Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

В-хромосомы восточноазиатской мыши (Apodemus peninsulae). Изменчивость и поведение в мейозе

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "В-хромосомы восточноазиатской мыши (Apodemus peninsulae). Изменчивость и поведение в мейозе"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им.Н.И.ВАВИЛОВА.

БОРЕИЕВ Талайбэк Эмилъбековкч

В-ХРОМОСОШ ВОСТОЧНОАЗКАТСКОЙ МЫШИ (АроЛешиз реп!паи1ав). ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ПОВЕДЕНИЕ В МЕЙОЗЕ

03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи УДК 576.316.79:576.35

Москва - 1991 год

Работа выполнена в лаборатории цитогенетики Института общей генетики им.Н. И.Вавилова АН СССР.

Научные руководители:

доктор биологических наук Ф.Богданов, кандидат биологических наук Ю.М.Борисов.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Г.Г.Порошеяко, кандидат биологических наук А.М.Малашенко.

Ведущее учреждение:

Институт биологии развития им.Н.К.Кольцова АН СССР.

Защита диссертации состоится "_"__ 1991 г.

в_час_мин на заседании специализированного

Ученого совета Д 0р2.49.01 при Институте общей генетики им.Н.И.Вавилова АН СССР по адресу: Москва, В-333, ул.Губкина, Д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им.Н.И.Вавилова АН СССР.

Автореферат разослан "_" _1991 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

Г.Н.Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Добавочные,иди В-хрсмоммы известны у IQI6 видов цветковых и голосеменных растений н примерно 270 видов животных, в том "числе у 30 видов млекопитающих (Борисов, 1981; Бекасова, 1934; Jones , Hess , 1982; Ciritellí et al. • 1989), -причем число описанных видов с В-хромосоиами с каждым годом увеличивается. B-хромосомы обладают несколькими характерными особенностями, что позволяет отличать их от хромосом основного набора (A-хромосом). В-хромоссмы имеют различную встречаемость в разных популяциях одного вида. Число В-хромоссм может варьировать у особей внутри популяция..при этом изменчивость чио-ла B-хромосом, как правило, не оказывает заметного влияния' на фенотип их носителей, в отличие от сверхчисяеаных A-хромосом. В-хромосомы нестабильны в митоза и мейозе. Это приводит к вариации числа добавочных хромосом в клетках одной особа (мозанвдзму по" Б-хромосомам), а также к увеличению их числа, в кейоцитах. У ряда видов растений и животных описаны щтслогаческае механизмы аккумуляции Б-хромосом в генеративной ткани ( Jon ее , Rees , 1982). В-хромосош могут содержать как гетеро-. так и эухроматин. Они влияют на ядерный фенотип, длительность клеточного цикла и на разнообразные клеточные процессы, в том числе па частоту а распределение хиазм в A-хромосомах и протекание ме2оза у межвидовых гибридов (Мопкович, 1979; Jones , Кеез , 1932). Полиморфные системы В-хромосом характеризуются стабильности» з ряду поколений и предположительно имеют адаптивное значение (Борисов, 1981; Jonea , Reeg , 1982).

Необычное по сравнению с A-хромосомами поведение В-хромосом, их широкое распространение в растительном и тавотном мире и наличие у хозяйственно важных объектов (рожь, кукуруза, лвсипа, пёОёц) обусловливают возрастающее внимание исследователей к этой категории хромосом.

Одним из малоизученных вопросоз в системе B-хромосом млекопитающих является поведение В-зромосом в мейозе. Применение световой микроскопии мейотических хромосом ограничено стадиями диакине-за и метафазы I мейоза. Новые перспективы детального изучения поведения 3-хромосом на ранних стадиях профазы I иейоза появились с разработкой метода получения тотальных препаратов сипаптонемннх

комплексов (СК) , сотшаа , Меуег , 1973). Электронношкроскопи-ческий анализ тот>.\.гых препаратов СК дает возмояность с высокой разрешающей способностью исследовать процессы синапсиса, хиазмо-образовашя В-хромосод, их СЕзшфачгского взаимодействия с А-хро-•мосомаш. Анализ синапс:-;-я В-хролисо« в некоей на основе "тотальных препаратов СК провидел V двух видов млекопитающих: чернобурых ЛИСИЦ ( ЗтЗдюваЫ. et а1„ 19В7) и енотозидной собаки ( ЗЫ чЪ е.\ 1988), Обнаружено, что некоторые В-хрсмоссмн чернобурых лисиц представляет^собой азохромосомы. Креме того, з сперматотатах отмечена тенденция к образованию ассоциаций осевых элементов В-хро-. мосол с половым бивалентом, что в соответствии с гипотезой ФореЗ-та може? влиять на фертильнссть аивотных ( ЗтеЗЛопак! еЪ 61,1987; Роге;^ 61- а1. , 1981).

'В целом, злеатрониомикроскопичзский анализ тотальных препаратов СК является современным методом изучения поведения В-здгакосом в мейозе к служит дополнительным источнике:.; информации о структуре В-зфомссом.

Удобным объектом для изучения сг.стемы В-хромосом мдекоаитай-Ш2Х является ВОСТОЧНОЭЗЕаТСКая МЫШЬ (Аройеяиа рападзиХае ), В-хромосомы которой имезт морфологические различия с А-хромосомали, разноббразвк по-размерам, отточатся высокой изменчивостью их чдо-ла (от 0 до 24) и встречаются практически у каждой особи данного вида (Борисов, 1981, 1986). Эти особенности позволяют использовать восточноазиатскую мыкь в качестве модельного объекта цитогенетиче-ских исследований системы В-хромосом млекопитающих.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы было исследование изменчивости вариантов системы В-хрсмссом востсч-ноазиатской мыши из географически удаленных точек ареала,' особенностей структурной организации и поведения В-хромосом в мейозе на основе анализа тотальных препаратов СК и препаратов датотзческих и мейотических хроыосоы методами световой и электронной микроскопии. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) провести анализ распределения В-хромосом в соматических клетках;

2) изучить характер распределения В-хромосом в сперматогониях и сперматоцитах;

3) провести сравнительный анализ распределений В-хромосом в клетках зародышевого пути и костного мозга;

4) изучить тотальные препараты СК и охарактеризовать осевые элементы В-хромосом и их поведение в мейозе.

Научная новизна и практическая значимость твботн. В работе' впервые проведено исследование поведения В-хромосом в мейозе на основе анализа тотальных препаратов СК из спершгоцитов зосточно-азиатскоа мыши. Показано, что в профазе I мейоза В-хромосомы вос-точноазиатской мыши представлены преимущественно в виде унивален- -тов. Обнаружено, что В-хромосомы формируют в профазе мейоза осевые элементы, аналогичные осевым элементам А-хршосомы. Сбнаружо-на тенденшя к расположению осевых элементов В-хромосом з непосредственной близости от полового бивалента на стадий пахитены. Выявлен мозаищзм по числу В-хромосом в клетках зародышевого пути. Проведен сравнительный анализ распределения клеток по числу В-хро-мосом з костном мозге и генеративной ткани. Пюэзанс, что эти распределения имеют различный характер. Обнаружено превышение среднего числа В-хромосом в клетках зародышевого 1гта по сравнению с клетками костного мозга. Выявлено 3 уровня изменчивости системы , В-хромосом восточноазиатской мыш: индивидуальная, тканевой (мо-заинязм) и изменчивость по вариантам дифференцзальной окраски В-хромосом.

Результата работы представляют интерес в шане выяснения закономерностей победения В-хромосом в мейозе а олунат предпосая-кой для дальнейшего исследования системы В-хромзссм млекопитающих. Полученные результаты свидетельствуют о важности сочетания световой микроскопии В-хромосом и электрснномикроскяического анализа тотальных препаратов СК, что и может найти пмр®гое применение в патогенетических исследованиях природы и роли добавочных хромосом.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 9-ой межреспубликанской научной конференции методах ученых (Фрунзе, 1*387), на Конференции молодых ученых Института ойцзи генетики им.Е.И.Вавилова АН СССР (Москва, 1988), на 7-оя Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990), на 3-ей Всесоюзной конференции "Генетика я цитология мейоза" (Новосибирск, 1990), на научном проблемном семинаре "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов® (Москва, 1990).

Структура и объе?л работы. Диссертационная работа состоит из зведешя, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований, обсуждения, зыбодов и .списка литературы.

Материалы диссертации изложены-на страницах машинописного тек:сг?а, содержат II таблиц, 5 рисунков и 58 электронно-микроскопических фотографий. Список литературы включает наименс-ваний работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Б качестве объекта исследования использоеэны ссоби восточно-азиатской мыши, обловленные в 1387-1989 гг. из природных копуляций в различных точках ареала (всего 29 животных). Основная часть материала была любезно предоставлена Ю.М.Борисовым, В.Г.Хотилови-чэм, Е.А.Новиковым и В.Ы.Малыгиным. Варианты системы В-хрбмосом у изученных особей восточноазиатской швд к места и г отлова приведены в таблице I.

Таблица I

Варианты системы В-хромосом у особей восточноазкатской ш из различных точек ареала

Ж I Зоологи-п/п ческай '' и пол

Количество

клеток

"1С* 100" "

100 100 100 12 63 25 100 58 19 23

Ъл} ТЗйаеё число В-хр.'

' "Чйсло~В-хромосом " оазтгкчных классов

I П Ш 1У у

6 7 8 9 10"

0 2 0 0 0

I 2 0 0 0

0 2 0 0 0

I I I 0 0

2 3 0 0 0

2 3 I 0 0

2 3 2 0 0

0 4 I 0 0

0 I 0 I 8

0 I 0 I . 9

0 I 0 I 10

Место отлова"

о. 7.

_ 2 _ хо87а"_

^бвЭо* *6Э0сГ 697сГ

705о* 652^

1.

50

51

50

51

53

54

55 53 53

59

60

. 5 .

2

3 2 3

5

6 7 5

10 II 12'

II

озеро, пос. Артыбаш Там ке

Там же

Западная Сибирь, заповедник "Столбы", окрестности г.Кра сно-ярска.пррай Се-

рьг р.Енисей

Продолжение

таблица I

, I 2 3 1 4 5 6 7 8 9 10

; 8. - 15 51 3 0 0 0 0 3

64 52 4 0 п 0 0 4

21 53 5 0 0 0 0 5

1 3- ^645 О* 23 53 5 0 4 '0 :о .1.

27 54 о 0 4 0 0 2

50 55 7 0 4 0 0 3

I 10. *653сГ* 78 54 6 0 2 I 0 3

13 55. 7 0 2 т 0 4

9 53 8 0 2 .1 0 5

II. 707сг* 100 53 5 I I 0 0 3

[ 12 7230*" 67 52 4 I 2 0 0 I

33 53 5 V •г 2 0 0 2

! 13. 693$ 31 64 16 I 2 I 0 12

23 65 17 I 2 I 0 13

43 66 18 I 2 I 0 14

| 14. %44о'г 15 51 3 0 0 0 0 3

72 52 4 0 0 0 0 4

.13 53 5 0 0 0 0 5

¡,15. ^6510* 83 53 7 0 2 I 0 4

49 56 8 0 2 т 0 5

1 16. 700о^ 100 56 8 т I 2 0 4

! 17, 721? 60 59 II I 0 2 0 8

40 60 12 г 0 2 0 9

¡18. 652о 12 54 6 0 2 С 0 4

62 55 7 0 2 0 0 5

15 55 8 0 2 0 0 6

П 57 9 0 2 0 0 7

¡19. 694§ 'ТТ 57 9 0 2 0 0 7

67 58 10 0 2 0 0 8

22 59 II 0 2 0 0 9

|20. 695^ 12 57 9. 0 I 2 0 6

19 58 10 0 I 2 0 7 -

47 59 II 0 I 2 0 8

! / 22 60 12 0 I 2 0 9

____II____

Восточная Сибирь, 15 км к с-з от г.Крзскоярска, левый берег р.Енисей

Там же

Там же

Там же Там же

Восточная Сибирь, Красноярский край окоесткостя г.Заозёрный

Восточная Сибирь, правый берег р.Кан, 40 км от' устья

Там же

Ханое побережье оз.Байкал, скоастности г.Еайхальска

Там же

Там же

Продолжение таблицы I

I 2 3 4 5 5 г» { 8 9 10 'II

21. 693^ 23 39 20 58 59 60 10 11 12 0 0 0 0 0 0 -3 3 3 0 0 Г) 7 8 9 Игшое побережье оз.Байкал, окрестности г.хайкальска

10 61 13 0 0 п «у 0 10

8 62 14 0 0 3 0 II

22. 37 58 10 0 0 3 0 7 Там жз

63 59 II 0 0 3 0 8

23. 701$ 100 53 6 0 2 3 0 0 Там кг

24. 706$ 25 75 59 60 11 12 0 0 2 2 0 0 0 0 9 10 Там же

25." 6980* 34 66 51 52 3 4 0 0 0 о' 2 2 0 0 1 2 Бурятская АССР, ПОС.ЙВОЛГЙНСК

26. 7150*' 100 50 2 0 0 0 0 2 Бурятская АССР, 30. км к зг-з от г Улан-Удэ

27. 717о* 91 52 4 0 0 I с 3 Там же

9 53 5 0 0 I 0 4

28. 725с/г 32 51 3 0 0 I 0 2 Там же

68 52 4 0 С 2 0 2

23. й647(/ 45 55 51 52 3 4 0 0 0 0 I I 0 0 2 3 Сев.Монголия, монастырь "Амар-Хийид"

Примечание: I - крупные метацентряки;.

П - средние мзтацентрики; Ш - мелкие метацентриют; Н - мелкие акроцентршш; У - точечные В-хромосомы.

Животные, изученные с помощью электронной ышсроскопай, отмечены (ж).

Приготовление препаратов для злектронномитфпскопического и осле сования проводили по методу Наларро ( navarro et а1Д981). Каплю суспензии клеток семенников наслаивали на поверхность гипотонического растворз (0,5$ lîaCl или 0,2М сахарозы). Затем прикасались к каплям предметным стеклом, покрытым пластиковой пленкой (0,5$ раствор пластика в хлороформе). Фиксацию проводник 4% раствором параформальдегида в 0,Ш сахарозе (рН 8,0-8,4) на льду 10 минут и промазали 30 секунд в 0,4? растворе фотофяо "Кодак" (рН 8,0). Препараты окрашивали 50$ раствором Aglio^ при 60°С в течение 2-3 часов при контроле под световым макроскопом, переносили ва бленды и исследовали в электронном микроскопе JEM -I00B. От каждого животного анализировали не менее 20 клеток на стадии пахихены.

Приготовление препаратов митотических хромосом из клеток костного мозга бедренных костей проводили по общепринятому методу Форда а Хамертона ( ?0rà , Hamerton , 1956) с модификациями (Гра-фодатский и Раджабли, 1988). Б каждом случае исследовали не менее 50 метафазных пластинок животного. Окрашивание проводили 2% расi>-вором красителя Гимза на фосфатном буфере Зеренсена (рй 6,8-7,0) з течение 15 минут или раствором азурП - эозина.

. Приготовление препаратов дня исследования хромосом в сперма-тогониях проводили по методу Вильямса ( Williams et al. ,1971). Препараты хромосом окрашивали 2% раствором красителя Гакза на фосфатном буфере Зеренсена (рН 6,8-7,0) в течение 30 минут.

Приготовление препаратов мейотических хромосом на стадиях ' диакинеза и метафазы I мейоза проводили по методу Эзанса ( Evaaa et al., 1964). Препараты окрашивали ацетоорсеином {1% раствор орсеина в 45$ уксусной кислоте) в течение 10-12 часов.

Дифференциальная окраска хромосом проводилась на препаратах хромосом из клеток костного мозга.

а -окраску хромосом осуществляла по методу Радкабли. и Кетовой (1973), Препараты окрашивали 2% раствором красителя Гимза на фосфатном буфере Зеренсена (рН 6,8-7,0) в течение 5-15 минут при контроле под световым микроскопом.

С-окраску на структурный гетерехроматин проводили по методу Сашерз (Suœner , 1972). Окрашивали А% раствором красителя Гимза .на фосфатном буфере Зеренсена (pli S,8-7,0) в те-еняе £0-40 мкзут.

IIOR -окраску ядрышкообразуюцих районов хромосом проводили по методу Ховелла и Елейна ( Howell , Black , 1980). Окрашивали 50$ раствором AgNO^ при 60°С в течение 3-5 минут. В случае не-обходимостит1редарэты подкрашивали в 2$ растворе красителя Гим-за в течение 20-30 секунд.

Статистическую обработку резуяьтатов проводили стандартными методами. Достоверность различий эмпирических распределений по числу В-хромосом в клетках костного мозга и генеративной ткани оценивали на основе критерия Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕШ.ШШЬНЫХ ИССЛЩОВАНИЙ И "ОБСУЖДЕНИЕ Ii Характеристика камотида я морфология В-хаомосом.

В хромосомных наборах восточноазиатской мыши насчитывается 48 постоянно присутствующих А-хромосом и от 0 до 24 добавочных хромосом (Борисов, 1980, 1986). Хромосомы основного набора представляют собой нисходящий по величине ряд акроцентриков. При обычной окраске морфологически можно идентифицировать Х-хромосому, которая является самым крупным акроцентриком набора и мелкую акроцентрическую х -хромосому (Радаабли, Борисов, 1279).

У исследованных наш мышей B-хромосомы встречались в числе от 2 до 18 и образовывали гетерогенную группу как по размерам, так и по морфология.

В системе В-хромосом восточноазиатской мыши условно выделено 5 классов добавочных хромосом (Борисов, 1986): I) крупные мета-центрики, равные 1-8 парам А-хромосом; 2) средние, метацентрики, равные по размерам 9-16 парам А-хромосом; 3) мелкие метацентрики, сравнимые с 17-23 парами А-хромосом; 4) мелкие акроцзнтрики, сравнимые с 17-23 парами А-хрсмоссм; 5) точечные B-хромосомы, в несколько раз меньше самых мелках А-хромосом.

В нашем материале обнаружены В-хромосомы всех пяти классов и разнообразные варианты системы В-хромосом восточноазиатской мыта. При этом наиболее часто в клетках костного мозга встречались точечные и средние метацзнтраческие В-хромосомы - соответственно в 75,9$ и 65,5$ особей. Самым вариабельным по числу оказался класс точечных В-хромосом. Сравнение частот встречаемости и изменчивости числа В-хромосом различных классов представлено в таблице 2.

Таблица 2

Частоты встречаемости В-хромосом различных классов и размах изменчивости их чиста

Классы В-хромосом 1

I 1 2 3 4 5 1

, Частота особей 8 19 16 I 22 • ,

! . * ■ ■ 27,6 65,5 55,2 3,4 75,9 1

, Число В-хромосом 1 (пределы) 0-2 0-4 0-3 0-1 0-14 ,

Таким образом, при кариологическом анализе выявляется вариабельность числа и морфологии В-хромосом, что свидетельствует о высокой индивидуальной изменчивости системы В-хромосом восточноезиатской мыши.

2.. Анализ мозаицизма по В-хромооомзм в клетках костного мозга.

У исследованных наш особей восточноазиатской мыши наблюдается Енутрииндивидуальная изменчивость числа В-хромосом в клетках костного мозга (мозаицкзм). Мозаиадзм по В-хромосомам у восточноазиатской мыши впервые был описан в работе Раджабли и Борисова (1979), а ранее был обнаружен и у некоторых других видов млекопитающих: калабу, обыкновенной лисицы, . крысозидного хомячка ( Наупал ей а!., 1959; Беляев и др., 1974; Борисов и др.,1978). Размах внутришгдивидуаяьной изменчивости числа В-хромосом предложено оценивать да количеству клеточных клонов. Клонами считаются клетки различной плоидности, если их доля составляет не менее 5% или 10% для гипер- к гипошюидных клеток соответственно (Беляев и др., 1974).

В нашем материале обнаружены животные как с мозаичным, так и стабильным кариотилама. Число клеточных клонов варьировало от I до 5.

Животные со стабильным и мозаичным кариотипами составили соответственно 31,0? и 6Э.0#, причем преобладали особи с 2 и 3 клеточными клонами - 58,7^ (Рис.1).

20 10

1 2 3 4 5 ' -

Bio.I. Частота животных с определенным числом клеточных клонов >

Следует отметить, что у ряда животных яаряяу с козаицизмом по числу В-хромосон обнаружен; мозакцизм по ах-морфологии, т.е. одинаковые по числу B-хромосом клетки могут отличаться набором 3-хрсмосом. ВнутрзйЕдивидуальнзя вариация числа B-хромосом набдзо-цалась по 3 классам. Исключение составили крупные метацентрики и мелкие акроцевтрЕки, вариация числа которых в нашем исследовании не обнаружена. Еаяболее ыитотаческа нестабильными оказались точечные и мелкие метацентрические B-хромосомы и мсзаицизм животных определялся главным образом вариацией числа B-хромосом этих классов.

Исходя из того, что причиной мозаицазма является нерасхажде-кие B-хромосом в ыатотическах делениях ( Jones , Rees , 1932) и, учитывая возможность слипания гетерохроматических районов хромосом в результате ях поздней репликации .в s -периоде, мсжно предположить, что мелкие метацентраческие и точечные В-хромосомы во-сточноазиатской мшии имеют гетэрохроматическую природу. Стабильность наследованяи-крупных и средних метацентриков может свидетельствовать о более низком удельном весе гетерохроматина к наличии эухроштических районов в них. Мозаицязм по числу и морфологии B-хромосом вызывается митотической нз стабильностью главным образом мелких ыетацентраческих и точечных В-хромосом.

3. Диай>ет>еяпкалвиая окраска В-хромооом. При дифференциальной окраске С-методом обнаружено более интенсивное окрашивание точечных B-хромосом по сравнению с аутосомами и метацентраческиш В-хромо-- сомами. Кроме того, выявлен разнообразный рисунок С- и G-окраски

добавочных хромосом (несколько вариантов) (Рис.2). Полученные нами результаты свидетельствуют о С-гетерохроыатической природе точечных В-хромосом. Нередко наблюдаемый симметричный относительно центромеры рисунок G-окраски некоторых метацентритеских В-хромосом позволяет предполагать существование в каряогапе восточно-азиатской мыши В-изохромосом.

Как известно, окраска хромосом азотнокислым серебром ( ное-охсраска) выявляет РНП ( Goodpasture , Bloom , 1975; Hau et al, 1975). При NOR-окраске яарышковые организаторы на В-хромосомах млекопитающих, как правило, на выявляются ('jocea . Rees » 1982). 7 исследованных нами животных окрашивания В-хромооом этим методом в клетках костного мозга также не наблюдалось. Ядрышковке организаторы выявлены на теломорных участках"2 пар средних по размерам аутосом.

Таким образом, полученные нами данные по дифференциальной -окраске В-хромосом свидетельствуют о существовании разнообразных типов В-хромосом, их различной структурной организации и негомоло-гичности.■

В работе выявлено, что система В-хромосом восточноазиатской мыши имеет три уровня изменчивости: индивидуальный, тканевой или внутрииндивидуальный (мозаивдзм) и изменчивость Б-хромосом ьо вариантам дифференциальной окраска.

4. Характеристика В-хромосом и типов их ассошзтай на основе анализа тотальных препаратов СК. Проведенный наш анализ тотальных препаратов распластанных пзхитенных.сперматоцятов восточноазиатской мыши показал, что СК аутосомных бивалентов имеет типичную структуру, сходную с СК других ВИДОВ млекопитающих ( Моаез, 1377). Осевые элементы Х- и У-хромосом отчетливо видан на стадиях поздней зиготены и пахитены е отличаются от боковых элементов аутосом более интенсивной окраской и раздвоением осевых тяжей Морфология и поведение полового бивалента у восточноазиатской шпш соответствуют таковым у других видов млекопитающих ( Мозез, 1977; Trea , 1977), что мокет бить использовано для идентификации под-стадий пахитены.

При исследовании тотальных препаратов СК нами обнаружено,что " В-хромосомы формируют "осевые тяги я образуют уни-, би- я мульти-валенты. Преимущественно встречаются В-униваленты (в 99$ клеток)

(таблица 3).

Таблица 3

Типы ассоциаций В-хромосом и их распределение в сперматоцитах на стадии пахитены

1 Jé Всего Число клеток, содержащих 1

1 животного клеток униваленты биваленты мультиваленты i

¡ 644 27 27 4 I i

1 645 21 21 3 I i

1 646 31 31 14 8 1

1 647 20 20 4 I \

{ , 651 20 20 2 0 i

, 653 23 23 9 I 1

1 687 26 25 6 0 1

i 683 23 23 2 0 ¡

1 689 25 24 4 I ,

| 690 23 23 3 0 i

Всего 239 237 51 13 [

i % i-------- 100 99 " 21 5 j

В-биваленты и В-мультиваленты встречались соответственно в 21% и 5% клеток. При этом наблюдались в основном В-биваленты и В~мультиваленты с неполнил синапсисом боковых элементов и фрагментами СК, что свидетельствует о частичной гомсшогичности В-хро-мосом. Кроме того, имея в виду преобладающее образование В-уни-Б£лентов (в 99% клеток), мы предполагаем, что В-хромосомы исследованных животных в основном кегомологичны друг другу. Это положение подтверждается также данными световой микроскопии В-хромосом, а именно результатами анализа их дифференциального окрашивания и обнаружением ряда вариантов С- и а -окраски В-хромосом (Рис.2).

При анализе тотальных препаратов СК нами обнаружено, что В-хромосомы восточноазиатской мыши иногда образуют структуры „ типа 1о1йЪаск , что подтверждает существование В-изохромосом в кариотипе.

В ходе анализа тотальных препаратов СК из сперматоцитов восточное зиатской мыши на стадии пахитены наш часто наблюдались скопления отдельных малых В-унивалентоз. Исходя из выявленной нами с помощью С-окраски гетерохроматической природы точечных В-хромосом, мы считаем возможным образование ими таких скоплений вследствие неспецифической конъюгации.

Таким образом, результаты анализа тотальных препаратов СК и дифференциальной окраcira В-хромосом свидетельствуют о негомо-логичности В-хромосом у исследованных животных и существовании в кариотипе восточноезяатской мшии В-изохромосом.

5. Ассотаация В-хромоссм с половым бивалентом. При анализе тотальных препаратов СК из сперматоцитов восточноазиатской мыши нами обнаружено, что в большом проценте клеток на стадии пахитены наблюдаются либо ассоциации осевых элементов половых и В-хромосом, либо осевые элементы В-хромосом располагаются в непосредственной близости от полового бивалента. К ассоциациям осевых элементов 'половых и В-хромосом мы относили: наложения, контакт концами осевых элементов, спаривание осевых тяжей половых и В-хромосом на отдельных участках, которое происходило с образованием фрагментов СК. Под непосредственной близостью расположения осевых элементов В- и половых хромосом мы подразумевали расположение их в районе полового бивалента, который условно определяли как область, границы которой проходят на расстоянии даны осевого элемента У-хромосомы от осевых тяжей половых хромосом. Аналогичный критерий расположения осевых элементов в непосредственной близости от полового бивалента применялся ранее в работе Сафро-новой и др. (1988), в которой под областью полового бивалента понималась описанная вокруг него окружность с некоторым диаметром.

Различное поведение А- и В-хромосом по отношению к половому биваленту отчетливо проявляется при сравнении абсолютных чисел осевых элементов А- и В-хромосом, находящихся в ассоциации с ХУ-бивалент-ом, в районе и вне района полового бивалента. По нашим данным, 83,4$ осевых элементов В-хромосом (против 6,6? аутосом-ных бивалентов) располагаются в районе полового бивалента или в ассоциации с ним (Рис.3). Наибольший процент осевых элементов В-хромосом, находящихся в ассоциации с половым бивалентом, отмечается в ранней пзхитене (10,8%)и понижается до 4,3$ в поздней пахитена (Рис.4). Одновременно увеличивается процент осевых эле-

а) б)

Рис.2. Варианты дифференциальной окраски средних метацентриче-ских В-хромосом а) С-окраскз, б) с-окраска

75

50

25

10 ГТТП( Щ

А -. хромосомы .В - хромосомы

Рис.3. 'Тиш распределений А- и В-хромосом по отношению к половому-биваленту (ХУ)

ЁЦ ~ ассоциация с ЗУ ¡ДЩ)- в районе ЗУ ;=}- вне района ЗУ

средняя: пахигена поздкяя пахитеша

ранняя пахктзкг.

Ряс. 4. Тиш распределений В-хромосом по отношению к половому биваленту Ш) по- подстадияы пахитены - ассоциация с ХУ

и

в районе лУ

вне района Х7

ментов В-хроносом, располагающихся в районе полового бивалента: от 62,4$ б ранней пахитене до 83,9^ в поздней пахятеке п уменьшается процент осевых элементов B-хромосом, находящихся вне района ХУ-бивалента: ст 23,8?£ в ранней пахитене до 11,8$ в поздней.

Обнаруженное нами неслучайное расположение осевых элементов В-хромосом в районе полового бивалента свидетельствует об определенном взаимодействии А- и В-хромосом в мейозе восточкоазиатской мкши. Аналогичная тенденция к расположению осевых элементов В-хромосом в непосредственной близости от полового бивалента обнаружена у черно-бурых лисиц ( Switonski et al., 1987), в связи с чем автора!.® обсуждается гипотеза Форейта о влиянии ассоциаций оссвых элементов Х- и А-хромосом на мужскую фертялькость ( Forejt at al. , 198I; Forejt , Gregorova , 1977).

Гипотеза Форейта о предполагаемом механизме мужской стерильности состоит в том, что ассоциации асинаптических участков осевых элементов аутосом с неспаренныт/ осевым элементом Х-хромосомы (пра аутосомннх. Х- и У-аутосомных транслокациях, инверсиях, три-соши и т.д.) приводят к реактивации Х-хромосомы, транскрипции части ее генов, что предположительно нарушает нормальное течение сперматогенеза ( Hotta , Chandley , IS92). Данное предположение Форейта находит подтверждения во многих исследованиях причин муж, ской стерильности у млекопитающих, в том числе человека ( chandley» 1932; Grop? et al. , 1982; Rosenmann et al. , 1985).

Свигонски я соавторы ( Switonski et al., 1937), з развитие данной гипотезы, предполагают, что в случае обнаруженных ими при анализе тотальных препаратов CK из сперматоцитов черно-бурых лисиц ассоциаций осевых алементов половых и B-хромосом, также возможно их влияние на фертильность самцов. Данное предположение подкрепляется тем обстоятельством, что влияние B-хромосом на фертильность несуках их особей широко распространено в жпвотнем мире ( Jones , Raes , 1982). При исследовании некоторых тракслокаций у мышей сделано важное дополнение к гипотезе Форейта ( Eichler et al., 1989). Обнаружено, что у стерильных животных ассоциации транслокационных конфигураций с половым бивалентом, как правило, препятствуют образованию полового пузырька. Формирование полового пузырька обычно свидетельствует о нормальном ходе сперматогенеза ( ri-

оЫег е* а1.> 1389).

Б нашем исследовании ассоциации осевых элементов половых и В-хромосом не препятствовали формированию полового пузырька. Походя из этого, и низкого процента клеток с ассоциациями осевых элементов половых и В-хромосом {Ъ%),ш предполагаем отсутствие их влияния на фертильность самцов восточноазиатской мыши.

Таким обрззом, на основе анализа тотальных препаратов СК из сперматоцитов восточноззиатской мыши нами обнаружена тенденция к образованию скоплений осевых элементов В-хромосом в непосредственной близости от полового бивалента, вплоть до образования тесных ассоциаций с ним. Включение В-хромосом в половой пузырек предположительно происходит вследствие неспецифической конъюгации, половых и В-хромосом.

А

6. Поведение В-хромосом в метагоазе I мэйоза.

Данные таблицу 4, полученные при светомикроскопичэском исследовании сперматоцитов на стадиях диакинеза и метафазы I аейо-за, свидетельствуют о том, что наиболее частыми (80,5$ клеток) являются конфигурации Ш В-бивалент + В-ункваленты или В-унивалек-ты.Таким образом, высокая встречаемость В-уйиьалентоз на стадии диакинеза и метафазы I мэйоза подтверждает вывод о негомологич-ности большей части В-хромосом у исследованных особей восточно-азиатской мыши.

Таблица 4

Типн ассоциаций В-хромосом на стадии диакинеза-метафззы I мейоза

ЖИВОТ- Всего Число клеток с В-^хромосомами в виде ,

>ного клеток унивз-лентов I би- и унивален- тов 2 би- и унивален- тов других К0Н-1 фигурации |

1 687 27 12 7 0 , 2 1

' 688 21 < 15 ' I 4 1

, 689 23 10 10 I 2 1

1 690 35 21 II . 2 2 '

1 697 31 6 Г? 4 4 ,

1 658 24 9 7 4 4 [

| 705 25 3 тл О-О 6 I 1

[ 707 22 9 9 3 , I 1

! ВсрГО 1 р Ж л? 92 43,8 21 10,0 20 г I 9,5 |

При исследовании поведения В-хромосом в сперматогониэльных митозах я на стадиях пахитены, диаканеза и метафазы I мейоза нами обнаружена индивидуальная (тканевая) изменчивость числа В-хромосом в этих клетках, т.е. наличие мозаицкзма в клетках зародышевого пути (табл.5).

Таблица 5

Распределение чисел В-хромосом в клетках костного мозга, спэрматоцитах и сперматогониальных митозах.

| жив02-, ного 1 Тип препарата Всего клеток Кол-во клоков Среднее число В-хромосом Коэф. вариации 1 ^ i 1 ? !

1 т 2 3 4 5 3 7 1 8 1

1 64-1 км 87 3 4,01+0,03 17,7 8,79 <0,01!

сп 27 5 6,55+0/-47 37,2

! 645: км сп 88 21 3 5 4,06+0,07 5,38+0,62 17,2 52,4 4,0 <0,01}

I 646 км сп П8 31 3 6 5,89+0,06 6,65+0,44 12,0 37,1 2,76 <0,0Р

1 647 км сп 98 20 2 5 3,50±0,06 4,10+0,36 16,0 38,8 3,0 <0,01}

| 651 км сп 144 20 3 7 7,79+0,08 7,85+0,36 13.4 23.5 0,52 >0,05!

1 653 км сц 99 23 3 4 6,33+0,09 7,0+0,37 14,3 26,0 2,69 <0,01}

| 687 км см 82 30 1 2 1,95±0,04 3,50+0,12 17,9 19,4 19,3 <0,011

сп 26 з 3,69+0,13 18,4 21,7 <0,011

с.д 27 3 3,48+0,14 21,6 13,9 <0,01'

! 688 км см 105 32 1 2 2,95+0,03 2,63+0,06 11,8 17,5 0,67 >0,051

сп 23 3 2,83+0,15 25,4 1,43 >0,051

сд 21 3 2,86+0,16 25,5 0,64 >0,05:

1 689 км 128 ■ I 2,13+0,04 20,9

см 31 4 3,32+0,15 25,0 10,80 <0,01}

сп 25 3 3,44+0,18 26,7 11,17 <0,01,

сд 23 4 3,26+0,18 | 26,7 9,87 <0,011 1

- 18 -

Продолжение таблица 5

1 I 2 3 4 5 J 6 1 7 8

1 1 650 км 102 I 3,05+0,05 16,1

I см 45 3 3,75^0, II 19,7 3,10 <0,

1 СП 23 3 4,09+0,19 22,0 3,50 <0,

1 1 СД 36 3 3,56+0,12 20,5 3,00 <0,

! 1 697 КМ ' од 104 31 3 4 5,91+0,08 5,10+0,20 14,2 22,4 2,65 <0,

1 1 1 ( 698 км сд 102 24 2 2 3,53±0,0о 4,0+0,16 16.4 19.5 3,35 <0,

705 кы 101 I 4,89+0,06 12,1

1 . сд 26 3 5,08+0,14 14,6 1,79 >0,

1 1 1 1. 707 . км сд 87 22 I 3 4,86^0,05 4,45+0,2 6 9,8 27,0 2,73 <0,

Примечание: км - костный мозг, см - сперматогонии,

сп - сперлатоцитн на стадии пахитены, ч сд - спешатоциты на стадии диакинеза-метафазы I мейоза.

Мозаицизы в клетках зародышевого пути характеризуется увеличением числа клеточных клонов по сравнении с клетками костного мозга. Кроме того, распределения чисая В~хромосом в сперматоцитах более вариабельно по сравнению с распределением в клетках костного мозга, о чем свидетельствуют большие"значения-коэффициента вариаади (табл.5).

Сравнение средних чисел В-хромосом в клетках костного мозга и репродуктивной ткани показало увеличение среднего числа В-хро-мосом в клетках зародышевого пути. При этом обнаружено достоверное по критерию Стьвд«ята различие средних чисел В-хромосом в этих тканях, что свидетельствует об аккумуляции В-хромосом в сперматогенезе восточноазиатской мыши.

Однако, следует отметить, что различие в средних числах В-хромосом мояет возникать такае б результате элиминации В-хромосом из соматических клеток на ранних эмбриональных стациях.

Элиминацию гетерохроматических А-хромосом и целых наборов, которая известна у нематод, циклопов и некоторых насекомых (Кикнадзе,19?5) нельзя полностью исключить и в случае с В-хромосомя-чи. Основные доводы, свидетельствующие против элиминации B-хромосом из соматических клеток и в пользу их аккумуляции в мейотическпх клетках, приведены ниже.

Как следует из нашего исследования, B-хромосомы восточноззи-атской мыши на стадия?: пахитены, диакинеза и метафэзы I мейозэ предстазленн-преимущественно в виде В-унивалентоз, Однако, В-уни-валенты, как правило, подвергаются элиминации в анафазах I и 2 делений мсйоза ( Jones, Rees , 1982). В этом случае неизбежно возникали бы особи восточноазаатской шша без добавочных хромосом, которые в действительности очень редки (Борисов, ISS3). Элиминация B-хромосом из соматических меток должна бнла бы приводить и я возникновению клеточных клонов без В-хромосом, которые в нашей работе, а также в других исследованиях не обнаружены (Борисов, 1990; Бека-сова, 1984). Следует обратить внимание к на наблюдаемое увеличение числа клеточных кленов в репродуктивной ткани по сравнению с клетками костного мозга, что, по-видимому, происходит вследствие аккумуляция В-хромооом. Кроме того, у многих видов растений и животных описана именно аккумуляция В-хромооом в репродуктивной ткана и в некоторых случаях изучен цитологический механизм их численного увеличения (Моажович, 1979; Jones ,.йебз , 1982).

Приведенные выше данные, а также обнаруженное нами увеличение числа B-хромосом в сперматогониях указывают на существование пре-мейотаческой аккумуляции В-хромосои в сперматогенезе восточноазя-атской мышя. Система B-хромосом этого зида мыши, по-видимому,- прошла немалый путь эволюции, о чем свидетельствуют ьысокгя встречаемость. В-хромос ом, наличие разнообразных морфологических типов B-хромосом, а также закономерности их популяционной изменчивости и возможная адаптивная роль (Борисов, 1988, 1978, 1990). Становление и развитие системы Б-хромосом было бы невозможным без контрольных генетических механизмов, одним из которых может быть механизм премейотической аккумуляции B-хромосом в сперматогенезе. Данный механизм, по предположению Нура ( Nur , ISS9) заключается ' з том, что: I) B-хромосомы повышают скорость деления несущих их клеток; 2) клетки- с большим числом В-хромоссм имеют больше шансов дать начало половым клеткам; 3) В-хромосомы- могут реплицироваться по крайней мере нз I раз больше, чем Й-хромосомы. Более того, вы-

сказывается мысль, что возможна контролируемая генетически., элиминация клеток с низким числом В-хромосом, а существование механизма премейотической аккумуляции В-хромоссм обусловливается эволювдон-но закрепленной необходимостью поддержания некоторого оптимального уровня В-хроыосом в популяции (Раднабли и др., 1978).

Таким образом, нами было выявлено, что распределения; чисел В-хромосом в клетках костного мозга и клетках зародышевого пути имеют различный характер. Обнаруженное увеличение среднего числа В-хромоссм в. генеративной ткани свидетельствует о существовании механизма премейотической аккумуляции В-хромосом в сперматогенезе восточноазиатской мыш,

ВЫВОДЫ

' Патогенетическое исследование особей восточноазиатской мыши из различных точек ареала, проведенное методами световой и электронной микроскопии, позволило сделать следующие выводы:

1. Выявлен индивидуальный характер изменчивости системы В-хромосом восточноазиатской мыши. Обнаружено три уровня изменчивости системы В-хромосом - вариабельность числа В-хромосом между особями (от 2 до 18) и независимая изменчивость их числа по пяти классам в следующих пределах: крупные метацентрики - от 0 до 2, средние метацентраки - от 0 до 4, мелкие метаценгрики - от О до 3, мелкие акроцентрика - от 0 до I, точечные В-хромосомы - от 0 до 14; мозаицизм по числу и морфологии В-хромосом; изменчивость рисунка в-и а -окраска морфологически сходных при рутинной окраске добавочных хромосом.

2. При исследовании тотальных препаратов СК из сперматоцитов восточноазиатской мыши установлено, что на стадиях поздней зиготе-ны и пахитены В-хромосомы, аналогично. А-хромосомам, образуют осевые алементы (тяжи) и представлены в виде уни-, би- и мультивалентов. Преимущественно встречаются В-униваленты.

3. С помощью электронно-микроскопического анализа тоталнных препаратов СК и различных методов' дифференциальной окраски хромосоь обнаружены неполная конъюгация и наличие ряда вариантов С- к й -окраски добавочных хромосом, что свидетельствует о негомодогичностн В-хромосом исследованных животных.

4. Обнаружено формирование В-хроыосомаш структур типа £о1йЬаск в профазе I мейоза'и симметричный относительно ценгро-

меры рисунок дифференциальной окраски части метаиектрических 1>-хро-сом, что указывает на существование в кариотипе восточноазяатской 1ШИ В-ИЗОХрОЦОСОМ.

5. Выявлена тенденция к располокенаа осевых элементов В-хро-мосом в районе полового бивалента, вплоть до образования тесных ассоциаций с ним на стадии пахитены. Предполагается, что данный процесс происходит вследствие неспецифической конъюгации половых и В-хромосом.

3. Показано, что распределения чисел B-хромосом в клетках костного ыозгз и клетках зародышевого пути имеют различный характер. Обнаружено увеличение среднего числа B-хромосом в генеративной ткани, что свидетельствует о существовании механизма премейотиче-ской аккумуляции B-хромосом в сперматогенезе восточноазиатской мыши.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы: '

1. Борбиев Т.Э. Световое и электрокномикроскопическое исследование добавочных хромосом восточноазиатской мыши ( Apodemus penlnsulae )//Сб. "Материалы 9 межреспубликанской научной конференции молодых ученых".-Фрунзе.-1988г.-С.201.

2. Kolomiets О.Ь., Borhiev Т.Е., Safronova b.D., Borisov Yu.M., Bogdanov Yu.F. Synaptonemal complex analysis of B-ohromosome behavior in raeiotic prophase X in the East-Asiatic mouse Apodemus penlnsulae (Muridae, Rodentia)//Cytogenet. Cell Genet.-19S8.- 7.49- P.133-137.

3. Борбиев Т. Э., Коломиец О.Л., Борисов Ю.М., Сафронова Л.Д., Богданов К-.Ф. Синаптонемные комплексы А- и B-хромосом сперма-тоцитов восточноазиатской мыши (Apodemus peninaulae)//Цитология.-1990.-Т.32.-.!з 2.- С.193-197.

4. Борбиев Т.Э., Коломиец О.Л., Сафронова Л.Д., Борисов k.M., Богданов Ю.Ф. Электронномикроскопическое исследование синапто-немного комплекса сперматоцитов восточноазиатской мыши ( Аро-(demus peninaulae )//Материалы 7 Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов".-М.-1990 г.-С.8.

5. Коломиец О.Л., Борисов iu.il., Борбиев Т. Э., Сафронова Л.Д., Богданов К.'. Ф. Поведение B-хромосом в профазе I мейоза у восточноазиатской ыыпа. Электронно-микроскопический анализ СК//Изв. СО АН СССР, сер.биол.- 1990.- 3.2.-С.4.