Варианты строения сперматозоидов человека в норме и при патологии, критерии прогнозирования успешности экстракорпорального оплодотворения и дифференцированного подхода к диагностике и лечению мужского

Бесков, Артем Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Варианты строения сперматозоидов человека в норме и при патологии, критерии прогнозирования успешности экстракорпорального оплодотворения и дифференцированного подхода к диагностике и лечению мужского
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Варианты строения сперматозоидов человека в норме и при патологии, критерии прогнозирования успешности экстракорпорального оплодотворения и дифференцированного подхода к диагностике и лечению мужского"

На правахрукописи

БЕСКОВ Артем Александрович

ВАРИАНТЫ СТРОЕНИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ, КРИТЕРИИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ УСПЕШНОСТИ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ И ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО ПОДХОДА К ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ МУЖСКОГО БЕСПЛОДИЯ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

НОВОСИБИРСК-2005

Работа выполнена в Государственном учреждении Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск), Российско-американском центре репродукции и генетики человека (Сочи) и Сибирском институте репродукции и генетики человека (Барнаул).

Научный руководитель: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Шкурупий Вячеслав Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Бгатова Наталья Петровна

кандидат медицинских наук Надеев Александр Петрович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего медицинского образования Алтайский медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (Барнаул).

Защита состоится « <?/ » Ь^-^-С^и^ 2005 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 в Государственном учреждении Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: ул. Академика Тимакова, 2, г.Новосибирск, 630117. Тел./факс 8 (3832) 33-64-56.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

Автореферат диссертации разослан 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.б.н.

Пальчикова Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Количество бесплодных супружеских пар в России достигает 12-15%, что, по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), сопоставимо с распространенностью бесплодия в мире (Кулаков В.И., Леонов Б.В., 2000). При изучении структуры бесплодия ВОЗ определила мужской фактор более чем в половине случаев (World Health Organization, 1987).

Качество сперматозоидов является важным показателем мужской фертильности, и поэтому их объективная оценка играет одну из ключевых ролей в обеспечении успешности методов вспомогательных репродуктивных технологий. Наибольшее распространение получил анализ морфологии сперматозоидов по строгим критериям, разработанным Kruger и соавт. (Kruger T.F. et al., 1986). Для повышения информативности разработаны индексы множественных дефектов сперматозоидов (Jouannet P. et al., 1988; Aziz N. et al., 1996). Однако, современная классификация аномалий сперматозоидов не позволяет выделить формы, имеющие отрицательную или положительную связь с частотой оплодотворения тем или иным методом и последующим развитием эмбрионов. Этим могут быть обусловлены и противоречия в данных литературы по вопросам преимущества экстракорпорального оплодотворения или интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в разных клинических ситуациях. Поэтому более дифференцированный подход к выбору метода вспомогательных репродуктивных технологий, основанный на точной морфологической оценке мужских гамет, возможно, позволит избежать слишком частого и неоправданного применения интрацитоплазматической инъекции сперматозоида, которое имеет тенденцию к расширению показаний. К тому же, изучение связи морфологии сперматозоидов с успешностью интрацитоплазматической инъекции может способствовать повышению эффективности самой микроманипуляции.

тозоида, необходимо, на основе точных количественных методов анализа, выявить прогностически ценные морфологические параметры, которые могут быть оценены и без использования дополнительных средств. Компьютерная морфометрия является высокоточным, воспроизводимым и стандартизованным методом, позволяющим количественно выразить структурные характеристики объекта и доказательно обосновать или отвергнуть значимость качественных оценочных критериев.

Цель исследования. Изучить варианты строения сперматозоидов человека в норме и при патологии и определить наиболее информативные интегральные морфологические критерии для прогнозирования успешности лечения бесплодия при применении вспомогательных репродуктивных технологий.

Задачи исследования:

1. Выявить качественные морфологические характеристики сперматозоидов, влияющие на успешность экстракорпорального оплодотворения и интрацитоплазматической инъекции в яйцеклетку.

2. Оценить возможность использования этих характеристик для выбора метода вспомогательных репродуктивных технологий.

3. Оценить возможности компьютерной морфометрии для объективной характеристики сперматозоидов при использовании в области вспомогательных репродуктивных технологий.

4. С помощью компьютерной морфометрии выявить наиболее информативные интегральные параметры сперматозоидов, пригодные для планирования лечения методами вспомогательных репродуктивных технологий.

5. На основании морфометрического анализа сперматозоидов выявить параллели между параметрами, полученными в результате интегрального качественного и количественного морфологического исследования.

Научная новизна исследования. Выявлены особенности морфологической оценки сперматозоидов при подготовке и проведении лечения бесплодия методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида, учет которых способствует повышению его эффективности. Установлены критерии оценки структур, которые обеспечивают прогнозирование успешности интрацитоплазматической инъекции сперматозоида. Обнаружена связь между качественной характеристикой строения сперматозоидов и качеством зигот, полученных

при классическом экстракорпоральном оплодотворении. Выявлены параллели между параметрами качественного и количественного морфологического анализа сперматозоидов. Определены количественные параметры, характеризующие форму головки сперматозоида и, таким образом, адаптирующие методику качественного анализа для морфометрического компьютерного исследования спермы.

Практическая значимость работы. Знание структурных особенностей сперматозоидов, влияющих на развитие эмбрионов после интрацитоплазматической инъекции, позволит повысить эффективность лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий за счет улучшения результатов микроманипуляции и более глубокого и дифференцированного подхода к диагностике мужского бесплодия на уровне эмбриологической лаборатории. Выявленные морфометрические параметры сперматозоидов, имеющие прогностическое значение, будут способствовать увеличению надежности автоматизированного морфологического анализа спермы и скорейшему его распространению в лабораторной практике с целью стандартизации результатов исследования.

Положения, выносимые на защиту:

1. Критерии, разработанные на основе морфометрических параметров сперматозоидов, коррелирующих с успешностью лечения методами вспомогательных репродуктивных технологий, объективизируют систему качественного анализа их структурных элементов.

2. Оценка некоторых структурных особенностей сперматозоидов, отражающих их функциональное состояние - фактора формы круга головки, индекса множественных аномалий шеечного отдела, доли сперматозоидов с искривленными шейками, округлости головки, большой оси головки, отношения «большая/малая ось головки», фактора формы круга акросомы, фактора формы эллипса акросомы, округлости акросомы, малой оси акросомы, отношения «малая/большая ось акросомы», относительной площади акросомы, отношения «периметр/площадь акросомы» - должна быть дифференцированной при прогнозировании успешности лечения бесплодия методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида и методом классического экстракорпорального оплодотворения.

чественные признаки формы головки сперматозоида и акросомы являются значимыми при прогнозировании успешности интрацито-плазматической инъекции сперматозоида.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на XII международной конференции Российской ассоциации репродукции человека (Санкт-Петербург, 2003), международной конференции «Twin-Meeting Alpha-Andrology: 4th Biennial Alpha Conference / 8th Meeting ofAndrology in the 2000s» (Антверпен, Бельгия, 2003), XXIX ежегодной конференции Американского андрологического общества (Балтимор, США, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах на русском языке и содержит 34 таблицы, 10 графиков, 16 фотографий и рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследования», трех глав с материалами собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы (71 отечественный и 170 иностранных источников). Весь представленный материал обработан и проанализирован лично автором.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основу работы составили данные о супружеских парах, получавших лечение по поводу бесплодия методами экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) в Российско-американском центре репродукции и генетики человека в г. Сочи и в Сибирском институте репродукции и генетики человека с августа 2001 года, с применением «длинного» протокола стимуляции суперовуляции, с использованием спермы мужа. Причиной бесплодия был трубный фактор в 26,1% случаев, сочетание нескольких женских этиологических факторов (13,0%), а также мужской фактор как единственный (12,5%) или в сочетании с женским (48,4%). Средний возраст женщин составил 31,8 ± 4,7 (М ± о) лет (от 21 до 40), мужчин - 34,6 ± 5,8 (от 21 до 45) лет.

В исследование, посвященное выявлению качественных морфологических характеристик сперматозоидов, влияющих на успешность экстракорпорального оплодотворения, была включена 261 пара, получавшая лечение методом классического ЭКО, и 106 пар, которым

потребовалось применение ИКСИ. Критериями эффективности лечения служили: 1) роды после лечебного цикла; 2) наличие плодного яйца в полости матки по данным ультразвукового исследования (УЗИ); 3) частота имплантации; 4) качество эмбрионов, переносимых в полость матки; 5) качество зигот; 6) частота и качество оплодотворения. Группы пациентов формировали на основании успешности лечения (наступление имплантации, роды) и разных значений индекса Крюгера (ИК) и индекса тератозооспермии (ИТЗ).

Для определения количественных показателей, имеющих клиническую значимость при проведении ИКСИ, при помощи компьютерного морфометрического анализа сперматозоидов использовали данные по 42 случайно выбранным супружеским парам, у которых был выявлен мужской фактор как единственная причина бесплодия. Средний возраст женщин составил 30,7 ± 4,7 лет (от 21 до 40), мужчин - 36,3 ± 6,8 (от 21 до 50 лет).

У 22 супружеских пар лечебные циклы завершились безрезультатно (I группа), у 20 женщин наступила имплантация (по данным УЗИ) (И группа). Группы I и II были однородны по возрасту (женщины 30,1 ± 5,0 и 31,8 ± 3,4 лет, мужчины 35,5 ± 7,2 и 38,0 ± 5,8 года, соответственно; р > 0,1), а также ключевым параметрам стимуляции суперовуляции и особенностям переноса эмбрионов. Оценку значимости показателей производили по 1187 сперматозоидам в I группе (в среднем 54,0 на одну супружескую пару) и 511 сперматозоидам во 11 группе (в среднем 25,6 сперматозоидов на одну пару). Для расчетов, связанных с оценкой значимости индексов множественных аномалий, количество сперматозоидов в I группе составило 1684 (в среднем 76,5 на одну супружескую пару), во II группе 1600 (в среднем 80,0 сперматозоидов на одну пару).

Обследование пациентов и лечение бесплодия методами экстракорпорального оплодотворения и интрацитоплазматической инъекции сперматозоида проводили по общепринятым протоколам, соответствующим Приказу МЗ РФ №67 от 26.02.2003 г. Морфологическую оценку зигот и эмбрионов осуществляли по распространенным классификациям (Scott L. et al., 2000; Леонов Б.В., Гусарева А.А.,2005). Анализ спермы проводили по методике и нормативным критериям, рекомендованным ВОЗ (1999). Для морфологической оценки использовали окраску препаратов по Паппенгейму-Крюкову. Индекс Крюгера равнялся относительному количеству сперматозои-

дов, соответствовавших строгим морфологическим критериям (Кг^ег Т.Б. й а1., 1986). ИТЗ рассчитывали как отношение общего числа патологий головки, шейки и хвоста к количеству аномальных сперматозоидов (1оиаппе1 Р. е! а1., 1988).

Морфометрические показатели сперматозоидов определяли методом компьютерной морфометрии с помощью системы анализа изображений «Видеотест - Морфо», осуществляющей преобразование и количественный анализ изображений на основе измерений яркост-ных, площадных и линейных параметров объектов, имеющих замкнутый контур.

Статистическую обработку данных производили с помощью компьютерной программы вгарИРаё 1п8Ш 3.0. Для сравнения независимых групп по количественному признаку использовали критерии Стьюдента (при нормальном распределении), Манна-Уитни, Кру-скалла-Уоллиса (при ненормальном распределении), критерий % и строгий критерий Фишера (для сравнения качественных признаков). Для выявления корреляционных зависимостей использовали методы Пирсона (параметрический) и Спирмена (непараметрический). Уровень статистической значимости (р) установили равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Качественные морфологические и функциональные характеристики сперматозоидов, влияющие на успешность ЭКО и

икси

В результате проведенного исследования выявлено, что качественные параметры морфологии сперматозоидов по строгим критериям Крюгера находились в положительной корреляционной связи с другими показателями спермограммы, а в программе ЭКО - с общей частотой оплодотворения (г = 0,19, р < 0,01), с частотой нормального оплодотворения (г = 0,13, р < 0,05), с относительным числом зигот (г = 0,18, р < 0,05) и 3-дневных эмбрионов (г = 0,13, р < 0,05), отнесенных по морфологическим признакам к категории 1. Однако, для частоты имплантации не было обнаружено подобной зависимости. Индекс тератозооспермии не был связан ни с одним из оцениваемых параметров классического ЭКО.

