Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СИСТЕМЫ ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ СВИНЕЙ НА ОСНОВЕ ПОЛУАВТОМАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ГРУПП КРОВИ С ПРИМЕНЕНИЕМ МУЛЬТИСКАНИРОВАНИЯ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СИСТЕМЫ ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ СВИНЕЙ НА ОСНОВЕ ПОЛУАВТОМАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ГРУПП КРОВИ С ПРИМЕНЕНИЕМ МУЛЬТИСКАНИРОВАНИЯ"

На правах рукописи

ФИЛИМОНОВ Алексей Юрьевич

М

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СИСТЕМЫ ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ СВИНЕЙ НА ОСНОВЕ ПОЛУАВТОМАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ГРУПП КРОВИ С ПРИМЕНЕНИЕМ МУЛЬТИСКАНИРОВАНИЯ

03.00.23. — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидат» биологических наук

Дубровкцы — 2007

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор, член-корреспондент РАСХН Наталия Анатольевна Зиновьева

Официальные доктор биологических наук,

оппоненты: профессор Юрий Павлович Фомкчев

доктор биологических наук, Нурмагомед Гаджикулиевич Букаров

Ведущее Московская государственная академия ветеринарной

учреждение: медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина

Защита состоится 2007 года, в ¿5о часов, на заседании

диссертационного совета Д 006.013.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства (ВИЖ),

Адрес института: 142132 Московская область, Подольский

район, пос. Дубровицы, ВИЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан ¿Згуай^З007 года.

Ученый секретарь диссертационь .

кандидат биологических наук/' Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1.. .Актуальность темы. Национальный проект «Развитие агропромышленного комплекса» м ведомственная целевая программа «Развитие свиноводства в Российской Федерация на период 2006-2010 годов и до 2015 года» наряду с использованием передовых энергосберегающих, ресурсосберегающих и экологически безопасных технологий предусматривает внедрение эффективных селекционно-генетических и биологических методов совершенствования лучших отечественных и зарубежных пород и линий свиней. Признавая ведущую роль традиционных методов разведения, следует отметить, что использование только классической селекции уже не может обеспечить должного уровня эффективности селекционно-племенной работы (Эрнст Л.К., 2005). Маркирование признаков на уровне генотипа в дополнение к традиционным классическим методам селекции позволяет значительно повысить эффективность селекционно-племенной работы и достигнуть желаемого результата уже в течение нескольких генерации (Глазко В.И. и др., 200], Зиновьева и др., 2005).

Генетическая экспертиза происхождения племенных животных в РФ является обязательным условием для ведения селекционной работы (Федеральный закон от 3 августа 1995 г. № 123-Ф3 "О племенном животноводстве"). В настоящее время одним из методов генетического контроля происхождения животных, и в частности свиней, является иммуногенетическое тестирование (Амерханов Х.А. и др., 2006). Однако применяемые сегодня в большинстве лабораторий методики тестирования по эритроцитарным антигенам характеризуются большой трудоемкостью, относительно низкой производительностью и визуальной оценкой результатов реакций. Таким образом, для повышения производительности, точности и достоверности иммуногенетической экспертизы происхождения животных актуальным является усовершенствование методических приемов определения групп крови свиней на основе использования современных полуавтоматических инструментальных методов анализа.

1.2. Цель н задачи исследований. Целью исследований явилась разработка высокопроизводительной системы генетического контроля происхождения свиней, основанной на выполнении полуавтоматического анализа групп крови с применением мультисканирования.

Для достижения цели работы были поставлены и решены следующие задачи:

•разработать усовершенствованный режим подготовки суспензии эритроцитов "МИКРО", основанный на использовании микропробирок и настольной микроцентрнфуги;

•разработать методику раскапывания и автоматического смешивания диагностику мов (реагент в. 1 |м п.гу нп г п * I иЦттч* гттгт

сывороток) и суспензии эритроцитов "МУЛШВ-АЙ^ЙЙФ'Л^Рб-ти луночном формате; имени К.А. Тимирязева I

ЦНБ имени Н-И. Железноаа Фонд научней «.«^д^ [

•создать режим "МУЛЬТИСКАНИРОВАНИЕ" для автоматической визуализации результатов с применением планшетного фотометра;

•определить критерии для автоматической обработки результатов анализа;

•провести экспериментальную апробацию системы для тестирования свиней различных пород;

•провести патентные исследования и изучить патентоспособность разработки,

13. Научная новизна исследований состоит в том, что впервые разработана система определения групп крови свиней, основанная на полуавтоматическом инструментальном определении групп крови в 96-лу ночном формате. Предложены способы подготовки суспензии эритроцитов, раскапывания и постановки реакций. Разработан алгоритм анализа результатов реакций агглютинации и гемолиза с применением планшетного фотометра и персонального компьютера. Получено положительное решение о выдаче патента РФ.

1.4. Практическая значимость результатов работы заключается в том, что предложенная усовершенствованная система позволяет повысить производительность и точность метода, снизить трудоемкость к добиться существенной экономии реагентов и, как следствие, снизить материальные к временные затраты.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту.

• Новый режим подготовки суспензии эритроцитов «МИКРО», позволяющий вне зависимости от исходных образцов крови свиней инструментально получать рабочую суспензию эритроцитов.

• Усовершенствованная методика постановки реакций в 9б-луночном планшетном формате «МУЛЬТИ-ДРОП», позволяющая сократить временные и материальные затраты.

