Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новый метод анализ генной экспрессии посредством рестрикционного картирования клеточных популяций кДНК. Идентификация и клонирование дифференциально экспрессирующихся генов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Новый метод анализ генной экспрессии посредством рестрикционного картирования клеточных популяций кДНК. Идентификация и клонирование дифференциально экспрессирующихся генов"

На правах рукописи

ИВАНОВА Наталья Борисовна

НОВЫЙ МЕТОД АНАЛИЗА ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ ПОСРЕДСТВОМ РЕСТРИКЦИОННОГО КАРТИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ кДНК. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КЛОНИРОВАНИЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ ГЕНОВ.

Специальность 03.00.03. - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-1996

Работа выполнена в KHK "Молекулярные основы дифференцировки и развития" Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

A.B. Белявский

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Н.К. Янковский

кандидат биологических наук P.JI. Турецкая

Ведущая организация : Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Зашита диссертации состоится " Л J " МЯЛ 1996 г. в /О часов на заседании диссертационного Совета Д 002.79.01 в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва В-334, ул. Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан " " г.

1

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

А.М. КРИЦЫН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность задачи. Дифференциальная генная экспрессия, реализуемая путем синтеза различных наборов мРНК, лежит в основе разнообразия фенотипов и функций живых организмов и в значительной мере определяет все жизненные процессы - развитие и дифференцировку, ответы на внешние воздействия, процессы гомеозиса, регуляцию клеточного цикла и даже запрограммированную клеточную смерть. Нормальное развитие, также как и патологические изменения, возникающие при различных заболеваниях, независимо от того, вызваны ли они одиночной мутацией или сложными мультигенными эффектами, сопровождаются изменением картины генной экспрессии. Сравнительный анализ генной экспрессии в различных типах клеток дает базисную информацию, опираясь на которую можно анализировать биологические процессы на молекулярном уровне.

Для идентификации и клонирования дифференциально экспрессирующихся генов в настоящее время широко применяются различные варианты дифференциального скрининга библиотек кДНК в сочетании, когда это необходимо, с вычитающей гибридизацией, а также фингерпринтирование клеточной популяции мРНК посредством ПЦР-амплификации с произвольными праймерами (дифференциальный дисплей мРНК). Одним из наиболее существенных недостатков этих методов является низкая чувствительность, что позволяет работать преимущественно с мРНК, имеющими относительно высокий уровень экспрессии - от нескольких сотен копий на клетку и выше. Однако, показано, что подавляющее большинство клеточных мРНК (около 96%) относится к классу редких последовательностей, число копий которых в клетке не превышает нескольких десятков. Предложенный недавно метод серийного анализа генной экспрессии, представляющий собой один из вариантов тотального секвенирования библиотек кДНК, теоретически обеспечивает возможность анализа редких мРНК, но его трудоемкость не позволяет надеятся на широкое применение в ближайшем будущем. Таким образом, разработка высокочувствительных методов анализа генной экспресии является актуальной задачей.

Цель работы. Целью исследования является разработка метода анализа генной экспрессии, позволяющего проводить идентификацию и клонирование дифференциально экспрессирующихся генов, в том числе с низким уровнем экспрессии.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе представлен новый метод анализа генной экспрессии, в основу которого положено рестрикционное картирование клеточной популяции кДНК высокого разрешения. В качестве основных стадий он включает получение репрезентативной популяции фрагментов кДНК, в которой каждому виду мРНК соответствует не более одного вида фрагментов кДНК, имеющих специфическую длину и последовательность, понижение сложности полученного набора фрагментов кДНК путем разбиения на менее сложные слабо-пересекающиеся поднаборы и анализ таких поднаборов при помощи высокоразрешающего электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле. Метод, таким образом, основан на визуализации фрагментов кДНК и позволяет "считывать" уровень генной экспрессии непосредственно с геля. Предлагаемый подход обеспечивает возможность прямого качественного и количественного сравнения спектров клеточных мРНК и детекции дифференциально экспрессируемых мРНК, что продемонстрировано на примере поиска генов, дифференциально экспрессирующихся в тимусе и селезенке мыши.

Метод может быть использован в молекулярной биологии и медицине для анализа экспрессии генов, диагностики и выявления механизмов патологий на генетическом уровне.

