликации в непосредственной близости от генов рПШ весьма характерна для ряда эубактерий и эукариот.

Кроме того, близкое расположение хромосомного участка инициации репликации по отношению к генам рРНК в геноме яь. iviiohttm и функционально вполне оправдано, поскольку ото могло он потенциально способствовать увеличению дозы продуктов соопттствущих гонов, необходимых ужо на самых ранних стадиях роста клетки. Наконец, как показывают ноии наблюдения, стандартные метода выделения получешшх в настоящей работе ■ нлазмил, обычно успешно используемые при выделении природных гплобактериалышх плаамид, дают крайне низкие выходы. Ь)эмоию, это связано с тем, что значительная честь таких п.лп?мид в процессе выделения соосавдается с куклеоидом, что часто происходит, если плазмидн связаны с мзмбраной или .другими клеточными структурами. По дошшм ряда исследователей (Wada fc Yura, 19V4: Ogden etal., 1980! Yung fc Romberg, 1908) такая ситуация характерна для хромосомных участков инициации репликации эубактерий и эукариот. Завершая обсуждение этого раздела, следует, видимо, отметить, что присутствие хромосомных участков инициации репликации или автономно реплицирующихся последовательностей в промоторной области генов архебактерий t> -кот отражать не только аволшионное родство отих функционально ваш« районов хромосом современных организмов, но и свидетельствовать об . аналогичной их организации у едшюго предшественника.

Как мы уже указывали выше, одним из необходимых свойств векторных систем вообще является возможность клонирования в них дополнительных последовательностей ДШ(, которые могут стабильно поддерживаться в составе .вектора и наследоваться рощитиентной клеткой. Имея в виду использовать полученные в настоящей работе векторные конструкции прекдо всего для изучения особенностей экспрессии, генов рРНК и рабоТн га.лобактериплыюго трансляционного аппарата, ми но ставили

Э 4

парад собой специально задачу введения ч «..и'.и.^к. гцицис векторные конструкции каких-то других гении. Однако, чы.1 не менее, представлялось достаточно ьакшм ы.чсшт,, ьшию участки нлазмидних конструкций могут бить питинциалыю испи/п, Ьовани для атих операций без нарушения жианошю ъакнш функций самих плазмид.

Анализ по Саузорну большого числа апАь»" кл^и^н ш.

иолучеишх при трансформации плезмид^й ьпкл,

показал, что в одном из трансформантиь разиири фрагминч'ов, л?

гиОридизуыцихся с Р меченной р1Шй, сказались зппчичслыь* больше тех, которые соответствуют исходной нлазмпду (рис.»о>.

]

15

щ

►А»!

Фа

Ыс.10. Анализ НО Сауь^и»

одного из трансфориантов нь. ьа1оЫит, выделенных при /,8 трансфоркации плазиидой рак/..

Проби Д|Щ годюлизовани рестрш; 7. тазой Еоо Ш; I - ДШС рецишентного тиииа 1п, 2 ДНК грансфорканта; 3 - ДНК илазиидц рш. Указаны размеры фрыивнтов в т.п.о.

Такой результат моыю оогяснмть ^ниылшицилш, -результате которих произошла либо инте!рицин нлазмидц цп^ и хромосому (что привело к изменению расположения сайтов расщенлеКин звдоиукдоазоЯ Еоо йл), либо иисерция в шиммиму рннг какого то фрагмента ДНК штамма-реципиента. Суммарна* дик трансформанта била гидролизована рестриктазами Рун!, и

ОаоН и болов Диталыы проанализирована по сиуоц.иу посредством гибридизации с меченной плизмидий к.ны:. Сояостиьлбний размеров зон ДНК, данцих иолокителиши «.ш ни* при сиорцдилырш, нозылило заклтчт ь, чт; 1ысле трансформации в плазмиде происходят изменоиин ь иОча.ла. распоЛииенноЙ моццу сайтом рестрикции аннопуююаои ь'^о 1п :>

последовательности плазмида рсиэгг п сайтом ростр; ¡¿ЦТ.." эндопуклеазн Вта1 ь позиции 566 (по отношению к Н1п<ии-сайту) к гаггобакториалыюй части плаэмкды.

