Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Усовершенствование программы экстракорпорального оплодотворения человека с помощью применения метода витрификации
ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование программы экстракорпорального оплодотворения человека с помощью применения метода витрификации"

На правах рукописи

Джамбор Варвара Воскановна

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПРОГРАММЫ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА ВИТРИФИКАЦИИ

03.00.30 - Биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005 г.

Работа выполнена в Институте по углубленному изучению бесплодия (г. Милуоки, США), в ГУ Научном Центре Акушерства, Гинекологии и Пе-ринатологии РАМН, г. Москва.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Л. Ф. Курило доктор медицинских наук, профессор Л. Н. Кузьмичев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук М. Н. Болтовская

кандидат биологических наук Л. В. Хилькевич

Ведущая организация: ГОУВПО Российский Государственный Медицинский

Защита диссертации состоится 16 марта 2006 года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.52 кафедры клеточной биологии и гистологии Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Адрес: 119992, г. Москва, Ленинские горы, д. 1., корп. 12, Биологический факультет, аудитория М1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. (119992, г.Москва, Ленинские горы, д. 1., корп. 12).

Университет

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Е.Н. Калистратова

2М6903

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В наши дни бесплодие среди супружеских пар достигает 15%, а экстракорпоральное оплодотворение преовуляторных ооцитов (ЭКО) и перенос эмбрионов (ПЭ) женщине приобретают все большее значение в лечении женского и мужского бесплодия. Бесплодие может развиваться вследствие гене-

тических и инфекционных факторов, эндокринной недостаточности, а также анатомических особенностей пациента. Одними из наиболее серьезных причин бесплодия женщины являются синдром поликистозных яичников (СПКЯ), эндометриоз, функциональная недостаточность яичников. Появление метода криоконсервации эмбрионов человека и его успешное применение [Trounson А., Mohr L., 1983] позволило специалистам решить ряд важных проблем. В циклах стимуляции овуляции пациенток с СПКЯ часто используют криоконсервацию эмбрионов для их переноса в естественном цикле [Chian R. et al., 2001]. Такой же подход применяют при развитии синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) [Ferraretti А. et al., 1999].

По одной из широко применяемых классификаций градации эмбрионы делятся на классы: "А"; "В"; "С"; "D", в зависимости от быстроты и качества их развития, соответственно. Выбор дня ПЭ зависит от количества эмбрионов, их градации, а также от статистических показателей успешных ЭКО и ПЭ в различных лабораториях. Во многих лабораториях выбор ПЭ ложится на пятый день. Эмбрионы, достигшие стадии бластоцисты на пятый день, в своем большинстве относятся к классу "А" [Dokras А. et al., 1993]. Неиспользованные после ПЭ бластоцисты и эмбрионы, из которых сформировались бластоцисты на шестой день (такие эмбрионы относятся к классу "В") также подвергают криоконсервации для переноса их в следующих циклах (крио циклах).

РО<

- f. ПАЯ

>

bjpt

В то время как метод медленного замораживания клеток и эмбрионов существует уже 20 лет и характеризуется медленным вытеснением воды кри-опротекторами с последующим медленным понижением температуры (от комнатной температуры до температуры жидкого азота, - 196°С) [Мепего У. е1 а1., 1992; УетапМСип I. ^ а1., 2003], метод витрификации (метод быстрой криоконсервации) еще недостаточно разработан и изучен и представляет большой интерес как в плане снижения стоимости метода, так и в плане быстроты его выполнения, а также результатов хранения в криоконсервации и последствий размораживания [ЫеЬегтапп I. й а1., 2002; ТгоипБоп А. й а1., 1987]. В нашей лаборатории был применен и модифицирован метод витрификации, разработанный д.б.н. М. Куваямой в клинике Като, специализирующейся по ЭКО (Токио, Япония) [Кишауата М., 2001]. Метод витрифика-ции основан на быстром воздействии криопротекторов вследствии их повышенной концентрации и на быстром понижении температуры с моментальным переносом эмбрионов в жидкий азот. Многие исследования отмечали значительное возрастание частоты выживаемости эмбрионов при использовании техники витрификации [ЕЮапавоип I. а!., 2001].

Ранее, при отсутствии метода криоконсервации, супружеские пары с оставшимися после ПЭ эмбрионами имели 3 выбора: разрушить эмбрионы; передать эмбрионы другим, нуждающимся в эмбрионах, супружеским парам для ПЭ без финансовой выгоды; передать эмбрионы для проведения на них строго ограниченных исследований: либо для отработки условий программы ЭКО, в том числе методов криоконсервации, либо для отработки условий преимплантационной генетической диагностики. Каждый из этих выборов имеет ряд недостатков в зависимости от взглядов отдельных супружеских пар. Криоконсервация дает возможность вернуться к решению вопроса о судьбе эмбрионов в будущем.

В настоящее время большинством соответствующих международных институтов рекомендовано переносить 2-3 эмбриона с учетом индивидуальных особенностей женщины [Englert J. et al., 2003]. С появлением криокон-сервации появилась возможность переносить женщинам лишь 2-3 эмбриона, а остальные подвергать замораживанию для использования в будущем в последующих циклах, что позволяет снизить риск развития многоплодной беременности.

До сих пор одной из важных проблем остается проблема старения яйцеклетки. У женщин с увеличением возраста (старше 35 лет) повышается риск развития хромосомных и генных мутаций в яйцеклетках и, значит, повышается частота мутаций у эмбрионов вследствие старения ооцитов в онтогенезе [Sperling К., 1984]. Применение криоконсервации яйцеклеток позволяет планировать последующие деторождения. Женщины, морально не готовые для создания семьи, могут не беспокоиться о старении их яйцеклеток, заморозив их в программе ЭКО в раннем репродуктивном возрасте. Женщины, проходящие различные курсы лечения, например, химио- и радиотерапию при онкозаболеваниях, имеют возможность заморозить свои яйцеклетки до начала соответствующего курса лечения.

Кроме того, важен этический аспект хранения эмбрионов в жидком азоте. Большинство пациентов предпочитает хранить свои неоплодотворен-ные яйцеклетки, а не эмбрионы, в том случае, если эмбрионы не будут использованы именно для них в будущем.

В наши дни криоконсервация эмбрионов является обычным методом программы ЭКО. Однако замораживание ооцитов для использования их затем в ЭКО до сих пор применяется редко и представляет скорее метод экспериментальный, чем клинический. Поэтому, разработка модификаций метода криоконсервации яйцеклеток и эмбрионов и установление наиболее опти-

мальных условии его протекания является одним из самых важных направлений программы ЭКО.

Цель работы

Оценить эффективность метода витрификации эмбрионов и ооцитов человека с помощью сравнения методов медленного замораживания и витрификации, установить наиболее оптимальные условия для успешного проведения витрификации с целью повышения частоты наступления беременностей и частоты имплантации в программе ЭКО и ПЭ.

Задачи исследования

1. Применить метод витрификации и метод медленного замораживания на бластоцистах человека (дня 5 и дня 6 развития).

2. Сравнить частоту выживаемости бластоцист при витрификации и методе медленного замораживания.

3. Сравнить частоту наступления клинической беременности и частоту имплантации при ПЭ после витрификации бластоцист и после использования метода медленного замораживания бластоцист с частотой наступления клинической беременности и имплантации перенесенных бластоцист и морул на день 5 в циклах ЭКО.

4. Сравнить схемы подготовки пациенток к переносу размороженных после медленной криоконсервации эмбрионов и после витрификации.

5. Применить метод витрификации ооцитов и оценить его результаты.

6. Разработать оптимальные условия витрификации ооцитов и эмбрионов человека.

Научная новизна

Применен модифицированный метод витрификации эмбрионов и ооци-тов человека. Выявлена высокая частота выживаемости эмбрионов; частоты имплантации и наступления клинической беременности при витрификации по сравнению с методом медленного замораживания. Разработаны условия проведения витрификации, при которых возрастает количество жизнеспособных клеток в каждом эмбрионе.

Практическая значимость

Доля выживших эмбрионов человека при использовании метода витрификации составляет 100%. При витрификации частота наступления беременностей возрастает в 2,4 раза, а частота имплантации - в 4,3 раза по сравнению с методом медленного замораживания. Метод витрификации ооцитов и эмбрионов человека занимает 10-15 минут, в то время как вся процедура медленного замораживания протекает в течение 3-х часов. Таким образом, витрификация позволяет экономить время, а также обходиться без использования дорогостоящего морозильного оборудования.

До настоящего времени пациенты, имеющие замороженные эмбрионы с помощью техники медленной криоконсервации и проходящие цикл стимуляции, всегда шли на риск потери эмбрионов из-за их возможной невыживаемости при их размораживании в день ПЭ. Теперь эта проблема может быть решена, так как при витрифицикации эмбрионов частота их выживаемости заметно возрастает.

Высокие показатели выживаемости яйцеклеток (92.4%) и доли их нормального оплодотворения (83.6%) после витрификации играют важную роль в дальнейшем совершенствовании программы ЭКО в будущем.

Внедрение в практику

В настоящее время предложенная нами модификация метода витрифи-кации применяется для всех пациентов, нуждающихся в ЭКО и имеющих неиспользованные эмбрионы после ПЭ в Институте по углубленному изучению бесплодия, Милуоки, США. При использовании донорских ооцитов эмбрионы замораживают на стадии бластоцист с применением техники витрифика-ции, и пациенты-реципиенты имеют возможность выбора времени прохождения ими крио цикла. Этот же подход рекомедуется пациенткам, использующим собственные ооциты с целью предоставления им права планирования семьи. Большое количество пациенток проходят циклы ЭКО с целью витрификации ооцитов и хранения их в жидком азоте для использования ооцитов в будущем. Данная модификация метода витрификации также применяется в Научном Центре Акушерства, Гинекологии и Перинатологии РАМН, г. Москва.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При оптимизации условий проведения витрификации, основанной на понижении токсичности высоких концентраций криопротекто-ров, возрастает количество таких эмбрионов, в которых большее число клеток сохраняет жизнеспособность.

2. Метод витрификации, как альтернативный метод криоконсервации эмбрионов, является более эффективным, чем метод медленного замораживания, что установлено при сравнении результатов частоты выживаемости эмбрионов и ооцитов человека, частоты имплантации и наступления беременностей.

3. Частота имплантации и наступления беременностей не зависит от выбранных схем подготовки пациенток (таких как естественный

цикл, а также циклы с применением препаратов фолликулостимули-рующего гормона (ФСГ) и препаратов 1,иргоп / Эстроген) к переносу размороженных после криоконсервации эмбрионов.

4. Витрификация ооцитов до сих пор является экспериментальным методом и требует статистически значимых цифр по результатам исследований для оценки его эффективности и использования в клинической практике. В настоящей работе получены обнадеживающие результаты частоты выживаемости витрифицированных ооцитов и частоты их оплодотворения.

Апробация работы

Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на межлабораторном семинаре в ЦАГП РАМН, а также в ГУ Медико-Генетическом научном центре РАМН, г. Москва, ноябрь, 2005 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, указателя литературы, содержащего 231 наименований публикаций (11 отечественных и 220 иностранных авторов). Работа изложена на 104 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 10 рисунков.

И. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПАЦИЕНТОВ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы исследования

При выполнении данного исследования было обследовано 144 пациентки, 327 эмбрионов, 66 яйцеклеток в программе ЭКО и ПЭ. Был проведен ряд клинических исследований, и все пациентки были разделены на 4 группы.

1-ая группа составлена из 51 пациентки со средним возрастом 35,5 лет, с количеством обследованных эмбрионов 147. Они прошли программу ЭКО и ПЭ с медленной криоконсервацией оставшихся после ПЭ бластоцнст на день 5 и день 6, с размораживанием их для ПЭ на день 5 в крио цикле.

