Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование системы иммуногенетического исследования свиней на основе полуавтоматического анализа групп крови с применением мультисканирования

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование системы иммуногенетического исследования свиней на основе полуавтоматического анализа групп крови с применением мультисканирования"

003050104

с ио»

На правах рукописи

ФИЛИМОНОВ Алексей Юрьевич

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СИСТЕМЫ ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ СВИНЕЙ НА ОСНОВЕ ПОЛУАВТОМАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ГРУПП КРОВИ С ПРИМЕНЕНИЕМ МУЛЬТИСКАНИРОВАНИЯ

/

03.00.23. - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы - 2007

003058104

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства

Научный руководитель доктор биологических наук,

профессор, член-корреспондент РАСХН Наталия Анатольевна Зиновьева

Официальные доктор биологических наук,

оппоненты профессор Юрий Павлович Фомичев

доктор биологических наук, Нурмагомед Гаджикулиевич Букаров

Ведущее Московская государственная академия ветеринарной

учреждение медицины и биотехнологии имени К.И Скрябина

Защита состоится года, в ^Р часов, на заседании

диссертационного совета Д 006 013.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства (ВИЖ)

Адрес института 142132 Московская область, Подольский

район, пос Дубровицы, ВИЖ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан » года

Ученый секретарь диссертационн

кандидат биологических нау^/ ^ Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Национальный проект «Развитие агропромышленного комплекса» и ведомственная целевая программа «Развитие свиноводства в Российской Федерации на период 2006-2010 годов и до 2015 года» наряду с использованием передовых энергосберегающих, ресурсосберегающих и экологически безопасных технологий предусматривает внедрение эффективных селекционно-генетических и биологических методов совершенствования лучших отечественных и зарубежных пород и линий свиней Признавая ведущую роль традиционных методов разведения, следует отметить, что использование только классической селекции уже не может обеспечить должного уровня эффективности селекционно-племенной работы (Эрнст JIК, 2005) Маркирование признаков на уровне генотипа в дополнение к традиционным классическим методам селекции позволяет значительно повысить эффективность селекционно-племенной работы и достигнуть желаемого результата уже в течение нескольких генераций (Глазко В И и др, 2001, Зиновьева и др, 2005)

Генетическая экспертиза происхождения племенных животных в РФ является обязательным условием для ведения селекционной работы (Федеральный закон от 3 августа 1995 г № 123-ФЭ "О племенном животноводстве") В настоящее время одним из методов генетического контроля происхождения животных, и в частности свиней, является иммуногенетическое тестирование (Амерханов X А и др, 2006) Однако применяемые сегодня в большинстве лабораторий методики тестирования по эритроцитарным антигенам характеризуются большой трудоемкостью, относительно низкой производительностью и визуальной оценкой результатов реакций Таким образом, для повышения производительности, точности и достоверности иммуногенетической экспертизы происхождения животных актуальным является усовершенствование методических приемов определения групп крови свиней на основе использования современных полуавтоматических инструментальных методов анализа

1.2. Цель Ii задачи исследований. Целью исследований явилась разработка высокопроизводительной системы генетического контроля происхождения свиней, основанной на выполнении полуавтоматического анализа групп крови с применением мультисканирования

Для достижения цели работы были поставлены и решены следующие задачи

• разработать усовершенствованный режим подготовки суспензии эритроцитов "МИКРО", основанный на использовании микропробирок и настольной микроцентрифуги,

•разработать методику раскапывания и автоматического смешивания диагностикумов (реагентов, иммуноспецифических

сывороток) и суспензии эритроцитов "МУЛЬТИ-ДРОП" в 96-ти луночном формате,

• создать режим "МУЛЪТИСКАНИРОВАНИЕ" для автоматической визуализации результатов с применением планшетного фотометра,

• определить критерии для автоматической обработки результатов анализа,

• провести экспериментальную апробацию системы для тестирования свиней различных пород,

• провести патентные исследования и изучить патентоспособность разработки

1 3. Научная новизна исследований состоит в том, что впервые разработана система определения групп крови свиней, основанная на полуавтоматическом инструментальном определении групп крови в 96-луночном формате Предложены способы подготовки суспензии эритроцитов, раскапывания и постановки реакций Разработан алгоритм анализа результатов реакций агглютинации и гемолиза с применением планшетного фотометра и персонального компьютера Получено положительное решение о выдаче патента РФ

1.4. Практическая значимость результатов работы заключается в том, что предложенная усовершенствованная система позволяет повысить производительность и точность метода, снизить трудоемкость и добиться существенной экономии реагентов и, как следствие, снизить материальные и временные затраты

1.5. Основные положения, выносимые на защиту.

• Новый режим подготовки суспензии эритроцитов «МИКРО», позволяющий вне зависимости от исходных образцов крови свиней инструментально получать рабочую суспензию эритроцитов

• Усовершенствованная методика постановки реакций в 96-луночном планшетном формате «МУЛЬТИ-ДРОП», позволяющая сократить временные и материальные затраты

• Новый режим «МУЛЪТИСКАНИРОВАНИЕ», позволяющий осуществлять автоматическое «чтение» реакций агглютинации и гемолиза

• Алгоритм для автоматической идентификации результатов иммуногенетического тестирования

• Положительное решение о выдачи патента РФ

1.6. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на III международной научно-практической конференции «Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства России», ВИЖ, 2005 г , на международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения акад МН Лущихина «Биотехнология в мире животных и растений», 2005, Бишкек, Киргизия, в рамках проведения школ-практикумов «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ,

2004, 2005 гг, на научных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖ, 2005,2006

1.7. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК (Свиноводство, 2007, № 2) Получено положительное решение о выдаче патента РФ

1.8. Структура и объем работы. Диссертационная работа написана на 108 страницах, состоит из следующих разделов введение, обзор литературы, материал и методы исследований, результаты и обсуждение исследований, заключение, приложение, выводы, практические предложения, список литературы Работа включает 39 таблиц и 8 рисунков Список литературы включает 124 источника, в том числе 30 источников на иностранных языках

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования выполнялись в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖ в 2003-200бгг, в ОНО э/х «Кленово-Чегодаево» в 20042006 гг, в ЗАО «Агроиндустрия» в 2006 г, в ОАО ПЗ им АС Георгиевского Орловской области в 2006 г, согласно схеме (рис 1) Для определения групп крови использовали реакции полной агглютинации и гемолиза Реакции проводили параллельно с использованием традиционной (С П Безенко, 1974) и новой методик

Кровь для исследований брали у свиней из краевой вены уха в пробирки с антикоагулянтом Методику подготовки суспензии эритроцитов отрабатывали на микроцентрифуге ТЭТА 10 (ООО «Компания «Биоком»), используя вместо традиционных стеклянных пробирок, одноразовые пластиковые пробирки объемом 2,5 мл Разведение и раскапывание проводили с помощью восьмиканапьного дозатора переменного объема

Чтение результатов реакций агглютинации и гемолиза осуществляли на планшетном спектрофотометре DYNEX MRX Revelation (Dynotech, США) с применением разработанного в ходе диссертационной работы алгоритма

Апробацию новой методики проводили по 18 эритроцитарным антигенам 8 генетических систем групп крови (А, В, D, Е, F, G, К, L) на свиньях трех пород ливенская (п=112), йоркшир (п=30) и ландрас (п=30) Набор моноспецифических сывороток-реагентов был приобретен во Всероссийском НИИ племенного дела

Схема исследования

Рисунок 1

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ЗЛ. Разработка режима подготовки суспензии эритроцитов «Микро»

Задачей первого этапа исследований явилась разработка приемов, позволяющих получить осадок эритроцитов равной плотности вне зависимости от исходных проб крови свиней с целью последующего получения 2-х процентной рабочей суспензии эритроцитов с минимальной степенью ошибки

В качестве приема нами было использовано 3-х кратное центрифугирование на микроцентрифуге TETA 10 Для выбора режима центрифугирования были выполнены несколько опытов, включающих визуальную и инструментальную оценку осадка эритроцитов, полученного в результате центрифугирования при 5000-8000 об/мин с шагом 1000 об/мин в течение 1 мин Оптимальный режим центрифугирования, используя визуальную оценку, выбирали по двум критериям цвету надосадочной жидкости, размеру и плотности осадка

Таблица 1

Бальная оценка надосадочной жидкости и плотность осадка эритроцитов в зависимости от способа пробоподготовки_

Кол-во оборотов в мин Бальная оценка надосадочной жидкости (А)* и количество эритроцитов, млрд/мл (В) в образцах Разница (тах- тт), %**

1 2 3 4 5

А В А В А В А В А В

5000 2 5,66 2 4,05 1 7,63 2 7,42 2 5,53 45,9

6000 3 7,48 2 7,68 2 5,65 2 5,21 2 7,27 53,1

7000 3 8,91 3 9,18 3 8,51 3 8,54 3 9,59 11,5

8000 3 9,01 3 9,25 3 8,15 3 8,65 3 9,86 17,3

* 1 - иадосадочная жидкость мутная, осадок рыхлый, 2 — надосадочная жидкость светлее, осадок более плотный, 3 - иадосадочная жидкость светлая, осадок плотный,

** D = (1 - a/b) хЮО, где а - min значение, b -max значение, D -разброс эритроцитов между пробами в процентах

Исходя из данных, представленных в табл 1, оптимальным режимом подготовки осадка эритроцитов, позволяющим получать наиболее равномерный по плотности осадок без гемолиза эритроцитов, является центрифугирование при 7000 об/мин в течение 3 мин

Следующим шагом явилось проведение исследований, направленных на замену процедуры визуального контроля определения рабочей концентрации суспензии эритроцитов на инструментальный метод с применением 8-и канальных дозаторов переменного объема Результаты обобщены в таблице 2

Таблица 2

Определение концентрации суспензии эритроцитов

№ образцов крови Концентрация эритроцитов в суспензии

Усовершенствованная методика Традиционная методика

Количество эритроцитов, мл Разница (шах-шт), % Количество эритроцитов, мл Разница (шах-шт), %*

1 8,8x10' 23,1% 9,2x10' 43,5%

2 10,0х107 5,2x10'

3 8,0x10' 6,3x10'

4 10,4х107 6,7x10'

5 8,7x107 5,5x10'

*Расчет проводили по формуле, приведенной в пояснении к табл I

Как следует из данных, приведенных в таблице 2, подготовка суспензии разработанным нами инструментальным способом способствует получению более равномерной по концентрации рабочей суспензии эритроцитов, что является предпосылкой для повышения точности метода

3.2. Разработка нового режима раскапывания реагентов «Мульти-Дроп».

Основной задачей данного этапа исследований явилось повышение объективности оценки групп крови свиней, с одной стороны, за счет сокращения количества используемых реагентов, с другой стороны, - за счет снижения трудозатрат Повышение объективности - это одна из наиболее важных задач, которую необходимо решить С П Безенко в своих методических рекомендациях (1974) указывал на эту проблему и предлагал ее решение с помощью второго лаборанта, который бы читал реакцию агглютинации независимо от первого

Суть определения реакции агглютинации в предложенной нами методике заключается в том, что при формировании агглютининов уменьшается оптическая плотность среды в пробе Это объясняется тем, что вначале реакции эритроциты равномерно распределены по всему слою пробы, а после ее окончания, в случае, когда эритроциты агглютинировали, формируются в виде комочков, которые отделены друг от друга Между комочками образуется достаточно большое расстояние для проникновения лучей света, что приводит увеличению светопроницаемости среды 3 2.1. Блокировка поверхности лунки в планшете. Для постановки реакций нами были использованы плоскодонные планшеты для иммуноферментного анализа, абсорбционные характеристики которых были предварительно заблокированы посредством обработки дезактивирующим раствором (фосфатно-солевой буфер + 10% бычьего альбумина, 37°С, 30-40 минут) По завершении обработки раствор сливали, плашки высушивали и хранили при температуре 2-4°С до использования

Предварительное блокирование поверхности плашки является важным моментом в разрабатываемой нами системе Проведенный сравнительный анализ с использованием сывороток Ар, Ва, ЕЬ, Ее, БЬ, ОЬ, Ьа, разведенных согласно титру, показал, что в необработанных плашках почти в 35-40% лунок, особенно где сыворотки более слабые, эритроциты не вступили в реакцию агглютинации и имели место ошибочно отрицательные результаты

3.2.2. Анализ влияния концентрации суспензии эритроцитов на постановку реакции.

Задачей данного этапа исследований явилось выявление оптимальной концентрации эритроцитов с тем, чтобы при агглютинации в реакцию вступало максимальное их количество, что привело к более существенным изменениям оптической плотности среды В качестве методических приемов решения этой задачи нами были исследованы следующие факторы •увеличение количества сыворотки, •уменьшение количества суспензии крови, •уменьшение концентрации суспензии крови с 2,5% до 1-2% Увеличение количества сыворотки хотя и упрощало интерпретацию результатов реакций, однако было экономически не оправдано Уменьшение количества суспензии крови приводило к затруднениям при раскапывании, а так же снижало точность (ошибка при малом объеме возрастала) В этой связи, нами были выполнены более детальные исследования влияния на результативность уменьшения рабочей концентрации суспензии эритроцитов

Эритроциты промывали физраствором в соотношение крови и физраствора 1:5с использованием оптимизированной нами ранее режим с использованием настольной центрифуги (раздел 3 1) Отмытые эритроциты использовали для приготовления суспензии эритроцитов с разной концентрацией 2,5%, 2,0%, 1,5%, и 1,0% В исследованиях использовали сыворотки Ар, Ва, ЕЬ, Ее, РЬ, ОЬ, Ьа (табл 3)

Таблица 3

Сравнительный серологический тест для крови разной ___ концентрации*_

Концентрация суспензии эритроцитов Номер животного Иммуноспецифические сыворотки

Ар Ва ЕЬ Ее БЬ вь Ьа

2,5% 1 1 4 3 4 4 4 2

2 1 4 4 4 4 4 2

2,0% 1 1 4 4 4 4 4 3

2 1 4 4 4 4 4 4

1,5% 1 0 4 0 3 4 4 3

2 0 4 4 1 4 2 4

1,0% 1 0 3 0 1 3 2 1

2 0 4 0 1 4 3 2

*Чтеиие реакций проводили с использованием иммунологического фотометра

Как показано в таблице 3, уменьшение концентрации суспензии эритроцитов ниже 2,0% отрицательно сказывается на результатах При концентрации суспензии эритроцитов 1,5%, сыворотки Ее и вЬ в пробе №2 показали ложноотрицательные результаты При концентрации суспензии эритроцитов 1,0% количество ошибочных результатов возрастало

Увеличение концентрации эритроцитов более 2% так же отрицательно сказывалось на точности определения результатов реакций Так, при концентрации суспензии эритроцитов 2,5% сыворотка Ьа показала положительную реакцию в двух пробах Это можно объяснить тем, что более слабая сыворотка лучше связывает суспензию крови более низкой концентрации То есть уменьшается количество эритроцитов, не вступивших в реакцию, тем самым, уменьшая оптическую плотность среды, так как из двух сред (суспензии крови и сыворотки) наиболее оптически плотной средой является кровь По результатам проведенного опыта видно, что наиболее оптимальной концентрацией суспензии является 2,0%, что было подтверждено результатами, полученными с использованием традиционной методики

3.3. Разработка режима автоматического «чтения» результатов реакций «МУЛЬТИСКАНИРОВАНИЕ» с применением планшетного фотометра.

3.3.1. Режим «чтения» реакций агглютинации.

Для повышения объективности «чтения» результатов реакций в качестве промежуточного этапа нами было выполнено исследование результативности использования для этих целей обычного сканера (рис 2)

На рисунке 2а показано, как располагаются агглютинины в лунке, оставшаяся часть среды практически прозрачна, что увеличивает проницаемость среды для светового луча На рисунке 26 реакция агглютинации не произошла, эритроциты равномерно распределены по всей поверхности лунки Свет равномерно поглощается по всей поверхности пробы

II

Рисунок 2

Сравнительный анализ лунок с «положительной» и

а) 6}

а) «положительная» реакция агглютинации (эритроциты склеены в комочки разной величины);

б) «отрицательная» реакция агглютинации (эритроциты равномерно распределены по всей лунке).

Хотя применение сканера существенно облегчает «чтение» результатов реакций по сравнению с традиционным методом и, кроме того, позволяет сохранять результаты тестирования в электронном виде (что является немаловажным в случае возникновения спорных вопросов), вместе с тем, данный метод «чтения» реакций остается субъективным и затрудняет процесс автоматизации системы.

В качестве инструмента, позволяющего повысить объективность и снизить трудозатраты на «чтение» результатов реакций, нами предложено использование планшетного спектрофотометра. Проведенные маркетинговые исследования показали, что практически единственным прибором, пригодных для этих целей, является планшетный спектрофотометр DYNbX MRX Revelation (США), снабженный функцией одновременного пропускания через каждую лунку плашки 32 лучей и подсчета средней арифметической оптической плотности лунки.

Определение результатов реакции агглютинации производили путем определения числовых значений степени поглощения света образцами при длине волны 630 нм.

С целью исключения влияния на результаты реакций типа сыворотки (разные сыворотки имеет различную степень светопропускания), нами был предложен способ двукратного инструментального определения степени светопропускания: до и после инкубирования реакции агглютинации. Фиксируя значения оптической плотности реакций до и после инкубирования, можно определить изменения, происходящие в пробе, установить, таким образом, наличие или отсутствие реакции.

Для автоматической интерпретации результатов нами был разработан алгоритм, согласно которому числовые значения степени поглощения света образцами после проведения реакции (матрица В) вычитали из числовых значений степени поглощения света образцами до проведения реакции (матрица А), а полученные значения переводили в баллы серологического теста

В качестве примера, приведем результаты исследования свиней породы йоркшир канадской селекции ЗАО «Агро-Индустрия» Орловской области Взятие крови, ее подготовку к реакции и раскапывание осуществляли согласно разработанной методике подготовки и раскапывания реагентов Числовые значения степени поглощения света образцами до проведения реакции (матрица А) представлены в табл 4

Таблица 4

Оптическая плотность образцов до начала реакции _(матрица А) __

Образцы крови Иммуноспецифические сыворотки

Ар Ва вь Da Еа Ed Eb Ее Eg Ef Fa Fb La Lb

1 1092 1 139 1 083 1 091 1 056 1 116 1 045 1 061 1061 0 973 1 031 1 079 1 117 1 108

2 0 847 0 914 0 843 0 867 0 874 0 890 0911 0 847 0 903 0 980 0 844 0 944 0914 1 017

3 0 877 0 889 0 832 0 813 0 841 1 076 0 766 0810 0 824 1 160 0 827 0 852 0 880 0 877

4 1 110 1063 1060 1 023 1 035 1 092 0 984 1 046 1 021 1 058 1 006 I 053 1 011 1 125

5 1233 1 192 1 185 1 133 1 161 1 168 1 115 1 108 1 140 1288 il 103 1 173 1 163 1 191

6 0 925 1 025 1 098 1 024 1056 1 101 1 009 0 997 1035 1 078 0 992 1065 1 057 1 172

7 1212 1 658 1 093 1 157 1 163 1 193 1 154 1 129 1 121 1 121 1 113 1 169 1 162 1 194

8 1036 0 942 1020 0 992 I 023 1077 0 000 1 008 1050 0 991 0 972 0 986 1030 1 260

Затем плашку помещали в термостат и проводили инкубацию реакций при температуре 37°С в течение 40 мин после чего еще раз его встряхивали и инкубировали еще в течение 1,5-2,0 часов Определяли степень поглощения образцами видимого света с длиной волны 630 нм после проведения реакций с использованием планшетного фотометра DYNEX MRX Revelation в режиме агглютинации (матрица В) табл 5

Таблица 5

Оптическая плотность образцов после проведения реакции _(матрица В)_

Образцы крови Иммуноспецифические сыворотки

Лр Ва ВЬ Da Еа Ed Eb Ее Eg Ef Fa Fb La Lb

1 1 127 0 919 1 101 0 953 1 103 1 038 0 926 1 042 0 971 0 944 1 109 0 819 1 028 1 034

2 0815 0 659 0 849 0618 0 872 0 725 0 734 0 782 0 726 0 976 0 858 0 635 0 874 0 822

3 0 886 0 702 0 778 0 633 0 812 0 926 0 643 0 748 0 742 1 149 0 810 0 632 0 824 0 816

4 1084 0 773 1 017 0 750 1008 0 989 0 969 0 930 0 881 0 987 1 017 0 726 1 003 0 960

5 1 225 0 959 1 168 0 905 1 145 1 035 0 993 1 112 0 986 1 158 1 109 0 909 1 148 I 116

6 0 776 0 702 1 052 0 725 1 012 1 029 0 989 0 848 0 778 1 024 1 001 0 754 1 025 0 887

1 1 175 1362 1091 1 139 1 155 1 101 1 098 1 023 0 887 1 105 1 126 0 892 1 162 1016

8 1 048 0 819 1 027 0 998 1 018 0 963 0 865 0 898 0 934 0 936 0 984 0 858 1 033 0 962

Для идентификации результатов реакций с использованием программы Excel проводили автоматическое вычитание результатов степени поглощения света средой до (матрица А) и после проведения реакций (матрица В) То есть из значений табл 4 вычитали значения табл 5 При наличии реакции агглютинации наблюдали более существенные различия в изменении степени поглощения света средой, чем в случае ее отсутствия

Таблица 6

Разница значений степени оптической плотности образцов до и _после реакции_

Образцы крови Пммуноспецифичсскис сыворотки

Ар Ва вь Da Еа Ed Eb Ее Eg Ef Fa Fb La Lb

1 -0 035 0 220 -0 018 0 138 -0 047 0 078 0 119 0019 0 090 0 029 -0 078 0 260 0 089 0 074

2 0 032 0 255 -0 006 0 249 0 002 0 165 0 177 0 065 0 177 0 004 -0 014 0 309 0 040 0 195

3 -0 009 0 187 0 054 0 180 0 029 0 150 0 123 0 062 0 082 ООН 0017 0 220 0 056 0 061

4 0 026 0 290 0 043 0 273 0 027 0 103 0015 0 116 0 140 0 071 -0 011 0 327 0 008 0 165

5 0 008 0 233 0017 0 228 0016 0 133 0 122 -0 004 0 154 0 130 -0 006 0 264 0 015 0 075

6 0 149 0 323 0 046 0 299 0 044 0 072 0 020 0 149 0 257 0 054 -0 009 0311 0 032 0 285

7 0 037 0 296 0 002 0018 0 008 0 092 0 056 0 106 0 234 0 016 -0 013 0 277 0 000 0 178

8 -0 012 0 123 -0 007 -0 006 0 005 0 114 -0 865 0 110 0 116 0 055 -0 012 0 128 0 003 0 298

Полученные цифровые значения автоматически с использованием функций, созданных в программе Excel, переводили в баллы серологического теста, согласно критериям, приведенным в табл 7

Таблица 7

Шкала для перевода цифровых значений в баллы серологического

теста.

Пределы разницы значений Баллы

от -0,1 до 0,025 0

от 0,025 до 0,04 1

от 0,04 до 0,055 2

от 0,055 до 0,1 3

от 0,1 до 1 4

«О» - эритроциты свободно взвешены, жидкость красная (реакция отсутствует),

«1» - агглютинация эритроцитов слабо заметна, жидкость мутная, «2» - эритроциты в виде мелких комочков, жидкость мутная, «3» - эритроциты в виде комочков разной величины, жидкость слегка мутная,

«4» - эритроциты соединены в один комок, жидкость прозрачная В результате получили значения табл 8 с данными реакции агглютинации в баллах серологического теста

Таблица 8

Серологический тест свиней породы йоркшир по группам крови

Образцы крови Иммуноспецифические сыворотки

Ар Ва ВЬ Ба Еа Ес1 ЕЬ Ее Ей ЕГ Ра РЬ Ьа ьь

1 0 4 0 4 0 3 4 0 3 1 0 4 3 3

2 1 4 0 4 0 4 4 3 4 0 0 4 2 4

3 0 4 2 4 1 4 4 3 3 0 0 4 3 3

4 1 4 2 4 1 4 0 4 4 3 0 4 0 4

5 0 4 0 4 0 4 4 0 4 4 0 4 0 3

6 4 4 2 4 2 3 0 4 4 0 0 4 1 4

7 1 4 0 0 0 3 4 4 4 0 0 4 0 4

8 0 4 0 0 0 4 4 4 4 3 0 4 0 4

Переводя баллы серологического теста в аллели групп крови свиней, получали генотипы свиней по группам крови (табл 9)

Таблица 9

Группы крови свиней породы йоркшир канадской селекции

Образцы крови Система групп крови

А В Б Е Р Ь

1 -/- а/а а/- сПэ^сйщ Ь/Ь а/Ь

2 -/- а/а а/- Ь/Ь Ь/Ь

3 -/- а/а а/- ёЬ^/с^ Ь/Ь а/Ь

4 -/- а/а а/- Ь/Ь Ь/Ь

5 а/а а/- сК^сМ Ь/Ь Ь/Ь

6 -/р а/а а/- deg/deg Ь/Ь Ь/Ь

7 а/а Ь/Ь Ь/Ь Ь/Ь

8 а/а Ъ/Ь сш^ег Ь/Ь Ь/Ь

Проведенное нами контрольное тестирование свиней по разработанному способу показало полное совпадение данных с результатами, полученными с использованием традиционного метода Таким образом, разработанный нами алгоритм позволил четко идентифицировать результаты реакции агглютинации с применением спектрофотометра

3.3.2. Режим «чтения» реакции гемолиза.

В реакции гемолиза эритроциты при взаимодействии с иммуноспецифической сывороткой и добавлении к ним комплемента разрушаются, вследствие чего оптическая плотность среды уменьшается, что регистрируется прибором

Рисунок 3

Сравнение лунок с «положительной» и «отрицательной»

а) «положительная» реакция гемолиза (стенки эритроцитов полностью разрушены, жидкость прозрачная);

б) «отрицательная» реакция гемолиза (эритроциты не разрушены и равномерно распределены по всей лупке).

Определение результатов реакции гемолиза проводили также на планшетном фотометре DYNEX MRX Revelaiion при длине волны 630 нм. Числовые значения степени поглощения света образцами после проведения реакции (матрица D), также как и при агглютинации, вычитали из числовых значений степени поглощения света образцами до проведения реакции (матрица С), а полученные значения переводили в баллы серологического теста.

В качестве примера, приведем результаты тестирования по эритроцитарным антигенам свиней ливенской породы ФГУП ПЗ им. A.C. Георгиев с ко го Орловской области.

Взятие крови ее подготовку к реакции и раскапывание в плашки осуществляли согласно методике. Числовые значения степени поглощения света образцами до проведения реакции (матрица С) представлены в табл. 10.

Таблица 10

Степень поглощения света образцами до начала реакции (матрица

С1

Иммуно-сиецифи-ческве сыворотки образцы крови свиней

• 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ii 12 13 14 15 IG

Ка 0,951 1,026 1,151 1.1 19 1,219 1,216 1,257 1,011 1,139 1,076 1,027 0,9 SS 0:!>35 1,069 1,030 0.98]

КЬ 0,935 0,954 1.127 1,104 1.191 1.179 1,256 1,047 1,090 ! ,090 1,067 0,992 0,925 1.113 1,093 0,971

Плашки тщательно встряхивали, выдерживали при комнатной температуре 20 минут Затем в каждую лунку вносили по 50 мкл комплимента, встряхивали и затем инкубировали 2 часа при температуре 37°С Чтение реакции проводили на приборе при длине волны 630 нм

Таблица 11

Степень поглощения света образцами после проведения реакции __(матрица Р)_

Иммуно-специфические сыворотки образцы крови свиней

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Ка 0,335 0,325 0,337 0,352 0,342 1,020 0 344 0,731 0,851 1,071 0,312 0,308 1,012 1,125 1,045 0,865

Kb 0 308|0,329 0,313 0,302 0,319 0,322 0,370 0 28 0,311 0 310 0,991 0,933 0 330 0,330 0,329 0,302

Далее с использованием программного обеспечения Excel проводили вычитание результатов степени поглощения света средой до (матрица С) и после проведения реакций (матрица D) При наличии реакции гемолиза наблюдали более существенные различия в изменении степени оптической плотности среды, чем в случае ее отсутствия Эти изменения значительно более существенны, чем при проведении реакций агглютинации (табл 12).

Таблица 12

Разница значений степени погдозения света образцами до н после _инкубирования_

Иммуно-специфические сыворотки образцы крови свиней

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Ка 0616 0 701 0,814 0 767 0 877 0 196 0 913 0 280 0 288 0 005 0715 0 68 -0 080 -0 060 -0 010 0 116

Kb 0,627 0,625 0,814 0,802 0,875 0,857 0,886 0,767 0,779 0,780 0,076 0,059 0,595 0,783 0,764 0 669

Полученные цифровые значения переводили в баллы серологического теста (табл 13)

Таблица 13

Пределы разницы значений

Пределы разницы значений Баллы

от-0,1 до 0,2 0

от 0,2 до 0,35 1

от 0,35 до 0,5 2

от 0,5 до 0,65 3

от 0,65 до 1 4

«О» - эритроциты свободно взвешены, жидкость красная (реакция отсутствует),

«1» - гемолиз эритроцитов слабо заметен, жидкость красная, «2» - небольшая часть эритроцитов гемолизирована, жидкость мутная, «3» -почти все эритроциты гемолизированы, жидкость слегка мутная, «4» -все эритроциты гемолизированы, жидкость прозрачная

В конечном итоге получили результаты реакции гемолиза в баллах серологического теста (табл 14) по которым были определены генотипы свиней по эритроцитарным антигенам (табл 15)

Таблица14

Серологический тест свиней ливенской породы по группам крови

Иммуно-специфические сыворотки образцы к рови свиней

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Ка 3 4 4 4 4 0 4 0 0 0 4 4 0 0 0 0

Kb 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 0 0 3 4 4 4

Таблица 15

Группы крови свиней_

Система групп крови образцы крови свиней

1 2 3 4 5 6 1 8 9 10 и 12 13 14 15 16

К а/Ь а/Ь а/Ь а/Ь а/Ь Ы а/Ь Ы Ы ы а/ а/ ь/ Ы Ы ь/

Сравнительный анализ результатов иммуиогенетического тестирования в реакциях агглютинации и гемолиза показал, что разница числовых значений степени поглощения света образцами до и после проведения реакции гемолиза существенно отличаются от агглютинации Если в реакции агглютинации при 4 баллах - это разница значений должна составлять более ОД, то в реакции гемолиза эта разница должна составлять свыше 0,65

3.4. Апробация методики.

Для апробации методики нами были использованы свиньи следующих пород ливенская (ФГУП ПЗ им А С Георгиевского Орловской области) в количестве 112 голов, йоркшир канадской селекции 30 голов и ландрас также 30 голов (ЗАО «Агроиндустрия» Орловской области) Апробацию проводили параллельно традиционной и новой методикой Проведенные исследования выявили 100% совпадение результатов тестирования, полученных с использованием традиционного и разработанного в ходе выполнения диссертационной работы метода

Результаты новой методики, а именно таблицы разницы значений оптической плотности среды в пробе до и после проведения реакций агглютинации и гемолиза приведены в приложении диссертационной работы

С целью характеристики локальной ливенской породы свиней нами были определены частоты встречаемости аллелей и генотипов по линиям и семействам, уровень гомозиготности стада Нами были протестированы по эритроцитарным антигенам 20 хряков и 92 матки, которые принадлежали к разным генеалогическим линиям и семействам, разводимым в настоящее время в ФГУП ПЗ им А С Георгиевского Орловской области

Установлено, что в семействах Высотки и у Грации концентрации аллеля Edef, который согласно литературным данным встречается у мясных пород свиней, составили 0,386 и 0,417 соответственно, но в среднем у семейств этот показатель ниже (0,250) В то же время отмечена довольно высокая (0,350) частота встречаемости аллеля deg Е локуса у свиноматок В ранее проведенных исследованиях (Гусев И В [и др], 2005), было установлено, что концентрация аллеля EdeB в ливенской породе была ниже концентрации аллеля Edcf, так как, начиная с 1968 года селекционная работа шла в сторону улучшения мясных качеств свиней Аллель Eieg связан с жизнеспособностью и у диких свиней его концентрация очень велика, и возможно в связи с достаточно низким уровнем содержания и кормления за

Edef

-

Из всех высокоиммунных антигенов - Bb, Еа, Eb, Ga у хряков ливенской породы отмечена только высокая частота встречаемости Ga по сравнению с другими антигенами, этот показатель составил 0,675

У хряков ливенской породы линий Василек и Тур имела место высокая частота встречаемости антигена Ар Это не сказывается негативно на оплодотворяемости и сохранности, так как частота встречаемости этого антигена у свиноматок также высокая за исключением семейств Мальвы и Грации Анализ таблиц по частоте встречаемости генотипов групп крови Е локуса показал, что свиньи ливенской породы имеют 11 из 15 возможных генотипов Концентрация их различна как у хряков, так и у свиноматок Среди свиноматок наиболее часто встречаются животные с генотипами Edeg/deg (0,185), Edeg/dbg (0,175), а среди хряков - производителей Edeg/deg (0,250), Edef/def (0,250)

На основании полученных данных нами был рассчитан уровень гомозиготности (УГ) стада ливенских свиней ГПЗ имени А С Георгиевского Уровень гомозиготности по маточному поголовью составил 0,77, из них 58,7% являются с высоким УГ, 31,5% - со средним УГ, и 9,8% - с низким УГ, а по хрякам уровень гомозиготности равен 0,87, причем 80% - с высоким УГ, а 20% - со средним УГ, - это достаточно высокий показатель для стада, связан с закрытым типом воспроизводства в последние годы и свидетельствует о высокой консолидации стада Для племенного хозяйства при чистопородном разведении (согласно данным С П Безенко, 1985), такой уровень гомозиготности является наиболее оптимальным

3.5. Анализ экономических показателей результативности разработанной системы.

Затраты на проведение генетической экспертизы племенной продукции подразделяются на приобретение необходимого оборудования для оснащения создаваемой лаборатории и затраты на покупку дорогостоящих реактивов

Для лабораторий, желающих работать по предложенной нами методике, основные затраты будут связаны с покупкой планшетного фотометра, цена которого на 1 01 2007 г составила 286350 руб, и 8-канального дозатора переменного объема (9000 руб)

С учетом стоимости реагентов, используемых при определении группы крови свиней (цена одной дозы сыворотки сегодня, согласно данным ВНИИплем, равна 9 руб), стоимость реагентов для тестирования 100 голов свиней по 20 антигенам составит 18000 руб

Предложенная нами методика позволяет сократить использование иммуноспецифических сывороток в 2 раза с 0,1 мл до 0,05 мл на дозу, что приведет к снижению затрат на тестирование 100 голов свиней с 18000 до 9000 руб , создавая весьма существенную экономию денежных средств

Только за счет экономии иммуноспецифических сывороток, затраты на приобретение планшетного спектрофотометра и 8-и канального дозатора окупаются после тестировании 3280 голов свиней

Что касается трудозатрат на «чтение» 96 серологических пробирок в стандартной методике необходимо затратить не менее 5 — 6 мин в зависимости от лаборанта, его опыта и профессиональной подготовки, в предлагаемой нами методике на это уходит около 1,5-2,0 мин , что почти в 35 раз быстрее Лабораториям иногда приходиться тестировать до 100 голов в день по 17 - 20 сывороток на голову, то есть до 2000 проб в день При стандартной методике на это потребуется 1,5 - 2,0 часа, в новой методике на это уйдет не более 30 мин

Предложенный способ определения групп крови свиней характеризуется меньшей трудоемкостью, более высокой производительностью и объективной идентификацией результатов реакций за счет мультисканирования на основе планшетного фотометра

По разработанной методике проведены патентные исследования и получено положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение № 2005133270/13 «Способ определения групп крови у свиней»

ВЫВОДЫ

1 Разработан новый способ подготовки суспензии эритроцитов свиней для иммуногенетического тестирования, позволяющий получать наиболее равномерный по плотности осадок Если при использовании традиционной методики плотность осадка эритроцитов в разных пробах варьировала в пределах 43,5%, то при применении усовершенствованной нами системы — в пределах 23,1% Разработанный способ позволяет инструментально получать концентрацию суспензии эритроцитов 2%, полностью исключив визуальную оценку

2 Усовершенствована методика постановки реакций агглютинации, позволяющая сократить расход иммуноспецифических сывороток по сравнению с традиционной методикой в 2 раза, с 0,1 мл до 0,05 мл на 1 тестодозу и снизить временные затраты почти в 3-5 раз

3 Разработан новый автоматический режим «чтения» реакций агглютинации и гемолиза «Мультисканирование», основанный на использовании планшетных фотометров Предложенный способ позволяет исключить субъективный фактор в интерпретации результатов реакций и сократить временные затраты на «чтение» реакций в 3-5 раз

4 Разработан алгоритм для автоматической интерпретации результатов иммуногенетического тестирования групп крови свиней, позволяющий переводить значения, полученные при спектрофотометрии, в баллы серологического теста Проведенное сравнительное тестирование образцов крови 172 голов свиней 3 пород показало 100% совпадение результатов, полученных с использованием разработанного и традиционного методов

5 Выполнена производственная проверка разработанной методики для иммуногенетического тестирования свиней трех пород ливенская (112 голов), ландрас (30 голов) и йоркшир (30 голов) Выполнен детальный анализ иммуногенетических профилей свиней ливенской породы Уровень гомозиготности по маточному поголовью составил 0,77, а по хрякам уровень гомозиготности равен 0,87, что является для свиней ливенской породы достаточно высоким показателем

6 Выполнены патентные исследования способов определения групп крови свиней Получено положительное решение о выдаче патента РФ «Способ определения групп крови у свиней»

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Иммуногенетическим лабораториям, занимающимся определением групп крови свиней, с целью сокращения материальных и временных затрат на тестирование рекомендуем использовать разработанную нами систему

СПИСОК РАБОТ ПО МЕТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1 Филимонов, А Ю К вопросу усовершенствования системы генетического тестирования свиней по группам крови / АЮ Филимонов, И В Гусев, Н А Зиновьева, К М Шавырина // Сборник материалов III международной научно-практической конференции «Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства России», научные труды ВИЖ, 2005, вып 63, Т 2, с 196-200

2 Филимонов, А Ю Разработка и экспериментальная апробация усовершенствованной системы тестирования свиней по эритроцитарным антигенам / АЮ Филимонов, ИВ Гусев, НА Зиновьева // Сборник материалов международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения акад М Н Лущихина «Биотехнология в мире животных и растений», 2005, Бишкек, Киргизия, с 162-165

3 Филимонов, А Ю Иммуногенетическое тестирование свиней с использованием усовершенствованной системы полуавтоматического анализа групп крови с применением мультисканирования / А Ю Филимонов, И В Гусев, Н А Зиновьева, К М Шавырина // Школа - практикум «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», 2005, вып 4, с 113-117

4 Зиновьева, Н А Сравнительный анализ генетических профилей свиней ливенской породы по ДНК-маркерам /НА Зиновьева, Е А Гладырь, О В Костюнина, А Ю Филимонов, К М Шавырина, А М Алобаев // Свиноводство, 2007, №2

5 Филимонов, АЮ Использование иммуногенетического маркирования в совершенствовании свиней / А Ю Филимонов, И В Гусев, К М Шавырина // Школа-практикум «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», выпуск 3, Дубровицы, 2004, С 53-59

6 Филимонов, А Ю Положительное решение о выдаче патента РФ № 2005133270/13 «Способ определения групп крови у свиней» / АЮ Филимонов, И В Гусев, Н А Зиновьева, К М Шавырина I

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл , Подольский р-н, п Дубровицы Тел (8 - 27) 65-14-24, (8 -27) 65-14-07

Сдано в набор 11 04 2007 Подписано в печать 12 04 2007 _Заказ № б.Печ л 1,0 Тираж 100 экз_

Отпечатано в типографии РУЭЦ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Филимонов, Алексей Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Механизм протекания реакции агглютинации.

1.2. Группы крови свиней.

1.3. Иммуноспецифические сыворотки групп крови.

1.4. Техника генетического маркирования свиней по эритроцитарным антигенам.

1.5. История совершенствования техники генетического маркирования.

1.6. Связь групп крови с продуктивными признаками свиней.

1.7. Иммунологическая несовместимость.

1.8. Концентрация аллелей и генотипов.

1.9. иммуногенетическая идентификация и подтверждение происхождения животных.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Усовершенствование системы иммуногенетического исследования свиней на основе полуавтоматического анализа групп крови с применением мультисканирования"

Актуальность темы. Национальный проект «Развитие агропромышленного комплекса» и ведомственная целевая программа «Развитие свиноводства в Российской Федерации на период 2006-2010 годов и до 2015 года» наряду с использованием передовых энергосберегающих, ресурсосберегающих и экологически безопасных технологий предусматривает внедрение эффективных селекционно-генетических и биологических методов совершенствования лучших отечественных и зарубежных пород и линий свиней. Признавая ведущую роль традиционных методов разведения, следует отметить, что использование только классической селекции уже не может обеспечить должного уровня эффективности селекционно-племенной работы [Эрнст JI.K., 2005]. Маркирование признаков на уровне генотипа в дополнение к традиционным классическим методам селекции позволяет значительно повысить эффективность селекционно-племенной работы и достигнуть желаемого результата уже в течение нескольких генераций [Глазко В.И. и др., 2001; Зиновьева Н.А. и др., 2005].

Генетическая экспертиза происхождения племенных животных в РФ является обязательным условием для ведения селекционной работы (Федеральный закон от 3 августа 1995 г. № 123-ФЭ "О племенном животноводстве"). В настоящее время одним из методов генетического контроля происхождения животных, и в частности свиней, является иммуногенетическое тестирование [Амерханов Х.А. и др., 2006]. Однако применяемые сегодня в большинстве лабораторий методики тестирования по эритроцитарным антигенам характеризуются большой трудоемкостью, относительно низкой производительностью и визуальной оценкой результатов реакций. Таим образом, для повышения производительности, точности и достоверности иммуногенетической экспертизы происхождения животных актуальным является усовершенствование методических приемов определения групп крови свиней на основе использования современных полуавтоматических инструментальных методов анализа.

Цель и задачи работы. Целью исследований явилась разработка высокопроизводительной системы генетического контроля происхождения свиней, основанной на выполнении полуавтоматического анализа групп крови с применением мультисканирования.

Для достижения цели работы были поставлены и решены следующие задачи:

•разработать усовершенствованный режим подготовки суспензии эритроцитов "МИКРО", основанный на использовании микропробирок и настольной микроцентрифуги;

•разработать методику раскапывания и автоматического смешивания диагностикумов (реагентов, иммуноспецифических сывороток) и суспензии эритроцитов в 96-ти луночном формате;

•создать режим "МУЛЬТИСКАНИРОВАНИЕ" для автоматической визуализации результатов с применением планшетного фотометра;

•определить критерии для автоматической обработки результатов анализа;

•провести экспериментальную апробацию системы для тестирования свиней различных пород;

•провести патентные исследования и изучить патентоспособность разработки.

Научная новизна. Впервые разработана система определения групп крови свиней, основанная на полуавтоматическом инструментальном определении групп крови в 96-луночном формате. Предложены способы подготовки суспензии эритроцитов, раскапывания и постановки реакций. Разработан алгоритм анализа результатов реакций агглютинации и гемолиза с применением планшетного фотометра и персонального компьютера. Получено положительное решение о выдаче патента РФ.

Практическая значимость. Предложенная усовершенствованная система позволяет повысить производительность и точность метода, снизить трудоемкость и добиться существенной экономии реагентов и, как следствие, снизить материальные и временные затраты.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Новый режим подготовки суспензии эритроцитов «МИКРО», позволяющий вне зависимости от исходных образцов крови свиней инструментально получать рабочую суспензию эритроцитов.

• Усовершенствованная методика постановки реакций в 96-луночном планшетном формате, позволяющая сократить временные и материальные затраты.

• Новый режим «МУЛЬТИСКАНИРОВАНИЕ», позволяющий осуществлять автоматическое «чтение» реакций агглютинации и гемолиза.

• Алгоритм для автоматической идентификации результатов иммуногенетического тестирования.

• Положительное решение о выдаче патента РФ.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на III международной научно-практической конференции «Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства России», ВИЖ, 2005 г.; на международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения акад. М.Н. Лущихина «Биотехнология в мире животных и растений», 2005, Бишкек, Киргизия; в рамках проведения школ-практикумов «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 2004, 2005 гг.; на научных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖ, 2005,2006.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК, Свиноводство, 2007, № 2. Получено положительное решение о выдаче патента РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа написана на 108 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материал и методы исследований, результаты и обсуждение исследований, заключение, приложение, выводы, практические предложения, список литературы. Работа включает 40 таблиц и 8 рисунков. Список литературы включает 124 источника, в том числе 30 источников на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Филимонов, Алексей Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый способ подготовки суспензии эритроцитов свиней для иммуногенетического тестирования, позволяющий получать наиболее равномерный по плотности осадок. Если при использовании традиционной методики плотность осадка эритроцитов в разных пробах варьировала в пределах 43,5%, то при применении усовершенствованной нами системы - в пределах 23,1%. Разработанный способ позволяет инструментально получать концентрацию суспензии эритроцитов 2%, полностью исключив визуальную оценку.

2. Усовершенствована методика постановки реакций агглютинации, позволяющая сократить расход иммуноспецифических сывороток по сравнению с традиционной методикой в 2 раза, с 0,1 мл до 0,05 мл на 1 тестодозу и снизить временные затраты почти в 3-5 раз.

3. Разработан новый автоматический режим «чтения» реакций агглютинации и гемолиза «Мультисканирование», основанный на использовании планшетных фотометров. Предложенный способ позволяет исключить субъективный фактор в интерпретации результатов реакций и сократить временные затраты на «чтение» реакций в 3-5 раз.

4. Разработан алгоритм для автоматической интерпретации результатов иммуногенетического тестирования групп крови свиней, позволяющий переводить значения, полученные при спектрофотомерии, в баллы серологического теста. Проведенное сравнительное тестирование образцов крови 172 голов свиней 3 пород показало 100% совпадение результатов, полученных с использованием разработанного и традиционного методов.

5. Выполнена производственная проверка разработанной методики для иммуногенетического тестирования свиней трех пород: ливенская (112 голов), ландрас (30 голов) и йоркшир (30 голов). Выполнен детальный анализ иммуногенетических профилей свиней ливенской породы. Уровень гомозиготности по маточному поголовью составил 0,77, а по хрякам уровень гомозиготности равен 0,87, что является для свиней ливенской породы достаточно высоким показателем.

6. Выполнены патентные исследования способов определения групп крови свиней. Получено положительное решение о выдаче патента РФ «Способ определения групп крови у свиней».

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРЕДЛОЖЕНИЕ

Иммуногенетическим лабораториям, занимающимся определением групп крови свиней, с целью сокращения материальных и временных затрат на тестирование рекомендуем использовать разработанную нами систему.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Маркерная селекция (селекция с использованием иммуногенетических, цитогенетических и ДНК-маркеров) в дополнение к традиционным методам селекции имеет ряд преимуществ. Она не учитывает изменчивость хозяйственно-полезных признаков, обусловленную внешней средой, делает возможным селекцию в раннем возрасте независимо от пола животных и, в конечном итоге, повышает эффективность селекции. Селекция по генотипу способствует идентификации и быстрому введению предпочтительных аллелей их ресурсных популяций в популяцию реципиентов с целью повышения продуктивности и устойчивости к заболеваниям улучшаемых пород животных [Зиновьева Н.А. и др., 2002].

Определение и знание генотипа свиней по иммуногенетическим критериям позволяет использовать их при контроле достоверности происхождения, при заказных спариваниях, для получения более жизнеспособного продуктивного потомства, для реализации отдельных селекционных программ, в том числе, для создания отцовских и материнских пар [Безенко С.П.и др., 1974, 1981, 1999г].

Использование иммуногенетических маркеров в селекции на сегодняшний день остается наиболее дешевым и широкораспространенным методом в России. Несмотря на стремительное развитие ДНК-диагностики для племенных хозяйств, уже имеющих лаборатории иммуногенетической экспертизы, экономически целесообразной является по-прежнему диагностика происхождения животных по группам крови.

Группы крови позволяют следить за направленностью селекционных процессов в популяциях, с успехом используются для решения многих вопросов изучения генетических особенностей пород, типов, линий, установления их сходства и различий, прогнозирования уровня гетерозиготности в популяциях, а также позволяют проводить специальный подбор пар для лучшего их сочетания [Данилов С.Г., 1993].

В связи с тем, что производство реагентов для определения групп крови достаточно дорого, само проведение анализа достаточно трудоемко, а идентификация результатов реакций зависит от лаборанта (то есть субъективна), и возникла необходимость в разработке усовершенствованной методики определения групп крови свиней, характеризующейся снижением материальных и временных затрат на проведение реакций, и отличающейся более объективной интерпретацией результатов реакций.

В результате проведенной работы нами была разработана и предложена методика по определению групп крови свиней полуавтоматическим способом, которая позволила сократить расход реагентов в 2 раза с 0,1 мл до 0,05 мл на 1 тестодозу.

Подготовка суспензии эритроцитов полностью переведена в пластиковую посуду, что дает возможность сократить трудозатраты на мойку пробирок после проведения реакций и на подготовку посуды перед анализами.

В опыте использованы современные электронные пипетки, которые дали возможность значительно ускорить время раскапывания и смешивания компонентов в 3-5 раз.

Наиболее сложная и ответственная часть опыта - а именно: «чтение» результатов реакций, - теперь не зависит от человека. Вся работа проводится на спектрофотометре DYNEX MRX Revelation, который регистрирует оптическую плотность среды и определяет результаты реакций. Эта процедура позволила полностью исключить субъективный «человеческий фактор» и сократить затраты времени на интерпретацию результатов в 3-5 раз.

Разработанный нами алгоритм идентификации результатов реакции сделал возможным перевод значений, полученных при спектрофотометрии, в баллы серологического теста. Для этих целей нами были созданы соответствующие функции в программе Microsoft Excel.

Выполнена производственная проверка разработанной методики для иммуногенетического тестирования свиней трех пород: ливенская (112 голов), ландрас (30 голов) и йоркшир (30 голов). Выполнен детальный анализ иммуногенетических профилей свиней ливенской породы. Уровень гомозиготности по маточному поголовью составил 0,77, а по хрякам - 0,87, что является для свиней ливенской породы достаточно высоким показателем.

Проведенная оценка экономической эффективности показала, что затраты на приобретение иммунологических сывороток при использовании усовершенствованной методики составляют 4,5 руб. на одну тестодозу на голову, по сравнению с 9 руб. при использовании традиционной методики. За счет использования в системе современных электронных пипеток и спектрофотометра трудозатраты сократились почти в 3-5 раз.

По разработанной методике проведены патентные исследования и получено положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение №2005133270/13 «Способ определения групп крови у свиней» (см. Приложение).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Филимонов, Алексей Юрьевич, Дубровицы

1. Амерханов, Х.А. Правила определения видов организаций по племенному животноводству / Х.А. Амерханов и др.. М., 2006, - 3 с.

2. Ананин, В.Н. Технология и методы разведения свиней на малых фермах с использованием генетических маркеров: автореф. дисс. канд. с.-х. наук. 1999. - ВНИИплем, Лесные поляны,- 18с.

3. Безенко, С.П. Методические рекомендации по опрдеделению происхождения свиней на основе анализа наследования антигенов эритроцитов / С.П. Безенко. Дубровицы, ВИЖ, 1974. - 47 с.

4. Безенко, С.П. Генетико-популяционные характеристики свиней по группам крови / С.П. Безенко // Породы свиней. М: Колос, 1981.- С. 133148.

5. Безенко, С.П. О направлениях иммуногенетики в селекции свиней / С.П. Безенко //Свиноводство. 1982. - №5. - С.25-26.

6. Безенко, С.П. 5 съезд Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова. «О приспособленности свиней различных генотипов по группам крови 10 генов в условиях промышленных хозяйств» / С.П. Безенко. М, 1987. - Т.З. - С.21.

7. Безенко, С.П. Свиньи Заволжский / С.П. Безенко, Н.В. Булычев, В.И. Бычкова// Авторское свидетельство № 30924,16.04.99г.

8. Безенко, С.П., Методическое пособие по определению генетических и иммунологических характеристик свиней для использования в селекции / С.П Безенко, Р.И. Мильчевская, Т.В. Аль-Кейси. Дубровицы, 2006.- 36-40с.

9. Бекенев, В.А. Селекция свиней. / Бекенев В.А. Новосибирск, 1997.- 183с.

10. Бекенев, В.А. Теория и практика определения племенной ценности и прогнозирования эффективности селекции свиней: сб. науч. тр. / В.А. Бекенев, А.Ф. Четкова, В.Н. Дементьев и др.. Новосибирск, 1999. - С. 18-19.

11. Березовский, Н.Д. Итоги перспективной селекции крупной белой породы свиней / Березовский Н.Д. // Свиноводство. 1997. - №6. - С.20-22.

12. Букаров, Н.Г. Генетика гарантия успеха племенной работы / Н.Г. Букаров, Е.Ю. Лебедев и др.. // Актуальные задачи генетических исследований в племенном скотоводстве. - М., 2004. - 11с.

13. Воробьев, А.А., Медицина. Адъюванты. / А.А. Воробьев, Н.Н. Васильев.- М., 1969. 206 с.

14. Гарай, В.В. Количественная оценка показателей продуктивности племенных стад / В.В Гарай, В.А Епишин, И.В. Николаева. //Современные проблемы развития свиноводства. Жодино, 2000. - С.40-42.

15. Герасименко, В.В Сочетаемость по иммуногенетическим показателям свиней украинской степной белой и украинской степной рябой пород при чистопородном разведении: автореф. дис. . канд. с.-х. наук: 06.02.01. / Герасименко В.В. Харьков, 1984.-.25с.

16. Глазко, В.И. Генетически детерминированный полиморфизм белков у сельскохозяйственных животных / Доклады ВАСХНИЛ. 1991. -№6.-С.31-36.

17. Глазко, В.И. Ведение в ДНК-технологии / В.И. Глазко, И.М. Дунин, Г.В. Глазко, Л.А. Калашникова. М., 2001. - 435с.

18. Горелов, И.Г. Дальнейшее изучение иммуногенетической системы О групп крови свиней / И.Г. Горелов, М.А. Савина // Генетика. -1997. Т.ЗЗ. -№10.-С.1441-1443.

19. Горелов, И.Г. Иммуногенетика и биоразнообразие домашних и диких свиней / И.Г. Горелов, М.А.Савина, А.А. Новиков // Аграрная Россия. -2002. №5. -С.33-38.

20. Гусев, И.В. Прошлое и настоящее ливенской породы свиней / И.В. Гусев, К.М. Шавырина // Свиноводство. 2005. - №4. - С.6-8.

21. Данилов, С.Г. Иммуногенетика и эффективность племенной работы / С.Г. Данилов, // Свиноводство. 1993. - №6. - С.9-12.

22. Дунин, И.М. ДНК технологии оценки сельскохозяйственных животных / ИМ. Дунин, JI.A. Калашникова, В.И. Глазко, Е.П. Голубика, Н.В. Рыжова // Изд. ВНИИПлем, 1999. - 147с.

23. Епишин, В.А. Сравнительное изучение иммуногенетических параметров и продуктивных качеств свиней мясных типов / В.А. Епишин, П.П. Кошель // Использование высокоценных племенных животных. 1988. -С. 140-146.

24. Епишин, В.А. Использование маркеров групп крови свиней в селекции свиней мясных типов / В.А. Епишин, И.Т. Тихонов // Пути повышения эффективности селекционно-племенной работы в свиноводстве. -М., 1988. С.50-55.

25. Епишко, Т.И. Иммуногенетическая характеристика чистопородных хряков, используемых на промышленных комплексах / Т.И. Епишко // Современные проблемы развития свиноводства. Жодино, 2000. -С.50-52.

26. Зиновьева, Н.А. ДНК-маркеры как рычаг повышения многоплодия свиней. / Н.А. Зиновьева, Е.А. Гладырь, О.В. Костюнина, К.М. Шавырина, Е.К. Кунаева // Промышленное и племенное свиноводство. М., 2005, №5, с. 18-21.

27. Йегер, JI. Клиническая иммунология и аллергология. / JI. Йегер; пер. с нем. С.С. Кирзон. -М.: Медицина, 1990, т. 1, с.295.

28. Казанцева, И.П. Скрещивание свиноматок крупной белой породы с хряками дюрок с учетом иммуногенетических показателей / И.П. Казанцева // автореф. дис. канд. биол. наук. Дубровицы, ВИЖ, 1993. - 21с.

29. Капанадзе, Г. Д. Продуктивные качества свиней крупной белой породы различных генотипов с разной стрессоустойчивостью: дис.канд. с.-х. наук: 06.02.04 / Г. Д. Капанадзе. М., 2003. - 104 с.

30. Кемзура, Р.К. Породная и популяционная генетическая структура литовских белых свиней по полиморфным белкам крови / Р.К. Кемзура // Тез. докл.: «Пути повышения эффективности животных и качества продукции». -Минск, 1980.-С.12.

31. Клемин, В.А., Использование в селекции свиней оценки по собственной продуктивности / В.А. Клемин, А.А. Кузьмина // Селекционно-биологические методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных. СПб., 1996.-с. 115-126.

32. Кленовицкий, П.М. Генные карты сельскохозяйственных животных. / П.М. Кленовицкий, В.А, Багиров, Н.С. Марзанов, Н.А. Зиновьева // Дубровицы, ВИЖ 2003. - 12 с.

33. Князев, С.П. Свидетельствует ли повышенная частота гетерозигот по генам групп крови свиней о гетерозисе жизнеспособности / С.П. Князев, С.В. Никитин, И.Г. Горелов, Н.В. Данильченко // Сельскохозяйственная биология. -2004. №2. - С.38-42.

34. Козин, И.Е. Изучение внутрипородной дифференциации крупной белой породы свиней по группам крови / И.Е. Козин //Сб. науч. тр. / ВНИИплем., 2000. вып. 10. - С.84-87.

35. Козин, И.Е. Совершенствование способов селекции и разведения свиней в условиях Чувашии с использованием генетических маркеров: автореф. дис. канд. с.-х. наук. / И.Е. Козин. 2001,- Лесные поляны. - 21с.

36. Козин, И.Е. Изучение генетической структуры популяций свиней крупной белой и цивильской пород / И.Е. Козин, А.А. Новиков, Н.И. Романенко, М.С. Семак // Сб. науч. тр. / ВНИИплем.,- вып. 10. 2000. - с. 80 -84.

37. Корешков, В.А. Использование полиморфных систем групп крови для повышения жизнеспособности поросят в племенных хозяйствах / В.А. Корешков, Воробьева Э.Г. // Тез. докл. Кишенев, 1983. - ч.2. - с.216.

38. Кошель, П.П. Связь откормочных качеств свиней с группами крови / П.П. Кошель // Влияние методов селекции и использование биологически активных веществ на производство продуктов животноводства. -М., 1985. С.48-51.

39. Максимов, Г.В. Качество мясной продукции и стрессустойчивости в связи с селекцией на мясность / Г.В. Максимов // Сельскохозяйственная биология. 1995. - №2. - с. 13-36.

40. Марзанов, Н.С. Иммунология и иммуногенетика овец и коз / Н.С. Марзанов. Кишинев: Штиинца, 1991.-е. 4-6.

41. Машуров, A.M. Генетические маркеры в селекции животных: Автореф. дис. д-ра биол. наук / ВНИИ разведения и генетики с.-х. животных / A.M. Машуров- Л. 1985. - 44с.

42. Материал междунар. научно-практической конф.: «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки», 7-10 сент. 2004 г.: в 2 т. -Дубровицы: ВИЖ, 2004. 2 т. - (Науч. тр. ВИЖа; вып.62, т. 1,2,3).

43. Меркурьева, Е.К. Генетика. / Е.К. Меркурьева, З.В. Абрамова, А.В. Бакай, И.И. Кочиш. М.: Агропромиздат, 1991. - 247с.

44. Методика определения экономической эффективности использования в сельском хозяйстве научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ, новой техники, изобретений и рационализаторских предложений. ВАСХНИЛ. - М.: Колос, 1980. - 112с.

45. Митичашвили, Р.С., Иммуногенетическая изменчивость при селекции заводских и аборигенных пород свиней / Р.С. Митичашвили, В.Н. Тихонов // Цитология и генетика. 1990. - №1. - Т. 24. - С.34-39.

46. Новиков, А.А. Генетические аспекты повышения эффективности селекции в свиноводстве: автореф. дисс.докт. биол. наук. / А.А. Новиков. -ВНИИплем, Лесные поляны. 1996. - 44с.

47. Новиков, А.А. Использование данных иммуногенетического анализа при определении племенной и пользовательной ценности хряков-производителей / А.А. Новиков // Итоги селек. плем. работы в свиноводстве. - Лесные поляны, 1992.-С.63-71.

48. Новиков, А.А., Генетико-популяционные характеристики свиней по группам крови / А.А. Новиков, С.П. Безенко // Породы свиней. М.: Колос, 1981. -с.133-148.

49. Новиков, А.А., Дифференциация крупной белой породы свиней по генетической структуре групп крови в связи с хозяйственно-полезными признаками / А.А. Новиков, И.Е. Козин, Н.И. Романенко // Сб. науч. тр. / ВНИИплем. вып. 10. - 2000. -с. 87-91.

50. Новиков, А.А. Создание новой линии свиней с использованием генетических маркеров / А.А. Новиков, Н.И. Романенко // Селекция, кормление, содержание с.-х. животных и технология производства продуктов животноводства. 1999. - вып. 7. - с. 56-60.

51. Новиков А.А. Иммуногенетические маркеры и их использование в селекции / А.А. Новиков, М.С. Семак, Н.И. Романенко //Сб. науч. тр. / ВНИИПлем, 1997. -с.165-178.

52. Павличенко, В.П. Использование иммуногенетических тестов в селекции на повышение хозяйственно-полезных признаков у свиней / В.П. Павличенко, З.П. Любимова, Н.Н. Смирнова // Тезисы докладов. М., 1984. -с. 52-54.

53. Панченко, А.И. Влияние иммуногенетических показателей и условий содержания на воспроизводительные качества свиноматок / А.И. Панченко // автореф. дис. канд. биол. наук. 1985. - ВИЖ. - 22с.

54. Панченко, А.И. Генетические особенности свиней уржумской породы / А.И. Панченко, Ю.И. Шмаков, А.А. Мглинец // Зоотехния. 1999. -№7. - С.6-7.

55. Панченко, А.И. Иммуногенетический анализ по группам крови свиней уржумской породы / А.И. Панченко, Ю.И. Шмаков, А.А. Мглинец //Доклады РАСХН. 1999. - №1. - с.29-30.

56. Петров, Р.В. Иммунология / Р.В. Петров. М.: Медицина, 1987.415с.

57. Пол, У. Иммунология / У. Пол; пер. с англ. Т.Н. Власик. М.: Мир, 1989. -т.З. - С. 5.

58. Ройт, А. Основы иммунологии / А. Ройт; пер. с англ. Т.В. Великодворской.-М.: Мир, 1991.-С. 90-91.

59. Северин, В.И. О повышении иммуногенетических оценок свиней племенных стад в Днепропетровской области / В.И. Северин, В.Т. Сметании, В.И. Сокрут, С.П. Безенко // Генетические аспекты селекции. Киев, 1992. -с.77-81.

60. Сердюк, Г.Н. Иммуногенетика свиней: теория и практика / Г.Н. Сердюк . СПб.: Лекс-Стар, 2002. - 390с.

61. Сердюк, Г.Н. Иммуногенетический контроль в селекционной практике / Г.Н. Сердюк, Ю.В. Силин, Н.Н. Берникова, Н.Н. Куценко // Зоотехния. 2000. -№10. - с.7-9.

62. Смирнова, Н.А. Воспроизводительные способности свиноматок при иммуногенетически совместимых и несовместимых подборах / Н.А. Смирнова // Молекулярно-генетические маркеры животных. Киев: Аграрная наука, 1994.-е. 103.

63. Соколов, Н.В. Теория и практика селекции и использования свиней мясного типа продуктивности: автореф. дис. . докт. с.-х. наук. / Н.В. Соколов Краснодар, 2001. - 44с.

64. Солдатенков, Н.К. Использование иммуногенетических тестов для повышения эффективности селекционно-племенной работы в промышленных комплексах: автореф. дисс. канд. с.-х наук / Н.К. Солдатенков. СПб., 1992,- 28с.

65. Солдатенков, Н.К. Устойчивость спермы хряков с разными группами крови к криоконсервации / Н.К. Солдатенков, // Тез. докл. 44 науч. конф. / Самар. гос. с.-х. академия. Самара, 1997. - 4.1. - с.239-240.

66. Сташ, В. Л. Анализ связи локусов групп крови и селекционируемых признаков свиней: автореф. дисс. канд. с.-х. наук. / В.Л. Сташ, -Л., 1988.- 17с.

67. Сухова, Н.О. Связь групп крови с откормочными и мясными качествами свиней / Н.О. Сухова, В. Бекенев, В.И. Коломников и др. // Докл. ВАСХНИЛ. 1989. - №2. - с.24-25.

68. Сухова, Н.О. Продуктивные показатели свиноматок крупной белой породы и ландрас с учетом их генотипа и сочетаемости с хряками по группам крови / Н.О. Сухова, И.И. Тонышев, Н.М. Набродова, В.А. Коломников // Докл. ВАСХНИЛ. 1990. - №1. - с.42-45.

69. Сухова, Н.О. Оценка иммуногенетических различий между линиями и семействами свиней разных пород при замкнутом разведении / Н.О. Сухова, A.M. Машуров, В.А. Бекенев, B.C. Деева, Н.М. Набродова // Вестн. РАСХН. 1997. 14. С. 51-54.

70. Тихонов, В.Н. Иммуногенетика и биохимический полиморфизм домашних и диких свиней / В.Н. Тихонов. Новосибирск: Наука, 1991. -304с.

71. Тихонов, В.Н. Внутрихромосомное картирование нового гена многоплодия домашних и диких свиней / В.Н. Тихонов, В.Е. Бобович, // Докл. РАСХН. -1995.-№5.-с.34-35.

72. Тихонов, В.Н. Иммуногенетические особенности некоторых форм диких свиней Европы, Азии, Африки и Америки / В.Н. Тихонов, И.Г. Горелов, В.Е. Бобович // Морфология и генетика кабана. М.: Наука, 1985. -279с.

73. Тихонов, В.Н. Связь системы В групп крови с многоплодием и жизнеспособностью свиней / В.Н. Тихонов, С.В. Никитин // Сб. науч. тр. Новосибирского СХИ, 1984.-е. 110.

74. Тихонов, В.Н. Хромосомное картирование локуса системы Е групп крови свиней / В.Н. Тихонов, К.И. Солодуха, В.Е. Бобович // Матер, межд. симпозиума. СПб., 1994. - с. 103-105.

75. Толпеко, Г.А. Формирование иммуногенетической структуры популяции свиней в связи с методами разведения и отбором по продуктивности: автореф. дисс. докт. с.-х. наук / Г.А. Толпеко.- 1985. 25с.

76. Филатов, А.И. Генетический потенциал племенных свиней и его использование / А.И. Филатов //Свиноводство. 2002. - №1. - с.2-4.

77. Филенко, В.Ф. Иммуногенетическая характеристика популяции свиней СМ-1 степного типа и крупной белой породы / В.Ф. Филенко // Зоотехния. 1993. -№9. - с.6-7.

78. Фомичев, Ю.П. Сыворотки иммуноспецифические для определения групп крови свиней. / Ю.П. Фомичев и др. // Технические условия, наставление и инструкция по изготовлению, контролю и применению. Дубровицы, ВИЖ, 2001. - 24с.

79. Фомичев, Ю.П. Инструкция по изготовлению сывороток иммуноспецифических для определения групп крови у свиней / Ю.П. Фомичев, Ю.И. Шмаков, К.М. Шавырина, В.И. Горбунов, С.В. Советкин. -ВИЖ, Дубровицы, 2001. - с. 43 - 56.

80. Харченко, П.Г. Воспроизводительные качества хряков в зависимости от генетической характеристики по группам крови / П.Г. Харченко. Новосибирск, 2000. - с. 135-136.

81. Хуан Jly Шеен. Биохимические и иммуногенетические маркеры крови и перспективы их использования в разведении свиней Китая: дис. . докт. с.-х. наук / Хуан Лу Шеен. 1992. - ВИЖ, Дубровицы. - 21с.

82. Чемоданов, B.C. Иммуногенетическая характеристика свиней породы дюрок / B.C. Чемоданов // Тр. Кубан. аграр. ун.-та, 1992. В. 324. -с.76-80.

83. Шмаков, Ю.И. Эффективность применения разных методов селекции на повышение продуктивных качеств свиней: дисс. докт. . с.-х. наук / Ю.И. Шмаков. Дубровицы, ВИЖ, 1999.- 271с.

84. Шмаков, Ю.И. Эффективность преимущественной селекции при чистопородном разведении / Ю.И. Шмаков, А.А. Мглинец // Современные проблемы развития свиноводства. Жодино, 2000. - с. 12-14.

85. Andresen, Е. Association between susceptibility to the Malignant Hyperthermia Syndromo (MHS) and H blood types in Danish Landrace pigs explained by linkage disequilibrium / E. Andresen // Livest. Prod. Sci. 1980. -V.7.-P. 155-162.

86. Andresen, E. Evidence indicating the sequence Phi, Hal, H of the three closely linked loci in pigs / E. Andresen //Nord. Vet. Med. 1979. - V.31. - P.443-444.

87. Bazala, E. Historic overovani realizace plemenarskych program rydanana za soucasnon skutecnost / E. Bazala, L. Vitek, J. Doupal // Nas. Chov. -2000. -N24. S.24-26.

88. Baltzer, J. Untersuchungen uber das Bestehen von Beziehungen zwischen Blutgruppenfactoren und Daten des Schlachtkorperwertes und der Mastleistung des Schweines / J. Baltzer // Zuchtungskunde. 1964. - Bd.36. - N7. -S.317-326.

89. Chen, P. Selection for lean growth rate and correlated responses in litter traits in a synthetic line of Yorkshine-Meishan pigs / P. Chen, T. Baas, J. Dekkers L. Christian // Canad. J. Anim. Sci. 2001. - V.81. - JVs2. - P.205-214.

90. Dziangys, V. Selection of Swedish Yorkshiret pigs for productivity in Lithuania / V. Dziangys, A. Stikliunas // Biologiy. 2000. - №3. - p.30-33.

91. Fries, H.K. Maping of the Gene for G blood group antigens to chromosome 15 in swine / H.K. Fries, B.A. Rasmusen, V.L. Jarnell, R.R. Maurer // Anim. Blood. Groups. Biochem. Genet. 1984. - V.15. - №4. - P.251-258.

92. Fries, H.K. Chromosomal mutations in pigs derived from x-irradiated semen / H.K. Fries, G. Stranzinger // Cytogenet. Cell Genet. 1982. - V.34. - №1. -P.55-66.

93. Hojny, J. New blood groups factors Es, Et and a new allel Ebdgimt (E16) in the pig E blood group system / J. Hojny, J. Hradecky, S. Cwik //Animal Genetics. 1991. -V.22.-P.251-258.

94. Hojny, J. Allel Ebdsimr (E17) in the pig E blood group system / J. Hojny, Nielsen P.B. //Anim. Genetics. -1992. V.23. - P.523-524.

95. Hojny, J. A contribution to the complex M blood groups system in pigs / J. Hojny, A. Van Zeveren // Animal Blood Groups and Biochem. Genet. -1985.-V.I6. -Suppl.l.-P.24.

96. Hradesky, I. Map arrangement of the SLA chromosomal region and the J and С blood groups loci in the pig /1. Hradesky, V. Hruban, J. Pazdera // Anim. Blood. Grps. Biochem. Genet. 1982. - V.I. - P.223-224.

97. Jensen, E. Testing methods for PSE syndrome: current research in Denmark / E. Jensen, E. Andresen // Livestock Prod. Sci. 1980. - V.I3. - P.245-262.

98. Jensen, E.L. Quantitative studies on blood group and serum protein systems in pigs / E.L. Jensen, C. Smith, L.N. Baker, D.F. Cox // J. Anim. Sci. -1968. V.27. - №4. - P.856-862.

99. Johansen, S. Evaluation of selection for increased lean tissue growth rate in pigs on low ore high dietary protein levels / S. Johansen // Diss. Uppsala. -1993.-76 P.

100. Kuryt, J. The comparative analysis of RYR1 and Hal genotypes defined on the basis of PCR/RFLP test and Hal-GPI-AlBG-Pgd haplotyping, respectively / J. Kuryt, A. Kossakowska // Anim. Genet. 1994. - V.25. - p.2.

101. Nagy, J. Kulonbozo szintu teljesitmenyrizsgalatokva alapozott szelekcio hatekonysaganak elemzese / J. Nagy, L. Csato, J. Farkas, L. Radnoczi // Allat. Takarmanyozas. 2001. - V.50. - №4. - P.311-315.

102. Nikitin, S. Aging viability and inheritance of allotypes of IgG-system of pigs / S. Nikitin, M. Savina, O. Yudina // Sixts International Veterinary Immunology Symposium, Uppsala, Sweden. 2001. - P.216.

103. Phong Ky Thuat Chan Nuoi. Results and prospect of reaning exstic pig with high leanness in Thai Binh province / Phong Ky Thuat Chan Nuoi // Nong. Ngeiep. Cong. 1996. - №9. -P.371-372.

104. Rasmusen, B.A. H blood types in pigs as predictors of stress susceptibility / B.A. Rasmusen, L.L. Christian // Science. 1977. - V.l91. - P.947-948.

105. Skiba, E. New immunoglobulin epitopes in pigs immunogenetics and linkae / E. Skiba, J. Wegrzym, P. Krzyscin // Roczn. Nank. Zootechn. 1998. -V.25(l). - P.7-17.

106. Vogeli, P. Genetiche marker und Fruchtberkeit / P. Vogeli // Schweiserische Landwirtschaftliche Monstshefte. 1984. - B.62. - №8-9. - P.253-259.

107. Wiatroszak, J. Study on correlation blood groups and some productive characteristics in pig / J. Wiatroszak // Genetic polonica. 1974. - V.l5. - №1-2. -P.101-106.92