Устойчивость растений горчицы к засолению и возможная роль пролина

Гринин, Антон Леонидович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Устойчивость растений горчицы к засолению и возможная роль пролина
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Устойчивость растений горчицы к засолению и возможная роль пролина"

На правах рукопись

ГРИЫИН Антон Леонидович

УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ ГОРЧИЦЫ К ЗАСОЛЕНИЮ И ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ ПРОЛИНА

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

1 7 ИЮН 2910

004605234

Работа выполнена в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва.

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Холодова Валентина Павловна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Тараканов Иван Германович

Доктор биологических наук, профессор Хрянин Виктор Николаевич

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет.

Защита состоится «22» июня 2010 г. в 1300 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.

Факс: (495) 977-80-18, e-mail: ifr@ippras.ru: m-azarkovich@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан «20 » мая 2010 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди неблагоприятных для растений факторов одним из самых распространенных является засоление. По последним данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН, более 800 млн га земли подвержены засолению. Воздействие хлоридного засоления значительно нарушает корневое питание и водный режим гликофитов, ингибирует процесс фотосинтеза, в результате чего подавляется рост растений и их урожайность (Flowers, 2004). Ценная сельскохозяйственная масличная культура горчица сарептская (Brassica juncea L.) культивируется в России преимущественно в условиях аридных зон, где около половины всех распаханных земель подвержены засолению. Важной практической задачей является отбор высокоурожайных сортов горчицы с повышенной солеустойчиво-стью.

Избыточное поступление солей в клетки растений при засолении сдвигает ионный баланс, нарушает структуру и функции макромолекул, инициирует избыточный синтез активных форм кислорода (АФК). Однако помимо прямого токсичного действия, засоление вызывает у растений осмотический стресс, обусловленный резким падением водного потенциала корнеобитаемой среды растения (Кузнецов, Шевякова, 1999). В ответ на нарушение баланса неорганических ионов и водного статуса в растении включается ряд антистрессорных механизмов, к которым относятся активация поглощения солей из среды с целью восстановления потока воды в растении и сопровождающая этот процесс аккумуляция в клетках совместимых осмолитов (Kumar, 2009). Одним из наиболее распространённых и важных осмолитов считается имино-кислота пролин (Про) (Misra, Saxenaa, 2009; Yousfi et al., 2010). Однако в настоящее время накапливается все больше данных, что у гликофитов осмотическая функция Про часто не выполняется или она не является основной (Munns, 2008; Verbruggen, Hermans, 2009; Attri et al., 2010). Ряд исследователей прямо критикуют идею о функционировании Про в качестве осмолита (Gagneul et al., 2007; Larher et al., 2009). В литературе до сих пор не существует систематического анализа соотношения концентраций NaCl индуцируемого Про с концентрациями накапливаемых в клетках ионов натрия и хлора.

В последние годы все больше говорится о Про как о химическом шапероне, способном защищать макромолекулы, сохраняя их нативную структуру и биологическую активность (Diamant et al., 2001; Chattopadhyay et al, 2004). Развитие представлений о химических шаперонах имеет важное практическое значение для понимания адаптационных процессов и разработки новых технологий консервации ферментов для медицинских целей и химической промышленности.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение некоторых физиологических и молекулярных механизмов адаптации растений горчицы к солевому стрессу и выяснение возможной роли пролина.

В связи с данной целью были поставлены следующие задачи:

1. Оценить устойчивость к засолению различных сортов горчицы.

2. Изучить взаимосвязи содержания Про с содержанием неорганических ионов, мРНК P5CS (ген пирролин-5-карбоксилат синтазы), мРНК PDH (ген пролин-дегидрогиназы) и величиной осмотического потенциала в условиях засоления.

3. Исследовать роль N0 в регуляции содержания Про при засолении.

4. Изучить возможность функционирования Про в качестве химического шаперона в условиях засоления.

Научная новизна. На основе ряда физиологических и биохимических параметров впервые проведена оценка на солеустойчявость нескольких отечественных сортов горчицы, активно используемых в сельском хозяйстве. Достоверно установлено явление резкого падения концентрации Про при продолжительном засолении. Впервые показано, что сигнальная функция оксида азота на начальных этапах засоления реализовалась в быстром повышении концентрации Na+, СГ и К+, вероятно, за счет активации ионных каналов в листьях горчицы, что вызывало дополнительную аккумуляцию Про. В модельных опытах впервые установлено, что Про в условиях засоления способен обеспечивать поддержание активности фермента малатдегидро-гиназы (МДГ), что свидетельствовало в пользу его функционирования в качестве химического шаперона. Выдвинуто предположение, что в условиях засоления выравнивание осмотического потенциала основных компартментов клетки могло осуществляться за счет аккумуляции в цитоплазме ионов К.

Практическая значимость. Полученные в работе данные по сортовым различиям растений горчицы в условиях засоления могут быть использованы в подборе сортов для выращивания растений на засоленных почвах. Исследования уточняют представления об осморегуляторной функции Про, о сигнальных процессах в растении и дают возможность высказать предположение об осморегуляторной роли ионов калия в цитоплазме. Данные по функционированию Про в качестве химического ша-перона имеют большой практический интерес для медицинских целей и химической промышленности в разработке сред для эффективной консервации ферментов. Теоретические обобщения и совокупность полученных экспериментальных данных могут использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов вузов страны.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007); международной научной конференциях «Физико-химические основы структурно-функциональней организации растений» (Екатеринбург, 2008); международной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего севера» (Апатиты, 2009), конференции молодых ученных ИФР РАН (Москва 2008,2009 годы).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них две статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных результатов и обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, включая 5 таблиц, 31 рисунков; библиография содержит 250 название, в т.ч. 219 на иностранных языках.

ОБЪЕКТ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования была выбрана горчица сарептская (Brássica júncea L.) - однолетнее травянистое, ценное сельскохозяйственное растение. Семена горчицы предоставлены Донским филиалом ВНИИМК Ростовской области. Исследовали высокопродуктивные сорта, активно используемые в сельском хозяйстве и пищевой

промышленности: Донской, Jlepa, Славянка и Скороспелка. Условия выращивания. Растения выращивали на модифицированной среде Хогланда-Снайдерс при 12-часовом световом периоде и освещенности 37,6 Вт/м3 люминесцентными лампами Philips (F36W/54), температуре воздуха - 23±1°С/15±1°С, относительной влажности -55/70% день/ночь. Условия проведения опытов. Дезинфицированные семена проращивали в кюветах с перлитом в течение 14 суток, после чего проростки пересаживали в пластиковые сосуды объемом 1000 мл на модифицированную среду Хогланда-Снайдерс. По достижению растениями ^-недельного возраста в питательный раствор опытных вариантов вносили NaCl в концентрации 100 и 150 мМ, проводя смену питательной среды каждые 5 суток. Действие засоления продолжалось до 35 суток, фиксацию растительного материала проводили в 12-14 часов жидким азотом и хранили при -70°С. Измерение свежей массы отдельных органов растений проводили стандартным весовым методом. Определение содержания К+ и Na+ проводили с помощью пламенного фотометра LEKI FP-640, фирмы LEKI Instruments (Финляндия). Измерения концентрации СГ и N03" проводили на ионолайзере ЕА 940, фирмы Orion Research lnc (США) с помощью ионоселективных электродов этой же фирмы и фирмы Metter Toledo (США). Осмотический потенциал измеряли криоскопическим методом на осмометре Osmomat 030, фирмы Gonotac (США). Величину осмотического потенциала выражали в МПа. Содержание свободного пролила определяли с помощью кислого нингидринового реактива (30 мл ледяной уксусной кислоты + 20 мл 6М Н3РО4 + 1,25 г нингидрина) (Bates et al. 1973). Активность пролиидегидрогнназы (ПДГ (ЕС:1.5.1.2)) оценивали по скорости использования НАД+ на окисление проли-на, измеряя увеличение концентрации образующегося НАДН в единицу времени (Mattioni et al., 1997). Определение содержания Сахаров проводили фенольным методом (Dubois et al.,1956) с небольшими модификациями. Содержание мРНК P5CS и PDH проводили методом обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Тотальную РНК выделяли с использованием RNeasy Mini Kit фирмы QIAGEN. Реакцию обратной транскрипции проводили по руководству фирмы Fermentas. Для ПЦР использовали ДНК-амплификатор 2720 Thermal Cycler фирмы Applied Biosystems (США). Специфические праймеры для проведения ПЦР генов P5CS и PDH конструировали с использованием базы данных Национальной медицинской библиотеки (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) в среде Vector NTI 9.0.0. Для выяснения меха-

низмов защитного действия N0 в условиях стресса в качестве донора N0 использовали нитропруссид натрия Nai[Fe(CN)5]NO (SNP); структурным аналогом нитро-пруссида, не являющимся донором NO, служил гексацианофсррат калия K3Fe(CN)6 (Кз-ГЦФ), а в качестве скэвенджера N0 использовали (2-(4 carboxtphenyl)-4,4.5,5-tetramethyl-imidozoline-l-oxyl-3-oxide) (cPTIO). Функционирование Про в качестве химического шапероиа определяли по способности пролина сохранять активность фермента малатдегидрогиназы (МДГ) под воздействием NaCl in vitro. Измерение активности фермента проводили спектрофотометрически при длине волны 340 нм (окисление НАДН), при 30 СС, в 50 мМ Tris буффере (рН 7,3), содержавшем 2 мМ ща-велевоуксусной кислоты; 0,14 мМ НАДН; 4,5 ед. МДГ Реакция запускалась добавлением МДГ. Измерение активности в отсутствие субстрата проводилось для корректировки спонтанного окисления НАДН. Измеряли активность МДГ в присутствии 100 мМ NaCl и различных концентрациях Про.

Все опыты проводили в трехкратной биологической повторности. Результаты обрабатывали общепринятыми методами статистики (Доспехов, 1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение устойчивости различных сортов горчицы к хлоридному засолению

Влияние засоления на прорастание и рост корней проростков оценивали с помощью балльной системы, присваивая наименьший балл наибольшему абсолютному значению того или иного показателя и наоборот (рис. 1). Наиболее сильно токсическое действие соли проявилось на проростках с. Лера, у которых сумма негативных баллов достигла максимального значения - 21. Наибольшей устойчивостью отличился с. Славянка (сумма баллов 10), с. Скороспелка и Донской заняли промежуточное положение (сумма баллов 13 и 16,- соответственно).

3 с; 20

I к 15

д 10

о 5

со

Рис. 1. Обобщенный показатель токсического действия засоления на проростки горчицы, баллы

□ Донской О Скороспелка

ВЛера □ Славянка

Влияние засоления на биомассу растений проводили на 20-е сутки выращивания растений в питательной среде с добавлением 100 мМ NaCl. Измеряли свежую биомассу листьев и корней (рис. 2-А, Б). По важному физиологическому показателю - биомассе листьев - наилучшие результаты показал с. Скороспелка: при росте на 100 мМ NaCl накопление биомассы снизилось всего на 24,1 %, на 150 мМ - на 33,2%, Сорт Славянка уступал ему около 10 % на каждой концентрации (разница недостоверна). У с. Скороспелка и Славянка при 100 мМ NaCl не было обнаружено достоверного различия по действию засоления на биомассу корней, при высокой концентрации соли биомасса корней снижалась почти наполовину (рис. 2-Б). Значительно сильнее проявилось негативное действие засоления на растениях с. Лера. При концентрации NaCl 100 мМ масса листьев растений этого сорта снизилась на 40% , масса корней - более чем на 50% (рис. 2-А, Б), а при 150 мМ NaCl растения этого сорта погибли на 17-й день опыта.

lOOMMNaCi 150мМ NaCi >Jlepa ^Скороспелка ЭСлавянка

100 мМ NaCl 1 5GmM NaC!

Рис. 2. Влияние засоления на биомассу листьев (А) и корней (Б) молодых растений горчицы, % от контроля.

Влияние засоления на содержание Na^ в листьях горчицы. Концентрация Na+ в листьях контрольных растений составляла 21,2±4,5 мкмоль/г св. массы и не изменялась на протяжении всего опыта (рис. 3). В условиях засоления все сорта показывали интенсивное накопление Na+. Уже на 5-е сутки засоления его концентрация превышала контрольные значения в 5 раз, на 10-е сутки - в 7-8 раз. У растений с. Jlepa при концентрации NaCl 150 мМ на 15-е сутки накапливалось до 400 мкмоль/г св. массы, в то время как два других сорта накапливали лишь до 300 мкмоль/г св. массы. У растений с. Славянка при обеих концентрациях NaCl после 10 суток воздействия поглощение №+стабилизировалось. Это характеризует данный сорт, как наиболее способный регулировать поступление Na+ при засолении. В листьях с. Скороспелка содержание Na+ росло на протяжении всего эксперимента.

