Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Упорядоченный дифференциальный дисплей кДНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Матц, Михаил Владимирович, Москва

/ « /' ,//Ч /

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М.ШЕМЯКИНА И Ю.ОВЧИННИКОВА

МАТЦ Михаил Владимирович

УПОРЯДОЧЕННЫЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ ДИСПЛЕЙ кДНК

специальность - 03.00.03 - молекулярная биология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель: кандидат биологических наук С.А.Лукьянов

Москва 1999 г

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ 2

ГЛАВА 1. Различные стратегии дифференциального дисплея и 5 области их применимости (обзор литературы)

1.1. Общая характеристика дифференциального дисплея 5

1.2. Две основные стратегии дифференциального дисплея 7

1.3. Классический дифференциальный дисплей 10 1.4 Методы систематического дифференциального дисплея 16 ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 23

2.1. Принцип метода. 23

2.2. Поиск региональных молекулярных маркеров планарии 27

2.3. Чувствительность УДД 28

2.4. Поиск различий в генной экспрессии между внутригнездовыми муравьями и муравьями-фуражирами - воспроизводимость УДД 29

2.5. Влияние сложности образца кДНК на эффективность УДД 31

2.6. Сверх-представленные транскрипты и виртуальная 32 нормализация

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 36

3.1.Материалы и оборудование 36

3.2. Методы исследования 38

3.2.1. Протокол упорядоченного дифференциального дисплея 38 кДНК

3.2.2. ОТ-ПЦР 53 ВЫВОДЫ 55 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 56 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 57

ВВЕДЕНИЕ

Методы, направленные на идентификацию транскриптов дифференциально экспрессирующихся генов (Т-ДЭГ, то есть мРНК, представленных в разной концентрации в сравниваемых образцах), представляют итерес для целого ряда областей биологии - эмбриологии, клеточной биологии, иммунологии и других. Кроме того, в настоящее время изучение ДЭГ становится одной из основных задач крупномасштабных геномных проектов.

Технические подходы, предназначенных для сравнения выделенных препаратов РНК in vitro с целью поиска Т-ДЭГ, несмотря на чрезвычайное разнообразие, имеют одну основу: метод дифференциальной гибридизации, или дифференциального скрининга (Rebagliati et al., 1985). Не вдаваясь в подробности, можно сказать, что он состоит в проверке уровня представленности случайно выбранных последовательностей (клонов) кДНК в сравниваемых образцах РНК с помощью гибридизации. Целью при этом является обнаружение последовательностей, присутствующих в одном из сравниваемых образцов РНК в гораздо большей концентрации, чем в другом. Самое очевидным неудобством этого метода была огромная трудоемкость: поскольку популяция Т-ДЭГ редко составляет более 1% от всей РНК, на каждый обнаруженный Т-ДЭГ могли приходиться сотни раундов гибридизации с общими последовательностями. Чтобы преодолеть это затруднение, был предложен прием вычтиающей гибридизации, целью которого является обогащение сравниваемых образцов Т-ДЭГ перед собственно дифференциальным скринингом. Было разработано (и успешно применено) множество вариантов техники вычитающей гибридизации.

В 1992 году был предложен альтернативный подход к дифференциальному скринингу (Liang and Pardee, 1992; Welsh et al., 1992), который теперь известен под общим названием "дифференциальный дисплей" (ДД). В общем, он состоит из следующих стадий: (а) из каждого из сравниваемых образцов РНК производятся упрощенные образцы фрагментов кДНК (т.е. включающие только небольшую часть из всех исходно имеющихся кДНК) таким образом, что их состав жестко определяется конкретными условиями их получения; такие образцы называются суб-популяциями; (б) аналогичные суб-популяции, полученные из сравниваемых образцов РНК, разделяются на соседних дорожках полиакриламидного геля (получаемые картинки из исторических соображений называются фингерпринтами); (в) полосы фрагментов кДНК, видимые только в одном из сравниваемых образцов (или гораздо более выраженные в одном образце чем в другом) вырезаются из геля и изучаются (такие фрагменты и происходят из Т-ДЭГ); (г) изменяя параметры получения суб-популяций, производятся суб-популяции другого состава и изучаются вышеописанным образом, чтобы сравнить уровень экспрессии для возможно большего числа генов. Преимущество такого подхода по сравнению с дифференциальным скринингом очевидно: вместо проведения отдельного раунда гибридизации для каждой из случайно выбранных последовательностей, сравнивается уровень представленности сразу нескольких десятков видов мРНК. Еще одним очень важным свойством ДД является возможность совместно анализировать более двух образцов РНК, что практически невыполнимо в случае дифференциального скрининга с использованием вычитающей гибридизации. В последующие годы ДД очень широко применялся для решения разнообразных задач, что привело к появлению нескольких сотен публикаций. Тем не менее выяснилось, что техника

ДД скрывает гораздо больше подводных камней, чем можно было предположить исходя из первых описаний (Debouck, 1995). Для преодоления обнаружившихся затруднений был предложен целый ряд модификаций исходного метода ДД (см. последние обзорные статьи Liand and Pardee, 1995; McClelland etal, 1995; детали современного экспериментального протокола даны у McClelland et al., 1997). Помимо этого, было разработано несколько перспективных методов, также использующих дисплей фрагментов кДНК, но имеющих принципиальные отличия от исходной техники ДД.

Таким образом, перед исследователем, планирующим поиск Т-ДЭГ, открывается весьма широкий выбор методов. При этом ни один из них не может быть рекомендован как идеальный, во всех случаях превосходящий другие. Выбор оптимального методического подхода должен диктоваться свойствами изучаемой биологической системы, а также целями конкретного научного проекта. Нижеследующий литературный обзор посвящен рассмотрению методов, относящихся к группе дифференциального дисплея, с целью обозначить области наибольшей продуктивности каждого из них и тем самым облегчить исследователю выбор метода для решения конкретной задачи.

Целью данной работы являлось создание нового метода дифференциального дисплея, который был бы достаточно прост в исполнении и при этом лишен большинства недостатков, свойственных разработанным ранее аналогичным методам.

ГЛАВА 1. РАЗЛИЧНЫЕ СТРАТЕГИИ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО ДИСПЛЕЯ И ОБЛАСТИ ИХ ПРИМЕНИМОСТИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1 Обицая характеристика дифференциального дисплея

При выборе между дифференциальным скринингом, базирующимся на вычитающей гибридизации, и ДД существуют два условия, строго диктующих выбор последнего. Во-первых, это необходимость одновременного сравнения более чем двух образцов, и во-вторых, ситуация, когда ожидаемая разница в концентрации интересующих Т-ДЭГ в сравниваемых образцах (так называемая "распределенность Т-ДЭГ") мала - не превышает десяти-пятнадцатикратной. Такая ситуация довольно обычна в тех случаях, когда для получения сравниваемого биологического материала используются микрохирургические процедуры или методы подразделения клеточной популяции, поскольку это обычно ведет к значительному загрязнению одного образца другим. Если каждый из таких препаратов на 10% состоит из материала другого образца, то максимально возможная распределенность Т-ДЭГ между ними будет ограничиваться десятикратной разницей. Кроме того, заинтересованность в слабо распределенных Т-ДЭГ может быть продиктована природой изучаемой системы, например, при изучении близких последовательных стадий какого-либо процесса (клеточной дифференцировки, раковой трансформации или клеточного ответа на стимуляцию). Существующие методы вычитающей гибридизации не позволяют достичь существенного обогащения для слабо распределенных транскриптов (Wan et al., 1996, Ermolaeva et al., 1996, Milner et a/., 1995), особенно когда наряду с ними имеются и более сильно распределенные (порядка 100:1 и более). В последнем случае в полученных вычтенных образцах слабо распределенные Т-ДЭГ будут скорее всего утрачены. В отличие от вычитающей

гибридизации, ДД способен детектировать даже самую незначительную разницу в представленности транскриптов (в 2-3 раза). Надо отметить, что существует и обратная сторона медали: при помощи ДД может оказаться довольно затруднительно отобрать Т-ДЭГ с действительно высокой распределенностью (такой, какая требуется, например, для пространственного молекулярного маркера: 500:1 и выше), поскольку на полиакриламидном геле уже двадцати кратная разница скорее всего будет выглядеть так же, как пятисоткратная.

Еще одним привлекательным свойством ДД является возможность с его помощью быстро оценить общее количество Т-ДЭГ, обнаруживающихся при некой конкретной постановке эксперимента. В случае некоторых задач (например, поиск генов первичного ответа на какую-либо стимуляцию) может понадобиться перепланировать эксперимент, если разница слишком велика (т.е. когда Т-ДЭГ составляют более 3-5% от всех видов мРНК). Возможна и обратная ситуация. Особенно информативной такая оценка оказывается для экспериментов, в которых невозможно что-либо определенно предсказать исходя из теоретических соображений. В таких случаях настоятельно рекомендуется прежде всего получить несколько гелей ДД, даже если в дальнейшем планируется использовать вычитающую гибридизацию.

Часто отмечают, что одним из преимуществ ДД перед вычитающей гибридизацией является возможность провести полный анализ с использованием очень незначительных количеств исходного материала (нескольких микрограмм тотальной РНК). По нашему мнению, этот момент уже нельзя рассматривать как особое преимущество, поскольку в последнее время были разработаны надежные методы получения представительных ПЦР-амплифицированных

образцов кДНК из 50 нанограмм тотальной РНК (Lukyanov К. et al., 1997), а также продемонстрирована возможность использования подобных образцов для вычитающей гибридизации (Zeng etal., 1994; Balzerand Baumlein, 1994; Yang and Sytkovski, 1996; Gurskaya et al., 1996). Кроме того, как будет обсуждаться ниже, снижение стартовых количеств РНК в ДД будет скорее всего сопровождаться резким повышением "уровня шума", то есть фракции ложных позитивов. Необходимо тем не менее отметить, что потенциальные возможности, предоставляющиеся при использовании амплифицированных образцов кДНК, до сих пор полностью не охвачены. На наш взгляд, их применение способствовало бы развитию техники ДД не меньше, чем вычитающей гибридизации.

Сходная ситуация наблюдается и при обсуждениии чувствительностей ДД и вычитающей гибридизации. Как правило, полагают, что обнаружение редкого Т-ДЭГ (составляющего менее 0.01% от всей мРНК) более вероятно при использовании ДД (Wan et al., 1996). Однако, в некоторых современных методах вычитающей гибридизации проблема смещения анализа в сторону более частых Т-ДЭГ в значительной мере преодолена (Gurskaya et al., 1996; von Stein et al., 1997), в то время как вопрос о степени представленности редких Т-ДЭГ в ДД-анализе все еще остается неразрешенным (см. ниже).

1.2 Две основные стратегии дифференциального дисплея.

В классическом методе ДД (Liang and Pardee, 1992; Welsh et al., 1992; см. Рис.1) для получения суб-популяций кДНК используется ПЦР со случайным затравлением. Уменьшение сложности образца кДНК достигается за счет того, что один из праймеров, используемых в таком ПЦР, имеет более или менее случайно выбранную последовательность нуклеотидов и отжигается только на те

мРНК

pJK АА

синтез первой цепи кДНК с использованием одного из 12 заякоренныхТ-праймеров

5'-TTTTTTTTTTAC

3'-

■САТТТТТТТТТ

ПЦР с

Т-праймером и праймером со случайно выбранной последовательностью

5'-TTTTTTTTTTAC 5'-GTTGCAAGGTTC

3'-

случайный отжиг, инициация амплификации

5'-G TTG CAaggttc--------

-—........САТТТТТТТТТ

GTTGCAAGGTTC

■САТТТТТТТТТ

анализ продуктов ПЦР на ПААГ

Рис. 1. Схема метода классического дифференциального дисплея (по Liang and Pardee, 1992)

кДНК, в которых оказывается соответствующий комплементарный сайт. В результате каждый фингерпринт выглядит как 50-70 хорошо различимых полос и представляет собой случайную выборку кДНК фрагментов из общего пула мРНК. Другая выборка может быть получена при использовании праймера с другой случайной последовательностью. Очевидно, эти выборки могут перекрываться, поскольку ничто не мешает одному и тому же виду кДНК быть амплифицированным при помощи более чем одной комбинации праймеров. В каком-то смысле эта ситуация напоминает секвенирование по технологии shotgun: довольно легко получить последовательность половины субклонированного фрагмента ДНК при секвенировании случайно выбранных перекрывающихся субкпонов, однако установление оставшейся последовательности потребует значительно больших трудозатрат, поскольку при случайной выборке все чаще будут попадаться уже известные субклоны. Сходных проблем следует ожидать и при попытке исследовать мРНК пул полностью при помощи классической стратегии ДД: чем большее число случайных праймеров протестировано, тем больше вероятность, что исследователь рассматривает уже встречавшиеся ему виды кДНК (McClelland et al., 1995; Kato, 1996). Если принять, что в клетке экспрессируется 15 ООО генов и каждый фингерпринт показывает случайно выбранные 70 транскриптов, можно сосчитать, что при идеальных условиях (а именно, если бы вероятность попадания некого вида мРНК в фингерпринт в каждом раунде ПЦР была одинакова для всех видов мРНК) для анализа 95% популяции мРНК понадобится получить около 600 фингерпринтов (т.е. просмотреть 45 000 полос вместо 15 000). Не следует забывать, что подобные рассчеты базируются на принятии вышеописанных идеальных условий, то есть не учитывают того, что редкие

транскрипты будут в среднем иметь меньшие шансы быть увиденными на фингерпринте. Таким образом, приведенные выше оценки скорее всего занижены (McClelland et al, 1995; McClelland et al., 1997). Остается только удивляться тому факту, что во множестве публикаций эти соображения совершенно упускаются из рассмотрения, когда речь заходит о принципиальных возможностях классического ДД.

Чтобы сделать технологию ДД столь же эффективной для исчерпывающего анализа пула мРНК сколь и для частичного его изучения, несколькими группами были разработаны методы, использующие альтернативную стратегию подразделения мРНК на суб-популяции. Эта стратегия может быть названа "систематической выборкой" в отличие от исходной "случайной выборки". Ее наиболее важным свойством является то, что некий вид мРНК может быть обнаружен в одной и только в одной суб-популяции; таким образом, субпопуляции являются неперекрывающимися. При этом очевидно, что для анализа всего пула мРНК необходимо просмотреть ровно столько полос на фингерпринтах, сколько имеется видов мРНК в образце. Конкретные способы достижения этого очень различны и будут рассмотрены ниже в соответствующем разделе.

1.3 Классический дифференциальный дисплей

В последние годы классический (основанный на ПЦР со случайным праймированием) метод ДД стал весьма популярен и доказал свою результативность. Он был весьма подробно рассмотрен в обзорных работах (Liand and Pardee, 1995; McClelland et а/, 1995). Здесь же будут проанализированы последние воззрения касающихся двух наиболее широко обсуждаемых проблем, связанных с классическим ДД: высокого процента ложных позитивов и возможной недопредставленности редких мРНК в ходе ДД-анализа.

Из всех полос, выглядящих дифференциальными на фингерпринтах классического ДД, доля ложных позитивов (т.е. дифференциальных полос, не содержащих Т-ДЭГ) часто достигает 50 и более процентов (Debouck, 1995; Wan eta!., 1996). Даже полное дублирование эксперимента с последующим отбором только воспроизводимых дифференциальных полос не позволяет решить эту проблему. Наиболее очевидной причиной этого являлся собственно ПЦР со случайным праймированием, который проводился с использованием коротких (10-12 оснований) олигонуклеотидов со случайной последовательностью. При этом в каждом цикле ПЦР приходилось использовать очень низкую температуру отжига (40-42°С). Такая амплификация очень неэффективна и чувствительна к малейшим вариациям температурного профиля в ходе ПЦР. В результате вид фингерпринта мог быть различным даже в зависимости от фасовки Taq-полимеразы или положения пробирки в ПЦР-приборе (Liang and Pardee, 1995), и, таким образом, был очень плохо воспроизводим. Эта проблема была решена путем замены коротких случайных олигонуклеотидов более длинными (20 оснований, (Zhao eta!., 1995). Благодаря этому низкая температура отжига стала необходима только в первом цикле ПЦР, а последующая амплификация

происходит при гораздо более жестких условиях (с температурой отжига 60°С) и уже нечувствительна к мелким температурным дисбалансам. Модифицированный таким образом, ДД стал заметно более воспроизводимым (Zhao et al., 1995, Diatchenko et al., 1996), кроме того, значительно облегчилось проведение последующих манипуляций (реамплификация изолированных полос и их секвенирование). Тем не менее, это не решило проблему ложных позитивов целиком.

П