Для того, чтобы понять, интегрировала ли плазмида рнпг. (или какая-то ео часть) в хромосому или произошла писернля I-ео последовательность какого-то фрагмента галобактериальноП ДНК, Сада проведена трансформация клеток в. оои суммарной Д1Е отого трансформанта. В результате такой трансформации былг. шдел'-'ни лрн клопы и проанализирована их штзмндная фракция. Гнло показано, что они действительно содержат плазкпду, Ос'львуп по размеру, пеке ли исходная плазмида рНПЕ. ПоследупакА рострикшюшшй анализ этой плазмида и гибридизация по Саузерлу показали, что она содержит фрагмента, не гибридизугащеся с штмидой рНР.г. Следовательно, мохно считать доказанным, что при трансформации голобактериальных клеток нлазмядой р1Ш нежат происходить интеграция в плазмзду дополнительных нуклеотидных последовательностей. При этом интеграция в участок, расположенный мокду сайтами растепления ростриктазсга ЕооШ и Бгпа1, не нарушает спосоОности плаэмшш рНП7. автономно реплицироваться как в клетках галобактерий, так и в клетках в. оои. То есть этот район плазмида ркяг потенциально кого* быть использован для клонирования дополнительна* последовательностей ДНК. Ни но шясчяли, какова природа спонтанно интегрировавшего в плазмвду рняг фрагнецта, одного ыавю предположить, что он моезт представлять собой один ео мобилышх генетических элементов, которого: столь богаты клетки яь. на1оыця.

VI. Э А К Л «> Ч В Н И В.

Подводя итог обсуадешш сконструированных к огтавншх с Настоящей работе векторных систем для трансформация голо^илыш аруебактерий, представляется целесообразна сделать несколько общих заключений. |

В последние два десятилетия благодаря развития в активному внедрению методов совремешюй генной шшенерии бал достигнут существенный' прогресс в области молекулярной

биологии и генетических исследования разнообразна* представителей какого мира.

Вндвлонме археоактерий в уникальное иирьичноо царетьо стимулировало поток исследований, направленных на ьиисивниа механизмов их клеточных процессов, которое мокет пролить свот на только па особенности, свойственные именно атиы организмам, ио и получить дополнительную информант о путях аьолиш киши организмов шобщо и выявить черты, присущие ах общему древнему предшественнику.

Созданные в самые последние годи ьикторша система для галофолишх и метаногвшшх архвбактериЯ, насмитрх на ах несовершенство, угга теперь позволила распирать наши знании о перспективах направленного получения различит мутьтов ерхебактариП (Ровноt et al., 1988), о структуре и зиспроссии ряда архебактериалышх генов (Holmen & Dyail-Bmith, i')So¡ Niewltmdt 4 Daniele, 1990¡ Krabe et al.,19911 N1 et al., 1S90). Однако генная инженерия делает эдось лодь перше ш&ги яа пути реализация своих возможностей. Позволяя осуществлять направленной иутагенез как In vivo, так и Iri vitro вакнайших для жизнедеятельности любых твил организмов рибоссшш генов, настоящая работа открывает значительные перспективы в получении прямой информации о функциональной значимости тех ила шшх участков трансляционного аппарата галобактерйилиюй №19тки и, i£i надеемся, займет свое место в развитии таких исследований.

<

выводи

1. Получен и охарактеризован "двойной" мутант !-г.'Лрпщ.пьно гало^ольной архобактерии ИсиоЬао^г-еил Г1а1оЬ(м., устлйчивнй к иигибиторпм белкового синтезе - анизомицину V,

ГИ'ТТрОПТОГу.

?. На основе мутантного оперона Ла1оЬао1вг1ит На1оЬ»и^п, спдоркчщпрл в гене 233 рРНК маркеры устойчивости к анизомицину и тиостронтону, создан ряд плазмид!шх конструкций и разработана эффективная система селекции трансформированных ими гапобпктерий.

т. Изучена популяция небольших мультикопийных плазмид родствотмх пшобактериальных штаммов Яа!оЬа<и*г1и«п 8ВЗ, ,Чо\оЬа'И'г1 ит СКВ И ЕГа1оЬао4вг<иЛ 0КЮ1 . Определена ПОЛНа« нуклеотиднвя последовательность двух мультикопийных плазмид, рНР.ГЧ И рнэвг штамма ВяХоЪасгвПип БВЭ.

