Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вариабельность концентрации липопротеина(а) и структурная организация генов аполипопротеина(а) и ингибитора активатора плазминогена 1 типа в норме и при инфаркте миокарда

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Вариабельность концентрации липопротеина(а) и структурная организация генов аполипопротеина(а) и ингибитора активатора плазминогена 1 типа в норме и при инфаркте миокарда"

На правах рукописи

ГГъ Ом

ВОЛКОВА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ КОНЦЕНТРАЦИИ ЛИПОПРОТЕИНА(а) И СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОВ АПОЛИПОПРОТЕИНА(а) И ИНГИБИТОРА АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА 1 ТИПА В НОРМЕ И ПРИ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА

03.00.04. - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

N

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в Отделении молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН (директор проф. Калинин В. Д.).

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Шварц Евгений Иосифович.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Денисенко Александр Дорофеевич,

доктор биологических наук Евтушенко Владимир Иванович.

Ведущее научное учреждение - Научно-исследовательский институт кардиологии министерства здравоохранения России

Защита состоится ................. в .............. часов на заседании

Диссертационного • совета по защите кандидатских диссертаций К001.23.01 при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12.

д. 12.

Автореферат разослан

,2000 г.

Ученый~секретарь Диссертационного

совета К001.23.01

доктор биологических наук

Куликова О.Г.

Актуальность проблемы Атеросклероз и его осложнения - ишемическая болезнь сердца (ИБС) и инфаркт миокарда (ИМ) - являются ведущей причиной смертности в большинстве стран мира. В процессе развития атеросклеротического повреждения сосудов лежат нарушения в функционировании различных систем, таких как система поддержания пипидного гомеостаза, коагуляционный каскад и ренин-ангиотензиновая система. В возникновении функциональных нарушений участвует сложный комплекс генетических и средовых факторов. Известна структура многих генов, продукты которых оперируют в вышеназванных системах. Однако механизмы наследственной предрасположенности к цанному заболеванию до настоящего времени остаются недостаточно изученными.

Одним из общепризнанных факторов риска преждевременного развития ИМ является повышенный уровень липопротеина(а) [ЛП(а)]. ПП(а) был открыт в 1963 г., но,несмотря на повышенный интерес к нему эольшинства исследователей, относительно мало известно о его роли в эрганизме человека (A. Van den Ende et al., 1996).

ЛП(а) - липопротеин, состоящий из липопротеина низкой плотности и ковалентно присоединенного к нему белка шолипопротеина(а) [апо(а)]. Концентрация комплекса в плазме имеет сильные межиндивидуальные различия и варьирует от менее 1 до более 100 мг/дл. Биохимическая и генетическая характеристики ЛП(а) и апо(а) осложнены структурной гетерогенностью и гомологией апо(а) с тпазминогеном - основным ферментом системы фибринолиза. Эсобенностью структуры гена апо(а) является присутствие в нем многократно повторяющихся участков, гомологичных кринглу IV глазминогена (KIV-2), число которых может варьировать от 11 до 54. зыло показано, что различия в числе KIV-2 повторов объясняют 40-70% пменчивости в уровне ЛП(а) (Boerwinkle et al., 1992).

Полиморфизм числа пентануклеотидных повторов [ПЧПП] число которых может варьировать от 6 до 11) локализован в промоторной )бласти гена апо(а) и, вероятно, является одним из факторов, связанных с сонцентрацией ЛП(а) в плазме (Thrommsdorff М. et al., 1995).

С/Т полиморфизм локализован в позиции +93 гена апо(а). 1рисутствие Т образует дополнительный сайт начала трансляции и, как

было показано, уменьшает на 60% уровень трансляции мРНК апо(а) in vitro (Zysov В. et al., 1995).

В последнее время наряду с другими факторами риска развития сердечно-сосудистой патологии внимание исследователей привлек тот факт, что в основе инфаркта миокарда может лежать нарушение функционирования системы фибринолиза. Гипофибринолиз, который приводит к пониженной деградации фибриновых сгустков (Bachmann F. et al., 1993), может быть одним из основных факторов риска развития тромботических состояний. Сразу же после определения первичной структуры гена апо(а) было сделано предположение, что склонность к тромбозам обусловлена конкуренцией ЛП(а) с плазминогеном за место посадки на фибрине. Это начальный этап превращения плазминогена в плазмин, приводящий к разрушению нитей фибрина. В свою очередь, сниженная фибринолитическая активность плазмы крови, может быть вызвана повышенной концентрацией ингибитора активатора плазминогена 1 типа (ИАПГ-1) - главного физиологического ингибитора тканевого и урокиназного активаторов плазминогена (Sprengers E.D. et а!., 1987). Обнаруженный в 1993 г. инсерционно-делеционный (4G/5G) полиморфизм в промоторной области гена ИАПГ-1 вызвал большой интерес с точки зрения его влияния на развитие атеросклероза (Dawson S et al., 1993). Присутствие аллеля 4G связано с повышенным уровнем ИАПГ-1, хотя результаты о взаимосвязи данного аллеля с развитием ИМ весьма противоречивы.

Таким образом, одновременный анализ генетических детерминант, определяющих с одной стороны, повышение уровня ИАПГ-1, а с другой,- повышение концентрации ЛП(а) может пролить свет на возможное аддитивное действие двух вышеназванных генов при формировании наследственной предрасположенности к тромботическим состояниям в артериальном русле.

Цели и задачи исследования

Целью работы являлось исследование взаимосвязи концентрации липопротеина(а) и аллельных вариантов структурных полиморфизмов генов аполипопротеина(а) и ингибитора активатора плазминогена 1 типа в норме и при инфаркте миокарда.

Задачи исследования включали: 1. Исследование взаимосвязи аллельных вариантов полиморфизма числа KIV-2 повторов, полиморфизма числа пентануклеотидных повторов в

позиции -1373, С/Т полиморфизма в позиции +93 и концентрации ЛП(а) в популяции г.Санкт-Петербурга.

2. Исследование распределения аллельных вариантов инсерционно-делеционного полиморфизма 40/50 в промоторной области гена ИАПГ-1 в популяции г.Санкт-Петербурга.

3. Исследование взаимосвязи аллельных вариантов полиморфизма числа К1У-2 повторов, полиморфизма числа пентануклеотидных повторов в позиции -1373, С/Т полиморфизма в позиции +93 и концентрации ЛП(а) в группах больных ИМ и здоровых лиц.

Исследование распределения аллелей инсерционно-делеционного полиморфизма 40/50 в промоторной области гена ИАПГ-1 в группах больных ИМ и здоровых лиц.

Научная новнзна полученных результатов

Впервые охарактеризовано распределение аллельных вариантов грех ДНК-полиморфизмов гена апо(а) (полиморфизм числа К1У-2 повторов, полиморфизм числа пентануклеотидных повторов в промоторной области и С/Т транзиция в позиции +93) в популяции г.Санкт-Петербурга и оценена их взаимосвязь с уровнем ЛП(а) сыворотки крови в норме и при инфаркте миокарда.

Впервые проведена оценка частот встречаемости аллелей инсерционно-делеционного полиморфизма промоторной области гена ингибитора активатора плазминогена 1 типа (40/50) в норме и при инфаркте миокарда.

Научно-практическая значимость работы

Выявленная ассоциация между повышенным уровнем ЛП(а) сыворотки крови, аллелями гена апо(а), содержащими число К1У-2 повторов меньше 20 и риском развития ИМ в возрасте до 45 лет в последующем может быть использована в клинической практике для выделения групп риска преждевременного развития ИМ.

Апробация работы

Результаты работы представлены на региональном научном совещании 'Генофонд населения Санкт-Петербурга и прогнозирование его динамики" (Санкт-Петербург, 1996), XXIX и XXX Европейских конференциях по генетике человека (Генуя, Италия, 1997), (Лиссабон, Португалия, 1998), IV всемирном симпозиуме, посвященном факторам риска развития сердечно-сосудистых заболеваний (Вашингтон, США,

1997), и на Всероссийской конференции "Достижения молекулярной генетики в кардиологии" (Санкт-Петербург, Россия, 1999).

По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисов.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы (216 наименований). Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц, 20 рисунков и фотографий.

Материалы и методы исследования Характеристика групп Для оценки распределения исследуемых параметров в популяции г.Санкт-Петербурга, были собраны образцы крови и сыворотки от 55 семей г.Санкт-Петербурга, члены которых не имели в анамнезе сердечнососудистых заболеваний. В 22 семьях имеются близнецовые пары. Анализ распределения исследуемых параметров в популяции Санкт-Петербурга проводили с использованием данных по 75 взрослым членам семей.

Для проведения первого этапа сравнительного анализа были получены образцы ДНК от 289 пациентов, перенесших ИМ (средний возраст 60 лет), находившихся в отделениях кардиореанимации Мариинской и Покровской больниц. В качестве контрольной группы использовали случайную выборку из 284 школьников г. Санкт-Петербурга (средний возраст 11 лет). Нами был собран полный семейный анамнез наличия или отсутствия ИМ или ИБС у старших членов семей. Такая группа представляет собой случайную выборку и отражает распределение аллельных вариантов изученных генов в популяции Санкт-Петербурга. Использованный здесь метод формирования группы контроля впервые был предложен Badenhop R.F. et al., 1995.