В группе ИКСИ были получены обратные результаты (рис. 1 и 2): частота оплодотворения не зависела от качественных морфологических параметров сперматозоидов, а частота имплантации оказалась

в обратной зависимости от индекса Крюгера (г = -0,30, р < 0,01) и в прямой - от индекса тератозооспермии (г = 0,32, р < 0,01). Отмечена достоверно более высокая частота наступления беременности в объединенной группе с индексом Крюгера менее 10 (28,75% против 5,00%, р < 0,05). Частота имплантации в группе с индексом Крюгера менее 10 тоже была достоверно выше (11,9% против 2,7% р < 0,05). При этом более высокая частота самопроизвольного прерывания беременности в группе с индексом Крюгера до 4% была недостоверна.

В семейных парах, у которых была получена беременность после ИКСИ, средний индекс Крюгера оказался достоверно ниже (на 3,13%), чем в группе с неудачными попытками, а средний индекс тератозооспермии, наоборот, достоверно выше на 0,163 единицы. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что повышение доли сперматозоидов с множественными аномалиями строения является свидетельством необходимости применения ИКСИ. Тем не менее, морфологические характеристики зигот были лучше при меньшей степени повреждения сперматозоидов (коэффициент корреляции Спирмена для индекса тератозооспермии и среднего балла зигот г = 0,33, р<0,05).

Частота наступления беременности была высока и в группе, где в эякуляте не было морфологически нормальных сперматозоидов. На основании этих данных можно констатировать, что введение аномального сперматозоида в яйцеклетку не всегда препятствует оплодотворению и нормальному развитию эмбриона.

Однако, возможность успешного завершения ИКСИ после оплодотворения морфологически аномальным сперматозоидом указывает и на недостаточную точность оценки по стандартным качественным критериям. Индекс тератозооспермии в этом случае также не повышает ее информативность, поскольку не выделяет отдельных форм аномалий головки, от количества которых, по данным вышеперечисленных исследований, и зависит успешность ИКСИ. Поэтому для выявления тонких различий в морфологии сперматозоидов, используемых для интрацитоплазматической инъекции, было проведено исследование с более детальной оценкой морфологических аномалий сперматозоидов, в том числе с использованием количественных показателей, полученных при помощи компьютерной морфометрии.

Анализ качественных морфологических параметров сперматозоидов с использованием индексов множественных аномалий

Оценка распределения аномалий формы различных отделов сперматозоидов в группах супружеских пар, у которых перенос эмбрионов не привел к наступлению беременности (группа I) и пациенток, у которых наступление имплантации было зарегистрировано по данным УЗИ (группа II), показала достоверные различия по относительному количеству сперматозоидов с аномальными головками, причем в группе забеременевших этот показатель был на 5,49% выше (87,56% против 82,07%, р<0,01). Различий по количеству сперматозоидов с аномалиями шейки и хвоста не выявлено.

На следующем этапе оценивали распределение отдельных видов аномалий каждого из отделов. Результаты дополняют картину, полученную при качественной оценке с помощью индексов Крюгера и те-ратозооспермии (таблица 1). Показано, что в группе с успешным исходом переноса эмбрионов после ИКСИ наблюдали более высокое содержание сперматозоидов с аномалиями формы головки в целом (на 9,93%), а также, в частности, сперматозоидов с наиболее деформированными головками - гантелевидными (на 2,25%) и аморфными (на 5,71%). Кроме того, в группе с произошедшей имплантацией дос-

товерно выше относительное количество сперматозоидов с аномальными акросомами (на 6,73%), сперматозоидов с чрезмерно большими головками (на 2,10%), сперматозоидов с вакуолями (на 2,28%) и с двумя головками (на 1,13%). Эти дефекты, как правило, видны при проведении ИКСИ, что способствует более успешной селекции встречающихся единичных сперматозоидов нормальной формы.

Таблица 1

Относительное количество (М±m) сперматозоидов с различными видами дефектов головки у супругов пациенток с безуспешным переносом эмбрионов (группа I, п=1684) и с зарегистрированной имплантацией (группа II, п=1600)

Виданомалии Группа I (%) Группа II (%) Р

Аномалии формы (в целом) 57,07 ±1,21 67,00 ±1,18 <0,01

Грушевидные 19,00 ±0,96 19,44 ±0,99 >0,1

Гантелевидные 1,13 ±0,26 3,38 ±0,45 <0,01

Округлые 6,53 ±0,60 6,00 ±0,59 >0,1

Удлиненные 25,59 ±1,06 26,31 ±1,10 >0,1

Аморфные 7,48 ±0,64 13,19 ±0,85 <0,01

С дефектами акросомы 50,71 ±1,22 57,44 ±1,24 <0,01

Аномальный размер (в целом) 31,00±1,13 35,19±1,19 0,01

Большие 3,09 ±0,42 5,19 ±0,55 0,01

Малые 27,91 ±1,09 30,00 ±1,15 >0,1

Наличие вакуолей 1,72 ±0,32 4,00 ±0,49 <0,01

Аномалии количества 0,12 ±0,08 1,25 ±0,28 <0,01

Примечания: m - стандартная ошибка доли, п - число наблюдений, р - достоверность различий между группами.

При рассмотрении различных видов патологии шеечного отдела сперматозоидов, в группе I обнаружено более высокое содержание сперматозоидов с аномально короткими (0,65% против 0,01%, р=0,01) и искривленными шейками (8,91% против 6,88%, р<0,05). Однако, в группе с успешными переносами чаще встречались сперматозоиды с аномалиями прикрепления шейки к головке (15,25% против 10,99%, р<0,01).

, Из различных видов аномалии хвостового отдела статистически достоверное различие (р<0,01) между группами наблюдалось лишь по числу сперматозоидов с аномальным количеством жгутиков, которых в группе II было в.7,3 раза больше.

Для определения степени поражения разных отделов сперматозоидов были введены индексы множественных аномалий каждого из отделов, учитывающие характер их поражения. Для головки принимали в расчет аномалии размера, формы, количества, акросомальной области, наличие вакуолей (возможные значения индекса множественных аномалий головки - ИМАГ = 1-5); для шейки - аномалии размера, формы, количества, прикрепления к головке, наличие цито-плазматической капли (индекс множественных аномалий шейки ИМАШ = 1-5), для хвоста - аномалии размера, формы, количества, наличие патологических изгибов и скрученности (индекс множественных аномалий хвоста ИМАХ = 1-4). Индексы множественных аномалий рассчитывали как отношение числа патологий данного отдела сперматозоида к количеству сперматозоидов с аномалиями этого отдела.

ИМАГ был выше в группе пациенток, у которых наступила беременность. ИМАШ как показатель тяжести поражения шеечного отдела оказался выше в группе I, что свидетельствует о существенном значении аномалий шеечного отдела для эмбриогенеза (таблица 2).

Для определения доминирующей аномалии сперматозоидов подсчитывали частоту встречаемости отдельных видов аномалии и их сочетаний у каждого пациента. Для этого был разработан алгоритм, согласно которому каждому виду аномалии по ВОЗ (грушевидные, гантелевидные, округлые и т. д.) присваивали свой математический

Таблица 2

Индексы множественных аномалий головки (ИМАГ) и шейки (ИМАШ) у супругов пациенток с безуспешным переносом эмбрионов (группа I) и с зарегистрированной имплантацией (группа II) (М±т)

Индекс Группа I п Группа II п Р

ИМАГ 1,713 ±0,019 1304 1,883 ±0,020 1401 <0,01

ИМАШ 1,178 ±0,012 1121 1,134 ±0,012 846 <0,05

Примечания: т - стандартная ошибка средней, п - число наблюдений, р - достоверность различий между группами.

порядок (единицы, десятки, сотни и т.д.), после чего значения суммировали, и по полученному числу можно было судить о наборе аномалий у каждого сперматозоида. Например, показатель 10100 означал сперматозоид с аномально маленькой головкой и дефектом акросомы (которым соответствовала единица) и нормальные значения остальных параметров (которым соответствовал «0»). Аномалии шейки и хвоста кодировали по аналогичному принципу, но с множителями 2 и 4, соответственно, чтобы показатели можно было складывать. Например, показатель 300 означал сперматозоид с малыми размерами головки и аномальным прикреплением шейки (100+200) при нормальных значениях остальных параметров.

При сравнении доминирующих аномалий разных отделов сперматозоидов между исследуемыми группами выявлено, что в группе с зарегистрированной имплантацией доминирующей аномалией головок (ДАГС) является удлиненная форма головки в сочетании с аномалией акросомы. Частота ее встречаемости составила 14,28%, что на 3,72% больше, чем относительное количество сперматозоидов со вторым по частоте сочетанием дефектов головок (маленький размер в сочетании с аномалией акросомы) (р<0,01). В группе без имплантации доминировали сразу несколько сочетанных аномалий, частота встречаемости которых была достоверно выше, чем в группе II (р<0,05): сперматозоиды с головками малых размеров в сочетании с аномалией акросомы (14,04% против 10,56%), с головками удлиненной формы (10,85% против 8,35%), грушевидной формы (10,71% против 7,99%), а также с аномалией акросомы как единственным дефектом (9,84% против 6,78), что говорит о возможном снижении оплодотворяющей способности сперматозоидов с этими дефектами, или о роли таких отклонений как индикаторов тяжелого нарушения сперматогенеза, которое может затрагивать и морфологически нормальные сперматозоиды на субмикроскопическом уровне. Так или иначе, относительное количество этих форм свыше 12,26%, 9,27%, 9,14%, и 8,34%, соответственно (по нижним границам 95% доверительных интервалов в группе без имплантации), может считаться неблагоприятным прогностическим признаком при производстве ИКСИ. Более высокая частота сперматозоидов с утолщенными искривленными шейками (более 3,93%) в группе без имплантации также позволяет отнести этот признак к числу неблагоприятных.

Морфометрический анализ сперматозоидов. Количественные показатели, имеющие клиническую значимость при проведении ИКСИ.

По результатам морфометрической оценки сперматозоидов с использованием нормативных величин, рекомендованных ВОЗ, сперматозоиды были разделены на две группы: с головками, соответствующими нормативным параметрам ВОЗ, и не соответствующими им. На основании нормативных значений, рекомендованных ВОЗ, были рассчитаны нормативы по дополнительным параметрам, позволяющим количественно выразить степень отклонения формы головки от правильного эллипса с ровными контурами, по размерам соответствующего головке нормального сперматозоида:

- площадь головки, соответствующий нормативный интервал 7,85-13,75 мкм2;

- периметр головки, соответствующий нормативный интервал 10,21-13,35 мкм;

- отношение периметра к площади, соответствующий нормативный интервал 0,97-1,3.

Кроме того, в соответствии с определенными ВОЗ нормальными значениями большой и малой осей головки сперматозоида, диапазон допустимых значений отношения длины к ширине был расширен до 1,42-1,75, поскольку при минимально допустимой величине малой оси (3,5 мкм) максимально допустимое значение большой оси (5 мкм) возможно лишь при их соотношении, равном 1,42.

Определили величины фактора формы круга, фактора формы эллипса, округлости и отношения периметра к площади - введенных нами параметров, позволяющих дать количественную характеристику форме сперматозоидов, - и сравнили их величины между группами сперматозоидов, соответствующих и не соответствующих строгим критериям Крюгера. Выявленные статистически достоверные различия между группами позволили определить величины, соответствующие значениям между 5-м и 95-м процентилями и характеризующие сперматозоиды, форма которых была признана соответствующей критериям Крюгера при качественной оценке. Для фактора формы круга интервал этих величин составил 0,884-0,979 отн. ед., для фактора формы эллипса 0,995-0,999 отн. ед., и для округлости 0,5880,713 отн. ед.