Открыто уникальное явление ¡сосуществования в одной клетке тшсокогомологичных между собой плазмид, различающихся ЛИ|!Н- незначительными инсерциями, деледаями и точечным« г.у1и!оогидними заменами.

4. На основе мутантного оперона рРНК Иа1оЬао*вг1ши )-/л1о(|(ич1 сконструирована шаттл-векторная плазмида . рНМ способная автономно реплицироваться в клетках как галофИльнш. чрхейактериА, так и е. сок.

. На основе мутантного оперона рРНК яа1оЬаа*гтт .'«[сынт л мультикопийной галобактериальной плазмида- рНВ81 сконструирована плазмида рннгн. Показана возможность ее

¡¡. |Г:.<1Г.к:нШШ1| ..'l'ut Ш««№>ШМ М/ТаЦий IU.K-. |кчи;ТЮ0111|.< ■■> • j { u.V. MtiUll 0)IU|K.it I'l'iliC (|.|1.'1.|Л«|'1ш lui. Иы, Ii, ,1,.-.

г,, lio т,"Itala c«¡,:í,i нлизиид. in>Au|1UiWK j.û.i »пчм*» ii|»«i • '!■ .[.'¡i .i.u>|a»ui ('IHK ti. • i.- i->• i -.i-11fuil^Mi.n, lluiniiiin'.bii IK. i!| tit • !нч V i: »."»¡.(j« nwimi яруги» i«ii.ui ги«..0йкг«.|.ий.

i. !I),v'1í>H ü|j,,mov ,[,aaíl ¡..дЯиН ».uj|»'4ia |.ll!lí к..: i i. . ■ tí 'Mi.'i У >4 Mu if'mjh, ¡V» vil <:..Jiu|.iaiT :i i. I .il - .,: 1 ■ ¡i.

.................... Г..-:,|.1ЧИ1Ч. aaï-. 11. r.'H; |.< |v|U,||Uiir.¡i- . •' '.:. Л; i •.

.lii.untUí u i не.un« mas .

К.'Маф.'Иап i mi Оилка, ачТр!ыан|,1К",ц||у.;.ч a laaiunn ¡ l illí

II i !..-I .,,> tc.T U.m ||.а,.1Лчи. lUna-.iaao, 'ill' аа«/!'!,,;, i4;'¡ НЦЛЙ i'.t; Jl.lt; UtUli. I («!••. uyt< I"mu«lll. I . M.illi.l UM O iuílv V.b.r .Utihtlli.llUi Ы ИНЫМ

»!•• l'umílvatUU ЩЛчГшК'П'Ц.аЙ. Ilflty'lt-.U i:yU4j!ll|u.«yik>UV 3T.il' I flrtllM. а и 'Wi.i ¡:¡. ■, ai.) :)h<)i¡'ui4'U[:vM4tiU.'ii l) U.u Сол. К Vaiomi .iiwi.»í Itlítt awiaut-.tifwutl c.i'iilMb.iM i h и-) C.Tii.ill.<;it:«r. I» lip ■М.л-'(>и. ну |.-.Д n¡ i iwp.'.ilti J.I'IIH 'i.•! f.( í„, íi-ii. (..<(..Mi,N.

список

ряяот, опубликованных по теме диссертации.

t. Кэгрпмаиова II.К., Миныспн A.C., Тетерина Н.Л., РуСцо» n.M., Конылор A.M., Саратова Л.А., Богданов A.A. "Нуклоотиднея последовательность гена 16G рРНК из пр'хгбактерии ffnlobaot«rtum hatofctum", БИООрГ. ХИМ. , Т.11, c.Mfj-S»??., (19Э5) ,*. Малькии A.C., Каграманова B.K. "Промотора генов потршюлируамнх ' ПК галофилышх архебактэрий. Предполагаемый внутротшй промотор оперонов рРНК архе-и зубпитррий", Виол.'паутш, Н 4, с.18-25, (1987) Мглькин A.C., Кнгроманова В.К. "Структура промоторного ряПона рибсссмггого оперона архебактерии Haiobaot*r»tM ^isHim", Материалы IV симпозиума СССР - Италия "Мшсромол^кулы в Функционирующей клетке", Пиев, 0.84, (1984)