Для проведения второго этапа сравнительного анализа были собраны образцы крови и сыворотки 100 пациентов (средний возраст 41 год), перенесших ИМ в возрасте до 45 лет, наблюдавшихся на кафедре факультетской терапии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова и 92 человек контрольной группы (средний возраст 40 лет), соответствующей группе пациентов по возрасту и полу. Как для пациентов, так и для лиц контрольной группы были получены данные по липидному составу крови и наличию ИБС и ИМ у родственников первой и второй степеней родства.

В обеих группах была собрана информация о пристрастии обследуемых к курению. В группе больных ИМ учитывалось количество перенесенных ИМ.

Методы

ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови с использованием стандартных методов. Полимеразную цепную реакцию ПЦР) проводили на автоматическом "MiniCycler" (MJ Research, USA) с Taq полимеразой ("Biomaster", Италия-Россия).

Идентификацию аллелей ПЧПП проводили при помощи ПЦР с юследующим электрофорезом по методу Thrommsdorf et al., 1995.

Идентификацию аллелей инсерционно-делеционного голиморфизма гена ИАПГ-1 проводили при помощи аллель-:пецифической ПЦР с последующим электрофорезом по методу Mansfield d.W. et al., 1995.

Для идентификации аллелей С/Т полиморфизма в позиции +93 ена апо(а), нами был разработан оригинальный метод, основанный на ¡ведении сайта рестрикции в амплифицируемый участок ДНК путем сайт-иправленного мутагенеза в одном из праймеров. С этой целью in vitro !ыл амплифицирован фрагмент гена апо(а) длиной 134 н.п., содержащий [сследуемую транзицию. Была выбрана следующая структура праймеров: ' СТТ TGC ТСТ АСС TGA ТТТ CAA AAA Т 3' и 5' CGT ТТА СТС TGA XJT AAG ТСА ACG А 3'. В 3' концевой праймер за один нуклеотид до 3' онца ввели G вместо природного А. При элонгации с праймером данной труктуры наличие С в позиции +93 формировало сайт для действия )ермента рестрикции Aatll. После ферментного гидролиза эндонуклеазой vatll (Fermentas, Литовская Республика), продукты рестрикции разделяли 10% полиакриламидном геле (рис.1).

Идентификацию числа KIV-2 повторов в гене апо(а) проводили ри помощи пульс-электрофореза фрагментов ДНК, полученных после нкубации с ферментом рестрикции Kpnl, с последующим блоттингом по !аузерну (Kraft HG. et al, 1992).

Определение изоформ белка апо(а) проводили при помощи лектрофореза образцов сыворотки крови в агарозном геле с оследующим иммуноблоттингом по методу Kraft HG. et al., 1988.

Концентрацию ЛП(а) сыворотки крови измеряли при помощи ммуноферментного анализа по методу Krempler F. et al, 1980.

Рис.1. С/Т полиморфизм в позиции +93 гена апо(а). Линии 4, 5 — гомозиготы Т/Т ; линии 6,1 - гетерозиготы С/Т; линии 8, 9 - гомозиготы С/С ; линии 2, 3 - продукты ПЦР; линии 1,10- маркер pBR322/AIuI

Статистическая обработка результатов

Весь статистический анализ был проведен с использованием пакета статистической обработки данных SPSS 8.0 for Windows 98.

Для выяснения соответствия частотного распределения аллелей и генотипов полиморфизмов изученных генов равновесию Харди-Вайнберга, был использован критерий у2.

Оценка достоверности различий в частотах встречаемости аллелей и генотипов, а также других качественных характеристик между группами проводили при помощи точного метода Фишера.

Распределение концентрации ЛП(а) перед статистической обработкой было либо приведено к нормальному, либо использовали непараметрические методы сравнения.

Для оценки степени генетического контроля концентрация ЛП(а) определяли корреляцию концентраций ЛП(а) в близнецовых парах.

Анализ ранговой корреляции по Спирману использовали для оценки взаимосвязи между уровнем ЛП(а) и числом К1У-2 повторов гена апо(а).

, Многофакторный дисперсионный анализ (АМОУА) применяли для выявления возможного влияния аллелей С/Т полиморфизма в позиции +93 на уровень ЛП(а) плазмы.

Непараметрический дисперсионный анализ Крускала-Валлиса использовали для сравнения медиан уровней ЛП(а) в группе больных ИМ моложе 45 лет, в зависимости от числа ИМ.

Для оценки риска, вносимого определенным числом К1У-2 повторов в гене апо(а) и величиной уровня ЛП(а) плазмы, был посчитан относительный риск (ОР) развития ИМ (одного или нескольких) в возрасте до 45 лет.

Метод пошаговой логистической регрессии проводили для оценки вклада исследуемых параметров в риск развития ИМ в возрасте до 45 лет.

Результаты и их обсуждение

Генетические основы вариабельности концентрации ЛП(а) и распределение аллелей инсерционно-делеционного полиморфизма 4в/5С в промоторной области гена ИАПГ-1 в популяции г.Санкт-Петербурга.

Средний уровень ЛП(а) в популяции Санкт-Петербурга составляет [20.9±4.5] мг/дп. Всего обнаружено 25 аллелей гена апо(а), содержащих число К1У-2 повторов от 15 до 45. Найдена обратная корреляция между полиморфизмом числа К1У-2 повторов и концентрацией ЛП(а) (рис.2).

Мы не нашли статистически достоверного влияния числа пентануклеотидных повторов в промоторной области гена апо(а) на концентрацию ЛП(а). Кроме того, не было найдено связи между аллелями С/Т (+93) полиморфизма и уровнем ЛП(а). В девяти семьях было выявлено не равновесие по сцеплению между Т аллелем в позиции +93 и аллелями с числом К1У-2 повторов средней длины в гене апо(а). Анализ наследования уровня ЛП(а), проведенного в близнецовых парах,показал, что концентрация ЛП(а) находится под жестким генетическим контролем. При этом не более 35% изменчивости уровня ЛП(а) объясняется вариабельностью числа К1У-2 повторов. Таким образом, известные на данный момент полиморфизмы структуры гена апо(а) не позволяют полностью понять молекулярную природу генетической детерминированности процесса вариабельности уровня ЛП(а).

150

® 10СИ

с с;

50 0

и

в в

в. в

40 50 60 70 80

Су?«ла числа КГЧ/-2 гшгороз

80

Рис.2. Взаимосвязь концентращ1и ЛП(а) и суммы числа К1У-2 повторов в популяции г.Санкт-Петербурга

Сравнительный анализ распространения аллелей гена апо(аУ. полиморфизм числа пентануклеотидных повторов в позиции -1373 и С/Т транзиции в позиции +93 и аллелей инсерционно-делеционного полиморфизма 40/50 в позиции -675 гена ИАПГ-1 в труппе больных ИМ и контрольной группе.

На следующем этапе проводили анализ распределения аллелей ГТЧПП и С/Т полиморфизма гена апо(а) не зависимо от их возможной связи с уровнем ЛП(а) в группе 289 больных ИМ и 284 лиц контрольной группы. Была обнаружена повышенная частота аллелей с числом пентануклеотидных повторов больше 8 в группе больных ИМ (таблица !)•

Таблица 1

Частоты встречаемости аллелей исследуемых полиморфизмов в группе больных ИМ и детской контрольной группе.

Аллели Больные ИМ Контрольная Р

(п=289) группа (п=284)

+93 позиция гена

апо(а)

С 0.94 0.9

Т 0.06 0.1

ПЧПП-1372 гена

апо(а)

6 0.001 0

7 0.007 0.003

8 0.655 0.701 <0.01

9 0.175 0.142

10 0.140 0.146

11 0.022 0.008

40/50 (-675) гена

ИАПГ-1

4в 0.42 0.50 <0.001

50 0.58 0.50

1ричем, эта связь особенно заметна в группе пациентов, перенесших ИМ возрасте до 55 лет (таблица 2). При исследовании распространения ллелей С/Т полиморфизма в позиции +93 гена апо(а) повышение частоты стречаемости Т аллеля было обнаружено в группе детей с отсутствием емейного анамнеза по ИБС и ИМ по сравнению с больными, еренесшими ИМ в возрасте до 55 лет (таблица 2).

Также было отмечено отсутствие в группе больных ИМ лиц, омозиготных по Т аллелю. При сравнении распределения аллелей нсерционно-делеционного полиморфизма гена ИАПГ-1 нами найдено ревалирование носителей аллеля 4в в группе контроля (таблицы 1 и 2). )днако, большинство исследователей в основном отмечали повышенную астоту генотипа 40/40 в группе больных ИМ моложе 45 лет, а в качестве онтрольной группы рассматривали популяцию лиц с отсутствием

анамнеза по сердечно-сосудистой патологии, соответствующую пациентам по возрасту и полу.