Кроме того, была проведена компьютерная оценка отделов головок сперматозоидов - акросомы и ядра. Для акросом были определены интервалы (границами которых служили 5-й и 95-й процентили для сперматозоидов, оцененных как нормальные) по следующим параметрам, характеризующим их размеры и форму: периметр (7,4210,15 мкм), большая ось (2,59-3,30 мкм), малая ось (1,89-2,83 мкм), отношение малой оси к большой (0,66-0,93), отношение периметра к площади (1,43-1,99), фактор формы круга (0,746-0,953 отн. ед.), фактор формы эллипса (0,946-0,983 отн. ед.) и округлость (0,605-0,805 отн. ед.). Для ядра: периметр (7,56-10,1 мкм), большая ось (2,53-3,28 мкм), малая ось (1,95-2,82 мкм), отношение малой оси к большой (0,70-0,95), отношение периметра к площади (1,46-2,02). Полученные показатели могут быть использованы при автоматическом компьютерном морфологическом анализе сперматозоидов.

При подсчете относительного количества сперматозоидов, соответствующих перечисленным новым критериям, в группах пациенток, у которых перенос эмбрионов не привел к наступлению беременности (группа I) и пациенток, у которых наступление имплантации было зарегистрировано по данным УЗИ (группа II), была обнаружена меньшая частота встречаемости сперматозоидов с нормальным отношением периметра акросомы к ее площади в группе I (46,42% против 52,84% в группе забеременевших). В то же время, сперматозоидов с нормальным фактором круга было меньше в группе II (39,92% против 46,17%).

При сравнении данных, полученных при компьютерной морфологической оценке головок сперматозоидов в группах пациенток с произошедшей имплантацией и без имплантации, получены достоверные различия в значениях фактора формы круга, округлости, длины головки и соотношения большой и малой осей (таблица 3).

Границы, установленные по 5-му и 95-му процентилям в группе забеременевших, оказались шире, чем установленные на основе качественной оценки сперматозоидов: фактор формы круга 0,691-0,986; округлость 0,397-0,775; большая ось 3,85-6,77 мкм; отношение большая/малая ось 1,29-2,63. Характер распределений в обеих группах схож, но для фактора формы круга характерен сдвиг в сторону больших величин в группе без имплантации.

Таблица 3

Значения показателей количественной оценки формы головок сперматозоидов (М±о) у супругов пациенток с безуспешным переносом эмбрионов (группа I, n=1177) и с зарегистрированной имплантацией (группа II, n=508)

Параметр Группа I Группа II Р

Площадь, мкм2 11,19±3,16 11,06 ±2,52 >0,1

Периметр, мкм 12,61 ±2,11 12,66 ±1,82 >0,1

Фактор формы круга 0,882 ±0,093 0,867 ±0,093 <0,01

Фактор формы эллипса 0,993 ±0,009 0,993 ±0,007 >0,1

Округлость 0,605 ±0,126 0,580 ±0,116 <0,01

Большая ось, мкм 4,90 ±1,03 5,02 ±0,90 <0,05

Малая ось, мкм 2,86 ±0,42 2,82 ±0,39 0,06

Большая/малая ось 1,74 ±0,43 1,81 ±0,42 <0,01

Примечания: - среднеквадратическое отклонение, - число наблюдений, р - достоверность различий между группами.

По различиям в величинах, полученных при морфометрической оценке акросом, также было возможно выделить границы, соответствующие 5-му и 95-му процентилям в группе забеременевших: фактор формы круга 0,683-0,964; фактор формы эллипса 0,926-0,990 отн. ед.; округлость 0,425-0,830 отн. ед.; малая ось 3,85-6,77 мкм; отношение малая/большая ось 0,48-0,94; процент площади от площади всей головки 15,53-60,64.

При оценке распределения частот различных видов патологии головок и шеек сперматозоидов в исследуемых группах обнаружена тенденция к повышенному содержанию сперматозоидов с аномальными акросомами в группе без имплантации (53,2% против 48,3%, р=0,06).

Оценка доминирующих комбинированных аномалий различных отделов сперматозоидов производилась по морфометрическим нормативам ВОЗ и по предложенным нами показателям количественной оценки формы сперматозоидов (фактор формы круга, фактор формы эллипса, округлость, отношение периметра к площади).

При применении нормативов ВОЗ достоверных различий по доминирующим аномалиям обнаружено не было. При оценке с помощью предложенных нами интервалов параметров для количественной

оценки формы сперматозоидов обнаружена более высокая частота встречаемости сперматозоидов с сочетанием отклонений по параметрам фактор формы круга + округлость + периметр + длина + ширина + отношение 'периметр акросомы / площадь акросомы' в группе с произошедшей имплантацией (3,43% против 1,55%, р<0,05), что свидетельствует о меньшем влиянии этой комбинации морфологических дефектов на оплодотворяющую способность сперматозоида, или о том, что эта комбинация манифестирует менее тяжелые формы общего нарушения сперматогенеза. По остальным комбинированным формам достоверных различий не обнаружено.

Полученные данные позволяют дополнить объективную морфо-метрическую оценку сперматозоидов параметрами, характеризующими форму головки сперматозоида (фактор формы круга, фактор формы эллипса, округлость, отношение периметра к площади), которые имеют особую значимость в случаях применения ИКСИ.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты работы свидетельствуют о ценности интегральной морфологической оценки эякулята как прогностического критерия при проведении ИКСИ, однако эта оценка имеет существенные отличия от общепринятой методики, применяемой для прогнозирования при естественном оплодотворении и ЭКО. Обнаружен ряд выраженных структурных аномалий головок сперматозоидов, частота которых положительно коррелирует с частотой имплантации эмбрионов. Это может быть связано с особенностями выбора сперматозоида для инъекции при повышенной частоте таких аномалий в эякуляте. Предложены новые параметры оценки, один из которых - фактор формы круга головки сперматозоида - имеет независимое значение для прогнозирования успешности ИКСИ. Показаны отклонения в структуре сперматозоидов, не снижающие их оплодотворяющий потенциал при интрацитоплазматической инъекции, за счет чего предложены новые нормативные величины, применимые только в случаях ИКСИ. В то же время, выделены аномалии строения сперматозоидов (акросо-мального и шеечного отделов), повышенная частота которых в эякуляте является неблагоприятным признаком при ИКСИ. Определение доминирующей комбинированной аномалии сперматозоидов в эякуляте не имеет клинического значения.

Определены морфометрические параметры, которые дополняют критерии ВОЗ и могут быть использованы при компьютерном морфологическом анализе сперматозоидов при ЭКО, поскольку предоставляют возможность оценки компьютером не только размеров, но и формы головки сперматозоида и ее частей (таблица 4).

Таблица 4

Морфометрические параметры, имеющие прогностическую значимость при лечении методом ЭКО

Объект морфометрии Величины, характеризующие сперматозоиды, форма которых была признана соответствующей критериям Крюгера при качественной оценке

Головки

Фактор формы круга 0,884-0,979

Фактор формы эллипса 0,995-0,999

Округлость 0,588-0,713

Отношение периметр/площадь 0,97-1,30

Акросомы

Периметр 7,42-10,15 мкм

Большая ось 2,59-3,30 мкм

Малая ось 1,89-2,83 мкм

Отношение малая/большая ось 0,66-0,93

Отношение периметр/площадь 1,43-1,99

Фактор формы круга 0,746-0,953

Фактор формы эллипса 0,946-0,983

Округлость 0,605-0,805

Ядра

Периметр 7,56-10,10 мкм

Большая ось 2,53-3,28 мкм

Малая ось 1,95-2,82 мкм

Отношение малая/большая ось 0,70-0,95

Отношение периметр/площадь 1,46-2,02

Кроме того, для использования в практической работе предложены следующие параметры, соответствующие 95%-ным довери-

тельным интервалам в группе с зарегистрированной имплантацией, как прогностически благоприятные в случаях ИКСИ (таблица 5).

Таблица 5

Морфометрические параметры, имеющие прогностическую значимость при лечении методом ИКСИ

Параметр Интервал

Индекс множественных аномалий шеечного отдела 1,11-1,16

Доля сперматозоидов с искривленными шейками не более 8,25%

Фактор формы круга головки 0,691-0,986

Округлость головки 0,397-0,775

Большая ось головки 3,85-6,77 мкм

Отношение большая/малая ось головки 1,29-2,63

Фактор формы круга акросомы 0,683-0,964

Фактор формы эллипса акросомы 0,926-0,990

Округлость акросомы 0,425-0,830

Малая ось акросомы 3,85-6,77 мкм

Отношение малая/большая ось акросомы 0,48-0,94

Относительная площадь акросомы 15,53-60,64% от площади головки

Доля сперматозоидов с отношением периметр/площадь акросомы, равным 1,46-2,02 не менее 48,36%

Из этих параметров, определение индекса множественных аномалий шейки и относительного количества сперматозоидов с искривленными шейками не требует специального оборудования и может быть использовано в повседневной практике. Для измерения остальных показателей необходимо применение методов морфометрии, в том числе с использованием вычислительной техники. Однако, они могут приблизительно быть оценены и визуально, что имеет значение для диагностики при невозможности морфометрии и для выбора сперматозоида непосредственно во время процедуры ИКСИ.

выводы

1. Критерии, полученные при качественной оценке строения сперматозоидов с использованием индекса Крюгера, в случаях применения метода классического экстракорпорального оплодотворения положительно коррелировали не только с частотой оплодотворения и качеством дробления эмбрионов, но и с качеством зигот, что расширяет возможности прогнозирования результатов лечения. Индекс те-ратозооспермии в этих случаях не имел значения.

2. В случаях применения метода интрацитоплазматической инъекции сперматозоида отмечена статистически значимая зависимость частоты имплантации от качественных морфологических характеристик сперматозоидов, причем корреляция с индексом Крюге-ра была отрицательной, а с индексом тератозооспермии - положительной, что следует использовать в практике для выбора метода оплодотворения.

3. Частота имплантации эмбрионов, полученных с помощью интрацитоплазматической инъекции сперматозоида, не только не снижается с повышением относительного количества сперматозоидов с ярко выраженными отклонениями головок от нормального строения (гантелевидные, аморфные, чрезмерно большие, вакуолизированные, с дефектами акросом и аномалиями количества, повышенные величины индекса множественных аномалий головки), но и положительно коррелирует с ним, что может быть связано с более успешной селекцией оператором сперматозоидов с минимальными нарушениями структурной организации для инъекции в ооцит.

4. Повышенная частота встречаемости некоторых дефектов шеечного отдела (искривление, укорочение) и увеличение индекса множественных аномалий шейки в группе с безуспешными попытками интрацитоплазматической инъекции свидетельствуют о снижении оплодотворяющей способности сперматозоидов с поврежденными шейками.

5. Определение доминирующей комплексной аномалии сперматозоидов по предложенным нами критериям в настоящее время не имеет клинического значения, но может найти применение при разработке автоматизированных компьютерных методов морфологического анализа спермы.

6. Определены дополняющие критерии Всемирной организации здравоохранения морфометрические параметры, численно характеризующие форму головки сперматозоида и ее частей (фактор формы круга, фактор формы эллипса, округлость, отношение «периметр/площадь», отношение «малая/большая ось»), одни из которых могут быть использованы при компьютерной морфологической оценке спермы при классическом экстракорпоральном оплодотворении, другие имеют диагностическую ценность только в случаях применения метода интрацитоплазматической инъекции сперматозоида. Эти критерии могут быть успешно использованы при качественном и количественном морфологическом анализе эякулята для эффективной диагностики мужского бесплодия и определения путей его преодоления.

