Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Условия культивирования IN VITRO и последующая продуктивность растений земляники

ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Условия культивирования IN VITRO и последующая продуктивность растений земляники"

На правах рукописи

ХАПОВА Светлана Александровна

УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO И ПОСЛЕДУЮЩАЯ ПРОДУКТИВНОСТЬ РАСТЕНИЙ ЗЕМЛЯНИКИ

Специальность 06.01.07 - плодоводство

Автореферат диссертации на соискание учёной степени / кандидата сельскохозяйственных наук

Москва 1997

Работа выполнена во Всероссийском селекционно-технологическом институте садоводства и питомниководства.

Научный руководитель - кандидат сельскохозяйственных наук В.А.Высоцкий.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук Ф.Я.Поликарпова; кандидат сельскохозяйственных наук Т.А.Никиточкина.

Ведущее предприятие - Главный ботанический сад Российской академии наук им. М.Н.Цицина.

Защита состоится .. . ............ 1992 г.

в......... часов на заседании диссертационного совета Д

020.20.01 во Всероссийском селекционно-технологическом институте садоводства и питомниководства по адресу: 115598, Москва, ул.Заг^б^ш, 4, ВСТИСП. Учёный совет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского селекционно-технологического института садоводства и питомниководства.

Автореферат разослан ^f.^P^^A-. . 1997 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат сельскохозяйственных наук

Л.А.ПРИНЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В нашей стране земляника является самой популярной ягодной культурой. Её ценят за ранние сроки созревания.

Постоянный и высокий спрос населения на свежие ягоды земляники и продукты их переработки обуславливается их высокими вкусовыми качествами. Ягоды земляники имеют прекрасный вкус, нежную консистенцию мякоти и приятный аромат, сбалансированное сочетание Сахаров и кислот, - это делает их десертным продуктом.

В восьмидесятых годах площадь под земляникой составляла 24 тыс. га с тенденцией увеличения удельного веса этой культуры до 40% от площадей, занимаемых всеми ягодными. В Московской области земляника занимает 45% площади промышленных посадок ягодников.

В настоящее время культура земляники в Нечерноземье, как и в целом в России, требует серьёзного внимания ввиду резкого сокращения плодоносящих площадей после подмерзания растений в суровые зимы, распространения рада опасных грибных и вирусных болезней. Закладка новых насаждений земляники сдерживается отсутствием в достаточном количестве оздоровленного посадочного материала перспективных сортов. В частности, биотехнические методы широко используются в практике плодоводства для получения и ускоренного размножения оздоровленного посадочного материала земляники.

Несколько лет назад были сделаны наблюдения, показывающие, что растения, регенерировавшие из соматических клеток в культуре тканей, не являются однородными, а проявляют значительную генетическую вариабельность. Эта вариабельность обозначается термином "сомаклональная изменчивость". Возникает вопрос, является ли сомаклональная изменчивость результатом реализации генетических различий уже существующих в соматических клетках изменений или это нарушается компонентами питательной среды.

Изменяя состав питательной среды, на которой культивируются различные виды растений, можно изменить их физиологическое состояние, усиливать и замедлять их рост, фотосинтез, повышать устойчивость к неблагоприятным воздействиям.

Для каждого вида и даже сорта культурного растения состав питательной среды необходимо подбирать индивидуально. Кроме того, для обеспечения активного роста нужна одна среда, для размножения - другая, для сохранения растений - третья, для ускорения - четвёртая. Следовательно, для каждого растения в агделыюсги, с учётом целей, необходимо разрабатывать особый состав питательной среды, соблюдая определённый баланс составляющих её компонентов. Данный факт свидетельствует о важности и необходимости расширения исследовательских работ по изучению условий влияния питательной среды in vitro на поведение растений регенератов земляники.

Выращивание растений в условиях in vitro даёт возможность контролировать многие факторы внешней среды: температуру, влажность, продолжительность и интенсивность светового дня.

Одним из главных направлений повышения продуктивности и устойчивости растениеводства и садоводства на современном этапе, является применение интенсивных технологий возделывания. В большинстве случаев в качестве обязательного приёма для борьбы с сорняками такие технологии включают применение гербицидов нового поколения, которые должны обладать высокой эффективностью и, в то же время, быть безвредными для человека и окружающей среды.

Система производства растений земляники с применением метода in vitro приобретает большую актуальность, поскольку ценность посадочного материала неизмеримо выше, чем рядовых растений.

Пели и задачи исследований. Целью настоящих исследований являлось изучение влияния условий культивирования на способность

земляники разных групп (обычные, ремонтантные, нейтрально-дневные) к размножению in vitro и последующую продуктивность растений.

Для реализации поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить влияние продолжительности освещения на этапах микроразмножения на биометрические показатели.

2. Определить степень влияния разного состава питательных сред на коэффициент размножения эксплантов земляники.

3. Определить пороговые концентрации вводимых в среду гербицидов для последующего отбора сомаклональных вариантов и трансформантов по признаку гербицидоустойчивосги.

4. Изучить влияние сроков переноса пробирочных растений в нестерильные условия на приживаемость.

5. Провести сравнительную оценку развития земляники, полученной методом

in vitro с растениями, выращенными обычными методами, в полевых условиях.

Научная новизна результатов исследований. Выявлено существенное влияние периода освещения на число побегов и их длину, количество листьев, а так же на число и длину корней, развивающихся у эксплантов испытанных сортов земляники in vitro.

Изучено влияние элементов азотного питания на развитие эксплантов земляники на этапах пролиферации при размножении. Экспериментально показана возможность совместного применения 6-бензил-аминопурина и кинетина для стимуляции бокового ветвления у эксплантов земляники. "

Впервые в культуре ткани земляники изучено влияние гербицидов на биометрические показатели и пигментную систему развивающихся эксплантов.

Определены наиболее благоприятные сроки для высадки пробирочных растений земляники в почвенные субстраты в условиях зимних отапливаемых теплиц.

Практическая ценность работы. Полученные результаты позволяют оптимизировать процесс клонального микроразмножения земляники, снизить затраты труда и себестоимость продукции по сравнению с общепринятой технологией.

Использование оптимальных сроков переноса растений в нестерильные условия дает возможность повысить выход адаптированных растений на 20% и более. Выявленные селективные концентрации гербицидов могут быть использованы для создания гербицидоустойчивых форм и получения трансгенных растений.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Всероссийском совещании "Молодые учёные -садоводству России" (г.Москва, 1995); на IV Международной конференции "Проблемы дендрологии, цветоводства, плодоводства, виноградарства и виноделия" (г-Ялта, 1996); на "The 18-th International group training on plant protection services" (Thailand, Bangkok, 1996); на IV Международной научно-практической конференции "Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье" (г.Симферополь, 1997); на VII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (г.Москва, 1997); на заседаниях секций ягодных культур Учёного совета ВСТИСП (1994-1997).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано семь научных статей.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трёх глав, выводов и рекомендаций, списка литературы. Текст диссертации изложен на 133 листах машинописного текста, содержит 26 таблиц, 20

рисунков. Список используемой литературы в:<лючает 237 наименований, в том числе 120 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Место исследований. Эксперименты проводились в лаборатории биологического факультета Ярославского Государственного университета им. ДемидоваП.Г. Исходный материал для опытов был получен по стандартной методике клонального микроразмножения в лаборатории биотехнологии отдела размножения плодовых и ягодных культур ВСТИСП.

Объекты исследований. Объектами исследования были сорта земляники: Гора Эверест, Дукат, Женева, Зенга-Зенгана, Профъюжен, Рапелла, Редгонтлит, Трибьют, Тристар, Холидей.

Условия культивирования. Сосуды с эксплантами закрывали фольгой и термоусадочной плёнкой и культивировали при освещении 3 тыс. ж, температуре 24-26°С и относительной влажности в помещении 70-75%. Источники освещения: в светохомнаге лампы типа ЛДЦ-20, в теплице -лампы накаливания мощностью 200, 500 Вт. Освещённость в теплице составляла утром и во второй половине дня по 2,5 тыс. лк, в середине дня 4-5 тыс. лк.

В специальных экспериментах, при изучении влияния светового периода на растения регенераты, культивирование вели при 8-ми, 12-ти, 16-ти, 24-ёх - часовом световом дне.

Влияние минерального и гормонального состава питательных сред на последующую продуктивность микроразмноженных растений изучалось при фотопериоде - 16 часов световой день и 1=25°С. Интенсивность освещения 2500 лк.

Посадку, пересадку, деление конгломератов на отдельные побеги проводили в стерильных условиях ламинар-бокса КГО-1 по общепринятым методам.

Состояние эксплантов оценивали по специально разработанной пятибальной шкале.

Гербицвды вводили в питательную среду перед автоклавированием в следующих концентрациях, выбранных на основании результатов предварительных экспериментов: 2Ч0*М, 10"5М, 2*10"5М, КИМ, 2*1(НМ, 10-ЗМ.

а) симазин, ингибирующий фотосинтетический транспорт электронов, тормозящий выделение кислорода при фотосинтезе;

б) раувдап, ингубирующий синтез ароматических аминокислот.

В качестве контроля использовали питательную среду, не содержащую гербицидов.

Высадку пробирочных растений земляники в нестерильные условия проводили в два этапа:

1, Сначала укоренённые пробирочные растения пересаживали в перлит, а для поддержания высокой влажности накрывали стеклянными сосудами. Постепенно открывали стеклянные сосуды.

2. Затем, примерно через месяц, такие растения земляники пересаживали в автоклавированную почвенную смесь, которая состояла из почвы, торфа и песка в отношении 1:1:1 и переносили в условия отапливаемой теплицы.

В мае каждого года растения переносили в открытый грунт. Растения высаживали в почву, покрытую мульчирующим материалом марки СУФМК-60 чёрного цвета.

Учёты и наблюдения. В ходе экспериментов in vitro учитывали следующие показатели:

1) коэффициент размножения;

2) регенерация вегетативных органов (листьев, почек, побегов, корней) с учётом их числа на зкспланте и числа эксплантов, проявивших морфогенетические реакции;

3) укореняемость почек (или побегов).

У растений-регенерантов в полевых условиях проводили снятие следующих показателей:

1) количество усов;

2) число и площадь листьев, число рожков, цветоносов, цветков,

плодов;

3) масса плодов;

4) выход укоренённых розеток;

5) изменение морфологии листьев и столонов;

6) наличие хлорофильных аномалий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

1. Реакция эксплантов земляники разных сортов на продолжительность освещения. В ходе работы мы определяли влияние режимов микроразмножения (8,12, 16 и 24 часа) на продуктивность растений разных групп сортов. Наибольшее число побегов имели экспланты, выращенные при 24-часовом периоде освещения. Среднее число побегов у сортов обычной группы (Згнга-Зенгана, Дукат, Редгонтлит) за весь период эксперимента составили 8,9 - 7,0 - 7,4 шт/эксплант, у сортов ремонтантной группы (Гора Эверест, Рапелла) - 8 - 2,9 шт/эксплант, у сортов нейтрально-дневной группы (Тристар, Трибьют) - 8,2 - 7,9 шт/экс-плант. Побегообразовательная способность у эксплантов сорта Рапелла оказалась очень низкой на всех периодах освещения (Табл. 1).

Оценка состояния растений, образуемых эксплантами разных сортов земляники в зависимости от светового режима культивирования показала, что лучше всего растения развивались при 16-часовом периоде освещения, например, состояние эксплантов, выращенных при 12-часовом периоде освещения составило 4,2 балла, при 16-часовом - 4,7 балла, а при 24-часовом - 3,6 балла.

Таблица 1

Среднее число побегов, образуемых эксплантами разных сортов земляники в зависимости от продолжительности освещения (шт.)

Сорта Продолжительность освещения

8 час/сут 12 час/сут 16 час/сут 24 час/сут

Гора Эверест 4,0 5,3 8,0 15,0

Рапелла 2,0 2,8 3,4 3,6

Дукат 4,3 5,0 7,8 11,0

Зенга-Зенгана 4,5 6,3 9,1 14,8

Редгонтлит 3,9 5,4 8,0 12,3

Тристар 5,4 6,7 8,5 14,2

Трибьют 5,6 6,8 9,2 12,1

X 4,0 5,1 7,7 Н,9

НСР05 взаимодействие 1,2

Полученные в условиях освещения продолжительностью 12 и 16 часов растения были адаптированы к нестерильным условиям.

Результаты наблюдений показали, что растения земляники, выращенные при 16-часовом периоде освещения in vitro давали существенно больше столонов, чем в случае культивирования при 12-часовом дне, а так же имели большую площадь листьев (Табл.2,3).

Действие света зависит от образования фоторецепторов и трансформации световой энергии в листовых клетках, фотостимуляции в них биосинтетических процессов.

Как показали наши исследования, более низкое количество содержания пигментов компенсируется растениями за счёт большей площади листовой поверхности.

Таблица 2

Среднее число столонов у разных сортов земляники, размноженных при различной продолжительности освещения (шт/расгение) (1995 г.)

Сорта Продолжительность освещения при микроразмножении

12час/сут 16 час/сут

Гора Эверест 33 ±3,6 40 ±2,8

Рапеяла 10 ±2,6 19 ±3,1

Зенга-Зенгана 26 ±3,1 41 ±4,2

Редгонтлит 37 ± 5,2 57 ±4,6

Дукат 14 ±3,7 24 ±3,5

Трисгар 18 +1,8 21 ±4,1

Трибыот 19 ± 1,6 25 ±4,2

Таблица 3

Влияние длины дня при культивировании in vitro на площадь листьев растений земляники в полевых условиях (1 августа 1995 г.)

Сорта Площадь листьев на 1 растении (см2)

12 час/сут 16 час/сут

Дукат 240 360

Зенга-Зенгана 550 720

Редгонтлит 450 576

Тристар 320 420

HCPos: световой режим 24,1 сорта 16,4

взаимодействие 18,2 2. Развитие эксплантов земляники в зависимости от концентрации в питательной среде разных форм азота. Как известно, процесс размножения in vitro происходит на питательных средах, из которых наибольшее распространение получила среда Мурасиге-Скуга. Однако, эта среда

содержит некоторые компоненты (особенно азот) в избыточных концентрациях.

Среди минеральных солей важное значение для роста и развития растений имеют азотосодержащие соли.

Мы исследовали влияние уменьшения состава питательной среды Мурасиге-Скуга в два и четыре раза. Наши эксперименты показали, что на этапах размножения снижать концентрацию солей в базовой среде Мурасиге-Скуга нецелесообразно. Поэтому мы попытались оценить концентрации разных форм азота в питательной среде на развитие эксплантов земляники. Оказалось, что снижение аммонийного азота в два раза не повлияло на коэффициент размножения (Табл. 4).

Таблица 4

Развитие эксплантов земляники сорта Тристар в зависимости от концентрации в питательной среде аммонийного азота

Концентрация квдо. Кол-во побегов, ТТГТ Длина побегов, ш Кол-во корней, птг Длина корней, мм Кол-во листов, тттт.

Кошроль 1650 мг/л 4,3 3,5 2,1 0,5 12,2

0,5. 4,0 3,2 0 0 14,1

0,25 3,9 3,2 0 0 12,2

0,125 3,8 3,0 0 0 11,0

0,5 4,3 3,2 0 0 12,1

0,253 3,9 3,2 0 0 12,1

0,125 3,8 3,2 0 0 10,3

НСРо5 - количество побегов

концентрация №ШОз Рф< Роз

Снижение нитратного азота в два раза отрицательно повлияло на побегообразовательную способность экспл актов. Коэффициент размножения снизился, по сравнению с контролем, на 3-4 единицы (Табл. 5).

Таблица 5

Развитие эксплантов земляники сорта Тристар в зависимости от концентрации в питательной среде нитратного азота

Концентрация Кол-во Длина

ЮТОэ побегов, побегов,

(часть) шт. см.

Контроль 1900 мг/л 5,5 2,8

0,5 1,7 1,6

0,25 1,4 1,2

0,125 0,8 1,2

0,5 2,0 2,1

0,25 1,7 1,3

П ПС 1,3 1,6

НСРо5 - количество побегов

концентрация КЖ)з = 1,3

Возможно такой эффект связан с механизмом поглощения

нитратного азота. Известно, что использование кетокислот на синтез аминокислот происходит более интенсивно при наличии в питательной среде аммонийного азота; нитратный азот в меньшей степени используется на синтез аминокислот.

На основании полученных данных можно сделать заключение, что снижение концентрации аммонийного азота на 825 мг/л в среде Мурасиге-Скуга не приводит к снижению коэффициента размножения, что может быть реализовано на практике.

3. Действие иитокининов и ауксинов на развитие эксплантов земляники. Так же одним из важных компонентов питательной среды являются регуляторы роста. Тщательный подбор и выявление оптимальных концентраций позволяют повысить эффективность метода клонального размножения.

Мы изучали сочетание 6-БАП и кинетина на развитие эксплантов. Сочетания 6-БАП и кинетина в концентрациях 0,25 мг/л + 0,25 мг/л и 0,25 мг/л + 0,5 мг/л соответственно незначительно стимулировали рост почек и разворачивание листочков (Табл. 6).

Таблица 6

Зависимость коэффициента размножения от концентрации 6-БАП и кинетина в питательной среде (сорт Зенга-Зенгана)

Концешрация цигокининов, г/л Число образовавшихся побегов, шт. Длина побегов, см.

6-БАП Кинетин

Контроль 6-БАП 1 мг/л 10,0 2,5

0,25 0,25 3,8 2,0

0,5 4,2 1,9

1,0 6,8 2,0

0,75 0,25 9,2 2,5

0,5 10,1 2,4

1,0 12,2 2,1

1,0 0,25 14,4 2,5

0,5 16,1 0,9

1,0 17,2 0,8

НСРоз 4,6 1,2

Лучшие результаты были достигнуты при сочетании 6-БАП-1 мг/л и кинетина - 0,25 мг/л. В этом случае число образовавшихся побегов было больше, чем в контрольном варианте.

Наиболее развитые экспланты были пересажены на среду для укоренения. Использование регуляторов роста ауксиновой природы обеспечивало в наших опытах высокую укореняемость побегов земляники на 20ый день культивирования. Сорт Зенга-Зепгтш одинаково хорошо укоренялся при использовании ИМК и И УК в концентрациях 0,5-1 мг/л. Сорта Тристар и Дукат на среде, содержащей ИУК - 1 мг/л по сравнению с контролем имели большее число укоренившихся эксплантов.

4.Чувствительность пролиферирующих культур земляники к гербицидам in vitro. В последние годы большее внимание уделяется возможности создания с помощью биотехнологических методов новых форм растений, в частности с помощью отбора сомаклональных вариантов с хозяйственно-ценными признаками. Отбор сомаклональных вариантов по признаку гербнцидоустойчивости может проводиться только после выявления летальных и сублетальных концентраций селективных агентов для культур клеток, тканей и органов.

Таких данных для земляники в литературе нами обнаружено не было, поэтому следующий этап работы был посвящён изучению чувствительности культивируемых in vitro тканей и органов различных сортов земляники к присутствию в питательной среде двух типов гербицидов.

Следует отметить, что гербииидный эффект испытанных препаратов сохранялся в культуре in vitro.

В случае использования симазина в диапозоне концентраций 2*10-5 - 2ХЮ 4М проявлялся ингибнрующий эффект в отношении роста и развития эксплантов. Концентрация 10-3М вызывала у эксплантов всех сортов вначале признаки хлороза вплоть до полного обесцвечивания с последующей гибелью.

Наиболее чувствительным к симазину оказался сорт Женева, для эхсплантов которого концентрация 1СИМ оказалась летальной (Табл.7).

Таблица 7

Состояние эксплантов различных сортов земляники (в баллах) в зависимости от присутствия в питательной среде гербицидов (1,5 месяца)

Концентрация гербицида (М)

Сорт Тип гербицида Контроль (без гербицида) О 2» 10* Ю-' 24 О-5 10-4 2*10-'

1 2 :5 4 5 6 7 8

Зенга- Симазин 5,0 4,8 4,6 3,8 3,6 2,2

Зенгана Раундап 5,0 4,6 4,2 3,0 0 0

Дукат Симазин 5,0 4,8 4,5 4,2 3,8 2,5

Раувдап 5,0 4,4 4,2 3,0 0 0

Редгошлиг Симазин 4,9 4,6 4,4 4,1 3,6 2,4

Раундап 4,9 4,5 4,0 2,6 0 0

Гора Симазин 4,9 4,5 4,4 3,9 3,8 1,5

Эверест Раувдап 4,9 4,5 3,7 2,4 0 0

Женева Симазин 4,8 4,5 4,0 4,2 0 0

Раундап 4,8 4,5 3,3 1,9 0 0

Трисгар Симазин 4,9 4,6 4,3 4,2 3,8 0

Раундап 4,9 4,5 3,4 2,7 0 0

Трибыот Симазин 4,9 4,7 4,2 4,1 3,8 1,5

Раундап 4,9 4,5 3,6 3,0 0 0

При изучении эффекта присутствия в питательной среде раундапа было выявлено, что три наиболее высокие концентрации (Ю-4, 2*1 (КМ, 10"3М) приводили к полной гибели эксплантов.

Для подтверждения пониженной чувствительности отобранных эксплантов их пересаживали повторно на питательные среды, содержащие сублегальные концентрации соответствующих гербицидов. При последующем культивировании отобранных условно толерантных эксплантов различных сортов земляники наблюдалась гибель значительной части культур. Это свидетельствует о том, что в подавляющем большинстве случаев мы имеем дело не с устойчивыми к гербицидам органами и тканями, а с эксплантами, которые не успели погибнуть в предыдущем субкультивировании.

Известно, что гербициды подавляют многие процессы метаболизма в растениях, в частности оказывают существенное влияние на фотосинтетическую активность.

Симазин подавляет фотосинтез у растений за счёт связывания с так называемым 32К белком, входящим в состав тилакоидной мембраны. Учитывая механизм гербицидного действия, который основан на торможении реакции Хилла, мы провели серию экспериментов по влиянию его на фотосинтетическую активность.

Глифосат воздействует на синтез очень важных ароматических аминокислот, точкой его приложения является фермент 3 - фосфошикимат -1 карбоксивинилтрасфераза. Вероятно, подавление данной стадии метаболизма вызывает дефицит ароматических аминокислот, накопление шикимата и в результате при контакте с глифосатом на концентрации 10-3М -гибель эксплантов земляники.

Таким образом, нами определены селективные концентрации двух гербицидов: симазина - КИМ, раундапа - 10-5М.

5.Влияние гербицидов симазина и раундапа на фотосинтез изолированных побегов земляники in vitro. В процессе работы мы изучили влияние содержания пигментов в листьях земляники при культивировании с раундапом и симазином (Рис. 1).\Мы отмечали высокую чувствительность эксплантов сорта Женева. Такая повышенная чувствительность нашла отражение и в реакции фотосинтетического аппарата на содержание пигментов в листьях земляники.

На восьмую неделю культивирования в варианте с концентрацией раундапа 2Х106М отмечали стимулирующее действие этого препарата на содержание количества пигментов у эксплантов.

6. Адаптация микропобегов к нестерильным условиям в зависимости от сроков пер<зсадки. Для выявления лучших сроков приживаемости растения земляники каждый месяц переносили в нестерильные условия. Наблюдения, проведённые за дальнейшем развитием таких растений, выявили, что самым благоприятным сроком выведения пробирочных растений был период с мая по август. Например, в 1996 году высокий процент приживаемости был у сортов Тристар - 96%, Трибьют -93%. У сорта Редгонтлит в июле 1996 года на 20% повысилась приживаемость растений по сравнению с 1994 годом этого же месяца. Эксперименты показали, что растение, высаженное в мае-июне-июле быстро развивалось. Так, растения сорта Зенга-Зенгана (Рис.2), перенесённое в нестерильные условия 11 мая с длиной побегов 3,5 см, через 1,5 месяца имело длину побегов 9 см, крупные листья; ещё через месяц растения высаживали в полевые условия. При выведении эксплантов в нестерильные условия в марте, растениям требуется 3,5 месяца для высаживания в полевые условия, а это на один месяц больше, чем в первом варианте.

б)

а 80 -60 -40 -20 -

0

100

Ш^Я

100

хлорофилл а

хлорофилл Ь

100

ч

каратиноиды

Рисунок 1. Содержание пигментов (%) в листьях земляники при культивировании на средах с раундапом и симазином в течение двух недель.

а) сорт Женева - контроль (без гербицидов) на средах с раундапом И - концентрация 2 10'6 М

б) сорт Женева 'ЦЦр - концентрация 10"5 М на средах с симазином р! - концентрация 10'3 М

Сорт Зенга-Звнганнз

Рис.2 Приживаемость растений земляники в зависимости от срока пересадки в нестерильные условия (сорт Зенга-Зенгана)

При переводе эксплантов земляники в нестерильные условия осенью и зимой процент приживаемости был низкий. Например, у сорта Зенга-Зенгана в декабре (1996 г.) укоренившихся растений было меньше на 70% по сравнению с результатами мая (1996 г.); у сорта Дукат в январе укоренившихся растений меньше: на 55% по сравнению с маем (1996 г.). По данным за три года (1994-1996 гг.) мы можем отметить, что экспланты, пересаженные в нестерильные условия в осенне-зимний период имели низкий процент приживаемости.

По-видимому, отмеченное нами явление связано в первую очередь с невозможностью поддерживать в производственных культуральных помещениях (зимних теплицах) одинаковые условия (освещённость, спектральный состав света) на одном уровне в течение всего года. Нельзя

также исключить влияние внутренних биологических причин в поведении растений, связанных с ритмами роста и развития растений.

Таким образом, приживаемость растений при переносе в нестерильные условия зависела от способа и срока высадки. Использование оптимальных сроков переноса растений в нестерильные условия дают возможность повысить выход адаптированных растений до 30%. 7. Хозяйственно-биологическая оценка растений разных сортов земляники, полученных методом in vitro и обычным способом. Оценивая хозяйственно-биологическое значение сортов земляники, мы сравнивали влияние двух методов размножения растений разных сортов на урожайность, число розеток, массу ягод, количество плодов, поражённых гнилями (Табл.8).

Таблица 8

Хозяйственно-биологическая оценка растений земляники, полученных разными способами размножения____

Сорта Способ размножения Средняя урожайность содного растения за 1 год, г Среднее число розеток содного растения в1год вегетации Среднее число розеток с одного растения воПгод вегетации

Зенга-Зенгана in vitro 126 37 38

стандартный 125 30 37

Редгоитлит in vitro 108 57 52

стандартный 105 40 53

Дукат in vitro 95 18 19

стандартный 99 14 18

Тристар invito 199 21 21

стандартный 183 18 21

Трибьют invito 186 24 26

стандартный 178 23 25

Женева invito 177 20 19

стандартный 173 21 19

НСР05: сорта 26,5 года 8,9

взаимодействие 5,6

Эксперименты показали, что в 1 год выращивания у некоторых сортов земляники число розеток зависит от метода размножения, так у сорта Зенга-Зенгаиа число розеток от учётного растения было больше на 8 шт. По сравнению с растениями, полученными обычным методом. На второй год этот эффект сглаживался. Процент плодов, поражённых гнилями, был выше у сортов, имеющих две волны плодоношения: во-первых, сказывается резкое колебание ночных и дневных температур осенью в Ярославской области; во-вторых, влияет накопление патогена в растениях за весь период вегетации. По урожайности и массе ягод существенных отличий не было.

Экономические вопросы размножения земляники in vitro.

Метод клонального микроразмножения является достаточно трудоёмким и требует большого количества материальных затрат. Вместе с тем высокая рентабельность метода in vitro обусловлена экономией площадей культивационных помещений, сокращением периода выращивания растений, увеличением коэффициента размножения, улучшением качества продукции (ССЭ), а также работой в осенне-зимний период.

Оценку экономической эффективности производства посадочного материала с применением метода in vitro проводили на примере земляники сорта Зенга-Зенгана. Производственные затраты вычисляли на основе методических рекомендаций ВСТИСП (Табл. 9).

Расчёты показали, что при числе исходных эксплантов - 5 шт., коэффициенте размножения - 8, числе субкультивирований - 3 с учётом рада коэффициентов (коэффициент приживаемости эксплантов, выхода пригодных для укоренения побегов, укореняемое™, приживаемости при адаптации) в течение полугода по общепринятой технологии можно получить 5000 шт. Побегов. Себестоимость одного экспланта, выращенного по общепринятой технологии составит 1,22 руб.

Важным аспектом экономической эффективности технологии in vitro явилось снижение затрат труда на выращивание 1 тыс. шт. растений земляники in vitro.

Таблица 9

Экономическая оценка производства посадочного материала земляники с

использованием метода клоналыюго микроразмножения (1 тыс. шт.)

Показатели Метод in vitro

1. Себестоимость 1 шт., руб. 1,22

2. Себестоимость и накладные расходы (180%), руб. 1,68

3. Цена реализации 1 шт., руб. 7,2

4. Прибыль от 1 тыс. шт., руб. 5,52

5. Число микропобегов на 1 м2, шт. 1000

6. Прибыль на 1 м2, руб. 11,04

6. Уровень рентабельности, % 328

Таким образом, метод клоналыюго микроразмножения даёт

значительный экономический эффект, что показывает преимущество использования его в производстве.

ВЫВОДЫ

1. Продолжительность периода освещения оказывает существенное влияние на развитие эксплантов земляники испытанных сортов. Среди изученных режимов культивирования продолжительность освещения 12 и 16 часов оказались наиболее благоприятными с точки зрения коэффициента размножения, длины образуемых побегов, количества листьев, а на этапе укоренения числа и длины корней.

2. Выращенные in vitro растения земляники при 16-ти часовом освещении давали существенно больше столонов, чем в случае культивирования при 12-ти часовом периоде, поэтому такие растения могут быть использованы в качестве исходных для закладки маточников. Растения, выращенные in vitro при 12-ти часовом освещении, характеризовались большим содержанием хлорофиллов

а, Ь и каратиноидов по сравнению с растениями, полученными при 16-ти часовом дне на 10%-30%.

3. При клональном размножении испытанных разных сортов земляники возможно снижение концентраций аммонийного азота в два раза по сравнению с базовой средой без ухудшения такого показателя развития, как коэффициент размножения

4. Для стимуляции бокового ветвления у эксплантов испытанных сортов земляники лучшие результаты даёт сочетание 6-БАП в концентрации 1 мг/л с кинетином 0,25 мг/л.

5. Включение в питательные среды гербицидов различного спектра действия -раундапа и симазина в концетрациях 2Х106М - 10"3М - оказывало существенное влияние на ростовые процессы у культивируемых эксплантов земляники. Раундап обладал более фототоксичным эффектом и вызывал гибель основной массы эксплантов в концентрации 2*1 (ИМ. Селективной концентрацией симазина является 10^М, раундапа 10~5М для испытанных семи сортов земляники. Эти исследования могут стать основой для отбора форм земляники с повышенной устойчивостью к гербицидам.

6. Присутствие в питательных средах гербицидов раундапа и симазина на уровне концентраций 105, 10~3М ингибировало синтез хлорофилла а, хлорофилла b и каратиноидов. Концентрация 2Х10"6М раундапа на восьмую неделю культивирования приводила к увеличению количественного содержания хлорофилла а и хлорофилла Ь.

7.0пределены наиболее благоприятные сроки для перегадай микроразмноженных растений в нестерильные условия с мая по август, что даёт возможность повысить выход адаптированных растений на 20% и более.

8. Оценка состояния растений в полевых условиях показала, что в первый год выращивания у растений сортов Зенга-Зенгана, Дукат, Профъюжен, Хомдей, Редгонтлит число розеток зависит от метода размножения. У растений, выращенных in vitro количество розеток было больше приблизительно в 1,3

раза. На второй год вегетации различия по числу образуемых розеток у всех исследуемых сортов земляники сглаживались. Существенных различий по урожайности испытанных сортов в зависимости от способа размножения не выявлено.

РЕКОМЕНДАЦИИ Д ЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

При размножении методом in vitro растений земляники рекомендуем в питательной среде Мурасиге-Скуга снизить концентрацию аммонийного азота до 825 мг/л. Для обеспечения массового размножения побегов оптимальная комбинация регуляторов роста 6-БАП и кинетина 1 мг/л, 0,25 мг/л соответственно.

Пересадку пробирочных растений в нестерильные условия необходимо проводить с мая по август.

Для отбора сомаклональных вариантов и трансгенных экземпляров с повышенной гербицидоусгойчивостью использовать в питательной среде следующие концешрации гербицидов: раувдапа - 2Х10"5, Ю"5М; симазина - 2М0"4, 1(НМ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хапова С. А. Влияние условий культивирования на клональное микроразмножение земляники и процессы её адаптации к нестерильным условиям // Тезисы докладов Всероссийского совещания "Молодые учёные -садоводству России". - М. -1995. - С.156-158

2. Хапова С.А. Влияние гербицидов на фотосинтез и развитие эксплантов

земляники in vitro // Материалы IV Международной конференции "Проблемы дендрологии, цветоводства, плодоводства, виноградарства и виноделия". -Ялта,-1996.-Т.2.-С.61-63

3. Khapova S. Tissue-culture strawbeny no virus // The 18 th International group training on

plant protection services. - Thailand. -1996. - Т. 1. - P.M-M3

4. Высоцкий В.А., Хапова С.А. Чувствительность культур изолированных органов земляники к гербицидам / Сб. труд. ВСТИСП. - М.; -1997. - С.83-89

5. Хапова С.А. Влияние состава субстрата и сроков пересадки в нестерильные

условия на приживаемость пробирочных ратсений земляники // Тезисы докладов научной конференции ЯрСХА. - Ярославль. -1997.

6. Хапова С.А. Реакция изолированных побегов земляники на присутствие гербицидов в питательной среде // Тезисы докладов VII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда". -1997. - С.382-383

7. Хапова С.А. Влияние светового режима на морфологию и ситез пигментов

растений земляники в полевых условиях // Материалы VI Международной научно-практической конференции "Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье". - Симферополь. -1997. - Т. 1-2. - С. 140-141