Таблица 2

Различия в распределении аллелей исследуемых полиморфизмов в подгруппах больных ИМ и контроля. _

р I ИМ до 55 лет (п=72) II ИМ после 55 лет (п=217)

С/Т +93 апо(а) ПЧПП -1373 апо(а) 40/50 -675 ИАПГ-1 С/Т +93 апо(а) ПЧПП -1373 апо(а) 40/50 -675 ИАПГ-1

ИБС+ Дети с положительным семейным анамнезом по ИМ и ИБС (п=97) N8 <0.001 N8 ЫБ <0.001

ИБС- Детис отсутствием семейного анамнеза по ИБС и ИМ (п=187) <0.05 <0.01 <0.001 ЫБ N8 <0.001

Аллельные варианты полиморфизмов структуры гена апо(аУ гена ИАПГ-1, концентрация ЛП(а) и их ассоциация с развитием ИМ в возрасте до 45 лет.

На основе результатов первого этапа сравнительного анализа была поставлена следующая задача: в группу пациентов включались лица, перенесшие ИМ в возрасте до 45 лет. В качестве контрольной группы

была взята выборка мужчин с отсутствием анамнеза по сердечнососудистой патологии, соответствующая группе пациентов по возрасту. В данном случае можно сравнить биохимические параметры, распределение которых имеет ярко выраженную возрастную зависимость. Величина относительного риска (ОР) развития ИМ в возрасте до 45 лет в 3.7 раза больше у лиц, чей уровень ЛП(а) находится в пределах верхнего 75% квартиля распределения концентрации ЛП(а) по сравнению с теми, чей уровень ЛП(а) расположен в пределах нижнего квартиля (25%). Была продемонстрирована обратная корреляция между числом К1У-2 повторов и риском развития ИМ. Величина среднего уровня ЛП(а) в группе больных ИМ достоверно выше, чем в контрольной группе у лиц, имеющих число К1У-2 повторов от 14 до 25. Лица с числом К1У-2 повторов больше 25 имеют примерно одинаковый уровень ЛП(а) как среди больных ИМ, так и в контроле (Рис.3). Однако, различия в частотах встречаемости аллелей гена апо(а) различной длины объясняют только 10% увеличения концентрации ЛП(а) в группе больных ИМ моложе 45 лет. Изоформы с одинаковым числом К1У-2 повторов могут быть связаны с различной концентрацией ЛП(а), особенно внутри каждой из отдельно исследуемых групп.

50.6*

2 50

5-40 с;

| 30

I 20

н

X

=г 10 х

о

■I

В1 Больные Ш СИ! Контроль

36.8**

23.9*

18.2** 101 10.7

14-19 20-25 >25

Число К1\/-2 повторов

Рис.3. Анализ сцепления уровня ЛП(а) с аллелями гена апо(а) определенной длины.

Средние значения уровня ЛП(а) для каждой группы обозначены в верхней части колонок. *Р=0.035, **Р=0.007

Если высокий уровень ЛП(а) действительно является строгим фактором риска развития ИМ в молодом возрасте, следует ожидать, что концентрация ЛП(а) увеличена внутри аллелей апо(а) определенной длины у больных ИМ за счет влияния других полиморфизмов последовательности гена апо(а), непосредственно связанных с высоким уровнем ЛП(а). Для проверки данной гипотезы была проведен анализ возможного влияния аллелей ПЧПП в позиции -1373 и С/Т полиморфизма в позиции +93 гена апо(а) на уровень ЛП(а) и, следовательно, на риск развития ИМ в молодом возрасте (таблица 3).

Таблица 3

Частоты встречаемости аллелей исследуемых полиморфизмов и группах больных ИМ до 45 лет и контроля.__

Аллели Больные ИМ до 45 Контрольная группа

лет (п=100) (п=92) Р

ПЧПП-1372

гена апо(а)

7 0.03 0.01

8 0.67 0.67

9 0.16 0.13 N8

10 0.13 0.17

11 0.01 0.02

С/Т +93 гена

апо(а)

С 1 0.94 <0.017

Т - 0.06

40/50-675

гена ИАПГ-1

40 0.59 0.48 <0.01

50 0.41 0.52

Была выявлена повышенная частота Т (+93) аллеля у лиц контрольной группы, подтверждая результаты, полученные на первом этапе сравнительного анализа. Аналогично результатам, полученным при

исследовании популяции Санкт-Петербурга, не было отмечено статистически достоверных различий в уровне ЛП(а) между лицами с генотипами С/С и С/Т. Отсутствие влияния Т в позиции +93 гена апо(а) на концентрацшо ЛП(а) in vivo может быть результатом

1. Неравновесия по сцеплению между Т (+93) аллелем и аллелями с числом KIV-2 повторов средней длины;

2. Ожидаемый эффект может проявляться только в гомозиготном состоянии по Т аллелю;

3. Т (+93) аллель может, находиться в неравновесии по сцеплению с аллельными вариантами полиморфизмов структуры гена апо(а) или других генов, действительно понижающих уровень ЛП(а) in vivo.

В группе больных ИМ была найдена достоверная обратная корреляция между числом пентануклеотидных повторов и уровнем ЛЩа) (Рис.4). Однако, для популяции г.Санкт-Петербурга данный факт статистически подтвержден не был. Не было найдено различий в частоте встречаемости аллелей ПЧПП между группами больных ИМ до 45 лет и контролем. Ранее нами было обнаружено превалирование апо(а) аллелей, содержащих число пентануклеотидных повторов больше 8 в группе пациентов с ИМ по сравнению с контрольной группой. Для выяснения возможных причин подобного несоответствия результатов, группа больных была разделена на две подгруппы: пациенты с одним ИМ и повторными ИМ. При сравнении уровня ЛЩа) между группами пациентов с одним и повторными ИМ была отмечена устойчивая тенденция к пониженшо концентрации ЛЩа) при повторных ИМ (рис.5). Можно предположить, что превалирование аллелей с числом пентануклеотидных повторов больше 8 в группе больных ИМ по сравнению с контрольной группой происходит за счет преобладания в группе пациентов лиц с повторными ИМ, имеющими аллели ПЧПП ассоциированные с низким уровнем ЛЩа). Мы определили, что относительный риск развития одного ИМ в возрасте до 45 лет в 8 раз выше у лиц, имеющих число KIV-2 повторов меньше 20 по крайней мере в одном аллеле гена апо(а) по сравнению с лицами, имеющими число KIV-2 повторов больше 25 в обоих аллелях гена апо(а) (таблица 4).

I I Контрольная группа ИЗ Бальные ИМ

Сумма аллелей числа пенгануклеотидных повторов

Рис.4. Анализ взаимосвязи числа пенгануклеотидных повторов и уровня ЛП(а) в группе больных ИМ до 45 лет и контрольной группе

1 ИМ 2 ИМ 3 ИМ

Пациенты с разным числом ИМ

Рис.5. Анализ взаимосвязи уровня ЛП(а) с числом перенесенных ИМ. Представлены медианные значения концентрации ЛП(а)

Таблица 4

Величины относительного риска (ОР) развития одного н повторных ИМ в возрасте до 45 лет в зависимости от концентрации ЛП(а) сыворотки крови и числа К1У-2 повторов аллелей гена апо(а)

ОР (95% доверите Один ИМ льный интервал) Повторные ИМ

Число К1У-2 повторов в аллеле меньшего размера гена апо(а), п 17-19 20-22 23-25 >25 2.67+ (0.98-7.237) 1.93 (0.687-1.962) 1.08 (0.933-3.987) 0.33++ (0.558-0.196) 0.36 (2.864-0.045) 0.81(3.308-0.200) 0.81 (24.632-0.027) 2.09 (0.913-4.770)

Число К1У-2 повторов в аллеле большего размера гена апо(а), п 20-22 23-25 >25 1.79 (10'4-2*10м) 0.81 (4*103-9*10'5) 0.64 (2*107-3*10"8) 0.53 (4.069-0.070) 2.32 (6*10"5-9*104) 0.56(2.286-0.165)

Концентрация ЛП(а), мг/дл >27.84 9.94-27.84 3.92-9.94 0-3.92 2.18+(1.157-4.114) 1.76 (.0894-3.475) 0.52(1.005-0.264) 0.44+ (0.869-0.226) 0.86(4.177-0.175) 0.78 (7*103-9*10'5) 1.23 (0.437-7.426) 1.80(0.157-9.689)

+Р<0.015 ++Р<0.0001

При анализе распределения частот и генотипов инсерционно-делеционного полиморфизма 40/50 в позиции -675 гена ИАПГ-1 в группе больных ИМ было отмечено достоверное увеличение частоты встречаемости генотипа 40/40 в группе пациентов по сравнению с контрольной группой. На первом этапе сравнительного анализа было обнаружено превалирование аллеля 40 в контрольной группе по сравнению с больными ИМ. Данная группа больных набиралась на базе

отделения кардиореанимации в течение первых 1-2 дней после острого ИМ. На втором этапе сравнительного анализа в обследование были включены пациенты, перенесшие ИМ не менее чем за 0.5 года до момента забора биологического материала. В этой связи можно предположить, что генотип 40/40 является фактором, определяющим течение ИМ. Сравнение распределения генотипов попарно в группах больных и контроля, исследованных на обоих этапах сравнительного анализа,также подтверждает преобладание лиц с генотипом 40/40 именно среди пациентов, с момента ИМ которых прошло более 0.5 года. Недавно на экспериментальных линиях мышей было показано, что экзогенная экспрессия ИАПГ-1 позволяет избежать смерти от разрыва сердца (Неушапэ Б. е1 а!., 1999). По причине повышенной активности отдельных компонентов системы фибринолиза происходит растворение миокарда. Можно допустить, что пациенты с генотипом 40/40, концентрация ИАПГ-1 в плазме которых повышена, имеют больше шансов избежать подобного осложнения. Однако данное предположение требует проведения дополнительного проспективного исследования по оценке выживаемости после острого ИМ пациентов с различными генотипами инсерционно-делеционного полиморфизма 40/50 в позиции -675 гена ИАПГ-1.

