Усовершенствование молекулярно-биологических, гематологических и патолого-анатомических методов диагностики инфекционной анемии цыплят

Селиверстова, Наталья Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Усовершенствование молекулярно-биологических, гематологических и патолого-анатомических методов диагностики инфекционной анемии цыплят
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование молекулярно-биологических, гематологических и патолого-анатомических методов диагностики инфекционной анемии цыплят"

На правах рукописи

Селиверстова Наталья Андреевна

Усовершенствование молекулярно-биологических, гематологических и патолого-анатомических методов диагностики инфекционной анемии цыплят

06.02.02 -ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 СЕН ДІ13

005533031

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии.

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук,

старший научный сотрудник Юшков Юрий Георгиевич

Официальные оппоненты: Глотова Татьяна Ивановна,

доктор биологических наук, профессор, ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии, заведующая лабораторией;

Барышников Петр Иванович,

доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Алтайский государственный аграрный университет», заведующий кафедрой

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-

исследовательский ветеринарный институт птицеводства Россельхозакадемии

Защита состоится « 8 » октября 2013 г. в «10-00» часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01. при ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 348-44-62, E-mail: dis.ievsidv@list.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « » Го^^а^ЛЛШ г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, /¿^¿^

канд. ветеринар, наук С-'^?* Г.М. Стеблева

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инфекционная анемия цыплят (ИАЦ) распространена в большинстве стран мира с развитой птицеводческой промышленностью. Впервые вирус был выделен от кур в Японии (М. Goryo, 1985; М. Goryo, 1987; Y. Otaki, 1987; N. Yuasa, 1987), затем в европейских странах, Китае, Асгралии, Новой Зеландии и Южной Африке (N.J. Chettle, 1989; В.Е. Engstrom, 1988; Т. Farkas, 1992).

Вирус инфекционной анемии цыплят посредством апопгоза поражает кроветворные клетки в костном мозге и тимоциты в корковом веществе тимуса. Заболевание сопровождается быстро прогрессирующей апластической анемией и состоянием выраженного иммунодефицита (V. Bulow, 1986).

В настоящее время в России наблюдается стойкая тенденция глобализации производственных процессов, связанных с введением более интенсивных технологий выращивания птицы. Осуществляется ввоз племенной птицы и финальных гибридов из других стран с различной эпизоотической ситуацией в отношении инфекционной анемии цыплят. В таких условиях, все чаще регистрируются вирусные заболевания, передающиеся не только воздушно-капельным, но и алиментарным путем. В связи с этим инфекционная анемия цыплят стала одной из наиболее часто встречающихся патологий птиц на территории России.

Актуальность борьбы с ней стала возрастать, так как ужесточение конкуренции между отечественными и зарубежными производителями мяса птицы привело к повышению уровня требований к его качеству. При наличии изменений, характерных для указанной болезни, снижаются сроки хранения, товарный вид и категорийность тушек бройлеров. Экономический ущерб птицеводческого предприятия складывается из стоимости павших птиц, недополучения прибыли от реализации продукции и затрат на лечебные мероприятия.

Для постановки диагноза на инфекционную анемию цыплят необходимо проводить комплекс исследований. Зачастую на производстве используют клинический и патологоанатомический методы диагностики ИАЦ. Клиническое проявление инфекционной анемии у цыплят сопровождается гематологичекими изменениями (снижением концентрации гемоглобина, падением гематокрита). Посмертные изменения включают дистрофию костного мозга, поражения тимуса, дерматиты и др. Наличие инфекции в стаде можно установить при помощи выявления титров антител в иммуноферментном анализе при исследовании парных проб сывороток крови. Однако сероконверсию возможно определить только у выжившей птицы через 3-4 недели после основной волны падежа, что значительно отодвигает сроки установления диагноза и проведения лечебно-профилактических мероприятий. Выделение вируса ИАЦ в культуре клеток является надежной, но трудоемкой процедурой и обычно не используется в лабораторной диагностике.

Для определения генома возбудителя в органах и тканях в мировой практике разработаны различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые применяются для научных исследований и диагностики ИАЦ (М.А. Goodwin, 1994; М.Н.М Notebom, 1992; K.M. Tham, W.L. Stanislawek,

1992; Cs.N. Dren, 1994; S.P. Taylor, 1993; L.U. Rehman, 2011;J. Hermann, 2012). В настоящее время на территории нашей страны нет сертифицированных ПЦР для диагностики ИАЦ, а используемые за рубежом ПЦР недоступны для России. В связи с этим возникает потребность в высокоспецифичных и чувствительных методах молекулярной диагностики ИАЦ и разработке диагностических тест-систем на их основе.

Цель и задачи исследования. Цель исследования - разработка полимераз-ной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для диагностики инфекционной анемии цыплят, а так же повышение эффективности гематологических и патологоанатомических методов исследований.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать ПЦР и ПЦР в режиме реального времени для выявления ДНК вируса ИАЦ в пробах биоматериала, а так же - критерии использования реакции для количественной оценки вируса;

2. Повысить эффективность гемиглобинцианидного метода для определения гемоглобина в пробах крови;

3. Выявить основные патоморфологические изменения, вызванные вирусом инфекционной анемии цыплят, разработать шкалу дифференциальной оценки качества тушек для выявления распространения ИАЦ на птицефабриках.

Научная новизна работы. Разработаны качественная ПЦР и ПЦР в режиме реального времени для детекции геномной ДНК вируса инфекционной анемии цыплят.

Впервые адаптирован для микропланшет гемиглобинцианидный метод определения концентрации гемоглобина в крови, который может быть использован для оценки популяции птиц в отношении инфекционной анемии цыплят.

Определена положительная связь выраженности патологоанатомических изменений тушек птиц на убое с концентрацией гемоглобина крови.

Разработана шкала оценки качества тушек на основе патологоанатомических изменений, характерных для ИАЦ.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в установлении локализации уникальных геномных структур вируса ИАЦ (VNTR-повторы, CpG-островки), выявлении достоверной взаимосвязи между концентрацией гемоглобина крови и характером патологоанатомических изменений при ИАЦ.

Полученные результаты могут быть использованы в области молекулярной диагностики ИАЦ для качественной и количественной детекции вируса в пробах биоматериала.

Гемиглобинцианидный метод определения концентрации гемоглобина адаптирован для микропланшет, что сокращает сроки и повышает эффективность гематологических исследований при ИАЦ.

Разработанная шкала оценки патологоанатомических признаков при инфекционной анемии цыплят, позволяет выявлять птицу с признаками заболевания и определять распространенность ИАЦ в стаде.

Апробация полученных результатов. Материалы исследований доложены на заседаниях Ученого совета ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии (2009 -

2013); II Сибирском ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2010); VI международной конференции молодых ученых, посвященной 40-летию СО Россельхозакадемии «Новейшие направления аграрной науки в работах молодых ученых» (Краснообск, 2010); на конференции молодых ученых, посвященной 60-летию АНИИСХ «Молодые ученые - сельскому хозяйству Сибири» в секции «Животноводство: разведение, кормление, ветеринария» (Барнаул, 2010); на региональной научно-практической конференции «Современные достижения аграрной науки в животноводстве, растениеводстве и экономике» (Томск, 2011); III международной научно-практической конференции (Горно-Алтайск, 2011); V международной научно-практической конференции «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых» (Краснообск, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 - в журналах рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ («Вестник НГАУ», «Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова», «Птицеводство»).