1. Kngmiranova V.R., Hankin А.Б., В -atora L.A., BogAanoT A.A. "Tho З'-temilnal nuoleotide eequende of the H-Jlnlirfertum Ha lob (vim 16S rKNA", FEBS Lett., V.144, Г-.17Г-1вО (]П82 ). г.. Каграч^новя B.K., Маиькпн A.C. "тРНК в мвкгенном спейсере рибосомного оперона архебактерии Haiobaoíertw» haic'íti^", Материала iv симпозиума СССР-Италия "Макрог.'олекули в Функююннрущей клетке", Киев, с.282, (i'>"?1 >

>-.. Н.шкiп Л.П., Kngnsnvuiova V.K., Teterina N.L.Rubtaov Г.Ы., r»lovn E.H., Rojiylov A.M., B&ratova L.A., Bcgdanoy А.Л. ''Die м>о1еоИ<До nequonoe of tho geno oo&lng for 166 rf<*M fi:M-, the arolmebaoterluni Hnlobaoteriun ha]obium", <;, 1.181-18? (1Ч£?Г>)

Т.'Манышн A.C., КШ'рьмааоьа B.K., 'Гетервна 11.i). ")1уь«<;и тадная последовательность архесакториальвой u-ü pi UK i:., ЕГа1оЬао<»г<ш* halab(um", UaTepiiOJlU KOItrjxKva io!K,paitai> Европейских Биохимически! Обществ, Москва, (п<н4)

a. líankln A.B., Bki-ipkln B.A. , Kagminuiiovu V.K.. "I putativa lnteinal promoter In the lfitä/ü«J lnluivv-ai.; apaoer oí the rWlX operoiv el mvhiiofcmilurl л eubaoteria", ?iSBS Lett., v.219. p.'¿'ii О :.>u() 9. HankJn A.S., Tbterlna N.L., Baliteo» V.M.. taul-..-L.A., Kagramanova V.K., "Putative piviuAdi« i-t.¿U.u >.,c rKNA operon from aroliaelaotei-liui Ujiut.uu-i ¡>.,¡ halobluw", Nuol. Aoiila Нее., v. 1 ü, y.íbi'l (ijín)

10. Uankln A.B., Kagi-anianova V.U., "Uoiuplsi tu ии.и л, í i ,!-aequenoe of the single i-lboeomal F<ti A i/putxa oi Halobaotartun Ка1оЬ<шя: uáüoudavy ttlruúiuiu of ill--arohaebaotarlal Ü38 rRHA", Uoleo.Gen.üena ! . , p.152-161, (1986) It, Uankln A.B., Kagramanova Y.K., "C^uplci i-ivu-^it.-paitara oí tlia singla rlloe OQittl lilíA OJluivit ^ t uH araliböbaüt&rlum Halobaotariu« liaU.bl».ia", !,'¡K.l . ! i.1 ¿a Rae., V.16, p.4679-4692, (1988) IS. Ilankln A.S., Ragï-ajuanova V.K., belova ¿.N., iuUi ;,.. H.L., Baratova L.A., Bogdtinov A.A., "ьч-Ьшгу tmj eeoondary atniutuc-e l,Г 53 i-RUA ftvm S;ibu<ii,i BalGbtuift". bloûllblïi. Int., V. 5 , p.7)9 7¿c, (Ivti.îJ Ci, Спиридонова В.A., Каграманова B.K., Нарачова я i .

' Голова C.B., Ченулаеиа Л.11.В Нянькин А.о.

"Клонирований гена рибоооыного бежа itít ap/eöia;tcj .i»,:

»

Ualubaoterlb» IuiIuMuk" . Ruoopr. ХИМИЙ, Т. Il, (I у: M J 14. Bpiriilcxmvh V.A. .AliühOiaiiOíü , >'.?.

Ч-HlMll Л.il. 'У. 1 I"-Ч. -IJ.-1 I [If. ■t.,.|l| fm,n lililí'lop < f

tl . !, , . I ^ (,,., !, , I, .b ; Jill.' I с >1, I r|.> ft i. 11 - - П " ( > Г'Г Uli' "i'íiíí; for ;.) ir-i гци! \-я ! он t г 11 of-m-i ]

it •«. •!••.•<". i'nn.,'.Uloi'ot>ii4 . , v. i'-, [i.ГЧ 1K.1 M'i'Vil, • ■ r.wr '.'■in >vn v.r.. ->v)¡<i,'I)fv;i N. I. . (link It) А.Г., "Tb» ,' ■ I p I.'? 1]:ь-1 "> M il" pfjueii'". of the nroh'V bao '«I-IhI I 1Ч--Т, M J.!)-;!* Г 1-.--П1 J).<Ь">т,,./,>. (,,., ;!IH", Kuol.Al.ln Нгя.. . Юд, .4 I '-'j, I i')>Vî i '. í ''/чггат' v'i'v v.k., 1)гм-.>1: o.oio v f> !).!., mrtnjcan а.г>.,

"Htmninl ti'i'.'liutiili еогщрноо í?"trrvK«?nf>lty of pinnl I

M']) t loopy jH'J-B |,ln.p,'n)rl íroiji 7i 1 1-4-Ii- trr- I„H S'BV,

!,iui..!.lîi,','ti"n. ,ï . «S 1>.1Ь'.>-1ЬЗ (»«•«•!) i ,'. m iiiwin a.,"., ! j jrldon-'va v.a , akhimnovr» a.n.,

ï.Г,., ";> liu,.» I.urn ami "!t|irtiH(i.toTi of Iii« НЪоноом!

ri- Uln цпп» olnofí1)' "f linloj'hl 1 lu arolmPbfioU'rlun; Il i|,.,i»i,'ir"(i.4 halnblum", In I r rua',о I mil Бутрон ! i.«n "!i, ' I fi'ul иг organization r, f I. 11, ) eg 1 no) (itruoturee", vr.So, Мм'.оои, р.ГМ, Í1').<>. ?) 'H. SqnKlii л .S. , Zyrinnm'tt 1 . N., Кчкгатнт.уя V.K., ИЛ ПО/

F Kî'-S J МП Syi'.poüi'in "Ar^h^üb« itf'.r) ч агИ rlboroir«) Л « : n ! i ' ", Noelnr.i nu. tui-J control of irwm 1 at ion" ,

' >, M'iiikin A.G., 7.yr ] .H. , Ka(rt'.'ii;ïu.m's V.K., Gurrt« tt

H . A . , "Hi boí'oinnl tn^niirocjni' In Ьн1о[ЬП1о. tu-oli4«ban tt r in" , b! InU-r^l Syirjioe 11 то "Лп)|ич<Ч'во< orla, TMliel, р.?'». (19*Л0 ■ o, AV ^hniwnovii i.S., K.'W'xmanovii V.R., NanKln A.S., "Маого Mit1' r,1oj\j hotoi'o^crioi ty ("f filial) (' 1 'ííin, i tir- Г roi,I )'•> !'.lí»rt»riur., в 11'M ill SM w.it ÖIU1". Il) |«t<-.r<>) öy»..i>.-.«lun; r i",),;, т., И!..,,, 10, (l'Oí; ' , íj'i'Iíi.ih .«¡{wit -ki n.M., Кчг| .м- ч -I.U 'ftiHt-i

мутация ь гвни i'-js pi i IK coecnenauhóT улил ыы.оть галчрилишх бактерий к антибиотикам анпзчмшишу и 'пшотрвптону", VU Двусторонний симпчаиум 0001' $ГГ, Иркумк, fi.37, (l'jfi:)) •.'<■.. Munkln A.:¡., Zyrlaiiova I.U., ttngrun'aii.wii V-Í-, lîurr-olt 11. 4. , "liiLiV/iiuo Ing líiulatlciia hilo tha tilaglu ôli'.'tIII:.»<íii,h 1 ¿íh i'hUi guile of lii'ohaeon B.ilut«aUi'(™ liil.'il.lnh ualiig an 1'1(МЛ op^ron badôii t Triunfa liiiuL Ion ayo I oír,", l'iv.i>.t<ul .Aea.l.Sol, 1124,(19 Í1), -m. Каграмацоао Ü.K., Доркачира H.H., Маш.кии i.U, " 1'р'".И(:ф)рмнЦИЯ il boK'KlpUUO OtiCÎJ'bMU rtpxartttlt'füpilíl", y.uiuin (!;.lip. On.ui.iriin, T. 112, auii.4, 0,a- lu ¡|iM.:).

И.'Щтг&ио a uí)>íu¡4. [':).!'ñ.iKi ¡яки <:> Ър-nv Pu - 11/16 Tui Hí füll

:l.r,i;üt», 'i'íiir,грабли