Практические рекомендации. Обнаруженные особенности строения сперматозоидов и предложенные новые параметры их оценки позволяют использовать качественные и количественные методы интегрального морфологического анализа спермы для прогнозирования успешности ИКСИ и повышения эффективности микроманипуляции, а также могут быть положены в основу создания методов автоматизированной компьютерной морфометрии сперматозоидов для введения в практическую медицину. Введение результатов данной работы в клиническую практику будет способствовать более адекватному планированию тактики лечения методами вспомогательных репродуктивных технологий и в некоторых случаях позволит избежать необоснованного применения ИКСИ за счет обоснования применения ЭКО или использования донорской спермы. Это даст возможность повысить эффективность лечения бесплодия, уменьшить психоэмоциональную нагрузку на пациентов и снизить финансовые и временные затраты.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Зависимость успешности интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов от их морфологических особенностей / А.А. Бесков, А.Г. Маркдорф, Д.С. Бронештер, А.Ю. Высоцкий, В.А. Шкурупий // Проблемы репродукции.-2003.-№5.-С.35.

2. Влияние морфологических характеристик сперматозоидов, пронуклеусов и эмбрионов на результаты лечения бесплодия методом

экстракорпорального оплодотворения / А.Ю. Высоцкий, А.А. Бесков, Д.С. Бронештер, А.Г. Маркдорф, ВА Шкурупий. // Проблемы репро-дукции.-2003 -№5.-С.37.

3. Особенности стимуляции суперовуляции и экстракорпорального оплодотворения, влияющие на качество дробления эмбрионов In vitro / А.Ю. Высоцкий, А.А. Бесков, Д.С. Бронештер, А.Г. Маркдорф, В.А. Шкурупий //Проблемы репродукции.-2003.-№5.-С.36-37.

4. Strict morphology of spermatozoa have discordant predictive value for ICSI and conventional IVF / A.A. Beskov, A.G. Markdorf, A.Y. Vy-sotsky, D.S. Broneshter, V.A. Shkurupy // Reproductive Biomedicine Online.-2003.-Vol.7,Suppl.l.-P.21.

5. Морфологическая оценка сперматозоидов как критерий прогнозирования успешности применения вспомогательных репродуктивных технологий / А.А. Бесков, В.А. Шкурупий, А.Ю. Высоцкий, Д.С. Бронештер, Т.А. Негуляева // Сибирский консилиум.-2004.-№1(31).-С. 39-44.

6. Роль оценки качества зигот и эмбрионов в прогнозировании успешности экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов / А.Ю. Высоцкий, В.А Шкурупий, А.А. Бесков, Д.С. Бронештер, А.Г. Маркдорф // Сибирский консилиум.-2004.-№1(31).-С. 3438.

7. Vysotski A.Y. Morphology of spermatozoa affects human embryo quality in vitro depending on the method of fertilization / A.Y. Vysotski, A.A. Beskov, A.G. Markdorf, D.S. Broneshter //American Society of An-drology: 29th Annual Meeting. April 17-20, 2004, Baltimore, Maryland, Program and Abstracts.-2004.-P.62.

8. Vysotski A.Y. The impact of genital infection on human spermatozoa assessed by spermograms, including strict morphological analysis, and the outcome of in vitro fertilization / A.Y. Vysotski, A.A. Beskov, A.G. Markdorf, D.S. Broneshter // American Society of Andrology: 29th Annual Meeting. April 17-20, 2004, Baltimore, Maryland, Program and Ab-stracts.-P.62.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ДАГС -доминирующая аномалия головок сперматозоидов

ИК - индекс Крюгера

ИКСИ - интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида ИМАГ - индекс множественных аномалий головок сперматозоидов

ИМАХ - индекс множественных аномалий хвостового отдела сперматозоидов

ИМАШ - индекс множественных аномалий шеечного отдела сперматозоидов

ИТЗ - индекс тератозооспермии

Отн. ед. - относительные единицы

УЗИ - ультразвуковое исследование

ЭКО - классическое экстракорпоральное оплодотворение

Подписано в печать 14.05.2005. Формат 60x84/16. Объем 1 п.л. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ № 14. Отпечатано: РА «ПАРАГРАФ», г. Барнаул, пр. Ленина, 40, каб. 334,тел.: (385-2) 366-143 Лицензия на полиграфическую деятельность ПД 12-061 от 04.01.2002 г

15 ь.'ОЛ 2CG5

К-

670

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Бесков, Артем Александрович

Список принятых сокращений

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1 .Цитологическая и физиологическая характеристика особенностей сперматозоидов человека в норме и при вариантах патологии

1.2.Использование компьютерных технологий в морфологическом анализе сперматозоидов

ГЛАВА 2. Материал и методы исследования

2.1. Характеристика пациентов

2.2. Методы исследования

ГЛАВА 3. Качественные морфологические и функциональные характеристики сперматозоидов, влияющие на успешность обычного экстракорпорального оплодотворения и с применением интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов

ГЛАВА 4. Анализ качественных морфологических параметров сперматозоидов с использованием индексов множественных аномалий

ГЛАВА 5. Морфометрический анализ сперматозоидов. Количественные показатели, имеющие клиническую значимость при проведении интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов

ГЛАВА 6. Общее заключение 103 Выводы 113 Внедрение результатов в практику 114 Список использованной литературы

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения ВРТ- вспомогательные репродуктивные технологии ДАГС - доминирующая аномалия головок сперматозоидов ДАС - доминирующая аномалия сперматозоидов ДИ - доверительный интервал ИК - индекс Крюгера

ИКСИ - интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в яйцеклетку

ИМАГ - индекс множественных аномалий головки сперматозоида

ИМАХ — индекс множественных аномалий хвоста сперматозоида

ИМАШ - индекс множественных аномалий шейки сперматозоида

ИТЗ - индекс тератозооспермии

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛГ - лютеинизирующий гормон

Отн. ед. - относительные единицы

ПВП - поливинилпирролидон

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТЗ - трийодтиронип

Т4 - тетрайодтиронин

ТТГ - тиреотропный гормон

УЗИ - ультразвуковое исследование

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

ЧИ - частота имплантации

ЧНБ - частота наступления беременности

40 - частота оплодотворения

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение без микроманипуляций

Введение Диссертация по биологии, на тему "Варианты строения сперматозоидов человека в норме и при патологии, критерии прогнозирования успешности экстракорпорального оплодотворения и дифференцированного подхода к диагностике и лечению мужского"

Актуальность темы. Количество бесплодных супружеских пар в России достигает 12-15%, что, по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), сопоставимо с распространенностью бесплодия в мире (Кулаков В.И., Леонов Б.В., 2000). Демографическая обстановка, сложившаяся в нашей стране, усугубляет проблему бесплодия. За последние 11 лет население Российской Федерации сократилось на 1,5%, и темпы убыли населения нарастают (Институт народнохозяйственного прогнозирования РАН. Центр демографии и экологии человека, 2001). Южный федеральный округ занимает одно из ведущих мест в России по показателю убыли населения, который в 2001 году составил 0,8% (Институт народнохозяйственного прогнозирования РАН, 2002). Кроме того, невозможность иметь ребенка приводит к тяжелой личной психической травме, результатом которой может быть расторжение брака и нарушение социальной адаптации.

При изучении структуры бесплодия ВОЗ определила мужской фактор более чем в половине случаев (World Health Organization, 1987). Данные многих работ свидетельствуют о прогрессирующем снижении качества спермы в мире (Carlsen Е. etal., 1992).

Качество сперматозоидов является важным показателем мужской фертиль-ности, и поэтому их объективная оценка играет одну из ключевых ролей в обеспечении успешности методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Наибольшее распространение получил анализ морфологии сперматозоидов по строгим критериям, разработанным Kruger и соавт. (Kmger T.F. et al., 1986). Для повышения информативности разработаны индексы множественных дефектов сперматозоидов (Jouannet P. et al., 1988; Aziz N. et al., 1996). Предполагается, что морфологический дефект прямо сопряжен с функциональной неполноценностью сперматозоида (Katz D. et al., 1996; Oehninger S. et al., 1994), и, вероятно, то или иное нарушение функции связано с определенным видом морфологической аномалии. Следовательно, разные морфологические дефекты могут иметь разное прогностическое значение для оплодотворения методами классического экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ). Однако, современная классификация аномалий сперматозоидов не позволяет выделить формы, имеющие отрицательную или положительную связь с частотой оплодотворения тем или иным методом и последующим развитием эмбрионов. Этим могут быть обусловлены и противоречия в данных литературы по вопросам преимущества ЭКО или ИКСИ в разных клинических ситуациях. Поэтому более дифференцированный подход к выбору метода ВРТ, основанный на точной морфологической оценке мужских гамет, возможно, позволит избежать слишком частого и неоправданного применения ИКСИ, которое имеет тенденцию к расширению показаний. К тому же, изучение связи морфологии сперматозоидов с успешностью ИКСИ может способствовать повышению эффективности самой микроманигтуляции. Морфологические характеристики являются определяющими при выборе сперматозоида для инъекции в яйцеклетку, но зависимость успешности операции от структурных особенностей вводимого сперматозоида еще предстоит изучить. Зная влияние той или иной морфологической аномалии на результат ИКСИ, можно делать выбор сперматозоида для инъекции в яйцеклетку более обоснованно.

Большинство классификаций морфологических дефектов сперматозоидов, предложенных до сегодняшнего дня, основывается на качественной характеристике их формы. Использование более сложных и трудоемких способов оценки нецелесообразно в повседневной лабораторной практике, но необходимо для фундаментального изучения связи строения сперматозоида с его функциональной компетентностью. Поэтому для разработки критериев, позволяющих оптимизировать процедуру ИКСИ, необходимо, на основе точных количественных методов1 анализа, выявить прогностически ценные морфологические параметры, которые могут быть оценены и без использования дополнительных средств. Компьютерная мор-фометрия является высокоточным, воспроизводимым и стандартизованным методом, позволяющим количественно выразить структурные характеристики объекта и доказательно обосновать или отвергнуть значимость качественных оценочных критериев.

Цель исследования: Изучить варианты строения сперматозоидов человека в норме и при патологии и определить наиболее информативные интегральные морфологические критерии для прогнозирования успешности лечения бесплодия при применении вспомогательных репродуктивных технологий.

Задачи исследования:

1. Выявить качественные морфологические характеристики сперматозоидов, влияющие на успешность экстракорпорального оплодотворения и интра-цитоплазматической инъекции в яйцеклетку.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Выявлены особенности морфологической оценки сперматозоидов при подготовке и проведении лечения бесплодия методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида, учет которых способствует повышению его эффективности. Установлены критерии оценки структур, которые обеспечивают прогнозирование успешности интрацитоплазматической инъекции сперматозоида. Обнаружена связь между качественной характеристикой строения сперматозоидов и качеством зигот, полученных при классическом экстракорпоральном оплодотворении. Выявлены параллели между параметрами качественного и количественного морфологического анализа сперматозоидов. Определены количественные параметры, характеризующие форму головки сперматозоида и, таким образом, адаптирующие методику качественного анализа для морфометрического компьютерного исследования спермы.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Знание структурных особенностей сперматозоидов, влияющих на развитие эмбрионов после интрацитоплазматической инъекции, позволит повысить эффективность лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий за счет улучшения результатов микроманипуляции и более глубокого и дифференцированного подхода к диагностике мужского бесплодия на уровне эмбриологической лаборатории. Выявленные морфометрические параметры сперматозоидов, имеющие прогностическое значение, будут способствовать увеличению надежности автоматизированного морфологического анализа спермы и скорейшему его распространению в лабораторной практике с целью стандартизации результатов исследования.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

2. Оценка некоторых структурных особенностей сперматозоидов, отражающих их функциональное состояние — фактора формы круга головки, индекса множественных аномалий шеечного отдела, доли сперматозоидов с искривленными шейками, округлости головки, большой оси головки, отношения «большая/малая ось головки», фактора формы круга акросомы, фактора формы эллипса акросомы, округлости акросомы, малой оси акросомы, отношения «малая/большая ось акросомы», относительной площади акросомы, отношения «периметр/площадь акросомы» - должна быть дифференцированной при прогнозировании успешности лечения бесплодия методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида и методом классического экстракорпорального оплодотворения.

3. Благодаря выявленным параллелям с морфометрическими параметрами сперматозоидов (фактором формы круга головки фактором формы круга акросомы, фактором формы эллипса акросомы), качественные признаки формы головки сперматозоида и акросомы являются значимыми при прогнозировании успешности интрацитоплазматической инъекции сперматозоида.

- 9

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Бесков, Артем Александрович

выводы

1. Критерии, полученные при качественной оценке строения сперматозоидов с использованием индекса Крюгера, в случаях применения метода ЭКО положительно коррелировали не только с частотой оплодотворения и качеством дробления эмбрионов, но и с качеством зигот, что расширяет возможности прогнозирования результатов лечения. Индекс тератозооспермии в этих случаях не имел значения.

2. В случаях применения метода ИКСИ отмечена статистически значимая зависимость частоты имплантации от качественных морфологических характеристик сперматозоидов, причем корреляция с индексом Крюгера была отрицательной, а с индексом тератозооспермии - положительной, что следует использовать в практике для выбора метода оплодотворения.

3. Частота имплантации эмбрионов, полученных с помощью ИКСИ, не только не снижается с повышением относительного количества сперматозоидов с ярко выраженными отклонениями головок от нормального строения (гантелевидные, аморфные, чрезмерно большие, вакуолизированные, с дефектами акросом и аномалиями количества, повышенные величины индекса множественных аномалий головки), но и положительно коррелирует с ним, что может быть связано с более успешной селекцией оператором сперматозоидов с минимальными нарушениями структурной организации для инъекции в ооцит.

4. Повышенная частота встречаемости некоторых дефектов шеечного отдела (искривление, укорочение) и увеличение индекса множественных аномалий шейки в группе с безуспешными попытками ИКСИ свидетельствуют о снижении оплодотворяющей способности сперматозоидов с поврежденными шейками.

6. Определены дополняющие критерии ВОЗ морфометрические параметры, численно характеризующие форму головки сперматозоида и ее частей (фактор формы круга, фактор формы эллипса, округлость, отношение «периметр/площадь», отношение «малая/большая ось»), одни из которых могут быть использованы при компьютерной морфологической оценке спермы при ЭКО, другие имеют диагностическую ценность только в случаях применения метода ИКСИ. Эти критерии могут быть успешно использованы при качественном и количественном морфологическом анализе эякулята для эффективной диагностики мужского бесплодия и определения путей его преодоления.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ

Обнаруженные особенности строения сперматозоидов и предложенные новые параметры их оценки позволяют использовать качественные и количественные методы интегрального морфологического анализа спермы для прогнозирования успешности ИКСИ и повышения эффективности микроманипуляции, а также могут быть положены в основу создания методов автоматизированной компьютерной морфометрии сперматозоидов для введения в практическую медицину. Введение результатов данной работы в практику Российско-американского центра репродукции и генетики человека и Сибирского института репродукции и генетики человека способствует более адекватному планированию тактики лечения методами вспомогательных репродуктивных технологий и в некоторых случаях позволяет избежать необоснованного применения ИКСИ за счет обоснования применения ЭКО или использования донорской спермы. Это дает возможность повысить эффективность лечения бесплодия, уменьшить психоэмоциональную нагрузку на пациентов и снизить финансовые и временные затраты.

- 115

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Бесков, Артем Александрович, Новосибирск

1. Автандилов Г.Г. Морфометрия в патологии. М.: Медицина, 1973.248 с.

2. Автандилов Г.Г., Зукакова И.Б. К методике морфометрического исследования почек // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1975.-Т.80,-№7.-С. 122-124.

3. Автандилов Г.Г. Введение в количественную патологическую морфологию. М.: Медицина, 1980.-216 с.

4. Автандилов Г.Г., >1блучанский H.H., Губенко В.Г. Системная стереометрия в изучении патологического процесса. — М.: Медицина, 1981.— 192 с.

5. Автандилов Г.Г., Невзоров В.П., Невзорова О.Ф. Системный стереометрический анализ ультраструктур клеток. Кишинев: Штиинца, 1984.-186 с.

6. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. М.: Медицина, 1990.— 384 с.

7. Авцын А.П., Шахламов В.А. Ультраструктурные основы патологии клетки. -М.: Медицина, 1979.-320 с.

8. Алов И.А., Брауде А.И., Аспиз М.Е. Основы функциональной морфологии клетки. М.: Медицина, 1969.-344 с.

9. Артифексов С.Б., Рыжаков Д.И. Диагностика и лечение заболеваний половой сферы у мужчин. Нижний Новгород: Изд-во Нижегородской гос. медицинской академии, 2003.-236 с.

10. Ю.Бонашевская Т.И., Беляева H.H., Кумпан Н.Б., Панасюк JT.B. Морфо-функционалъные исследования в гигиене. М.: Медицина, 1984.-160 с.

11. Васильев Г., Гуски X., Лушников Е.Ф., Загребин В.М. Основы морфо-метрии и ее применение в световой и электронной микроскопии // Арх. патологии-1977.-Т.39.-№9-С.80-87.

12. Воробьева O.A., Корсак B.C., Леонтьева O.A. Влияние морфологии сперматозоидов на частоту оплодотворения и нарушения развития эмбрионов в программе ЭКО // Цитология. 1996.-Т.38.-№2.-С. 12481254.

13. З.Воробьева O.A., Скрипкина O.A., Корсак B.C. Методы оценки сперматозоидов и их прогностическое значение в программе ЭКО // Пробл. репрод. 1995.-Т. 1.-№3.-С.71-76.

14. Н.Воробьева O.A., Филатов М.В., Леонтьева O.A. Значение анализа организации хроматина ядер сперматозоидов в диагностике мужского бесплодия // Пробл. репрод. 1997.-Т,3.-№4.-С.23-26.

15. Герке П.Я. Исследование семени как метод определения плодовитости человека // Вопросы морфологии и физиологии. Рига, 1956.—№11.— С.227.

16. Гистология / Под ред. Афанасьева Ю.И., Юриной H.A.; М.: Медицина, 2001.-744 с.

17. Глаголев A.A. Геометрические методы количественного анализа агрегатов под микроскопом. Львов: Госгеолитиздат, 1941.-82 с.

18. Гулькевич Ю.В., Лазюк Г.И., Гулькевич K.IO. Каузальный генез уродств и специфичность тератогенного воздействия // Арх. пат.— 1960.-№12.-С.З.

19. Гуцол A.A., Кондратьев Б.Ю. Практическая морфометрия органов и тканей. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1988.-136 с.

20. Джарбусынов Б.У. Мужское бесплодие. Алма-Ата: Казахстан, 1991.— 200 с.

21. Дроздов А.Л., Иванков В.II. Морфология гамет животных. Значение для систематики и филогенетики. М.: Круглый год, 2000.-460 с.

22. Дыбан А.П. Очерки патологической анатомии человека. — М.:1959.23.3инкович И.И. Постнатальный морфогенез печени в норме и при стафилококковой инфекции: Дис. . канд. мед. наук. Донецк, 1983 -168 с.

23. Исаков В.JI., Пинчук В.Г., Исакова JI.M. Современные методы автоматизации цитологических исследований. Киев: Наук, думка, 1988 — 216 с.

24. Каган С.А. Патология сперматогенеза. — JI.: Медицина, 1969.-215 с.

25. Кагап С.А., Машапский В.Ф., Тиктинский O.JT., Кочура Г.М., Михай-личенко В.В., Скрябин Г.Н., Екимов М.В., Сизов М.Г. Новые данные об ультраструктуре сперматозоонов при некоторых формах патоспер-мии //Урология и нефрология-1987.—№1.-С.5 1-53.

26. Калмыков К.Ф., Вервильский Б.М. К вопросу окраски сперматозоидов быка // Лаб. практика-193 7.-№5.-С.4.

27. Кальницкая Ф.С. К вопросу бесплодия // Сб. науч. тр. Ташкентского мед. ии-та. Ташкент, 1961.-Вып.18.-С.291.

28. Коваль В.П. К вопросу о прижизненном микроскопическом строении сперматозоида человека // Цитология.-1963.-Т.5.-№4.-С.449.

29. Коваль В.П. Изменение морфофункциональньтх свойств сперматозоидов мужчин при нарушениях нормального течения беременности у их жен // Тезисы докладов межобластной конференции акушеров-гинекологов и педиатров палат новорожденных. Львов, 1965 -С. 107.

30. Коваль В.П. Люминесцентная и аноптральная микроскопия сперматозоидов человека при некоторых формах мужского бесплодия: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Львов, 1969.

31. Коденцова В.М., Вржесипская O.A., Спиричев В.Б. Мужская фертиль-ность: возможная роль витаминов // Украинский биохимический журнал. 1994.-№66.-С. 17-22.

32. Комарова М.В. Характеристика эякулята в оценке репродуктивных возможностей человека: Дис. . канд. мед. наук. Самара, 1999.-145 с.

33. Контактные инфекции, передающиеся половым путем / Под ред. Мав-рова И.И.; Киев: Здоровья, 1989.-384 с.

34. Концепция демографического развития Российской Федерации на период до 2015 года / Собрание законодательства РФ 2000—№ 2.

35. Кошевой Ю.В., Лежнев Э.И., Макарова О.П. Прижизненная морфомет-рия клеток. -М.: Наука, 1977.-129 с.

36. Кунин М.А. Исследование спермы при бесплодном браке. Воронеж: Изд-во ВГУ, 1968.-1 12 с.

37. Кунин М.А. Бесплодие в браке. М.: Медицина, 1973.-232 с.

38. Кузьмичев Л.Н., Кулаков В.И., Леонов Б.В. Экстракорпоральное оплодотворение: отбор, подготовка и тактика ведения больных. М.: Мир, 2001.-165 с.40Лакин Г.Ф. Биометрия. -М.: Высшая школа, 1968.-284 с.

39. Леонтьева O.A., Воробьева O.A. Сравнительный анализ морфологии сперматозоидов человека: нативный эякулят прогрессивно подвижная фракция //Пробл. репрод. - 1999.-Т.5-№3.-С.29-36.

40. Леонтюк A.C., Леонтюк Л.А., Сыкало А.И. Информационный анализ в морфологических исследованиях. Минск: Наука и техника, 1981.160 с.

41. Молнар Е. Общая сперматология. Будапешт: Изд-во АН Венгрии, 1969.-294 с.

42. Морголина М.Т. Семя // Руководство по лабораторным методам исследования / Предтеченский В.Е., Боровская В.М., Морголииа Л.Т. М., 1940.-С.452.

43. Морозов П.Г. Мужское бесплодие: прецизионная диагностика. Кишинев: Штиинца, 1990.-88 с.

44. Население России 2001. Девятый ежегодный демографический доклад / Ответственный редактор А.Г. Вишневский. Институт народнохозяйственного прогнозирования РАН. Центр демографии и экологии человека. М., 2002.

45. Непомнящих JT.M., Лушникова Е.Л., Непомнящих Г.И. Морфометрия и етереология гипертрофии сердца. Новосибирск: Наука, 1986.-304 с.49.0нищенко Г.Е. Центриолярный и центросомный циклы при дифферен-цировке и патологии. М.: Наука, 1993.-256 с.

46. Перов Ю.Л. Морфометрическое изучение почки в норме и при патологии: возможности и ограничения // Арх. патологии—1984—Т.46—№7 — С.78-84.5 1 .Плохинский H.A. Биометрия. -М.: Изд-во МГУ, 1970.-367 с.

47. Порудоминский И.М. Половые расстройства у мужчин. М., 1968.280 с.

48. Рубенков A.A. Ценное достижение в технике одновременного подсчета нормальных и патологических сперматозоидов // Животноводство.— 1959.-№2.-С.64.

49. Руденко A.B. Бесплодие у мужчин как следствие микоплазма-инфекции // Актуальные вопросы сексопатологии.-Киев, 1984.-С.31.