Внедрение результатов исследования. Результаты научных исследований использованы при составлении методического пособия «Новые методы диагностики инфекционной анемии цыплят», утвержденного на подсекции «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 2 от 26.02.2013).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Диссертационная работа иллюстрирована 20 рисунками и 16 таблицами. Список литературы представлен 135 источниками, в том числе 118 - зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработка ПЦР и ПЦР-РВ и оценка возможностей использования их для диагностики инфекционной анемии цыплят;

2. Адаптированный для микропланшет метод гемиглобинцианидного определения концентраций гемоглобина в крови птиц.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы

Работа выполнена в 2009-2012 гг. в лаборатории болезней птиц ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии.

Праймеры для полимеразной цепной реакции для детекции ДНК ИАЦ. Для подбора праймеров использовали программы «Primer Premier 5.0» и «DNAs-tar».Синтетические олигонуклеотидные праймеры были синтезированы ООО «Сибэнзим». ПЦР проводили на фрагмент, находящийся в позиции 10 - 278 п.н., содержащий в своем составе CpG- островки и VNTR повторы. Всего исследовано 191 проба биоматериала.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени для количественной оценки ДНК ИАЦ. При разработке количественной ПЦР в режиме реального времени для определения концентрации вируса ИАЦ определяли внутренний стандарт. В качестве такого стандарта была разработана ПЦР-РВ на геном птиц (белок авидин). ПЦР проводили на фрагмент в позиции 173-351 п.н.

Для проведения ПЦР-РВ на вирус ИАЦ нами была подобрана пара прайме-ров и Tagman зонд на ген VP1 ИАЦ. ПЦР проводили на фрагмент, в позиции 1230-1306 п.н. Олигонуклеотидные праймеры и Tagman зонд были синтезированы ЗАО «Биосинтез» (Новосибирск). ПЦР в режиме реального времени проводили на базе ГНЦ Вирусологии и биотехнологии «Вектор», на приборе Bio Rad IQ5. Методом ПЦР-РВ исследовано 42 пробы биоматериала.

Контрольные образцы ДНК В качестве контрольных образцов ДНК при проведении ПЦР и ПЦР-РВ использовали ДНК вакцинных штаммов вируса ИАЦ 26Р4, Сих-1. При разработке ПЦР-РВ на ген авидина птиц использовали пробу ДНК, выделенную из селезенки курицы. х

Выделение ДНК. Выделение ДНК вируса ИАЦ осуществляли традиционным способом с использованием коммерческого набора «ДНК-сорб» производства ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора и набор QUAGEN DNA Kit (S.R. Coyne, 2004). Для выделения ДНК из агарозного геля использовали набор «QIAEX II Gel Extraction Kit (150)», производство Интер-ЛабСервис.

Электрофорез. Аликвоты реакционной смеси фракционировали методом электрофореза в 6%-м полиакриламидном геле и в 1%-м агарозном геле. В работе использовали источник питания «Эльф-4» производства «ДНК-Технология». Электорфорез проводился в течение 30 минут при силе тока 190мА. Результаты электрофореза учитывали, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе трансиллюминатор «Vil-ber Lourmat ecx-20.m» и видеосистемы «Vitran-foto».

Гематологические исследования. Материалом для определения концентрации гемоглобина являлась кровь, стабилизированная гепарином. Для исследований использовали набор ООО «Фирма Синтакон» Санкт-Петербург. Учет результатов производили при длине волны 540 нм на приборе TECAN Sunrise. Для расчета концентрации гемоглобина использовали метод интерполяции в программе RidaSofiWin. Всего исследовано 101 проба крови от птицы в возрасте 42 дн.

Патоморфологические исследования. Всего исследовано 385 кур разного возраста по методу А.П. Стрельникова (A.B. Жаров, И.В. Иванов, А.П. Стрельников, 1997). Гистологические работы проводили классическим методом (Ф. Лили, 1969). Фиксированные гистологические препараты тканей готовили согласно стандартной методике. Кусочки органов фиксировали в формалине, с последующей обработкой биологических тканей и заливкой в парафин на аппарате MICOM STP 120. Для приготовления срезов использовали микротом MI-QOM НМ 325. Срезы окрашивали квасцовым гематоксилином по Эрлиху (Г.И. Роскин, 1957) и заключали в полистирол.

Статистическая обработка результатов. Полученные данные обрабатывали с использованием программ Microsoft Office Excel 2003 по общепринятым методам описательной статистики (И.П. Ашмарин, 1974). Достоверность полученных результатов определяли по критерию Стьюдента.

2.2 Результаты исследований 2.2.1 Разработка полимеразной цепной реакции 2.2.1.1 Выбор нуклеотидных последовательностей для разработки ПЦР

При сравнении различных изолятов вируса ИАЦ установлено, что реплика-тивная форма вируса состоит из 2298-2319 п.н. В исследуемой нами нуклеотид-ной последовательности генома вируса ИАЦ обнаружено две области, в которых располагаются вариабельные тандемные повторы (VNTR). В периоде 144-204 п.н. находится 3 тандемных повтора, а в положении 219-259 п.н. обнаружено два VNTR. Между тандемными повторами есть вставка, состоящая из 15 п.н. Нами обнаружено, что в состав VNTR входят геномные регионы, состоящие из часто встречающихся CpG участков. Геномная ДНК вируса инфекционной анемии цыплят имеет 4 CpG островка.

2.2.1.2 Подбор синтетических олигоиуклеотидных праймеров для

выявления ДНК вируса ИАЦ в пробах патологического материала

На основе полученных данных об организации вируса были подобраны олигонуклеотидные праймеры, которые имели последовательности:

Р1 - 5' CGAAACGTCACTTTCGCAAC 3',

Р2 - 5' TGGTTACTATTCCATCACCAT 3'.

2.2.1.3 Выявление ДНК вируса ИАЦ в полимеразной цепной реакции

Компоненты ПЦР: Юхбуфер В 305, рН 8,8 - 2,5мкл; dNTPs ( по 2,5 мМ каждого) - 2,5 мкл; смесь праймеров (Pi - 4,91 нМ; Р2 - 5,33 нМ) - 2,5 мкл; вода бидистиллированная автоклавированная - 12 мкл; Taq-полимераза 5000u/ml -0,5 мкл.

Реакционную смесь предварительно прогревали при 95°С в течение 30 с. Сорок циклов ПЦР проводили при следующем температурном режиме: денатурация - 95°С в течение 30 с, отжиг праймеров - 58°С в течение 30 с, элонгация - 72°С в течение 30 с.

Результаты полимеразной цепной реакции проверялись методом электрофореза в 6%-м полиакриламидном геле. В случае положительной реакции в окрашенном геле визуализировался фрагмент ДНК размером 268 п.н. Для определения аналитической чувствительности предложенной ПЦР была проведена серия десятикратных разведений ампликона (табл. 1). В пробирки внесены эм-пликоны вируса инфекционной анемии цыплят в различных концентрациях

В результате проведенных исследований была выявлена минимальная концентрация ДНК при которой визуализируется специфический ампликон равный 10 копиям на реакцию (2000 копий/см ).

Таблица 1 - Результаты оценки чувствительности испытуемой ПЦР

№ п/п Количество копий ДНК на 5 мкл Результат

1 1 отрицательно

2 10 положительно

3 100 положительно

4 1000 положительно

5 10000 положительно

6 100000 положительно

Для оценки специфичности ПЦР тестировали пробы биоматериала птицы и различных изолятов ДНК-содержащих патогенов птиц (рис. 1): пробы № 1-4 были отобраны от бройлеров в 43 дня с патологоанатомическими изменениями, характерными для ИАЦ (треки: 1 - тимус, 2 - костный мозг, 3 - селезенка, 4 -тимус); пробы 5-7 отобраны от бройлеров в возрасте 46 дней с патологоанатомическими признаками заболевания (треки: 5 - тимус, 6 - костный мозг, 7 - селезенка); ДНК вируса синдрома снижения яйценоскости, шт. В8/78 (трек 8), ДНК вируса болезни Марека 1-го серотипа, шт. Rispens (трек 9), ДНК вируса инфекционного ларинготрахеита, шт. О (трек 10) и ДНК вируса ИАЦ шт. 26 Р4 (трек 11).

Рисунок 1 - Определение специфичности ПЦР

Положительные результаты были получены в пробах биоматериала, от птиц с патологоанатомическими изменениями, характерными для ИАЦ и ДНК

изолята вируса ИАЦ.

Проверка специфичности синтеза ампликона проводилась с использованием ПДРФ анализа. Ампликоны, специфичные для ИАЦ штамма 26р4, подвергались гидролизу рестрикгазой А1и1, с образованием 2-х фрагментов длинной 241 и 27 п.н.

2.2.1.4 Адаптация ПЦР для амплификаторов в режиме реального времени

Принципиальным преимуществом данного метода является возможность осуществления детекции накопления ампликонов без открывания пробирки, что минимизирует риск получения ложноположительных результатов из-за контаминации проб и реагентов продуктами амплификации. Существенное

уменьшение количества манипуляций с исследуемым образцом сокращает затраты времени, упрощает анализ и позволяет снизить вероятность ошибок.

Первым этапом создания ПЦР в режиме реального времени являлась наработка специфического ампликона и установление температуры его плавления, которая составляла 88°С. Оптимальная температура для отжига праймеров составляла 59°С. SYBR Green использовали в разведении 1:250.

Для определения аналитической чувствительности метода была проведена серия десятикратных разведений ампликона. После этого с каждым разведением была поставлена ПЦР в режиме реального времени. Учет реакции проводили на основании графиков, отражающих кривую плавления. Чувствительность реакции составляла не менее 10 копий ампликона вируса ИАЦ в пробе объемом 5 мкл (2000 копий/см3).

Для оценки специфичности ПЦР тестировали 4 пробы изолятов ДНК-содержащих патогенов птиц (табл.2): вирус ИАЦ шт. 26 Р4; вирус синдрома снижения яйценоскости, шт. В8/78; вирус болезни Марека 1-го серотипа, шт. Rispens\ вирус инфекционного ларинготрахеита, шт. О.

Таблица 2 - Определение специфичности ПЦР для детекции геномной ДНК ИАЦ

№ трека Проба ДНК Ампликоны

1 Вирус ИАЦ шт. 26 Р4. +

3 Вирус синдрома снижения яйценоскости, В8/78 -

4 Вируса болезни Марека 1-го серотипа, шт. Rispens -

5 Вирус инфекционного ларинготрахеита, шт. О. -

Примечание: «+» - положительный результат; «-» - отрицательный результат

Положительный результат был получен в реакции с вирусом ИАЦ.

Таким образом, разработанная ПЦР адаптирована для проведения в режиме реального времени, обладает чувствительностью, специфичностью и может применяться в ветеринарных диагностических лабораториях для выявления ДНК вируса ИАЦ в органах и тканях.

Данным методом исследовано 191 проба биологического материала от птиц разного возраста, из них выявлена 71 положительная, что составляет 37%.

2.2.2 Разработка полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для количественной оценки вируса ИАЦ 2.2.2.1 Разработка полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для оценки копийности генома птиц

Для разработки критериев использования количественной ПЦР в режиме реального времени для определения концентрации вируса ИАЦ необходимо было определить внутренний стандарт, в отношении которого будут сравниваться результаты. В качестве такого стандарта разработана ПЦР-РВ на геном птиц. Нами была выбрана последовательность гена авидина, кодирующая белок авидин.

Для подбора синтетических олигонуклеотидных праймеров выбрана последовательность гена авидина, состоящая из 1133 п.н. Прямой праймер 5'-TGCAGTGCTCGCTGACTGGG-3\ обратный праймер 5'-

AGGTGGGCTGGC AGGCTCT-3'.

Компоненты реакции для исследования одного образца ДНК: 10х буфер pH 8,8 - 2,5мкл; dNTPs ( по 0,5 мМ каждого) - 2,5 мкл; смесь праймеров (ЮмМ каждого) - 0,3 мкл; вода бидистиллированная автоклавированная - 5,0 мкл; Taq-полимераза в концентрации 5000u/ml в разведении 1:8; 1:16 - 0,5 мкл; SYBR Green (1:250) - 0,25 мкл.

Нами был разработан температурный протокол ПЦР в режиме реального времени на ген авидина птиц (табл. 3).

Таблица 3 - Температурные режимы ПЦР на ген авидина птиц

Этап Температура, °С Число циклов Время

1 95 1 3 мин

2 95 28 Юс

58 28 Юс

72 28 Юс

86 28 Юс

Чувствительность реакции определяли путем постановки ПЦР-РВ с ампли-коном, очищенным от примесей реакции. В результате проведенных исследований было установлено, что чувствительность реакции составляет 200 копий ДНК/см3 или 1 копию ДНК/реакцию.

Для оценки специфичности ПЦР-РВ тестировали 7 образцов ДНК от животных и птиц. Положительный результат был выявлен в пробах ДНК от кур кроссов Иза, Картман, голубя, попугая. Отрицательные результаты получены в пробах от человека, собаки, морской свинки.

При разработке калибровочной кривой дня ПЦР-РВ использовали суспензию клеток селезенки курицы. Посредством ПЦР-РВ проводили наработку специфического ампликона, его очистку. Каждое разведение ДНК было стабилизировано с ДНК фага->.. На основании результатов реакции построили калибровочный график (рис. 2).

На основе разработанного калибровочного графика проводили ПЦР-РВ с использованием проб с неизвестной концентрацией авидина, таким образом, определяя концентрацию авидина для каждой пробы.

Рисунок 2 - Калибровочный график, построенный на основании четырех десятикратных разведений стандарта

2.2.2.2 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени на ген УР1 вируса инфекционной анемии цыплят

Для подбора синтетических олигонуклеотидных праймеров и ТацМап зонда был выбран ген УР1 вируса инфекционной анемии цыплят. Поскольку этот участок вирусного генома является наиболее консервативным. Зонд TagMan имел следующий состав: 5'-((5,6)-РАМ)

АС А АСССОСйОАСА АСТССССТА АТТЗ' -ВН(21, прямой праймер 5'-ОАТТССООАСОООТСТАА-З', обратный праймер 5'-

АССССАССТТАТТАТСТАСССССА-З'.

Компоненты реакции для исследования одного образца ДНК: Юхбуфер рН 8,8 - 2,5мкл; сП^ТРв (по 0,5мМ каждого) - 2,5 мкл; ЮхСмесь праймеров и зонд Та§Мап - 2,5 мкл; вода бидистиллированная автокл. - 12 мкл; Бшай-полимераза в концентрации 5000и/т1 - 0,5 мкл.

Нами был разработан температурный протокол ПЦР в режиме реального времени (табл. 4).

Таблица 4 - Температурные режимы ПЦР-РВ на ген УР-1 вируса ИАЦ

Этап Температура, °С Число циклов Время

1 95 1 10 мин

2 95 45 Юс

58 45 30 с

72 45 10с

Аналитическую чувствительность определяли путем постановки ПЦР с ампликоном очищенным от примесей реакции в серии его десятикратных разведений. В результате проведенных исследований было установлено, что чувствительность реакции составляет 200 копий/см3 или 1 копию/реакцию.

Специфичность ПЦР-РВ для VP1 гена ИАЦ определяли путем проведения реакции с образцами ДНК штаммов вируса ИАЦ 26Р4 и Сих-1, а также ДНК других патогенов: аденовирус шт. В8/78, цирковирус свиней шт. 1010 PCV2, вирус болезни Марека шт. Rispens, вирус ларинготрахеита птиц шт.О. Положительный результат был выявлен в реакциях со штаммами вируса ИАЦ.

Для создания калибровочной кривой проводили наработку специфического ампликона, его очистку, определяли концентрацию. С целью построения калибровочного графика проводили серию десятикратных разведений стандарта. На основе полученного колибровочного графика определяли концентрацию ДНК вируса в пробах биологического материала, от кур, в том числе имеющих клиническое проявление заболевания (рис. 3).

• стандарт

tпроба

о Ч ,

0 а,5 i 1,5 2 2,5

Log количество копий ДНК вируса в пробе

E-1DQ, 9%

Рисунок 3 - Значение проговых циклов полученных в результате проведения реакций с пробами биоматериала, отложенных на калибровочном графике

На рисунке 3 точками обозначены известные концентрации ГЭ ИАЦ, а крестами - пробы с неизвестными концентрациями. На основании калибровочного графика вычислена концентрация ГЭ вируса ИАЦ в тестируемых образцах.

2.2.2.3 Количественное определение вируса инфекционной анемии цыплят

Для определения вирусной нагрузки на организм птицы необходимо соотнести данные о количестве геномных эквивалентов (ГЭ) организма птицы и ГЭ вируса ИАЦ. Нами были исследованы пробы биологического материала от 42 голов цыплят-бройлеров из них выявлено 12 положительных (28%). Концентрацию вируса определяли в селезенке, так как на этот орган приходится самая большая концентрация - 75%. Постановку ПЦР-РВ на геном птиц и вирус ИАЦ в одноименных пробах. Результаты положительных реакций представлены в таблице 5 .

Таблица 5 - Соотношение ДНК вируса ИАЦ и ДНК авидина птиц

Проба ДНК вируса ИАЦ (log 10) ДНК авидина птиц (Log 10) ДНК вируса ИАЦ (log 10)/ ДНК авидина (Log 10)

1 1,64 4,97 0,33

2 0,79 4,76 0,17

3 4,43 5,41 0,82

4 0,46 5,40 0,09

5 0,43 5,16 0,08

6 0,57 5,24 0,11

7 0,10 5,32 0,02

8 0,22 5,67 0,04

9 0,34 4,94 0,07

10 0,41 5,33 0,08

11 0,49 5,12 0,09

12 0,81 5,06 0,16

Таким образом, для количественной оценки содержания вируса в органах и тканях разработаны две ПЦР, которые применяются сочетано для одной пробы ДНК. Первым этапом определяется количество ДНК хозяина (птицы), вторым этапом определяется концентрация вируса ИАЦ. Из полученных значений вычисляют коэффициент вирусной нагрузки, по которому можно судить о концентрации вируса ИАЦ в исследуемой пробе.

2.2.3 Гематологическая диагностика инфекционной анемии цыплят

Одним из признаков инфекционной анемии цыплят является низкая концентрация гемоглобина в крови.

Пробы крови исследуют колориметрическим методом при помощи набора реагентов для определения гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом (Т.И. Лукичева, 2005).

Для автоматизации определения концентрации гемоглобина в крови стандартный гемиглобинцианидный метод был адаптирован для микропланшет.

Построение калибровочного графика. Калибровочный график составляли при исследовании каждой партии проб крови. В первый вертикальный ряд титр-трубок, начиная с А1 и завершая 01, вносили гемоглобин-контроль следующих объемов: 10 мкл, 8 мкл, 6 мкл, 4 мкл, 2 мкл. Соответственно калибровочному графику концентрации гемоглобина в титр-трубках распределялась следующим образом: А1 - 234 г/л, В1 - 187,2 г/л, С1 - 140,4 г/л, 01 - 93,6 г/л, Е1 - 46,8 г/л, И - 0 (рис. 4).

Определение концентрации гемоглобина в крови. Для определения концентрации гемоглобина использовали пробы крови, стабилизированные гепарином. В титр-трубки на п образцов, содержащие 1000 мкл трансформирующего раствора вносили 4 мкл крови. Содержимое пробирки тщательно перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 10-20 минут, переносили в 96-луночные плоскодонные микропланшеты по 250 мкл. Затем проводили измерение оптической плотности раствора гемиглобинцианида при длине волны

540 нм на микропланшетном спектрофотометре. Для учета реакции использовали программное обеспечение, позволяющее проводить расчет результатов методом интерполяции - программу ІІіс1а8ой:\¥іп.

Рисунок 4 - Калибровочный график для определения концентрации гемоглобина в крови

Модифицированный микропланшетный метод позволяет сократить расход трансформирующего раствора в 5 раз. Использование многоканальных дозаторов переменного объема для внесения трансформирующего раствора в титр-трубки и переноса содержимого в 96-луночные микропланшеты сокращает сроки постановки реакции. Аппаратный метод учета результатов и программная обработка данных позволяет одномоментно определить концентрацию гемоглобина в 88 пробах и оценить достоверность результатов на основании калибровочного графика. Из данных таблицы 6 видно, что результат определения концентрации гемоглобина в микрообъемах коррелирует с результатом, полученным стандартным методом и достоверно не отличаются (Р=0,96).

Таблица 6 - Сравнительная эффективность двух вариантов гемиглобинцианид-ного метода определения концентрации гемоглобина в крови

Исследовано проб Концентрация гемоглобина в крови, г/л Достоверность (Р) Коэффициент корреляции

стандартный метод модифицированный метод

16 125,91+6,99 125,40+7,73 0,96 0,95

2.2.4 Усовершенствование патоморфологических методов исследования при инфекционной анемии цыплят

На большинстве птицефабрик ИАЦ проявляется в субклинической форме. Определить процент распространенности ИАЦ на предприятии возможно на убойном пункте при убое птицы одного или нескольких корпусов. Исследования были проведены в течение четырех дней на убойном пункте птицефабри-

ки, всего исследовано 380 тушек бройлеров. Диагноз на ИАЦ подтверждали методами ИФА в парных пробах сывороток. Результаты исследований представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Патологоанатомические показатели тушек бройлеров при субклиническом проявлении ИАЦ

Патологоанатомические признаки Количество голов имеющих изменения, (%)

Кровоизлияния на перьевых фолликулах 53

Дерматит 21

Плохое обескровливание 2

Поражения тимуса 66

Поражения селезенки 44

Бледность костного мозга 7

Всего тушек с пат. признаками 300 голов/79%

Всего тушек без пат. признаков 80 голов/21%

В результате проведенных исследований установлено, что 79% тушек бройлеров имели патологоанатомические изменения, из них наиболее часто встречались поражения тимуса, селезенки и кровоизлияния на перьевых фолликулах. На основании результатов исследований была разработана шкала пато-логоанатомических признаков для оценки распространенности ИАЦ на птицефабрике. Для повышения эффективности выявления тушек с признаками ИАЦ рекомендуется использовать разработанную шкалу.

2.2.5 Изучение диагностической эффективности разработанных методов при ИАЦ

Был проведен сравнительный анализ зависимости между концентрацией гемоглобина и выраженностью патоморфологических признаков ИАЦ. При вскрытии и постановке диагноза пользовались шкалой оценки патологоанатоми-ческих признаков ИАЦ. Всего исследовано 85 голов, из них 32 не имели патоло-гоанатомичесих признаков ИАЦ, а 53 - имели разную степень их проявления.

Тимус, селезенку, печень, костный мозг от птицы с патологоанатомиче-скими изменениями исследовали гистологическим методом. Отмечали изменения, характерные для инфекционной анемии, а именно, воспалительные процессы в тимусе, резкую делимфатизацию коркового слоя, встречались пробы с тотальной инволюцией и замещением тимуса жировой тканью. В селезенке отмечали склеротические процессы, некроз клеток. В пробах печени изменения варьировали от гепатита до тотального некроза. Печень имела признаки гепатита, деструктивные изменения в гепатоцитах и эндотелии сосудов. В костном мозгу встречались фокальные очаги погибших клеток, и участки, замещенные жировой тканью, что является одним из определяющих признаков инфекционной анемии цыплят. Кость имела маленькие лакуны для костного мозга.

В результате проведенных исследований установлено, что среднее значение концентрации гемоглобина у птиц, не имеющих патологоанатомических признаков ИАЦ составляет 92,98±2,09 г/л, а у птицы с проявлением признаков ИАЦ - 82,33+2,51 г/л. Концентрация гемоглобина в крови пораженной птицы достоверно ниже, чем у непораженной (Р<0,01). Так как низкая концентрация гемоглобина крови является одним из признаков инфекционной анемии, то на неблагополучных по ИАЦ птицефабриках для постановки предварительного диагноза необходимо проводить исследования гемоглобина крови одновременно с оценкой патологоанатомических изменений.

С целью изучения диагностической значимости разработанных методов диагностики ИАЦ исследовали пробы биологического материала от одних и тех же птиц методами ИФА и ПЦР.

Исследованию методом ПЦР подвергали ДНК из тимуса бройлеров 16-, 29- и 50-дневного возраста. Результаты серологических и ПЦР исследований представлены в таблице 8.

Таблица 8 - Результаты сравнительного изучения диагностической эффективности ИФА и ПЦР при инфекционной анемии цыплят

Группа Возраст, да. Результаты исследований

ИФА ПЦР

Количество проб Титр АТ Количество проб Положительные пробы / %

Эмбрионы 19 20 9679,0 ±757,9 60* 0/0

Бройлеры 16 20 1036,7+166,5 20 6/30

29 20 197,5 + 39,2 20 8/40

50 20 1013,9 ± 123,2 20 18/90

Примечание: * - Исследованию подверглись 20 эмбрионов, у каждого эмбриона исследовали печень, селезенку и костный мозг методом ПЦР, всего 60 проб.

В результате проведенных исследований установлено, что диагностику инфекционной анемии цыплят необходимо производить комплексно, на основании клинических, патологоанатомических, гистологических, гематологических, серологических исследований и выявления ДНК вируса посредством ПЦР. На раннем этапе диагностики ИАЦ необходимо оценивать клинические, патологоанагомические признаки и проводить выявление ДНК вируса ИАЦ методом ПЦР, а также отбирать парные пробы сыворотки крови для исследования сероконверсии. Гематологические исследования рекомендуется проводить в качестве экспресс-метода для постановки предварительного диагноза ИАЦ.

3 ВЫВОДЫ

1. Разработанная полимеразная цепная реакция (ПЦР) с праймерами, фланкирующими последовательность вируса ИАЦ в позиции 10-278 п.н., которая адаптирована для проведения реакции в режиме реального времени на осно-

ве интеркалирующего красителя SYBR Green, имеет чувствительность 2000 копий ДНК/см3 (10 копий ДНК/реакцию) и обладает специфичностью. В результате амплификации ДНК возбудителя синтезируется фрагмент равный 268 п.н.

2. Разработаны ПЦР-РВ для детекции ДНК авидина птиц и вируса ИАЦ, которые применяются сочетано и дают возможность количественной оценки содержания вируса ИАЦ относительно генома птиц в пробах биоматериала, реакции имеют чувствительность 200 копий ДНК/см3 (1 копию ДНК/реакцию), являются специфичным методом выявления генома птиц и вируса ИАЦ в одноименных пробах биоматериала.

3. Адаптированный для микропланшет метод определения концентрации гемоглобина в крови птицы достоверно не отличается от классического метода (Р=0,96). Позволяет сократить расход трансформирующего раствора в 5 раз. Аппаратный метод учета результатов и программная обработка данных позволяет одномоментно определить концентрацию гемоглобина в 88 пробах, и оценить достоверность результатов на основании графика калибровочной кривой.

4. Разработанная шкала оценки патологоанатомических признаков позволяет выявлять птиц, имеющих разную степень выраженности ИАЦ, является дополнением к действующему ГОСТу 52702-2006, и может быть использована для проведения мониторинга болезни на птицефабриках по производству мяса бройлеров.

5. В условиях бройлерных птицефабрик Сибири выявлены характерные для ИАЦ патоморфологические изменения (дистрофия костного мозга, атрофия тимуса, дерматиты, кровоизлияния на коже, застой крови в подкрыльцовой вене), подтвержденные результатами гематологических исследований (снижение концентрации гемоглобина в крови в среднем до 82,33+2,51 г/л), сероконверси-ей в ИФА и выявлением ДНК вируса ИАЦ.

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для предупреждения развития ИАЦ на благополучных в отношении данной инфекции птицеводческих предприятиях, полимеразную цепную реакцию рекомендуется использовать для выявления ДНК вируса ИАЦ в тимусе, селезенке, костном мозге бройлеров.

Для постановки предварительного диагноза на ИАЦ рекомендуется определять концентрацию гемоглобина в крови птицы и проводить патоморфологические исследования.

В связи с увеличением частоты встречаемости инфекционной анемии цыплят на птицефабриках, разработанную шкалу оценки патологоанатомических изменений, характерных для ИАЦ, необходимо использовать в сочетании с действующим ГОСТом для увеличения выявления тушек с признаками заболевания.

Результаты исследований, отраженные в методическом пособии «Новые методы диагностики инфекционной анемии цыплят», внедрены в практику диагностических лабораторий на птицеводческих предприятиях Сибирского региона.

5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Селиверстова, H.A. Поиск вариабельных генетических элементов у вируса инфекционной анемии цыплят способных влиять на реализацию патогенного потенциала вируса / H.A. Селиверстова // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2010. -Т.6. - №3. — С. 27.

2. Донченко, A.C. Инфекционная анемия кур, как фактор, сопутствующий проявлению секундарных бактериальных инфекций передающихся воздушно-капельным путем / A.C. Донченко, H.A. Селиверстова, Ю.Г.Юшков // Вестник НГАУ. - 2011. - №5 (21). - С. 79-83.

3. Юшков, Ю.Г. Патоморфологические исследования для мониторинга инфекционной анемии цыплят / Ю.Г. Юшков, H.A. Селиверстова, C.B. Леонов, B.C. Городов, Ю.В. Итэсь // Птицеводство.- 2013.- №7. - С. 28-31.

4. Проявление инфекционной анемии цыплят на птицефабриках Сибири / H.A. Селиверстова, Ю.Г. Юшков, B.C. Городов, C.B. Леонов, Ю.В. Итэсь // Материалы II Сибирского ветеринар, конгресса. - Новосибирск, 2010 г. -С. 361.

5. Селиверстова, H.A. Использование показателей концентраций гемоглобина для мониторинга инфекционной анемии цыплят в эпизоотическом очаге / H.A. Селиверстова // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых: тр. Междунар. науч.-практ. конф. молодых ученых, посвящ. 40-летию СО Россельхозакадемии. - Новосибирск, 2010 г. - С. 109-111.

6. Селиверстова, H.A. Разработка и изучение специфичности ПЦР при инфекционной анемии цыплят / H.A. Селиверстова // Актуальные вопросы ветеринарной медицины: материалы X Сибирской ветеринарной конференции. -Новосибирск, 2011. - С. 90-91.

7. Селиверстова, H.A. Инфекционная анемия кур, как причина возникновения вторичных бактериальных инфекций респираторной системы у цыплят бройлеров / H.A. Селиверстова, В.Н. Афонюшкин // РацВетИнформ. - 2011. -№10 (122).-С. 11-12.

8. Селиверстова, H.A. Исследование механизмов передачи вируса инфекционной анемии цыплят на птицефабриках Сибирского региона // H.A. Селиверстова, B.C. Городов, C.B. Леонов, Ю.Г. Юшков // Актуальные вопросы ветеринарной медицины: материалы XI Сибирской ветеринарной конференции. - Новосибирск, 2012. - С. 148-149.

9. Селиверстова, H.A. Разработка и изучение специфичности ПЦР в режиме реального времени для детекции ДНК при инфекционной анемии цыплят / H.A. Селиверстова // Современные достижения аграрной науки в животноводстве, растениеводстве и экономике: сб. тр. регион, науч.-практ. конф. -Томск, 2011.-С. 21-23.

Подписано в печать 22.08.2013 г. Формат 60*84 У16. _Объем 1 п. л. Заказ № 61. Тираж 100 экз._

Отпечатано в ГНУ СибНСХБ Россельхозакадемии 630501, Новосибирская обл., пос. Краснообск

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Селиверстова, Наталья Андреевна, Новосибирск

продукции интерлейкина-1 макрофагами селезенки, экспрессии

Fc-рецепторов и фагоцитарной активности (C.D.G. Мс Connel, В.М. Adair, M.S. McNulty, 1993). Результатом заражения также является разрушение клеток костного мозга, после чего возникает анемия и уменьшение циркулирующего числа лейкоцитов (D. Todd, 1994).

Вирус ИАЦ тропен к клеткам-предшественникам первичных лимфоидных органов и оказывает неблагоприятное воздействие на функцию иммунной системы. Можно предположить, что заболевание будет проявлятся субклинически после снижения титра материнских антител (M.S. McNulty, TJ. Connor, F. McNeilly, D. Spackman, 1989).

Для исследования свойств изолятов вируса ИАЦ его культивировали на MDCC-MSB1 (В. Lucio, 1993). Трансформированные клеточные лимфобластоидные линии очень чувствительны к инфицированию различными изолятами вируса ИАЦ. Изолят CIA-1 давал меньший цитопатогенетический эффект, чем Cux-1 (R.W. Renshaw, 1996)

Вирус специфически поражает Т-клетки или их предшественников в лимфоидных тканях (М. Goryo, Y. Shibata, Т. Suwa, 1987; S.H.M. Jeurissen, J.M.A. Pol, G.F. De Boer, 1989). Клетки-предшественники увеличивают число моноцитов, поэтому вирус ИАЦ влияет на функцию макрофагов -он уменьшает их количество. Мс Connel в 1993 году показал, что макрофаги зараженной птицы утрачивают способность продуцировать интерлейкин-1, который играет важную роль в развитии противовоспалительного ответа. Таким образом, происходит снижение противобактериальной активности организма. Это увеличивает возможность развития вторичной бактериальной инфекции.

1.7

Современные методы диагностики инфекционной

Сравнительное исследование в ИФА и РНИФ полевых сывороток и от СПФ-кур (388 проб) показало совпадение результатов более чем в 98% случаев (D. Todd, 1990).

1.7.1.3 Иммуноферментный анализ (ELISA, ИФА)

Обнаружение специфических антител в сыворотке крови играет важную роль в диагностике ИАЦ. Метод определения концентрации специфических антител при помощи иммуноферментного анализа более чувствительный, чем реакция вирусной нейтрализации и непрямая реакция флюоресцирующих антител (D. O'Rourke, 1994). В 1990 г. исследователь D. Todd описал высокоспецифичный и высокочувствительный метод ИФА с использованием моноклональных антител.

В настоящее время разработано большое количество различных методов твердофазного ИФА. Наборы для проведения данного анализа имеются в продаже и доступны для рутинных исследований в диагностических ветеринарных лабораториях. При помощи ИФА в настоящее время проводится количественное определение титра AT в широком диапазоне концентраций с использованием единичного разведения сыворотки. На большинстве птицеводческих предприятий мясного направления определяют титр материнских антител. Такое исследование позволяет определить иммунный статус поголовья и прогнозировать вспышку заболевания.

1.7.2 Определение и дифференциация вируса ИАЦ при помощи ПЦР

Для определения ДНК вируса инфекционной анемии кур в

инфицированных клетках, куриных тканях или вакцинах разработана полимеразная цепная реакция (М.А. Goodwin, 1994; М.Н.М Notebom, 1992; K.M. Tham, W.L. Stanislawek, 1992; S.P. Taylor, 1993; Cs.N. Dren, 1994).

Daniel Todd предложил олигонуклеотидные праймеры, которые фланкируют участок белка капсида ИАЦ размером в 675 п.н. Выделение ДНК производили из тимуса птицы, а также из культуры клеток MDCC-MSB1, зараженных вирусом ИАЦ. ДНК выделялась гуанидин изоцианатным методом и с применением фенола.

Для проведения полимеразной цепной реакции использовались олигонуклеотидные праймеры следующего состава 5-GAC TGTAAG ATG GCA AGA CGA GCT С-3' и 5'-GGC TGAAGG АТС ССТ CAT ТС-3\ Данные праймеры специфичны для двухцепочечной последовательности репликативной формы ДНК изолята Cuxl. Учет реакции производили в 1% агарозном геле. При помощи полимеразной цепной реакции D. Todd (D. Todd, К.A. Mawhinney, M.S. McNulty, 1992) исследовал 14 изолятов вируса инфекционной анемии кур. Автор разделил изоляты на семь групп используя рестрикционно-ферментный анализ.

D. Todd определил, что для северной Ирланидии характерны изоляты NI CAV-1 и NI CAV-2, для Австралии - 89/3711 и 89/3713, для США - 87/10/44 и 87/11/52. Изоляты, выделенные на стационарно неблагополучных птицефабриках, могут различаться при помощи эндонуклеаз. Например, японские изоляты Gifu-1 и ТК5803 различаются с использованием эндонуклеазы Hinfl, австралийский изолят IMP704 может быть дифференцирован при помощи эндонуклеазы HaelII. Изоляты из Японии, Германии и Швеции похожи на изоляты из США, Великобритании, Австралии и Республики Ирландии. Для дифференциации изолятов из Республики Ирландии и Северной

Ирландии необходимо использовать не менее трех рестриктаз. Данные, полученные D. Todd, могут быть использованы для эпизоотологической оценки хозяйств, а также для выбора вакцин.

М.Н.М. Noteborn в 1991 году создал совмещенную гнездовую полимеразную цепную реакцию для детекции геномной ДНК инфекционной анемии цыплят. Автор использовал две пары синтетических олигонуклеотидных праймеров, комплементарных области геномной ДНК изолятов ИАЦ. Реакцию проводили в два этапа. После проведения первого этапа в 1%-м агарозном геле различали специфические полоски размером 186 п.н. Продукт ПЦР амплифицировали со второй парой праймеров и получали ампликон размером 120 п.н.

1.8 Последовательности генома кур для разработки количественной ПЦР

Для разработки критериев использования реал-тайм ПЦР необходимо установить внутренний стандарт, в отношении которого будут сравниваться результаты. Определить, какое количество геномных эквивалентов (ГЭ) вируса ИАЦ приходится в фиксированном количестве проб куриного генома, измеряемого в геномных эквивалентах. В данной реакции куриный геном будет являться внутренним контрольным образцом (ВКО) реакции. В качестве целевого гена для создания диагностикума был выбран авидин. Он представляет собой гликопротеид яичного белка с молекулярной массой 68000, обладающий чрезвычайно высоким сродством к молекулам витамина биотина (Т. Нго, Г. Ленхоффа, 1988).

применяются в классической вирусологии на территории России и недоступны для ветеринарных диагностических лабораторий.

За рубежом для диагностики ИАЦ используют различные серологические методы, такие как реакция нейтрализации вируса и реакция с применением флюоресцирующих антител. Перечисленные методы диагностики требуют высокую квалификацию персонала, выполняются длительное время — до пяти недель. В связи с этим для выявления вируса необходимо создать диагностикум, позволяющий в короткие сроки качественно провести исследования. Более перспективным методом является метод полимеразной цепной реакции. Существует большое количество модификаций данной методики (К.М. Ririe et al., 1997; В. Kaltenboeck, C.Wang, 2005; H.D. VanGuilder et al., 2008). Необходимо разработать лабораторный образец тест-системы для качественного и количественного определения вируса ИАЦ в клеточной культуре или тканях пораженной птицы.

Перечисленные в заключение обзора литературы вопросы обусловили цели и задачи, сформулированные во введении.

На рисунке 1 изображена диаграмма гомологии нуклеотидных последовательностей вируса инфекционной анемии цыплят. В зависимости от сравнения последовательностей каждому нуклеотиду, расположенному по оси абсцисс, присваивается значение по оси ординат. Максимальное значение соответствует высокой степени подобия нуклеотидов. В целом последовательности вируса оказались похожи, что подтверждается исследованиями D.Todd (1992,1994).

При сравнении различных изолятов вируса установлено, что репликативная форма вируса состоит из 2298-2319 п.н. Последовательности различаются как по составу нуклеотидов, так и по размерам, за счет инсерций и делеций. Таким образом, нуклеотидные последовательности различных изолятов вируса ИАЦ в своем составе имеют высоко- и низкоконсервативные участки ДНК. Информацию о структуре генома вируса использовали для подбора праймеров, которые фланкируют структурную единицу генома вируса, в которую входят тандемные повторы и CpG-островки.

Структурными компонентами вируса являются тандемные повторы — VNTR (variable tandem repeats). Тандемные повторы — последовательности повторяющихся фрагментов ДНК. Они представляют участки ДНК, содержащие несколько последовательно монотонно повторяющихся нуклеотидных сайтов произвольного состава. Характерная особенность VNTR — различное число повторов (аллелей), которое наследуется в соответствии с законами генетики. Оно может различаться у штаммов вируса и являться их уникальной генетической характеристикой.

В исследуемой нами нуклеотидной последовательности генома вируса ИАЦ обнаружено две области, в которых располагаются тандемные повторы. В периоде 144-204 оснований находится 3 тандемных повтора, а

10. Кэлнек, Б.У. Болезни домашних и сельскохозяйственных птиц / Б.У. Кэлнек и др. - М.: Аквариум, 2003. - 850 с.

11. Лабинская, А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А.С. Лабинская - М.: Медицина, 1978.-333 с.

12. Лили, Ф.Патогистологическая техника и практическая гистохимия / Ф. Лили. - М.: Издательство Мир, 1969. - 645 с.

13. Лукичева, Т.И. Гемихромный метод определения гемоглобина в крови: информционно - методическое пособие / Т.И. Лукичева, В .И. Пупкова. - М., 2002. - 31 с.

14. Нго, Т. Иммуноферментный анализ: Пер. с англ. / Т. Нго, Г. Ленхоффа. -М.: Мир, 1988.- 446 с.

15. Роскин, Г.И. Микроскопическая техника / Г.И. Роскин. -Государственное издательство «Советская наука». - 1957. - 189 с.

16. Саломе, А. Профилактка инфекционной анемии кур / А. Саломе // Птицеводство. - 1993. - № 1. - С. 30-32.

17. Серологический мониторинг инфекционной анемии Цыплят и молекулярно-биологическая характеристика изолятов вируса / В .А. Лобанов и др. // Вестн.РАСХН. - 2003. - №1. - С. 66-68.

18. A hot start PCR for the laboratory diagnosis of CAV / Cs.N. Dren, [et al]. // On Infect. Bursal dis. And Chicken Infect. Anemia : Proc. Intern. Symp. - Rauischholzhausen - 1994. - P. 413.

19. A Hypervariable Region in VP1 of Chicken Infectious Anemia Virus Mediates Rate of Spread and Cell Tropism in Tissue Culture / R.W. Renshaw [et al] // J. Virol. - 1996. - № 12. - P. 72-78.

20. Ahlroth, M.K. Characterization and chromosomal localization of the chicken avidin gene family / M.K. Ahlroth, E.H. Kola, D. Ewald // Anim. Genet. - 2000. - № 31. - P. 367-375.

21. An outbreak of disease due to chicken anaemia agent in broiler chick-ens in England / N.J. Chettle, R.K. Eddy, PJ. Wyeth, S.A. Lister // Vet. Rec. - 1989. -№124. - P. 211-215.

22. Arends, M. J. Apoptosis: the role of the endonucleases / M.J. Arends, R.G. Morris, A.H. Wyllie // J. Pathol. - 1990. - № 136. - P. 593608.

23. Avian encephalomyelitis following oral vaccination / J.A. Smyth, F. McNeilly, G.A. Reilly, E.R. McKillop // Avian Pathol. - 1994. - № 3. - P. 435-445.

24. Bacterial infection / T.A. Kunnas, MJ. Wallen, M.S. Kulomaa // Biochim. Biophys. Acta. - 1993. - № 3. - P. 441-445.

25. Bisgaard, M. An age related and breeder flock associated hemorrhagic disorder in Danish broilers / M. Bisgaard // Nord. Vet. Med. -1983.-№ 11. -P.397-407.

26. Boevink, P. Sequence of subterranean clover stunt virus DNA: affinities with the geminiviruses / P. Boevink, P.W.G. Chu, P. Keese // Virology.- 1995.-№2.-P. 354-361.

27. Buchholz, U. Characterization of chicken anaemia virus (CAV) proteins / U. Buchholz, V. von Bulow // On Infect. Bursal dis. And Chicken Infect. Anemia: Proc. Intern. Symp. - Rauischholzhausen, 1994. - P. 366-375.

28. Bullow, V.v. Unsatisfactory sensitivity and specificity of indirect immunofluorescence tests for the presence or absence of antibodies to chicken anaemia agent (CAA) in sera of SPF and broiler breeder chickens / V.v. Bullow // Zentralbl Veterinarmed B. - 1988. - № 8. - P. 594-600.

96. Packed cell volume reference intervals to aid in the diagnosis of anemia and polycythemia in young leghorn chickens / M.A. Goodwin, J. Brown, K.S. Latimer, S.L. Miller. // Avian Dis. - 1991. — № 35.-P. 820-823.

97. Phenix, K.V. Transcriptional analysis and genome expression of chicken anaemia virus / K.V. Phenix, B.M. Meehan, D. Todd, M.S. McNulty // J. Gen. Virol. - 1994. - № 75 - P. 905-909.

98. Polymerase chain reaction for detection of the chicken anemia agent in formalin-fixed paraf-fin-embedded thymus sections / M.A. Goodwin [et al] // On Infect. Bursal dis. And Chicken Infect. Anemia : Proc. Intern. Symp. - Rauischholzhausen - 1994. - P. 425-427.

99. Relationship of common avian pathogen antibody titers in so-called chicken anemia agent (CAA)-antibody-positive chicks to titers in CAA-antibody-negative chicks / Goodwin, M.A [et al] // Avian Dis. - 1992. - №36. -P. 356-358.

100. Relationship of the enzyme-linked immunosorbent assay to indirect immunofluorescent antibody test for the detection of so-called chicken anemia agent antibodies in serum from broiler breeders / M.A. Goodwin, [et al] // Avian Dis. - 1992. - №36. - P. 512-514.

101. Riences and problems in high-security SPF poultry flocks / D. O'Rourke, W.P. Michalski, TJ. Bagust. // On Infect. Bursal dis. And Chicken Infect. Anemia: Proc. Intern. Symp. - Rauischholzhausen, 1994. - P. 456-464.

102. Ririe, K.M. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction / K.M. Ririe, R.P. Rasmussen, C. T. Wittwer // Anal. Biochem. - 1997. - № 2. - P. 154-160

103. Rosenberger, J.K. The isolation and characterization of chicken anemia agent (CAA) from broilers in the United States / J.K. Rosenberger, S.S. Cloud // Avian Dis. - 1989. - №4. - P. 707-713.

104. Rocde, W. Nucleotide sequence of a circular single-stranded DNA associated with coconut foliar decay virus / W. Rocde, J.W. Randies, P. Langride // Virology. - 1990. - №2. - P. 648-651.

105. Schat, K.A. Understanding Marek's Disease Immunity: A Continuing Challenge / K.A. Schat // Int. J. Poul. Scien. - 2004. - №3. - P.89-95.

106. Sharma, J.M. Virus-induced immunosuppression in chickens / J.M. Sharma, K. Karaca, T. Pertile // Poult. Sci. - 1994. - № 7. - P. 10821086.

107. Smyth, J.A. A sequential histopathologic and immunocytochem-ical study of chicken anemia virus infection at one day of age / J.A. Smyth [et al] // Avian Dis. - 1993. - № 2. - P. 324-338.

108. Soine, C. Sequence analysis of cell culture- and non-cell culture-adapted strains of chicken infectious anemia virus / C. Soine // On Infect. Bursal dis. And Chicken Infect. Anemia: Proc. Intern. Symp. -Rauischholzhausen, 1994. - P. 364-365.

109. Taniguchi, T. Chronological observations on hemato-pathological changes in chicks inoculated with chicken anemia agent / T. Taniguchi, N. Yuasa, M. Maeda, T. Horiuchi // Nati. Inst. Anim. Health Q. - 1983. - № 1. - P.l-12.

110. Taniguchi, T. Hematopathological changes in dead and moribund chicks induced by chicken anemia agent / T. Taniguchi, N. Yuasa, M. Maeda, T. Horiuchi. // Nati. Inst. Anim. Health. Q. Qpri. - 1982. -№22. - P. 61-69.

120. Vaux, D.L. Bel- prevents death of deprived cells but fails to prevent apoptosis I targets of cell-mediated killing / D. L. Vaux, H. L. Aguila, I. L. Weissmann. - Int. Immunol. - 1992. - № 4 -P. 821-824.

121. Vielitz, E. Anaemia-dermatitis of broilers: Field observations on its occurrence, transmission and pre~,vention / E. Vielitz, H. Landgraf // Avian Pathol. - 1988-№ 17-P. 113-120.

122. Wallen, M.J. Two chicken repeat one (CR1) elements lacking a silencer-like region upstream of the chicken avidin related genes Avr 4 and Avr 5 / M.J. Wallen, R.A. Keinanen, M.S. Kulomaa // Biochim. Biophys. Acta. - 1996. -№ 3. - P. 193-196.

123. Wang, D. The selection pressure analysis of chicken anemia virus structural protein gene VP1 / D. Wang, G.Z. Han, C.Q. He // Virus Genes. -2009.-№2.-P. 8-16.

124. Wilchek, M. Introduction to avidin-biotin technology / M. Wilchek, E.A. Bayer // Meth. Enzymol. - 1990. - № 184. - P. 5-13.

125. Yuasa, N. CAA: Review and recent problems / N. Yuasa // Proc 38th West Poult. Dis. Conf. - Tempe, 1989. - P. 14-20.

126. Yuasa, N. CAA: review and recent problems / N. Yuasa // Proc. 38th Western Poultry Dis. Conf. - Tempe, Ariz. - 1989. - P. 14-20.

127. Yuasa, N. Etiological examination of an outbreak of hemorrhagic syndrome on a broiler flock in Japan / N. Yuasa, K. Imai, K. Watanabe // Avian pathol. - 1987. - № 16. - P. 197-204

128. Yuasa, N. Experimental eggtransmission of chicken anemia agent / N. Yuasa, I. Yoshida // Natl. Inst. Anim. Health Q. - 1983. - № 23. - P. 99100.

7 ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1

Директор ГНУ ИЗВСяДВ Россельхозакадемии

AA^CMBKfJcXH

г.

АКТ

комиссионной апробации полимеразной цепной реакции для детекции геномной ДНК инфекционной анемии цыплят.

Для комиссионной апробации полимеразной цепной реакции для детекции геномной ДНК инфекционной анемии цыплят сформирована комиссия в составе: А.Г. Глотова, зав. лабораторией биотехнологии -диагностический центр ГНУ ИЭВСиДВ, д.в.н., (председатель); Ю.Г.Юшкова, зав. лабораторией болезней птиц ГНУ ИЭВСиДВ, к.в.н.; A.B. Нефедченко, с.н.с. лаборатории биотехнологии - диагностический центр ГНУ ИЭВСиДВ, к.в.н., В.В. Храмцова зав лабораторией лейкозов ГНУ ИЭВСиДВ, д.в.н., Т.И. Глотовой, зав сектором вирусологии, д.б.н., Г.М. Стеблевой с.н.с. лаборатории оптимизации противоэпизоотических систем, к.в.н.; В.Н. Афонюшкина с.н.с. лаборатории болезней птиц ГНУ ИЭВСиДВ, к.б.н. (члены комиссии).

Методика испытана на пригодность ПЦР для диагностики инфекционной анемии цыплят.

Результаты исследования в ПЦР проб ДНК из биоматериала от птицы, имеющей патологоанатомические и патогистологические изменения, характерные для инфекционной анемии цыплят с птицефабрики неблагополучной по инфекционной анемии и образцов ДНК, не содержащих генома вируса инфекционной анемии цыплят (ИАЦ).

Таблица 1.- Результаты оценки специфичности испытуемой тест-системы

№ п/п Наименование пробы Результат

1 ДНК из тимуса бройлера, 43 дня положительно

2 ДНК из костного мозга бройлера, 43 дня положительно

3 ДНК из тимуса бройлера, 44 дня положительно

4 ДНК из тимуса бройлера, 44 дня положительно

5 ДНК из тимуса бройлера, 46 дней положительно

6 ДНК из тимуса бройлера, 46 дней положительно

7 ДНК из тимуса бройлера, 46 дней положительно

8 ДНК из тимуса бройлера отрицательно

9 ДНК из тимуса бройлера отрицательно

10 ДНК из тимуса бройлера отрицательно

11 Вакцина производства «Интервет» - СЛ\' Р4. положительно

12 Цирковирус свиней 2-го типа отрицательно

13 Вирус синдрома снижения яйценоскости отрицательно

14 Вакцина живая на основе аттенуированного штамма вируса болезни Марека 1-го серотипа «Авивак» ' отрицательно

15 А. ЫШамп отрицательно

16 Вирус инфекционного ларинготрахеита отрицательно

17 М. ЫтгаазяШсНз отрицательно

18 Вирус инфекционного ларинготрахеита, шт. О. отрицательно

19 ДНК из тимуса бройлера отрицательно

20 ДНК из тимуса бройлера отрицательно

Положительный контроль положительно

Отрицательный контроль отрицательно

Примечание к таблице 1.

Образцы ДНК № 1-7 были выделены от птицы имеющей клинические, патологоанатомические и патогистологические изменения, характерные для инфекционной анемии цыплят. Образец ДНК № 11 был получен из живой вакцины против инфекционной анемии цыплят. В результате исследования данных проб в 6% полиакриламидном геле был выявлен ампликон, равный 268 п.н.

Пробы ДНК № 8,9,10,19,20 были получены от птицы не имевшей признаков ИАЦ. Кроме того, в опыте присутствовали образцы ДНК, принадлежащие различным вирусам и бактериям. При постановке ПЦР с этими пробами специфических ампликонов не обнаружено, что свидетельствует о высокой специфичности реакции.

Таблица 2.- Результаты оценки чувствительности испытуемой тест-системы