Во 2-ую группу вошли 35 пациенток со средним возрастом 35,6 лет, с количеством эмбрионов 77. Эти пациентки прошли программу ЭКО и ПЭ с замораживанием оставшихся после ПЭ бластоцист на день 5 и на день 6 методом витрификации с их размораживанием и переносом в полость матки в крио цикле.

3-я группа (контрольная) представлена 48 пациентками программы ЭКО и ПЭ со средним возрастом 35,9 лет и с переносом бластоцист и морул (то есть, только эмбрионов класса А и В) на день 5 развития. Оценено 103 эмбриона.

4-я группа состояла из 10 пациенток с замороженными ооцитами методом витрификации (всего 66 ооцитов). Ооциты были разморожены для проведения программы ЭКО с применением метода ИКСИ и последующим ПЭ. Из этих 10 пациенток у трех пациенток со средним возрастом 31 год были витрифицированы собственные ооциты; семь пациенток воспользовались витрифицированными донорскими ооцитами, со средним возрастом доноров 27,4 лет, реципиентов - 41 год.

Для выполнения одной из задач нашей работы (усовершенствования метода витрификации), также проводили исследование на 72 эмбрионах 32 пациентов. Эти эмбрионы прекратили свое развитие, и, следовательно, не были пе-. ренесены в полость матки или заморожены, но все еще имели живые клетки на день 6 развития. Пациенты предоставили свои эмбрионы нашей лаборатории для отработки метода витрификации, подписав необходимые договоры. Такие эмбрионы использовали для витрификации и размораживания с оценкой их выживаемости при изменении условий витрификации с целью установления ее оптимального протекания. 72 эмбриона разделили на 2 группы:

Группа 5: 35 эмбрионов, которые подвергали витрификации и соответствующему размораживанию без изменения условий витрификации.

Группа 6: 37 эмбрионов, которые верифицировали и размораживали с предложенными в нашей лаборатории модификациями.

Методы исследования

1. При стимуляции суперовуляции пациенток в программе ЭКО и ПЭ использовали Lupron или Antigon.

2. В процессе стимуляции суперовуляции проводили гормональный и УЗ-мониторинг пациенток.

3. Трансвагинальная пункция яичников (ТВП).

4. Оплодотворение ооцитов in vitro.

5. Применение метода интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в яйцеклетку (ИКСИ).

6. Оценка результатов оплодотворения.

7. Культивирование ооцитов и эмбрионов in vitro.

8. Градация эмбрионов на различных стадиях их развития.

9. Подготовка пациенток к переносу эмбрионов в крио циклах с использованием естественных циклов, циклов с применением препара-

тов ФСГ, а также циклов с использованием препаратов эстрогена и Lupron.

10. Медленное замораживание эмбрионов на стадии бластоцист с последующим размораживанием для ПЭ в крио циклах, оценка выживаемости эмбрионов.

11. Витрификация эмбрионов на стадии бластоцист с размораживанием их для ПЭ в крио циклах, оценка выживаемости эмбрионов.

12. Витрификация ооцитов на стадии преовуляторных ооцитов (МП) с размораживанием их для проведения ИКСИ и ПЭ в крио циклах, оценка выживаемости ооцитов, частоты оплодотворения и дробления, а также морфологии развивающихся из них эмбрионов.

13. Микроманипуляционный выклев (assisted hatching).

14. Перенос эмбрионов в полость матки.

15. Определение биохимической и клинической беременности.

16. Витрификация эмбрионов, которые прекратили свое развитие, отданных пациентками для проведения экспериментальных работ с целью разработки модификации метода витрификации.

17. Статистическая обработка результатов.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Сравнение частоты наступления беременностей и частоты имплантации в результате переноса медленно криоконсервированных и верифицированных бластоцист в крио циклах

В данной работе при использовании двух разных методов криокон-сервации: метода медленного замораживания (группа 1) и метода витрификации (группа 2) сравниваются результаты крио циклов с результатами обычных циклов ЭКО с переносом эмбрионов на тот же день (день 5) (кон-

трольная группа 3). Поскольку из эмбрионов, замороженных в группах 1 и 2, сформированы бластоцисты как на день 5 (класс А), так и на день 6 (класс В), в контрольной группе 3 для сравнения результатов использовали циклы ЭКО с переносом эмбрионов классов А и В, то есть бластоцист и морул на день 5.

Перед тем как перейти к сравнению групп 1, 2 и 3, необходимо описать показания к проведению программы ЭКО и ПЭ (таблица 1), а также циклы стимуляции пациенток этих групп (таблица 2).

Таблица 1

Показания пациенток групп 1, 2 и 3 к программе ЭКО

Показания к ЭКО Группа 1 Группа 2 Группа 3

ИКСИ 49% (25/51) 40% (14/35) 41,7% (20/48)

Эндометриоз 15,7% (8/51) 22,9% (8/35) 16,7% (8/48)

СПКЯ 11,8% (6/51) 11,4% (4/35) 12,5% (6/48)

Непроходимость фаллопиевых труб 9,8% (5/51) 14,3% (5/35) 10,4% (5/48)

Возрастной фактор 3,9% (2/51) 8,6% (3/35) 6,3% (3/48)

Нарушение овуляции 9,8% (5/51) 2,9% (1.35) 12,5% (6/48)

Для доказательства сходства показаний к ЭКО была применена статистическая программа с установлением коэффициента корреляции, которая дала следующие результаты:

коэффициент корреляции между группой 1 и группой 2 = 0,918686; коэффициент корреляции между группой 1 и группой 3 = 0,998022; коэффициент корреляции между группой 2 и группой 3 = 0,908030. По сравнению с практически идентичной схемой стимуляции суперовуляции пациенток группы 3 (Ьиргоп или Ап^оп после овуляции 225 единиц в день в течение 10-ти дней), в группах 1 и 2 использовали 3 различных метода подготовки пациенток к крио циклам, указанные в таблице 2.

Таблица 2

Методы подготовки пациенток групп 1 и 2 к крио циклам

Группа 1 Группа 2

Естественный цикл 47% (24/51) 51,4% (18/35)

ФСГ 31,4% (16/51) 34,3% (12/35)

1.иргоп / Эстроген 21,6% (11/51) 14,3% (5/35)

Коэффициент корреляции также применили для анализа подготовки пациенток 1-ой и 2-ой групп к крио циклам, и он составил 0,984405. Таким образом, было показано, что не существовало значительных отличий между показаниями к программе ЭКО для пациенток 1-ой, 2-ой и 3-ей групп, а также между методами подготовки пациенток 1-ой и 2-ой групп к крио циклам. Все эмбрионы сравниваемых групп были перенесены на 5-ый день после овуляции с результатами, представленными в таблице 3.

Таблица 3

Результаты, полученные в группах 1, 2 и 3 при переносе эмбрионов

Группа 1 Группа 2 Группа 3

Количество пациенток 51 35 48

Средний возраст 35,5 35,6 35,9

Выживаемость эмбрионов 86,4% (127/147) 100% (77/77)

Среднее количество эмбрионов /ПЭ 2,5 (127/51) 2,2 (77/35) 2.1 (103/48)

Частота наступления беременностей 17,6% (9/51) 7 родов, 1 спонтанный аборт, 1 прогрессирующая беременность 42,9% (15/35) 13 родов, 2 прогрессирующие беременности 50% (24/48) 20 родов, 2 спонтанных аборта, 2 прогрессирующие беременности

Частота имплантации 7% (9/127) 29,9% (23/77) 37,9% (39/103)

Как видно из таблицы 3, средний возраст пациенток в группах 1, 2 и 3 практически не отличался. Частота выживаемости бластоцист при медленной криоконсервации в группе 1 составила 86.4%, в то время как при витрифика-ции бластоцист в группе 2 выжили все бластоцисты (100%). При оценке количества перенесенных эмбрионов в группах 1, 2 и 3 было выявлено, что наибольшее количество бластоцист в расчете на 1 пациентку было перенесено в группе 1 (2.5) по сравнению с группой 2 (2.2) и группой 3 (2.1). Также учитывали градацию перенесенных эмбрионов в 1-ой, 2-ой и 3-ей группах, представленную в таблице 4.

Таблица 4

Градация эмбрионов в группах 1,2 и 3

Группа 1 Группа 2 Группа 3

ДО криоконсервации после криоконсервации ДО криоконсервации после криоконсервации

Количество эмбрионов класса А 41% (52/127) 31,5% (40/127) 54,5% (42/77) 50,6% (39/77) 59,2% (61/103)

Количество эмбрионов класса В 59% (75/127) 62,2% 79/127) 45,5% (35/77) 49,4% (38/77) 40,8% (42/103)

Количество эмбрионов класса С 6,3% (8/127)

Анализируя данные таблицы 4, необходимо отметить, что все бластоцисты групп 1 и 2 во время их замораживания были отнесены к классам А и В. Причина, по которой некоторые бластоцисты группы 1 были перенесены как эмбрионы класса С объясняется низкой частотой выживаемости каждого эмбриона в отдельности в группе 1. Также из таблицы видно, что после размораживания 23% (12/52) бластоцист группы 1 перешли из класса А в класс

В, по сравнению с группой 2, в которой лишь у 7% (3/42) бластоцист была понижена градация с класса А на класс В.

Для статистического анализа частоты наступления беременностей и частоты имплантации применяли р-величину, с помощью которой получали доказательства статистически значимых различий или сходства полученных данных, указанных в таблице 5.

Таблица 5

Сравнение р-величины в группах 1,2, и 3 для частоты наступления беременностей и частоты имплантации

Частота наступления беременностей р-величина

Группа 1 (17,6%) и Группа 2 (42.9%) 0,0145

Группа 1 (17,6%) и Группа 3 (50%) 0,0012

Группа 2 (42,9%) и Группа 3 (50%) 0,6565

Частота имплантации

Группа 1 (7%) и Группа 2 (29.9%) 0,0001

Группа 1 (7%) и Группа 3 (37.9%) 0,0001

Группа 2 (29,9%) и Группа 3 (37.9%) 0,2729

Исходя из полученных р-величин можно заключить, что значимыми различиями характеризуются результаты частоты наступления беременностей в группах 1 и 2 и в группах 1 и 3, как и частоты имплантации в группах 1 и 2 и в группах 1 и 3. При оценке р-величины данных в группах 2 и 3 при частоте наступления беременностей и имплантации выявляются сходные результаты. Частота наступления беременностей в группе 2 возрастает в 2.4 раза по сравнению с группой 1, в группе 3 - в 2.8 раза по сравнению с группой 1. Что касается имплантации, то ее частота возрастает в 4.3 раза в группе 2 по сравнению с группой 1, а в группе 3 - в 5,4 раза по сравнению с группой 1.

Возрастание частоты наступления беременностей (в 1,2 раза) и имплантации (в 1,3 раза) в контрольной группе 3 по сравнению с группой 2 не

является статистически значимым и имеет несколько объяснений. Во-первых, как уже было отмечено, эмбрионы с лучшей морфологией были перенесены в полость матки в предыдущем цикле ЭКО, а во-вторых, эмбрионы при крио-консервации подвергаются воздействию криопротекторов и изменениям температуры, что само по себе является дополнительным стрессом и отражается на их жизнеспособности.

Высокая частота выживаемости верифицированных бластоцист (100%) позволяет размораживать лишь необходимые для ПЭ эмбрионы; планировать дальнейшие крио циклы пациенток в зависимости от количества имеющихся у них замороженных эмбрионов, а также прогнозировать частоту наступления беременностей и частоту имплантации, основываясь на результатах их предыдущих циклов и на градации верифицированных эмбрионов.

Как видно из таблицы 9, при переносе размороженных верифицированных бластоцист достаточно переносить в полость матки в среднем 2,2 эмбриона с такими результатами, как частота наступления беременностей, составляющая 42.9% (п=35); частота имплантации - 29,9% (п=77). Таким образом предотвращается риск многоплодной беременности. Эти высокие показатели позволят повысить эффективность циклов ЭКО пациенток с СПКЯ и СГЯ.

В соответствии с литературными данными, 40-50% эмбрионов от общего полученного количества эмбрионов способны формировать бластоци-сты к дням 5 и 6 развития; а примерно 40-50% от этих сформированных бластоцист успешно имплантируются и дают начало развитию плода [Dokras А. et al., 1993; Hardy К., 1993; Janny L„ Menezo Y., 1994; Janny L., Menezo Y., 1996]. Следовательно, можно предположить, что одного цикла ЭКО, то есть одной трансвагинальной пункции яичников будет достаточным для наступления 2-х - 3-х беременностей. Применение витрификации, как единственно-

го метода криоконсервации ооцитов и эмбрионов в программе ЭКО и ПЭ, позволит повысить частоту наступления беременностей и частоту имплантации почти до традиционных уровней в циклах ЭКО.

При анализе результатов криоконсервации бластоцист было уделено большое внимание методам подготовки пациенток 1-ой и 2-ой группы к крио циклам, которые приведены в таблице 6.

Таблица 6

Частота наступления беременностей у женщин в группах 1 и 2

в зависимости от метода подготовки пациенток к крио циклам

Метод подготовки Количество беременностей в группе 1 Количество беременностей в группе 2

Естественный цикл 4 (44,4%) 6 (40%)

ФСГ 3 (33,3%) 4 (26,7%)

1_иргоп + эстроген 2 (22,2%) 5 (33,3%)

Из полученных нами данных некорректно делать какие-либо обоснованные выводы, поскольку приведено не высокое число случаев (не имеющее статистической значимости), и частота наступления беременностей в зависимости от метода подготовки пациенток к крио циклам практически не отличается между группами. Представляется интересным вернуться к этой теме в будущем при наличии большего количества наблюдений.

Применение метода витрификации ооцитов человека

В настоящей работе группа 4 состояла из 10 пациенток с замороженными ооцитами методом витрификации. Все ооциты были разморожены, оплодотворены с помощью ИКСИ с проведением ПЭ на день 2 или 3, с результатами, представленными в таблице 7.

Таблица 7

Результаты витрификации яйцеклеток человека в программе ЭКО и ПЭ

Группа 4

Количество пациенток 10

Количество размороженных ооцитов 66

Выживаемость ооцитов 92,4% (61/66)

Среднее количество ооцитов пациентки 6,1 (61/10)

Частота нормального оплодотворения ооцитов 83,6% (51/61)

Частота дробления эмбрионов 84,3% (43/51)

Среднее количество эмбрионов / ПЭ 4(40/10)

Частота наступления беременностей 30% (3/10)

Частота имплантации 7,5% (3/40)

Градация перенесенных эмбрионов в группе 4 распределилась следующим образом: 14 эмбрионов класса А, 21 эмбрион класса В, 5 эмбрионов класса С.

К сожалению, из-за небольшого количества пациенток и использованных витрифицированных ооцитов, а также из-за переноса эмбрионов в группе 4 на их ранних стадиях развития не представляется возможным сравнивать результаты по женщинам группы 4 с таковыми контрольной группы 3 с применением статистических функций. Однако в данном исследовании стоит обратить внимание на частоту выживаемости ооцитов и частоту их оплодотворения. В соответствии с опубликованными данными частота выживаемости медленно крио-консервированных ооцитов составляет 20-30% [Porcu Е. et al., 1997; Tucker М. et al., 1996; Tucker M. et al., 1998; Young E. et al., 1998]. С помощью применения метода витрификации в группе 4 выжили 61 из 66 ооцитов (92.4%). Также на основании литературных данных частота оплодотворения зрелых ооцитов в программе ЭКО составляет 80-90% [Liu J. et al., 1995]. В нашей работе частота оплодотворения размороженных витрифицированных ооцитов составила 83.6%, что является нормальным результатом программы ЭКО.

Разработка модификации метода витрификации

По определению частоты выживаемости эмбрионов во всех Центрах ЭКО выжившим считается эмбрион, более 50% клеток которого сохранились после размораживания [Edgar D. et al., 2000]. И в данной работе при использовании метода витрификации в группе 2 выжили все бластоцисты. Однако при их размораживании выживаемость каждого эмбриона была оценена в отдельности, и ее результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8

Выживаемость клеток бластоцист в группе 2

Доля выживших бластомеров бластоцисты Количество бластоцист

100% 19

95% 10

90% в

Исследование для установления наиболее оптимальных условий протекания витрификации было проведено на 72 эмбрионах, имевших от 8-ми до 10-ти клеток на день 6, что означало, что они перестали нормально развиваться и непригодны для перенесения в полость матки. Эти эмбрионы были предоставлены пациентками для проведения экспериментальных работ с целью разработки модификации метода витрификации. Клетки этих эмбрионов еще не дегенерировали, и могли быть использованы для оценки эффективности метода витрификации.

Для разработки модификации витрификации главное внимание уделялось понижению токсичности криопротекторов. Поскольку все среды для витрификации приготавливали в нашей лаборатории, мы проводили строгое наблюдение за соблюдением точности концентраций добавляемых в среды криопротекторов. Нами были разработаны определенные моменты технологии витрификации и предложены к выполнению следующие рекомендации:

1. Используемые среды для витрификации и соответствующего размораживания с высокими концентрациями криопротекторов могут испаряться при комнатной температуре. Кроме того при перегревании работающего микроскопа может повышаться температура сред, а следовательно, усиливается токсичность криопротекторов. Поэтому необходимо: во-первых, дождаться охлаждения микроскопа перед тем, как начинать процесс витрификации; во-вторых, для избежания перегрева микроскопа и объекта исследования в процессе витрификации, охлаждать кожух лампы микроскопа, помещая на него лед в пластиковых пакетиках;

2. В средах эквилибрации (при витрификации) и разбавления (при размораживании) необходимо постоянно наблюдать за реакцией эмбриона, чтобы не упустить момент перехода к следующему этапу работы. Если эмбрион перестал реагировать на изменение концентрации криопротекторов, - сразу же переходить к следующему этапу, таким образом, ускоряя проводимый процесс и предохраняя эмбрион от избыточного контакта с криопротекторами;

3. Промывание эмбриона в среде витрификации должно занимать от 40 секунд до 1 минуты, не более, так как при наблюдении за реакцией сжатия эмбрионов было отмечено, что только через 40 секунд начинается его обезвоживание. Но после нахождения эмбриона в среде витрификации в течение 1 минуты к нему начинает возвращаться его прежний объем. Следовательно, рекомендовано строго соблюдать длительность времени данной манипуляции - не менее 40 секунд, не более 1 минуты для предотвращения кристаллизации;

4. Необходимо нанесение минимальной капли среды с эмбрионом на соломину перед помещением в жидкий азот в целях повышения скорости замерзания капли;

5. Рекомендуется замораживание одного эмбриона на соломине, а не двух, так как каждый эмбрион может по-разному реагировать на изменение концентрации криопротекторов;

6. Помещение соломины с эмбрионом в жидкий азот должно быть моментальным из-за объема капли (примерно 1 мкл);

7. При переносе эмбриона из жидкого азота в среду размораживания необходимо использовать микропипетки с большим диаметром кончика, чтобы не повредить эмбрион, так как на этом этапе работы эмбрион полностью обезвожен.

72 эмбриона были разделены на 2 группы: группа 5 (35 эмбрионов, верифицированных и размороженных без предложенных условий) и группа 6 (37 эмбрионов, витрифицированных и размороженных с применением этих условий). Результаты данного исследования представлены в таблице 9.

Таблица 9

Доля выживаемости эмбрионов при модификации метода витрификации

Количество выживших клеток Группа 5 Группа 6 р-величина

100% (8/8 или 10/10) 40% (14/35) 75,7% (29/37) 0,0016

90% (9/10) 31,4% (11/35) 16,2% (6/37) 0,1685

87,5% (7/8) 28,6% (10/35) 8,1% (2/37) 0,0011

При 90%-ном выживании клеток (р=0,1685) отличий результатов между группами 5 и 6 не было выявлено. Однако р величина при 100%-ном и 87.5%-ном выживании клеток составила 0,0016 и 0,0011, соответственно, что означало, что статистические величины 5-ой и 6-ой групп имели значимые отличия (статистически достоверные различия), то есть эмбрионы в группе 6 имели большее количество жизнеспособных бластомеров. Полученные результаты позволяют сделать предположение о том что, что поддержание необходимой концентрации криопротектора, регуляция токсичности криопро-

тектора, а также ускоренное протекание витрификации и размораживания сказываются на эффективности этого метода. Эффективность метода витрификации обеспечивается за счет прямого контакта эмбрионов с жидким азотом, а следовательно, моментальным замораживанием без формирования кристаллов льда, также за счет быстрого понижения и повышения температур и минимальных осмотических повреждений.

ВЫВОДЫ

1. Новый, модифицированный нами способ витрификации, основанный на устранении токсичности криопротекторов (через изменение их концентрации и длительности их воздействия), создает лучшие условия, с применением которых повышается частота выживаемости бластоме-ров эмбриона человека по сравнению с традиционно используемым методом витрификации.

2. Частота выживаемости эмбрионов человека при витрификации возрастает в 1,2 раза по сравнению с частотой их выживаемости при медленной криоконсервации.

3. Частота имплантации возрастает в 4,3 раза, а частота наступления клинической беременности в 2,4 раза при применении метода витрификации по сравнению с техникой медленной криоконсервации эмбрионов человека.

4. При сравнении методов подготовки пациенток к крио циклам не было выявлено зависимости частоты имплантации и частоты наступления беременности от методов подготовки (таких как естественный цикл; а также циклы с применением препаратов ФСГ; препаратов Ьиргоп / Эстроген), а средний возраст женщин сравниваемых групп не имел значительных отличий.

5. Применен метод витрификации ооцитов человека [Кшуауата., 2001], который позволяет получать высокие показатели их выживаемости (92,4%) с последующей частотой их нормального оплодотворения (83,6%).

6. Модифицированный нами метод витрификации финансово более экономичен, по сравнению с методом медленной криоконсервации, и может быть рекомендован для дальнейшего совершенствования не только в медицинской практике, но и ветеринарии и животноводстве.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В целях повышения доли выживших эмбрионов, частоты наступления беременности и частоты имплантации эмбрионов человека в программе ЭКО при прохождении пациентами крио циклов рекомендуется применять технику витрификации, как альтернативный метод криоконсервации, а также соблюдать разработанные нами условия протекания витрификации, такие как предохранение используемых сред от перегрева, постоянное наблюдение за реакцией эмбриона или ооцита на изменение концентрации криопротекторов, ускорение протекания витрификации с целью предохранения эмбрионов и ооцитов от избыточного контакта с криопротекторами, повышение скорости замораживания среды, содержащей эмбрион для предотвращения кристаллизации.

Для достижения высоких результатов частоты имплантации и частоты наступления беременности можно использовать такие схемы подготовок пациенток к крио циклам, как естественный цикл, а также циклы с применением препаратов ФСГ и препаратов Ьиргоп / Эстроген.

С целью предотвращения риска развития хромосомных и генных мутаций в яйцеклетках и, значит, у эмбрионов вследствие старения ооцитов в онтогенезе рекомендуется витрификация ооцитов и хранение их в жидком азоте для использования в будущем.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Stehlik J., Stehlik Е., Katayama К. P., Brohammer R., Jambor V. Vitirfication demonstrates significant improvement over conventional slow freezing of blastocysts // Fertility Sterility. Abstract P-76. 59th annual meeting of the American Society for Reproductive Medicine. San Antonio, Texas. 2003. Vol. 80. P. 145.

2. Джамбор В.В., Стайлик Д, Стайлик Э., Катаяма К.П., Казарян JI.M., Кузьмичев JI.H. Применение метода витрификации эмбрионов человека в программе эстракорпорального оплодотворения // Тезисы VI форума «Мать и дитя», г. Москва. 12-15 октября 2004 г, с. 338.

3. Кузьмичев J1.H., Казарян JI.M., Джамбор В.В. Выбор оптимальной схемы подготовки пациенток к переносу оттаянных после криоконсерва-ции эмбрионов / Тезисы VI форума «Мать и дитя», г. Москва. 12-15 октября 2004 г, с. 367.

4. Stehlik Е., Stehlik J., Katayama К. P., Kuwayama M., Jambor V., Brohammer R., Kato O. Vitrification demonstrates significant improvement versus slow freezing of human blastocysts // Reproductive BioMedicine Online.

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

ПЭ - перенос эмбрионов

СПКЯ - синдром поликистозных яичников

ИКСИ - интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в яйцеклетку

2005. Vol. 11. Р. 53-57.

Список сокращений

СГЯ - синдром гиперстимуляции яичников РТ - репродуктивные технологии

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон ТВП - трансвагинальная пункция яичников

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН Подписано в печать 02.12.05 Заказ № 697 Тираж 100 экз.

í

г

о

I

*

]

i

!

РНБ Русский qboH,a

2007-4 5707

Получено 29 ДЕК 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Джамбор, Варвара Воскановна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Основные аспекты программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов человека.

1.1.1. Причины женского бесплодия и экстракорпоральное оплодотворение человека.

1.1.2. Гормональная стимуляция овуляции пациенток

1.1.3. Условия культивирования эмбрионов человека in vitro.

1.1.4. Подготовка сперматозоидов для экстракорпорального оплодотворения человека.

1.1.5. Этапы развития эмбрионов человека и перенос эмбрионов.

1.1.6. Этические и правовые аспекты репродуктивных технологий.

1.2. Метод медленного замораживания.

1.3. Метод витрификации.

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы исследования.

2.2. Методы исследования

2.2.1. Программа экстракорпорального оплодотворения и перенос эмбрионов человека.

2.2.2. Метод медленной криоконсервации.

2.2.3. Метод витрификации.

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Сравнение частоты наступления беременностей и частоты имплантации в результате переноса медленно криоконсервированных и витрифицированных бластоцист в крио циклах.

3.2. Применение метода витрификации ооцитов человека

3.3. Разработка модификации метода витрификации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Усовершенствование программы экстракорпорального оплодотворения человека с помощью применения метода витрификации"

В наши дни бесплодие среди супружеских пар достигает 15%, а экстракорпоральное оплодотворение преовуляторных ооцитов (ЭКО) и перенос эмбрионов (ПЭ) женщине приобретают все большее значение в лечении женского и мужского бесплодия. Бесплодие может развиваться вследствие генетических и инфекционных факторов, эндокринной недостаточности, а также анатомических особенностей пациента. Одними из наиболее серьезных причин бесплодия женщины являются синдром поликистозных яичников (СПКЯ), эндометриоз, функциональная недостаточность яичников. Мужское бесплодие может иметь место вследствие нарушения сперматогенеза, развивающегося в свою очередь из-за гормональных, инфекционных или иных воздействий. Генетические факторы играют существенную роль в развитии как мужского, так и женского бесплодия, и это направление исследований стало одним из ведущих в мире в последние несколько десятилетий [Курило Л.Ф., Шилейко JI.B. и др., 1997; Курило Л.Ф., Шилейко JI.B. и др., 2000]. В результате применения метода ЭКО и ПЭ большое количество детей (более 200 тысяч в год), зачатых in vitro, рождается во многих странах мира. Развитие и совершенствование ЭКО и ПЭ дали начало таким методам как ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в яйцеклетку) [Van Steirteghem, А. et al., 1993; Van Steirteghem, A. et al., 1994], ПГД (преимплантационная генетическая диагностика), FISH (флуоресцентная in situ гибридизация) [Берлинский Ю., 1996], а также методам замораживания эмбрионов и ооцитов в жидком азоте для их использования в будущем [Whittingham D. et al., 1972; Wilmut I., 1972].

Появление метода криоконсервации эмбрионов человека и его успешное применение [Trounson А., Mohr L., 1983] позволило специалистам решить ряд важных проблем. В циклах стимуляции суперовуляции пациенток с СПКЯ часто используют криоконсервацию эмбрионов для их переноса в естественном цикле [Chian R. et al., 2001]. Такой же подход применяют при развитии синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) [FerrarettiA. et al., 1999].

По одной из широко применяемых классификаций градации эмбрионы делятся на классы: "А"; "В"; "С"; "D", в зависимости от быстроты и качества их развития, соответственно. К классу "А" относят эмбрионы с достаточным количеством одинаковых по размеру бластомеров (2-4 бластомера на день 2, 6-12 бластомеров на день 3, компактизация бластомеров и гладкая структура морулы на день 4, формирование бластоцисты (эмбриобласта и трофобласта) на день 5; фрагментация составляет менее 5% от общего объема эмбриона. Эмбрионы класса "В" также имеют достаточное количество бластомеров на день 2 и день 3, бластомеры могут немного отличаться по размеру, либо фрагментация составляет 5-10% от общего объема эмбриона, компактную структуру морулы на день 4 с фрагментацией 5-10% от общего объема эмбриона, на день 5 эмбрион все еще находится на стадии морулы. Эмбрионы класса "С" характеризуются недостаточным количеством бластомеров в эмбрионе, неодинаковыми по размеру бластомерами, отсутствием структур морулы и бластоцисты на день 4 и на день 5, соответственно, и фрагментацией 15-25% от общего объема эмбриона. К классу "D" относят эмбрионы, которые сильно отстают в развитии и почти полностью фрагментированы (более 25% от общего объема эмбриона). [Alikani М. et al., 1999; Claman Р. et al., 1987; Desai N. et al., 2000; Hardarson T. et al., 2001; Lewin A. et al., 1994].

Выбор дня ПЭ зависит от количества эмбрионов, их градации, а также от статистических показателей успешных ЭКО и ПЭ в различных лабораториях. В некоторых лабораториях предпочтение отдается ранним дням ПЭ (второму или третьему). В этих случаях переносят лишь часть эмбрионов, а оставшиеся эмбрионы классов "А" и "В" замораживают для переноса их в следующих циклах (крио циклах). Во многих лабораториях выбор ПЭ ложится на пятый день. Эмбрионы, достигшие стадии бластоцисты на пятый день, в своем большинстве относятся к классу "А" [Эокгаз А. & а1., 1993]. Неиспользованные после ПЭ бластоцисты и эмбрионы, из которых сформировались бластоцисты на шестой день (такие эмбрионы относятся к классу "В") также подвергают криоконсервации.

В то время как метод медленного замораживания клеток и эмбрионов существует уже 20 лет и характеризуется медленным вытеснением воды криопротекторами с последующим медленным понижением температуры (от комнатной температуры до температуры жидкого азота, — 196°С) [Мепего У. е1 а1., 1992; Укап^Юип I. е1 а1., 2003], метод витрификации (метод быстрой криоконсервации) еще недостаточно разработан и изучен и представляет большой интерес как в плане снижения стоимости метода, так и в плане быстроты его выполнения, а также результатов хранения в криоконсервации и последствий размораживания [ЫеЬегтапп I. е1 а1., 2002Ь; ТгоипБоп А. е1 а1., 1987]. В нашей лаборатории был применен и модифицирован метод витрификации, разработанный д.б.н. М. Куваямой в клинике Като, специализирующейся по ЭКО (Токио, Япония) [Кишауата М., 2001]. Метод витрификации основан на быстром воздействии криопротекторов вследствии их повышенной концентрации и на быстром понижении температуры. При витрификации происходит быстрое вытеснение воды из эмбрионов для предотвращения ее кристаллизации в клетках с последующим моментальным переносом эмбрионов в жидкий азот. Многие исследования отмечали значительное возрастание частоты выживаемости эмбрионов при использовании техники витрификации [Е1-БапаБоип I. е1 а1., 2001].

В наши дни криоконсервация эмбрионов является обычным методом программы ЭКО. Однако замораживание ооцитов для использования их затем в ЭКО до сих пор применяется редко и представляет скорее метод экспериментальный, чем клинический, в то время как проблема старения яйцеклетки и становления ее нефункциональности была и остается одной из наиболее серьезных проблем медицины. Поэтому, разработка модификаций метода криоконсервации яйцеклеток и эмбрионов и установление наиболее оптимальных условий его протекания является одним из самых важных направлений программы ЭКО.

Таким образом, целью нашего исследования явилось оценить эффективность метода витрификации эмбрионов и ооцитов человека с помощью сравнения методов медленного замораживания и витрификации, установить наиболее оптимальные условия для успешного проведения витрификации с целью повышения частоты наступления беременностей и имплантации в программе ЭКО и ПЭ.

Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования;

1. Применить метод витрификации и метод медленного замораживания на бластоцистах человека (дня 5 и дня 6 развития).

2. Сравнить частоту выживаемости бластоцист при витрификации и методе медленного замораживания.

3. Сравнить частоту наступления клинической беременности и частоту имплантации при ПЭ после витрификации бластоцист и после использования метода медленного замораживания бластоцист с частотой наступления клинической беременности и имплантации перенесенных бластоцист и морул на день 5 в циклах ЭКО.

4. Сравнить схемы подготовки пациенток к переносу размороженных после медленной криоконсервации эмбрионов и после витрификации.

5. Применить метод витрификации ооцитов и оценить его результаты.

6. Разработать оптимальные условия витрификации ооцитов и эмбрионов человека.

Научная новизна

Применен модифицированный метод витрификации эмбрионов и ооцитов человека. Выявлена высокая частота выживаемости эмбрионов; частоты имплантации и наступления клинической беременности при витрификации по сравнению с методом медленного замораживания. Разработаны условия проведения витрификации, при которых возрастает количество жизнеспособных клеток в каждом эмбрионе.

Практическая значимость

Метод витрификации ооцитов и эмбрионов человека занимает 10-15 минут, в то время как вся процедура медленного замораживания протекает в течение 3-х часов. Таким образом, витрификация позволяет экономить время, а также обходиться без использования дорогостоящего морозильного оборудования. Доля выживших эмбрионов человека при использовании метода витрификации составляет 100%. При витрификации частота наступления беременностей возрастает в 2.4 раза, а частота имплантации - в 4.3 раза по сравнению с методом медленного замораживания.

До настоящего времени пациенты, имеющие замороженные эмбрионы с помощью техники медленной криоконсервации и проходящие цикл стимуляции, всегда шли на риск потери эмбрионов из-за их возможной невыживаемости при их размораживании в день ПЭ. Теперь эта проблема может быть решена, так как при витрифицировании эмбрионов частота их выживаемости заметно возрастает.

Высокие показатели выживаемости яйцеклеток (92.4%) и доли их нормального оплодотворения (83.6%) после витрификации играют важную роль в дальнейшем совершенствовании программы ЭКО в будущем.

Положения, выносимые на защиту;

1. При оптимизации условий проведения витрификации, основанной на понижении токсичности высоких концентраций криопротекторов, возрастает количество таких эмбрионов, в которых большее число клеток сохраняет жизнеспособность.

2. Метод витрификации, как альтернативный метод криоконсервации эмбрионов, является более эффективным чем метод медленного замораживания, что установлено при сравнении результатов частоты выживаемости эмбрионов и ооцитов человека, частоты имплантации и наступления беременностей.

3. Частота имплантации и наступления беременностей не зависит от выбранных схем подготовки пациенток (таких как естественный цикл, а также циклы с применением препаратов фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и препаратов Ьиргоп / Эстроген) к переносу размороженных после криоконсервации эмбрионов.

4. Витрификация ооцитов до сих пор является экспериментальным методом и требует статистически значимых цифр по результатам исследований для оценки его эффективности и использования в клинической практике. В настоящей работе получены обнадеживающие результаты частоты выживаемости витрифицированных ооцитов и частоты их оплодотворения.

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Джамбор, Варвара Воскановна

ВЫВОДЫ

1. Новый, модифицированный нами способ витрификации, основанный на устранении токсичности криопротекторов (через изменение их концентрации и длительности их воздействия), создает лучшие условия, с применением которых повышается частота выживаемости бластомеров эмбриона человека по сравнению с традиционно используемым методом витрификации.

2. Частота выживаемости эмбрионов человека при витрификации возрастает в 1.2 раза по сравнению с частотой их выживаемости при медленной криоконсервации.

3. Частота имплантации возрастает в 4.3 раза, а частота наступления клинической беременности в 2.4 раза при применении метода витрификации по сравнению с техникой медленной криоконсервации эмбрионов человека.

4. При сравнении методов подготовки пациенток к крио циклам не было выявлено зависимости частоты имплантации и частоты наступления беременности от методов подготовки (таких как естественный цикл; а также циклы с применением препаратов ФСГ; препаратов Ьиргоп / Эстроген), а средний возраст женщин сравниваемых групп не имел значительных отличий.

5. Применен метод витрификации ооцитов человека [Кишауаша., 2001], который позволяет получать высокие показатели их выживаемости (92.4%) с последующей частотой их нормального оплодотворения (83.6%).

6. Модифицированный нами метод витрификации финансово более экономичен, по сравнению с методом медленной криоконсервации, и может быть рекомендован для дальнейшего совершенствования не только в медицинской практике, но и ветеринарии и животноводстве.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, при применении метода витрификации ооцитов и эмбрионов человека значительно возрастают такие показатели, как доля выживших эмбрионов, частота наступления беременности и частота имплантации, по сравнению с теми же результатами после проведения метода медленной криоконсервации. Как было выявлено в данной работе, эти результаты не зависели от причин бесплодия и метода подготовки пациенток к циклам овуляции, а средний возраст женщин сравниваемых групп не имел значительных отличий.

При применении метода витрификации ооцитов человека также были получены высокие показатели выживаемости ооцитов и количества ооцитов, нормально прошедших оплодотворение после их размораживания.

Разработанные нами условия проведения витрификации, основанные на понижении концентрации криопротекторов, позволяют повысить жизнеспособность эмбрионов человека.

Разработка данной модификации метода витрификации ооцитов и эмбрионов имеет несомненный экономический народнохозяйственный эффект в животноводстве (при биотехнологической работе с сельскохозяйственными и лабораторными животными).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Джамбор, Варвара Воскановна, Москва

1. Анашкина Г. А., Торганова И. Г., Сперанская Н. В. Гормональная регуляция менструального цикла. Методы оценки эндокринной функции репродуктивной системы // Сб. Научных трудов ВНИЦ ОЗМР СССР. М., 1986. С. 28-37.

2. Берлинский Ю. Преимплантационная генетическая диагностика // Проблемы репродукции, 1996. Т. 4. С. 68-70.

3. Иванов В. И., Курило Л. Ф., Ижевская В. Л. Этические и правовые вопросы клонирования человека // В кн.: Биомедицинская этика. Ред. В.И.Покровский, Ю.М.Лопухин, Москва: Медицина, 2002. Вып. 3. С. 71-76.

4. Курило Л. Ф. Некоторые морально-этические проблемы репродукции человека // В кн.: Биомедицинская этика. Ред. В.И.Покровский, Москва: Медицина, 1997. С. 151-171.

5. Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Сорокина Т.М., Гришина Е.М. Структура наследственных нарушений половой системы. //Вестн. РАМН, 2000, №5. С.32-36.

6. Курило Л. Ф., Шилейко Л. В. Этико-правовые аспекты репродуктивных технологий и технологии эмбриональных стволовых клеток человека // В кн.: Биомедицинская этика. Ред. В.И.Покровский, Ю.М.Лопухин, Москва: Медицина, 2002. Вып. 3. С. 98-114.

7. Курило Л. Ф. Этические и правовые проблемы некоторых биомедицинских технологий // В сб.: Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. Ред. А.Б.Масленников, Новосибирск: Альфа-Вита, 2003. Вып. 4. С. 69-84.

8. Леонов Б. В., Яворовская К. А., Стыгар А. М. и др. Описание случая редукции пятиплодной беременности, наступившей после стимуляции овуляции // Пробл. Репрод. 1995. № 2. С. 49-51.

9. Руководство по эндокринной гинекологии / Под редакцией Е. М. Вихляевой. М.: Мед. инф. Агенство, 1997. С. 9-33,206-214.

10. Филипова Р. Д. Состояние антиспермального иммунитета у женщин с бесплодием и наружным генитальным эндометриозом: Дис. канд. мед. Наук. М., 1993. С. 109.

11. Al-Azemi М., Bernal A., Steele J. et al. Ovarian response to repeated controlled stimulation in in-vitro fertilization cycles in patients with ovarian endometriosis // Hum. Reprod. 2000. Vol. 15. P. 72-75.

12. Ali J., Shelton N. Design of vitrification solutions for the cryopreservation of embryos //J. Reprod. Fertil. 1993a. Vol. 99. P. 471-477.

13. Ali J., Shelton N. Vitrification of preimplantation stages of mouse embryos // J. Reprod. Fertil. 1993b. Vol. 98. P. 459-465.

14. Alikani M., Cohen J., Tomkin G. et al. Human embryo fragmentation in vitro and implications for pregnancy and implantation // Fertil. Steril. 1999. Vol. 71. P. 836-842.

15. Aman R., Parks J. Effects of cooling and rewarming on the meiotic spindle and chromosomes of in vitro-matured bovine oocytes // Biol Reprod. 1994. Vol. 50. P. 103-110.

16. Arav A., Zeron Y. Vitrification of bovine oocytes using modified minimum drop size technique (MDS) is effected by the composition and concentration of the vitrification solution and by the cooling conditions // Theriogenology 1997. Vol. 47. P. 341.

17. Arav A., Zeron Y., Ocheretny A. A new device and method for vitrification increases the cooling rate and allows successful cryopreservation of bovine oocytes // Theriogenology. 2000. Vol. 53. P. 248.

18. Asch R., Balmaceda J., Ellsworth L. et al. Gamete intrafallopian transfer (GIFT): A new treatment for infertility // Int. J. Fertil. 1985. Vol. 30. P. 4145.

19. Ashwood-Smith M., Farrant J. Low temperature preservations in medicine and biology. Piman Press. Bath. 1980.

20. Assisted reproductive technologies: analysis and recommendations for public policy // New York state task force on life and the law. New York. 1998. Chap. 12.

21. Barnes F., Crombie A., Gardner D. et al. Blastocyst development and birth after in vitro maturation of human primary oocytes, intracytoplasmic sperm injection and assisted hatching // Hum. Reprod. 1995. Vol. 10. P. 32433245.

22. Barnes F., Kausche A., Tiglias J. et al. Production of embryos from in vitro matured primary human oocytes // Fertil. Steril. 1996. Vol. 65. P. 11511153.

23. Blake M., Garrisi J., Tomkin G. et al. Sperm deposition site during ICSI affects fertilization and development // Fertil. Steril. 2000. Vol. 73. No. 1. P. 31-37.

24. Blankstein J., Quigley M. Induction of ovulation with gonadotropines // Clinical Reproductive Endocrinology and Infertility. 1991. P. 31-37.

25. Bongso A. Handbook on blastocyst culture. 1999. P. 49-51.

26. Bos-Mikich A., Wood M., Candy C. et al. Cytogenetic analysis and developmental potential of vitrified oocytes // Biol. Reprod. 1995. Vol. 53. P. 780-784.

27. Carroll J., Wood M., Whittingham D. Normal fertilization and development of frozen thawed mouse oocytes: protective action of certain macromolecules // Biol. Reprod. 1993. Vol. 48. P.1993-1996.

28. Cha K., Koo J., Choi D. et al. Pregnancy after in vitro fertilization of human follicular oocytes collected from non-stimulated cycles, their culture in vitro and their transfer in a donor oocyte programm // Fertil. Steril. 1991. Vol. 55. P. 109-113.

29. Chen C. Pregnancies after human oocyte ciyopreservation // Ann. NY Acad. Sci. 541. 1988. P. 541-549.

30. Chen S., Lien Y., Chao K. et al. Cryopreservation of mature human oocytes by vitrification with ethylene glycol in straws // Fertil. Steril. 2000a. Vol. 74. P. 804-808.

31. Chen S., Lien Y., Chen H. et al. Open pulled straws for vitrification of mature mouse oocytes preserve patterns of meiotic spindles and chromosomes better than conventional straws // Hum. Reprod. 2000b. Vol. 15. P. 2598-2603.

32. Chian R., Gulekli B., Buckett W. et al. Pregnancy and delivery after cryopreservation of zygotes produced by in-vitro matured oocytes retrieved from a woman with polycystic ovarian syndrome // Hum. Reprod. 2001. Vol. 16. P. 1700-1702.

33. Chung H., Hong S., Lim J. et al. In vitro blastocyst formation of human oocytes obtained from unstimulated and stimulated cycles after vitrification at various maturational stages // Fertil. Steril. 2000. Vol. 73. P. 545-551.

34. Claman P., Armant D., Seibe M. et al. The impact of embryo quality and quantity on implantation and the establishment of viable pregnancies // Jour. In Vitro Fert. Embryo Transf. 1987. Vol. 4. P. 218-222.

35. Cobo A., Requena A., Neuspiller F. et al. Maturation in vitro of human oocytes from unstimulated cycles: selection of the optimal day for ovumretrieval based on follicular size // Hum. Reprod. 1999. Vol. 14. P. 18641868.

36. Cohen J., Simons R., Edwards R. et al. Pregnancies following the storage of expanding human blastocysts // Jour. In Vitro Fert. Embryo Transfer 1985. Vol. 2. P. 59-64.

37. Cohen J., Edwards R. Responses to nine questions concerning research of human embryos // Hum. Reprod. 1986. Vol. 1. P. 263-269.

38. Cole H., Hart G. The potency of blood serum of mares in progressive stages of pregnancy in effecting the sexualmaturity of the immune rate // Am. J. Physiol. 1930. Vol. 93. P. 57.

39. Critser J., Agca Y., Gunasena K. The cryobiology of mammalian oocytes. In: Karow A.M., Critser J.K. (eds.) // Reproductive Tissue Banking. San Diego. Academic Press. 1997. P. 329-357.

40. Dawson K. Human embryo experimentation: a background paper and select bibliography // National Bioethics Consultative Committee. Adelaide. 1990. Chap. 23.

41. Dawson K., Trounson A. Ethics of sex selection for family balancing: why balance families? // Hum. Reprod. 1996. Vol. 11. P. 2577-2580.

42. De Kretzer D., Dennis P., Hudson B. et al. Transfer of a human zygote // Lancet. 1973. Vol. 2. P. 728.

43. Delhanty J., Griffin D., Handyside A. et al. Detection of anaploidy and mosaicism in human embryos during preimplantation sex determination by FISH // Hum. Mol. Genet. 1993. Vol. 2. P. 1183-1185.

44. Desai N., Goldstein J., Rowland D. et al. Morphological evaluation of human embryos and derivation of an embryo quality scoring system specific for day 3 embryos: a preliminary study // Hum. Reprod. 2000. Vol. 15. P. 2190 2196.

45. Devroey P., Liu J., Nagy Z. et al. Pregnancies after testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection in non-obstructive azoospermia//Hum. Reprod. 1995. Vol. 10. P. 1457-1460

46. Devroey P., Nagy Z., Tournaye H. et al. Outcome of intracytoplasmic sperm injection with testicular spermatozoa in obstructive and nonobstructive azoospermia//Hum. Reprod. 1996. Vol. 11. P. 1015-1018.

47. Devroey P., Staessen C., Camus M. Zygote intrafallopian transfer as successful treatment for unexplained infertility // Fertil. Steril. 1989. Vol. 52 P. 875-876.

48. Diez C., Le Bourhis D., Heyman Y. et al. Effect of partial lipid removal from in vitro produced bovine zygotes on further development in vitro and on the freezing tolerance of blastocysts // Theriogenology. 1996. Vol. 45. P. 166.

49. Dokras A., Sargent I., Barlow D. Human blastocyst grading: an indicator of developmental potential? // Hum. Reprod. 1993. Vol. 8. P. 2119-2127.

50. Dolian G., Alexaniaats S., Tatevosian M. Some hormonal indeces at women with induced ovulation pregnancy // J. Perinat. Medicine. 1991. Vol. 19(2). P. 115.

51. Dumoulin J., Bergers-Janssen J., Pieters M. et al. The protective effects of polymers in the cryopreservation of human and mouse zonae pellucidae and embryos // Fertil. Steril. 1994. Vol. 62. P. 793-798.

52. Dvorak M. Ultrastructure and quantitative analysis of mouse and human oocytes. In: Liss AR (ed.), Developments in Ultrastructure of Reproduction // New York: Academic Press. 1989. P. 273-280.

53. Edgar D., Bourne H., Speirs A. et al. A quantitative analysis of the impact of cryopreservation on the implantation potential of human early cleavage stage embryos // Hum. Reprod. 2000. Vol. P. 175 179.

54. Edwards R. Maturation in vitro of mouse, sheep, cow, pig, rhesus monkey and human ovarian oocytes //Nature. 1965. Vol. 208. P. 349-351.

55. Edwards R., Brody S. Principles and Practice of Assisted Human Reproduction// Saunders. 1995. Philadelphia.

56. El-Danasouri I., Selman H. Successful pregnancies and deliveries after a simple vitrification protocol for day 3 human embryos // Fertil Steril. 2001. Vol. 76. P. 400-4002.

57. Elliot K., Whelan J. The freezing of mammalian embryos. CIBA foundation symposium 52. Elsevier / North Holland, Amsterdam. 1977.

58. Emiliani S., Van den Bergh M., Vannin A.S. et al. Comparison of ethylene glycol, 1,2-propanediol, and glycerol for cryopreservation of slow-cooled mouse zygotes, 4-cell embryos, and blastocysts // Hum. Reprod. 2000. Vol. 15. P. 905-910.

59. Endocrinology ( Basic and Clinical Principles) / Ed. P. Michael Conn and Shlomo Melmed. Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997. P. 183-223.

60. Englert J. et al. The protection of the human embryo in vitro. Report by the Working Party on the Protection of the Human Embryo and Fetus (CDBI-CO-GT3). Steering Committee on bioethics of Council of Europe (CDBI) // Strasbourg, 19 June 2003.

61. Eppig J. Oocyte maturation // In Vitro Fert. and Assist. Reprod. 1997. Monduzzi Editore. Bologna. P. 133-138.

62. Fahy G. Vitrification: a new approach to organ cryopreservation. In: Meryman H.T. (ed.) // Transplantation: Approaches to Graft Rejection. New York, AlanRLiss. 1986. P. 305-335.

63. Fahy G., MacFarlane D., Angell C. et al. Vitrification as an approach to cryopreservation//Cryobiology. 1984. Vol. 21. P. 407-426.

64. Fehilly C., Cohen J., Simmons R. et al. Cryopreservation of cleaving embryos and expanded blastocysts in the human: a comparative study // Fertil. Steril. 1985. Vol. 44. P. 638-644.

65. Ferraretti A., Gianaroli L., Magli C. et al. Elective cryopreservation of all pronucleate embiyos in women at risk of ovarian hyperstimulation syndrome: efficiency and safety // Hum. Reprod. 1999. Vol. 14. P. 14571460.

66. Fleming R., Howies C. New trends in superovulation // Science and Medicine. 1991. P. 3-25.

67. Fleming R., Jamieson M., McQueen D. et al. Follicular phase initiation of GnRH-a theory for ovarian stimulation // GnRH analogues in Obstretics and Gynecology. 1990. Vol. 3. P. 71-78.

68. Franks S., Mason H., Willis D. Disoders of folliculogenesis in polycystic ovary syndrom // Ovulation induction. 1998. P. 37-40.

69. Freedman M., Farber M., Farmer L. et al. Pregnancy resulting from cryopreserved human embryos using a one-step in situ dilution procedure // Obstet. Gynecol. 1988. Vol. 72. P. 502-505.

70. Fridstrom M., Carlstrom K., Sjoblom P. et al. Effect of prednisolone on serum and follicular fluid androgen concentrations in women with polycystic ovary syndrome undergoing in-vitro fertilization // Hum. Reprod. 1999. Vol. 14 P. 1440-1444.

71. Friedler S., Mashiach S., Laufer N. Births in Israel 1982-1989: National Registry of the Israeli Association resulting from in-vitro fertilization/embryo transfer, for Fertility Research // Hum. Reprod. 1992. Vol. 7. P. 1159-1163.

72. Fritz M., Speroff L. Current conceptions of the endocrine characteristics of normal menstrual function: the key to diagnosis and management of menstrual disorders // Clin. Obstetr. And Gynecol. 1983. Vol. 26. P. 647689.

73. Gardner D., Lane M., Stevens J. et al. Changing the start temperature and cooling rate in a slow freezing protocol increases human blastocyst viability // Fertil. Steril. 2003. Vol. 79. P. 407-410.

74. Gissler M., Malin Silverio M., Hemminki E. In vitro fertilization pregnancies and perinatal health in Finlandin 1991 to 1993 // Hum. Reprod. 1995. Vol. 10. P. 1856-1861.

75. Glenister P., Wood M., Kirby C. et al. The incidence of chromosome anomalies in first cleavage mouse embryos obtained from frozen-thawed oocytes fertilized in vitro // Gamete Res. 1987. Vol. 16. P. 205-206.

76. Gougeon A. Dynamics of follicular growth in the human: a model from preliminary results // Hum. Reprod. 1986. Vol. 1. P. 81-87.

77. Gook D., Osborn S., Bourne H. et al. Fertilization of human oocytes following cryopreservation; normal karyotypes and absence of stray chromosomes //Hum. Reprod. 1994. Vol. 9. P. 684-686.

78. Gook D., Osborn S., Johnston W. Cryopreservation of mouse and human oocytes using 1,2-propanediol and the configuration of the meiotic spindle // Hum. Reprod. 1993. Vol. 8. P. 1101-1102.

79. Gorus F., Pipeleers D. A rapid method for the fractionation of human spermatozoa according to their progressive motility // Fertil. Steril. 1981. Vol. 35. P. 662-665.

80. Gutierrez A., Garde J., Artiga C. et al. In vitro survival of murine morulae after quick freezing in the presence of chemically defined macromolecules and different cryoprotectants // Theriogenology. 1993. Vol. 39. P. 11111115.

81. Hardarson T., Hanson C., Sjogren A. et al. Human embryos with unevenly sized blastomeres have lower pregnancy and implantation rates: indications for aneuploidy and multinucleation // Hum. Reprod. 2001. Vol. 16. P. 313-318.

82. Hardy K. Development of human blastocysts in vitro. Serono Symposium on Preimplantation Embryo Development. 1993. Chapter 14. P. 184-199.

83. Hirsh A. Vitrification in plants as a natural form of ciyoprotection // Cryobiology. 1987. Vol. 24. P. 214-228.

84. Homburg R., Levy T., Berkovitz D., Farchi J. et al. Gonadotropin-releasing hormone agonist reduses the miscarriage rate for pregnancies achieved in women with polycystic ovarian syndrome // Fertil. Steril. 1993. Vol. 59. P. 527-531.

85. Hong S., Chung H., Lim J. et al. Improved human oocyte development after vitrification: a comparison of thawing methods // Fertil. Steril. 1999. Vol. 72. P. 142-146.

86. Howies C., Macnamee B. The endocrinology of superovulation: lessons from assisted conception therapy // Experta Medica. 1989. P. 3-18.

87. Hunter J., Fuller B., Bernard A. et al. Fertilization and development of the human oocyte following exposure to cryoprotectants, low temperatures and cryopreservation: a comparison of two techniques // Hum. Reprod. 1991. Vol. 6. P. 1460-1462.

88. Hurtt A., Landim-Alvarenga F., Seidel G. et al. Vitrification of immature and mature equine and bovine oocytes in an ethylene glycol, Ficoll, and sucrose solution using open-pulled straws // Theriogenology. 2000. Vol. 54. P. 119-128.

89. Imoedemhe D., Sigue A. Survival of human oocytes cryopreserved with or without the cumulus in 1,2-propanediol // Jour. Assist. Reprod. Genet. 1992. Vol. 9. P. 323-324.

90. Isachenko V., Alabart J., Nawroth F. et al. The open pulled straw vitrification of ovine GV oocytes: positive effect of rapid cooling or rapid thawing or both? // Ciyo Lett. 2001. Vol. 22. P. 157-162.

91. Jackowski S., Leibo S., Mazur P. Glycerol permeabilities of fertilized and unfertilized mouse ova //Exp. Zool. 1980. Vol. 212. P. 329-333.

92. Jacobs H. Polycystic ovaries and polycystic ovary syndrome // Gynecol. Endocrinol. 1987. № 1. P. 113-131.

93. Janny L., Menezo Y. Evidence for a strong paternal effect on human preimplantation embryo development and blastocyst formation // Mol. Reprod. Dev. 1994 Vol. 38. P. 36-42.

94. Janny L., Menezo Y. Maternal age effect on early human embryonic development and blastocyst formation // Mol. Reprod. Dev. 1996. Vol. 45. P. 31-37.

95. Jaroudi K., Hollanders J., Sieck U. et al. Pregnancy after transfer of embryos which were generated from in vitro matured oocytes // Hum. Reprod. 1997. Vol. 12. P. 857-859.

96. Jelinkova L., Selman H., Arav A. et al. Twin pregnancy after vitrification of 2-pronuclei human embryos // Fertil. Steril. 2002. Vol. 77. P. 412-414.

97. Jeulin C., Feneux D., Serres C. et al. Sperm factors related to failure of human in vitro fertilization // J. Reprod. Fertil. 1986. Vol. 76. P. 1-4.

98. Kanno H., Speedy R., Angell C. Supercooling of water to -96°C under pressure // Science. 1975. Vol. 189. P. 880-881.

99. Karow A., Liu W., Humphries A. Survival of dog kidneys subjected to high pressures: necrosis of kidneys after freezing // Cryobiology. 1970. Vol. 7.P.122-128.

100. Kasai M., Hamguchi Y., Zhu S. et al. High survival of rabbit morulae after vitrification in an ethylene glycol based solution by a simple method // Biol. Reprod. 1992. Vol. 46. P. 1042-1048.

101. Kasai M., Komi J., Takakamo A. et al. A simple method for mouse embryo cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability // J Reprod Fertil. 1990. Vol. 89. P. 91-97.

102. Keel B., May J., DeLonge C. Handbook of the assisted reproduction laboratory. 2000. P. 264-266.

103. Khan I., Staessen C., Van den Abbeel E. et al. Time of insemination and its effect on in-vitro fertilization, cleavage and pregnancy rates in GnRH agonist/HMG-stimulated cycles // Hum. Reprod. 1989. Vol. 4. P. 921 926.

104. Klotzko A. The debate about Dolly // Bioethics. 1997. Vol. 11. P. 427-429

105. Knobil E. The neuroendocrine control of the menstrual cycle // Recent. Prog. Horm. Res. 1980. Vol. 36. P. 53-88.

106. Kodama H., Fukuda J., Karube H. et al. High incidence of embryo transfer cancellations in patients with polycystic ovarian syndrome // Hum. Reprod. 1995. Vol. 10. P. 1962-1967.

107. Kola I., Kirby C., Shaw J. et al. Vitrification of mouse oocytes results in aneuploid zygotes and malformed fetuses // Teratology. 1988. Vol. 38. P. 267-269.

108. Krueger T., Acosta A., Simmons K. et al. Predictive value of abnormal sperm morphology in vitro fertilization // Fertil. Steril. 1988. Vol. 49. P. 112-115.

109. Kuleshova L., Gianaroli L., Magli C. et al. Birth following vitrification of a small number of human oocytes: case report // Hum. Reprod. 1999a. Vol. 14. P. 3077-3079.

110. Kuleshova L., MacFarlane D., Trounson A. et al. Sugars exert a major influence on the vitrification properties of ethylene glycol-based solutions and have a low toxicity to embryos and oocytes // Cryobiology. 1999b. Vol.38. P. 119-130.

111. Kuleshova L., Shaw J., Trounson A. Studies on replacing most of the penetrating cryoprotectant by polymers for embryo cryopreservation // Cryobiology. 2001. Vol. 43. P. 21-31.

112. Kuwayama M. Vitrification of human oocytes and embryos. In Suzuki S (ed.) IVF Updatein Japanese. // Medical View Co. Tokyo, Japan. 2001. P. 230-234.

113. Kuwayama M., Kato O. All round vitrification of human oocytes and embryos J. Assist. Reprod. Genet. 2000a. Vol. 17. P. 477.

114. Kuwayama M., Kato O. Successful vitrification of human oocytes // Fertil. Steril. 2000b. Vol. 74. P. 349.

115. Lane M., Bavister B., Lyons E. et al. Container-less vitrification of mammalian oocytes and embryos // Nat. Biotechnol. 1999a. Vol. 17. P. 1234-1236.

116. Lane M., Schoolcraft W., Gardner D. Vitrification of mouse and human blastocysts using a novel cryoloop container-less technique // Fertil. Steril. 1999b. Vol.72. P. 1073-1078.

117. Lehninger A. Biochemistry: The Molecular Basis of Cell Structure and Function // New York: Worth Publishers. 1972.

118. Leibo S. Water permiability and it's activation energy of fertilized and unfertilized mouse ova //Membr. Biol. 1980. Vol. 53. P. 179-182.

119. Leibo S., McGrath J., Cravalho E. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate // Cryobiology. 1978. Vol. 15. P 257-259.

120. Lewin A., Schenker J., Safran A. et al. Embryo growth rate in vitro as an indicator of embryo quality in IVF cycles // Jour. Assist. Reprod. Genet. 1994. Vol. 11. P. 500-503.

121. Liebermann J., Tucker M. Effect of carrier system on the yield of human oocytes and embryos as assessed by survival and developmental potential after vitrification // Reproduction. 2002a. Vol. 124. P. 483-489.

122. Liebermann J., Nawroth F., Isachenko V. et al. Potential importance of vitrification in reproductive medicine // Biol. Reprod. 2002b. Vol. 67. P. 1671-1680.

123. Liebermann J., Tucker M., Graham J. et al. Mathiopoulou H., Stillman R., Levy M. The importance of cooling rate for successful vitrification of human oocytes: comparison of the cryoloop with the flexipet // Biol. Reprod. 2002c. Vol. 66. P. 1195.

124. Liebermann J., Tucker M., Graham J. et al. Blastocyst development after vitrification of multipronucleate zygotes using the flexipet denuding pipette (FDP) // RBMOnline. 2002d. Vol. 4. P. 148-52.

125. Liu D., Baker H. A new test for the assessment of sperm-zona pellucida penetration: relationship with results of other sperm tests and fertilization in vitro // Hum. Reprod. 1994. Vol. 9. P. 489-491.

126. Liu D., Baker H. Tests of human sperm function and fertilization in vitro // Fértil. Steril. 1992. Vol. 58. P. 465-467.

127. Liu J., Katz E., Garcia J. et al. Successful in vitro maturation of human oocytes not exposed to human chorionic gonadotropin during ovulation induction, resulting in pregnancy // Fértil. Steril. 1997. Vol. 67. P. 566568.

128. Liu J., Nagy Z., Joris H. et al. Analysis of 76 total fertilization failure cycles out of 2732 intracytoplasmic sperm injection cycles // Hum. Reprod. 1995. Vol. 10. P. 2630-2634.

129. London S., Haney A., Weinberg J. Macrophages and Infertility: Enhancement of Human Macrophage-mediated Sperm Killing by Antisperm Antibodies //Fértil. Steril. 1985. Vol. 43. P. 274-282.

130. Luyet B. The vitrification of organic colloids and of protoplasm // Biodynamica. 1937. Vol. 1. P. 1-14.

131. MacDougall M., Tan S., Balen A. et al. A controlled study comparing patients with and without polycystic ovaries undergoing in in vitro fertilization//Hum. Reprod. 1993. Vol. 8. P. 233-237.

132. MacFarlane D. Physical aspects of vitrification in aqueous solutions // Cryobiology. 1987. Vol. 24. P. 181-195.

133. MacFarlane D., Scheirer J., Smedley S. Pressure coefficient of conductance and of glass transition temperatures in concentrated aqueous LiCl, Lil, and A1C13 solutions // J. Phys. Chem. 1986. Vol. 90 P. 21682173.

134. Macnamee M., Howies C., Edwards A. Short term luteinizing hormone releasing hormone agonist: prospective trial of a novel ovarian stimulation regiment for in vitro fertilization // Fértil. Steril. 1989. Vol. 52. P. 264-269.

135. Magistrini M., Szollosi D. Effects of cold and isopropyl-N-phenylcarbamate on the second meiotic spindle of mouse oocytes // Eur. J. Cell Biol. 1980. Vol. 22. P. 699-707.

136. Marek D., Langley M., Gardner D. et al. Introduction of blastocyst culture and transfer for all patients in an in vitro fertilization program // Fertil. Steril. 1999. Vol. 72. P. 1035-1040.

137. Maro B., Howlett S., Webb M. Nonspindle microtubule organization centers in metaphase II-arrested mouse oocytes // Cell Biol. 1985. Vol. 101. P. 1665-1672.

138. Martino A., Songsasen N., Leibo S. Development into blastocysts of bovine oocytes cryopreserved by ultrarapid cooling // Biol. Reprod. 1996. Vol. 54. P. 1059-1069.

139. Matsumoto H., Jiang J., Tanaka T. et al. Vitrification of large quantities of immature bovine oocytes using nylon mesh // Cryobiology. 2001. Vol. 42. P. 139-144.

140. Mazur P. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos // Cell Biophys. 1990. Vol. 17. P. 53-56.

141. Menezo Y., Nicollet B., Herbaut N. et al. Freezing cocultured human blastocysts //Fertil. Steril. 1992. Vol. 58. P. 977-980.

142. Mills M., Eddowers H., Cahill D. et al. A prospective controlled study of in-vitro fertilization, gamete intra-fallopian transfer and intrauterine insemination combined with superovulation // Hum. Reprod. 1993. Vol. 7. p. 490-494.

143. Minguez Y., Rubio C., Bernal A. et al. The impact of endometriosis in couples undergoing intracytoplasmic sperm injection because of male infertility // Hum. Reprod. 1997. Vol. 12. P. 2282 2285.

144. Mordel N., Zajicek G., Simon A. et al. Evidence for better follicular synchronization in combined gonadotropin releasing hormone agonist -human menopausal gonadotropin treatment for in vitro fertilization: The

145. Proceedings of the 2nd Intern. Symp. On GnRH Analogues in Cancer and

146. Human Reproduction. Geneva, November, 1990. P. 15-20.

147. MRC Working Party. Births in Great Britain resulting from assisted conception 1978-87 // British Medical Journal. 1990. Vol. 300. P. 12291233.

148. Mukaida T., Nakamura S., Tomiyama T. et al. Successful birth after transfer of vitrified human blastocysts with use of a cryoloop container-less technique // Fertil. Steril. 2001. Vol. 76. P. 618-623.

149. Nagashima H., Kashiwasaki N., Ashman R. et al. Recent advances in cryopreservation of porcine embryos // Theriogenology. 1994. Vol. 41. P. 113-118.

150. Nagashima H., Kashiwazaki N., Asman R. et al. Cryopreservation of porcine embryos //Nature. 1995. Vol. 374. P. 416-417.

151. Nagashima H., Kuwayama M., Grupen C. et al. Vitrification of porcineearly cleavage stage embryos and oocytes after removal of cytoplasmic lipid droplets // Theriogenology. 1996. Vol. 45. P. 180.

152. Nagy Z., Verhyen G., Tournaye H. et al. Special applications on intracytoplasmic sperm injection: the influence of sperm count, motility, morphology, source and sperm antibody on the outcome of ICSI // Hum. Reprod. 1998. Vol. 13. P. 143-154.

153. Nakayma T., Goto Y., Kanzaki H. et al. Developmental potential of frozen thawed human blastocysts // Jour. Assist. Reprod. Genet. 1995. Vol. 12. P. 239-243.

154. Navot D. Practical guidelines to prevention and management of ovarian hyperstimiluation syndrome// Serono fertility series. 1997. Vol. 1 P. 59-68.

155. Ng S., Liow S., Sathananthan H. et al. Review: Microinjection of human sperm directly into human oocytes // J. Assist. Reprod. Genet. 1993. Vol. 10. P. 337-339.s

156. Ng, S., Liow S., Ahmad A. et al. Sperm microinjection, in Visual Atlas Human Sperm Structure and Function for Assisted Reproductive Technology// Serono, Singapore. 1996. P. 175-178.

157. Niemann H., Lucas-Hahn A., Stoffregen C. Cryopreservation of bovine oocytes and embryos following microsurgical operation // Mol. Reprod. Dev. 1993. Vol. 36. P. 232-235.

158. Nygren K., Nyboe Andersen A. Assisted reproductive technology in Europe 1997. Results generated fromEuropean registers by ESHRE // Hum. Reprod. 2001. Vol. 16. P. 284-291.

159. Oberstein N., O'Donovan M., Bruemmer J. et al. Cryopreservation of equine embryos by open pulled straws, cryoloop, or conventional cooling methods // Theriogenology. 2001. Vol. 15. P. 607-613.

160. O'Neill L., Paynter S., Fuller B. Vitrification of mature mouse oocytes: Improved results following addition of polyethylene glycol to a dimethyl sulfoxide solution // Cryobiology. 1997. Vol. 34. P. 295-301.162. Organon, IVF News. 1997.

161. Page D., Siber S., Brown L. Men with infertility caused by AZFc deletion can produce sons by introcytiplasmic sperm injection, but are likely to transmit the deletion and infertility // Hum. Reprod. 1999. Vol. 14. P. 1722-1726.

162. Palermo G., Joris H., Devroey P. et al. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte // Lancet. 1992. Vol. 340. No. 8810. P. 17-18.

163. Park S., Kim E., Kim D. et al. Simple, efficient and successful vitrification of bovine blastocysts using electron microscopic grid // Hum. Reprod. 1999. Vol. 14. P. 2838-2843.

164. Park S., Kim E., Oh J. et al. Ultrarapid freezing of human multipronuclear zygotes using electron microscope grids // Hum. Reprod. 2000. Vol. 15. P. 1787-1790.

165. Parks J., Graham J. Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes //Theriogenology. 1992. Vol. 38. P. 209-211.

166. Parks J., Ruffin N. Factors affecting low temperature survival of mammalian oocytes // Theriogenology. 1992. Vol. 37. P. 59-73.

167. Pedro P., Zhu S., Makino N. et al. Effects of hypotonic stress on the survival of mouse oocytes and embryos at various stages // Cryobiology. 1997. Vol. 35. P. 150-158.

168. Pickering S., Braude P., Johnson M. et al. Transient cooling to room temperature can cause irreversible disruption of the meiotic sprindle in the human oocyte//Fértil. Steril. 1990. Vol. 54. P. 102-108.

169. Pickering S., Johnson M. The influence of cooling on the organization of the meiotic spindle of the mouse oocytes // Hum Reprod. 1987. Vol. 2. P. 207-216.

170. Pollard J., Leibo S. Chilling sensitivity of mammalian embryos // Theriogenology. 1994. Vol. 41. P. 101-104.

171. Porcu E., Fabbri R., Seracchioli R. Birth of a healthy female after intracytoplasmic sperm injection of cryopreserved human oocytes // Fértil. Steril. 1997. Vol. 68. P. 724-726.

172. Pregnancies and births resulting from in vitro fertilization // Fértil. Steril., 1995. Vol. 64. P. 746-756. FIVNAT (French In vitro National).

173. Quinn P. Principles of membrane stability and phase behavior under extreme conditions // J. Bioenerg Biomembr. 1989. Vol. 21. P. 3-19.

174. Rail W., Fahy G. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification//Nature. 1985. Vol. 313. P. 573-575.

175. Richard D., Búfalos M., Terence Lee C. Polycystic ovary syndrome: pathophysiology and results of in vitro fertilization // Fértil. Steril. 1996. Vol. 65. P. 5-11.

176. Roest J., Mous H., Zeimaker G. et al. The incidence of major clinical complications in a Dutch transport IVF program // Hum. Reprod. 1996. Vol. 2. P. 345-353.

177. Ruffing N., Steponkus P., Pitt R. et al. Osmometric behavior, hydraulic conductivity, and incidence of intracellular ice formation in bovine oocytes at different developmental stages // Cryobiology. 1993. Vol. 30. P. 562580.

178. Russel J., Knezevich K., Fabian K. et al. Unstimulated immature oocyte retrieval: early vs. mid follicular endometrial priming // Fertil. Steril. 1997. Vol. 67. P. 616-620.

179. Sampalo M., Serra V., Miro F. et al. Development of ovarian cysts during GnRH analogues administration // Hum. Reprod. Abstracts of the 2nd ESCO-ESHRE Meeting. Milan. 1990. P. 115.

180. Sathananthan A. Ultrastructural changes during meiotic maturation in mammalian oocytes: unique aspects of the human oocyte // Microsc Res Tech. 1994. Vol. 27. P. 145-164.

181. Sathananthan A., Kirby C., Peura A. et al. Mouse oocyte cooling // J. Assist Reprod Genet. 1992. Vol. 9. P. 139-148.

182. Scott L., Alvero R., Leondires M. et al. Pronuclear morphology // Hum. Reprod. 2000. Vol. 15. P. 1- 10.

183. Selman H., El-Danasouri I. Pregnancies derived from vitrified human zygotes// Fertil. Steril. 2002. Vol. 77. P. 422-423.

184. Senor S., Glekli B., Turhan N. et al. Does the suppression criteria in GnRHa cycles predict in vitro fertilization outcome // Hum. Reprod. 1993. Vol. 8. P. 154.

185. Shaw J., Diotavellevi L., Trounson A. A simple rapid dimethyl sulphoxide freezing technique for the cryopreservation of one-cell to blastocyst stage preimplantation mouse embryos // Reprod. Fertil. 1991. Vol. 3. P. 621-623.

186. Shaw J., Kuleshova L., MacFarlane D. et al. Vitrification properties of solutions of ethylene glycol in saline containing PVP, Ficoll, or dextran // Cryobiology. 1997. Vol. 35. P. 219-229.

187. Shea B., Baker R., Latuor J. Human follicular oocytes and their matiration in vitro // Fertil. Steril. 1975. Vol. 26. P. 1075-1082.

188. Shulman A., Gen-nun I., Ghetler Y. et al. Relationship between embryo morphology and implantation rate after in vitro fertilization treatment in conception cycles // Fértil. Steril. 1993. Vol. 60. P. 123-126.

189. Simon C., Guiterrez A., Vidal A. et al. Outcome with patients with endometriosis in assisted reproduction: results from in-vitro fertilization and oocyte donation // Hum. Reprod. 1994. Vol. 9. P. 725-729.

190. Somerville C. Direct test of the role of membrane lipid composition in low temperature induced photoinhibition and chilling sensitivity in plants and cyanobacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. Vol. 92. P. 6215-6218.

191. Sperling K. Frequency and origin of chromosome abnormalities in man // Mutation in map. 1984. Springer Berlin, Heidelberg, N-Y.

192. Speroff L., Glass R., Kase N. Clinical Gynecologic Endocrinology and infertility // Fifth Edition. Baltimore, Maryland, USA, 1994.

193. Stadtmauer L., Wong B., Oehninger S. Should patients with polycystic ovary syndrome be treated with metformin?: Benefits of insulin sensitizing drugs in polycystic ovary syndrome—beyond ovulation induction // Hum. Reprod. 2002. Vol. 17. P. 3016-3026.

194. Staessen C., Devroey P., Camus M. et al. The relationship between embryo quality and the occurrence of multiple pregnancies // Fértil. Steril. 1992. Vol. 57. P. 626-630.

195. Steptoe P., Edwards R., Walters D. Observations on 767 clinical pregnancies and 500 birth after human in vitro fertilization // Hum. Reprod. 1986. Vol. 1. P. 89-98.

196. Steptoe P., Edwards R. Preimplantation of a human embryo with subsequent tubal pregnancy // Lancet. 1976. Vol. 1. P. 880.

197. Steptoe P., Edwards R. Birth after the preimplantation of a human embryo //Lancet. 1978. Vol. 2. P. 366.

198. Steward J., Hamilton P., Murdoch A. Thromboembolic disease associated with ovarian stimulation and assisted conception techniques // Hum. Reprod. 1997. Vol. 12. P. 2167-2173.

199. Sutton R. Organ cryopreservation // Chem Br. 1991. Vol. 27. P. 432-434.

200. Tarin J., Trounson A. Effects of stimulation or inhibition of lipid peroxidation on freezing thawing of mouse embryos // Biol. Reprod. 1993. Vol. 49. P. 1362-1364.

201. Todorow S., Siebzehnrubi E., Spitzer M. et al. Comparative results on survival of human and animal eggs using different cryoprotectants and freeze-thawing regimens. II human // Hum. Reprod. 1989. Vol. 4/ P/ 812815.

202. Toth T., Baka S., Veeck L. et al. Fertilization and in vitro development of cryopreserved human prophase I oocytes // Fertil. Steril. 1994a. Vol. 61. P. 891-893.

203. Toth T., Lanzendorf S., Sandow B. et al. Cryopreservation of human prophase I oocytes collected from unstimulated follicles // Fertil. Steril. 1994b. Vol. 61. P. 1077-1079.

204. Trounson A., Mohr L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing, and transfer of an eight-cell embryo// Nature. 1983. Vol. 305. P. 707-709.

205. Trounson A., Peura A., Freemann L. et al. Ultrarapid freezing of early cleavage stage human embryos and eight cell mouse embryos // Fertil. Steril. 1988. Vol. 49. P. 822-826.

206. Trounson A., Peura A., Kirby C. Ultrarapid freezing: a new low cost and effective method of embryo cryopreservation // Fertil. Steril. 1987. Vol. 48. P. 843-850.

207. Trounson A., Wood C., Kausche A. In vitro maturation and the fertilization and developmental competence of oocytes recovered from untreated polycystic ovarian petients // Fertil. Steril. 1994. Vol. 62. P. 353362.

208. Tucker M., Morton P., Wright G. et al. Clinical application of human egg cryopreservation//Hum. Reprod. 1998.Vol. 13. No. 11. P. 3156-3159.

209. Tucker M., Wright G., Morton P. et al. Preliminary experience with human oocyte cryopreservation using 1,2-propanediol and sucrose // Hum. Reprod. 1996. Vol. 11. P. 1513-1515.

210. Vajta G., Booth P., Holm P. et al. Successful vitrification of early stage bovine in vitro produced embryos with the open pulled straw (OPS) method // Ciyo Lett. 1997. Vol. 18. P. 191-195.

211. Vajta G., Holm P., Kuwayama M. et al. Open pulled straws (OPS) vitrification: a new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos // Mol. Reprod. Dev. 1998. Vol. 51. P. 53-58.

212. Van der Elst J., Camus M., Van den Abbeel E. et al. Prospective randomised study on the cryopreservation of human embryos with dimethylsulfoxide or 1,2-propanediol protocols // Fertil. Steril. 1995. Vol. 63. P. 92-94.

213. Van Kooij R. Fertilization practice // Laboratory aspects of in vitro fertilization / Eds.: Bras M., Lens J., Piederiet M. et al. The Niderlands: N. V. Organon, 1996. P. 147-164.

214. Van Steirteghem, A., Nagy, Z., Joris, H. et al. High fertilization and implantation rates after intracytoplasmic sperm injection // Hum. Reprod. 1993. Vol. 8. P. 1061-1064.

215. Van Steirteghem, A., Nagy, Z., Liu, J. et al. Intracytoplasmic sperm injection ICSI // Reprod. Med. Rev. 1994. Vol. 3. P. 199-201.

216. Van Uem., Siebzehuruble E., Schuh B. et al. Birth after cryopreservation of unfertilized oocytes // Lancet. 1987. Vol. 1. P. 752-753.

217. Vandervorst M., Vanderzwalmen P., Standaart V. et al. Blastocyst transfer after vitrification in a hemistraw (HS) system // Hum. Reprod. 2001. Vol. 16. P. 1153-154.

218. Vanderzwalmen P., Bertin G., Debauche Ch. et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification // Hum. Reprod. 2002. Vol. 17. P. 744-751.

219. Virant-Klun I., Tomazevic T., Bacer-Kermavner L. et al. Successful freezing and thawing of blastocysts cultured in sequential media using a modified method // Fertil. Steril. 2003. Vol. 79. P. 1428-1433.

220. Von Düring V. Pregnancies, births and infants after in-vitro fertilization in Norway (Norwegian) // Tidsskrift for den Norske Laegeforening. 1995. Vol. 115. P. 2054-2060.

221. Whittemore A., Harris R., Itnyre J. and Collaborative Cancer Group Characteristics relating to ovarian cancer risk: collaborative analysis of 12 US case control studies // Am. J. Epidemiol. 1992. Vol. 136. P. 11841203.

222. Whittingham D., Leibo S., Mazur P. Survival of mouse embryos frozen to -196°C and-269°C//Science. 1972. Vol. 178. P. 411-413.

223. Wilmut I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent, and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing//Life Sei. 1972. Vol. IIP. 1071-1074.

224. World Health Organization (WHO). Laboratory manual for the examination of human semen and semen-cervical mucus interaction. UK: Cambridge University Press, 1999. 129 P.

225. Yeoman R., Gerami-Naini B., Mitalipov S. et al. Cryoloop vitrification yields superior survival of rhesus monkey blastocysts // Hum. Reprod. 2001. Vol. 16. P. 1965-1969.

226. Yokota Y., Sato S., Yokota M. et al. Successful pregnancy following blastocyst vitrification // Hum Reprod. 2000. Vol. 15. P. 1802-1803.

227. Yoon T., Chung H., Lim J. et al. Pregnancy and delivery of healthy infants developed from vitrified oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program // Fertil. Steril. 2000. Vol. 74. P. 180-181.

228. Young E., Kenny A., Puigdomenech E. et al. Triplet pregnancy after intracytoplasmic sperm injection of cryopreservad embryos: case report // Fertil. Steril. 1998. Vol. 70. P. 360-361.

229. Zhu S., Kasai M., Otoge H. et al. Ciyopreservation of expanded mouse blastocysts by vitrification in ethylene glycol-based solutions // J. Reprod. Fertil. 1993. Vol. 98. P. 139-145.