Проведенный анализ пошаговой логистической регрессии показал, что из исследуемых нами параметров только уровень ЛП(а) и С/Т транзиция в позиции +93 гена апо(а) достоверно отвечают за риск развития ИМ в возрасте до 45 лет. Использование в данном анализе также величин уровней общего холестерина (ОХС), триглицеридов (ТГ), холестерина липопротиенов высокой плотности (ХС ЛПВП), холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС ЛПНП), индекса массы тела, наличия курения и семейного анамнеза по ИМ и ИБС определило четыре параметра, оказывающие статистически достоверное влияние на риск развития ИМ в возрасте до 45 лет: величины уровней ТГ, ХС ЛПНП, ЛП(а) и наличие курения. Логично предположить, что вклад аллелей С/Т полиморфизма в позиции +93 гена апо(а) в развитие ИМ происходит именно за счет взаимосвязи с концентрацией ЛП(а). А величина уровня ЛЩа) является независимым фактором риска предрасположенности к развитию ИМ в возрасте до 45 лет.

ВЫВОДЫ:

1. В популяции Санкт-Петербурга уровень ЛП(а) находится под жестким генетическим контролем.

2. В популяции Санкт-Петербурга изменчивость уровня ЛП(а) на 35% объясняется вариабельностью числа KIV-2 повторов.

3. В группе больных с ИМ в возрасте до 45 лет найдена обратная корреляция между числом пентануклеотидных повторов в промоторной области гена аполипопротеина(а) и уровнем ЛП(а). Этот эффект не зависит от вариабельности числа KIV-2 повторов гена аполипопротеина(а).

4. В популяции г.Санкт-Петербурга повышенный уровень ЛЩа) и число KIV-2 повторов меньше 20 в гене апо(а) являются факторами риска развития ИМ в возрасте до 45 лет.

5. Аллель 4G инсерционно-делеционного полиморфизма в позиции -675 гена ИАПГ-1 достоверно чаще встречается в группе пациентов, с момента ИМ которых прошло более 6 месяцев и достоверно реже среди больных острого периода ИМ.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Volkova М, Vasina V., Obraztsova G, Schwartz E, Identification of the CT polymorphism in +93 position of Apo (a) gene by mismatch PCR-mediated site-directed mutagenesis and restriction enzyme digestion, (1996) Biochemical and Molecular Medicine, 59, 91-92.

2. Волкова M.B, Васина В.И, Фомичева E.B. Анализ распространения пентануклеотидных повторов в позиции -1373 и С/Т полиморфизма в позиции +93 гена аполипопротеина (а) в популяции больных инфарктом миокарда и в контрольной группе. Региональное научное совещание "Генофонд населения Санкт-Петербурга и прогнозирование его динамики", Тезисы докладов 1996, стр.18.

3. Volkova M., Vasina V., Fomicheva E., Schwartz E. Comparative analysis of apo(a) gene alleles distribution of pentanucleotide repeats in position -1373 and C/T transition in position +93 among myocardial infarction patients and control group in St.Petersburg, Russia.(1997) Biochemical and Molecular Medicine, 61,208-213.

4. Volkova, Maria, Fomicheva, E, Vasina, V, and Schwartz, E. Distribution of pentanucleotide repeat polymorphism in 5' region and C/T polymorphism in +93 position of apolipoprotein(a) gene among MI patients and control group. Abstract of 29th meeting of the ESHG Genoa, May 1997, P4.104.

5. Schwartz E., Volkova M., Sverdlova A., Baranovskaya S., Fomicheva E., Vasina V., Chakir Kh., Skobeleva N., Shevtsov S. Study of molecular basis of inhereted predisposition of heard disease in St.Petersburg, Russia . IVth International Symposium on Multiple Risk Factors in Cardiovascular Disease: Strategies of prevention of coronary heart disease, cardiac failure, and Stroke. USA, April 23-25, 1997, p.71.

6. Volkova M., Molchanov O., Vasina V., Fomicheva E., Solovieva D., Khavinson V., Schwartz E. Distribution of 4G/5G polymorphism in the promoter region of PAI-1 gene in myocardial infarction patients and two control group of St.Petersburg. Abstract of 30th meeting of the ESHG Genoa, May 1998, P4.068.

7. M.B. Волкова, M. Хохенеггер, В.И. Ларионова, Х-Г. Крафт, Г.Утерманн, Е.Шварц. Анализ молекулярно-генетических основ вариабельности уровня липопротеина(а) в российской популяции. Артериальная гипертензия, 1999.5:17-18.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волкова, Мария Владимировна

Список используемых сокращений.

Введение:

Актуальность проблемы.

Цели и задачи исследования.

Научная новизна полученных результатов.

Научно-практическая значимость работы.

Апробация работы.

Структура и объем диссертации.

Обзор литературы:

Липопротеин(а) . Структура и состав.

Структура гена апо(а).

Метаболизм.

Липопротеин(а) и клинические проявления атеросклероза.:.

Ингибитор активатора плазминогена 1 типа. Система фибринолиза и ингибитор активатора плазминогена типа.

Структура гена ИАПГ-1.

Метаболизм.

ИАПГ-1 и атеротромбоз.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Волкова, Мария Владимировна

112 ВЫВОДЫ:

1. В популяции Санкт-Петербурга уровень ЛП(а) находится под жестким генетическим контролем

2. В популяции Санкт-Петербурга изменчивость уровня ЛЩа) на 35% объясняется вариабельностью числа KIV-2 повторов.

3. В группе больных с ИМ в возрасте до 45 лет найдена обратная корреляция между числом пентануклеотидных повторов в промоторной области гена аполипопротеина(а) и уровнем ЛП(а). Этот эффект не зависит от вариабельности числа KIV-2 повторов гена аполипопротеина(а).

4. В популяции г.Санкт-Петербурга повышенный уровень ЛЩа) и число KIV-2 повторов меньше 2 0 в гене апо(а) являются факторами риска развития ИМ в возрасте до 45 лет.

5. Аллель 4G инсерционно-делеционного полиморфизма в позиции -675 гена ИАПГ-1 достоверно чаще встречается в группе пациентов, с момента ИМ которых прошло более б месяцев и достоверно реже среди больных острого периода ИМ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волкова, Мария Владимировна, Санкт-Петербург

1. М.В. Ежов, О.И. Афанасьева, Г.Ф. Беневоленская, А.П. Савченко, А. А. Лякишев. С.Н. Покровский. Связь фенотипа апобелка(а) с наличием ишемической болезни сердца у мужчин молодого возраста// Кардиология.-1999.-Т.39.-С.12-15.

2. Alessi M.C., Juhan-Vague I., Kooistra Т., Declerck P.J., Collen D. Insulin stimulates the synthesis of plasminogen activator Inhibitor 1 by the human hepatocellular cell line Hep G2// Thromb. Haemost.-1988.-V.60.-P.491-494.

3. Argraves K., Kozarsky -K. F., Fallon J.Т., Harpel P.C. and Strikland D.K. The atherogenic lipoprotein(a) is internalized and degraded in a process mediated by the VLDL receptor// J. Clin. Invest.-1997.-V.100.-P.2170-2181.

4. Armstrong V.W., Walli A.K. and Seidel P. Isolation, characterization and uptake in human fibroblasts of an apo(a)-free lipoprotein obtained in reduction of lipoprotein<a)// J. Lipid. Res.-1985.-V.26.-P.1314-1323.

5. Assmann G., Schulte H. and von Eckardstein A. Hypertriglyceridemia and elevated lipoprotein (a) are risk factors for major coronary events in middle-aged men/'/ Am. J. Cardiol.-1996.-V.77.-P.117 9-1184.

6. Austin M.A., Sandholzer C., Selby J.V., Newman В., Krauss R.M. and Utermann G. Lipoprotein(a) in women twins: heritability and relationship to apolipoprotein phenotypes// Am. J. Hum. Genet.-1992.-V.51.-P.829-840.

7. Bachmann F., Juhan-Vague I. and Alessi M.C. Plasminogen activator inhibitor 1 and atherothrombosis// Thromb. Haemost.-1993.-V.70.-P.138-143.

8. Bard J-M., Delattre-Lestavel S., Clavey V. , Pont P., Derudas В., Parra H-J. and Fruchard J-C. Isolation and characterisation of two sub-species of Lp(a), one containing apo E and one free of Apo E// Biochem. Biophys. Acta.-1992.-V.1127.-P.124-130.

9. Boerwinkele E., Menzel H.J., Kraft H-G. and Utermann G. Genetics of the guantitative Lp(a) lipoprotein trait// Ниш. Genet.-1989.-V.82.-P.73-78.

10. Boerwinkle E., Leffert C.C., Lackner C. , Chiesa G., Hobbs H.H. Apolipoprotein(a) gene accounts for greater than 90% of the variation in plasma lipoprotein(a) concentrations// J. Clin. Invest.-1992.-V.90.-P.52-60.

11. Boomsma D.I., Kaptain A., Kempen H.J.M., Leuven J.A. and Princen H.M.G. Lipoprotein (a): relation to other risk factorsand genetic heritability. Results from a Ditch parent-twin study// Atherosclerosis.-1993.-V.99.-P.23-33.

12. Booth N.A., Simpson A.J., Croll A., Bennett В., MacGregor I.R. PAI-1 in plasma and platelets// Brit. J. Haematol.-1988.-V.70.-P.327-333.

13. Bosma P.J., van den Berg E.A. Kooistra T. Human PAI-1 gene// J. Biol. Chem.-1988.-V.263.-P.9129-9141.

14. Breslow J.L., Azrolan N. and Bostom A. N-acetylcysteine and lipoprotein(a)// Lancet.-1992.-V.339.-P.126-127.

15. Callow M.J., Stolzf us L.J., Lawn R.M. and Rubin E.M. Expression of human apolipoprotein В and assembly of lipoprotein(a) in transgenic mice// Proc. Natl. Acad. Sci.-1994.-V.91.-P.2130-2134.

16. Carmeliet P., Collen D. Molecular genetics of the fibrinolytic and coagulation systems in haemostasis, thrombogenesis, restenosis and atherosclerosis// Curr. Opin. Lipidol.-1997.-V.8.-P.118-125.

17. Cesari M., Sartori M.T., Patrassi G.M., Vettore S., Rossi G.P. Determinants of plasma levels of plasminogen activator inhibitor-1: a study of normotensive twins// Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.-1999.-V.19.-P.316-320.

18. Cobbaert C. and Kesteroot H. Serum lipoprotein (a) levels in racially different populations// Am. J. Epidemiol.-1992.-V.136.-P. 441-449.

19. Collen D. and Lijnen HR. Basic and clinical aspects of fibrinolysis and thrombolysis// Blood.-1991.-V.78.-P.3114-3124.

20. Cox L.A., Jett C. and Hixson J.E. Molecular basis of arv apolipoprotein null allele: a splice mutation is associated with deletion of a single exon// J. Lipid. Res.-1998.-V.39.-P.1319-1326.

21. Dahlen G., Ericson C., Furberg C., Lundkvist L. and Svaerdsudd K. Studies on an extrapre-beta lipoprotein fraction// Acta. Med. Scand.-1972.-Suppl.531.-P.1-29.

22. Dichek D., Quertermous T. Thrombin regulation of mRNA levels of tissue plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor-1 in cultured human umbilical vein endothelial cells// Blood.-1989.-V.74.-P.222-228.

23. Doucet C., Huby Т., Chapman J. and Tillet J. Lipoprotein (a) in the chimpanzee: relationship of apo(a) phenotype to elevated plasma Lp<a) levels// J. Lipid. Res.-1994.-V.35.-P.263-270.

24. Drayana D.T., Hegele R.A., Haas P.E., Emi M., Wu L.L., Eaton D.L., Lawn R.M., Williams R.R., White R.L. and Lalouel J.M. Genetic linkage between lipoprotein(a) phenotype and a DNApolymorphism in the plasminogen gene// Genomics.-1988.-V.3.-P.230-236.

25. Durovic S., Marz W., Frank S. Decreased binding of apolipoprotein(a) to familial defective apolipoprotein B100 -(Arg3500Gln) // J. Biol. Chem.-1994 .-V. 269.-P. 30320-30325 .

26. Edelberg J.M. and Pizzo S.V. Lipoprotein (a) : the link between impaired fibrinolysis and atherosclerosis// Fibrinolysis.-1991.-V.5.-P.135-143.

27. Edelberg J.M., Reilly C.F., Pizzo S.V. The inhibition of tissue type plasminogen activator by plasminogen activator inhibitor-1. The effects of fibrinogen, heparin, vitronectin, and lipoprotein(a)// J. Biol. Chem.-1991.-V.266.-P.7488r7493 .

28. Edelberg J.M., Pizzo S.V. Lipoprotein {a) in the regulation of fibrinolysis// Atheroscler. Thromb.-1995.-V.2.-Suppl.1.-P.S5-7 .

29. Ehrlich K.C. and Ehrlich M. Highly repeated sites in the apolipoprotein(a) gene recognized by methylated DNA-binding protein, a sequence specific DNA-binding protein// Mol. Cell. Biol.-1990.-V.10.-P.4957-4960.

30. Emeis J.J., Kooistra T. Interleukin 1 and lipopolysaccharide induce an inhibitor of tissue-type plasminogen activator in vivo and in cultured endothelial cells// J. Exp. Med.-1986.-V.163.-P.1260-1266.

31. Eriksson P., Kallin В., van't Hooft F.M., Bavenhoim P., Hamsten A. Allele-specific increase in basal transcription of the plasminogen activator inhibitor-1 gene is associated with myocardial infarction// Proc. Natl. Acad. Sci.-1995.-V.92.-P.1851-1855.

32. Espeland M.A., Marcovina S.M., Miller V., Wood P.O., Wasilauskak C., Sherwin R. , Schrott H., Bush T.L. Effect of postmenopausal hormone therapy on lipoprotein(a) concentration// Circulation.-1998.-V.97.-P.979-986.

33. Feely J., Barry M., Keeling P.W.N., Weir D.G. and Cook T. Lipoprotein(a) in cirrhosis// BMJ.-1992.-V.304.-P.545-546.

34. Fless G.M., Pfaffinger D. and Scanu A.M. Relative affinity of human Lp-(a) , ApoB-100-Apo (a) and Apo (a) for various lipoproteins// Circulation.-1989.-V.80.-P.11-180.

35. Fless G.M., Pfaffinger 0., Eisenbart J.D. and Scanu A.M. Solubility, immunochemical and lipoprotein binding properties of apoB100-apo{a), the protein moiety of lipoprotein(a)// J. Lipid. Res.-1990.-V.31.-P.909-918.

36. Folio M. , Ginsburg D. Structure and expression "of the human gene encoding plasminogen activator inhibitor, PAI-1// Gene.-1989.-V.84.-P.447-453.

37. Frank S., Durovik S. and Kostner -G.M. The assembly of lipoprotein Lp(a)// Eur. J. Clin. Invest.-1996.-V.26.-P.109-114.

38. Frank S.L., Klisak I., Sparkes .R.S., Mohandas .Т., Tomlinson J.E., McLean J.W., Lawn. R.M. and Lusis A.J. The apolipoprotein(a) gene resides on human chromosome 6q26-27, in close proximity to the homogeneous gene for plasminogen// Am. J.

39. Hum. Genet.-1998.-V.79.-P.352-356.• v1

40. Fujii S., Sawa H., Saffitz J.E., Lucore C.L., Sobel B.E. Induction of endothelial sell expression of the plasminogen activator inhibitor type 1 gene by thrombosis in vivo// Circulation.-1992.-V.86.-P.2000-2010.

41. Gabel В., Yao Z., Young S.G., Koschinsky M.L. Carboxyl-terminal truncation of apolipoprotein BlOO inhibits lipoprotein(a) particle formation// FEBS Lett.-1994.-V.350.-P.77-81.

42. Gaubatz J.W., Chari M.V., Nava M.L., Guyton J.R. and Morisett J.D. Isolation and characterization of the two major apoproteins in human lipoprotein(a)// J. Lipid. Res.-1987.-V.28.-P.69-79.

43. Gavish D. and Breslow JL. Lipoprotein(a) reduction by N-acetylcysteine// Lancet.-1991.-V.337.-P.203-204.

44. Gaw A., Brown A., Ford I. Impact of apo(a) length polymorphism and the control of plasma Lp(a) concentrations. Evidence for a threshold effect// Arterioscler. Tromb. Vase. Biol.-1998.-V.18.-P.1870-1876.

45. Ghilain J.M., Parfondry A., Kozyreff V. and Heller F.R. Lipoprotein(a), cholesterol and coronary heart disease// Lancet.-1988.-V.2.-P.963.

46. Ghiselli G., Gaddi A., Barozzi G., Clarroc-chi A., Descovich G. Plasma lipoprotein(a) concentration in familial hypercholesterolemi-c patients without coronary artery disease// Metabolism.-1992.-V.41.-P.833-838 .

47. Ginsburg D., Zeheb R., Yang A.Y., Rafferty U.M., Andreasen P. A., Nielsen L. , Dano K., Lebo R.V., Gelehrter Т.О. cDNA cloning of human plasminogen activator inhibitor from endothelial cells// J. Clin. Invest.-1986.-V.78.-P.1673-1680.

48. Ginsburg D. Regulation of PAI-1 gene expression// Thromb. Haemost.-1991.-V.65.-P.740.

49. Grainger D.J., Kirschelohr H.L., Metcalfe J.C., Weissberg P.L., Wade D.P. and Lawn R.M. Proliferation of human smooth muscle cells promoted by lipoprotein(a)// Science.-1993.-V.260.-P.1655-1658.

50. Gries A., Malle E., Wurm H. and Kostner G.M. Influence of dietary fish oils on plasma Lp(a) levels// Thromb. Res.-1990.-V.58.-P.667-668.

51. Guevara J., Knapp R.D., Honda S., Northup S.R. and Morisett J.D. A structural assessment of the apo(a) protein of human lipoprotein (a)// Proteins.-1992.-V.12.-P.188-199.

52. Guevara J., Spurlino J., Jan A.Y., Yang C., Tulinsky A., Prasad B.V., Gaubatz J.W. and Morisett J.D. Proposed mechanismsfor binding of apo {a) kringle type 9 to apoBlOO in human lipoprotein(a)// Biophys. J.-1993.-V.64.-P.68-70.

53. Haberland M.E., Fless G., Scanu A.M. and Folgemann A.M. Modification of Lp(a) by malodialdehyde leads to avid uptake by human monocyte-macrophages// Circulation.-1989.-V.80.-P.11-163.

54. Hajjar K.A., Gavish D., Breslow J.L. and Nachmann R.L. Lipoprotein<a) modulation of endothelial cell surface fibrinolysis and its potential role in atherosclerosis// Nature.-1989.-V.339.-P.303-305.

55. Hamsten A., Wiman В., De Faire U., Blomback M. Increased plasma levels of a rapid inhibitor of tissue plasminogen activator in young survivors of myocardial infarction// N. Engl. J. Med.-1985.-V.313.-P.1557-1563.

56. Hamsten A., De Faire Y., Walldius G. , Dahlen G. , Szamosi A., Landou C., Blomback M., Wiman B. Plasminogen activator inhibitor in plasma. Risk for recurrent myocardial infarction// Lancet.-1987.-V.2.-P.3-9.

57. Hamsten A., Walldus *0., Szamosi A., Blomback M., De Faire U., Dahlen 0., Landou C. and Wiman B. Plasminogen activator inhibitor in plasma// Lancet.-1987.-V.2.-P.3.

58. Harpel P.C., Hermann A., Zhang X., Ostfeld I. and Borth W. Lipoprotein(a), plasmin modulation and atherogenesis// Thromb. Haem.-1995.-V.74.-P.382-386.

59. Hasstedt S.J., Wilson E.E., Edwards C.Q., Cannon W.N., Carmeili D. and Williams R.R. The genetics of quantitative plasma Lp{a): analysis of a large pedigree// Am. J. Med. Genet.-1983.-V.16.-P.169-188.

60. Hearn J.A., Demaio S.J., Roubin G.S., Hammerstorm M. and Sgoutas D. Predictive value of lipoprotein(a) and other serumlipoproteins in angiographic diagnosis of coronary artery disease// Am. J. Cardiol.-1990.-V.66.-P.1176-1180.

61. Hegele R.A., Sutherland S., Robertson M., Wu L., Emi M., Hopkins P.N., Williams R.R. and Lalouel J-M. The effect of genetic determinants of low density lipoprotein levels on lipoprotein{a)// Clin. Invest. Med.-1991.-V.14.-P.146-152.

62. Hegele R.A., Freeman M.R., Langer A., Connelly P.W. and Armstrong P.W. Acute reduction of lipoprotein(a) by tissue-type plasminogen activator// Circulation.-1992.-V.85.-P.2034-2038 .

63. Helmhold M. , Bigge J., Muc-he R. , Mainoo J., Thiery J., Seidel D. and Armstrong V. Contribution of the apo{a) phenotype to plasma Lp(a) concentrations shows considerable ethnic variation// J. Lipid. Res.-1992.-V.32.-P.1919-1928.

64. Hendriks H.F.J., Veenstgra J., Velthuste-Wierik E.J.M., Schaafsma G., Kluft C. Effect of moderate dose of alcohol with evening meal on fibrinolytic factors// BMJ.-1994.-V.308.-P.1003-.1005

65. Hewitt D.J., Milner C., Breckenridge C. and Macguire G. Heritability of "sinking pre-B lipoprotein level: A twin study// Clin. Genet.-1977.-V.11.-P.224-226.

66. Hixon J.E., Britten M.L., Manis G.S. and Rainwater D.L. Apolipoprotein(a) glycoprotein isoforms results from size differences in apo(a) mRNA in baboons// J. Biol. Chem.-1989.-V.264.-P.6013-6016.

67. Ichinose A.,and Kuriyama M. Detection of polymorphisms in the 5'-flanking region of the gene for apolipoprotein(a)// BBRC.-1995.-V.209.-P.372-378.

68. Ikeo К., Takahashi К. and Gojobori Т. Evolutionary origin of numerous kringles in human and simian apolipoprotein(a)// FEBS Lett.-1991.-V.287.-P.14 6-148.

69. Islam S., Gutin В., Smith C., Treiber F. and Kamboh M.I. Association of apolipoprotein(a) phenotypes in children with family history of premature coronary artery disease// Arterioscler. Thromb.-1994.-V.14.-P.1609-1616.

70. Jansson J.J., Nilsson Т.К., Johnson 0. Von Willebrandt factor in plasma: a novel risk for recurrent myocardial infarction and death// Br. Med. J.-1991.-V.66.-P.351-355.

71. Juhan-Vague I., Vague P., Alessi M.C., Badier C., Valadier J., Aillaud M.F., Atlan C. Relationship between plasma insulin, triglyceride, body mass index, and plasminogen activator inhibitor-1// Diabete. Metab.-1987.-V.13.-P.331-336.

72. Juhan-Vague I. and Alessi M.C. Plasminogen activator inhibitor-1 and atherothrombosis// Thromb. Haemost.-1993.-V. 70 .-P.138-143.

73. Juhan-Vague I., Руке S.D.M., Alessi M.C., Jespersen J., Haverkate F., Thompson S.G. Fibrinolytic factor and the risk of myocardial infarction or sudden death in patients with angina pectoris// Circulation.-1996.-V.94.-P.2057-2063.

74. Kamboh M.I., Ferrel R.E. and Kottke B.A. Expressed hypervariable polymorphism of apolipoprotein(a)// Am. J. Hum. Genet.-1991.-V.49.-P.1063-1074.

75. Klausen I.С., Beisiegel U., Menzel H.J., Rosseneu M., Niecaud V. and Faergeman 0. Apo(a) phenotypes and Lp(a) concentrations in offspring of men with and without myocardial infarction// Arterioscler. Tromb. Vase. Biol.-1995.-V.15.-P.1001-1008.

76. Klausen I.C., Sjol A., Hansen P.S., Gerdes L.U., Holler L. , Lemming L., Schroll M., Faergeman 0. Apolipoprotein (a) isoforms and coronary heart disease in men: a nested case-control study// Atherosclerosis.-1997.-V.132.-P.77-84.

77. Kliewer S., Lenhard J., Willson T.M., Patel I., Morris D., Lehmann J. A prostaglandin J2 metabolite binds peroxisome proliferator-activated receptor у and promotes adipocyte differentiation// Cell.-1995.-V.83.-P.813-819.

78. Koschinsky M.L., Beisiegel U., Henne-Bruns D., Eaton D.L. and Lawn R.M. Apolipoprotein (a) size -heterogenity is related to variable number of repeat sequences in its Mrna// Biochemistry.-1990.-V.29.-P.640-644.

79. Koschinsky M.L., Cote P., Gabel B. and Van der Hoek Y.Y. Identification of the cysteine residue in apolipoprotein(a) thatmediates extracellular coupling with apolipoproteinBlOO// J. Biol. Chem.-1993.-V.268.-P.19819-19825.

80. Kostner G.M. The affection of lipoprotein (a) by lipid lowering drugs// In: Recent aspects of diagnosis and treatment of lipoprotein disorders: impact on prevention ofratherosclerotic diseases/ Alan R. Liss Inc.-1988.-P. 255-263.

81. Kostner G.M., Gavish D., Leopold В., Bolzano K., Weintraub M.S. and Breslow J.L. HMG-CoA-reductase inhibitors lower LDL cholesterol without reducing Lp(a) levels// Circulation.-1989.-V.80.-P.1313-1319.

82. Kraft H-G., Dieplinger H., Hoye E., Utermann G. Lp(a) phenotyping by immunoblotting with policlonal and monoclonal antibodies// Atherosclerosis.-1988.-V.8.-P.212-216.

83. Kraft H-G., Koechl S., Menzel H.J., Sandholzer C., Dtermann G. A transcribed hypervariable locus controlling plasma lipoprotein{a) concentration// Hum. Genet.-1992.-V.90.-P.220-230.

84. Krempler F., Kostner G.M., Bolzano K., and Sandhofer F. Turnover of lipoprotein(a) in man// J. Clin. Invest.-1980.-V.65.-P.1483-1490.

85. Krempler F., Kostner G.M., Haslauer F. and Bolzano K. Studies on the role of specific cell surface receptors in the removal of lipoprotein(a) in man// J. Clin. Invest.-1983.-V.71.-P.1431-1441.

86. Kruithof E.K.O., Tran-Thang C., Ransijn A., Bachmann F. Demonstration of the fast-acting inhibitor of plasminogen activators in human plasma// Blood.-1984.-V.64.-P.907-913.

87. Lackner C., Boerwinkle E., Leffert C.C., Rahming T. and Hobbs H.H. Molecular basis of apolipoprotein(a) isoforms heterogenity as revealed by pulse-field electrophoresis// J. Clin. Invest.-1991.-V.87.-P.2153-2161.

88. Lackner C., Cohen J.C. and Hobbs H.H. Molecular definition of the extreme size polymorphism in apolipoprotein (a)// Hum. Mol. Genet.-1993.-V.2.-P.933-940.

89. Lahiri O.K., Bye S. A non-organic and non-enzymatic extraction method gives higher yields of genomic DNA from whole-blood samples than do nine other methods tested// J. Biochem. Biophys. Meth.-1992.-V.25.-P.193-205.

90. Lawn R.M. Lipoprotein(a) in heart disease// Sci. Am.-1993.-V.4.-P.12-22.

91. Lawn R.M. How often has Lp(a) evolved?// Clin. Genet.-1996.-V.49.-P.167-174.

92. Leerink C.B., Gimpel J.A., Kortlandt W., Bouma B.N. and Rijn van H.J.M. Kinetic analysis of lipoprotein(a) inhibition of plasminogen activation by issue plasminogen activator in vitro// Fibrinolysis.-1991.-V.5.-P.233-238.

93. Lindahl G., Gersdorf E., Menzel H.J., Duba K. , Cleve H., Humphries S. and Utermann G. The gene for the Lp (a)-specific glycoprotein is closely linked to the gene for plasminogen on chromosome 6// Hum. Genet.-1989.-V.81.-P.149-152.

94. Lingenhel A., Kraft H-G, Kotze M., Peeters A.V., Kronenberg F., Kruse R. and Utermann G. Concentrations of the atherogenic Lp (a) are elevated in FH// Eur. J. Hum. Genet.-1998. -V. 6.-P. 5060.

95. Loskutoff D.J., Samad F. The adipocyte and hemostatic balance in obesity: studies of PAI-1// Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.-1998.-V.18.-P.1-6.

96. Lucore C.L., Fujii S., Wun T.C., Sobel B.E., Billadello J.J. Regulation of the expression of type 1 plasminogen activator inhibitor in HepG2 cells by epidermal growth factor// J. Biol. Chem.-1988.-V.263.-P.15845-15848.

97. Lucore C.L., Sobel B.E. Interaction of tissue-type plasminogen activator with plasma inhibitors and their-pharmacologic implications// Circulation.-1988/-V.77.-P.660-669.

98. Lyons K.M., Stein J.H. and Smithies O. Length polymorphisms in human proline-rich protein genes generated by intragenic unequal crossing over// Genetics.-1988.-V.120.-P.267-278.

99. Makino K. and Scanu AM. Lipoprotein(a): nonhuman promate models// Lipids.-1991.-V.26.-P.679-683.

100. Malle E., Ibovnik A., Steinmetz A., Kostner G.M. and Sattler W. Identification of: glycoprotein lib as the lipoprotein(a)-binding protein an platelets// Arterioscler. Thromb.-1994.-V.14.-P.345-352.

101. Mann A.W., Kra.ft H-G, Rader D.J., Schaefer J.R., Zech L.A., Gregg R.E., Hoeg J.M. and Brewer H.B. Jr. Human in vivo -catabolism of lipoprotein(a)// Circulation.-1989.-V.80.-P.II-181.

102. Mansfield M.W., Strickland M.H., Carter M.P., Grant P.J. Polymorphisms of the plasminogen activator inhibitor-1 gene in type 1 and type 2 diabetes, and in patients with diabetic retinopathy// Thromb. Haemost.-1994.-V.71.-P.731-736.

103. Marcovina S.M., Zhang Z.H., Gaur V.P. and Albers J.J. Identification of 34 apolipoprotein(a) isoforms: differentialexpression of apolipoprotein(a) alleles between American blacks and whites// BBRC.-1993.-V.191.-P.1192-1196.

104. Marcovina S.M., Lippi G., Bagatell C.J., Bremner W.J. Testosterone-induced supression of lipoprotein(a) in normal men; relation to basal lipoprotein(a) level// Atherosclerosis.-1996.-V.122.-P.89-95.

105. McGill J.В., Schneider D.J., Arfken C.L., Lucore C.L., Sobel B.E. Factors responsible for impaired fibrinolysis in obese subjects and NIDDM patients// Diabetes .-1994 .-V.43.-P.104-109.

106. McLean J.W., Tomlinson J.E., Kuang W.J., Eaton D.L., Chen E.Y., Fless G. M. , Scanu A.-M. and Lawn R.M. DNA sequence of human apolipoprotein(a) is homologous to plasminogen// Nature.-1987.-V. 300.-P.132-137.

107. Mehta J., Mehta P., Lawson D., Saldeen Т. Plasma tissue plasminogen activator inhibitor levels in coronary artery disease: correlation with age and serum triglyceride concentrations// J. Am. Coll. Cardiol.-1987.-V.9.-P.263-268.

108. Moss A.J., Goldstein R.E., Marder V.J., Sparks C.E., Oakes

109. E., Sadler ЕГ, Eddy R. and Show's T.B// Am. J. Hum. Genet.-1987.-V.40.-P.338-350.

110. Nestel P., Noakes M., Belling В., McArthur R., Clifton P., Janus E. and Abbey'M. Plasma lipoprotein lipid and Lp(a) changes with substitution of eladic acid for oleic acid in diet// J. Lipid. Res.-1992.-V.33.-P.1029-1036.

111. Nil sson L., Oafvels M., Musakka L., Ensler K., Strickland K., Angelin В., Hamsten A. and Eriksson P. VLDL activation of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) expression: involvement of the VLDL receptor// J. Lipid. Res.-1999.-V.40.-P.913-919.

112. Nilsson Т.К., Johnson 0. The extrinic fibrinolytic system in survivors of myocardial infarction// Thromb. Res.-1987.-V.48.-P.621—630.

113. Ogorelkova M. , Gruber A., Utermann G. Molecular basis of congenital lp(a) deficiency: a frequent apo(a) 'null' mutation in Caucasians// Hum. Mol. Genet.-1999.-V.8.-P.2087-96.

114. Oseroff A., Krishnamurti €., Hassett A., Tang D. , Alving B. Plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor activities in men with coronary artery disease// J. Lab. Clin. Med.-1989.-V.113.-P.88-93.

115. Pannekoek H., Veerman H., Lambers H., Diergarde P., Verweij C.L., van Zonneveld A.J., van Mourik J.A. Endothelial plasminogen activator inhibitor (PAI): a new member of the Serpin gene family// EMBO J.-1986.-V.5.-P.2539-2544.

116. Pralong G., Calandra Т., Glauser M.P., Schellekens J., Verhoef J., Bachmann F., Kriuthof E.K.O. Plasminogen activator inhibitor-1: a new prognostic marker in septic shock// Thromb. Haemost.-1989.-V.-61.-P. 459-462.

117. Prins M.H., Hirsh J. A critical review of the relationship between impaired fibrinolysis and myocardial infarction// Amer. Heart. J.-1991.-V.122.-P.54 5-551.

118. Rath M., Niendorf A., Reblin T.M. Dietel M., Krebber H-J. and Beisiegel U. Detection and quantification of lipoprotein(a) in the arterial wall of 107 coronary bypass patients// Atherosclerosis.-1989.-V.9.-P.579-592.

119. Rath M. and Pauling L. Hypothesis: lipoprotein (a) is a surrogate for ascorbate// Proc. Natl. Acad. Sci.-1990.-V.87.-P.6204-6207.

120. Ren S., Man R.Y.K., Angel A., Shen G.X. Oxidative modification enhances lipoprotein(a)-induced overproduction of plasminogen activator inhibitor-1 in cultured vascular endothelial cells// Atherosclerosis.-1997.-V.128.-P.1-10.

121. Rhoads G.G., Dahlen G.H., Berg K., Morton N.'E. and Dannenberg A.L. Lp{a) lipoprotein as a risk factor for myocardial infarction// JAMA.-1986.-V.256.-P.2540-2544.

122. Riccio A., Lund L.R., Sartorio R. , -Lania A., Andreasen P.A., Dano K., Blasi F. The regulatory region of the human plasminogen activator inhibitor type-1 (PAI-1) gene// Nucleic. Acids. Res.-1988.-V.16.-P.2805-2824.

123. Ridker P.M., Hennekens C.H. and Stampfer M.J. A prospective study of lipoprotein (a) and the risk of myocardial infarction// Atherosclerosis.-1992.-V.92.-P. 123-12 9.

124. Ridker P.M., Hennekens C.H., Stampfer M.J. A prospective study of lipoprotein (a) and the risk of myocardial infarction// JAMA.-1993.-V.270.-P.2195-2199.

125. Ritter M.M., Suehler K., Richter W. and Schwandt P. Short and long-term effects of LDL-apheresis on lipoprotein (a) serum levels// Clin. Chem. Acta.-1990.-V.195.-P.9-16.

126. Ross R. The process of atherogenesis cellular and molecular interaction: from experimental animal models to humans// Diabetologia.-1992.-V.35(suppl.2).-P.S34-S40.

127. Rouy D., Grailhe P. , Nigon F., Chapman J. and Angles-Cano E. Lipoprotein(a) impaires generation of plasmin by fibrin-bound tissue-type plasminogen activator// Arterioscler. Thromb.-1991.-V.11.-P.629-638.

128. Samad F. and Loskutoff D.J. Tissue distribution and regulation of plasminogen activator inhibitor-1 in obese mice// Mol. Med.-1996.-V.2.-P.568-582.

129. Sandholzer C., Feussner G., Brunzell J. and Utermann G. Distribution of apolipoprotein(a) in the plasma from patients with lipoprotein lipase deficiency and with type III hyperlipoproteinemia// J. Clin. Invest.-1992.-V.90.-P.1958-1965 .

130. Sawa H., Fujii S., Sobel B.E. Augmented arterial wall expression of type I plasminogen activator inhibitor induced by thrombosis// Arterioscler. Thromb.-1992.-V.12. -P.1507-1515.

131. Schneiderman J., Sawdey M.S., Keeton M.R., Bordin G.M., Bernstein E.F., Dilley R.B., Loskutoff D.J. Increased type 1 plasminogen activator inhibitor gene expression in atherosclerotic human arteries// Proc. Natl. Acad. Sci.-1992.-V.89.-P.6998-7002.

132. Sprengers E.D. and Kluft C. Plasminogen activator inhibitors// Blood.-1987.-V.69.-P.381-387.

133. Sprengers E.D., Akkerman J.W.N., Jansen B.G. Blood platelet plasminogen activator inhibitor : two different pools of endothelial cell type plasminogen activator inhibitor in human blood// Thromb. Haemost.-1986.-V.55.-P.325.

134. Swallow D.M., Gendler S., Griffith В., Corney G., Taylor-Papadimitriou J. and Bramwell M.E. The human tumor-associatedepothelium mucins are coded by an expressed hypervariable gene locus PUM// Nature.-1987.-V.328.-P.82-84.

135. Takada Y., Takada A. Plasma levels of t-PA free PAI-1 and a complex of t-PA with PAI-1 in human males and females at various ages// Thromb. Res.-1989.-V.55.-P.601-609.

136. Takahashi Y., Tanaka Т., Minowa H., Ookubo Y., Sugimoto M., Nakajima M., Miyauchi Y., Yoshioka A. Hereditary partial deficiency of plasminogen activator inhibitor-1 associated with a lifelong bleeding tendency// Int. J. Hematol.-1996.-V.64.-P.61-68.

137. Taskinen M.R., Puolakka J., Pyorala Т., Luotola H., Bjoern M., Kaariainen J., Lahdenpera S. and Ehnholm C. Hormone replacement therapy lowers plasma ' Lp(a) concentrations// Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.-1996.-V.16.-P.1215-1221.

138. Terres W., Krewitt M., Hamm C.W. Effects of lipoprotein(a) in vitro lysis of whole blood thrombi from healthy volunteers// Thromb. Res.-1993.-V.69.-P.479.

139. Tholstrup Т., Marckmann P., Vessby B. and Sandstoerm B. Effect of fats high in individual satureated fatty acids onplasma lipoprotein(a) levels in young healthy men// J. Lipid. Res.-1995.-V.36.-P.1147-1452.

140. Utermann G., Menzel H.J., Kraft H-G., Duba H.C., Kernmler H.G. and Seit C. Lp( a) glycoprotein phenotypes.' Inheritance and relation to Lp(a)-lipoprotein concentrations i-n plasma// J. Clin. Invest.-1987.-V.80.-P.458-465.

141. Utermann G., Duba C. and Menzel H.J. Genetics of the quantitative Lp(a) lipoprotein trait. II. Inheritance of Lp(a) glycoprotein phenotypes// Hum. Genet.:-1988 .-V. 78 .-P. 4 7-50.

142. Utermann G. The mysteries of lipoprotein(a)// Science.-1989.-V.246.-P.904-910.

143. Utermann G. and Kraft H-G. Lipoprotein(a) in cirrhosis// BMJ.-1992.-V.305.-P.185.

144. Van den Ende A., van der Hoek Y.Y., Kastelein J. J.P., Koschinsky M.L., Labeur C., Rosseneu M. Lipoprotein(a)// Adv. Clin. Chem.-1996.-V.32.-P.73-134.

145. Van der Berg J.L., Weitkamp L., Kammers C.M., Weill P., Aivaliotis M.J. and Rainwater D.L. Linkage of plasminogen (pig)and apolipoprotein(a) (Lpa) in baboons// Genomics.-1991.-V.11.-P.925-930.

146. Van der Hoek Y.Y., Wittekoek M.E., Beisiegel U., Kastelein J.J. and Koschinsky M.L. The apolipoprotein(a) kringle IV repeats which differ from the major repeat kringle are present in variable-sized isoforms// Hum. Mol. Genet.-1993.-V.2.-P.361-366.

147. Vanderkerckhove Y., Baele G., De Puydt H., Weyne A. , Clement D. Plasma tissue plasminogen activator levels in patients with coronary heart disease// Thromb. Res.-1988.-V.50.-P.44 9-453 .

148. Van Meijer M., Pannekoek H. Structure of plasminogen activator inhibitor ! (PAI-1) and it's function in fibrinolysis: an update// Fibrinolysis.-1995.-V.9.-P.263-27 6.

149. Vague P., Juhan-Vague I., Alessi M.C., Badier C., Valadier J. Metformin decrease the high plasminogen activator capacity, plasma insulin and triglyceride levels in non-diabetic obese subjects// Thromb. Haemost.-1987.-V.57.-P.326-328.

150. Wade D.P., Clarke J.G., Lindahl A.C., Liu B.R., Zysow B.R., Meer K. , Schwartz K., and Lawn R.M. Genetic influences on lipoprotein(a) concentration// Biochem. Soc. Trans.-1993.-V.21.-P. 4 99-502.

151. Wade D.P., Clarke J.G., Lindahl A.C., Liu B.R., Zysov B.R., Meer K., Schwartz K., Lawn R.M. 5' control regions of the.apolipoprotein(a) gene and members of the related plasminogen family// Proc. Nat. Acad. Sci.-1993.-V.90.-P. 1369-1373.

152. Wade D.P., Puckey L.H., Knight B.L. , Acquati F., Mihalich A. and Taramelli R. Characterization of multiple enhanser regions upstream of the apolipoprotein(a) gene// J. Biol. Chem.-1997.-V.2-8.-P.30387-30399.

153. Wang X.L., Wilcken D.E.L. and Dudman N.P.B. Early expression of the apolipoprotein(a) gene: relationship between infants and their parents serum apolipoprotein (a) levels// Pediatrics.-1992.-V.89.-P.401-406.

154. Wanner C., Rader D. , Bartens W., Kramer J., Brewer H.B., Schollmeyer P. and Wieland H. Elevated plasma lipoprotein (a): in patients with the nephrotic syndrome// Ann. Intern. Med.-1993.-V.119.-P.263-269.

155. Wasylyk В., Hahn S.L., Giovane A. The ETS family of transcription factors// Eur. J. Biochem.-1993.-V.211.-P. 7-1в .

156. Wiman В., Almquist A., Sigurdardottir 0., Lindahl T. Plasminogen activator inhibitor 1 (PAI) is bound to vitronectin in plasma// FEBS Lett.-1988.-V.242.-P.125-128.

157. Zenker G., Koltringer P., Bone G. , Niederkorn K. , Pfeiffer K. and Jurgens G. Lipoprotein(a) as a strong indicator for cerebrovascular disease// Stroke.-1986.-V.17.-P.942-945.

158. Zidovetzki R. , Chen P., Fisher M., Hofman F.M. NicotineVincreases plasminogen activator inhibitor-1 production by human brain endothelial cells via protein kinase C-associated pathway// Stroke.-1999.-V.30.-P.651-655.

159. Zysov В., Lindahl G. , Wade D. , Knight В., Lawn R. C/T polymorphism in the 5' untranslated region of the apolipoprotein(a) gene introduces an upstream ATG and reduces in vitro translation// Arterioscler. Tromb. Vase. Biol.-1995.-V.15.-P.58-64.