О S 10 15 20 О 5 10 15 20 0 5 10 15 20

время, сутки

Рис. 3. Содержание Na+ в листьях растений. Сорт Лера (А), Славянка (Б), Скороспелка (В): о - контроль; ■ - 100 мМ NaCl; ▲ - 150 мМ NaCl

Влияние засоления на содержание СГ в листьях горчицы. Как и Na+, СГ при засолении интенсивно поступал в листья растений всех исследованных сортов (рис. 4). При 100 мМ NaCl на 5-е сутки их содержание в 10 раз превышало контрольные значения, а при концентрации NaCl 150 мМ СГ - в 25-27 раз. При дальнейшем воздействии у с. Славянка и Скороспелка наблюдалось сокращение скорости поступления ионов хлора. Растения с. Лера при концентрации NaCl 150 мМ накапливали значительно больше СГ (до 400 мкмоль/г св. массы) по сравненшо с другими сортами, что, вероятно, вместе с накоплением ионов натрия служило одной из причин гибели растений.

0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 время, сутки

Рис. 4. Содержание СГ в листьях растений. Сорт Лера (А), Славянка (Б), Скороспелка (В): о - контроль; ■ - 100 мМ №С1; А - 150 мМ ЫаС1

Влияние засоления на содержание К* в листьях горчицы. Концентрация калия в норме в растениях горчицы составляла 70,3±9,1 мкмоль/г св. массы. Интенсивное поступление приводило к снижению содержания К+, которое наблюдалось у всех сортов уже на 5-е сутки (рис. 5.). На 15-е сутки засоления у растений всех сортов снижение концентрации К+ прекращалось. Вероятно, концентрация 10-15 мкмоль/г св. массы была необходимым минимумом для поддержания жизнедеятельности растений.

Рис. 5. Содержание К+ в листьях растений. Сорт Лера (А), Славянка (Б), Скороспелка (В): о - контроль; ■ - 100 мМ NaCl; ▲ - 150 мМ NaCl

Влияние засоления на содержание Пролина. В условиях интенсивного накопления Na+H СГ в листьях растений представлялось необходимым оценить в них уровень совместимых (органических) осмолитов. В растениях горчицы основным осмо-литом является Про (Arshaf, 2005).

В ответ на засоление происходило быстрое накопление свободного Про в листьях растений всех сортов, и уже на 5-е сутки его содержание превышало исходные значения в 2-8 раз (рис. 6). Наиболее высокая концентрация Про регистрировалась у с. Лера, в листьях растений которого при концентрации NaCl 150 мМ на 5-е сутки Про содержалось в 8 раз больше исходного значения, на 10-е сутки увеличилось еще в 1,8 раза. Это привело к тому, что максимальная концентрация Про у растений этого сорта составляла 25 мкмоль/г свежей массы тканей листьев и была выше соответствующих значений у растений других сортов в 1,2 и в 1,16 раз (для сортов Славянка и Скороспелка, соответственно).

Однако неожиданно на 10-15-е сутки воздействия NaCl содержание Про в листьях растений всех сортов горчицы стало снижаться и к концу опыта (па 20-е сутки) резко падало. У растений с. Лера и Скороспелка при 100 мМ NaCl содержание Про снизилось наиболее резко, в 5 и в 1,8 раза соответственно. В отличие от этих сортов, у растений с. Славянка понижение содержания Про началось позже, на 15-е сутки, и было менее выраженным, превосходя в конце опыта уровень контрольного варианта в 4 раза.

Рис. 6. Содержание Про в листьях растений. Сорт Лера (А), Славянка (В), Скороспелка (С): о - контроль; ■ - 100 мМ NaCl; А - 150 мМ NaCl

В литературе содержатся немногочислешше факты о снижении Про при засолении, однако это явление до сих пор не обсуждалось (Larher et al.,2003; Yamada et al., 2005). Достоверность сильного, многократного снижения содержания Про в условиях засоления на растениях горчицы была подтверждена нами в нескольких опытах.

Влияние засоления на активность ПДГ. В регуляции содержания Про участвует фермент ПДГ, ответственный за деградацию этой иминокислоты. Измерение активности ПДГ (рис. 7) в листьях растений изученных сортов горчицы, выращенных в отсутствие засоления, показало довольно высокий конститутивный уровень (5-6 нмол/ мин*г свежей массы) его активности, но не выявило существенных сортовых различий и не обнаружшто значительных изменений в ходе опыта. Активность ПДГ при 150 мМ КаС1 на 10-й день воздействия снижалась в листьях растений с. Славянка до 60% от контроля. У с. Скороспелка падение активности было чуть более глубоким, до 65% от контроля, сопровождаемое, как и у с. Славянка, увеличением активности на 20-й день эксперимента. Сильное отличие с. Лера касалось главным образом завершающего периода опыта, в течение которого произошел очень резкий подъем активности ПДГ- до 5,2 нмол/ мин*г свежей массы листьев при 100 мМ НаС1 в среде (рис. 7А), что даже превышало уровень активности растений контрольного варианта.

время, сутки

Рис. 7. Измерение активности фермента ПДГ. Сорт Лера (А), Славянка (В), Скороспелка^): о-контроль; ■ - 100 MMNaCl; А - 150 MMNaCl

Сопоставление данных по содержанию Про и активности ключевого фермента его катаболизма показало наличие обратной зависимости между этими параметрами (рис 8), подтверждая тот факт, что в условиях засоления активность ПДГ является важным механизмом регуляции содержания Про в тканях растений горчицы.

-5 0

У =-2,5903х+17,054

Рис. 8. Зависимость содержания Про от активности фермента ПДГ

2 4 6 8 10 активность ПДГ нмоль/ мин*гсв. м.

У растения горчицы в условиях засоления наблюдали взаимосвязь содержания Про и уровня матричных РЖ генов его метаболизма. Исследования проводили на растениях с. Славянка. Содержание мРНК Р5С8 увеличивалась до 5 суток, что совпадало с фазой увеличения концентрации Про. После 5-х суток воздействия ИаС1 содержание мРНК Р5С8 резко снижалось (рис. 9), на 10-е сутки падение составило 1,8 раз, а на 20-е - достигло уровня контроля, который в течение всего эксперимента проявлял крайне низкую активность. Содержание мРНК РОН после 10 суток резко возрастало и увеличивалось на 20-е сутки в 15 раз. Следовательно, падение концентрации Про после 15 суток засоления коррелировало с изменением содержания матричных РНК как фермента синтеза, так и фермента деградации Про.

100

О 5 10 15 20 Время, сутки

Р5С5

РОН

Асйп

Рис. 9. Содержание мРНК: А -Р5СЯ; ■ - РОЯ

Расчет максимальной концентрации Про у горчицы сарептской, в пересчете на объем цитоплазмы (5%), в сопоставлении с суммой концентраций и С Г показал соотношение 2/3. У галофитов, по литературным данным (Регета ег а1.,1997; иес!а е! а1.,2002), это соотношение было близким к 1.

Таким образом, в процессе сортового анализа было установлено, что с. Лера оказался наименее, а с. Славянка наиболее устойчивым к условиям засоления. Был достоверно установлен факт резкого падения содержания Про при продолжающемся воздействии засоления. Продемонстрирована зависимость между концентрацией Про и активностью ПДГ. Показана зависимость между содержанием Про и содержанием мРНК Р5СБ и РйН. Установлено, что даже максимальная концентрация Про в листьях растений при засолении составляла не более 2/3 суммы внутриклеточной концентрации натрия и хлора. Исходя из этого можно заключить, что содержание Про было недостаточным для поддержания осмотического равновесия между цитоплазмой и вакуолью.

Целью следующих этапов работы стало изучение возможной роли Про на разных этапах адаптации растений к условиям засоления. Работа проводилась на растениях с. Славянка. В исследованиях использовали концентрацию №С1 - 100 мМ, которая ингибировала рост растений, но не вызывала их гибели.

Изучение возможной роли пролина на разных фазах стрессорного ответа на засоление

Исходя из принципа дискретности адаптационного процесса, стрессорный ответ растений на засоление мог быть условно разделен на:

• быстрый стрессорный ответ или стресс-реакцию

• этап специализированной, или долговременной адаптации

Помимо этого было изучено поведение растений на этапе восстановления, т.е. при переносе растений, подвергнутых действию ЫаС!, на среду без избыточного засоления (с 15 по 20 сутки).

Быстрый стрессорный ответ (стресс-реакция') отчетливо проявлялся в течение первых 5 суток воздействия соли. Засоление приводило к интенсивному поступлению ионов в листья растений. Увеличение содержания ионов натрия и хлора было достоверным уже через 24 часа воздействия, концентрация Ыа+ увеличивалась в 2,4 раза, а СГ - в 4 раза (рис. 10-А,Б). Дальнейшее накопление этих ионов имело линейный характер с небольшим замедлением после 3-х суток. На 5-е сутки концентрация превышала исходное значение уже в 5,5 раза, а концентрация СГ- в 9,5 раз.

Содержание К+ (рис. 10-В) при засолении быстро уменьшалось. Достоверное изменение содержания калия регистрировалось на первые сутки воздействия ЫаС1, когда падение составляло 12% по отношению к контролю. Дальнейшее уменьшение концентрации калия имело линейный характер и на 5-е сутки содержание К4" было в 2,6 раза ниже исходных значений.

время, часы

Рис. 10. Содержание (А), СГ (Б), К+ (В) в листьях растений: о - контроль; ■ - 100 мМ №С1

Достоверное понижение осмотического потенциала клетки происходило на 2-е сутки засоления (рис. 11-А). Замедление скорости понижения осмотического потенциала после 3-х суток можно соотнести с небольшим сокращением поглощения ионов на данном отрезке времени.

А Время, часы

время, часы

Рис. 11. Изменение осмотического потенциала (А) и содержания Про (Б) в листьях растений: о - контроль; ■ - 100 мМ ЫаС1

Увеличение содержания Про было достоверным на 2-е сутки эксперимента (рис. И-Б), увеличиваясь более чем втрое по отношению к контролю и продолжая линейно расти до 5 суток воздействия.

Быстрое изменение содержание Про в ответ на засоление позволяло предполагать, что регуляция этого процесса происходит на уровне экспрессии генов метаболизма Про на самых ранних этапах стрессорного ответа. Действительно, изменение содержания мРНК 1'5СИ наблюдалось уже в первые часы засоления (рис. 12). На 2-й час содержание мРНК 1'5СЗ увеличилось вдвое, а на 5-е сутки - почта в 20 раз. Содержание мРНК РВН было низким вплоть до 5-х суток, что, очевидно, способствовало интенсивной аккумуляции синтеза Про в ответ на солевой стресс.

(шМКдСЗ) (ВяЖ)

Р5С$ \

рт: т

шшШШШк.

10 20 время, часы

Рис. 12. Содержание мРНК: А -РЗСЯ; в - РПН

На ранней стадии засоления хорошо прослеживались корреляции между поступлением неорганических ионов и содержанием Про, что проявлялось в высоких значениях: Кыо*.пРо= 0,976, а Кам1ро= 0,978. Это показывает, что на раннем этапе воздействия солевого стресса между поступлением ионов и содержанием Про в растениях существовала достоверная прямая зависимость, тогда как между накоплением Про и изменением осмотического потенциала устанавливалась обратная (Я ос п.Лро= -0,711) зависимость. Исходя из этого, можно предположить, что на ранней стадии засоления Про, хоть и не накапливался в равном соотношении с суммой Ма' и СГ (65%), все же был ведущим осморегулятором.

Этап специализированной (долговременной') адаптации характеризуется переходом быстрых кратковременных защитных изменений в долговременные механизмы поддержания жизнедеятельности организма в новых, ранее не пригодных условиях. На данном этапе происходит стабилизация метаболизма и физиологических

функций. У растений горчицы наступление данного этапа наблюдалось на 17-20-е сутки засоления. Так, интенсивное поступление Иа+и СГ на 17-30-е сутки достигало уровня 300 мкмоль/г св. массы и в дальнейшем не претерпевало значительных изменений (рис. 13-А,Б).

350 А

300

5 250 -

150 100 50 0

250

150 100 50 0

15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 время, сутки

15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35

Рис. 13. Содержание (А), СГ (Б) в листьях растений: о - контроль; ш -100 мМ№С1

После 20-х суток засоления скорость снижения концентрации К+ замедлялась, и содержание устанавливалось на уровне 10 мкмоль/г св. массы (рис. 14-А).