Структура и объем работы. Работа изложена на 98 страницах машинописного текста; включает введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы (99 названий); содержит 18 рисунков и 4 таблицы.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на ежегодном конкурсе научных работ ИМБ РАН (Москва, 1995) в виде внеконкурсного сообщения и на международной Энгельгардтовской конференции (Москва, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 печатные работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Основные этапы процедуры. Обобщенная схема предложенного метода анализа генной экспрессии приведена на рисунке 1. Разработка протокола проходила в два этапа. Первоначально был использован упрощенный вариант метода, обозначенный на схеме цифрой (Т) ; вариант (П) , включающий дополнительную стадию разбиения исходного препарата кДНК на менее сложные поднаборы, был разработан для анализа редких мРНК.

Первым шагом процедуры является синтез двуцепочечной кДНК, иммобилизованной на твердофазном носителе. Применялись два варианта синтеза, представленные на рисунке 2. В первом варианте (рис. 2А) реакция обратной транскрипции проводилась с использованием олиго(ёТ)-праймера, несущего на 5'-конце биотин-содержащую группу. После присоединения к 3'-концу первой цепи кДНК олиго(сЮ)-"хвосга" при помощи терминальной трансферазы синтезировалась вторая цепь кДНК с использованием олиго(с1С)-праймера и ДНК-полимеразы ВюТац. После удаления димеров праймеров осаждением цетавлоном молекулы кДНК иммобилизовались на магнитные частицы, содержащие стрептавидин, обладающий высоким сродством к биотину. Во втором варианте (рис. 2Б) при синтезе первых цепей кДНК использовался олиго(<1Т)-праймер, ковалентно пришитый за 5'-конец к магнитным частицам. Тейлирование в этом случае приводило к появлению неспецифического высокомолекулярного фона при последующей ПЦР-амплификации. Поэтому синтез вторых цепей инициировался посредством самоотжига З'-концов первых цепей кДНК на внутренних участках молекул и проводился модифицированной ДНК-полимеразой фага Т7 Sequena.se. В таком варианте иммобилизация кДНК на твердофазном носителе существенно упрощает и ускоряет процедуру, а также исключает потери материала при осаждении и очистке.

Оба использованных варианта синтеза кДНК предполагают работу с 3'-

1

концевыми фрагментами кДНК, что достигается за счет использования олиго(сГГ)-праймера, инициирующего синтез первой цепи на поли(А)-"хвосте" мРНК.

з

мРНК

Двухцепочечная кДНК, иммобилизованная на твердофазном носителе

■АААААААА

Синтез двухце почечной кДНК, иммобилизованной на твердофазном носителе.

Адаптор

3'-концевые фрагменты кДНК

®

1. Обработка частошепящей эндонуклеазой рестрикции

2. Лигирование адаптера

ПЦР-амплификация с биотинилированным олиго((1Т)-' и адапторным праймерами, — иммобилизация.

Шаг 1

Одна из возможных —ГТГШ комбинаций жм С

праймеров

Твердофазный носитель

1. ПЦР-амплификация

2. Иммобилизация

Шаг п

—пттс*0

1

Уменьшение сложности набора фрагментов кДНК посредством разбиения на поднаборы при помощи ПЦР-амплификации

Один из возможных поднаборов фрагментов кДНК

Обработка ферментом 1

I Обработка | ферментом п

Уменьшение сложности набора фрагментов кДНК посредством обработки эндонуклеазами рестрикции

О

5

Электрофорез в . полиакриламидном геле

Рисунок 1. Схема предложенного метода картирования клеточных популяций мРНК.

МРНК

Биотин-и| ТТТТТ

Биотмнилированный

олиго(<Ш-праймер

«СССССС

ОООООО, ■СССССС ■

000006« ■СССССС-

« ААААААА

Обратная транскрипция Очистка от свободного прайыера

I-Биотин

Присоединение олиго(сЮ)-"хвоста

■ ТТТТТ ■■ -Биотин

•ААААААА

Щелочной гидролиз РНК I-Биотин

Синтез второй цепи кДНК

I -Биотин

Иммобилизация на твердофазной носителе

«!' П7ГШ*Биотин-5

мРНК

■ТТТТТ

олиго(сЛ>лраЙмер, ковалентно пришитый к носителю

О

Обратная транскрипция

Температурная денатурация цепей

Отжиг З'-концов кДНК на внутренних участках молекул

Синтез второй цепи

¡шттш^

Рисунок 2. Варианты синтеза двуцепочечной кДНК, иммобилизованной на твердофазном носителе. А. Синтез кДНК в растворе с последующей иммобилизацией. Б. Синтеза с олиго(дТ)-праймером, ковалентно пришитым к твердофазному носителю.

Иммобилизованные кДНК обрабатываются частощепящей эндонуклеазой рестрикции, и к оставшимся на твердой фазе 3'-концевым фрагментам, соответствующим участкам мРНК от сайта отжига олиго(с1Т)-праймера до ближайшего рестриктного сайта, лигируется двуцепочечный адаптер. Таким образом, каждая мРНК оказывается представленной не более чем одним фрагментом кДНК. Этот этап процедуры является первым шагом по устранению гетерогенности длин кДНК одного вида, обусловленной деградацией РНК и синтезом неполноразмерных цепей на стадии обратной транскрипции. 1

Следующим этапом процедуры является понижение сложности полной популяции полученных 3'-концевых фрагментов путем разбиения на слабопересекающиеся поднаборы посредством ПЦР-амплификации препарата с

фланкирующими праймерами, содержащими дополнительные дискриминирующие нуклеотиды. Эта стадия может повторятся многократно, пока не будет достигнуто требуемое упрощение. Праймеры для каждого раунда разбиения конструируются путем добавления к 3'-концам праймеров, использованных на предыдущей стадии, одного из возможных вариантов нуклеотидов. Модификация каждого фланкирующего праймера в общем случае позволяет разбивать набор фрагментов на четыре поднабора - в, А, Т, С- поднаборы (на начальном этапе разбиения для олиго((1Т)-праймера возможны только три варианта - в, А, С). Модификация обоих праймеров дает 16 различных поднаборов (12 - для начального этапа разбиения). Принимая во внимание средний размер популяции мРНК (15 тысяч последовательностей) и упрощение за счет рестрикции (доля фрагментов, расщепляемых в результате обработки ферментом с шестибуквенным сайтом узнавания, составляет около 5% от исходного нерасщепленного набора), можно считать, что даже анализ экспрессии редких генов потребует не более двух раундов разбиения. В случае, когда анализируются мРНК средней и высокой степеней представленности, этот этап процедуры может быть опущен.

После предварительного разбиения на поднаборы иммобилизованные фрагменты кДНК радиоактивно метятся по концу, не содержащему биотин, для визуализации их положения на геле.

Следующая стадия - последовательная обработка эндонуклеазами рестрикции -преследует две основные цели: устранение гетерогенности длин фрагментов, обусловленной неоднозначностью позиции отжига олиго(с!Т)-праймера при синтезе первых цепей, и дополнительное разбиение анализируемого набора фрагментов на менее сложные поднаборы. После каждой реакции рестрикции отщепленные фрагменты собираются и анализируются в денатурирующем полиакриламидном геле, полученные для разных препаратов мРНК радиоавтографы сравниваются, фрагменты предполагаемых дифференциально экспрессирующихся генов вырезаются из геля, элюируются и с помощью представленной на рисунке 3 процедуры клонируются в подходящий вектор.

Вырезание полос из геля Элюцня фрагментов

Есо1*! |

4ВашН I

БаиЗА 11

{Й-тейлинг -СССОССО

БаиЗА 11 ЕсоЯЦ

.СССССС

ПЦР-ам пл ифи нация

4 ЕсоШ

.СССССС

ЕсоЯ [ I

Обработка ВатН [ и ЕсоЧ I

|ВатН I

ЭаиЗА I |

| Лигирование

—— ссссс-

Трансформация

1

Отбор нужных клонов

Рисунок 3. Схема процедуры клонирования обнаруженных фрагментов дифференциально экспрессирующихся генов.

На 5'-концах выделенных из геля фрагментов содержится последовательность, комплементарная адапторному праймеру. К 3'-концам присоединяются олиго(сЮ)-"хвосты", что обеспечивает возможность ПЦР-амплификации с использованием олиго(с!С)- и адапторного праймеров, в 5'-концевые участки которых введены рестриктные сайты для клонирования. Несколько рекомбинантных клонов анализируются с помощью метода быстрого секвенирования плазмидных вставок, ПЦР-амплифицированных непосредственно с колоний. Искомый фрагмент обычно соответствует наиболее часто встречающемуся клону. Введение дополнительных этапов клонирования и секвенирования обусловлено необходимостью очистки фрагмента от загрязняющих примесей, попадающих в препарат на этапе вырезания полос из геля. Такие примеси могут существенно изменить, например, картину гибридизации при последующей проверке специфичности фрагмента.

Одной из важных характеристик предложенного метода анализа генной экспрессии является полнота охвата популяции мРНК. В данном случае вопрос состоит в том, насколько полно клеточная популяция мРНК может быть представлена наборами фрагментов, получаемых в результате первичной обработки эндонуклеазой рестрикции и далее при последовательной обработке вторичными эндонуклеазами. Для оценки возможных "потерь" последовательностей было проведено компьютерное моделирование процедуры. Контрольная выборка включала 659 известных последовательностей мРНК мыши из банка нуклеотидных последовательностей EMBL (Release 38), имеющих полностью просеквенированный 3'-конец. Распределения длин 3'-концевых фрагментов, получаемых после обработки первичной эндонуклеазой рестрикции, приведено на рисунке 4А для ферментов с четырехбуквенным (Sau3 I) и шестибуквенным (BamH I) сайтами узнавания. В случае Sau3A I 93% полноразмерных кДНК содержали сайт расщепления на расстоянии не более 1500 нуклеотидных пар от сайта полиаденилирования, следовательно, полученные 3 -концевые фрагменты кДНК попадали в область эффективной ПЦР-амплификации. В случае BamH I доля таких кДНК составляла 34% от общего числа последовательностей. Для варианта первичного расщепления эндонуклеазой Sau3A I

была рассчитана зависимость количества расщепленных фрагментов от числа последовательно проведенных вторичных рестрикций. Вычисления, результаты которых представлены на рисунке 4Б, были проведены для ферментов с четырехбуквенными и шестибуквенными сайтами узнавания и показали, что в первом случае небольшого набора ферментов достаточно для практически полного анализа (96% 3'-концевых фрагментов, полученных после первичного расщепления вовлекаются в анализ).

А Б

Рисунок 4.

A. Распределение фрагменов, получаемых после первичной обработки эндонуклеазой рестрикции. Данные приведены для ферментов БаиЗА I и ВашН I. Плотность фрагментов определялась как доля ( в % от общего числа последовательностей) кДНК, имеющих сайт расщепления внутри 10-нуклеотидного интервала вокруг данного значения длины, разделенная на 10. Интегрирование плотности по всему диапазону длин дает долю мРНК, вовлеченных в анализ.

B. Зависимость числа фрагментов кДНК, расщепленных в результате последовательной обработки эндонуклеазами рестрикции, от числа проведенных рестрикций для ферментов с четырех- и шестибуквенными сайтами узнавания.

При необходимости долю расщепленных фрагментов можно довести до 100%, если в 5'-концевую часть последовательности олиго(<1Т)-праймера ввести сайт узнавания последней в наборе для вторичных рестрикций эндонуклеазы. При этом на 3'-конец праймера нужно добавить один или два дополнительных нуклеотида для

заякоривания праймера на конце поли(А)-"хвоста" мРНК и устранения таким образом гетерогенности длин получаемых фрагментов. Ферменты с четырехбуквенными сайтами узнавания, однако, дают наборы фрагментов, слишком сложные для анализа в полиакриламидном геле, разрешающая способность которого ограничена несколькими сотнями полос на одной дорожке. Рестриктазы с шестибуквенными сайтами узнавания дают менее сложные наборы фрагментов. Поэтому, оптимальный набор ферментов для последовательных вторичных рестрикций должен содержать несколько эндонуклеаз с шестибуквенными сайтами узнавания, за которыми должны следовать ферменты с пяти- и четырехбуквенными сайтами.

2. Проверка пригодности процедуры для поиска дифференциально экспрессирующихся генов. Первоначальный упрощенный вариант (Т) был использован для поиска генов, дифференциально экспрессирующихся в тимусе и селезенке мыши. Первичные расщепления были проведены ферментами Sau3A I и BamH I. Набор ферментов для вторичных рестрикций включал EcoR I, Pst I, Msp I и HinP I. Полученные сравнительные карты генной экспрессии приведены на рисунке 5. Для четырех дифференциальных полос, обозначенных стрелками, были проведены клонирование, секвенирование и дополнительная проверка картины экспрессии при помощи гибридизации с Northern блотами препаратов поли(А)+ мРНК из тимуса и селезенки. Результаты Northern-блот гибридизации представлены на рисунке 6 (А-Г). Полоса 1 при клонировании дала две различные последовательности 1.1 и 1.2, что объясняется неточностями при вырезании полосы из геля (по-видимому, последовательность 1.2, дающая менее интенсивный гибридизационный сигнал, соответствует нижней полосе детектируемого на радиоавтографе дублета). Обе последовательности имеют высокий уровень экспрессии в тимусе и не детектируются при гибридизации с мРНК из селезенки (рис. 6А, Б). Гибридизация с фрагментом 2 выявила транскрипт, уровень экспрессии которого в селезенке приблизительно в десять раз превышал уровень экспрессии в тимусе (рис. 6В).

344

298

1 2 3 4 5 L TSTSTSTSTS

220 201 .

154 , 134 |

75

Рисунок 5. Сравнительный анализ генной экспрессии в тимусе и селезенке мыши. Первичные расщепления проведены эндонуклеазами Sau3A I (дорожки1-4) и BamH I (дорожка 5). Последовательная обработка эндонуклеазами рестрикции включала ферменты EcoR I (дорожка 1), Pst I (дорожки 2, 5), Msp I (дорожка 3), HinP I (дорожка 4). Для фрагментов, обозначенных стрелками, была проведена независимая проверка картины экспрессии соответствующих генов.

Нуклотидная последовательность фрагмента 3 совпала с 3'-концевым участком последовательности теминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы. Данные по экспрессии (рис. 6Г) также совпали с известными из литературы (Когиа! еС а1., 1986). Фрагмент 4 не дал сигнала при гибридизации с МогЛегп-блотами, вероятно, из-за недостаточной длины гибридизационного зонда и был проверен при помощи гибридизации с 5ошЬегл~блотом обработанных эндонуклеазой рестрикции ВатН I

ПЦР-амплифицированных библиотек кДНК. Фрагмент, имеющий длину 500 нуклеотидных пар, был детектирован в препарате из тимуса; в препарате из селезенки сигнал отсутствовал (рис. 6Д). Таким образом, для всех исследованых фрагментов данные по локализации экепресии, полученные с помощью предложенной процедуры, полностью подтвердились в результате независимой проверки. Нуклеотидные последовательности обнаруженных фрагментов, за исключением фрагмента 3, не дали значимых гомологии при поиске по банку нуклеотидных последовательностей EMBL (Release 38). Они были помещены в банк данных под номерами Х83884, Х83885, Х83886 и Х84016. Уровень представленности мРНК, соответствующих исследованным фрагментам, может быть оценен на основе известных из литературы данных по распределению мРНК терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы, которая относится к классу мРНК средней степени представленности. На основе данных Northern-блот гибридизации можно утверждать, что в случае высокоспециализированных тканей даже упрощенный вариант метода позволяет исследовать мРНК средней степени представленности и некоторые редкие последовательности.

STSTSTST S т

Рисунок 6. Гибридизация фрагментов 1.1 (А), 1.2 (Б), 2 (В), 3 (Г) с №>пЬет-блотами РНК из тимуса (Т) и селезенки (С) мыши. Д. Гибридизация фрагмента 4 с БоиЛегп-блотом кДНК.

Несмотря на то, что метод удовлетворительно сработал при поиске генов, обладающих дифференциальной экспрессией в тимусе и селезенке мыши, ясно, что для анализа экспрессии редких генов необходимо повысить его разрешающую способность. Действительно, даже в случае, когда для последовательной обработки эндонуклеазами рестрикции берутся ферменты с шестибуквенными сайтами узнавания, на одну дорожку геля может приходиться до 2000 различных фрагментов (эта оценка справедлива для популяций мРНК, состоящих из 20-50 тысяч молекул). Поскольку с помощью денатурирующего полиакриламидного электрофореза можно разделять не более 400 полос, это означает, что лишь 10-30% наиболее часто встречающихся фрагментов дадут сигналы, четко детектируемые на фоне редких последовательностей.

3. Повышение чувствительности метода посредством разбиения исходной популяции фрагментов кДНК на менее сложные поднаборы. Для этой цели была выбрана стратегия разбиения полной популяции фрагментов кДНК на слабо-пересекающиеся поднаборы меньшей сложности при помощи ПЦР-амплификации с праймерами, содержащими на 3'-концах дополнительные дискриминирующие нуклеотиды. Возможность такого подхода была продемонстрирована в работах по аллель-специфичной амплификации участков геномной ДНК (Ehlen and Dubeau, 1989), а также при попытке повысить разрешающую способность дифференциального дисплея мРНК (Ralph et al., 1993). Для ряда ДНК-полимераз, в том числе и для Taq-полимеразы, было показано, что эффективность удлинения совершенных дуплексов праймер-матрица существенно превышает эффективность удлинения дуплексов, имеющих на З'-концах неспаренные основания (Huang et al., 1992). Константы дискриминации для разных типов 3'-концевых мисматчей лежат в диапазоне 10~2-10'7. Стоит отметить, что эффективность дискриминации для обратной транскриптазы AMV лежит в пределах 10-10'3 (Mendelman et al., 1990), что существенно ниже эффективности для Taq-полимеразы, поэтому разбиение полной популяции мРНК на поднаборы не выгодно производить на стадии обратной транскрипции.

Определяющее влияние на селективность процедуры оказывает стадия формирования комплекса праймер-матрица: образование высокостабильных и

долгоживущих комплексов отрицательно влияет на степень дискриминации. Первоначально использованные адапторные праймеры с дополнительными 3'-концевыми нуклеотидами длиной 27 нуклеотидов не давали практически никакой дискриминации в широком диапазоне температур отжига (рис. 7Б ), при уменьшении длины праймера до 19 нуклеотидов за счет удаления 5'-концевой части, хорошая дискриминация была достигнута при температуре отжига 57°С (рис. 7А). Другие параметры ПЦР оказывают существенно меньшее влияние.

Т=57°С Т=60°С

Ь=19 т Ь=27 т

5 '-ССТТСАААТАААСССАТСН 5 '-САТСаОТТТАТТТОААОСТТСОАОСССАССМ

№ О А Т С — О АТС —

Ф !

Рисунок 7. Разбиение участка библиотеки фрагментов кДНК на четыре поднабора при помощи адапторного праймера с дополнительными дискриминирующими нуклеотидами для праймеров длиной 19 нуклеотидов (А) и 27 нуклеотидов (Б). Библиотека была предварительно амплифицирована с Био-Т13-ХЬо-Т6~Ы праймером, Н=0,А,Т,С (5'-биотин-ССССТТТТГТТГГТТГТСТССАОТТТТГТЫ) и адапторным праймером (5 '-САТССаТТТ АТТТСААССтЮ АССССАСО).

Теоретически, разбиение при помощи адапторного праймера дает четыре поднабора (в, А, Т, С), в случае разбиения при помощи олиго(с1Т)-праймера получается три поднабора (в, А, С), а их комбинация дает двенадцать поднаборов.

Эффективность каждого из этих вариантов была проверена в эксперименте на полной мРНК из эмбрионов Хепориз /аег« на стадии ранней гаструлы.

Для разбиения с помощью дополнительных нуклеотидов на 3'-конце олиго(с1Т)-праймера были использованы олигонуклеотиды Био-Т|3-Х1к>-Т6ТЧ, N=0, А, Т, С (5'-биотин-ССССТТТТТТТТТТТТТСТССАОТГГТТШ). Полученные результаты (рис. 8А, Б) показывают неэффективность такого разбиения, что может быть обусловлено несколькими факторами. Во-первых, принимая во внимание наличие на 3'-конце мРНК А/Т-богатых последовательностей, олиго(с1Т)-праймер может иметь несколько альтернативных сайтов отжига на внутренних участках кДНК, что приводит к синтезу фрагментов кДНК, которые при расщеплении по внутренним сайтам дают фрагменты рестрикции одинаковой длины (рис. 8Б). При расщеплении эндонуклеазой, сайт узнавания которой входит в последовательность праймера, получаются фрагменты разных длин (рис. 8А). Во-вторых, из-за неоднозначно определенной позиции отжига олиго((1Т)-праймера на поли(А)-участке возможен синтез продуктов с мисматчами во втором 3'-концевом положении, что, как и в случае с внутренними сайтами отжига, приводит к синтезу нескольких фрагментов, соответствующих одной и той же последовательности мРНК.

При разбиении на поднаборы с помощью адапторного праймера ситуация существенно улучшается - полученные поднаборы практически не перекрываются (рис. 8В).

Таким образом, наиболее эффективна процедура разбиения на поднаборы с помощью адапторных праймеров. При этом первый шаг осуществляется с четырьмя вариантами праймеров (в, А, Т, С). Амплифицированный материал иммобилизуется на стрептавидиновые магнитные микрошарики для удаления праймеров, и. при необходимости, проводится второй цикл разбиения. При этом для каждого адапторного праймера, использованного на предыдущей стадии, применяются следующие четыре варианта дискриминирующих нуклеотидов. Таким образом, в результате двух циклов разбиения исходный препарат дает шестнадцать поднаборов. Дискриминация одновременно по двум 3'-концевым нуклеотидам идет неэффективно

Xho I Pst I

Xhol

Pstl

- «

— ■»

G А С G А С G АТС Blo-T13XhoT6N AdN

AdG

_ GAT С AdGN Bto-T13XhoT6G

Рисунок 8. Результаты разбиения препарата 3'-концевых фрагментов кДНК из эмбрионов Xenopus laevis на стадии ранней гаструлы на менее сложные поднаборы. Расщепления проводились эндонуклеазами рестрикции Pst I (Б, Г) и Xho I (А, В), сайт узнавания которой входит в последовательность олиго(<1Т)-праймера. Комбинации праймеров, использованных для ПЦР-амплификации, приведены в нижней части рисунка.

(Мои et al., 1994). Пошаговое разбиение с помощью адапторных праймеров может быть продолжено и далее, однако, даже для популяций мРНК, включающих 50 тысяч различных последовательностей, два цикла разбиения в сочетании с обработкой эндонуклеазой рестрикции с шестибуквенным сайтом узнавания дают около 200 полос на одной дорожке полиакриламидного геля и могут эффективно анализироваться (рис. 8Г). В случае, когда начальное количество экспериментального материала ограничено, перед разбиением необходимо провести предварителыгую ПНР-амплификацию препарата с немодифицированными концевыми праймерами для того, чтобы улучшить соотношение сигнал:фон. Экспериментально показано, что такая предварительная амплификация не приводит к изменениям на радиоавтографах. 4. Воспроизводимость процедуры. Основной стадией процедуры, приводящей к появлению артефактов, может быть ПЦР-амплификация, поэтому принимались специальные меры для повышения ее надежности. При проведении реакции использовался "горячий старт", при котором Taq-полимераза добавлялась к реакционной смеси после нагревания до температуры денатурации. Дополнительно использовался новый продукт Perfect Match (Stratagene), дестабилизирующий несовершенные дуплексы праймер-матрица. Адапторный праймер добавлялся в реакционную смесь на стадии денатурации второго цикла амплификации, так как его присутствие в первом цикле, который проводится в условиях низкотемпературного отжига (42°С), может приводить к амплификации внутренних участков последовательностей и понижать выход полезных продуктов. Полученные результаты показывают, что карты генной экспрессии хорошо воспроизводятся в независимых экспериментах для последовательностей с высокой и средней степенями представленности, в случае низко представленных фрагментов воспроизводимость понижается. Причины такого явления до конца неясны. Вполне возможно, что при высоком разрешении на картах становится видимым невоспроизводимый фон, вносимый следовыми примесями нуклеиновых кислот, загрязняющих Некоторые партии ферментов. При анализе экспрессии редких генов необходимо проводить как минимум две серии параллельных экспериментов и отбирать для дальнейшего анализа только те полосы, интенсивность которых совпадает в обоих сериях. Стоит, однако,

отметить, что полученный уровень воспроизводимости существенно выше, чем в методе дифференциального дисплея мРНК, где невоспроизводимость проявляется уже на уровне последовательностей с высокой и средней степенями представленности.

5. Сравнение с другими методами анализа генной экспрессии, возможные усовершенствования и перспективы применения. По сравнению с методом дифференциального скрининга предложенный подход позволяет существенно понизить уровень детекции дифференциально экспрессируемых мРНК за счет исключения стадии гибридизации чрезвычайно сложной смеси нуклеиновых кислот. Кроме того, возможен одновременный анализ сразу нескольких препаратов. Информация, полученная в результате процедуры, не теряется и позволяет соотносить новые последовательности с известными ранее. Дополнительным преимуществом является снижение трудоемкости и временных затрат. Полная процедура с разбиением на шестнадцать независимых поднаборов и расщеплением набором из десяти эндонуклеаз рестриктаз занимает у одного исследователя не более недели.

По сравнению с дифференциальным дисплеем мРНК метод дает преимущества при полномасштабном анализе популяций мРНК за счет возможности разбивать исходный препарат на слабопересекающиеся поднаборы. При использовании дифференциального дисплея необходимо проводить до тысячи независимых реакций ПЦР-амплификации, результаты которых в значительной степени перекрываются. Метод позволяет получать адекватное отображение популяции мРНК, что практически невозможно в случае дифференциального дисплея, где интенсивность полосы определяется не только уровнем представленности соответствующей последовательности мРНК, но и степенью сродства произвольного праймера к матрице. Кроме того, в предложенном методе каждая последовательность мРНК представлена одним фрагментом кДНК, длина которого является инвариантной и определяется расстоянием между двумя рестрикгными сайтами, тогда как при использований дифференциального дисплея часто невозможно заранее определить положение фрагмента известной последовательности на геле. Немаловажным преимуществом является повышение воспроизводимости результатов.

Среди планируемых усовершенствований стоит отметить использование для физического разделения фрагментов кДНК систем двумерного гельэлектрофореза, с помощью которого можно одновременно анализировать до двух тысяч фрагментов (Lerman and Silverstein, 1987, Utterlinden et al., 1989), что позволит значительно снизить трудоемкость процедуры. При этом для разделения фрагментов в первом направлении может проводится электрофорез в денатурирующем градиенте, а во втором - обычный денатурирующий электрофорез. При электрофорезе в денатурирующем градиенте происходит разделение последовательностей по нуклеотидному составу, основанное на том, что в условиях, соответствующих температуре плавления двойной спирали молекула резко меняет свою подвижность. Во втором направлении фрагменты разделяются по длинам.

Предложенный метод открывает новые возможности для создания баз данных генной экспрессии. Каждую последовательность мРНК можно однозначно идентифицировать на геле по длине соответствующего фрагмента кДНК, а интенсивность полосы определяется уровнем экспрессии. С учетом возможностей двумерного электрофореза, это позволит вести одновременный мониторинг экспрессии огромного числа генов.

ВЫВОДЫ:

1. Разработан новый метод анализа генной экспрессии, в основу которого положено рестрикционное картирование клеточной популяции кДНК высокого разрешения.

2. Показано, что предложенный подход обеспечивает возможность прямого качественного и количественного сравнения спектров клеточных мРНК и детекции дифференциально экспрессируемых мРНК. При анализе генной экспрессии в тимусе и селезенке мыши обнаружено четыре ранее не известных гена, обладающих тканевой специфичностью экспрессии.

3. Для анализа мРНК с низкой степенью представленности разработан специальный высокочувствительный вариант процедуры, включающий дополнительную стадию пошагового разбиения общей популяции кДНК на слабопересекающиеся поднаборы меньшей сложности при помощи ПЦР-амплификации с

фланкирующими праймерами, на 3'-концах которых содержаться дополнительные дискриминирующие нуклеотиды.

4. Показано, что разбиение на поднаборы при использовании олиго(<ГГ)-праймера идет менее эффективно, чем при использовании адапторного праймера.

5. Исследована зависимость эффективности разбиения от параметров ПЦР-амплификации и подобраны условия, обеспечивающие максимальную эффективность процедуры.

6. Предложена процедура клонирования идентифицированных фрагментов кДНК.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Иванова Н.Б., Фесенко И.В., Белявский А.В. 1994. Новый метод сравнительного анализа экспрессии генов и идентификации дифференциально экспрессирующихся мРНК., Молекулярная биология, т. 28, вып. 6: 1367-1375

2. Ivanova N.B. and Belyavsky A.V. 1995. Identification of differentially expressed genes by restriction endonuclease-based gene expression fingerprinting. Nucleic Acids Res., 23: 2954-2958.

3. Ivanova N.B. and Belyavsky A.V. 1996. Restriction endonuclease-based gene expression fingerprinting. In Gene cloning and analysis: Current innovations., Ed: B.Schaefer, Horizon Scientific Press, (принято к печати).