• Новый режим «МУЛЬТИСКАНИРОВАНИЕ», позволяющий осуществлять автоматическое «чтение» реакций агглютинации и гемолиза.

• Алгоритм для автоматической идентификации результатов иммуногенетического тестирования.

• Положительное решение о выдачи патента РФ.

1.6. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на Ш международной научно-практической конференции «Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства России», ВИЖ, 2005 г.; на международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения акад. М.Н. Лущихина «Биотехнология в мире животных и растений», 2005, Бишкек, Киргизия; в рамках проведения школ-практикумов «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ,

2004, 2005 гг.; на научных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖ, 2005,2006.

1.7. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК (Свиноводство, 2007, № 2). Получено положительное решение о выдаче патента РФ.

1.8. Структура н объем работы. Диссертационная работа написана на 108 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материал и методы исследований, результаты и обсуждение исследований, заключение, приложение, выводы, практические предложения, список литературы. Работа включает 39 таблиц и 8 рисунков. Список литературы включает 124 источника, в том числе 30 источников на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования выполнялись в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖ в 2003-200бгг., в ОНО э/х «Кленово-Чегодаево» в 20042006 гг., в ЗАО «Агроиндустрия» в 2006 г., в ОАО ПЗ им. А.С. Георгиевского Орловской области в 2006 г., согласно схеме (рис. 1). Для определения групп крови использовали реакции полной агглютинации и гемолиза. Реакции проводили параллельно с использованием традиционной (С.П. Безеико, 1974) и новой методик.

Кровь для исследований брали у свиней из краевой вены уха в пробирки с антикоагулянтом. Методику подготовки суспензии эритроцитов отрабатывали на микроцентрифуге ТЭТА 10 (ООО «Компания «Биоком»), используя вместо традиционных стеклянных пробирок, одноразовые пластиковые пробирки объемом 2,5 мл. Разведение и раскапывание проводили с помощью восьми канального дозатора переменного объема.

Чтение результатов реакций агглютинации и гемолиза осуществляли на планшетном спектрофотометре DYNEX MRX Revelation (Dynotech, США) с применением разработанного в ходе диссертационной работы алгоритма.

Апробацию новой методики проводили по 18 эритроцитарным антигенам 8 генетических систем групп крови (А, В, D, Е, F, О, К, L) на свиньях трех пород: л «венская (п=112), йоркшир (п=30) и ланшрас (п=30). Набор моноспецифических сывороток-реагентов был приобретен во Всероссийском НИИ племенного дела.

Схем« исследования

Рисунок I

Традиционная методика

"Г

Усовершенствованная методика

X

т

Отбор образцов крови.

X

х

Центрифугирование и подготовка суспензии

эритроцитов ь обычном режиме

Центрифугирование и подготовка суспензии _эритроцитов в режиме МИКРО_

Раскалывание реагентов в иммунологические лробцжн

X

Раскалывание реагентов в режиме _МУЛЬТИ-ДРОП_

X

Т

Инкубация

X

х

Чтение результатов реакций витуально на в гглкгп отоскопе

X

Разработка способа постановки и чтения реакций на приборе РУКЕХ МКХ Яеуеіаііоп

[ Обработка результатов реакций вручную | Обработка результатов реакций на ПК

| Апробация новой методики (исшльзойали 3 породы, 172 головы)

Характеристика аллелей и генотипов лив енской порода! свиней -.' -- ^

Экономическое обосноваї ше методики

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ . Разработка режима подготовки суспензии эритроцитов «Микро».

Задачей первого этапа исследований явилась разработка приемов, позволяющих получить осадок эритроцитов равной плотности вне зависимости от исходных проб крови свиней с целью последующего получения 2-х процентной рабочей суспензии эритроцитов с минимальной степенью ошибки.

В качестве приема нами было использовано 3-х кратное центрифугирование на микроцекгрифуге TETA 10. Для выбора режима центрифугирования были выполнены несколько опытов, включающих визуальную и инструментальную оценку осадка эритроцитов, полученного в результате центрифугирования при 5000-8000 об/мин с шагом 1000 об/мин в течение I мин. Оптимальный режим центрифугирования, используя визуальную оценку, выбирали по двум критериям: цвету нааосадочной жидкости, размеру и плотности осадка.

Таблица 1

бальная оценка нааосадочной жидкости и платность осадка эритроцитов в зависимости от способа пробоподготрвки__

Кол-во оборотов в мин. Бальная оценка надосадочной жидкости (Л)* и количество эритроцитов, млрд/мл (В) в образцах Разница (тах- тіп), %**

1 2 3 4 5

А В А В А В А В А В

5000 2 5,66 2 4,05 1 7,63 2 7,42 2 5,53 45,9

6000 3 7,48 2 7,68 2 5Т65 2 5,21 2 7,27 53,1

7000 3 8,91 3 9,18 3 8,51 3 8,54 3 9,59 11.5

8000 3 9,01 3 9,25 3 8,15 3 8,65 3 9,86 173

* I — надосадочная жидкость мутная, осадок рыхлый; 2 — надосадочная жидкость светлее, осадок более плотный; 3 ~ надосадочная жидкость светлая, осадок плотный;

**£>= (I -а/Ь) х100, где: а - тіп значение; Ь -тах значение; О ~ разброс эритроцитов между пробами в процентах.

Исходя из данных, представленных в табл. 1, оптимальным режимом подготовки осадка эритроцитов, позволяющим получать наиболее равномерный по плотности осадок без гемолиза эритроцитов, является центрифугирование при 7000 об/мин в течение 3 мин.

Следующим шагом явилось проведение исследований, направленных на замену процедуры визуального контроля определения рабочей концентрации суспензии эритроцитов на инструментальный метод с применением 8-й канальных дозаторов переменного объема. Результаты обобщены в таблице 2,

Таблица 2

Определение концентрации суспензии эритроцитов

X» образцов крови Концентрация эритроцитов в суспензии

Усовершенствованная методика Традиционная методика

Количество эритроцитов, мл Разница (нпах-тт), % Количество эритроцитов, мл Разница (тах-тт), %*

1 8,8x107 23,1% 9,2x10' 43,5%

2 10,0x10' 5,2x10'

3 8,0x10' 63x10'

4 10,4x10' 6,7x10'

5 8,7x10' 5,5x10'

*Расчет проводили по формуле, приведенной в пояснении к табл. I.

Как следует из данных, приведенных в таблице 2, подготовка суспензии разработанным нами инструментальным способом способствует получению более равномерной по концентрации рабочей суспензии эритроцитов, что является предпосылкой для повышения точности метода.

3.2. Разработка нового режима раскапывания реагентов «Мульти-Дроп».

Основной задачей данного этапа исследований явилось повышение объективности оценки групп крови свиней, с одной стороны, за счет сокращения количества используемых реагентов, с другой стороны, - за счет снижения трудозатрат. Повышение объективности — это одна из наиболее важных задач, которую необходимо решить. С.П. Безенко в своих методических рекомендациях (1974) указывал на эту проблему и предлагал ее решение с помощью второго лаборанта, который бы читал реакцию агглютинации независимо от первого.

Суть определения реакции агглютинации в предложенной нами методике заключается в том, что при формировать и агглютининов уменьшается оптическая плотность среды в пробе. Это объясняется тем, что вначале реакции эритроциты равномерно распределены по всему слою пробы, а после ее окончания, в случае, когда эритроциты агглютинировали, формируются в виде комочков, которые отделены друг от друга. Между комочками образуется достаточно большое расстояние доя проникновения лучей света, что приводит увеличению светопроницаемости среды.

3.2.1. Блокировка поверхности лунки в планшете.

Для постановки реакций нами были использованы плоскодонные планшеты для иммуноферментного анализа, абсорбционные характеристики которых были предварительно заблокированы посредством обработки дезактивирующим раствором (фосфатно-солевой буфер + 10% бычьего альбумина, 37°С, 30-40 минут). По завершении обработки раствор сливали, плашки высушивали и хранили при температуре 2-4°С до использования.

Предварительное блокирование поверхности плашки является важным моментом в разрабатываемой нами системе. Проведенный сравнительный анализ с использованием сывороток Ар, В а, ЕЬ, Ее, РЬ, ЄЬ, Ьа, разведенных согласно титру, показал, что в необработанных плашках почти в 35-40% лунок, особенно где сыворотки белее слабые, эритроциты не вступили в реакцию агглютинация и имели место ошибочно отрицательные результаты.

3.2Л. Анализ влияния концентрации суспензии эритроцитов на постановку реакции.

Задачей данного этапа исследований явилось выявление оптимальной концентрации эритроцитов с тем, чтобы при агглютинации в реакцию вступало максимальное их количество, что привело к более существенным изменениям оптической плотности среды. В качестве методических приемов решения этой задачи нами были исследованы следующие факторы; •увеличение количества сыворотки; •уменьшение количества суспензии крови; •уменьшение концентрации суспензии крови с 2,5% до 1-2%. Увеличение количества сыворотки хотя и упрощало интерпретацию результатов реакций, однако было экономически не оправдано. Уменьшение количества суспензии крови приводило к затруднениям при раскапывании, а так же снижало точность (ошибка при малом объеме возрастала). В этой связи, нами были выполнены более детальные исследования влияния на результативность уменьшения рабочей концентрации су спешки эритроцитов.

Эритроциты промывали физраствором в соотношение крови и физраствора 1:5с использованием оптимизированной нами ранее режим с использованием настольной центрифуги (раздел З.І.). Отмытые эритроциты использовали для приготовления суспензии эритроцитов с размой концентрацией 2,5%, 2,0%, 1,5%, и 1,0%. В исследованиях использовали сыворотки Ар, В а, ЕЬ, Ее, РЬ, вЬ, 1-а (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительный серологический тест для крови разной

_концентрации*_

Концентрация суспензии эритроцитов Номер животного Иммуносп еци фические сыворотки

Ар Ва ЕЬ Ее РЬ ЄЬ и

2,5% 1 1 4 3 4 4 4 2

2 1 4 4 4 4 4 2

2,0% 1 1 4 4 4 4 4 3

2 ] 4 4 4 4 4 4

1,5% 1 0 4 0 3 4 4 3

2 0 4 4 1 4 2 4

1,0% 1 0 3 0 1 3 2 1

2 0 4 0 1 4 3 2

*Чтение реакций проводили с использованием иммунологического фотометра

Как показано в таблице 3, уменьшение концентрации суспензии эритроцитов ниже 2,0% отрицательно сказывается на результатах. При концентрации суспензии эритроцитов 1,5%, сыворотки Ее и Gb в пробе №2 показали ложноотрицательные результаты. При концентрации суспензии эритроцитов 1,0% количество ошибочных результатов возрастало.

Увеличение концентрации эритроцитов более 2% так же отрицательно сказывалось на точности определения результатов реакций. Так, при концентрации суспензии эритроцитов 2,5% сыворотка La показала положительную реакцию в двух пробах. Это можно объяснить тем, что более слабая сыворотка лучше связывает суспензию крови более низкой концентрации. То есть уменьшается количество эритроцитов, не вступивших в реакцию, тем самым, уменьшая оптическую плотность среды, так как из двух сред (суспензии крови и сыворотки) наиболее оптически плотной средой является кровь. По результатам проведенного опыта видно, что наиболее оптимальной концентрацией суспензии является 2,0%, что было подтверждено результатами, полученными с использованием традиционной методики.

3.3. Разработка режима автоматического -«чтения» результатов реакций «МУЛ ЬТ И С (САН И РОВ АН НЕ» с применением планшетного фотометра.

3.3.1. Режим «чтения» реакций агглютинации.

Для повышения объективности «чтения» результатов реакций в качестве промежуточного этапа нами было выполнено исследование результативности использования для этих целей обычного сканера (рис. 2).

На рисунке 2а показано, как располагаются агглютинины в лунке, оставшаяся часть среды практически прозрачна, что увеличивает проницаемость срелы для светового луча. На рисунке 26 реакция агглютинации не произошла, эритроциты равномерно распределены по всей поверхности лунки. Свет равномерно поглощается по всей поверхности пробы.

Сравнительный анализ лунок с

Рисунок 2 «положительной» H

«отрицательной;» реакциями агглютинации с применением сканера

а) б)

а) «положительная» реакция агглютинации (эритроциты склеены в комочки разной величины);

б) «отрицательная» реакция агглютинации (эритроциты равномерно распределены по всей лунке).

Хотя применение сканера существенно облегчает «чтение» результатов реакций по сравнению с традиционным методом и, кроме того, позволяет сохранять результаты тестирования в электронном виде (что является немаловажным в случае возникновения спорных вопросов), вместе с тем, данный метод «чтения» реакций остается субъективным и затрудняет процесс автоматизации системы.

В качестве инструмента, позволяющего повысить объективность н снизить трудозатраты на «чтение» результатов реакций, нами предложено использование планшетного спектрофотометра. Проведенные маркетинговые исследования показали, что практически единственным прибором, пригодных для этих целей, является планшетный спектрофотометр DYNEX MRX Revelation (США), снабженный функцией одновременного пропускания через каждую лунку плашки 32 лучей и подсчета средней арифметической оптической плотности лунки.

Определение результатов реакции агглютинации производили путем определения числовых значений степени поглощения света образцами при длине волны 630 нм.

С целью исключения влияния на результаты реакций типа сыворотки (разные сыворотки имеет различную степень свето про пускания), нами был предложен способ двукратного инструментального определения степени светопропуекания: до н после инкубирования реакции агглютинации. Фиксируя значения оптической плотности реакций до и после инкубирования, можно определить изменения, происходя unie в пробе, установить, таким образом, наличие или отсутствие реакции.

Для автоматической интерпретации результатов нами был разработан алгоритм, согласно которому числовые значения степени поглощения света образцами после проведения реакции (матрица В) вычитали из числовых значений степени поглощения света образцами до проведения реакции (матрица А), а полученные значения переводили в баллы серологического теста.

В качестве примера, приведем результаты исследования свиней породы йоркшир канадской селекции ЗАО «Агро-Индустрия» Орловской области. Взятие крови, ее подготовку к реакции и раскапывание осуществляли согласно разработанной методике подготовки и раскапывания реагентов. Числовые значения степени поглощения света образцами до проведения реакции (матрица А) представлены в табл. 4.

Таблица4

Оптическая плотность образцов до начала реакции _(матрица А)_

Обр*эцы крови Иммупослецифическне сыворотки

Ар Ва вь Da Ей Ed ЕЬ Ее ЕЙ Ef Fa Fb la lb

1 1.0« 1.139 1.083 1.091 1.056 U16 1.045 1.06] 1.061 0.973 1.031 1,079 1,117 1.108

2 0.847 0.9М 0.867 0.874 0.890 0.911 0,847 0,903 0.980 0,844 0,944 0914 1.017

3 0.477 0,819 0.S32 0.S13 0.84» 1.076 0.766 os ю 0.(24 1.160 0,827 0.851 O.iiO 0.877

4 1.110 1.063 1.060 1.023 1.035 1.092 0.914 1.046 1.021 1.058 1.006 1.053 1011 1.125

5 иш им и кз і.пз 1.161 1. >68 |.ш i.ios 1.140 1.288 иоз 1,173 1.163 1.191

6 0 925 1.025 1.09S 1.024 1.056 1.101 1,009 0,997 1-035 1.078 0,992 1.065 1.057 1,172

7 1.212 1,65« 1.093 1.157 1.163 1.193 1.154 1.129 1121 1.121 1.113 1.169 1.162 1.194

8 1.036 0,942 1.020 0.992 1.023 1,077 о.ооо 1.008 1.050 0.991 0.972 0.986 1,030 1.260

Затем плашку помещали в термостат и проводил» инкубацию реакций при температуре 37°С в течение 40 мин после чего еше раз его встряхивали и инкубировали еще в течение 1,5-2,0 часов. Определяли степень поглощения образцами видимого света с длиной волны 630 нм после проведения реакций с использованием планшетного фотометра DYNEX MRX Revelation в режиме агглютинации (матрица В) табл. 5.

Таблица 5

Остическая платность образцов после проведения реакции _(матрица В)_

Образцы крови Иммунососцнфнчсскнс сыворотки

Ар В* ВЬ Da Ея Ed ЕЬ Ее Eg Ef Fa Fb La Lb

1 1,127 0.919 1.101 0.933 1.103 1.038 0.926 1.042 0.971 0,944 1.109 0,819 1.028 1.034

2 0,815 0.639 0.849 0.618 0.872 0.725 0-734 0.782 0.726 0.976 0.858 0.635 0.874 0.822

З 0.886 0,702 0.778 0.633 0.8 І 2 0.926 0.643 0.748 0.741 1.149 0.810 0,632 0,824 0.816

4 1.084 0,773 1.0 L7 0.750 1.008 0.9Е9 0,969 0.930 0,881 0.987 1,017 0,726 1.003 0.960

5 1,225 0.959 1.168 0.905 1.145 1,033 0,993 1.112 0.986 1.158 1.109 0.909 1.148 1.116

6 0.776 0.702 1.052 0.725 1.012 1,029 0.989 0,848 0,778 1.024 1.001 0.754 1.025 0.887

7 1.175 1.362 1.091 1.139 1.155 1.101 1.098 1.023 0.887 1.105 І. І 26 0.892 1.162 1,016

8 1.048 0.819 1027 0.99S 1.018 0,963 0,865 0.898 0,934 0.936 0.984 0.858 1.033 0.962

Для идентификации результатов реакций с использованием программы Excel проводили автоматическое вычитание результатов степени поглощения света средой до (матрица А) и после проведения реакций (матрица В). То есть из значений табл. 4 вычитали значения табл. 5. При наличии реакции агглютинации наблюдали более существенные различия в изменении степени поглощения света средой, чем в случае ее отсутствия.

Таблица б

Разница значений степени оптической плотности образцов до и _после реакции_

Образцы крови Иммувоспепифичсскне сыво ротки

Лр в» вь Da Еа Ed БЬ Бе ЕЕ ЕГ F* Fb La Lb

1 •0,035 0220 -0,01! о.ш ■0.047 0.07» 0.119 0.019 0.090 0.О29 -0,078 0.260 O.OS9 0,074

2 0032 0,2» 4.006 0.2« 0.002 0.1« 0.177 0.065 0.177 0.004 -0.014 0,309 0.040 0.195

3 -0,009 ОЛИ о.оя О.Ш 0.029 0.130 0.1» 0.062 0.082 0.011 0.017 0.220 0.05« 0.061

4 0.026 0,290 0.043 0,273 0,027 ОІОЗ 0.015 «,П6 0.140 0.071 -ООП 0,327 o.oog 0.165

5 0.008 0 233 0.017 0,228 0.01« 0.133 0.122 •«.004 0.154 0.130 -0.00« 0.264 0.015 0.075

б о.т 0.323 0.04« 0,2» 0.0« 0,072 0.020 0.149 0.257 0.054 -0,009 0,311 0,032 0.2S5

7 0.037 0.296 0.002 0.018 0.008 0.092 0.056 0.106 0,234 0.О16 -0.013 0.277 о.ооо 0,178

8 -0.012 0.123 -0.007 -0.00« 0.005 0.114 -0.S6S O.I to 0.116 0.055 ■0.012 0.12S -0.003 0.293

Полученные цифровые значения автоматически с использованием функций, созданных в программе ЕхсеІ, переводили в баллы серологического теста, согласно критериям, приведенным в табл. 7.

Таблица 7

Шкала для перевода цифровых значений в баллы серологического

теста.

Пределы разницы значений Баллы

от -0.1 до 0,025 0

от 0,025 до 0,04 1

от 0,04 до 0,055 2

от 0,055 до 0,1 3

от 0,1 до 1 4

«О» - эритроциты свободно взвешены, жидкость красная (реакция отсутствует);

«1» - агглютинация эритроцитов слабо заметна, жидкость мутная;

«2» - эритроциты в виде мелких комочков, жидкость мутная;

«3» - эритроциты в виде комочков разной величины, жидкость слегка мутная;

«4» - эритроциты соединены в один комок, жидкость прозрачная.

В результате получили значения табл. 8 с данными реакции агглютинации в баллах серологического теста.

Таблица 8

Серологический тест свиней породы Йоркшир по группам крови

Образцы крови Иммуноспшифическис сыворотки

Ар Ва ВЬ Ра Еа Ей ЕЬ Ее ЕГ Ра РЬ Ьа и>

1 0 4 0 4 0 3 4 0 3 1 0 4 3 3

2 1 4 0 4 0 4 4 3 4 0 0 4 2 4

3 0 4 2 4 1 4 4 3 3 0 0 4 3 3

4 1 4 2 4 1 4 0 4 4 3 0 4 0 4

5 0 4 0 4 0 4 4 0 4 4 0 4 0 3

6 4 4 2 4 2 3 0 4 4 0 0 4 1 4

7 1 4 0 0 0 3 4 4 4 0 0 4 0 4

8 0 4 0 0 0 4 4 4 4 3 0 4 0 4

Переводя баллы серологического теста в аллели групп крови свиней, получали генотипы свиней по группам крови (табл. 9).

Таблица?

Группы крови свиней породы йоркшир канадской селекции

Образцы крови Система г рупп крови

А В О Е Р ь

1 а/а а/- <1Ь§МЬ§ Ь/Ь а/Ь

2 я/л а/- сІЬсМек Ь/Ь Ь/Ь

3 а/а а/. аьгЛіег Ь/Ь а/Ь

4 -/- а/а а/- ¿еріУеҐ Ь/Ь Ь/Ь

5 а/а а/- Ь/Ь Ь/Ь

6 -ІР а/а а/. йееМеё Ь/Ь Ь/Ь

7 •Л а/а Ь/Ь (ЗЬаДіеп Ь/Ь Ь/Ь

8 а/а Ь/Ь <ІЬг/<іеГ Ь/Ь Ь/Ь

Проведенное нами контрольное тестирование свиней по разработанному способу показало полное совпадение данных с результатами, полученными с использованием традиционного метода. Таким образом, разработанный нами алгоритм позволил четко идентифицировать результаты реакции агглютинации с применением спектрофотометра.

3.3.2. Режим «чтениям реакции гемолиза.

В реакции гемолиза эритроциты при взаимодействии с иммуиоспеиифической сывороткой и добавлении к ним комплемента разрушаются, вследствие чего оптическая плотность среды уменьшается, что регистрируется прибором.

Рисунок З

Сравнение лунок с «положительной» и «отрицательной»

а) а положительная» реакция гемолиза (стенки эритроцитов полностью разрушены, жидкость прозрачная);

б) «отрицательная» реакция гемолиза (эритроциты не разрушены и равномерно распределены по есей лучке).

Определение результатов реакции гемолиза проводили также на планшетном фотометре DYNEX МКХ Revelation при длине волны 630 нм. Числовые значения степени поглощения света образцами после проведения реакции (матрица D), также как и при агглютинации, вычитали из числовых значений степени поглощения света образцами до проведения реакции (матрица С), а полученные значения переводили в баллы серологического теста.

В качестве примера, приведем результаты тестирования по эритроцитарным антигенам свиней л и венской породы ФГУП ПЗ им. A.C. Георгиевского Орловской области.

Взятие крови ее подготовку к реакции и раскапывание в плашки осуществляли согласно методике. Числовые значения степени поглощения света образцами до проведения реакции (матрица С) представлены в табл. 10.

Таблица 10

Степень поглощения света образцами до начала реакции (матрица

С1

Имнумо-слеинфи-ческие сыворотки образцы кроен свиней

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 IS 16

к» 0,951 1.026 1,151 1,119 1,219 1.21« 1,257 1.011 1,139 1,076 1,027 0,988 0,93 І 1,069 1.ОМ 0,981

Kb 0.935 0,954 1.127 1.10* 1,194 1,179 І.Ї56 1,047 (,090 1,090 1,067 0,992 0,925 1.І1Ї 1,093 0,971

Плашки тщательно встряхивали, выдерживали при комнатной температуре 20 минут. Затем в каждую лунку вносили по 50 мкл комплимента, встряхивали и затем инкубировали 2 часа при температуре 37*С. Чтение реакции проводили на приборе при длине волны 630 нм.

Таблица 11

Степень поглощения света образцами после проведения реакции _(матрицаР)_

Иммуно-спецнфи-ческне сыворотки образцы крови свиней

I 2 3 4 S 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Кя 0,335 0.325 0,337 0,352 0,142 1,020 0,344 0,731 0.831 1,071 0,312 0,308 1,012 1,125 1,045 0,865

Kb 0.30« 0,319 0,313 0,302 0,319 0,322 0,370 0,23 0,311 0,310 0,991 0.933 0,330 0,130 0329 0J02

Далее с использованием программного обеспечения Excel проводили вычитание результатов степени поглощения света средой до (матрица С) и после проведения реакций (матрица D). При наличии реакции гемолиза наблюдали более существенные различия в изменении степени оптической плотности среды, чем в случае ее отсутствия. Эти изменения значительно более существенны, чем при проведении реакций агглютинации (табл. 12).

Таблица 12

Разница значений степени логдоземня света образцами до н после _инкубирования_

Пммуно-слсинфн-чсскне сыворотки образцы крови свиней

1 2 3 4 5 « 7 S 9 10 п 12 13 14 13 16

Кя 0,616 0.701 o.su 0,767 0,877 0,196 0,913 0,280 0,288 0,005 0,715 0.68 -0,080 <060 -0,010 0.116

Kb 0,627 0,625 0,814 0.802 0.875 0,857 0,886 0,767 0,779 0,780 0,076 0,059 0,595 0.783 0,764 0,669

Полученные цифровые значения переводили в баллы серологического теста (табл. 13).

Таблица (3

Пределы разницы значений

Пределы разницы значений Баллы

от -0fl до 0,2 0

от 0,2 до 0,35 1

от 0,35 до 0,5 2

от 0,5 до 0,65 3

от 0,65 до 1 4

«О» - эритроциты свободно взвешены, жидкость красная (реакция отсутствует);

«I» - гемолиз эритроцитов слабо заметен, жидкость красная;

«2» - небольшая часть эритроцитов гемолизирована, жидкость мутная;

«3» -почти все эритроциты гемолкзированы, жидкость слегка мутная;

«4» -все эритроциты гемолкзированы, жидкость прозрачная,

В конечном итоге получили результаты реакции гемолиза в баллах серологического теста (табл. 14) по которым были определены генотипы свиней по эритроштгарным антигенам (табл. 15).

Таблица!4

Серологический тест свиней ливенской породы по группам крови

Иммуно-специфи чески е сыворотки образцы к] рови свиней

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Ка 3 4 4 4 4 0 4 0 0 0 4 4 0 0 0 0

КЬ 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 0 0 3 4 4 4

Таблица 15

Группы крови свиней_

Система групп крови образцы крови свиней

1 2 3 4 5 6 7 S 9 10 11 12 13 14 15 и

К а/Ь а/Ь а/Ь а/Ь а/Ь Ь/. а/Ь Ы. Ы. ь/. а/. а/. ь/. Ы. Ь/. ы.

Сравнительный анализ результатов иммуногенетического тестирования в реакциях агглютинации и гемолиза показал, что разница числовых значений степени поглощения света образцами до и после проведения реакции гемолиза существенно отличаются от агглютинации. Если в реакции агглютинации при 4 баллах — это разница значений должна составлять более 0,1, то в реакции гемолиза эта разница должна составлять свыше 0,65.

3.4. Апробация методики.

Для апробации методики нами были использованы свиньи следующих пород: лнвенская (ФГУП ПЗ им. A.C. Георгиевского Орловской области) в количестве 112 голов, йоркшир канадской селекции 30 голов и ландрас также 30 голов (ЗАО «Arpoиндустрия» Орловской области). Апробацию проводили параллельно традиционной и новой методикой. Проведенные исследования выявили 100% совпадение результатов тестирования, полученных с использованием традиционного и разработанного в ходе выполнения диссертационной работы метода.

Результаты новой методики, а именно таблицы разницы значений оптической плотности среды в {фобе до и после проведения реакций агглютинации и гемолиза приведены в приложении диссертацийнноЙ работы.

1К

С целью характеристики локальной ливенской породы свиней нами 5ыли определены частоты встречаемости аллелей и генотипов по линиям и семействам, уровень гомоадготности стада. Нами были протестированы по эртроиитариым антигенам 20 хряков и 92 матки, которые принадлежали х разным генеалогическим линиям и семействам, разводимым в настоящее время в ФГУП ПЗ им. А.С. Георгиевского Орловской области.

Установлена, что в семействах Высотки и у Грации концентрации аллеля Edtt, который согласно литературным данным встречается у мясных пород свиней, составили 0386 н 0,4)7 соответственно, но в среднем у семейств этот показатель ниже (0,250). В то же время отмечена довольно высокая (0350) частота встречаемости аллеля deg Е локуса у свиноматок, В ранее проведенных исследованиях (Гусев И.В. [и др], 2005), было установлено, что концентрация аллеля Ede* в ливенской породе была ниже концентрации аллеля Edcfk так как, начиная с 1968 года селекционная работа шла в сторону улучшения мясных качеств свиней. Аллель Е*ев связан с жизнеспособностью и у диких свиней его концентрация очень велика, и возможно в связи с достаточно низким уровнем содержания и кормления за животными, произошла элиминация аллеля Е^.

Из всех высокоиммунных антигенов - Bb, Еа, Eb, Ga у хряков ливенской породы отмечена только высокая частота встречаемости Ga по сравнению с другими антигенами, этот показатель составил 0,675.

У хряков ливенской породы линий Василек и Тур имела место высокая частота встречаемости антигена Ар. Это не сказывается негативно на оплодотворяемости и сохранности, так как частота встречаемости этого антигена у свиноматок также высокая за исключением семейств Мальвы и Грации. Анализ таблиц по частоте встречаемости генотипов групп крови Е локуса показал, что свиньи ливенской породы имеют II из 15 возможных генотипов. Концентрация их различна как у хряков, так и у свиноматок. Среди свиноматок наиболее часто встречаются животные с генотипами Edcg/deg (0,185), Edeg/dbg (0,175), а среди хряков - производителей Edeg/deg (0,250), EdePdef (ОД 50).

На основании полученных данных нами был рассчитан уровень гомозиготностн (УГ) стада л «венских свиней ГПЗ имени А.СХеоргиевского. Уровень гомозиготностн по маточному поголовью составил 0,77, из них 58,7% являются с высоким УГ, 31,5% - со средним УГ, и 9,8% - с низким УГ, а по хрякам уровень гомозиготностн равен 0,87, причем 80% - с высоким УГ, а 20% - со средним УГ, - это достаточно высокий показатель для стада, связан с закрытым типом воспроизводства в последние годы и свидетельствует о высокой консолидации стада. Для племенного хозяйства при чистопородном разведении (согласно данным С.П. Безенко, 1985), такой уровень гомозиготностн является наиболее оптимальным.

3.5. Анализ экономических показателей результативности разработанной системы.

Затраты на проведение генетической экспертизы племенной продукции подразделяются на приобретение необходимого оборудования для оснащения создаваемой лаборатории и затраты на покупку дорогостоящих реактивов.

Для лабораторий, желающих работать по предложенной нами методике, основные затраты будут связаны с покупкой планшетного фотометра, цена которого на 1.01.2007 г. составила 286350 руб., и 8-канального дозатора переменного объема (9000 руб.).

С учетом стоимости реагентов, используемых при определении группы крови свиней (цена одной дозы сыворотки сегодня, согласно данным ВНИИплем, равна 9 руб.), стоимость реагентов для тестирования 100 голов свиней по 20 антигенам составит 18000 руб.

Предложенная нами методика позволяет сократить использование имму носпецифических сывороток в 2 раза с 0,1 мл до 0,05 мл на дозу, что приведет к снижению затрат на тестирование £00 голов свиней с 18000 до 9000 руб., создавая весьма существенную экономию денежных средств.

Только за счет экономии иммуноспецифических сывороток, затраты на приобретение планшетного спектрофотометра и 8-й канального дозатора окупаются после тестировании 3280 голов свиней.

Что касается трудозатрат: на «чтение» 96 серологических пробирок в стандартной методике необходимо затратить не менее 5 — 6 мин. в зависимости от лаборанта, его опыта и профессиональной подготовки, в предлагаемой нами методике на это уходит около 1,5-2,0 мин., что почти в 35 раз быстрее. Лабораториям иногда приходиться тестировать до 100 голов в день по 17 - 20 сывороток на голову, то есть до 2000 проб в день. При стандартной методике на это потребуется 1,5 - 2,0 часа, в новой методике на это уйдет не более 30 мин.

Предложенный способ определения групп кров» свиней характеризуется меньшей трудоемкостью, более высокой производительностью и объективной идентификацией результатов реакций за счет мультисканирования на основе планшетного фотометра.

По разработанной методике проведены патентные исследования и получено положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение № 2005133270/13 «Способ определения групп крови у свиней».

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый способ подготовки суспензии эритроцитов свиней для иммуногенетического тестирования, позволяющий получать наиболее равномерный по плотности осадок. Если при использовании традиционной методики плотность осадка эритроцитов в разных пробах варьировала в пределах 43,5%, то при применении усовершенствованной нами системы — в пределах 23,1%. Разработанный способ позволяет инструментально получать концентрацию суспензии эритроцитов 2%, полностью исключив визуальную оценку.

2. Усовершенствована методика постановки реакций агглютинации, позволяющая сократить расход иммуноспецифнческих сивороток по сравнению с традиционной методикой в 2 раза, с 0,1 мл до 0,05 мл на 1 тестодозу и снизить временные затраты почти в 3-5 раз.

3. Разработан новый автоматический режим «чтениям реакций агглютинации н гемолиза «Мультисканнрование», основанный на использовании планшетных фотометров. Предложенный способ позволяет исключить субъективный фактор в интерпретации результатов реакций н сократить временные затраты на «чтение» реакций в 3-5 раз.

4. Разработан алгоритм для автоматической интерпретации результатов иммуиогенетнческого тестирования групп крови свиней, позволяющий переводить значения, полученные при спектрофотометрин, в баллы серологического теста. Проведенное сравнительное тестирование образцов крови 172 голов свиней 3 пород показало 100% совпадение результатов, полученных с использованием разработанного и традиционного методов.

5. Выполнена производственная проверка разработанной методики для иммуногенетическото тестирования свиней трех пороз: ливенская (112 голов), ландрас (30 голов) к Йоркшир (30 толов). Выполнен детальный анализ иммуногенетмческих профилей свиней ливенской породы. Уровень гомозиготи ости по маточному поголовью составил 0,77, а по хрякам уровень гомозиготи ости равен 0,37, что является для свиней ливенской породы достаточно высоким показателем.

6. Выполнены латентные исследования способов определения групп крови свиней. Получено положительное решение о выдаче патента РФ «Способ определения групп крови у свиней«.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Иммуногенетическим лабораториям, занимающимся определением групп крови свиней, с целью сокращения материальных и временных затрат на тестирование рекомендуем использовать разработанную нами систему.

СПИСОК РАБОТ ПО МЕТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Филимонов, А.Ю, К вопросу усовершенствования системы генетического тестирования свиней по группам крови / А.Ю. Филимонов, И.В, Гусев, НА. Зиновьева, K.M. Шавырина /У Сборник материалов III международной научно-практической конференции «Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства России», научные труды ВИЖ, 2005, вып. 63, Т, 2, с 196-200.

2. Филимонов, А.Ю. Разработка и экспериментальная апробация усовершенствованной системы тестирования свиней по эритроцнтарным антигенам / А.Ю. Филимонов, И.В. Гусев, H.A. Зиновьева // Сборник материалов между народной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения акад. М.Н. Лущил ина «Биотехнология в мире животных и растений», 2005, Бишкек, Киргизия, с. 162-165.

3. Филимонов, AJO. Имму ногеиетическое тестирование свиней с использованием усовершенствованной системы полуавтоматического анализа групп крови с применением мультнскаиирования / AJO. Филимонов, И.В. Гусев, H.A. Зиновьева, K.M. Шавырина // Школа - практикум «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», 2005, вып. 4, с. 113-117.

4. Зиновьева, H.A. Сравнительный анализ генетических профилей свиней ливенской породы по ДНК-маркерам / H.A. Зиновьева, Е.А. Гладырь, О.В. Костюнина, А.Ю. Филимонов, K.M. Шавырина, A.M. Алобаев // Свиноводство, 2007, №2.

5. Филимонов, А.Ю. Использование иммуногенетич ее кого маркирования в совершенствовании свиней / А.Ю. Филимонов, И.В. Гусев, K.M. Шавырина И Школа-практикум «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», выпуск 3, Дубровицы, 2004, C.J3-59

6. Филимонов, А.Ю. Положительное решение о выдаче патента РФ Ла 2005133270/13 «Способ определения групп крови у свиней» / А.Ю. Филимонов, ИЗ. Гусев, НА. Зиновьева, K.M. Шавырина. i

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл., Подольский р-н, л. Дубровицы Тел. (8 - 27) 65-14-24, {8 -27) 65-14-07

Сдано в набор 11.04.2007. Подписано в печать 12.04.2007 _ЗаказДв б.Печ.л. 1,0. Тираж 100 экз._

Отпечатано в типографии РУЭЦ