70 60 50 -40 30 -20 10 о

время, сут 20 25 30

1517

19 21 23 25 27 29 31 33 35 время, сутки

Рис. 14. Содержание К+ (А), величина осмотического потенциала в листьях растений (Б): о - контроль; ■ - 100 мМ ^'аС1

Понижение величины осмотического потенциала в листьях, связанное с поступлением и СГ, прекращалось на 25 сутки засоления на уровне 2,1±0,5 мПа (рис. 14-Б).

При стабилизации СГ и низком осмотическом потенциале можно было ожидать, что Про в листьях будет продолжать сохранять высокие концентрации. Од-

нако после 15 суток засоления происходило резкое падение уровня Про (более чем иа 50%) (рис. 15-А). Затем на 23-27 сутки, наблюдалось увеличение концентрации Про, сменяющееся на 30-е сутки падением в 1,5 раза. На 35-е сутки наблюдалось очередное повышение концентрации. Следовательно, изменение содержания Про при длительном засолении имело циклический характер. Следует отметить, что накопление Про в ответ на засоление не было транзиторным, так как его исчезновение не связано с переходом растений в фазу долговременной адаптации. Факт падения содержания Про позволяет предположить, что эта иминокислота, не являлась основным осмоли-том при длительном засолении. В качестве другого возможного осмолита были изучены сахара (рис. 15-Б). Однако общее содержание Сахаров при засолении было даже ниже, чем в контрольном варианте, что не дает возможности говорить об их существенном вкладе в поддержание осмотического равновесия.

15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 время, сутки

Рис. 15. Содержание Про (А), общее содержание Сахаров в листьях растений (Б): о - контроль; ■ - 100 мМ ШС1

Корреляции между содержанием С1" с одной стороны, и содержанием Про с другой, на протяжении этапа специализированной адаптации не являлись достоверными (Я м„+ про~ 0,495, а Я СГ, про= 0,614). Коэффициент корреляции между содержанием Про и уровнем осмотического потенциала также был крайне низок (— 0,112), что говорит об отсутствии взаимосвязи между этими параметрами. Как и на этапе быстрого стрессорнош ответа, соотношение концентрации Про в цитоплазме и суммы ионов натрия и хлора не превышало 66%. Полученные результаты дают возможность предполагать, что концентрация Про была недостаточной для осуществления осморегуляции на стадии специализированной адаптации

Этап восстановления. Восстановление длилось в течение 5 суток. За данный период наблюдалось незначительное (около 12%) снижение содержания N2* и и СГ (рис. 16А, Б).

Рис. 16. Содержание Ыа+ (А), СГ (Б), К+, Про (Г) и величина осмотического потенциала (Д) в листьях растений на этапе восстановления: п - контроль; и - 100 мМ

№С1;

1 - восстановление

На стадии репарации практически вдвое восстанавливалась концентрация калия (рис. 16-В), осмотический потенциал увеличился на 67% (рис. 16-Д). Содержание Про при переносе растений на среду без №С1 снижалось и через 5 суток было близким к контрольным значениям (рис. 16-Г). Однако нельзя исключать, что это «жжение было продолжением процесса падения, наблюдаемого при засолении на 15-е сутки.

Падение содержания Про при восстановлении совпадало со снижением содержания мРНК Р5С5, схожее сокращение экспрессии было и при продолжительном засолении (рис. 17-А). Более сложная картина наблюдалась с содержанием мРНК РОН (рис. 17-Б). При засолении регистрировалось увеличение содержания мРНК в 2,5 раза на 10-е сутки и еще двукратное увеличение на 20-е сутки. При восстановлении содержание мРНК РОН понижалось до уровня контроля. Исходя из этого, можно сделать вывод, что природа падение содержания Про при продолжающемся засолении и при восстановлении имеет разнонаправленный характер и реализуется на уровне ПДГ и кодирующей его мРНК.

P5CS

PDH

*«« 5 10 15 20 15+5

Actin

Время, сутки'

О 5 10 15 20 Время, сутки

Рис. 17. Содержание мРНК: A -P5CS; ■ -PDU

Корреляции между содержанием Na+, CI и Про была недостоверной (R^a., про= О ,792; Rcr, про= 0,626). Зависимость между величиной осмотического потенциала и содержанием Про отсутствовала, R^ocm. пот = -0,250. Полученные данные позволяют заключить, что хотя накопление Про при засолении не соотносилось с осморегуля-торной функцией, однако было стрессиндуцируемым и снималось с прекращением действия NaCl.

Вопрос о сигнальных молекулах, вовлеченных в регуляцию уровня пролина, остается открытым. В настоящее время в литературе появились данные о регуляции содержания Про при участии оксида азота. В этой связи в листьях растений горчицы, подвергнутых 3-дневному воздействию 100 мМ ИаС1, а также КаС1 в определенных сочетаниях с БКР и сРТЮ, было проанализировано содержание Про (рис. 18).

Регуляция содержания пролина при участии NO

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 18. Содержание Про в листьях 4-недельных растений горчицы, выращенных на среде Хогланда-Снайдерс (1), при 3-дневном воздействии ЫаС1 100 мМ (2), вЫР 25 мкМ (3), К3-ГЦФ 25 мкМ (4), сРТЮ 100 мкМ (5), №С1 100 мМ+БЫР 25 мкМ (6), ЫаС1 100 мМ + Кз-ГЦФ 25 мкМ (7), №С1 100 мМ+5№ 25мкМ+ сРТЮ 100 мкМ (8)

Полученные результаты показали, что на действие ЫаС! растения отвечали увеличением концентрации Про с 0,8 мкмоль/г св. массы в листьях контрольного варианта до 10,4 мкмоль, т.е. в 13 раз. Внесение в среду БИР, К3-ГЦФ или сРТЮ без ИаС1 сопровождалось небольшими недостоверными изменениями концентрации Про в контрольных растениях. Достоверное влияние N0 на аккумуляцию Про проявлялось при совместном действии с 100 мМ ЫаС1. При этом содержание Про в листьях растений увеличилось в 2,2 раза по сравнению с растениями, подвергнутыми действию ЖС1. Однако сРТЮ, скэвенджер N0, более чем на 2/3 снижал стимулирующий эффект ЯКР на аккумуляцию Про при засолении, тогда как К3-ГЦФ совместно с ЫаС1 не оказывал достоверного эффекта на уровень свободного Про.

600

Рис. 19. Содержание ионов N8, С1, К, N03 в листьях 4-недельных растений горчицы, выращенных на среде Хогланда-Снайдерс(1), при 3-дневном воздействии №С1 100 мМ (2), 10 мкМ (3), 25 мкМ (4), 50 мкМ (5), №С1100 мМ + вОТ 10 мкМ (6), №С1 100 мМ+ SNP 25 мкМ (7), NaCl 100 мМ + 50

Было установлено, что в листьях молодых растений горчицы концентрация и СГ, увеличившаяся в 7-10 раз за трое суток роста на среде с 100 мМ №С1, еще бо-

лее возрастала при воздействии экзогенного N0 (рис. 19). Увеличение концентрации Ыа+ при совместном внесении в среду БОТ и МаС1 зависело от дозы добавленного 5№>; максимальный прирост содержания указанных ионов по сравнению с МаС1 достигал двукратного значения. При этом БИР в отсутствие соли не изменял содержания Ыа+ и СГ в листьях. При засолении концентрация К+ в листьях горчицы заметно понижалась, что в целом характерно для гликофитов; в этих условиях еще существеннее падала концентрация N0 з- В отличие от и СГ, позитивное действие на уровень К+ и Ж)"з проявлялось не только в условиях засоления, но и при росте на стандартной среде в отсутствие №С1. В абсолютных величинах эффект БОТ мог показаться небольшим, но по сравнению с пониженным уровнем К+ и К0"3 при засолении максимальное увеличение концентрации К+ под действием достигало 3 раз, МО'з - 3,7 раза.

Таким образом, впервые было убедительно показано, что экзогенный оксид азота стимулирует КаС1-зависимую аккумуляцию Про. Аккумуляция Про, очевидно, опосредована ЫО-регулируемым накоплением в клетках неорганических ионов (№+, СГ, К+, К03") за счет стимуляции функционирования как катионных, так и анионных каналов.

Функционирование Про в качестве химического шаперона

Про является мультифункциональным антистрессорным фактором. Как уже говорилось ранее, в настоящее время в литературе все активнее обсуждается роль Про в качестве химического шаперона. Эта функция особенно важна при засолении, так как высокие концентрации №С1 в клетке ведут к повреждению макромолекул, нарушению ферментативной активности. Полученные данные отсутствии корреляции между осмотическим потенциалом, содержанием ионов и содержанием Про, а также об участии N0 в регуляции Про, позволяют говорить о том, что Про при длительном засолении не выполняет осмотической функции. Было предположено и на примере модельных опытов впервые установлено, что Про при засолении способен функционировать в качестве химического шаперона, защищая макромолекулы от повреждения.

I о

Рис. 20. Измерение активности МДГ in vitro, при засолении

0 0,5 1 1,5 2 2,5 концентрация прелина, M

В условиях in vitro NaCl сильно (более 50%) ингибировал активность фермента МДГ. Низкие концентрации Про, до 100 мМ, совместно с засолением не оказывали защитного действия на активность фермента. В диапазоне концентраций от 200 до 500 мкМ Про нивелировал негативное действие NaCI (рис. 20). Однако в концентрациях выше 500 мМ Про оказывал отрицательное воздействие на активность МДГ, проявляя при этом четкую концентрационную зависимость. Данный факт позволяет предположить, что падение содержания Про при длительном засолении связано с достижением концентрации, при которой Про нарушает ферментативную активность.

В результате исследований было установлено, что содержание NaCl в питательном растворе в концентрациях 100 и 150 мМ вызывало у растений горчицы состояние стресса. Растения по устойчивости к засолению проявляли сортовые различия. Сорт Лера оказался наименее устойчивым, а с. Славянка - наиболее устойчивым к воздействию засоления. Для горчицы как для типичного гликофита, было характерно наличие быстрого транзиторного первичного «рессорного ответа. В ответ на засоление интенсивно накапливался Про, наблюдалось поступление ионов натрия и хлора, происходило снижение осмотического потенциала. Содержание мРНК P5CS увеличивалось уже в первые часы засоления, доказывая что синтез Про являлся важным стресс-ивдуцируемым защитным фактором. В течение 5 суток первичного ответа содержание Про коррелировало с поступлением ионов в листья растений. Это позволяло с высокой долей вероятности утверждать, что Про на данном этапе участвовал в осморегуляторной функции. Однако начиная с 10-15 суток засоления содержание

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Про в листьях резко падало. При этом его концентрация в пересчете на объем цитоплазмы составляла всего 1/10 от суммы концентраций ионов натрия и хлора, и была недостаточной для поддержания осмотического равновесия. В ходе специализированной адаптации защитные механизмы стабилизировались, обеспечивая поддержание метаболизма в ранее неблагоприятных условиях. Так, содержание ионов натрия и хлора после 17-20 суток не изменялось, стабилизировался осмотический потенциал, прекратилось снижение концентрации калия. Содержание Про на фоне данной стабилизации претерпевало колебательные изменения. К тому же на этом этапе даже при максимальных концентрациях Про составлял лишь 2/3 суммы концентраций ионов натрия и хлора, что не было достаточным для осуществления осмотической функции. На протяжении всего засоления содержание Про показало четкую взаимозависимость с содержанием мРНК Р5С<Ч и РПН, доказывая регуляцию Про на молекулярном уровне. Активность фермента ПДГ также коррелировала с содержанием Про, свидетельствуя о регуляции на ферментативном уровне. Этап восстановления показал, что регуляция падения содержания Про на молекулярном уровне при длительном засолении отличалась от регуляции при снятии стрессового воздействия. Установленная взаимосвязь содержания Про с влиянием N0 при засолении, позволяла предположить, что регуляция уровня Про происходила при участии сигнальных молекул.

Основываясь на результатах модельных опытов с МДГ было предположено, что при засолении Про, находясь в цитоплазме в непосредственной близости с макромолекулами, выполнял функцию химического шаперона. Однако при высоких концентрациях Про негативно влиял на активность ферментов, что, вероятно, становилось сигналом для активации его деградации. Опыты по воздействию N0 совместно с ЫаС1, позволили предположить, что осмотическую функцию в цитоплазме могли выполнять ионы К. Выравнивание осмотического потенциала также могли осуществлять №+и СГ, негативное действие которых, нивелировалось функционированием Про в качестве химического шаперона.

ВЫВОДЫ

1. Действие засоления проявлялось на горчице сарепсткой, как на типичном гликофите, ингибируя рост растений, вызывая осмотический стресс и инициируя реализацию ряда адаптивных стратегий, среди которых - активный синтез Про, обладающего стресс-протекторными свойствами.

2. Выявлены сортовые различия растений горчицы, в основе которых лежала разная способность к регуляции поступления и СГ и интенсивность аккумуляции пролина. Сорт Лера оказался наименее устойчивым, а сорт Славянка наиболее устойчивым к воздействию засоления.

3. Впервые достоверно установлено явление резкого падения концентрации Про при длительном засолении, несмотря на стабильное сохранение высокого содержания ионов Ыа и С1 в листьях. Достоверность сильного снижения концентрации Про была подтверждена на молекулярном и ферментативном уровне.

4. На протяжении всего действия засоления максимальная концентрация Про в расчете на объем цитоплазмы, составляла не более 2/3 а минимальная - не более 1/10 от суммарной концентрации ионов N2 и С1. Судя по величинам корреляции на разных фазах адаптации между содержанием пролина с одной стороны и содержанием ионов Ыа, С1 и величиной осмотического потенциала с другой, Про мог выполнять функцию ведущего совместимого осмолита лишь на этапе стресс-реакции.

5. Впервые показано, что сигнальная функция оксида азота на начальных этапах засоления реализовалась в быстром повышении концентрации СГ и К+ в листьях растений горчицы, вероятно, за счет активации ионных каналов, что вызывало дополнительную аккумуляцию Про.

6. На основе модельных опытов впервые установлено, что Про в условиях засоления способен обеспечить поддержание активности фермента МДГ, функционируя в качестве химического шаперона. При этом выравнивание осмотического потенциала основных компартментов клетки - цитозоля и вакуоли - могло осуществляться за счет аккумуляции в цитозоле ионов К.

7. Полученные данные позволяют заключить, что в условиях засоления Про у растений горчицы на разных стадиях адаптации и восстановления мог функционировать преимущественно в качестве или совместимого осмолита или химического шаперона.

Список публикаций по теме диссертации

1. Гринин А. Л., Ралдугина Г.Н., Кузнецов. Вл.В. (2007) Действие хлорид-ного засоления на прорастание семян и рост проростков ряда сортов горчицы сарепт-ской // Материалы Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем». Сыктывкар, 2007. - С. 98.

2. Гринин Л. JI., Коршунов И.А., Холодова В.П., Ралдугина Г.Н. (2008) Сортовые различия растений горчицы сарептской по устойчивости к повышенным концентрациям солсй меди // Материалы международной научной конференции «Физико-химические основы структурно-функцианальной организации растений». Екатеринбург, 2008 - С. 152-153.

3. Гринин А. Л. Башмакова Е.Б., Холодова В.П. (2009) Возможные функции пролина на разных стадиях адаптации растений горчицы сарептской к засолению И Материалы международной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего севера». Апатиты, 2009.-С. 103-104

4. Гринин А. Л., Холодова В.П., Великсар С.Г., Волков К.С., Зарипова Н.Р., Коршунов И.А., Лисник С.С., Стеценко Л. А., Кузнецов Вл.В. (2009) Скрининг растений с целью подбора форм, перспективных для фиторемвдиации загрязненных солями меди почв // Материалы Международной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего севера». Апатиты, 2009. С. 347-349.

5. Гринин А. Л., Холодова В.П., Иванова Е.М., Волков К.С., Кузнецов Вл.В. (2009) Участие металлотионеинов в детоксикации меди и цинка в растениях // Материалы Международной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего севера». Апатиты, 2009. С. 349-350.

6. Kuznetsov Vl.V., Ivanova Е.М., Volkov K.S., Grinin A.L., Kholodova V.P Metallothionein participation in copper and zinc detoxification in plants. FESPB Congress, I 2008.

7. Гринин А.Л., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В. (2010) Сравнительный анализ физиологических механизмов солеустойчивсти различных сортов горчицы. Вестник Российского университета дружбы народов, серия «Агрономия и животноводство» m 2010 С. 27-38.

8. Гринин А.Л., Холодова В.П., Башмакова Е.Б., Мещеряков А.Б., Кузнецов Вл.В. (2Q10) Оксид азота предотвращает ингибирование роста растений горчицы при засолении путем усиления поглощения неорганических ионов ПДоклады РАН. В печати.

Подписано в печать:

19.05.2010

Заказ № 3773 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гринин, Антон Леонидович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Общие представления об адаптации растений к неблагоприятным факторам окружающей среды.

1.2. Засоление, как неблагоприятный фактор окружающей среды.

1.3. Особенности влияния засоления на растения разных таксономических групп.

1.4 Рост и развитие растений при засолении.

1.5. Водный статус растений при засолении.

1.6. Осмотический потенциал растительных тканей при засолении.

1.7. Аккумуляция ионов в растении при засолении.

1.7.1. Поступление Na+.

1.7.2. Поступление С1".

1.7.3. Поступление К+.

1.8. Совместимые осмолиты при засолении.

1.8.1. Накопление пролина при засолении.

1.8.2. Современные представления о функциях пролина.

1.8.3. Функционирование пролина в качестве химического шаперона.

1.8.4. Метаболизм пролина.

1.8.5. Современные представления о возможном токсическом действиях пролина.

1.9. Представление о сигнальных системах растений при стрессах.

1.9.1. Сигнальные системы растений в условиях засоления при засолении.

1.9.2. Участие NO в сигнальных реакциях.

1.9.3. Участие NO при засолении и взаимосвязь NO с биосинтезом пролина

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Условия выращивания.

2.2.1. Посев семян.

2.3. Измерение всхожести семян.

2.4 . Измерение биомассы.

2.5. Определение содержания ионов.

2.6. Определение осмотического потенциала.

2.7. Определение содержания свободного пролина.

2.8. Определение активности пролиндегидрогеназы.

2.9. Определение содержания Сахаров.

2.10. Определение Содержание мРНК P5CS и PDH.

2.10.1. Выделение тотальной РНК.

2.10.2. Обратная транскрипция.

2.10.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.11. Определение содержания пролина при действии NO в условиях засоления.

2.12. Определение функционирования пролина, в качестве химического шаперона in Vitro.

2.13. Математическая обработка данных.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Изучение устойчивости различных сортов горчицы к хлоридному засолению.

3.1.1. Изучение влияния засоления на всхожесть семян и рост корней проростков.

3.1.2. Оценка биомассы листьев, стеблей и корней молодых растений горчицы.

3.1.3. Влияние засоления на содержание Na+в листьях горчицы.

3.1.4. Влияние засоления на содержание СГ в листьях горчицы.

3.1.5. Влияние засоления на содержание К+ в листьях горчицы.

3.1.6. Влияние засоления на содержание пролина.

3.1.7. Влияние засоления на активность ПДГ.

3.1.8. Оценка осмотической роли пролина при засолении.

3.2. Изучение возможной роли пролина на разных фазах стрессорного ответа на засоление.

3.2.1. Быстрый стрессорный ответ (стресс-реакция).

3.2.2. Этап специализированной (долговременной) адаптации.

3.2.3. Этап восстановления.

3.3. Регуляция содержания пролина при участии NO.

3.4. Функционирование пролина в качестве химического шаперона.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Устойчивость растений горчицы к засолению и возможная роль пролина"

Среди неблагоприятных для растений факторов одним из самых распространенных является засоление. По последним данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН, более 800 млн га земли подвержены засолению. Воздействие хлоридного засоления значительно нарушает корневое питание и водный режим гликофитов, ингибирует процесс фотосинтеза, в результате чего подавляется рост растений и их урожайность (Flowers, 2004). Ценная сельскохозяйственная масличная культура горчица сарептская (-Brassica juncea L.) культивируется в России преимущественно в условиях аридных зон, где около половины всех распаханных земель подвержены засолению. Высокую, урожайность в таких условиях обеспечивает генетически обусловленная способность растений горчицы переносить засуху и сильную жару (Картамышев, 2008), а также высокая фенотипическая пластичность и экологогенетическая разнородность (Tarakanov et al., 1994). Однако Brassica juncea, как и большинство других сельскохозяйственных растений - гликофит и ее устойчивость к засолению относительно невелика. Важной практической задачей является отбор высокоурожайных сортов горчицы с повышенной солеустойчивостью.

Kumar, 2009). Одним из наиболее распространённых и важных осмолитов считается иминокислота пролин (Про) (Misra, Saxenaa, 2009; Yousfi et al., 2010). Однако в настоящее время накапливается все больше данных, что у гликофитов осмотическая функция Про часто не выполняется или она не является основной (Munns, 2008; Verbruggen, Hermans, 2009; Attn et al., 2010). Ряд исследователей прямо критикуют идею о функционировании Про в качестве осмолита (Gagneul et al., 2007; Larher et al., 2009). В литературе до сих пор не существует систематического анализа соотношения концентраций NaCl индуцируемого Про с концентрациями накапливаемых в клетках ионов натрия и хлора.

В последние годы все больше говорится о Про как о химическом шапе-роне, способном защищать макромолекулы, сохраняя их нативную структуру и биологическую активность (Diamant et al., 2001; Chattopadhyay et al., 2004). Развитие представлений о химических шаперонах имеет важное практическое значение для понимания адаптационных процессов и разработки новых технологий консервации ферментов для медицинских целей и химической промышленности.

Цель и задачи исследования.

В связи с данной целью были поставлены следующие задачи:

1. Оценить устойчивость к засолению различных сортов горчицы.

2. Изучить взаимосвязи содержания Про с содержанием неорганических ионов, мРНК P5CS (ген пирролин-5-карбоксилат синтазы), мРНК PDH (ген пролиндегидрогиназы) и величиной осмотического потенциала в условиях засоления.

3. Исследовать роль NO в регуляции содержания Про при засолении.

4. Изучить возможность функционирования Про в качестве химического шаперона в условиях засоления.

Научная новизна. На основе ряда физиологических и биохимических параметров впервые проведена оценка на солеустойчивость нескольких отечественных сортов горчицы, активно используемых в сельском хозяйстве. Достоверно установлено явление резкого падения концентрации Про при продолжительном засолении. Впервые показано, что сигнальная функция оксида азота на начальных этапах засоления реализовалась в быстром повышении концентрации Na+, СГ и К+, вероятно, за счет активации ионных каналов в листьях горчицы, что вызывало дополнительную аккумуляцию Про. В модельных опытах впервые установлено, что Про в условиях засоления способен обеспечивать поддержание активности фермента малатдегидрогиназы (МДГ), что свидетельствовало в пользу его функционирования в качестве химического шаперона. Выдвинуто предположение, что в условиях засоления выравнивание осмотического потенциала основных компартментов клетки могло осуществляться за счет аккумуляции в цитоплазме ионов К.

Практическая значимость. Полученные в работе данные по сортовым различиям растений горчицы в условиях засоления могут быть использованы в подборе сортов для выращивания растений на засоленных почвах. Исследования уточняют представления об осморегуляторной функции Про, о сигнальных процессах в растении и дают возможность высказать предположение об осморегуляторной роли ионов калия в цитоплазме. Данные по функционированию Про в качестве химического шаперона имеют большой практический интерес для медицинских целей и химической промышленности в разработке сред для эффективной консервации ферментов. Теоретические обобщения и совокупность полученных экспериментальных данных могут использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов вузов страны.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них две статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных результатов и обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, включая 5 таблиц, 37 рисунков; библиография содержит 234 название, в т.ч. 205 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Гринин, Антон Леонидович

выводы

1. Действие засоления проявлялось на горчице сарепсткой, как на типичном гликофите, ингибируя рост растений, вызывая осмотический стресс и инициируя реализацию ряда адаптивных стратегий, среди которых — активный синтез Про, обладающего стресс-протекторными свойствами.

2. Выявлены сортовые различия растений горчицы, в основе которых лежала разная способность к регуляции поступления Na+ и СГ и интенсивность аккумуляции пролина. Сорт Лера оказался наименее устойчивым, а сорт Славянка наиболее устойчивым к воздействию засоления.

3. Впервые достоверно установлено явление резкого падения концентрации Про при длительном засолении, несмотря на стабильное сохранение высокого содержания ионов Na и С1 в листьях. Достоверность сильного снижения концентрации Про была подтверждена на молекулярном и ферментативном уровне.

4. На протяжении всего действия засоления максимальная концентрация Про в расчете на объем цитоплазмы, составляла не более 2/3 а минимальная — не более 1/10 от суммарной концентрации ионов Na и С1. Судя по величинам корреляции на разных фазах адаптации между содержанием пролина с одной стороны и содержанием ионов Na, С1 и величиной осмотического потенциала с другой, Про мог выполнять функцию ведущего совместимого осмолита лишь на этапе стресс-реакции.

5. Впервые показано, что сигнальная функция оксида азота на начальных этапах засоления реализовалась в быстром повышении концентрации в листьях растений горчицы Na+, СГ и К+, вероятно, за счет активации ионных каналов, что вызывало дополнительную аккумуляцию Про.

Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю к.б.н. Холодовой Валентине Павловне за огромную помощь, бесценный научный опыт, внимание, поддержку и терпение. Глубоко признателен д.б.н. профессору Владимиру Васильевичу Кузнецову за постоянную помощь в работе и обсуждение результатов; к.б.н. Галине Николаевне Ралдуги-ной за помощь и руководство в работе; а также всем сотрудникам и аспирантам лаборатории молекулярных и физиологических механизмов адаптации Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН за поддержку и дружеское отношение; всем родным и близким за заботу и понимание.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате исследований было установлено, что засоление является сильным стрессорным фактором для растений горчицы. Было определено, что при концентрациях NaCl более 200 мМ отсутствовала всхожесть семян, а молодые растения были не способны к нормальной жизнедеятельности.

Растения горчицы сарептской имели различия по устойчивости к засолению, с. Лера оказался наименее, а с. Славянка - наиболее устойчивым. Так как растения горчицы являются типичным гликофитом, то их стресс-толерантность во многом определяется способностью к регуляции поступления Na+ и СГ. В условиях засоления растения вынуждены поглощать эти ионы для понижения осмотического потенциала и поддержания необходимого водного статуса, однако высокие концентрации Na+ и С1 могут быть токсичными для организма. Растения с. Лера характеризовались наиболее интенсивным поглощением ионов натрия и хлора. Это особенно проявлялось при концентрации NaCl 150 мМ, при которой растения накапливали Na+и СГдо 400 мкмоль/г св. массы, что значительно превышало содержание у других сортов и, вероятно, стало причиной гибели растений на 17-е сутки опыта. Наименее выраженная способность растений с. Лера к регуляции поступления Na+ и СГ также могла привести к сильному снижению биомассы надземных и подземных органов. Более всего в условиях засоления ингибировалась биомасса стеблей. Это наблюдалось у всех сортов и, видимо, имело адаптивный характер для экономии ресурсов в стрессовых условиях. Примечательно, что у неустойчивого сорта Лера ингибирование корней было выражено более, чем у других сортов. Между тем считается, что осмотический стресс у гликофитов обычно вызывает большее торможение роста надземных органов, в то время как корни продолжают расти для обеспечения поступления воды (Munns, 2008). У растений с. Славянка при концентрации NaCl 100 мМ, подавление роста корней проявлялось меньше по сравнению с двумя другими сортами, в то время как рост стеблей ингибировался сильнее. Такие результаты позволяют судить о более высокой адаптивной способности к соле-устойчивости у данного сорта.

Все сорта характеризовались интенсивным накоплением Про в условиях солевого стресса. Как показали исследования, достоверное увеличение содержания Про происходило уже на 2-е сутки засоления. Это сопровождалось быстрым увеличением содержания ионов Na+ и СГ, падением содержания К+, снижением величины осмотического потенциала. Подобная картина вполне типична на фазе стресс-реакции, в период, когда в растении включаются общие механизмы устойчивости и отключаются процессы, несущественные для обеспечения жизнедеятельности при стрессовом воздействии. Косвенно о таком отключении говорит резкое снижение содержания К+ и NO3" в условиях засоления. Про в условиях солевого стресса выступает в роли защитного фактора. Про полифункционален и, очевидно, выполняет различные защитные функции на этапе стресс-реакции. Быстрое изменение содержания Про в ответ на засоление дало возможность предполагать, что регуляция этого процесса происходит на уровне экспрессии генов метаболизма Про на самых ранних этапах стрессорного ответа. Действительно, изменение содержания мРНК P5CS наблюдалось уже в первые часы засоления, доказывая, что синтез Про являлся важным стресс-индуцируемым защитным фактором. Изучение корреляций между содержанием Про, с одной стороны, и содержанием Na+, СГ и величиной осмотического потенциала — с другой, показало, что Про с высокой долей вероятности выполняет осмотическую функцию на этапе стресс-реакции.

Дальнейшее засоление предполагало переход растений в фазу долговременной адаптации, которая характеризуется стабилизацией процессов, запущенных при стресс-реакции и поддержании жизнедеятельности растений в условиях стресса. На этом этапе наблюдалась стабилизация концентрации Na+, СГ, К+, NO3", осмотического потенциала. Содержание Про, однако, не было стабильным. Неожиданно на 15-е сутки воздействия NaCl содержание Про в листьях растений всех сортов горчицы стало снижаться и на 20-е сутки резко падало. Схожая картина наблюдалась у всех сортов. Примечательно, что падение содержания Про у с. Славянка было не таким резким, как у остальных сортов. Это дает основание предполагать, что данный сорт обладает способностью к более гибкой регуляции адаптивных процессов.

Как уже говорилось, в литературе имеются немногочисленные сведения о снижении Про при засолении. Нами было достоверно доказано это явление. Падение концентрации Про наблюдалось в листьях всех ярусов. Верхний ярус, состоящий из более молодых листьев, характеризовался самым интенсивным накоплением Про, а наибольшее падение содержания Про наблюдалось в более старых листьях, образующих нижний ярус. Предположительно такая разница в содержании Про в условиях засоления может быть объяснена разной локализацией ферментов синтеза и распада Про. Вероятно, P5CS локализована в большей степени в молодых, растущих листьях, а ПДГ— в старых, где в целом преобладает процесс катаболизма. Однако данное утверждение требует дополнительной проверки.

Была установлена обратная взаимосвязь между активностью ПДГ и содержанием Про при солевом стрессе. Было показано, что у всех сортов в период падения содержания Про активность ПДГ резко возрастала. Взаимозависимость была установлена также между содержанием Про и содержанием мРНК генов его метаболизма.

При расчете концентрации Про, с учетом объема цитоплазмы от суммы концентраций Na+ и СГ, нами было установлено, что на фазе падения концентрации Про данное соотношение составляло 1/10. На протяжении всего засоления это соотношение концентрации Про и суммы ионов не превышало 2/3 и теоретически не было достаточным для обеспечения осмотической функции Про, однако на фазе падения данная функция, очевидно, не могла осуществляться вовсе.

Дальнейшее изучение процесса засоления показало, что падение содержания Про после 10-15 суток было не случайным явлением, оно повторялось на 20-е и 30-е сутки засоления. На фоне стабилизации содержания ионов Na и С1 и при неизменяющемся осмотическом потенциале это могло означать смену функций Про. В качестве другого возможного осмолита были изучены сахара. Однако общее содержание Сахаров при засолении было даже ниже, чем в контрольном варианте, что не дает основания говорить об их существенном вкладе в поддержание осмотического равновесия.

Примечательно, что содержание Про при засолении изменялось значительно лишь в листьях растений и не демонстрировало существенных изменений в корнях. Это, очевидно, говорит об органной специфике функций Про в растениях горчицы.

Были проведены исследования при переносе растений на среду без избыточного содержания NaCl. Одной из основных целей данного этапа являлось подтверждение того, что изучаемые нами процессы имели адаптивный характер, а воздействие стресса не носило необратимого характера. В результате этапа репарации у растений наблюдалось восстановление содержания ионов К, повышение осмотического потенциала, снижение содержания ионов Na и С1, снижение содержания Про. При этом нельзя исключать, что снижение содержания Про при восстановлении было продолжением процесса падения на 15-е сутки засоления. Однако то, что снижение содержания Про при восстановлении и продолжительном засолении различалось по содержанию мРНК PDH, позволяет сделать заключение о разных инициирующих падение содержания Про факторах.

Интересно, что наибольшее сокращение содержания Про при восстановлении наблюдалось в листьях нижнего яруса. Это согласуется с данными о падении уровня Про при длительном засолении и дополнительно дает возможность предполагать, что активность деградации Про выше в листьях нижнего яруса, тогда как активность синтеза выше в молодых листьях верхнего яруса.

Стадия восстановления еще раз доказала, что падение содержания Про при продолжительном засолении регулируется как на ферментативном, так и на генном уровнях. В настоящее время в литературе накапливаются данные о регуляции содержания Про при участии сигнальной молекулы оксида азота. Нами впервые было показано, что NO способствует повышению устойчивости при засолении растений горчицы. Это подтвердилось как на стадии прорастания, так и в процессе роста молодых растений. Было установлено, что при добавлении в среду донора оксида азота у растений интенсивно накапливался Про, который, вероятно, осуществлял протекторное действие. Повышенное накопление Про, на наш взгляд, было опосредованным и вызывалось, вероятно, стимуляцией функционирования как катионных, так и анионных каналов и - вследствие этого - интенсивного накопления Na+, СГ, К+ и NO3". Накопление К+ и NO3" нетипично при засолении и позволяет предположить возможное участие этих ионов в антистрессорных механизмах. В частности, вполне вероятно, что концентрация ионов К хотя и снижалась при засолении, все же находилась в достаточном количестве для обеспечения поддержания осмотического равновесия. С учетом объема цитоплазмы содержание К+ в течение солевого воздействия составляло 200 мкмоль/г св. массы и вместе с Про на фазах его высокой концентрации было равным сумме концентрации Na+ и СГ. При падении уровня Про поддержание осмотического равновесия, очевидно, имело иной характер. Мы предположили, что на фазе сокращения содержания Про происходила смена его функциональной направленности. В литературе в последнее десятилетие активно обсуждается функционирование Про в качестве химического шаперона. Химические шапероны способны защищать нативную структуру макромолекул и сохранять их активность при воздействии стресса. В модельных опытах изучения влияния засоления на активность МДГ мы установили, что Про способствовал сохранению высокой активности фермента при стрессе. Однако в концентрациях свыше 500 мМ Про оказывал отрицательное воздействие на активность МДГ, проявляя при этом четкую концентрационную зависимость. Схожие данные встречаются в литературе (Diamant et al., 2000). К тому же неоднократно показано негативное и даже токсическое воздействие высоких концентраций Про на растения. Все это позволило предположить, что падение содержания Про при длительном засолении связано с достижением концентрации, при которой Про, возможно, оказывает уже отрицательное действие на макрамо-лекулы и нарушает ферментативную активность.

Функционирование в качестве химического шаперона неразрывно связано с выполнением Про других функций, в частности осмотической. Интенсивное накопление Про на стадии стресс-реакции наиболее вероятно связано с обеспечением поддержания осмотического равновесия. Однако быстрое поступление Na+ и СГ ведет к достижению концентрации Про 25-30 мкмоль/ г св. массы, что, исходя из полученных данных, можно считать критическим максимумом. В расчете на объем цитоплазмы такая концентрация будет составлять около 600 мМ, что, как было показано на опытах с влиянием засоления на активность МДГ, было достаточным для нарушения ферментативной активности. Это, вероятно, и служило сигналом для начала процесса деградации Про. В связи с этим увеличивалось содержание мРНК PDH, возрастала активность ПДГ. Процессы синтеза Про, исходя из содержания мРНК P5CS, сокращались. В результате концентрация Про резко падала, составляя 100-200 мМ с учетом объема цитоплазмы. Такое низкое содержание не могло обеспечить поддержание осмотического баланса, но было достаточным для обеспечения функции химического шаперона. На этой фазе, вероятно, функцию совместимого осмолита могло выполнять какое-то иное вещество. Выравнивание осмотического потенциала могли также осуществлят Na+ и СГ, негативное действие которых нивелировалось функционированием Про в качестве химического шаперона.

Подтверждением высказанных предположений о возможной причине падения уровня Про и его возможных функциях при длительном засолении могут послужить данные, полученные при исследовании влияния ТМ на растения горчицы. Было показано, что действие CuSC>4 и Z11SO4 вызывало интенсивное накопление Про до 20-30 мкмоль/г св. массы, после чего наблюдалось резкое падение. Так как действие ТМ не было связано с осмотическим стрессом, то можно предположить, что Про выполнял преимущественно функцию химического шаперона.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что в условиях засоления Про у растений горчицы на разных стадиях адаптации и в зависимости от концентрации мог менять преимущественные функции, выступая в роли совместимого осмолита или химического шаперона.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гринин, Антон Леонидович, Москва

1. Бабурина O.K., Леонова Т.Г. (1994) Динамика содержания Na+ и К+в клетках суспензионной культуры люцерны при высоких концентрациях NaCl. Физиология растений, 41, 460-463.

2. Генкель П.А. (1954) Солеустойчивость растений и пути ее направленного повышения. Серия: Тимирязевские чтения, вып. XII. М.: Изд-во Акад. наук СССР.

3. Гринин АЛ., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В. (2010) Сравнительный анализ физиологических механизмов солеустойчивсти различных сортов горчицы. Вестник Российского университета дружбы народов, серия «Агрономия и животноводство» №1 2010, 27— 38.

4. Дмитриев А.П. (2003) Сигнальные молекулы растений для активации защитных реакций в ответ на биотический стресс. Физиология растений, 50(3), 465-474.

5. Емец А.И., Красиленко Ю.А., Шеремет Я.А., Блюм Я.Б. (2009) Реорганизация микротрубочек как ответ на реализацию сигнальных каскадов оксида азота (II) в растительной клетке. Цитология и генетика, 43(1), 3-10.

6. Ермакова И.П., Алечина Н.Д., Балнокин Ю.В., Гавриленко В.Ф. и др. (2005) Физиология растений. М.: Издательский центр «Академия», 640 с.

7. Жолкевич В.Н., Гусев Н.А., Капля А.В. и др. (1989) Водный обмен растений. М.: Наука, 259 с.

8. Захарин А.А. (1994) Быстрая кинетика роста растений при солевом стрессе. Физиология растений, 41(1), 101-106.

9. Картамышев В.Г. (2008) Генетика, селекция и семеноводство масличных культур. Ростов н/Д: Изд-во ЮНЦ РАН, 304 с.

10. Колупаев Ю.Е., Карпец Ю.В. (2009) Участие оксида азота (NO) в трансдук-ции сигналов абиотических стрессоров у растений. Вгсник Хартеського нацюнального аграрного ушверситету. Сергя бюлоггя, 3(18), 6-19.

11. Косулина Л.Г., Луценко Э.К., Аксенова В.А. (1993) Физиология устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды. Ростов н/Д: Изд-во РГУ.

12. Кузнецов Вл.В. (1992) Индуцибельные системы и их роль при адаптации растений к стрессорным факторам. Дисс. Докт. биол. наук. Кишинев: ИФРАНРМ, 1992. 74 с.

13. Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. (1999) Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция. Физиология растений, 46, 321-336.

14. Кузнецов Вл.В., Дмитриева Г.А. (2005) Физиология растений. М.: Высшая школа, 763 с.

15. Кузнецов Вл.В., Кимпел Дж., Гокджиян Д., Ки Дж. (1987) Элементы неспецифичности реакции генома растений при холодовом и тепловом стрессе. Физиология растений, 34 (5), 859-868.

16. Кузнецов Вл.В., Хыдыров Б., Рощупкин Б.В., Борисова Н.Н. (1990) Общие системы устойчивости хлопчатника к засолению и высокой температуре: Факты и гипотезы. Физиология растений, 37(5), 987-996.

17. Лапина JI.П., Строгонов Б.П. (1979) Локализация солей в клетках в связи с приспособлением растений к условиям засоления. Успехи современной биологии, 88(1), 93.

18. Максимович А.Е. (1968) Химия сахарной свеклы в первый год жизни. В сб.: Физиология сельскохозяйственных растений. М.: МГУ, т. 7, с. 366.

19. Нобел П. (1973) Физиология растительной клетки. М.: Мир, 187с.

20. Прусакова Л.Д., Аль-Карим Л., Мещеряков А.Б. (1993) Влияние хлорхо-линхлорида на устойчивость яровой пшеницы к хлоридному засолению. Физиология растений, 40(5), 776-780.

21. Пустовой И.В., Филин В.И., Корольков А.В. (1995) Практикум по агрохимии. М.: Колос, 336 с.

22. Селье Г. (1977) Концепция стресса. Как мы ее понимаем в 1976 году. В сб.: Новое о гормонах и механизме их действия, под ред. Кавецкого Р.Е. и др. Киев: Наукова думка, с. 27-51.

23. Тарчевский И.А. (2002) Сигнальные системы клеток растений. М.: Наука, 294 с.

24. Тян С.Р., Лей Ю.Б. (2007) Физиологические ответные реакции проростков пшеницы на засуху и облучение УФ-Б. Влияние нитропруссида натрия. Физиология растений, 54(5), 763-769.

25. Чжан X., Ли Я.Х., Ху Л.Ю. и др. (2008) Влияние обработки листьев пшеницы донором окиси азота на антиокислительный метаболизм при стрессе, вызванном алюминием. Физиология растений, 55(4), 523-528.

26. Чиркова Т.В. (2002) Физиологические основы устойчивости растений. СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 244 с.

27. Шевякова Н.И. (1983) Метаболизм и физиологическая роль пролина в растениях при водном и солевом стрессе. Физиология растений, 30(4), 743751.

28. Abraham E., Rigo G., Szekely G., Nagy R., Koncz C., Szabados L. (2003) Light-dependent induction of proline biosynthesis by abscisic acid and salt stress is inhibited by brassinosteroid in Arabidopsis. Plant Mol. Biol., 51, 363-372.

29. Adams P., Thomas J.C., Veron D.M., Bohvert H.J., Jonsen R.G. (1992) Distinct cellular and organismic responses to salt stress. Plant Cell Physiol., 33(8), 1215-1223.

30. Amtmann A., Sanders D. (1999) Mechanisms of Na+ uptake by plant cells. Adv. Bot. Res., 29, 75-112.

31. Arasimowicz M. and Floryszak-Wieczorek J. (2007) Nitric oxide as a bioactive signaling molecule in plant stress responses. Plant Science, vol. 172, 876-887.

32. Arasimowicz-Jelonek M., Kubis J., Floryszak-Wieczorek J. (2009) Involvement of nitric oxide in water stress-induced responses of cucumber roots PlantScience, vol. 177, 682-690.

33. Ashraf M. (2001) Relationships between growth and gas exchange characteristics in some salt-tolerant amphidiploid Brassica species in relation to their diploid parents. Env. Exp. Bot., 45, 155-163.

34. Ashraf M., McNeilly T. (2004) Salinity Tolerance in Brassica Oilseeds. Critical Reviews in Plant Sciences, 23, 157-174.

35. Attri P., Venkatesu P., Lee M.-J. (2010) Influence of Osmolytes and Denaturants on the Structure and Enzyme Activity of-Chymotrypsin. J. Phys. Chem. В., 114, 1471-1478.

36. Ayliffe M.A., Roberts J.K., Mitchell H.J., Zhang R., Lawrence G.J., Ellis J.G., Pryor J.T. (2002) A plant gene up-regulated at rust infection sites. Plant Physiol., 129, 169-180.

37. Aziz I., Khan M.A. (2001) Effect of seawater on the growth, ion content and water potential of Rhizophora macronata Lam. J. Plant Res., 114, 369-373.

38. Bates L.S., Waldren R.P., Teare I.D. (1973) Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and Soil, 39, 205-207.

39. Besson-Bard A., Astier J., Rasul S., Wawer I., Dubreuil-Maurizi C., Jeandroz S., Wendehenne D. (2009) Current view of nitric oxide-responsive genes in plants. Plant Science, 177, 302-309.

40. Borsani O., Zhu J., Verslues P.E., Sunkar R., Zhu J.K. (2005) Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cisantisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis. Cell, 123, 1279-1291.

41. Buchner J., Schmidt M., Fuchs M., Jaenicke R., Rudolph R., Schmid F. X. and Kiefhaber T. (1991). GroE facilitates refolding of citrate synthase by suppressing aggregation. Biochemistry, 30, 1586—1591.

42. Caldas Т., Demont-Caulet N., Ghazi A., and Richarme G. (1999) Thermo protection by glycine betaine and choline. Microbiology 145, 2543—2548.

43. Chandler SF. and . Thorpr T.A (1987) Characterization of growth, water relations, and proline accumulation in sodium sulfate tolerant callus of Erassica napus L. cv. Westar (Canola). Plant Physiol., 84, 106-111.

44. Chartzoulakis K., Klapaki G. (2000) Response of two green house pepper hybrids to NaCl salinity during different growth stages. Sci. Hortic., 86, 247-260.

45. Chattopadhyay M. K., Kern R., Mistou M., Dandekar A.M., Uratsu S.L., Richarme G. (2004) The chemical chaperone proline relieves the thermosensi-tivity of a dnaK deletion mutant at 42{degrees} C. J. Bacteriol., 186, 81498152.

46. Cheeseman J.M., Wickens L.K. (1986) Control of Na+, K+ transport in Spergula-ria marina. II. Effect of plant size, tissue ion contents and roots- shoot ratio at moderate salinity. Physiol. Plant., 67, 7-14.

47. Chen H., An R., Tang J.-H., Cui X.-H., Hao F.-S., et al. (2007) Over-expression of a vacuolar Na+/H+ antiporter gene improves salt tolerance in an upland rice. Mol. Breed., 19, 215-225.

48. Cherian S., Reddy M.P., Pandya J.B. (1999) Studies on salt tolerance in Avicen-nia marina (Forstk.) Vierh.: effect of NaCl salinity on growth, ion accumulation and enzyme activity. Indian J. Plant Physiol., 4, 266-270.

49. Chiang H.H., Dandekar A.M. (1995) Regulation of proline accumulation in Arabidopsis thaliana (L) Heynh during development and in response to desiccation. Plant Cell Environ, 18, 1280-1290.

50. Colmer T.D., Munns R., Flowers T.J. (2005) Improving salt tolerance of wheat and barley: future prospects. Aust. J. Exp. Agric., 45, 1425-1443.

51. Courtois C., Besson A., Dehan J., et al. (2008) Nitric oxide signalling in plants:1. О+interplays with Ca ~ and protein kinases. J. Exp. Bot., 59, 155-163.

52. Cramer G.R. (1992) Kinetics of maize leaf elongation. II. Responses of a Na-excluding cultivar and a Na-including cultivar to varying Na/Ca salinities. J. Exp. Bot., 43, 857-864.

53. Cramer G.R. (2002) Response of abscisic acid mutants of Arabidopsis to salinity. Funct. Plant Biol., 29, 561-567.

54. CreightonT. E. (1993) Proteins, structures and molecular properties; WH.Freeman and Company: New York.

55. Chuan Chi Lin, Ching Huei Kao. (1996) Proline accumulation is associated with inhibition of rice seedling root growth caused by NaCl Plant Science, 114 121-128.

56. Cuin T.A., Miller A.J., Laurie S.A., Leigh R.A. (2003) Potassium activities in cell compartments of salt-grown barley leaves. J. Exp. Bot., 54, 657-661.

57. Datta K.S., Sharma D.D. (1990) Effect of chloride and sulphate types of salinity on Characteristics of chlorophyll content, photosynthesis and respiration of chick pea (Cicer arientum L.). Physiol, plant., 32(5), 391-395.

58. Davies W.J., Kudoyarova G., Hartung W. (2005) Long-distance ABA signaling and its relation to other signaling pathways in the detection of soil drying and the mediation of the plant's response to drought. J. Plant Growth Regul., 24, 285-295.

59. Dellodonne M., Xia Y., Dixon R.A., Lamb C. (1998) Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance. Nature, 394, 585-588.

60. Deuschle К., Funck D., Forlani G., Stransky H., Biehl A., Leister D., van der Graaff E., Kunze R., Frommer W.B. (2004) The role of Dl-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase in proline degradation. Plant Cell, 16, 3413-3425.

61. Deuschle K., Funck D., Hellmann H., Daschner K., Binder S., Frommer W.B.2001) A nuclear gene encoding mitochondrial Dl-pyrro-line-5-carboxylate dehydrogenase and its potential role in protection from proline toxicity. Plant J., 27, 345-355.

62. Diamant S., Eliahu N., Rosenthal D., Goloubinoff P. (2001) Chemical chape-rones regulate molecular chaperones in vitro and in cells under combined salt and heat stresses. The Journal Of Biological Chemistry, 276(43), 3958639591.

63. Dubois M., Gillew K.A., Hamilton J.K., Reber P.A., Smiyh F. (1956) Colome-tric method of determination of sugars. Analyt. Chem., 3, 350-356.

64. Durner G., Wendehenne D., Klessig D.F. (1998) Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP and cyclic ADP-ribose. Proc. Natl. Acad. Set USA, 95(17), 10328-10333.

65. E Misra N., Saxenaa P. (2009) Effect of salicylic acid on proline metabolism in lentil grown under salinity stress. Plant Science, 177(3), 181-189.

66. Elthon Т.Е., Stewart C.R. (1981) Submitochondrial location and electron transport characteristics of enzymes involved in proline oxidation. Plant Physiol., 67, 780-784.

67. Fabro G., Kovacs I., Pavet V., Szabados L., Alvarez M.E. (2004) Proline accumulation and AtP5CS2 gene activation are induced plant-pathogen incompatible interactions in Arabidospis. Mol Plant Microbe Interact, 17, 343-350.

68. Felle H. (1994) The Н7СГ symporter in root-hair cells of Sinapis alba. An electrophysiological study using ion-selective microelectrodes. Plant Physiol., 106,1131-1136.

69. Flowers T.J. (2004) Improving crop salt tolerance. J. Exp. Botany, 55, 307-319.

70. Flowers Т.J., Dalmond D. (1992b) Protein synthesis in halophytes: the influence of potassium, sodium and magnesium in vitro. Plant Soil., 146, 153-161.

71. Flowers T.J., Hajibagheri M.A., Clipson N.J.W. (1986) Halophytes. O. Rev. Biol., 61,313-331.

72. Flowers T.J., Troke P.F., Yeo A.R. (1977) The mechanism of salt tolerance in halophytes. Annu. Rev. Plant Physiol., 28, 89-121.

73. Flowers T.J., Yeo A.R. (1992a) Solute transport in plants. Glasgow, Scotland: Blackie, 176 p.

74. Fricke W. (2004) Rapid and tissue-specific accumulation of solutes in the growth zone of barley leaves in response to salinity. Planta, 219, 515—25

75. Fricke W., Leigh R.A., Tomos A.D. (1996) The intercellular distribution of vacuolar solutes in the epidermis and mesophyll of barley leaves changes in response to NaCl. J. Exp. Bot., 47, 1413-1426.

76. Fricke W., Peters W.S. (2002) The biophysics of leaf growth in salt-stressed barley. A study at the cell level. Plant Physiol., 129, 374-388.

77. Fukutoku Y., Yamada Y. (1984) Sources of praline-nitrogen in water-stressed soybean (Glycine max). II. Fate of 15N-labelled protein. Plant Physiol., 61, 622-628.

78. Gagneul D., Ainouche A., Duhaze C., Lugan R., Larher F. R., Bouchereau A.2007) A reassessment of the function of the so-called compatible solutes in the Halophytic Plumbaginaceae Limonium latifolium. Plant Physiol., 144, 1598-1611.

79. Garthwaite A.J., von Bothmer R., Colmer T.D. (2005) Salt tolerance in wild Hordeum species is associated with restricted entry of Na+ and СГ into the shoots. J. Exp. Bot., 56, 2365-2378.

80. Gilliham M., Tester M. (2005) The regulation of anion loading to the maize root xylem. Plant Physiol., 137, 819-828.

81. Glenn E.P., Brown J.J., Blumwald E. (1999) Salt tolerance and crop potential of halophytes. Crit. Rev. Plant Sci., 18, 227-255.

82. Gorham J. (1990a) Salt tolerance in the Triticeae: Ion discrimination in Rye and Triticale. J. Exp. Bot., 41 (226), 609-614.

83. Gorham J., Wyn Jones R.G., Bristol A. (1990) Partial characterization of the trait for enhanced K+-Na+ discrimination in the D genome of wheat. Planta, 180, 590-597.

84. Goloubinoff P. and Paolo De Los Rios. (2007) The mechanism of Hsp70 chape-rones: (entropic) pulling the models together. Trends in Biochemical Sciences,Ъ2 No.8, 372-379.

85. Greenway H., Munns R. (1980) Mechanisms of salt tolerance in non-halophytes. Annu. Rev. Plant Physiol., 31, 149-190.

86. Greenway H., Osmond C.B. (1972) Salt responses of enzymes from species differing in salt tolerance. Plant Physiol., 49, 256-259.

87. Hanson A.D., Nelsen C.E., Pederson A.R. and Everson E.H. (1979) Capacity for proline accumulation during water stress in barley and its implication for breeding for drought resistance. Crop Sci., 19,489-493.

88. Hamdy A., Abdul-Dayem S., Abu-Zeid M. (1993) Saline water management for optimum crop production. Agricultural Water Management, 24, 189-203.

89. Hare P.D., Cress W.A. (1997) Metabolic implications of stress-induced proline accumulation in plants. Plant Growth Regiil., 21, 79-102.

90. Hare P.D., Cress W.A., Van Staden J. (1998) Dissecting the roles of osmolyte accumulation during stress. Plant Cell Environ., 21, 535-53.

91. Haro R., Banuelos M.A., Senn M.A.E., Barrero-Gil J., Rodrfguez-Navarro A. (2005) HKT1 mediates sodium uniport in roots. Pitfalls in the expression of HKT1 in yeast. Plant Physiol., 139, 1495-1506.

92. Harrington H.M., Aim D.M. (1988) Interation of heat and salt shock in cultural tobacco cells. Plant Physiol., 88(3), 618-625.

93. Hartl F. U. and Hayer-Hartl M. (2002) Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. Science, 295. 1852-1858.

94. Hellmann H., Funck D., Rentsch D., Frommer W.B. (2000) Hypersensitivity of an Arabidopsis sugar signaling mutant toward exogenous proline application. Plant Physiol., 122, 357-367.

95. Hernandez J., Nistal, Dopico В., Labrador E. (2002) Cold and salt stress regulates the expression and activity of a chickpea cytosolic Cu/Zn superoxide dismutase. Plant Sci., 163, 507-514.

96. Ни C.A., Delauney A.J., Verma D.P.S. (1992) A bifunctional D1 enzyme pyrro-line-5-carboxylate synthetase catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 9354-9358.

97. Hu Y., Burucs Z., von Tucher S., Schmidhalter U. (2007) Short-term effects of drought and salinity on mineral nutrient distribution along growing leaves of maize seedlings. Environ. Exp. Bot., 60, 268-275.

98. Hu Y., Fricke W., Schmidhalter U. (2005) Salinity and the growth of nonhalo-phytic grass leaves: the role of mineral nutrient distribution. Funct. Plant Biol., 32, 973-985.

99. Huang J., Redman R.E. (1995) Salt tolerance of Hordeum and Brassicu species during germination and early seedling growth. Can. J. Plant Sci., 75, 815819.

100. Huang S., Spielmeyer W., Lagudali E.S., James R.A., Platten J.D., et al. (2006) A sodium transporter (HKT7) is a candidate for Naxl, a gene for salt tolerance in durum wheat. Plant Physiol., 142, 1718-1727.

101. Jain S., Nainawatee H.S., Jain R.K., Chowdhury J.B. (1991) Proline status of genetically stable salt-tolerant Brassica juncea L. somaclones and their parent cv. 'Parkash'. Plant Cell Rep., 9, 684-687.

102. James R.A., Davenport R.J., Munns R. (2006a) Physiological characterisation of two genes for Na+ exclusion in durum wheat: Naxl and Nax2. Plant Physiol., 142, 1537-1547.

103. James R.A., Rivelli A.R., Munns R., von Caemmerer S. (2002) Factors affecting C02 assimilation, leaf injury and growth in salt-stressed durum wheat. Funct. Plant Biol., 29, 1393-1403.

104. Jones M.M., Osmond C.B., Turner N.C. (1980) Accumulation of solutes in leaves of sorghum and sunflower in response to water deficits. Aust. J. Plant Physiol, 7, 193-205.

105. Kalaji M.H., Pietkiewicz S. (1993) Salinity effects on plant growth and other physiological processes. Acta Physiol. Plantarum, 15, № 2, 89-124.

106. Kardpal R.P., Rao N.A. (1985) Alterations in the biosynthesis of proteins and nucleicacids inlingermillet (Eleucine carocana) seedlings during water stress and effect of proline on protein biosynthesis. Plant. Sci., 40, 73-79.

107. Khan M.A., Ungar I.A., Showalter A.M. (2000) The effect of salinity on the growth, water status, and ion content of a leaf succulent perennial halophyte Suadea fruticosa (L.) Forssk. J. Arid Environ., 45, 73-84.

108. Kishor P.B.K., Hong Z., Miao G.-H., Ни C.-A.A., Verma D.P.S. (1995) Over-expression of Dl-pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants. Plant Physiol., 108, 1387-1394.

109. Klepper L. (1991) NOx evolution by soybean leaves treated with salicylic acid and selected derivaties. Pest. Biochem. Physiol., 39, 43-48.

110. Kraut, J. Serine proteases: structure and mechanism of catalysis. (1977) Annu. Re. Biochem., 46, 331-358.

111. Kuznetsov Vl.V., Rakitin V., Borisova N.N., Rotschupkin B.V. (1993) Why does Heat Shock Increase Salt Resistance Cotton? Plant Physiol. Biochem., 31, 181-188.

112. Madhab K. Chattopadhyay, Rene K., Michel-Yves Mistou, Abhaya M. Dan-dekar, Sandra L. Uratsu, and Gilbert Richarmel (2004) The Chemical Chaperone Proline Relieves the Thermosensitivity of a dnaK Deletion Mutant at 42°C. Journal Of Bacteriology, 8149-8152

113. Maggio A., Miyazaki S., Veronese P., Fujita Т., Ibeas J.I., Damsz В., Nara-simhan M.L., Hasegawa P.M., Joly R.J., Bressan R.A. (2002) Does proline accumulation play an active role in stress-induced growth reduction? Plant J., 31, 699-712.

114. Mani S., Van de Cotte В., Van Montagu M., Verbruggen N. (2002) Altered levels of proline dehydrogenase cause hypersensitivity to proline and its analogs in Arabidopsis. Plant Physiol., 128, 73-83.

115. Mattioni C., Lacerenza N.G., Troccoli A., De Leonardis A.M., Di Fonzo N. (1997) water and salt stress-induced alterations in proline metabolism of Tri-tictim durum L. seedlings. Plant Physiol., 101, 787-792.

116. Meloni D.A., Oliva M.A., Ruiz H.A., Martinez C.A. (2001) Contribution of proline and inorganic solutes to osmotic adjustment in cotton under salt stress. J. Plant Nutr., 24, 599-612.

117. Mennen H., Jacoby В., Marschner H. (1990) Is sodium proton antiport ubiquitous in plant cells? J. Plant Physiol, 137, 180-183.

118. Moftah A.E. and Michel B.E. (1987) The effect of sodium chloride on solute potential and proline accumulation in soybean leaves. Plant Physiol., 83, 238240.

119. Munns R. (1993) Physiological processes limiting plant growth in saline soils: some dogmas and hypotheses. Plant Cell Environ., 16, 15-24.

120. Munns R. (2002) Comparative physiology of salt and water stress. Plant Cell Environ., 25, 239-250.

121. Munns R. (2005) Genes and salt tolerance: bringing them together. New Phytol., 167, 645-663.

122. Munns R., James R.A. (2003) Screening methods for salinity tolerance: a case study with tetraploid wheat. Plant Soil, 253, 201-218.

123. Munns R., James R.A., Lauchli A. (2006) Approaches to increasing the salt tolerance of wheat and other cereals. J. Exp. Bot., 57, 1025-1043.

124. Munns R., Tester M. (2008) Mechanisms of salinity tolerance. Annu. Rev. Plant Biol., 59, 651-681.

125. Neill S., Bright J., Desikan R. et al. (2008) Nitric oxide evolution and percepton. J. Exp. Bot., 59(1), 25-35.

126. Neill S.J., Desikan R., Ryan C.A. (2003) Nitric oxide signaling in plants. New Phytologist., 159, 11-35.

127. Neves-Piestun B.G., Bernstein N. (2005) Salinity-induced changes in the nutritional status of expanding cells may impact leaf growth inhibition in maize. Funct. Plant Biol., 32, 141-152.

128. Niu X., Bressan R.A., Hasegawa P.M., Pardo J.M. (1995) Ion homeostasis in NaCl stress environments. Plant Physiol., 109, 735-742.

129. Paleg L.G., Stewart G.R., Bredbeer J.W. (1984) Proline and glycinebetaine influence protein solvation. Plant Physiol., 75, 974-978.

130. Pankaj A., Pannuru V. and Ming-Jer Lee. (2010) Influence of Osmolytes and Denaturants on the Structure and Enzyme Activity of Chymotrypsin, J. Phys. Chem., 114, 1471-1478.

131. Passioura J.B., Munns R. (2000) Rapid environmental changes that affect leaf water status induce transient surges or pauses in leaf expansion rate. Aust. J. Plant Physiol., 27, 941-948.

132. Patnaik J.K., Debata B.K. (1997) In vitro selection of NaCl tolerant callus lines of Cymbopogon martinii (Roxb.) Wats. Plant Sci., 124, 203-210.

133. Perez-Alfocea F., Larher F. (1995) Effects of phlorizin and p-chloromercuribenzenesulfonic acid on sucrose and proline accumulation in detached tomato leaves submitted to NaCl and osmotic stresses. J. Plant Physiol, 145, 367-373.

134. Petrusa L.M., Winicov I. (1997) Proline status in salt-tolerant and salt-sensitive alfalfa cell lines and plants in response to NaCl. Plant Physiol. Biochem., 35,303-310.

135. Platten J.D., Cotsaftis O., Berthomieu P., Bohnert H., Bressan R., et al. (2006) Nomenclature for HKT genes, key determinants of plant salinity tolerance. Trends Plant Sci., 11, 372-374.

136. Plesset J., Palm C., Mclaughlin C.S. (1982) Induction of heat shock proteins an termotolerance by ethanol in saecharomyces cereviasiae. Biochem. Biophys. Res. Commun., 108, 1340-1345.

137. Prior L.D., Grieve A.M., Bevington K.B., Slavich P.G. (2007) Long-term effects of saline irrigation water on 'Valencia' orange trees: relationships between growth and yield, and salt levels in soil and leaves. Aust. J. Agric. Res., 58, 349-558.

138. Ramagopal S. (1987) Salinity stress induced tissue specific proteins in barley seedlings. Plant Physiol, 84(2), 324-331.

139. Raven J.A. (1985) Regulation of pH and generation of osmolarity in vascular plants: A cost-benefit analysis in relation to efficiency of use of energy, nitrogen and water. New Phytol., 101, 25-77.

140. Rayapati P.J., Stewart C.R., Hack E. (1989) Pyrroline-5-carboxylate reductase is in Pea (Pisum sativum L.) leaf chloroplasts. Plant Physiol., 91, 581-586.

141. Rengasamy P. (2002) Transient salinity and subsoil constraints to dryland farming in Australian sodic soils: an overview. Aust. J. Exp. Agric., 42, 351-361.

142. Rhodes D., Nadolska-Orczyk A., Rich P.J. (2002) Salinity, osmolytes and compatible solutes. In: Salinity: Environment — Plants — Molecules, Lauchli A., Liittge U. (eds.). Dordrecht, Netherlands: Kluwer, pp. 181-204.

143. Richarme G., and Caldas T. D. (1997) Chaperone properties of the bacterial pe-riplasmic substrate-binding proteins. J. Biol. Chem.212, 15607-15612.

144. Rivero R.M., Kojima M., Gepstein A., Sakakibara H., Mittler R., Gepstein S., Blumwald E. (2007) Delayed leaf senescence induces extreme drought tolerance in a flowering plant. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 19631-19636.

145. Rodriguez H.G., Roberts J.K.M., Jordan W.R., Drew M.C. (1997) Growth, water relations and accumulation of organic and inorganic solute in roots of maize seedlings during salt stress. Plant Physiol., 113(3), 881-893.

146. Romero N., Denicola A., Radi R. (2006) Red blood cells in the metabolism of nitric oxide-derived peroxynitrite. IUBMB Life, 58(10), 572-580.

147. Romeroaranda R., Soria Т., Cuartero J. (2001) Tomato plant water uptake and plant-water relationships under saline growth conditions. Plant Sci., 160, 265-272.

148. Roosens N.H., Thu T.T., Iskandar H.M., Jacobs M. (1998) Isolation of the orni-thine-d-aminotransferase cDNA and effect of salt stress on its expression in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol., 117, 263-271.

149. Rout N.P., Shaw B.P. (1998) Salinity tolerance in aquatic macrophytes: probable role of proline, the enzymes involved in its synthesis and C4 type of metabolism. Plant Science, 136, 121-130.

150. Rus A., Lee B.H., Munoz-Mayor A., Sharkhuu A., Miura K., et al. (2004) AtHKTl facilitates Na+ homeostasis and K+ nutrition in planta. Plant Physiol.,136, 2500-2511.

151. Saradhi P.P., Alia S., Arora K.V.S.K. (1995) Prasad, Proline accumulates in plants exposed to UV radiation and protects them against UV induced peroxidation, Biochem. Biophys. Res. Commun., 209, 1-5.

152. Saradhi P., Alia P., Arora S., Prasad K.V. (1995) Proline accumulates in plants exposed to UV radiation and protects them against UV induced peroxidation. Biochem. Biophys. Res. Commun., 209, 1-5.

153. Saradhi P.P. Saradhi A. (1991) Proline accumulations under heavy metal stress. J. Plant Physiol., 138, 554-558.

154. Savoure A., Hua X.J., Bertauche N., Van Montagu M., Verbruggen N. (1997) Abscisic acid-independent and abscisic acid-dependent regulation of the proline biosynthesis upon cold and osmotic stresses in Arabidopsis thaliana. Mol. Gen. Genet., 254, 104-109.

155. Seki M., Umezawa Т., Urano K., Shinozaki K. (2007) Regulatory metabolic networks in drought stress responses. Curr. Opin. Plant Biol., 10, 296-302.

156. Serrano R., Gaxiola R. (1994) Microbial models and salt stress tolerance in plants. Crit. Rev. Plant Sci., 13, 121-138.

157. Shannon M.C. (1998) Adaptation of plants to salinity. Adv. Agron., 60, 75-119.

158. Shi H.Z., Quintero F.J., Pardo J.M., Zhu J-K. (2002) The putative plasma membrane NaVH4" antiporter SOS1 controls long-distance Na+ transport in plants. Plant Cell, 14, 465-477.

159. Sickler C.M., Edwards G.E., Kiirats O., Gao Z., Loescher W. (2007) Response of mannitol-producing Arabidopsis thaliana to abiotic stress. Funct. Plant Biol., 34, 382-391.

160. Siripornadulsil S., Train S., Verma D.P.S., Sayre R.T. (2002) Molecular mechanisms of proline-mediated tolerance to toxic heavy metals in transgenic microalgae. Plant Cell, 14, 2837-2847.

161. Skerrett M., Tyerman S.D. (1994) A channel that allows inwardly directed fluxes of anions in protoplasts derived from wheat roots. Planta, 192, 295-230.

162. Slatyer R.O. (1967) Plant-water Relationships. New York: Acad. Press, 287 p.

163. Smirnoff N., Cumbes Q.J. (1989) Hydroxyl radical scavenging activity,of compatible solutes. Phytochemistry, 28, 1057-1060.

164. Stabilization, Ahern T.J., Manning M.C. (eds.) New York: Plenum, pp. 265-285.

165. Spitz G. A., Furtado С. M., Sola-Penna M., Zancan P. (2009) Acetylsalicylic acid and salicylic acid decrease tumor cell viability and glucose metabolism modulating 6-phosphofructo-l-kinase structure and activity. Biochem. Pharmacol. 77, 46-53.

166. Sokolovski S.G. and Blatt M.R. (2007) Nitric oxide and plant ion channel control Nitric Oxide in Plant Growth, Plant Cell Monographs, vol. 5. 153-171.

167. Stanley, C.; Rau, D. C. (2008) Assessing the Interaction of Urea and Protein-Stabilizing Osmolytes with the Nonpolar Surface of Hydroxypropylcellulose. Biochemistry, 47, 6711-6718.

168. Stewart G. R., Lee J. A. (1974) The role of proline accumulation in halophytes. Planta (Berl.), 120, 279-289.

169. Storey R., Walker R.R. (1999) Citrus and salinity. Sci. Hortic., 78, 39-81.

170. Timasheff S. (1992) Stabilization of protein structure by solvent additives. In: Stability of Protein Pharmaceuticals: Part B: In Vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein

171. Timasheff S. N. Protein hydration, thermodynamic binding, and preferential hydration. (2002) Biochemistry, 41, 13473-13482.

172. Tomos A.D., Leigh R.A., Shaw C.A., Wyn Jones R.G. (1984) A Comparison of methods for measuring turgor pressures and osmotic pressures of cells of red beet storage tissue. J. Exp. Bot., 35, 1675.

173. Trotel P., Bouchereau A., Niogret M.F., Larher F. (1996) The fate of osmo-accumulated proline in leaf discs of rape (Brassica napus I.) Incubated in a medium of low osmolarity. Plant Sci., 118, 31-45.

174. Uchida A., Jagendorf А. Т., Hibino T. et al. (2002) Effects of hydrogen peroxide and nitric oxide on both salt and heat stress tolerance in rice. Plant Sci., 163(3), 515-523.

175. Uozumi N., Kim E.J., Rubio F., Yamaguchi Т., Muto S., et al. (2000) The Ara-bidopsis HKT1 gene homolog mediates inward Na+ currents in Xenopus lae-vis oocytes andNa+ uptake in Saccharomyces cerevisiae. Plant Physiol., 122, 1249-1259.

176. Venkatesalu V., Kumar R.R., Chellappan K.P. (1994) Growth and mineral distribution of Sesuvium portulacastrum L., a salt marsh halophyte, under sodium chloride stress. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 25, 2797-2805.

177. Venkatesu P, Lee MJ, Lin HM (2007) Thermodynamic characterization of the osmolyte effect on protein stability and the effect of GdnHCl on the protein denatured state. JPhys Chem B, 111, 9045-9056

178. Verbruggen N., Hua X.J., May M., Van Montagu M. (1996) Environmental and developmental signals modulate proline homeostasis: evidence for a negative transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 8787-8791.

179. Verbruggen N.E., Hermans С. (2008) Proline accumulation in plants: a review. Amino Acids, 35, 753-759.

180. Verslues P.E., Bray E.A. (2006) Role of abscisic acid (ABA) and Arabidopsis thaliana ABA-insensitive loci in low water potential-induced ABA and proline accumulation. J. Exp. Bot., 57, 201-212.

181. Willenbrric M.E., Huseman W. (1995) Photoautotrophic Cell Suspension cultures from Mesembryanthemum crystallinum and their response to salt stress. Botanica Acta, 108(6), 497-504.

182. Wilson I.D., Neill S.J., Hancock J.T. et al. (2008) Nitric oxide synthesis and signaling in plants. Plant Cell Environ., 31, 622-631.

183. Wright P.R., Morgan J.M., Jessop R.S. (1997) Turgor maintenance by osmoregulation in Brassica napus and B.juncea under field conditions. Ann.Bot., 80, 313-319.

184. Wyn Jones R.G., Storey R., Leigh R.A., Ahmad N., Pollard A. (1977) A hypothesis on cytoplasmic osmoregulation. In: Regulation of Cell Membrane Activities in Plants, Marre E., Cifferi O. (eds.) Amsterdam: Elsevier, pp. 121136.

185. Yancey Paul H, Somero George N. (1979) Counteraction of urea destabilization of protein structure by methylamine osmoregulatory compounds of elasmo-branch fishes. Biochem J. 183(2), 317-323.

186. Yancey P.H., Clark M.E., Hand S.C., Bowlus R.D. (1982) Somero G.N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217(4566),1214-1222.

187. Yamada M., Morishita H., Urano K., Shiozaki N., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K-, Yoshiba Y. (2005) Effects of free proline accumulation in petunias under drought stress. J. Exp. Bot., 56(417), 1975-1981.

188. Yeo A.R. (1998) Molecular biology of salt tolerance in the context of whole-plant physiology. J. Exp. Bot., 49, 915-929.

189. Yeo A.R., Lee K.S., Izard P., Boursier P.J., Flowers T.J. (1991) Short- and long-term effects of salinity on leaf growth in rice (Oryza sativa L.). J. Exp. Bot., 42, 881-889.

190. Yoshiba Y., Kiyosue Т., Nakashima K., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki

191. K. (1997) Regulation of levels of proline as an osmolyte in plants under water stress. Plant Cell Physiol., 38, 1095-1102.

192. Yousfi N., Slama I., Ghnaya Т., Savoure A., Abdelly C. (2010) Effects of water deficit stress on growth, water relations and osmolyte accumulation in Medi-cago truncatula and M. laciniata populations. Comptes Rendus Biologies, 333(3), 205-213.

193. Zhang C.S., Lu Q., Verma D.P.S. (1995) Removal of feedback inhibition of Dl-pyrroline-5-carboxylate synthetase, a bifunctional enzyme catalyzing the first two steps of proline biosynthesis in plants. J. Biol. Chem., 270, 20491-20496.

194. Zhang Y., Wang L., Liu Y et al. (2006) Nitric oxide enhances salt tolerance in maize seedlings through increasing activities of proton-pump and NaVH* an-tiport in the tonoplast. Planta, 224, 545-555.

195. Zhang L., Zhou S., Xuan Y., Sun M. (2009) Protective effect of nitric oxideagainst oxidative damage in Arabidopsis leaves under Ultraviolet-B Irradiation. J. Plant Biol, 52, 135-140.

196. Zhao M.G., Tian Q.Y., Zhang W.H., Plant Physiol. ( 2007) Nitric Oxide Syn-thase-Dependent Nitric Oxide Production Is Associated with Salt Tolerance in Arabidopsis. Plant Physiology. 144, vol. 206-217.

197. Zhu J-K. (2002) Salt and drought signal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol., 53, 247-273.

Информация о работе

Гринин, Антон Леонидович
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.05

Диссертация

Устойчивость растений горчицы к засолению и возможная роль пролина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы