Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

В-фруктофуранозидаза микромицета Aspergillus niger BKMF-2259 препаративное получение и некоторые физико-химические свойства

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "В-фруктофуранозидаза микромицета Aspergillus niger BKMF-2259 препаративное получение и некоторые физико-химические свойства"

РГ8

ол

На правах рукописи

УХИНЛ Елена Юрьевна

РУКТОФУРЛНОЧИДЛЗА МИКРСМИЦБТЛ .\SPERGiLLUS Нг-.-2'2:"9 ПГРПЛРЛТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ И НЕКОТОРЫЕ ФИ31 ГКО ХИМИЧ ЕС КИЕ СВО ЙСТВА

Специальное гь 03.00 23- Биотсхноло! ¡;я

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Воронеж-1998

Работа выполнена на кафедре бчолимии и микробиологии Воронежской государственной технологической академии ( ВГТА ;

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

Жеребцов Н. А. Научный консультант - доктор технических наук, профессор

Григоров В. С.

Официальные оппоненты: - доктор технических наук, профессор

Пащенко Л. П. - кандидат биологических наук, доцент Ивамо.) Б. Ф. Всдушая организация - АООТ "Воронежслеб"

Защита состоится ¡998 г»дд а № "часов на кудлаты

диссертационного Совета Д С63.90.01 при Воронежской государственной техноло!нчес.'.оп академии по адресу • '>94017. г. Воронеж, проспект ¡'с полиции,! 9

С диссертацией можно ознакомиться к библиотеке 1311 А

Автореферат разослан ■ --"—*.

¡998 г

Ученый секретарь

диссертационного Совета, 1

доктор технических наук, »рофесеор^й^^*^«^ Григороч ¡5 С

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Ферментные препараты находят широкое применение в различных отраслях промышленности. Они уникальны по своей структуре и функции, их использование позволяет получить целевые продукты высокого качества и с большим выходом.

В исследовании ферментов наиболее актуальными являются вопросы их биосинтеза; изучение физико-химических свойств; механизма катализа; изыскание путей их рационального использования в технологии пищевых продуктов. Среди гидролитических ферментов особое внимание заслуживает ß-фруктофуранозидаза.

ß-фруктофуранозидаза (К. Ф. 3.2.1.26) широко распространена в высших растениях и микроорганизмах. Она осуществляет гидролиз сахарозы, разрывая связь, находящуюся у ß-углеродного атома остатка фруктозы. Образовавшийся при гидролизе инвертный сироп (смесь эквимолекулярных количеств глюкозы и фруктозы) находит широкое применение в производстве кондитерских изделий. Биотехнология ферментного препарата связана с подбором активных продуцентов ß-фруктофуранозидазы. В решении данного вопроса перспективными являются микромицсты рода Aspergillus, обладающие способностью к интенсивному биосинтезу этого фермента.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с тематикой научных исследований кафедры биохимии и микробиологии Воронежской государственной технологической академии по проблеме " Изыскание оптимальных условий микробного синтеза ферментов и исследование их физико-химических свойств Данная проблема включена в координационный план РАН по программе " Микробиологический синтез и научные основы микробиологического получения практически ценных веществ ".

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось выделение высокоспецифичного продуцента ß-фруктофуранозидазы, получение активного препарата для гидролиза сахаросодержащего сырья, исследование его некоторых физико-химических свойств и механизма катализа.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих основных задач:

• отбор активного продуцента ß-фруктофуранозидазы, исследование условий ее биосинтеза и рационального режима культивирования продуцента;

• разработка эффективного метода выделения и очистки [3-фруктофуранозндазь из поверхностной культуры продуцента;

• исследование некоторых физико-химических свойств фермента;

• идентификация функциональных групп фермента и исследование меха низма их каталитического действия на сахарозу;

• сопоставление рациональных режимов ферментативного и кислотногс гидролиза сахарозы;

• использование препарата р-фруктофуранозидазы в производстве некото рых пищевых продуктов.

Научная новизна. Огобран микромицет Аврег^Ииз гицег НКМ! - 2259, осу ществляющий активный биосинтез Р-фруктофуранозидазы. Подобраны рацио нальные режимы биосинтеза и состав питательной среды для твердофазноп культивирования микромицета. Разработан способ получения препарап Р-фруктофуралозидазы и предложена схема его очистки. Найдены, оптимальны! рН и температура действия фермента. Исследован процесс термической и кислот ной инактивации р-фруктофуранозидазы. На основе экспериментальных данпы: сделано сопоставление режимов кислотного и ферментативного гидролиза сахаро зы. Показана целесообразность применения полученного ферментного препарата; производстве некоторых кондитерских изделий.

Практическая значимость работы. Штамм А. niger- 2259 рекомендуете: для ферментной промышленности в качестве продукта Р-фруктофуранозидазы.

Препарат Р-фруктофуранозидазы апробирован при производстве муч пых кондитерских изделий в АООТ" Хлебозавод N 1" г. Воронежа Проведены также исследования по применению препарата в производств! диетических овощных добавок и комплексных улучшителей.

Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссерта ции докладывались на республиканских и международных конференциях и сим позиумах. Они были представлены на Международной конференци] "Прогрессивные технологии и техника пищевой промышлснности"(г. Краснодар 1994), на 1У-ом Международном симпозиуме " Экология человека: пищевые тех нологии и продукты " (Видное, 1995), Международной конференции "Научно технический прогресс в пищевой промышленности" (г. Могилев, 1995 Межрегиональной конференции "Пищевая промышленность - 2000" (г. Казаш

1996), Всероссийской конференции "Современное достижение биотехнологии" (г. Ставрополь, 1996), на научных конференциях ВГТА за 1994-1997 г. г.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 13 публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 171 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждений, заключения, выводов, списка литературы из 144 наименований и приложений. Иллюстрационный материал включает 35 рисунков, 21 таблицу.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований. При выборе продуцента ß-фруктофуранозидазы использовали культуры микромицетов родов Aspergillus, l'enicillium, Rhizopus, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Культивирование продуцента проводили твердофазным методом в колбах емкостью 750 см3, содержащих 20 г среды по воздушно-сухой массе. Выращивание осуществляли при температуре 30-32 "С в течение 48 ч

При исследовании влияния источников углерода глубинное культивирование осуществляли в колбах емкостью 750 см' содержащих по 100 см 3 питательной среды, на лабораторной качалке с частотой вращения 4 с"1 (уровень аэрации 1,4 г Oi/дм 1 ч) в течение 120 ч при 30-32 "С.

Определение активности фермента. Метод основан на определении редуцирующих веществ, образующихся в процессе гидролиза сахарозы под действием фермента. За единицу ß-фруктофуранозидазной активности принято такое количество фермента, которое катализирует образование 2 мкм редуцирующих веществ (фруктоза+ глюкоза ) за 1 мин. в стандартных условиях. Количество образующихся редуцирующих веществ в пробе определяли полу микрометодом Бертрана.

Математическое планирование эксперимента. При подборе оптимального состава питательных сред и условий культивирования продуцента для достижения максимального биосинтеза ß-фруктофуранозидазы использовали толный факторный эксперимент.

Выделение и очистка ферментов. Для выделения препаратов ферментов использовали ультрафильтрацию,осаждение органическими растворите-

лями, фракционирование сульфатом аммония, ионообменную хроматографию и гельфильтрацию.

Статистическая обработка результатов. Опыты проводились в 3-4 • кратном повторении. Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизведены в каждом опыте.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор активного продуцента Р-фруктофуранозидазы. Из 40 штаммов род; Aspergillus, Pénicillium, Rhizopns, находящихся в музее кафедры биохимии v микробиологии ВГТА, подобран микромицет, обладающий способностью i активному биосинтезу р-фруктофуранозидазы. Микромицеты выращивали твер дофазным способом в течение 44 ч при 30 "С, используя в качестве среды пше ничные отруби. Наибольшей способностью к биосинтезу р-фруктофуранозидазь обладал микромицет A. niger BKMF- 2259.

Подбор оптимальных условий для твердофазного _кул1Я1Шировп[щ: продуцента. Главным достоинством этого способа культивирования являете: высокий выход целевого продукта. В качестве основных факторов, влияю щих на биосинтез |3-фруктофуранозидазы, были выбраны температур? влажность и состав питательной среды, продолжительность выращивание Критерием оценки влияния каждого фактора на процесс биосинтеза служил активность Р-фруктофуранозидазы.

Методом множественной корреляции было получено уравнение, адекватн описывающее процесс биосинтеза Р-фруктофуранозидазы. Поиск условий макет мального биосинтеза Р-фруктофуранозидазы осуществляли по полученному ypai нению градиентным методом. В результате были получены следующие оптимаш ные соотношения параметров: температура культивирования 31 "С; продолжится! ность выращивания 48 ч; влажность питательной среды 65%; крахмалистость oip} бей 19%. При таких значениях параметров активность p-фруктофуранозидазы ра: нялась 2282 ед/г воздушно-сухой массы поверхностной культуры.

Получение препарата Р-фрустофуранозидазы из микромицета A. niger - 225 и исследование ею некоторых физико-химических свойств. Ферментный препар; p-фруктофураиозидазы получали из экстракта поверхностной культуры микромищ та методом ультрафильтрационного разделения, осаждением растворителями (этат

эм, ацетоном, изопропаполом), сульфатом аммония, гель-фильтрацией на сефадек-1х 0-25 и С-100. Эти операции позволили получить препарат с 89-кратной очисткой удельной активностью 1018 ед/ мг белка. Предложенная схема очистки обсснечи-1ет достаточно высокий выход активного препарата р-фруктофурапозидазы габл.1). Определение молекулярной массы Р-фруктофуранозидазы на сефадексе О-00 дало величину 110 кДа.

Таблица I.

Очистка р-фруктофуранозидазы А. пц>сг - 2259

Стадии очистки Активность Р-фруктофуранозидазы ,ед/м л Масса белка, мг Удельная активная, ед/ мг Степень очистки Выход, %

Ферментная вытяжка 12024,7 972,3 11,3 1,0 100

Ультрафильтрация 11232,9 821,3 13,6 1,2 84,5

Эсаждение этанолом 1: 1,5 8056,4 170,8 47,2 4,2 67,0

Высаливание сульфатом аммония при насыщении 55-75% 5892,2 62,4 94,4 8,3 49,0

Гель-фильтрация на сефадексе в-25 2885,9 11,3 255,2 22,5 19,5

Гель-фильтрация на сефадексе в-100 1262,0 1,2 1018,0 89,8 10,0

Некоторые физико-химические свойства р-фруктофуранозидазы. При идролизе сахарозы основными факторами, влияющими на активность и стабильность Р-фруктофуранозидазы, являются температура и величина рН. Остановлены рН- оптимум -4,0 и оптимальная температура -65 "С.

Опыты по кислотной инактивации Р-фруктофуранозидазы показали наиболь-дую стабильность фермента в интервале рН 4.0-5.0. При рН 4.0 и температуре 40 °С за 2 ч активность (¡юрмагга снижаюсь на 6%, а при 50 "С - на 23%. При 65 "С и рН 4,5 статочная активность составляла 49%. Повышение температуры до 70 °С привело к ще большей инактивации фермента: за 30 мин -активность его составила 10%.

Термическая инактивация Р-фруктофуранозидазы исследовалась в ин-ервале температур 30-70 "С. Фермент проявлял достаточно высокую термо-табильность в интервале температур 40-60 "С.

Сопоставление полученных данных с литературными по другим гидролазам (амилазам, протеазам) позволило сделать вывод, что Р-фруктофуранозидаза А. и^сг ВКМР- 2259 обладает высокой рН- и термостабильностью.

Несмотря на сложность перехода нативного фермента в инактивиро-ванное состояние, это т процесс для большинства ферментов является реакцией первого порядка, которая описывается уравнением:

(1)

г /',

где К- константа скорости инактивации, ч"1; Е() - исходная активность; Е-активность в момент времени г.

Поскольку инактивация была необратимой, определить ее истинные термодинамические параметры (энтальпию А Н, свободную энергию А С} эшропию А Б) оказалось затруднительно. Но, воспользовавшись теорией абсолютных скоростей реакций Эйринга, можно дать термодинамическую характеристику процесса инактивации, определив зги параметры для актив1грованногокомплекса А Н *, А С ', А Б* (табл. 2).

Из табл. 2 видно, что инактивация |3-фруктофуранозидазы А. ш'рег- 2259 носит сложный характер; в формировании белковой глобулы фермента участвуют, видимо, два типа взаимодействий - различные виды электростатических связей и гидрофобные взаимодействия. Можно предположить существование двух параллельных реакций с различными температурными коэффициентами.

Таблица 2.

Термодинамическая характеристика активированного комплекса процесса

кинетики инактивации р-фруктофуранозидазы А. ш'^ег- 2259

Температура, °С рН Еакт АН', кДж. моль"1 АС, кДж» моль"' Дв', Дж. град"'. моль"1

30-60 3,0 134,58 131,96 89,63 128,27

60-70 3,0 312,49 310,04 67,80 821,15

30-60 4,0 113,25 110,63 90,83 60,00

60-70 4,0 291,53 289,08 72,16 735,32

30-60 5,0 121,52 118,90 90,32 86,61

60-70 5,0 301,75 299,30 70,60 775,25

30-60 6,0 163,55 160,93 87,85 221,45

60-70 6,0 255,05 252,60 62,87 643,15

В зоне рН 3,0-6,0 и температурах (30-60 ПС) происходит разрушение сла-)ых электростатических связей, по всей видимости, водородных, которые иг->ают незначительную роль в формировании белковой глобулы. Об этом свиде-сльствуют небольшие изменения энтропии ДБ*. При повышении температу-1Ы от 60 до 70°С скорость инактивации возрастает. Тепловая энергия вызы-;аст интенсивное разрушение гидрофобных взаимодействий. В результате фоисходит более глубокое развертывание полипептидной цепи, случайное »асположение ее участков относительно друг друга, что подтверждается вы-окими значениями энтропии ДБ*.

Идентификация функциональных групп активного центра >-фруктофуранозидазы А. шеег - 2259. Идентификация функциональных рупп является важным подходом в исследовании механизма действия ферментов. 1тобы идентифицировать функциональные группы, входящие в активный центр фермента, мы находим несколько независимых экспериментальных критериев. Это (ало возможность заключить о механизме действия ферментов.

С этой целью были проведены исследования по влиянию диэтнмпирокарбопата ¡а акгивпость |5-фрукгофуранозидазы, получсил зависимость активности (¡»ермеша от )Н, рассчитаны величины рК и теплоты ионизации ионных групп активного центра рермента.

Величины рК определили по кинетической зависимости скорости феррита от рН (рис. 1). Профиль кривой характерен для кривой диссоциации юнных групп аминокислот и свидетельствует об участии в элементном акте взрыва Р—1.2 — гликозидной связи в сахарозе двух функциональных групп.

По методу (Жеребцов, 1997) были определены рК| и рК2; для 1-фруктофуранозидазы А. ш'сег-2259 они оказались равными рК, = 2,6, рК2 = ,6. Эти величины показывают, что в формировании активного центра фер-[ента участвуют карбоксильная группа либо глутаминовой, либо аспараги-овой, либо какой-то другой С - концевой аминокислоты и имидазольная руппа гистидина.

Наличие в активном центре (3-фруктофуранозидазы карбоксильной и мидазольной групп подтверждают найденные нами величины теплоты нотации этих групп. Рассчитанная по уравнению Вант-Гоффа теплота иони-ации функиональных групп оказалась равна для восходящей ветви кривой

2

--- -

\ V

-* - — >

!

рк.

\

рк2

Рис. 1. Зависимость (рН) при температуре, °С : 1 - 5; 2 - 60;

начальная скорость реакции, % от максимальной.

9,9 кДж/моль и для нисходящей -34,3 кДж/моль, что соответствует тсплотам ионизации карбоксильной и имидазольной групп.

Типичной реакцией на имидазольную группу гистидина является фотоокисление, вызывающее разрыв имидазольного кольца. Фотоокисление осуществляли при разных значениях рН и температуры в присутствии метиленового синего, играющего роль фотосеисибилизатора (рис. 2 ).

Р - фруктофуранозидаза подвергалась интенсивной фотоинактивации, которая описывается уравнением реакции первого порядка. На рис. 3 представлена зависимость константы скорости инактивации от рН [К=Т(рН)]. Кривая этой зависимости имеет Б - образную форму. Прямая, проведеннная

Рис. 2. Динамика инактивации р - фруктофуранозидазы Л. niger - 2259 фотоокислением при рН: 1 - 3.0; 2 - 4.0; 3 - 5.0; 4 - 6.0; 5 - 7.0.

гараплелыю оси абсцисс на расстоянии от нее, равном Ко / 2, дает точку пе->есечения с кривой, соответствующую рК?/ 5,2, характерную для имидазоль-юй группы гистидипа.

КИСЛОТНЫЙ И ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ САХАРОЗЫ Динамика и кинетика кислотного и ферментативного гидролиза саха-юзы. Для изучения динамики и кинетики гидролиза сахарозы гидролизиро-1апи 10%-ный раствор сахарозы при различных рН и температуре 100"С табл. 3).

к, ч '

к,

7 рН

фрукгофуранозидазы

3 4 5 Рм 5-2 6

Рис. 3. Зависимость К = {" (рН) при фотоокислении р

А. 1%ег - 2259.

Таблица 3.

Динамика и кинетика кислотной инверсии 10%-ного раствора сахарозы при

температуре 100 "С

Продолжительность гидролиза, ч РН

5,0 2,0

сг,% Д СГ,% К, ч Д

0,1 0,74 0,11 0,09 65,40 10,6 2,5

0,2 1,82 0,11 0,20 88,20 10,5 3,1

0,3 2,67 0,10 0,30 94,20 10,0 4,9

0,5 4,05 0,10 0,50 96,50 9,8 5,2

1,0 7,74 0,10 0,60 88,90 2,2 6,7

2,0 17,50 0,09 0,80 76,10 0,7 7,8

4,0 23,70 0,09 1,10 64,25 0,3 9,1

Из табл. 3 видно, что при рН 5,0 увеличение степени гидролиза (СГ) ыло весьма незначительным, через 4ч было ирогидролизировано лишь 24% 1харозы. Несущественным было и наращивание оптической плотности (О) . инетика гидролиза сахарозы в этих условиях представляла собой типичную гакцию первого порядка. Иная картина наблюдалась при рН 2,0. Через 30 ин сахароза была полностью прогидролизиропана (СГ = 96,5 %). В даль-ейшем СГ уменьшалась, что связано с разложением инвертного сахара, с олимеризацией и конденсацией продуктов этого разложения. При этом ве-ичина О была па порядок выше, чем при рН 5,0. Величина К была постоян-ой вплоть до СГ - 96,5%, затем она резко снижалась, что связано с инпен-ивным разложением инвертного сахара, о чем свидетельствует уменьшение .'Г и нарастание О.

Исследование кинетики ферментативного гидролиза сахарозы | — фруктофуранозидазой А. тнрег - 2259 проводили в растворах 2- 80 %-ной онцентрации. Зависимость динамики и кинетики гидролиза от концентрации ахарозы при температуре 30"С и рН 4,0 представлена в табл. 4.

Таблица 4.

Влияние концентрации субстрата на скорость гидролиза сахарозы

(3 - фруктофуранозидазой А. ш^ег - 2259

Время гидролиза, ч Концентрация сахарозы, %

2 10 40 80

СГ,% К,ч СГ,% К,ч СГ,% К,ч СГ,% К,ч

0,5 89,2 2,21 64,3 0,64 11,8 0,112 7,2 0,020

1,0 94,0 2,42 68,5 0,68 26,1 0,110 12,4 0,024

1,5 97,3 2,17 70,8 0,67 46,8 0,110 20,7 0,022

2,0 98,9 2,19 75,6 0,65 60,7 0,113 46,9 0,023

3,0 99,5 1,97 80,2 0,63 73,6 0,114 58,4 0,024

4,0 99,5 1,94 84,4 0,62 82,1 0,110 65,8 0,025

12,0 99,6 1,92 98,3 0,60 98,9 0,112 98,8 0,024

Из табл. 4 видно, что гидролиз сахарозы хорошо описывается уравнением еакции первого порядка. При увеличении концентрации сахарозы в растворе с до 80% К резко снижалась примерно в 80 раз. Это объясняется тем, что при 0%-ной концентрации на одну молекулу сахарозы приходится меньшее коли-ество фермента, чем для 2%-ной сахарозы.

О механизме кислотного и ферментативного гидролиза сахарозы. При кислотном гидролизе в основе механизма разрыва гликозидной связи в молекуле сахарозы лежит нуклеофильная атака Н+-ионов на эту связь (рис. 4). Причиной атаки является неравномерное распределение электронной плотности в гликозидной связи сахарозы. Атом кислорода этой связи, обладая большим отрицательным эффектом, будет иметь и большую электронную плотность, чем С1 и Сг гликозидной связи. Уменьшение электронной плотности у последних связано также с индукционным воздействием на них атомов кислорода пиранозного кольца глюкозы и фуранозного кольца фруктозы. Это и является причиной электрофильной атаки Н+-ионами атома кислорода гликозидной связи и разрыва последней.

I 2 5- сн,он

I--о I

ОН он

+ Н +

, хг НО

/ \ I >

О [ 1 сн,он - Н *

сн,он

I ' сн,он _ >-о I -^о

сн,он

он

он

ь

о

ОН j он

®

но

сн,он

н

сн,он

IZL. ,

— к_)* м г УСЗ__г

ОН I ' \ н ОН | СН,ОН ¿н I он

ОН он ОН

свободная свободная

фруктоза глюкоза

Рис.4. Механизм разрыва гликозидной связи в молекуле сахарозы под действием Н - ионов. Исследования ферментативного гидролиза показали, что р - фрукгофураиозидаза A. niger - 2259 гидролизует инулин, на одну треть рафинозу; фермент не дей-

л-вует на мальтозу. Это свидетельствует о том, что Р - фруктофуранозидаза этщепляет от сахарозы фруктозу, разрывая О-С2 связи, но не С|-0 -связь, находящуюся со стороны остатка молекулы глюкозы. Причиной расщепления 0-С2 связи Р - фруктофуранозидазой является та же самая высокая электрон-пая плотность О - атома связи, что и при кислотном гидролизе сахарозы. Образуется комплекс между этой связью и системой карбоксилат-имидазолий,

Рис. 5. Механизм расщепления гликозидной связи в молекуле сахарозы р - фруктофуранозидазой А. шдег - 2259.

ведущий к перераспределению электронов в ней (рис. 5). Нуклеофильная атака связи молекулой воды {ЬО завершает ее расщепление.

Применение ферментного препарата р - фруктофуранозидазы в производстве хлебобулочных изделий. Разработан метод получения ииверт-ного сиропа ферментативным способом. Установлено, что наилучший результат достигается при температуре 65 "С, рН 4,0, дозировке фермента 15 ед/ г, концентрации субстрата 70 %. Такие условия позволяют достичь 100%-ную степень гидролиза за 240-300 мии,

Получен полуфабрикат диетического назначения для мучных кондитерских изделий, а также комплексный улучшитель на основе ферментного препарата. Показана целесообразность использования его в рецептурах сахарного и затяжного печенья.

выводы

1. Из 40 штаммов микроорганизмов отобран Aspergillus niger - 225* осуществляющий интенсивный биосинтез р - фруктофуранозидазы. Это штамм относится к термотолсрантным микроорганизмам;

2. При твердофазном культивировании эффективный биосинте Р - фруктофуранозидазы микромицетом Aspergillus niger - 2259 идет пр следующих условиях: температура - 31 °С; продолжительное! выращивания 48 ч; влажность питательной среды 65 %; крахмалистое-! отрубей - 19%. При таких значениях параметров активное! р - фруктофуранозидазы была 2280 ед/г;

3. Разработана схема получения высокоочищенного препарат Р - фруктофуранозидазы, включающая в себя ультрафильграцию <|)Cf ментпой вытяжки на мембране 0,03 мкм; осаждение этанолом соотношении объемов I: 1.5; высаливание сульфатом аммония при нась щении 55-75 %; гель-фильтрацию на сефадексах G-25 и G-100. Удельна активность высокоочищенного препарата р - фруктофуранозидазы был 1017 ед/мг;

4. Инактивация фермента описывается уравнением реакции первого порядк; Р - фруктофуранозидаза Aspergillus niger - 2259 обладает высоко кислотной и термической устойчивостью (рН 4,0, температура 65 °С),

5. Расчет термодинамических параметров в процессе инактивации позволи. заключить, что в формировании белковой глобулы фермента важную рол играют гидрофобные взаимодействия;

6. Профиль кривой активность Р - фруктофуранозидазы- рН, величины р! ионогенных групп, расчет теплот ионизации, фотоинактивация фермент; в присутствии метиленового синого позволили заключить, что в катали тический центр фермента входит система карбоксилат- имидазолий Предложен механизм разрыва гликозидной связи в сахарозе под действи ем р - фруктофуранозидазы, осуществляющийся по типу кислотно- ос новного (электрофильно-нуклеофильного) катализа;

7. Оптимальными параметрами кислотного гидролиза сахарозы оказались рН 2,0; температура 100 °С; продолжительность гидролиза 30 мин; прт

ферментативном гидролизе: pH 4,0;температура 60 "С; дозировка ферментного препарата 6 ед/г; продолжительность 120 мин; >. Предложен ферментативный способ получения ипвертного сиропа; получен полуфабрикат диетического назначения из свекольного пюре; выбрана рецептура диабетического печенья, характеризующегося пониженной энергетической ценностью; предложен комплексный улучшитель для сахарного и затяжного печенья на основе ферментного препарата.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Жеребцов H.A., Ухина Е.Ю. Биосинтез ß - фруктофуранозидазы Aspergillus niger - 2259 // Прогрессивные технологии и техника в пищевой промышленности: Тез. докл. межд. конф.-Краснодар, 1994. - с. 107.

2. Ухина Е.Ю., Григоров B.C. Исследования по выбору оптимальных параметров для биосинтеза ß - фруктофуранозидазы Aspergillus niger - 2259// Материалы XXXIV отчет, науч конф. ВГТА за 1994 г. - Воронеж, 1994,- с.146.

3. Ухина Е.Ю. ß - фруктофуранозидаза микромицета Aspergillus niger - 2259 // Материалы научи, конф. молодых учен,, аспир. и студ. ВГТА,- Воронеж, 1995,-с. 142-144,

4. Ухина Е.Ю., Дерканосова Н.М, Ферментативное получение ипвертного сиропа // Экология человека: Пищевые технологии и продукты: Тез. докл. [V Межд. симп,- Видное, 1995.-с.335.

5. Ухина Е.Ю., Дерканосова Н.М. Модели принятия технологических решений в нечетких условиях // Информационные технологии и системы: Тез. докл. Всерос. конф,-Воронеж, 1995 -с.54.

6. Ухина Е.Ю., Дерканосова Н.М., Пономарева И.Н. Перспективы применения новой активной ß - фруктофуранозидазы в производстве мучных кондитерских изделий // Научно- технический прогресс в пищевой промышленности: Тез. доки. Межд. науч.-техн. конф,- Могилев, 1995. с. 17.

7. Ухина Е.Ю. Новый диетический полуфабрикат// Молодежь и проблемы информационного и экологического мониторинга:Тез. докл. Рос. молод, симпозиума- Воронеж, 1996. -с. 130.

8. Ухина Е.Ю., Дерканосова Н.М. Применение комплексного улучшителя на основе ферментного препарата в производстве сахарного печенья// Пище-

вая прмышленкость -2000: 'Гез. докл. Межрегион, науч.-нракт. koikJ Казань, 1996.-е. 57.

9. Ухина Е.Ю., Дерканосова Н.М. Новый комплексный улучшитель в penei туре затяжного печенья// Современные достижения биотехнологии: Тс докл. Всерос. конф,- Ставрополь, 1996,- с.227.

10. Ухина Е.Ю., Дерканосова Н.М., Жеребцов H.A. Обоснование параметре биосинтеза и использования ß - фруктофуранозидазы в производстве п< ченья// Известия ВУЗов. Пищевая технология.- 1996,- N 3-4,- с.33-34.

11. Ухина Е.Ю., Дерканосова Н.М., Жеребцов H.A. Гидролизованнос св< кольное пюре в рецептуре диетического печенья.// Вестник Российскс Академии сельскохозяйственных наук,- I996.-N 4,- с.79-80.

12. Жеребцов H.A., Ухина Е.Ю., Руадзе И.Д., Яковлев А.Н. Исследоваш механизма кислотного гидролиза сахарозы.// Известия ВУЗов. Пищсв; технология,- 1997,- N 2-3,- с.36-38.

13. Жеребцов H.A., Корнеева О.С., Черемушкина И.В., Ухина Е Ю. Кисло ный гидролиз дисахаридов// Экология и безопасность жизнедеятельност] Межвуз. сб. науч тр. Вып. 2,- Воронеж, 1997- с. 95-98.

Лицензия ЛР № 0.!06! 5 от 28.0? 1994 г Международная аказсмия информатизации.

Подписано з печать !.4.05.1>8 г. Формат 84x108 Усл.кеч..! 1.0 Тираж 100 жз. Пумага для мко;кигельны.\ аппаратов Заказ 45. Отпечатано: Участок оперативной полиграфии РНКЦ «Рснакорд»