50. Руководство по гистологии. В 2 т. T.II / Под ред. Данилова Р.К., Быкова В.Л., Одинцова И.А.; СПб.: Спецлит, 2001.-735 с.

51. Рыжаков Д.И., Артифексов С.Б. Мужское бесплодие и сексуальные дисфункции. Нижний Новгород: Изд-во Нижегородской гос. медицинской академии, 2002. - 308 с.

52. Рябов К.П. Гистология с основами эмбриологии. Мн.: Вышэйшая школа, 1990.-255 с.

53. Салтыков С.А. Стереометрическая металлография. М.: Металлургия, 1970.-376 с.

54. Серов В.В., Пауков B.C. Ультраструктурная патология. М.: Медицина, 1975.-432 с.

55. Соколовский И.И., Ойвадис Г., Абилов И. и др. О значении акросомы в оценке семени самцов // Животноводство-1981.-№9—С.46-47.

56. Стропус P.A., Тамашаускас К.А., Якубаускайте Б.Б. Применение точечного счета для количественного изучения нервных структур. — В кн.: Общин закономерности морфогенеза и регенерации. Каунас,1976.-С.68-69.

57. Струков А.И., Кактурский JI.B. О применении морфометрии в патологической анатомии // Арх. патологии-1979.-Т.41 .-№6.-С.З-9.

58. Ташкэ К. Введение в количественную цитогистологическую морфологию. Бухарест: Изд-во АН Румынии, 1980.-192 с.

59. Тиктинский О.Л., Новиков И.Ф., Михайличенко В.В. Заболевания половых органов у мужчин. JT.: Медицина, 1985.-296 с.

60. Тиктинский O.JL, Михайличенко В.В. Андрология. СПб.: Медиа Пресс, 1999.-464 с.

61. Умаров Т.Т. Состояние сперматогенеза у больных сахарным диабетом в возрастном аспекте // Мед. журн. Узбеки стана.-1975.-№12.

62. Чернявский К.С. Стереология в металловедении. М.: Металлургия,1977.-280 с.

63. Экстракорпоральное оплодотворение и его новые направления в лечении женского бесплодия / Под ред. Кулакова В.И., Леонова Б.В.; М.: Медицинское информационное агентство, 2000.-782 с.

64. Юнда И.Ф. Болезни мужских органов. К.: Здоровья, 1989.-272 с.

65. Юнда И.Ф., Иванюта Л.И., Илишинецкая Л.П. и др. Бесплодие в супружестве. Киев: Здоровья, 1990.-463 с.

66. Якубов A.C., Кац В.А. Современная морфометрия в электронной микроскопии биологических и медицинских объектов // Вестн. АМН СССР-1974-№12.-С.77-83.

67. Aitken R.J., Clarkson J.S. Significance of reactive oxygen species and antioxidants in defining the efficacy of sperm preparation techniques // J. An-drol.-1988.-№9.-P.367-376.

68. Alper M.M., Lee G.S., Seibel M.M. et al. The relationship of semen parameters to fertilization in patients participating in a program of in vitro fertilization //J. In Vitro Feitil. Embryo Transfer. 1985.-№2.-P.217-223.

69. Angelopoulos T. et al. Simultaneous assessment of sperm chromatin condensation and morphology before and after separation procedures: effect on the clinical outcome after in vitro fertilization // Fertil. Steril.—1998.— Vol.69.-P.740-747.

70. Ao A., Erickson R.P., Winston R.M.L., Handyside A.H. Transcription of paternal Y-linked genes in the human zygote as early as the pronucleate stage // Zygote.-l 994,-VoI.2.-P.281 -287.

71. Avery S., Marriott V., Mason B. et al. An assessment of efficiency of various sperm preparation techniques / Presented at the Vth World Congress on I VF and ET, Norfolk, Virginia. Program Suppl. 1987.-№85.-P.58.

72. Aziz N., Buchan I., Taylor C. et al. The sperm deformity index: a reliable predictor of the outcome of oocyte fertilization in vitro // Fertil. Steril.— 1996.-Vol.66.-P. 1000-1008.

73. Aziz N., Saleh R.A., Sharma R.K. et al. Novel association between sperm reactive oxygen species production, sperm morphological defects, and the sperm deformity index // Fertil. Steril.-2004.-Vol.81-№2.-P.349-354.

74. Baccetti B., Renieri T., Rosati F. et al. Further observations on the morphogenesis of the round headed human spermatozoa // Andrologia-1977.-Vol.9.-P.255-264.

75. Baccetti B., Fraioli F., Paolucci D. et al. Double spermatozoa in a hyperprolactinemic man // J. Submicrosc. Cytol.-1978.-Vol.l0.-P.240-260.

76. Baccetti B., Burrini A.G., Collodel G. et al. Crater defect in human spermatozoa// Gamete Res.-1989.-Vol.22.-P.249-255.

77. Bartoov B., Eltes F., Lumenfeld E. et al. Sperm quality of subfertile males before and after treatment with human follicle-stimulating hormone // Fertil. Steril.-1994.-Vol.61.-P.727-733.

78. Bartoov B., Zabludovsky N., Eltes F. et al. Semen quality of workers exposed to ionizing radiation in decontamination work after the Chernobyl nuclear reactor accident // Int. J. Occup. Environ. Hcalth.-1997.-Vol.3.-P. 198203.

79. Bartoov B., Berkovitz A., Eltes F. et al. Real-time fine morphology of motile human sperm cells is associated with IVF-ICSI outcome // J. Androl-2002.-Vol.23.-P. 1-8.

80. Berkovitz A., Eltes F., Yaari S. et al. The morphological normalcy of the sperm nucleus and pregnancy rate of intracytoplasmic injection with morphologically selected sperm // Hum. Reprod.-2005.-Vol.20.-№1.-P.185-190.

81. Biljan M.M., Taylor C.T., Manasse P.R. et al. Evaluation of different sperm function tests as screening methods for male fertilization potential — the value of the sperm migration test // Fertil. Steril.-1994.-Vol.62.-P.591-598.

82. Bonduelle M., Liebaers I., Deketelaere V. et al. Neonatal data on a cohort of 2889 infants born after ICSI (1991-1999) and of 2995 infants born after IVF (1983-1999) //Hum. Reprod.-2002.-Vol. 17.-P.671-694.

83. Bostoffe E., Serup J., Rebbe H. Relation between morphologically abnormal spermatozoa and pregnancies obtained during a twenty-year follow-up period // Int. J. Androl.-1982.-Vol.5-P.379-386.

84. Braude P., Bolton V., Moore S. Human gene expression first occurs between the four and eight-cell stages of preimplantation development // Na-ture.-1988.-Vol.332.-P.459-461.

85. BuiTuel V.R., Yanagimachi R., Whitten W.K. Normal mice develop from oocytes injected with spermatozoa with grossly misshapen heads // Biol. Reprod.-1996.-Vol.55.-P.709-714.

86. Bustos-Obregon E., Diaz O., Sobarzo C. Parathion induces mouse germ cells apoptosis // Ital. J. Anat. Embryol.-2001.-Vol.106.-Suppl.2.-P. 199204.

87. Calvo L., Dennison-Lagos L., Bank, S.M. et al. Acrosome reaction induci-bility predicts fertilization success at in-vitro fertilization // Hum. Reprod.-1994.-Vol.9.-P. 1880-1886.

88. Camatini M., Franchi E., Faleri M. Ultrastructure of acrosomal malformations in men with obstructive azoospermia // Archs. Androl.-1978.-Vol. 1 .— P.203-209.

89. Carlsen E., Giwercman A., Keiding N. et al. Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years// Br. Med. J.-1992.~Vol.305.-P.609-613.

90. Carothers A.D., Beatty R.A. The recognition and incidence of haploid and polyploid spermatozoa in man, rabbit and mouse // J. Reprod. Fertil.—1975.— Vol.44.-P.487-500.

91. Chan S.Y.W., Wang C., Chan S.T.H. et al. Predictive value of sperm morphology and movement characteristics in the outcome of in vitro fertilization of human oocytes // J. in Vitro Fertil. Embryo Transfer- 1989.-Vol.6-№3.-P.142-148.

92. Cheines H. Phenotypes of sperm pathology: genetic and acquired forms in infertile men // J. Androl.-2000.-Vol.21 .-P.799-808.

93. Chcmes H., Brugo Olmedo S., Carrere C. et al. Ultrastructural pathology of the sperm flagellum. Association between flagellar pathology and fertility prognosis in severely asthenozoospermic men // Hum. Reprod.-1998.-Vol.13.-P.2521-2526.

94. Cheines H.E., Puigdomenech E.T., Carizza C. et al. Acephalic spermatozoa and abnormal development of the head-neck attachment. A human syndrome of genetic origin // Hum. Reprod.-l 999.-Vol. 14.-P. 1811-1818.

95. Cheines H.E., Rawe V.Y. Sperm pathology: a step beyond descriptive morphology. Origin, characterization and fertility potential of abnormal sperm phenotypes in infertile men // Hum. Reprod. Update.-2003.-Vol.9.-№5.-P.405-428.

96. Chen S.U. et al. Comparison between a two-layer discontinuous Per-coll gradient and swim-up for sperm preparation on normal and abnormal semen samples // Assist. Repros. Genet.-1995.-Vol.l2.-№10.-P.698-703.

97. Coetzee K., Kruger T.F., Lombard C.J. Predictive value of normal sperm morphology: a structured literature review // Hum. Reprod. Update.— 1998.-Vol.4.-№ 1 .-P.73-82.

98. Contreras H.R., Bustos-Obregon E. (1999) Morphological alterations in mouse testis by a single dose of malathion // J. Exp. Zool.-1999.-Vol.3-P.355-359.

99. Coskun S., Jaroudi K., AI-Hassan S. et al. Unexplained Infertility: ICSI or Not to ICSI // Fertil. Steril.-2000.-Vol.74.-№3.-Suppl.l.-P.S156.

100. Cui K.-H. Size differences between human X and Y spermatozoa and prefertilization diagnosis // Mol. Hum. Reprod.-1997.-Vol.3.-P.61-67.

101. Cutter E. Die mänliche Infertilität // Med. Wed. NY.-1886.-Vol.4-P.18.

102. David G., Bisson J.P., Czyglik F. et al. Anomalies morphologiques de spermatozoide humain. 1. Propositions pour un systeme de classification // J. Gynekol. Obstet. Biol. Reprod.-1975.-Vol.4.-Suppl.l.-P.17-36.

103. Davis R.O., Bain D.E., Siemers R.J. et al. Accuracy and precision of the CellForm-Human automated sperm morphometry instrument // Fertil. Steril.-l 992.-Vol.58.-P.76-79.

104. Davis R.O., Gravance C.G. Standardization of specimen preparation, staining and sampling methods improves automated sperm-head morphometry analysis//Fertil. Steril.-1993.-Vol.59.-P.412-417.

105. De Vos A., Van De Velde H., Joris H. et al. Influence of individual sperm morphology on fertilization, embryo morphology, and pregnancy outcome of intracytoplasmic sperm injection // Fertil. Steril.-2003.-Vol.79.-№l.-P.42-48.

106. Dittrich R., Maltaris T., Dragonas C. et al. Individual assessment of sperm morphology of single spermatozoa used for intracytoplasmic sperm injection // Andrologia.-2005.-Vol.37.-№ I .-P.53-56.

107. Eliasson R. Standards for investigation of human semen? // Androlo-gie.-1971 -Vol.3.-P.49-64.

108. Elizur S., Levron J., Seidman D. et al. Comparison of ICSI and conventional IVF on sibling oocytes in couples with or without mild male factor infertility // Fertil. Steril.-Vol.78.-№3.-Suppl. I.

109. ElJack A.H., Hrudka, F. (1979) Patterns and dynamics of teratospermia induced in rams by parenteral treatment with ethylene dibromide // J. Ultrastruct. Res.-1979.-Vol.67.-P.124-134.

110. Eningsu M.E., Dumoulin C.J.M., Pieters M.M.E.C. et al. Evaluation of human sperm morphology using strict criteria after Diff-Quik staining: correlation of morphology with fertilization in vitro // Hum. Reprod.-l 991 — Vol.6.-P.854-858.

111. Enginsu M.E., Pieters M.H.E.C., Dumoulin J.C.M. et al. Male factor as determinant of in-vitro fertilization outcome // Hum. Reprod.-l 992-Vol.7.-P.l 136-1140.

112. ESHRE Andrology Special Interest Group. Guidelines on the application of CASA technology in the analysis of spermatozoa // Hum. Reprod-1998.-Vol.13.-P. 142-145.

113. Evenson D.P., Jost L.K., Marshall D. et al. Utility of the sperm chromatin structure assay as a diagnostic and prognostic tool in the human fertility clinic // Hum. Reprod.-1999.-Vol.14.-P. 1039-1049.

114. Fischbcin A., Zabludovsky N., Eltes F. et al. Ultramorphological sperm characteristics in the risk assessment of health effects after radiation exposure among salvage workers in Chernobyl // Environ. Health Perspect.— 1997-Vol. 105.-P. 1445-1449.

115. Florence L.H. et al. Comparison of Percoll and swim-up methods for sperm preparation from abnormal semen samples // Hum. Reprod.-1992.-~ Vol.2.-P.261-266.

116. Francavilla F., Romano R., Santucci R., Poccia G. Effect of sperm morphology and motile sperm count on outcome of intrauterine insemination in oligospermia and/or asthenozoospermia // Fertil. Steril.—1990.— Vol.53.-P.892-897.

117. Franken D.R. et ai. Sperm-zona pellucida binding and penetration assays / Acosta A.A., Kruger T.F. (eds.) // Human Spermatozoa in Assisted Reproduction-Parthenon Publishing Company, New York.-1996.-P.237.

118. Fredricsson B., Bjork R. Morphology of postcoital spermatozoa in the cervical secretion and its clinical significance. Fertil. Steril.-1977.-Vol.28.-P.841-845.

119. Freund M. Standards for the rating of human sperm morphology // Int. J. Fertil.-1966.-Vol. 11 .-P.97-118.

120. Garrett C., Bake, H.W.G. A new fully automated system for the morphometry analysis of human sperm heads // Fertil. Steril.-1995.-Vol.63.-P.1306-1317.

121. Garrett C., Liu D.Y., Baker H.W.G. Selectivity of the human sperm-zona pellucida binding process to sperm head morphometry // Fertil. Steril — 1997-Vol. 67.-P.362-371.

122. Gebreegziabher Y., Marcos E., McKinon. W. et al. Sperm characteristics of endurance trained cyclists // Int. J. Spoils. Med.-2004.-Vol.25.-№4-P.247-251.

123. Harrison K.L. Semen parameter defects and toxin contact related occupation in infertility patients // Middle East Fertil. Soc. J.-1998.-Vol.3.-P.3-10.

124. Hinting A., Comhaire F., Vermeulen L. et al. Value of sperm characteristics and the result of in-vitro fertilization for predicting of the outcome of assisted reproduction // Int. J. Androl.-1990.-Vol.l3-P.59-66.

125. Hoffmann G.E., Santilli B.A., Kindig S. et al. Intraobserver, interobserver variation of sperm critical morphology: comparison of examiner and computer-assisted analysis // Fertil. Steril.-l 996.-VoL65.-P. 1021-1025.

126. Hoffman N., Haider S.G. Neue Ergebnisse morphologischer Diagnostik der Spermatogenesestorungen // Gynakologe-1985 -Vol.18 -P.70-80.

127. Holstein A.F. Morphologische Studien an abnormen spermatiden und spermatozoen des menschen // Virchows Arch-1975.-№367.-P.93-112.

128. Host E., Ernst E., Lindenberg S., Smidt-Jensen S. Morphology of spermatozoa used in IVF and ICSI from Oligozoospermie men // Reprod. Biomed. 0nline.-2001 .-Vol.3.-№3.-P.212-215.

129. Huwe P., Diemer T., Ludwig M. et al. Influence of different uropatho-genic microorganisms on human sperm motility parameters in an in vitro experiment//Andrologia.-l 998.-Vol.30.-P.55-59.

130. Irvine D.S., Macleod I.C., Templeton A.A. et al. A prospective clinical study of the relationship between the computer-assisted assessment of human semen quality and the achievement of pregnancy in vivo // Hum. Re-prod.-1994.-Vol.9.-P.2324-2334.

131. Jouannet P., Ducot B., Feneux D., Spira A. Male factors and the likelihood of pregnancy in infertile couples. 1. Study of sperm characteristics // Int. J. Androl.-1988.-Vol. 11 .-P.379-394.

132. Kanwar K.C., Yanagimachi R., Lopata A. Effects of human seminal plasma on fertilizing capacity of human spermatozoa // Fertil. Steril.-1979.-Vol.31.-P.321-327.

133. Kartagener M.I. Mitteilung: Bronchiektasien bei situs viscerum inversus // Beitr. Klin. Tuberk.-1935.-Vol.83.-P.489.

134. Katz D., Diel L., Overstreet J. Differences in the movement of morphologically normal and abnormal human seminal spermatozoa // Biol. Re-prod.-1982.-Vol.26.-P. 5 5 6-5 70.

135. Katz D., Morales P., Samuels S., Overstreet J. Mechanisms of filtration of morphologically abnormal human sperm by cervical mucus // Fertil. Steril-1990-Vol.54.-P-513-516.

136. Katz D.R., Overstreet J.W., Samuels S.J. et al. Morphometric analysis of spermatozoa in the assessment of human male fertility // J. Androl.-1986.-Vol.7-P.203-210.

137. Kishikawa H., Tateno H., Yanagimachi R. Chromosome analysis of BALB/c mouse spermatozoa with normal and abnormal head morphology // Biol. Reprod.-1999.-Vol.61 .-P.809-812.

138. Kobayashi T., Jinno M., Sugimura K. et al. Sperm morphological assessment based on strict criteria and in vitro fertilization outcome // Hum. Reprod.-l 991.-Vol.6.-P.983-986.

139. Kremer J. The in vitro spermatozoal penetration test in fertility investigations: Ph.D. dissertation.—University of Groningen, The Netherlands-1968.

140. Kruger T. Computer-assisted sperm analysis systems: morphometric aspects // Hum. Reprod.-1995.-Vol. 10.-Suppl. 1 .-P.46-52.

141. KrugerT.F., Acosta A.A., Simmons K.F. et al. Predictive value of abnormal sperm morphology in in vitro fertilization // Fertil. Steril.—1988.— Vol.49.-P. 112-117.

142. Kruger T.F, du Toit T.C., Franken D.R. et al. Sperm morphology: assessing the agreement between the manual method (strict criteria) and the sperm morphology analyzer IVOS // Fertil. Steril.-1995-Vol.63.-P.134-141.

143. Kruger T.F., Lacquet L. A., Sarmiento C.A.S. et al. A prospective study on the predictive value of normal sperm morphology evaluated by computer (IVOS) // Fertil. Steril.-1996.-Vol.66.-№2.-P.285-291.

144. Kruger T.F., Menkveld R., Stander F.S.H. et al. Sperm morphologic features as a prognostic factor in in vitro fertilization // Fertil. Steril.—1986.— Vol.46.-P.l 118-1 123.

145. Krzanowska H. Sperm head abnormalities in relation to the age and strain of mice//J. Reprod. Fertil.-l 981 .-Vol.62.-P.385-392.

146. Kupker W., al-Hasani S., Schulze W. et al. Morphology in intracyto-plasmic sperm injection // Gynakol Geburtshilfliche Rundsch-1995 -Vol.35.-Suppl.l -P.132-136.

147. Lee J.D. et al. Analysis of chromosome constitution of human spermatozoa with normal and aberrant head morphologies after injection into mouse oocytes // Hum. Reprod.-1996.-Vol.9.-P. 1942-1946.

148. Lewis-Jones L, Aziz N., Seshadri S. et al. Sperm chromosomal abnormalities arc linked to sperm morphologic deformities // Fertil. Steril.— 2003.-Vol.79.-№ 1 -P.212-215.

149. Lipshultz L.I. 'The debate continues' the continuing debate over the possible decline in semen quality // Fertil. Steril.-1996.-Vol.65.-P.909-91 1.

150. Liu D.Y., Baker H.W.G. Morphology of spermatozoa bound to the zona pellucida of human oocytes that failed to fertilize in vitro // J. Reprod. Fertil.-l 992.-Vol.94.-P.71-84.

151. Liu J., Nagy Z.P., Joris H. et al. Analysis of 76 total fertilization failure cycles out of 2732 intracytoplasmic sperm injection cycles // Hum. Re-prod.-1995.-Vol. 10.-P.2630-2636.

152. Liiders G. Ein dcfckt der kopf-schwanz-verknuEpfung beim menschlichen spennatozoen // Andrologia.-1976.-Vol.8.-P.365-368.

153. MacLeod J., Gold R.Z. The male factor in fertility and infertility. IV. Sperm morphology in fertile and infertile marriage // Fertil. Steril.— 1951 .— Vol.2.-P.394-414.

154. Marsh S. et al. The effect of morphology on the ability of human spermatozoa to penetrate zona-free hamster oocytes // Aum. Reprod-1987.-Vol.2.-P.499-503.

155. Martin R.H., Rademaker A. The relationship between sperm chromosomal abnormalities and sperm morphology in humans // Mutat. Res.— 1988.-Vol.207.-P. 159-164.

156. Megory E., Zuckerman H., Shoham Z., Lunenfeld B. Infectionsand male fertility // Obstet. Gynecol. Surv.-1987.-Vol.42.-P.283-290.

157. Menkveld R., Franken D.R., Kruger T.F. et al. Sperm selection capacity of the human zona pellucida // Mol. Reprod. Dev.-1991.-Vol.30.-P.346-352.

158. Menkveld R., Kruger T.F. Sperm morphology and male urogenital infections // Andrologia.-1998.-Vol.30.-Suppl. 1 -P.49-53.

159. Mieusset R. Influence of lifestyle on male infertility: potential testicular heating factors // Middle East Fertil. Soc. J.-1998-Vol.3.-Suppl. 1 .-P.40-45.

160. Milatiner D., Halle D., Huerta M. et al. Associations between androgen receptor CAG repeat length and sperm morphology // Hum. Reprod.-2004.-Vol. 19-№6.-P. 1426-1430.

161. Mönch G.L. Zur Frage der menschlichen Sterilität // Zbl. Gynäl — 1927.-Vol.43.-P.2730.

162. Mönch G.L. Sperm morphology in relation to Fertility // Am. J. Obstet. Gynecol-1931 .-Vol.22.-№2.-P. 199.

163. Morales P., Vantman D., Barros C., Vigil P. Human spermatozoa selected by Percoll gradient or swim-up are equally capable of binding to the human zona pellucida and undergoing the acrosome reaction // Hum. Re-prod.-l 991 .-Vol.6.-P.401-404.

164. Mortimer D. Sperm preparation methods // J. Androl.-2000.-Vol.21.-№3.-P.357-366.

165. Mortimer D., Leslie E.E., Kelley R.W. et al. Morphological selection of human spermatozoa in vivo and in vitro // J. Reprod. Fertil.-1982.-Vol.64.-P.391-399.

166. Mortimer D., Mortimer S.T. Methods of sperm preparation for assisted reproduction // Ann. Acad. Med. Singapore- 1992.-Vol.21.--P.517-524.

167. Mortimer D., Mortimer S.T. Value and reliability of CASA systems / Ombelet W., Bosmans E., Vandeput H. et al., eds. Modern ART in the 2000s.-Carnforth, UK: Parthenon Publishing, 1998.-P.73-89.

168. Mortimer S.T., Swan M.A., Mortimer D. Effect of seminal plasma on capacitation and hyperactivation in human spermatozoa // Plum. Reprod.-1998 -Vol. 13.-P.2139-2146.

169. Naftulin B.N., Samuels S.J., Hellstrom W.J. Semen quality in varicocele patients is characterized by tapered sperm cells // Fertil. Steril.—1991 .— Vol.56.-P. 149-151.

170. Nagy Z.P., Liu J., Joris H. et al. The result of intracytoplasmic sperm injection is not related to any of the three basic sperm parameters // Hum. Reprod.-1995.-VoI.10.-P.l 123-1129.

171. Nagy Z.P., Verheyen G., Liu J. et al. Results of 55 intracytoplasmic sperm injection cycles in the treatment of male-immunological infertility // Hum. Reprod.-1995.-Vol. 10.-№7.-P. 1775-1780.

172. Nikolettos N., Kupker W., Dcmirel C. et al. Fertilization potential of spermatozoa with abnormal morphology // Hum. Rcprod.-1999.-Vol. 14.-P.47-70.

173. O'Connell M.O., Me Clure N., Lewis S.E.M. The effects of cryopre-servation on sperm morphology, motility and mitochondrial function // Hum. Reprod.-2002.-Vol. 17.-P.704-709.

174. Oehninger S. et al. Defective calcium influx and acrosome reaction (spontaneous and progesterone-induced) in spermatozoa of infertile men with severe teratozoospermia // Fertil. Steril.-l994.-Vol.61 .-P.349-354.

175. Oehninger S., Acosta A.A., Kruger T.F. et al. Failure of fertilization in in vitro fertilization: the "occult" male factor // J. In Vitro Fertil. Embryo Transfer.-1988.-Vol.5.-P. 181-187.

176. Ombelet W., Bosmans E., Janssen M. et al. Semen parameters in a fertile versus subfertile population: a need for change in interpretation of semen testing//Hum. Reprod.-1997.-VoI.12.-P.987-993.

177. Ombelet W., Fourie F., Vandeput FI. et al. Teratozoospermia and in vitro fertilization: a randomized prospective study // Hum. Reprod.-1994-Vol.9.-P. 1479-1484.

178. Ombelet W., Pollet FI., Bosmans E., Vereecken A. Results of a questionnaire on sperm morphology assessment// Hum. Reprod.-1997.-Vol.12-№5.-P.1015-1020.

179. Osawa Y., Sueoka K., Iwata S. et al. Assessment of the dominant abnormal form is useful for predicting the outcome of intracytoplasmic sperminjection in the case of severe teratozoospermia // J. Assist. Reprod. Genet.-1999-Vol. 16.-№8.-P.436-442.

180. Palermo G., Joris H., Devroey P., Van Steirteghem A.C. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte // Lancet.-1992.-Vol.340.-P. 17-18.

181. Parinaud J., Mieusset R., Vieitez G. et al. Influence of sperm parameters on embryo quality // Fertil. Steril.-1993.-Vol.60.-P.888-892.

182. Pedersen H., Fawcett D.W. Functional anatomy of the human spermatozoon / Hafez E.S.E., ed. Fluman Semen and Fertility Regulation in Men-St Louis, CV Mosby Company, 1976.-P.65-75.

183. Purvis K., Christiansen E. Infection in the male reproductive tract: impact, diagnosis and treatment in relation to male infertility // Int. J. An-drol.-1993.-Vol.16.-P. 1-13.

184. Rawe V.Y., Galavei "na G.D., Acosta A.A., et al. Incidence of tail structure distortions associated with dysplasia of the fibrous sheath in human spermatozoa// Hum. Reprod.-2001.-Vol.l6.-P.879-886.

185. Rawe V.Y., Terada Y., Nakamura S. et al. A pathology of the sperm centriole responsible for defective sperm aster formation, syngamy and cleavage // Hum. Reprod.-2002.-Vol. 17.-P.2344-2349.

186. Reichart M., Eltes F., Soffer Y. et al. Sperm ultramorphology as a pathophysiological indicator of spermatogenesis in males suffering varicocele // Andrologia.-2000.-Vol.32.-P. 139-145.

187. Robinson J.N., Lockwood M., Dokras A. et al. Does isolated teratozoospermia affect performance in in-vitro fertilization and embryo transfer? // Hum. Reprod.-l 994-Vol.9.-P.870-874.

188. Rossman C.M., Forrest J.B., Less R.M. et al. The dyskinetic cilia syndrome: abnormal ciliary motility in association with abnormal ciliary ultrastructure //Chest.-1981,-Vol.80.-P.860-865.

189. Saias-Magnan J., Metzler-Guillemain C., Mercier G. et al. Failure of pregnancy after intracytoplasmic sperm injection with decapitated spermatozoa: case report // Hum. Reprod.-1999.-Vol. 14.-P. 1989-1992.

190. Sakkas D., Manicardi G.C., Tomlinson M. et al. The use of two dense degraded centrifugation techniques and swim-up sperm separation to separate spermatozoa with chromatin and nuclear DNA anomalies // Hum. Re-prod.-2000.-Vol. 15.-P. 11 12-11 16.

191. Salumets A., Suikkari A.-M., Möls T. et al. Influence of oocytes and spermatozoa on early embryonic development // Fertil. Steril.-2002-Vol.78.-№5.-P. 1082-1087.

192. Sauer M.V., Bustillo M., Serarni P. Transient acrosomal hypoplasia of spermatozoa and male fertility // Arch. Androl-1989-Vol.22.-P.95-98.

193. Seuanez H.N., Carothers A.D., Martin D.E. et al. Morphological abnormalities in spermatozoa of man and great apes // Nature-1977,-Vol.270.-P.345-347.

194. Schevchenko V.A., Ramaya L.K., Pomerentseva M.D. et al. Genetic effects of 131 I in reproductive cells of male mice // Mutat. Res.-1989-Vol.226-P.87-91.

195. Schmiady H., Radke E., Kentenich H. Round-headed spermatozoa -contraindication for IVF // Geburtshilfe Fraucnheilkd.-1992.-Vol.52.-P.301-303.

196. Schoevaert D. Automated recognition and morphological analysis of human spermatozoa / Robard D., Forti G., eds. Computers in endocrinology .-New York: Raven Press, 1984.-P.187-199.

197. Scott L. et al. The morphology of human pronuclear embryos is positively related to blastocyst development and implantation // Hum.Reprod-2000-Vol. 15.-№11 -P.2394-2403.

198. Shalika S. et al. Mono-Percoll separation technique improves sperm recovery of normal and male factor specimens when compared with the swim-up technique// Hum. Reprod.-l 995,-Vol. 10.-P.3195-3197.

199. Sobarzo C., Bustos-Obregon E. Sperm quality in mice acutely treated with parathion // Asian J. Androl.-2000.-Vol.2.-P. 147-150.

200. Sofikitis N., Miyagawa I., Dimitriadis D. et al. Effects of smoking on testicular function, semen quality and sperm fertilizing capacity // J. Urol.-1995,-Vol. 154.-P. 1030-1034.

201. Spano M., Cordelli E., Leter G. et al. Nuclear chromatin variations in human spermatozoa undergoing swim-up and cryopreservation evaluated by ilow cytometric sperm chromatin structure assay // Mol. Hum. Reprod.— 1999.-Vol.5-P.29-37.

202. Svalander P., Jakobsson A.H., Forsberg A.S. et al. The outcome of in-tracytoplasmic sperm injection is unrelated to 'strict criteria' sperm morphology//Hum. Reprod.-l 996.-Vol. 11 .-№5 .-P. 1019-1022.

203. Sukcharoen N., Sithipravej T., Promviengchai S. et al. Sperm morphology evaluated by computer (IVOS) cannot predict the fertilization rate in vitro after intracytoplasmic sperm injection // Feitil. SteriL-1998.-Vol.69.-№3.-P.564-568.

204. Tasdemir I., Tasdemir M., Tavukcuoglu S. et al. Effect of abnormal sperm head morphology on the outcome of intracytoplasmic sperm injection in humans // Hum. Reprod.-1997.-Vol.12-№6.-P.1214-1217.

205. Tesarik J., Mcndoza C., Greco E. Paternal effects acting during the first cell cycle of human preimplantation development after ICSI // Hum. Reprod.-2002.-Vol. 17.-№ 1 .-P. 184-189.

206. Thonneau P., Bujan L., Multigner L., Mieusset R. Occupational heat exposure and male fertility: a review // Hum. Reprod.—1998.—Vol. 13 — P.2122-2125.

207. Van der Spoel A.C., Jeyakumar M., Butters T.D. et al. Reversible infertility in male mice after oral administration of alkylated imino sugars: a nonhormonal approach to male contraception // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2002.-Vol.99.-P. 17173-17178.

208. Van Der Zvalmen P. et al. Sperm morphology and IVF pregnancy rate: comparison between Percoll gradient centrifugation and swim-up procedure// Hum. Reprod-1991 -Vol.4.-P.581-588.

209. Vazquez-Levin M.H., Friedman P., Goldberg S.l. et al. Response of routine semen analysis and critical assessment of sperm morphology by Kruger classification to therapeutic varicocelectomy // J. Urol-1997.-Vol.158.-P. 1804-1807.

210. Vegetti W., Van Assche E., Frias A. et al. Correlation between sperm parameters and sperm aneuploidy rates investigated by fluorescence in-situ hybridization in infertile men // Hum. Reprod.-2000.-Vol.l5.-№2.-P.351-365.

211. Vicari E., Perdichizzi A., De Palma A. et al. Globozoospermia is associated with chromatin structure abnormalities: case report // Hum. Reprod — 2002.-Vol.l7.-P.2128-2133.

212. Whorton M.D., Meyer C.R. Sperm count results from 861 American chemical agricultural workers from 14 separate studies // Fértil. Steril.— 1981.-Vol.35.-P.46-53.

213. World Health Organization. Impact of the environment on reproductive health. Report and recommendations of a WHO international workshop // Dan. Med. Bull.—1991 .-Vol.38.-P.425.

214. World Health Organization (WHO). Towards more objectivity in diagnosis and management of male infertility. Results of a World Health Organization multicenter study // Int. J. Androl.-1987.-Suppl.7.

215. World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Semen-cervical Mucus Interaction, 1st edn.-Singapore: Press Concern, 1980.

216. World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Semen-cervical Mucus Interaction, 2nd edn.-Cambridge University Press, Cambridge, 1987.

217. World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Semen-cervical Mucus Interaction, 3rd edn.-Cambridge University Press, Cambridge, 1992.

218. World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Semen-cervical Mucus Interaction, 4th edn.-Cambridge University Press, Cambridge, 1999.

219. World Health Organization. WHO manual for the standardized investigation and diagnosis for the infertile couplc.-Cambridge University Press, Cambridge, 1993.

220. Yanagimachi R. Mammalian fertilization / Knobil E., Neill J.D., eds. The Physiology of Reproduction. 2nd ed.-New York: Raven Press; 1994.

221. Yogev L., Kleiman S., Shabtai E. et al. Seasonal variations in pre- and post-thaw donor sperm quality // Hum. Reprod.-2004.—Vol.l9.-№4.-P.880-885.

222. Zamboni L. The ultrastructural pathology of the spermatozoon as a cause of infertility: the role of electron microscopy in the evaluation of semen quality // Fértil. Steril.-1987.-Vol.48.-P.711-734.

223. Zamboni L. Sperm structure and its relevance to infertility. An electron microscopic study // Arch. Pathol. Lab. Med.-1992.-Vol.l 16.-P.325-344.

224. Zaneveld L.J.D., Polakoski K.L. Collection and physical examination of the ejaculate / In Hafez E.S.E. (ed.), Techniques of Human Andrology.-Elsevier/North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, 1977.-P.147-172.

225. Zinaman M.J., Uhler M.L., Vertuno E. et al. Evaluation of computerassisted semen analysis (CASA) with IDENT stain to determine sperm concentration //J. Androl.-1996.-Vol. 17.-P.288-292.

Информация о работе

Бесков, Артем Александрович
кандидата медицинских наук
Новосибирск, 2005
ВАК 03.00.25

Диссертация

Варианты строения сперматозоидов человека в норме и при патологии, критерии прогнозирования успешности экстракорпорального оплодотворения и дифференцированного подхода к диагностике и лечению мужского - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы