Участие НАДФН-оксидазы плазмалеммы в генерации супероксид-анион радикала в апопласте

Пиотровский, Михаил Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Участие НАДФН-оксидазы плазмалеммы в генерации супероксид-анион радикала в апопласте
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Участие НАДФН-оксидазы плазмалеммы в генерации супероксид-анион радикала в апопласте"

На правах рукописи

Пиотровский Михаил Сергеевич

Участие НАДФН-оксидазы плазмалеммы в генерации супероксид-анион радикала в апопласте

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О СЕН 2012

Москва-2012

005047112

Работа выполнена в лаборатории мембран растительных клеток Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Трофимова Марина Сергеевна

Официальные оппоненты:

Новикова Галина Викторовна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, лаборатория молекулярных основ внутриклеточной регуляции, ведущий научный сотрудник

Дыкман Лев Абрамович, доктор биологических наук, старший научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, лаборатория иммунохимии, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Биологический факультет, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится «9» октября в «11» часов на заседании диссертационного совета Д 002.210.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., 35.

Факс: (499) 977-80-18, электронная почта: m-azarkovich@ipDras.ru: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук

Автореферат диссертации размещен на сайтах ВАК РФ и wvvw.ippras.ru Автореферат разослан «7» сентября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Актуальность проблемы. Согласно исследованиям последних лет функции активных форм кислорода (АФК) в физиологических процессах растительной клетки являются более разнообразными и важными, чем предполагалось (Dat et al., 2000; Apel and Hirt, 2004). Если ранее считали, что эти молекулы оказывают деструктивное действие на белки, липиды, ДНК (Moller et al., 2007), являются важным элементом в реализации фитоиммунитета (Bindschedler et al, 2006), а также выполняют субстратную роль в синтезе лигнина и суберина (Bernards et al., 2004), то в последнее время все более подтверждается их значение как регуляторов роста и развития растений (Foreman et al., 2003; Tsukagoshi et al., 2010) и модуляторов внутриклеточных процессов сигналинга (Miller et al., 2008; Pitzschke and Hirt, 2009). Известно, что в растительной клетке АФК образуются в хлоропластах, митохондриях, пероксисомах и апопласте. Значение апопласта в жизни клетки достаточно велико. Именно апопласт является компартментом, в котором локализованы первичные сенсоры стрессовых сигналов, работает механизм их декодирования и передачи декодированного сигнала на белки-регуляторы, через апопласт транспортируются потоки воды, ионов и других веществ, определяя в значительной степени внутреннюю среду цитозоля (Miller et al., 2010). Уровень АФК в апопласте зависит от активности ряда ферментов, таких как аминооксидазы (Angellini et al., 2008), оксалатоксидазы (Galiskan and Cuming, 1998) и пероксидазы III типа (Bolwell et al., 2002; Kawano, 2003) - секретируемые белки, а также интегрального белка плазмалеммы - НАДФН-оксидазы (Torres and Dangl, 2005). Биохимическая функция НАДФН-оксидазы состоит в катализе реакции образования 02 путем переноса электрона от НАДФН на 02 (Vignais, 2002). Образующийся 02 ~ в результате реакции дисмутации с участием супероксиддисмутазы или самопроизвольно переходит в более долгоживущую форму АФК - Н202. Согласно молекулярно-генетическим исследованиям, НАДФН-оксидазы растений имеют гомологию с каталитической субъединицей gp91phox фагоцитов и принадлежат к NOX-семейству белков (Sagt and Fluhr, 2006; Kawahara et al., 2007). В оптимальных условиях существования растений стационарная концентрация АФК поддерживается на достаточно низком уровне. При возникновении температурного или других типов неблагоприятных воздействий образование АФК резко возрастает, что индуцирует окислительный стресс и активирует защитные реакции организма (Miller et al., 2008). Какие изменения в структуре и активности НАДФН-оксидазы плазмалеммы происходят при этом, пока не исследовано, однако о наличии ответной реакции на изменение температурного режима свидетельствует ряд фактов. Например, показано, что растения Arabidopsis, трансгенные по генам rboh, более чувствительны к температуре, чем дикий тип (Larkindale et а!., 2005). Кроме того, обнаружено участие продукта гена rbohD в дистанционной передаче информации о содержании АФК по растению в ответ на изменение температуры или других факторов (Miller et al, 2009). Исходя из данных о молекулярных характеристиках и физиологических эффектах, можно предполагать, что НАДФН-оксидаза плазмалеммы является наиболее вероятным претендентом на роль участника системы клеточного сигналинга среди других АФК-производящих

ферментов в апопласте. Одним из экспериментальных подходов для доказательства этой роли может быть исследование особенностей активации этого фермента при изменении температуры выращивания растений, что и было предпринято в настоящей работе.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании свойств и активности НАДФН-оксидазы плазмалеммы как источника образования АФК в апопласте клеток растений при изменении условий роста. Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1) Оценить и охарактеризовать супероксид-продуцирующую НАДФН-оксидазную активность плазмалеммы, изолированной из этиолированных проростков кукурузы;

2) Определить динамику образования перекиси водорода в проростках после снижения температуры выращивания от 25 до б°С;

3) На системах разного уровня сложности (плазмалемма, клетки, проростки) исследовать активность НАДФН-оксидазы в зависимости от аналогичных изменений температуры выращивания;

4) В белковом спектре плазмалеммы выявить белки, обладающие супероксид-продуцирующей активностью, и идентифицировать среди них вестерн-блот анализом белки ЫОХ-семейства.

5) С помощью нативного электрофореза высокого разрешения (ЬгСИ-РАОЕ) выяснить необходимость белок-белковых взаимодействий для проявления активности НАДФН-оксидазы.

6) Путем сопоставления молекулярных масс белковых комплексов плазмалеммы с супероксид-продуцирующей и пероксидазной активностями проверить возможность их локализации в одном и том же мембранном комплексе.

Научная новизна. Впервые обнаружено, что активность НАДФН-оксидазы плазмалеммы возрастает относительно исходного уровня в течение первых часов снижения температуры выращивания до 6°С и опускается ниже исходного уровня при дальнейшем выдерживании проростков на холоду. В результате наблюдается ингибирование их роста. Таким образом, активация фермента носит транзиторный характер, что предполагает его включение в каскад процессов, запускаемых в ответ на низкотемпературный стресс. В плазматической мембране впервые идентифицирован содержащий НАДФН-оксидазу 02 "-продуцирующий надмолекулярный белковый комплекс, активность которого подавляется дифенилен иодониумом. Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе данные об особенностях активации НАДФН-оксидазы плазмалеммы при снижении температуры выращивания проростков являются существенным аргументом в пользу того, что образованный этим ферментом 02~ является молекулой, участвующей в системе клеточного сигналинга. Совокупность экспериментальных данных и

подходов может быть использована для продолжения исследования этой проблемы при других типах (а)биотических стрессов, а теоретические обобщения - для чтения курсов лекций студентам биологических специальностей ВУЗов. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на: Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва 2008), Международной научной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008), Международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и нанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2010), VII Съезде Общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011) и других научных мероприятиях. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из которых 1 - в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 114 страницах, включает 18 рисунков и 1 таблицу. Список литературы содержит 195 источников, из которых 193 - на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были 5-дневные этиолированные проростки кукурузы (Zea mays L.) и изолированные из них плазматические мембраны, а также клетки суспензионной культуры Arabidopsis (Степанченко и др., 2012), полученные и любезно предоставленные д.б.н. Носовым А.В. (ИФР РАН).

Содержание Н202 в тканях проростков оценивали по абсорбции пероксидов титана при 415 нм как в (Brennan and Frenkel, 1977), экстрагируя Н202 холодным ацетоном.

Плазмалемму получали разделением микросомальных мембран в водной двухфазной полимерной системе 6.2% ПЭГ3500 - 6.2% Декстран Т500 (Larsson et al., 1994). Степень обогащения фракции плазмалеммой оценивали по активности маркерных ферментов в сопряженной системе (Palmgren, 1990). Содержание белка определяли по Bradford (1976) или с помощью бицинхониновой кислоты (Smith et al., 1985), в качестве стандарта используя БСА.

Для оценки супероксид-продуцирующеи активности мембран регистрировали кинетику восстановления плазмалеммой 2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сулфонфенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилида (ХТТ) по абсорбции образующегося растворимого формазана при 470 нм, используя НАДФН в качестве субстрата (Sagi and Fluhr, 2001).

Зоны продукции суперокснда в проростках выявляли по образованию фиолетового преципитата формазана, загружая в ткани нитросиний тетразолий (NBT) с использованием вакуумной инфильтрации.

О содержании Н202 и активности пероксидаз в апоиласте судили по измерению интенсивности флуоресценции родамина 123 (R123), образующегося при окислении дигидрородамина 123 (DHR123) (Henderson and Chappel, 1993). Для этого DHR123 вносили в суспензию клеток или с помощью вакуумной инфильтрации загружали в проростки. Интенсивность флуоресцентного окрашивания регистрировали сканированием образцов на Typhoon Trio Plus («GE Healthcare», Великобритания) при длине возбуждающего света 532 нм, используя отсекающий светофильтр 555ВР20.

Флуоресцентное окрашивание клеток для выявления компартментов образования АФК проводили внесением в суспензию красителей R123, DHR123 или дихлоргидрофлуоресцеин диацетата (H2DCFDA). Флуоресценцию визуализировали с помощью микроскопа Axio Imager Z2 («Zeiss», Германия).

Денатурирующий электрофорез мембранных белков проводили в 10% ПААГ по методу Laemmli (1970).

Для натпвного электрофореза высокого разрешения (hrCN-PAGE) плазмалемму солюбилнзнровалм в растворе 1%-ных (в/в) додецилмальтозида или дигитонина при отношении детергент/белок 5:1 в течение 30 мин при 4°С. Солюбилизированные белки разделяли в 5-20%-ном ПААГ по (Witting et al., 2007). В катодный буфер, содержавший 50 мМ трицин, 15 мМ Bis-Трис и 0.02% додецилмальтозид, вводили 0.05% дезоксихолат натрия (рН=7.0). Для электрофореза во втором направлении дорожки геля инкубировали в денатурирующем буфере. Разделение белков проводили в 10%-ном ПААГ по Laemmli (1970), но с заменой электродного буфера на Трис-трициновый по Schagger (2006).

Для выявления активности супероксид-продуцирующих ферментов плазмалеммы в ПААГ после электрофореза в денатурирующих условиях (без ДТТ) белки ренатурировали, заменяя .ZmCNa Тритоном Х-100 и отмывая буфером как описано Rouet et al. (2006), а после нативного электрофореза - только буфером. Все операции выполняли при 4°С. После отмывки в обоих случаях гели перекладывали в раствор, содержавший 100 мМ Трис-HCl (рН 7.8) с 2 мМ NBT на 20 мин. Реакцию образования 02~ запускали внесением НАДФН. Для визуализации пероксидазной активности в ПААГ после проведения нативного электрофореза гель отмывали PBS-буфером при 4°С. Пероксидазную реакцию окисления диаминобензидина (ДАБ) запускали внесением Н202. После развития окрашивания гели сканировали на Epson Perfection V700 PHOTO.

Для пммунодетскции НАДФН-оксидазы белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Super («Amersham», Великобритания) по Towbin et al. (1979) с добавлением в буфер 0,1% ДДСЫа. Мембрану блокировали в PBS, содержащем 0.05% Tween 20 и 2% сухое молоко. В качестве первичных антител

использовали пептид-специфичные антитела Anti-CYBB фирмы «Sigma» (США). Для визуализации - вторичные флуоресцентно меченые антитела («Медгамал», Россия). Блоты сканировали с использованием Typhoon Trio Plus («GE Healthcare», Великобритания).

На графиках представлены средние значения и стандартные отклонения, полученные на мембранном материале, выделенном независимо, а также результаты типичных экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изменение содержания Н202 в тканях проростков после снижения температуры

выращивания

Кукуруза является теплолюбивым растением, и снижение температуры может приводить к развитию в клетках окислительного стресса. Показателем его возникновения служит резкое увеличение содержания АФК в тканях. Чтобы проверить, развивается ли в проростках окислительный стресс после снижения температуры выращивания, растения перемещали с 25 на 6°С. Видно, что снижение температуры сопровождается увеличением содержания Н202 как в корнях, так и в побегах, достигая своего максимума через 2 ч после охлаждения (таблица). Увеличение содержания Н202 происходило и в корнях и побегах и составляло около 30% по отношению к контролю (проростки, не подвергнутые охлаждению). После 3 ч охлаждения содержание Н202 начинало снижаться и достигло практически контрольного уровня. Более того, к концу суточного пребывания проростков при низкой температуре уровень Н202 снизился даже ниже контрольного и в корнях, и в побегах. Полученные данные показали, что при временном снижении температуры выращивания изменение содержания АФК имеет транзиторный характер. При этом наблюдалось торможение роста проростков, однако другие видимые повреждения отсутствовали. Таким образом, можно заключить,

Таблица. Изменение содержания Н202 (мкмоль/г сырой массы) в тканях корней и побегов 5-дневных этиолированных проростков кукурузы после снижения температуры выращивания с 25 до 6°С.

Время пребывания проростков при 6°С, ч Корни Побеги

0 1.55 ±0.12 4.63 ±0.33

1 1.53 ±0.20 4.52 ±0.23

2 2.45 ±0.13 5.87 ±0.25

3 1.75 ±0.11 4.75 ± 0.34

24 1.32 ±0.10 3.67 ±0.22

что в экспериментальных условиях, используемых нами, проростки не испытывали неконтролируемого окислительного повреждения. Эти данные согласуются с результатами работы (Prasad et al., 1994), где впервые был установлен транзиторный характер изменений содержания Н202 на начальных этапах закаливания проростков кукурузы. При обработке проростков экзогенной Н202 при нормальной температуре авторы получили имитацию закаленных растений. На этом основании была высказана идея о том, что транзиторный характер изменений Н202 имеет регуляторное значение.

Следует отметить, что как при оптимальной температуре выращивания, так и при охлаждении проростков содержание пероксида в побегах примерно в три раза превышало его содержание в корнях (таблица).

Определение суммарной Н202 в тканях не позволяет идентифицировать источники ее генерации, поскольку сумма может складываться из активности большинства ферментов, способных к ее образованию, в том числе, и НАДФН-оксидазы плазмалеммы. Исследование активности этого фермента составило предмет настоящей работы, выполненной на системах различного уровня сложности: проростках, клетках, мембранах и мембранных белках.

Образование АФК в апопласте проростков кукурузы Для изучения продукции АФК в апопласте проростки окрашивали нитросиним тетразолием (NBT) - соединением, которое не проникает внутрь клеток и, относительно специфично взаимодействуя с 02~, образует нерастворимый формазан, имеющий фиолетовую окраску. В результате окрашивания проростков можно выявить области образования АФК, а использование ингибиторов позволит установить, какой из ферментов отвечает за их образование в этих участках. В экспериментах с проростками были использованы NaNj и дифенилен иодониум (ДФИ) - ингибиторы пероксидаз и НАДФН-оксидаз соответственно (Bolwell et al., 2002). Формазан интенсивно накапливался в апикальной части корня, но довольно слабо - в побегах (не представлено). Возможная причина такой разницы в NBT-восстанавливающей активности - недостаточная концентрация красителя в апопласте побегов. После обработки ингибиторами пероксидаз или НАДФН-оксидаз окрашенные зоны сокращались по сравнению с контролем. Особенностью данного вида гистохимического окрашивания является его продолжительность по времени -для стабилизации окраски требуется не менее часа, поэтому использование NBT для определения кинетики ДФИ-чувствительного образования 02" не является вполне надежным, так как за время развития окраски, 02" может частично или полностью дисмутировать в другую форму АФК.

Поэтому далее вместо NBT использовали краситель - дигидрородамин 123 (DHR123), который при взаимодействии с Н202 переходит во флуоресцирующую форму родамин 123 (R123). Окисление DHR123 в растворе многократно ускоряется в присутствии пероксидазы и эффективно подавляется ингибитором пероксидаз, но не

-f

mm •.......

(a)

(в)

флавин-содержащих оксидаз. Метод с использованием ОНЯ123 является более чувствительным, чем с ЫВТ, что позволило следить за ходом окрашивания, как корней, так и побегов (рис. 1). Можно видеть, что краситель от корней через зерновку достигает апикальной части колеоптиля, то есть время инфильтрации проростков достаточно для загрузки красителя. Видно, что окрашивание в побегах слабее, чем корнях. Судя по окрашиванию, в месте отсечения побега от зерновки пероксидазная активность с БН1и23 проявляется наиболее интенсивно. Вместе с тем окрашивание корня ОН11123 от апикальной части к

\ - побегу обнаруживало специфику: в

1 кончике корня оно почти отсутствовало,

в то время как с ^Т именно эта область наиболее интенсивно прокрашивалась. Совместная загрузка красителя с ингибиторами пероксидаз или НАДФН-оксидаз позволила заключить, что эти ферменты либо различаются по активности, либо по гетерогенности локализации в тканях корня. Так в присутствии №N3 (рис. 1в) интенсивность флуоресценции

существенно снижалась по всей длине корня, кроме кончика, в то время как с ДФИ (рис. 16) интенсивное окрашивание сохранялось по всему корню, кроме апикальной части. Следует отметить, что с помощью инфильтрации ОНШ23 в побегах не было выявлено гетерогенности по интенсивности зон флуоресценции. Учитывая равномерное и слабое окрашивание побегов по сравнению с корнями, можно предположить, что пероксидазы в побегах распределены относительно гомогенно, так как использованный метод позволяет судить не только о количестве Н202, но и об эндогенной пероксидазной активности. Нечувствительность флуоресцентного окрашивания к ДФИ может указывать на отсутствие НАДФН-оксидазы в побегах, что маловероятно, либо свидетельствовать о неприменимости этого подхода для идентификации активности фермента.

Рис.1. Локализация АФК-генерирующих активностей в этиолированных проростках кукурузы.

Корни проростков помещали в среду: 5 мМ Mes-KOH (рН 6.0), 1 мМ CaS04 и 2 мкг/мл DHR123. В варианте (б) вносили 100 мкМ ДФИ, в варианте (в) - 2 мМ ЫаЫз. После вакуумной инфильтрации корни и побеги отделяли от зерновки, помещали в 9 мм чашки Петри и сканировали на Typhoon Trio Plus.

Продукция АФК клетками суспензионной культуры АгаЫАорь'и (ИаИапа

В дальнейших экспериментах использовали клетки суспензионной культуры, имеющие большую площадь поверхности, непосредственно контактирующую с АФК-индикатором. На рис. 2 представлены клетки, окрашенные в присутствии ОНЮ23, Я 123 или дихлордигидрофлуоресцеин диацетата (Н2ОСРОА). При окрашивании ОНШ23 флуоресценция наблюдается в виде ровного слоя, располагающегося преимущественно по периферии клеток, и ее интенсивность выше в местах их контакта. Я123 является потенциал-зависимым реагентом, который накапливается в активно работающих митохондриях. Действительно, на рис. 26 можно видеть мелкие флуоресцирующие структуры внутри клеток. Существенно, что ОНЯ123 как субстрат апопластных пероксидаз применялся нами в концентрациях на порядок ниже тех, что обычно используются для визуализации митохондрий в клетках, и за время экспозиции клеток с этим реагентом не выявлялось какого-либо внутриклеточного окрашивания (рис. 2а и 26). На рис. 2в показана микрофотография клеток, окрашенных проникающим индикатором Н2ОСРОА, переходящим в цитозоле под действием неспецифических эстераз в Н2ОСР, который взаимодействует с АФК неферментативным путем с образованием флуоресцирующего дихлорфлуоресцеина. Характерно, что в этом случае флуоресценция не распределяется в цитозоле гомогенно, а обнаруживается внутри клеточных компартментов, идентификация которых требует специальных исследований (рис. 2а и 2в).

Рис. 2. Флуоресцентное окрашивание суспензии клеток в присутствии дигидрородамина 123 (а), родамина 123 (б) и дихлордигидрофлуоресцеин диацетата (в).

Среду культивирования

клеток заменяли на 5 мМ Меэ-КОН (рН 6.0) и 1 мМ Са804. 1 мл плотного объема клеток доводили этой средой до 10 мл. Из него отбирали 3 объема по 1 мл и вносили в конечной концентрации ОНЯ123 - 0.5 (а); Ш23 - 12.5 (б) и ЩЭСРОА - 5(в) мкМ. Слева - просмотр клеток во флуоресцентном режиме, справа — в проходящем свете.

Целью следующей серии экспериментов была регистрация кинетики образования Н202 в апопласте клеток при смене температуры культивирования и действии ингибиторов НАДФН-оксидаз и пероксидаз. Рис. За демонстрирует, что интенсивность флуоресцентного окрашивания в ячейках планшеты возрастала пропорционально времени пребывания клеток при низкой температуре. Видно также, что интенсивность флуоресценции снижалась при наличии в среде культивирования ДФИ. Расчет разницы в интенсивности флуоресценции между контрольными и обработанными клетками дал кривую с максимумом на 60-80 мин охлаждения и возвращением к исходному уровню (рис. 36). Таким образом, процесс образования Н202 в апопласте клеток, индуцируемый снижением температуры, носит транзиторный характер. Такая транзиторность, скорее

Время, 0 15 30 45 60 75 90 105 120

80 100 120

Время, мин

Рис. 3. Влияние 10 мкМ дифенилен иодониума на кинетику изменений интенсивности флуоресценции родамина 123 в суспензии клеток Arabidopsis (а) при снижении температуры среды культивирования и графическое отображение (б) разности уровней флуоресценции в отсутствие и присутствии и ДФИ.

Среду культивирования клеток заменяли на 5мМ Mes-KOH (рН 6.0) и 1 мМ CaSOí. 1 мл плотного объема клеток доводили этой средой до 10 мл и переносили по 100 мкл в ячейки планшет, содержащих по 25 мкл среды указанного состава с добавкой ДФИ, конечная концентрация которого после внесения клеток составила 10 мкМ (2), или без него (1). Ячейки по очереди перемешали на 6°С на время, указанное на графике. После 2 ч эксперимент завершали и во все варианты вносили DHR 123 в конечной концентрации 0.2 мкг/мл. Через 15 мин образцы сканировали на Typhoon Trio Plus.

всего, отражает активность НАДФН-оксидазы, поскольку чувствительна к ДФИ. Не исключено, что определенный вклад в усиление продукции АФК вносит и активность внеклеточных пероксидаз. В пользу этого вывода свидетельствовало практически полное ингибирование окрашивания в планшетах в присутствии NaN3 в этот отрезок времени (не представлено).

Вместе с тем, вопрос об источниках генерации Н202 и 02~ при снижении температуры выращивания растений остается не до конца ясным. Разграничение участия пероксидазы (POXIII) и НАДФН-оксидазы плазмалеммы в генерации АФК в апопласте представляет определенную проблему. Это связано с тем, что, пероксидазы POXIII-семейства могут не только окислять субстраты с использованием Н202, но также участвовать в продукции АФК (вплоть до НО") в оксидазном цикле фермента (Berglund et а!., 2002). Однако до сих пор не ясно, какое соединение в апопласте клеток растений служит восстанавливающим субстратом для пероксидаз (Kawano, 2003). Тем не менее, можно найти подход к оценке вклада этих ферментов в образование АФК в апопласте. Факторами разграничения могут быть разная субстратная специфичность и чувствительность к ингибиторам, а также различие в молекулярной организации ферментов. Поскольку НАДФН-оксидаза является единственным интегральным мембранным белком, то для более детального исследования условий ее активации работа была продолжена на изолированных плазматических мембранах.

Суперокспд-продуцирующая активность плазмалеммы

Для обнаружения активности НАДФН-оксидазы были предприняты эксперименты, в которых в присутствии низких концентраций ДФИ - ингибитора флавин-содержащих ферментов регистрировалась НАДФН-зависимая продукция 02" плазмалеммой, изолированной из корней и побегов контрольных проростков (рис. 4). Чувствительность реакции образования супероксида к ДФИ в низких концентрациях используется в качестве критерия активности ФАД-содержащих оксидаз (Cross and Jones, 1986).

Для оценки супероксид-продуцирующей активности плазмалеммы регистрировали кинетику скорости нарастания в растворе абсорбции формазана при добавлении НАДФН (рис. 4, врезка). Растворимый формазан образуется в результате восстановления ХТТ в присутствии 02 ~. Из рис. 4 видно, что образование формазана из ХТТ запускается внесением НАДФН. Реакция связана с образованием супероксид-анион радикала, поскольку полностью блокируется внесением в реакционную среду супероксиддисмутазы. НАДФН-оксидазная активность плазмалеммы побегов контрольных проростков составляла 50±9 нмоль формазана/(мг-белка-мин), что в 1.5 раза выше активности, обнаруженной в плазмалемме корней. При этом ЕС50 ингибирования активности дифенилен иодониумом составила 5.1 мкМ для побегов и 9.05 мкМ для корней. Эффективность ингибирования ДФИ достигала 70% от

20 40 60 80 100 [Дифенилен иодониум], мкМ

Рис. 4. Концентрационная зависимость ингибирования дифенилен иодониумом НАДФН-оксидазной активности плазмалеммы,

изолированной из побегов (1) и корней (2) 5-дневных этиолированных проростков кукурузы. На врезке представлена кинетика супероксид-продуцирующей активности плазмалеммы побегов и ее ингибирование внесением супероксиддисмутазы (100 ед./мл). В 1-см кювету спектрофотометра вносили 2 мл буфера, содержащего 10 мМ Трис-Ме5 (рН 7.5), 300 мМ сахарозу, 0.25 мМ ХТТ и 30-50 мкг мембранного белка. Реакцию запускали внесением 0.2 мМ НАДФН.

1 2 3 4 5 6

контроля. Это указывает на то, что большая часть продукции супероксид-анион радикала плазмалеммой связана с активностью НАДФН-оксидазы.

На рис. 5 представлены некоторые характеристики НАДФН-оксидазной активности плазмалеммы корней и побегов, а именно: чуствительность к ингибитору пероксидаз №N3, активация ионами кальция, доступность субстрата,

обусловленная ориентацией везикул, и влияние

осмотичности среды измерения. Из представленных данных видно, что 02 "-продуцирующая активность не обнаруживала чувствительности к №N3. Это указывает, в первую очередь, на отсутствие существенной

активности пероксидаз в

Рис. 5. Влияние 5 мМ СаС12 (2), 0.05% Вгц 58 (3), 2.5 мМ ЫаЫ3 (4) или осмолярности среды измерения (5 и 6) на НАДФН-оксидазную активность плазмалеммы,

изолированной из побегов (а) и корней (б) 5-дневных

этиолированных проростков

кукурузы, выращенных при 25°С. В измерительную кювету с мембранами вносили добавки и инкубировали в течение 5 мин. Для оценки влияния тоничности среды мембраны вносили в буфер, содержащий 0.4 (5) или 0.1М (6) сахарозу. Реакцию запускали внесением НАДФН в конечной концентрации 0.2 мМ. За 100% принимали активность

плазмалеммы побегов или корней контрольных вариантов (1).

выделяемых фракциях плазмалеммы. При обработке мембран Brij 58 - детергентом, «выворачивающим» все везикулы цитоплазматической стороной наружу, измеряемая активность вырастала примерно в 2 раза, что указывает на локализацию каталитического центра, связывающего НАДФН, с внутренней стороны плазмалеммы. Измерения, проведенные в средах с различной осмолярностью, показали, что НАДФН-оксидазная активность чувствительна к ее изменению -увеличивается при снижении концентрации осмотика и, наоборот, уменьшается при увеличении. В присутствии ионов кальция 02~-продуцирующая активность возрастала примерно в 1.5 раза, что совпадает с данными (Keller et al., 1998; Sagi and Fluhr, 2001; Ogasawar et al., 2008). рН-зависимость НАДФН-оксидазной активности плазмалеммы имела оптимум в слабощелочной области с максимумом при рН 7.5 (не представлено). На основании этого можно заключить, что каталитический центр фермента ориентирован в цитозоль, поскольку для апопласта характерны значительно более низкие значения рН. Таким образом, образование Ог" плазмалеммой в присутствии НАДФН связано именно с активностью НАДФН-оксидазы.

В следующей серии экспериментов исследовали возможность активации

НАДФН-оксидазы плазмалеммы после изменения температуры выращивания проростков, а также влияние «раневого» стресса (рис. 6). Видно, что кратковременное (2 ч) низкотемпературное воздействие активирует

НАДФН-оксидазную активность до 1.5 раз относительно контроля,

причем такие изменения более выражены на мембранах побегов. После

продолжительного (24 ч) охлаждения проростков 02 -продуцирующая активность плазмалеммы снижалась по

Рис. 6. Изменение НАДФН-оксидазной активности плазмалеммы побегов (а) и корней (б) после снижения температуры выращивания от 25 до 6°С. Температуру в камере с 5-дневными этиолированными проростками снижали с 25 до 6°С на 2 (2) или 24 ч (3). При этой же температуре отделяли побеги и корни от зерновки и использовали для получения плазмалеммы. В контрольном варианте (1) проростки выращивали при 25"С и также отрезали корни и побеги. Отсечение проводили в течение 15 мин во всех вариантах. В серии экспериментов после отделения от зерновки корни и побеги выдерживали в течение 1 ч при 25°С (4). За 100% принимали активность плазмалеммы побегов или корней контрольных вариантов (1).

отношению Характер суммарного содержания

контролю, эффектов изменения перекиси

водорода в проростках и клетках в ответ на кратковременное низкотемпературное воздействие и продукция 02" плазмалеммой оказался идентичным, т.е. кратковременным и транзиторным.

Однако прирост 02~-продуцирующей активности мембран после снижения температуры выращивания оказался существенно ниже, чем для плазмалеммы, выделенной из проростков, подвергнутых «раневому» стрессу (рис. 6) и составлял примерно 200 % от активности плазмалеммы, выделенной сразу же после отделения корней от побегов. Этот уровень генерации 02~ не обязательно связан с НАДФН-оксидазой, поскольку при повреждении растительных тканей могут активироваться другие АФК-генерирующие системы примембранной области (Cona et al., 2006; Kumar et al., 2007; Cosio and Dunand, 2009).

Транзиторность изменений НАДФН-оксидазной активности при охлаждении проростков предполагает как активацию, так и инактивацию фермента. Пока не ясно, связано ли это с ассоциацией/диссоциацией ферментного комплекса НАДФН-оксидазы с регуляторными белками по аналогии с оксидазой фагоцитов (Bedard and Krause, 2007; Wong et al., 2007), либо с увеличением/уменьшением содержания молекул самого фермента в плазмалемме посредством везикулярного транспорта. Механизмы транзиторности активации пока не совсем понятны, хотя интенсивно исследуются.

Идентификация НАДФН-оксндазы среди белков плазмалеммы с супероксид-продуцнрущей активностью

Иммунологическое исследование белков плазмалеммы с антителами, полученными против 50-ти аминокислотного С-терминалыюго пептида НАДФН-оксидазы фагоцитов представлено на рис. 7а. Антитела реагировали с белками, молекулярные массы которых составляли 48, 88 и 98 кД. Массы двух последних соответствуют массам белков, кодируемых генами rboh растений (Fluhr, 2009). Также видно, что интенсивность иммуноокрашивания белков плазмалеммы побегов выше, чем корней. Это может свидетельствовать о более высоком содержании НАДФН-оксидаз в надземных частях проростков и быть причиной того, что 02 -продуцирующая активность плазмалеммы побегов в 1.5 раза выше, чем корней. Судя по интенсивности иммуноокрашивания содержание НАДФН-оксидаз после изменения температуры выращивания в плазмалемме корней и побегов не изменилось. Это предполагает, что усиление продукции 02™ плазмалеммой не обусловлено увеличением количества молекул фермента в мембране, а скорее связано с посттрансляционными модификациями НАДФН-оксидазы.

В последующих экспериментах было проведено сопоставление молекулярных масс белков, выявляемых антителами, с белками, способными восстанавливать NBT в геле в присутствии НАДФН. Для этого после проведения денатурирующего электрофореза белки в гелях ренатурировали и выявляли полосы с максимальной

кД 1 2 3 4 1234 1234

115 _

98 —

51 —

Рис. 7. Иммунодетекция НАДФН-оксидазы (а) плазмалеммы, изолированной из побегов (1 и 3) или корней (2 и 4) кукурузы, и супероксид-продуцирующая активность в геле (б и в) после снижения температуры выращивания 5-дневных этиолированных проростков кукурузы.

Температуру в камере снижали с 25 до 6°С на 2 ч (3 и 4), в контрольном варианте (1 и 2) проростки не подвергали охлаждению. Белки плазмалеммы разделяли электрофорезом в денатурирующих условиях. На дорожку наносили 7 (а) или 20 мкг (б и в) белка. После ренатурации гели инкубировали 20 мин в растворе с 2 мМ NBT в отсутствие (б) или в присутствии (в) 25 мкМ ДФИ, реакцию образования формазана запускали внесением НАДФН. Для иммунодетекции использовали CYBB-антитела, для визуализации -меченые флуоресцеином вторичные антитела.

продукцией формазана. Как видно на рис. 76, таких полос оказалось по пять в плазмалемме корней и побегов. Они имели молекулярные массы 130, 88, 74, 51 и 48 кД. При этом белки с молекулярной массой 130 кД и 48 кД были наиболее интенсивно окрашены, но только белки с молекулярной массой 88 и 48 кД детектировались антителами. Кроме того, инкубирование геля с дифенилен иодониумом вызывало исчезновение всех НАДФН-окисляющих полос за исключением полосы с молекулярной массой 74 кД интенсивность окрашивания которой формазаном в этих условиях даже повышалась (рис. 7в). Из представленных результатов следует, что только 88 кД белок в плазмалемме побегов и корней проростков кукурузы может идентифицироваться как белок rboh-семейства, так как только он выявляется с антителами и обнаруживает зависимое от ДФИ и НАДФН образование супероксид-анион радикала.

Максимальную 02'~-продуцирующую и ингибируемую ДФИ активность в геле проявляли белки с молекулярной массой в области 130 кД (рис. 76 и 7в). Однако они не реагировали с антителами против каталитической области белков семейства NOX. Причина этого может состоять в недоступности сайта связывания антител у фермента, принявшего каталитически наиболее активную конформацию. Кроме того, недоступность сайта связывания с антителами может объясняться его блокированием

в результате агрегации гидрофобных белков мембран, в том числе, и НАДФН-оксидаз, при солюбилизации и проведении денатурирующего электрофореза. И наконец, не исключено, что белковая полоса с этой молекулярной массой вообще не содержит НАДФН-оксидазу.

Как сообщают Oda с соавт. (2010), активная конформация для НАДФН-оксидазы представляет собой димер, мономеры которого взаимодействуют между собой посредством С-терминальных цитоплазматических доменов, и такое взаимодействие зависит от присутствия ионов Са2+.

Учитывая все сказанное выше, было сделано предположение о том, что в непосредственном контакте с молекулой НАДФН-оксидаз должны находиться определенные белки, от которых зависит ее функциональная активность. Одним из таких известных белков является малая ГТФаза (Wong et al., 2007), и возможно, что она не единственный партнер в окружении НАДФН-оксидазы в плазмалемме. Для идентификации таких партнеров в нашей работе был использован нативный электрофорез, когда электрофоретическому разделению подвергаются солюбилизированные в присутствии неионных детергентов белковые комплексы мембран и не нарушаются белок-белковые связи.

Значение белок-белковых взаимодействий для активности НАДФН-оксидазы

плазмалеммы

На первом этапе была предпринята попытка выявить в плазматической мембране белковые комплексы с 02 "-продуцирующей активностью (рис. 8). С этой целью был использован метод нативного электрофореза высокого разрешения, характерной особенностью которого является введение в катодной буфер ионного детергента 0.05% дезоксихолата для придания заряда гидрофобным белковым комплексам мембран (Witting et al., 2007).

На рис. 8а представлены результаты электрофореза, где хорошо различимо примерно 10 белковых комплексов, окрашенных Coomassie R-250. Справа

Рис. 8. Белковые комплексы плазмалеммы, разделенные нативным электрофорезом (а), выявление комплексов, обладающих супероксид-продуцирующей активностью (б), и ее зависимость от количества наносимого на дорожку белка.

Плазмалемму солюбилизировали в присутствии 1%-ного додецилмапьтозида в отношении детергент/белок 5:1. На дорожку наносили 50 (1), 100 (2) или 200 (3) мкг белка. Гель (а) окрашен Coomassie Я-250.Для определения супероксид-продуцирующей активности в геле (б) использовали NBT и НАДФН в качестве субстрата.

кД

669 — 440 —

232 — 140 —

(а)

представлена концентрационная зависимость образования 02~ комплексами в геле. Видно, что с увеличением количества нанесенного белка, увеличивается интенсивность окрашивания формазаном полос в геле. Это подтверждает, что образование супероксида в присутствии НАДФН осуществляется ферментативным путем (рис. 86). По результатам окрашивания на супероксид, в плазматической мембране выявляется, по крайней мере, четыре белковых комплекса с разной скоростью восстановления КВТ, причем высокомолекулярный комплекс (> 669 кД) проявляет самую высокую 02~-продуцирующую активность.

Для идентификации НАДФН-оксидазы в белковых комплексах после денатурирующего электрофореза второго направления использовали вестерн-блот анализ с антителами против §р91р1юх (рис. 9). В белковом комплексе с массой выше 669 кД были обнаружены белки, проявляющие кросс-реактивность с антителами. Молекулярная масса этих белков соответствовала массе белков гЬоЬ-семейства. Также из рисунка 9 видно, что образование супероксида высокомолекулярным

кД

669 —

440 — I

232 — <4 4

О,;,:.., —

140 —

(а)

КД 669 440 232 140 £! 1 1 - 1

132-г

Рис. 9. Выявление НАДФН-оксидазы в ДФИ-чувствительных супероксид-продуцирующих белковых комплексах плазмалеммы.

Плазмалемму солюбилизировапи в присутствии 1%-ного додецилмальтозида в отношении детергент/белок 5:1 и разделяли нативным электрофорезом на белковые комплексы. Гель разрезали на дорожки. Одну часть дорожек переносили в растворы, содержащие 100 мМ Трис-НС1 (рН 7.8) с 2 мМ ЫВТ, в один из которых вносили 25 мкМ ДФИ (2), а в другой -нет (1). Реакцию образования формазана запускали внесением НАДФН (а). Другую часть дорожек инкубировали в денатурирующем буфере и проводили электрофорез второго направления по ЬаешшН (в). После электрофореза вестерн-блот анализом выявляли НАДФН-оксидазу (б). Для иммунодетекции использовали СУВВ-антитела, для визуализации - меченые флуоресцеином вторичные антитела.

комплексом ингибируется ДФИ - инкубация геля в буфере с ДФИ заметно уменьшала осадок формазана в этой полосе. Кроме того антитела против gp91phox взаимодействовали с белком из комплекса с массой < 232 кД. Однако этот низкомолекулярный комплекс характеризовался существенно более слабой способностью к НАДФН-зависимому восстановлению NBT, которое полностью блокировалось ДФИ.

Таким образом, впервые обнаружено, что уровень активности растительных гЬоЬ-белков зависит от их нахождения в комплексе с другими мембранными белками, пока еще не идентифицированными.

В последнее время идет активная дискуссия о том, связана ли 02~-продуцирующая активность плазмалеммы с функционированием исключительно НАДФН-оксидазы или в этот процесс могут быть вовлечены и другие белки. Наиболее часто считают, что такими белками являются пероксидазы P0XIII (Bindschedler et al. 2006). Более того, некоторые исследователи предполагают возможность сопряжения между этими белками, когда продукт одного фермента является субстратом для другого (Lüthje et al., 2009). По мнению других, такое сопряжение между 02~-продуцирующей НАДФН-оксидазой и POXIII-пероксидазной чрезвычайно опасно и вряд ли возможно, поскольку в присутствии 02 ~ и Н202 железо гема пероксидаз может выступать катализатором в реакции Fenton с генерацией НО' (Heyno et al.,2011).

Для проверки этих альтернатив был проведен сравнительный анализ 02~-продуцирующей и пероксидазной активностей белковых комплексов плазмалеммы побегов 5-дневных этиолированных проростков кукурузы после их разделения нативным электрофорезом высокого разрешения (рис. 10). В экспериментах для солюбилизации использовали два типа детергентов: додецилмальтозид и дигитонин, различающихся по способности разрушать липид-липидные и/или липид-белковые контакты, что позволяет получать мицеллы, содержащие разный набор белковых

Рис. 10. Белковые комплексы плазмалеммы, разделенные нативным электрофорезом (а), и выявление среди них комплексов с супероксид-продуцирующей (б) и

пероксидазной активностями (в). Плазмапемму солюбилизировапи в присутствии 1%-ных додецилмальтозида (1) или дигитонина (2) в отношении детергент/белок 5:1. Гель (а) окрашен Coomassie R-250. Для выявления комплексов с супероксид-продуцирующей активностью использовали NBT и НАДФН в качестве субстрата (б), с пероксидазной активностью -диаминобензидин с Н202 (в). На каждую дорожку геля нанесено по 100 мкг белка.

кД 1 2

669 — г 440 — 232 —

1 2 шщ

1 2

щг-щщ

(а)

шШ

(б) (В)

комплексов и липидов (Reisinger and Eichacker, 2008).

Комплекс с кажущейся массой выше 669 кД, проявляющий максимальную супероксид-продуцирующую активность в присутствии НАДФН, выявлялся после солюбилизации обоими детергентами (рис. 106). Пероксидазная активность, регистрируемая по окислению ДАБ в присутствии экзогенной Н2С>2, локализовалась в геле в области > 440 кДа. Скорость образования продукта окисления зависела от использованного детергента и была выше в случае додецилмальтозида. При этом после солюбилизации дигитонином обнаруживалась дополнительная полоса с пероксидазной активностью и кажущейся молекулярной массой > 900 кДа (рис. 10в).

Несовпадение молекулярных масс белковых комплексов плазмалеммы с пероксидазной и 02"-продуцирующей активностями указывает на то, что НАДФН-оксидаза и пероксидаза находятся в разных белковых комплексах и дистанцированы друг от друга. Это не способствует возможности донирования электрона от железа пероксидазы на 02'~ и образования НО". Не исключено, что находясь на расстоянии друг от друга, эти ферменты могут функционировать сопряжено, при этом образующаяся в результате реакции дисмутации перекись становится промежуточной формой их взаимодействия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Стационарные концентрации АФК в клетках растений по сравнению с животными существенно выше (Queval et al., 2008), при этом растения обладают значительной устойчивостью к этим молекулам (Halliwell, 2006). Одной из причин такой устойчивости является развитость сети антиоксидантных ферментов и метаболитов, участвующих в поддержании АФК-гомеостаза (Mittler et al., 2004). Повышение концентрации АФК, с которой не справляется система антиоксидантной защиты, способно нанести вред как отдельным биомолекулам, так и клеточным структурам. С другой стороны, колебание концентрации АФК в достаточно узком диапазоне обеспечивает функционирование работы систем регулирования клеточных процессов, таких как апикальный рост (Foreman et al., 2003), переход от деления к дифференцировке (Tsukagoshi et al., 2010), работа устьиц (Kwak et al., 2003), ионный гомеостаз (Ma et al., 2012). Очевидно, что мишени, способные подвергаться регулированию АФК, должны иметь свой определенный уровень сродства к этим молекулам. Это предполагает, что для осуществления регулирующей роли АФК важен не обобществленный пул АФК в растении, а их локальные концентрации в определенных клеточных компартментах. Одним из таких компартментов с высокой концентрацией АФК является внеклеточный матрикс - апопласт, где работают АФК-генерирующие ферменты.

Для образования АФК с участием секретируемых ферментов, таких как оксалатоксидазы, аминооксидазы и пероксидазы, в апопласт должны поступать и их

субстраты, которые транспортируются через плазматическую мембрану с участием переносчиков. В этом отношении НАДФН-оксидаза редко испытывает дефицит субстрата - НАДФН, поскольку он образуется в цитозоле в восстановительном пентозофосфатном цикле и акцептируется с цитоплазматической стороны плазмалеммы.

При функциональной идентификации НАДФН-оксидазы в изолированной плазмалемме существует проблема корректной оценки ее активности по причине существования интегрированных и ассоциированных с этой мембраной оксидаз, для которых восстанавливающие субстраты в условиях эксперимента становятся одинаково доступными. Нами было показано, что такая часть супероксид-продуцирующих активностей плазмалеммы, не имеющих отношения к НАДФН-оксидазе, может составлять около 30 %, что подтверждается ингибированием ДФИ, который полностью не блокировал образование 02'~ в присутствии НАДФН (рис. 4).

Конститутивная активность (рис. 7) отличает НАДФН-оксидазу плазмалеммы растений от оксидазы фагоцитов, активация которой требует ассоциации мембранных субъединиц gp91phox и p22phox с цитоплазматическими белками (Vignais, 2002). Однако выявление нами НАДФН-оксидазы в одном из высокомолекулярных комплексах плазмалеммы с максимальной супероксид-продуцирующей активностью (рис. 9), может указывать на необходимость контакта этого фермента с белками, регулирующими его активность. Кроме того, не исключено, что такой высокомолекулярный комплекс может содержать белки, которые являются мишенями регуляции самой НАДФН-оксидазой.

Скорость продукции Oi~ плазмалеммой в присутствии НАДФН не была одинаковой, а менялась по принципу транзиторности в зависимости от времени пребывания проростков при низкой температуре (рис. 6). Такая динамика изменений может быть показателем того, что повышение уровня вырабатываемого НАДФН-оксидазой супероксида обусловлено необходимостью инициации запуска каскада регуляторных реакций, в которых АФК играют роль сигнальных молекул. Спад в образовании 02 после 24 ч охлаждения можно рассматривать как свидетельство того, что потребность в них отпала, так как цепь регуляторных реакций приведена в действие.

Очевидно, что НАДФН-оксидаза не может непосредственно воспринимать сигнал об изменении окружающей температуры, поскольку таким сенсором, скорее всего, является липидный бислой мембран, который изменяет свое фазовое состояние путем повышения или снижения вязкости (Hasel, 1995), вследствие чего изменяется активность мембранных белков, чувствительных к таким изменениям. Как показано в ряде работ, к такому типу белков относятся Са2+ -каналы (Demidchik et al., 2003; Mori and Schroeder, 2004; Kurusu et al., 2012). Их активация способствует входу внутрь клетки ионов Са2+, которые, связываясь с Са2+-связывающими сайтами НАДФН-

оксидазы, приводят ее в активное состояние. Таким образом, предполагается, что активация фермента является опосредованной.

ВЫВОДЫ

1) Снижение температуры выращивания проростков кукурузы от 25 до 6°С приводило к кратковременному, в течение 2-3 ч, увеличению содержания перекиси водорода в тканях с последующим восстановлением ее исходного уровня через 24 ч.

2) Изменение ДФИ-зависимой продукции перекиси водорода в апопласте культивируемых клеток арабидопсиса в ответ на снижение температуры также носило транзиторный характер.

3) НАДФН-оксидазная активность изолированной плазмалеммы увеличивалась относительно исходного уровня в первые часы снижения температуры и понижалась при дальнейшем охлаждении проростков.

4) Транзиторный характер изменений содержания АФК в проростках, в апопласте культивируемых клеток и супероксид-продуцирующей активности плазмалеммы при изменении температуры выращивания свидетельствуют о возможности участия НАДФН-оксидазы в системе реакций клеточного сигналинга.

5) Сопоставление молекулярных масс белков с ДФИ-ингибируемой супероксид-продуцирующей активностью в геле и результатов иммунодетекции после денатурирующего электрофореза выявило присутствие в плазмалемме побегов и корней проростков двух белков ЫОХ-семейства, из которых лишь один проявлял НАДФН-оксидазную активность.

6) В результате дативного электрофореза высокого разрешения в плазмалемме выявлен белковый комплекс с кажущейся молекулярной массой около 700 кД, который содержал НАДФН-оксидазу, обладал ДФИ-ингибируемой супероксид-продуцирующей, но не пероксидазной активностью.

7) Несовпадение молекулярных масс белковых комплексов плазмалеммы с пероксидазной и супероксид-продуцирующей активностями указывает, скорее всего, на отсутствие пероксидазы в ближайшем окружении НАДФН-оксидазы, но не исключает возможности их функционального взаимодействия через пул перекиси водорода.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Пиотровский М.С., Жесткова И.М, Трофимова М.С. (2008) Активность НАДФН-оксидазы плазмалеммы клеток корней и побегов проростков кукурузы при абиотическом стрессе. Международная научная конференция «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (тезисы докладов), Екатеринбург, Россия, с. 332-333.

2. Пиотровский М.С. (2008) Функциональная идентификация НАДФН-оксидазы плазмалеммы растительных клеток. Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008» (тезисы докладов), Москва, Россия, с. 194-195.

3. Piotrovsky M.S. (2009) Activity of plasma membrane NADPH-oxidase from etiolated maize seedlings under lowering of growth temperature. Book of Abstr., International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75lh anniversary of the birth of professor Yuri Ovchinnikov, Moscow-Puschino, Russia, p. 189.

4. Пиотровский M.C., Шевырева T.A., Жесткова И.М., Трофимова М.С. (2010) Транзиторность активации НАДФН-оксидазы плазмалеммы при снижении температуры выращивания проростков кукурузы и клеток суспензионной культуры сахарной свеклы. Всероссийский симпозиум «Растение и стресс» (тезисы докладов), Москва, Россия, с. 281-282.

5. Пиотровский М.С., Шевырева Т.А., Жесткова И.М., Трофимова М.С. (2011) Активация НАДФ-Н-оксидазы плазмалеммы при действии низких положительных температур на этиолированные проростки кукурузы. Физиология растений, 58, 234-242.

6. Shevereva Т.А., Piotrovsky M.S., Zhestkova l.M, Trofimova M.S., Nosov A.V. (2011) Identification of plasmalemma protein complexes with peroxidase and superoxide producing activities by high resolution clear native electrophoresis. Book of Abstr., ldh International Conference on Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Plants, Budapest, Hungary, p. 30.

7. Пиотровский M.C., Шевырева T.A., Жесткова И.М., Трофимова М.С. (2011) Супероксид-продуцирующие белковые комплексы плазмалеммы, содержащие НАДФН-оксидазу. VII Съезд Общества физиологов растений России (тезисы докладов), Нижний Новгород. Россия, с. 561.

Подписано в печать:

13.08.2012

Заказ № 7506 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пиотровский, Михаил Сергеевич

Введение.

Цель и задачи исследования.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Активные формы кислорода: образование, структура, свойства.

1.2. Редокс-регуляция и передача АФК-сигнала.

1.2.1 Обратимое окисление цистеиновых остатков белков как мишень редокс-регуляции.

1.2.2. Факторы транскрипции и АФК.

1.2.3 МАПК-каскад и передача АФК-сигнала.

1.2.4. ^/«-мутант АгаЫс1ор818 и специфичность АФК-сигнала.

1.3- АФК и экспрессия генов.

1.4. Локализация АФК-генерирующих систем.

1.4.1 Хлоропласта.

1.4.2 Митохондрии.

1.4.3 Пероксисомы.

1.4.4. Апопласт.

1.5. НАДФН-оксидаза растений.

1.5.1 Ж)Х-белки: структура и работа каталитического сайта.

1.5.2 Гены ЯЬок Ж)Х-семейства.

1.5.3. Регуляция активности НАДФН-оксидазы растений.

1.6. Физиологическое значение НАДФН-оксидазы растений.

1.6.1. Рост и развитие растений.

1.6.2. Абиотический стресс.

1.6.3. Замыкающие клетки устьица и АБК-сигналинг.

1.6.4. Патогенез и симбиоз.

Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Выращивание растений.

2.2. Получение плазмалеммы.

2.3. Определение активности маркерных ферментов.

2.4. Определение содержания белка.

2.5. Оценка супероксид-продуцирующей активности плазмалеммы.

2.6. Оценка пероксидазной активности в растворе по измерению интенсивности флуоресценции родамина 123.

2.7. Определение зон образования АФК в корнях этиолированных проростков кукурузы.

2.8. Кинетика образования перекиси водорода в апопласте при снижении температуры культивирования суспензии клеток с применением дигидрородамина 123.

2.9. Флуоресцентная микроскопия клеток.

2.10. Денатурирующий электрофорез мембранных белков в ПААГ.

2.11. Нативный электрофорез высокого разрешения.

2.12. Окрашивание гелей.

2.13. Определение активности супероксид-продуцирующих ферментов в полиакриламидном геле после ренатурации белков с нитросиним тетразолием.

2.14. Определение пероксидазной активности в ПААГ.

2.15. Вестерн-блот анализ.

2.16 Определение содержания перекиси водорода в тканях проростков.

Глава 3 Результаты и обсуждение.

3.1. Изменение содержания Н202 в тканях проростков после снижения температуры выращивания.

3.2. НАДФН-оксидазная активность в апопласте проростков кукурузы.

3.3. Продукция АФК клетками суспензионной культуры АгаЫс1орз13 МаНапа.

3.4. Супероксид-продуцирующая активность плазмалеммы.

3.5. Идентификация НАДФН-оксидазы среди белков плазмалеммы с супероксид-продуцирущей активностью.

3.6. Значение белок-белковых взаимодействий для активности

НАДФН-оксидазы плазмалеммы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие НАДФН-оксидазы плазмалеммы в генерации супероксид-анион радикала в апопласте"

Согласно исследованиям последних лет функции активных форм кислорода (АФК) в физиологических процессах растительной клетки являются более разнообразными и важными, чем предполагалось (Dat et al., 2000; Apel and Hirt, 2004). Если ранее считали, что эти молекулы оказывают деструктивное действие на белки, липиды, ДНК (Moller et al., 2007), являются важным элементом в реализации фитоиммунитета (Bindschedler et al, 2006), а также выполняют субстратную роль в синтезе лигнина и суберина (Bernards et al., 2004), то в последнее время все более подтверждается их значение как регуляторов роста и развития растений (Foreman et al., 2003; Tsukagoshi et al., 2010) и модуляторов внутриклеточных процессов сигналинга (Miller et al., 2008; Pitzschke and Hirt, 2009). Известно, что в растительной клетке АФК образуются в хлоропластах, митохондриях, пероксисомах и апопласте. Значение апопласта в жизни клетки достаточно велико. Именно апопласт является компартментом, в котором локализованы первичные сенсоры стрессовых сигналов, работает механизм их декодирования и передачи декодированного сигнала на белки-регуляторы, через апопласт транспортируются потоки воды, ионов и других веществ, определяя в значительной степени внутреннюю среду цитозоля (Miller et al., 2010). Уровень АФК в апопласте зависит от активности ряда ферментов, таких как аминооксидазы (Angellini et al., 2008), оксалатоксидазы (Galiskan and Cuming, 1998) и пероксидазы III типа (Bolwell et al., 2002; Kawano, 2003) - секретируемые белки, а также интегрального белка плазмалеммы - НАДФН-оксидазы (Torres and Dangl, 2005). Биохимическая функция НАДФН-оксидазы состоит в катализе реакции образования 02 путем переноса электрона от НАДФН на 02 (Vignas, 2002). Образующийся 02~ в результате реакции дисмутации с участием супероксиддисмутазы или самопроизвольно переходит в более долгоживущую форму АФК - Н202. Согласно молекулярно-генетическим исследованиям НАДФН-оксидазы растений имеют гомологию с каталитической субъединицей gp91phox фагоцитов и принадлежат к NOX-семейству белков (Sagi and Fluhr, 2006; Kawahara et al., 2007). В оптимальных условиях существования растений стационарная концентрация АФК поддерживается на достаточно низком уровне. При возникновении температурного или других типов неблагоприятных воздействий образование АФК резко возрастает, что индуцирует окислительный стресс и активирует защитные реакции организма (Miller et al., 2008). Какие изменения в структуре и активности НАДФН-оксидазы плазмалеммы происходят при этом пока не исследовано, однако о наличии ответной реакции на изменение температурного режима свидетельствует ряд фактов. Например, показано, что трансгенные растения Arabidopsis по генам rboh более чувствительны к температуре, чем дикий тип (Larkindale et al., 2005). Кроме того, обнаружено участие продукта гена rbohD в дистанционной передаче информации о содержании АФК по растению в ответ на изменение температуры или других факторов (Miller et al, 2009). Исходя из данных о молекулярных характеристиках и физиологических эффектах, можно предполагать, что НАДФН-оксидаза плазмалеммы является наиболее вероятным претендентом на роль участника системы клеточного сигналинга среди других АФК-производящих ферментов в апопласте. Одним из экспериментальных подходов для доказательства этой роли может быть исследование особенностей активации этого фермента при изменении температуры выращивания растений, что и было предпринято в настоящей работе.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель настоящей работы состояла в исследовании свойств и активности НАДФН-оксидазы плазмалеммы как источника образования АФК в апопласте клеток растений при изменении условий роста. Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

2) Определить динамику образования перекиси водорода в проростках после снижения температуры выращивания от 25 до 6°С;

4) В белковом спектре плазмалеммы выявить белки, обладающие супероксид-продуцирующей активностью, и идентифицировать среди них вестерн-блот анализом белки 1ЧОХ-семейства.

5) С помощью нативного электрофореза высокого разрешения (ЪгОЧ-РАОЕ) выяснить необходимость белок-белковых взаимодействий для проявления активности НАДФН-оксидазы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Пиотровский, Михаил Сергеевич

выводы

1. Снижение температуры выращивания проростков кукурузы от 25 до 6°С приводило к кратковременному, в течение 2-3 ч, увеличению содержания перекиси водорода в тканях с последующим восстановлением ее исходного уровня через 24 ч.

2. Изменение ДФИ-зависимой продукции перекиси водорода в апопласте культивируемых клеток арабидопсиса в ответ на снижение температуры также носило транзиторный характер.

3. НАДФН-оксидазная активность изолированной плазмалеммы увеличивалась относительно исходного уровня в первые часы снижения температуры и понижалась при дальнейшем охлаждении проростков.

4. Транзиторный характер изменений содержания АФК в проростках, в апопласте культивируемых клеток и супероксид-продуцирующей активности плазмалеммы при изменении температуры выращивания свидетельствуют о возможности участия НАДФН-оксидазы в системе реакций клеточного сигналинга.

5. Сопоставление молекулярных масс белков с ДФИ-ингибируемой супероксид-продуцирующей активностью в геле и результатов иммунодетекции после денатурирующего электрофореза выявило присутствие в плазмалемме побегов и корней проростков двух белков ЫОХ-семейства, из которых лишь один проявлял НАДФН-оксидазную активность.

6. В результате нативного электрофореза высокого разрешения в плазмалемме выявлен белковый комплекс с кажущейся молекулярной массой около 700 кД, который содержал НАДФН-оксидазу, обладал ДФИ-ингибируемой супероксид-продуцирующей, но не пероксидазной активностью.

7. Несовпадение молекулярных масс белковых комплексов плазмалеммы с пероксидазной и супероксид-продуцирующей активностями указывает, скорее всего, на отсутствие пероксидазы в ближайшем окружении НАДФН-оксидазы, но не исключает возможности их функционального взаимодействия через пул перекиси водорода.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для образования АФК с участием секретируемых ферментов, таких как оксалатоксидазы, аминооксидазы и пероксидазы, в апопласт должны поступать и их субстраты, которые транспортируются через плазматическую мембрану с участием переносчиков. В этом отношении НАДФН-оксидаза редко испытывает дефицит субстрата - НАДФН, поскольку он образуется в цитозоле в восстановительном пентозофосфатном цикле и акцептируется с цитоплазматической стороны плазмалеммы.

При функциональной идентификации НАДФН-оксидазы в изолированной плазмалемме существует проблема корректной оценки ее активности по причине существования интегрированных и ассоциированных с этой мембраной оксидаз, для которых восстанавливающие субстраты в условиях эксперимента становятся одинаково доступными. Нами было показано, что такая часть супероксид-продуцирующих активностей плазмалеммы, не имеющих отношения к НАДФН-оксидазе, может составлять около 30 %, что подтверждается ингибированием ДФИ, который полностью не блокировал образование 02~ в присутствии НАДФН (рис. 11).

Конститутивная активность (рис. 15) отличает НАДФН-оксидазу плазмалеммы растений от оксидазы фагоцитов, активация которой требует ассоциации мембранных субъединиц gp91phox и р22р1юх с цитоплазматическими белками (У1§па1з, 2002). Однако выявление нами НАДФН-оксидазы в одном из высокомолекулярных комплексах плазмалеммы с максимальной супероксид-продуцирующей активностью (рис. 17), может указывать на необходимость контакта этого фермента с белками, регулирующими его активность. Кроме того, не исключено, что такой высокомолекулярный комплекс может содержать белки, которые являются мишенями регуляции самой НАДФН-оксидазой.

Скорость продукции 02~ плазмалеммой в присутствии НАДФН не была одинаковой, а менялась по принципу транзиторности в зависимости от времени пребывания проростков на низкой температуре (рис. 14). Такая динамика изменений может быть показателем того, что повышение уровня вырабатываемого НАДФН-оксидазой супероксида обусловлено необходимостью инициации запуска каскада регуляторных реакций, в которых АФК играют роль сигнальных молекул. Спад в образовании 02" после 24 ч охлаждения можно рассматривать как свидетельство того, что потребность в них отпала, так как цепь регуляторных реакций приведена в действие.

Очевидно, что НАДФН-оксидаза не может непосредственно воспринимать сигнал об изменении окружающей температуры, поскольку таким сенсором, скорее всего, является липидный бислой мембран, который изменяет свое фазовое состояние путем повышения или снижения вязкости (Hasel, 1995), вследствие чего изменяется активность мембранных белков, чувствительных к таким изменениям. Как показано в ряде работ, к такому типу белков относятся Ca -каналы (Demidchik et al., 2003; Mori and Schroeder, 2004; Kurusu et al., 2012). Их активация способствует входу ионов Са2+ внутрь клетки, которые связываясь с Са2+-связывающими сайтами НАДФН-оксидазы, приводят ее в активное состояние. Таким образом, предполагается, что активация фермента является опосредованной.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пиотровский, Михаил Сергеевич, Москва

1. Смирнова А.В., Матвеева Н.П., Полесская О.Г., Ермаков И.П. (2009) Образование активных форм кислорода при прорастании пыльцевого зерна. Онтогенез. 40, 425-435.

2. Alvarez М.Е., Pennell R.I., Meijer P.-J., Ishikawa A., Dixon R.A, Lamb C.1998) Reactive oxygen intermediates mediate a systemic signal network in the establishment of plant immunity. Cell, 93, 773-784.

3. Angelini R., Tisi A., Rea G., Chen M.M., Botta M., Federico R., Cona A.2008) Involvement of polyamine oxidase in wound healing. Plant Physiol., 146, 162-177.

4. Apel K., Hirt H. (2004) Reactive Oxygen Species: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal Transduction. Plant Biol., 55, 373-99.

5. Aro E., Suorsa M., Rokka A., Allahverdiyeva Y., Paakkarinen V., Saleem A., Battchikova N, Rintamaki E. (2005) Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. J. Exp. Bot., 56, 347-356.

6. Asada K. (1999) The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygen's and dissipation of excess photons. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol Biol., 50, 601-639.

7. Asai S., Yoshioka H. (2009) Nitric oxide as a partner of reactive oxygen species participates in disease resistance to necrotrophic pathogen Botrytis cinerea in Nicotiana benthamiana. Mol. Plant Microbe Interact., 22, 619-629.

8. D'Autreaux B., Toledano M.B. (2007) ROS as signaling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat. Rev., 8, 813-824.

9. Bader N. and Grune T. (2006) Protein oxidation and proteolysis. Biol. Chem., 387, 1351-1355.

10. Bechtold U., Richard O., Zamboni A. (2008) Impact of chloroplastic- and extracellular-sourced ROS on high light-responsive gene expression in Arabidopsis. J. Exp. Bot., 59, 121-133.

11. Bedard K., Krause K.H. (2007) The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev., 87, 245-313.

12. Berglund G., Carlsson G., Smith A., Szoke H., Henriksen A., Hajdu J. (2002) The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution. Nature, 417, 463-468.

13. Bernards M.A., Summerhurst D.K., Razem F.A. (2004) Oxidases, peroxidases and hydrogen peroxide: the suberin connection. Phytochem. Rev., 3, 113-126.

14. Bienert G.P., Moller A.L., Kristiansen K.A., Schulz A., Moller I.M., Schjoerring J.K., Jahn T.P. (2007) Specific aquaporins facilitate the diffusion of hydrogen peroxide across membranes. J. Biol Chem., 282, 1183-1192.

15. Bolwell G.P., Bindschedler L.V., Blee K.A., Butt V.S., Davies D.R., Gardner S.L., Gerrish C., Minibayeva, F. (2002) The apoplastic oxidative burst in response to biotic stress in plants: a three component system. J. Exp. Bot., 53, 1367-1376.

16. Bowler C., Fluhr R. (2000) The role of calcium and activated oxygens as signals for controlling cross-tolerance. Trends Plant Sci., 5, 241-245.

17. Bradford M. (1976) Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248-254.

18. Brand M.D., Affourtit., Esteves T.C., Green K., Lambert A.J.,Miwa S., Pakay J.L., Parker N. (2004) Mitochondrial superoxide production, logical effects, and activation of uncoupling proteins. Free Radical. Biol. Med., 37, 755-767.

19. Brennan T., Frenkel C. (1977) Involvement of hydrogen peroxide in the regulation of senescence in pear. Plant Physiol., 59, 411-416.

20. Brownleader M.D., Hopkins J., Mobasheri A., Dey P.M., Jackson P., Trevan

21. M. (2000) Role of extension peroxidase in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) seedling growth. Planta, 210, 668-676.

22. Caliskan M., Cuming A.C. (1998) Spatial specificity of H202-generating oxalate oxidase gene expression during wheat embryo germination. Plant J., 15, 165-171.

23. Charity T. Aiken C.T., Kaake R.M., Wang X., and Huang L. (2011) Oxidative Stress-Mediated Regulation of Proteasome Complexes. Mol. Cell. Proteomics, 10, 10.1074/mcp.Rl 10.006924, 1-11.

24. Coelho S.M., Brownlee C., Bothwell J. (2008) A tip-high, Ca2+-interdependent, reactive oxygen species gradient is associated with polarized growth in Fucus serratus zygotes. Planta, 227, 1037-1046.

25. Cona A., Rea G., Angelini R., Federico R., Tavladoraki P. (2006) Functions of amine oxidases in plant development and defense. Trends Plant Sci., 11, 80-88.

26. Corpas F.J., Barroso J.B., Del Rio L.A. (2001) Peroxisomes as a source of reactive oxygen species and nitric oxide signal molecules in plant cells. Trends Plant Sci., 6,145-150.

27. Cosio C., Dunand C. (2009) Specific functions of individual class III peroxidase genes. J. Exp. Bot., 60, 391-408.

28. Cross A.R., Segal A.W. (2004) The NADPH oxidase of professional phagocytes prototype of the NOX electron transport chain systems. Biochim. Biophys. Acta, 1657, 1-22.

29. Cross A.R., Jones O.T.G. (1986) The effect of the inhibitor diphenylene iodonium on the superoxide-generating system of neutrophils. Specific labeling of a component polypeptide of the oxidase. Biochem. J., 237, 111-116.

30. Dat J., Vandenabeele S., Vranova E., Van Montagu M., Inze D., Van Breusegen F. (2000) Dual action of the active oxygen species during plant stress responses. Cell Mol. Life Sci., 57, 779-795.

31. Davletova S., Rizhsky L., Liang H.J., Zhong S.Q., Oliver D.J., Coutu J., Shulaev V., Schlauch K., Mittler R. (2005) Cytosolic ascorbate peroxidase-1 is a central component of the reactive oxygen gene network of Arabidopsis. Plant Cell, 17, 268-281.

32. DellaPenna D., Pogson B.J. (2006) Vitamin synthesis in plants: tocopherols and carotenoids. Annu. Rev. Plant Biol., 57, 711-738.

33. Del Rio L.A, Corpas F.J, Sandalio L.M, Palma J.M, Gomez M, Barroso J.B.2002) Reactive oxygen species, antioxidant systems and nitric oxide in peroxisomes. J. Exp. Bot., 53, 1255-1272.

34. Del Rio L.A., Sandalio L.M., Corpas F.J., Barroso J.B. (2006) Reactive oxygen species and reactive nitrogen species in peroxisomes. Production, scavenging, and role in cell signaling. Plant Physiol., 141, 330-335.

35. Demidchik V., Shabala S.N., Coutts K.B., Tester M.A., Davies J.M. (2003) Free oxygen radicals regulate plasma membrane Ca and K -permeable channels in plant root cells. J. Cell Sci., 116, 81-88.

36. Desikan R., Mackerness S.A.-H., Hancock J.T., Neill S.J. (2001) Regulation of the Arabidopsis transcriptome by oxidative stress. Plant Physiol., 127, 159-172.

37. Dismukes G.C., Klimov V.V., Baranov S.V., Kozlov Y.N., DasGupta J., Tyryshkin A. (2001) The origin of atmospheric oxygen on Earth: the innovation of oxygenic photosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 2170-2175.

38. Dowdle J., Ishikawa T., Gatzek S., Rolinski S., Smirnoff N. (2007) Two genes in Arabidopsis thaliana encoding GDP-l-galactose phosphorylase are required for ascorbate biosynthesis and seedling viability. Plant J., 52, 673-689.

39. Dunand C., Crevecoeur M., Penel C. (2007) Distribution of superoxide and peroxide in Arabidopsis root and their influence on root development: possible interaction with peroxidases. New Phytol., 174, 332-341.

40. Epple P., Mack A.A., Morris V., Dangl J.L. (2003). Antagonistic control of oxidative stress-induced cell death in Arabidopsis by two related, plant specific zinc finger proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 6831-6836.

41. Fedoroff N. (2006) Redox regulatory mechanisms in cellular stress responses. Ann. Bot., 98, 289-300.

42. Fluhr R. (2009) Reactive oxygen-generating NADPH oxidases in plants. In: Reactive Oxygen Species in Plant Signaling. Signaling and Communication in Plants, Del Rio L.A. and Puppo A. (eds), Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag., pp 1-24.

43. Fobert P.R., Despres C. (2005) Redox control of systemic acquired resistance. Curr. Opin. Plant Biol., 8, 378-382.

44. Foreman J., Demidchik V., Bothwell J.N., Mylona P., Miedema H., Torres M.A., Linstead P., Costa S., Brownlee C., Jones J.D., Davies J.M., Dolan L.2003) Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase regulate plant cell growth. Nature, 422, 442-446.

45. Foyer C., Noctor G. (2005) Oxidant, antioxidant signalling in plants: a reevaluation of the concept of oxidative stress in a physiological context. Plant Cell Environ., 28, 1056-1071.

46. Foyer C.H., Noctor G. (2009) Redox regulation in photosynthetic organisms: signaling, acclimation, and practical implications. Antioxid. Redox Signal, 11, 861906.

47. Fukamatsu Y., Yabe N., Hasunuma K. (2003) Arabidopsis NDK1 is a component of ROS signaling by interacting with three catalases. Plant Cell Physiol., 44, 982-989.

48. Fry S.C. (2004) Oxidative coupling of tyrosine and ferulic acid residues: intra-and extra-protoplasmic occurrence, predominance of trimers and larger products, and possible role in inter-polymeric cross-linking. Phytochem. Rev., 3, 97-111.

49. Fujii H., Chinnusamy V., Rodrigues A., Rubio S., Antoni R., Park S.Y., Cutler S.R., Sheen J., Rodriguez P.L., Zhu J.K. (2009) In vitro reconstitution of an abscisic acid signalling pathway. Nature, 462, 660-664.

50. Grant J.J., Loake G.J. (2000) Role of reactive oxygen intermediates and cognate redox signaling in disease resistance. Plant Physiol., 124, 21-30.

51. Gu Y., Wang Z., Yang Z. (2004) ROP/RAC GTPase: an old new master regulator for plant signaling .Curr. Opin. Plant Biol., 7, 527-536.

52. Grennan A.K. (2007) Lipid rafts in plants. Plant Physiol., 143, 1083-1085.

53. Halliwell B. (2006) Reactive species and antioxidants. Redox biology is a fundamental theme of aerobic life. Plant Physiol., 141, 312-322.

54. Hazel J.R. (1995) Thermal adaptation in biological membranes: is homeoviscous adaptation the explanation? Annu. Rev. Physiol., 57, 19-42.

55. Henderson L. M., Chappell J. B., JonesT. G. (1993) Dihydrorhodamine 123: a fluorescent probe for superoxide generation? Eur. J. Biochem., 217, 973-980.

56. Heyno E., Mary V., Schopfer P., Krieger-Liszkay A. (2011) Oxygen activation at the plasma membrane: relation between superoxide and hydroxy 1 radical production by isolated membranes. Planta, 234, 35-45.

57. Hideg E., Barta C., Kalai T., Vass I., Hideg K., Asada K. (2002) Detection of singlet oxygen and superoxide with fluorescent sensors in leaves under stress by photoinhibition or UV radiation. Plant Cell Physiol, 43, 1154-1164.

58. Hu X., Jiang M., Zhang J. (2007) Calcium-calmodulin is required for abscisic acid-induced antioxidant defense and functions both upstream and downstream of of H2O2 production in leaves of maize (Zea mays) plants. New Phytol, 173, 27-38.

59. Jiang M., Zhang J. (2002) Involvement of plasma-membrane NADPH oxidase in abscisic acid- and water stress-induced antioxidant defense in leaves of maize seedlings. Planta, 215, 1022-1030.

60. Jakob, B. and Heber, U. (1996) Photoproduction and detoxification of hydroxyl radicals in chloroplasts and leaves and relation to photoinactivation of photosystem I and II. Plant Cell Physiol., 37, 629-635.

61. Jaleel C.A., Riadh K., Gopi R. (2009) Antioxidant defense responses: physiological plasticity in higher plants under abiotic constraints. Acta Physiol. Plant., 31, 427-436.

62. Jaspers P., Kangasjarvi J. (2010) Reactive oxygen species in abiotic stress signaling. Physiol. Plantarum, 138, 405-413.

63. Johansson F., Olbe M., Sommarin M., Larsson C. (1995) Brij 58, a polyoxyethylene acyl ether, creates membrane vesicles of uniform sidedness. Anew tool to obtain inside-out (cytoplasmic side-out) plasma membrane vesicles. Plant J., 7, 165-173.

64. Kaminaka H., Nake C., Epple E., Dittgen J., Schütze K., Chaban C., Holt B.F., Merkle T., Schafer E., Harter K., Dangl J.L. (2006) bZIPlO-LSDl antagonism modulates basal defense and cell death in Arabidopsis following infection. EMBOJ., 25, 4400-4411.

65. Kawahara T., Quinn M.T., Lambeth J.D. (2007) Molecular evolution of the reactive oxygen-generating NADPH oxidase (Nox/Duox) family of enzymes. BMCEvol. Biol., 7, 109.

66. Kawano T. (2003) Roles of the reactive oxygen species-generating peroxidase reactions in plant defense and growth induction. Plant and Cell Rep., 21, 829-837.

67. Kawasaki T., Henmi K., Ono E., Hatakeyama S., Iwano M., Satoh H., Shimamoto K. (1999) The small GTP-binding protein Rae is a regulator of cell death in plants. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96, 10922-10926.

68. Kehrer J.P. (2000) The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology, 149, 43-50.

69. Kiddle G., Pastori G.M., Bernard S. (2003) Effects of leaf ascorbate on defense and photosynthesis gene expression in Arabidopsis thaliana. Antioxid. Redox Signal., 5, 23-32.

70. Kobayashi M., Kawakita K., Maeshima M., Doke N., Yoshioka H. (2006) Subcellular localization of Strboh proteins and NADPH-dependent 02 "-generating activity in potato tuber tissues. J Exp. Bot., 57, 1373-1379.

71. Kobayashi M., Ohura I., Kawakita K., Yokota N., Fujiwara M., Shimamoto K., Doke N., Yoshioka H. (2007) Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. Plant Cell, 19, 1065-1080.

72. Kovtun Y., Chiu W-L., Tena G., Sheen J. (2000) Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants. Proc Natl Acad Sci. USA, 97, 2940-2945.

73. Kumar G.N.M., Iyer S., Knowles N.R. (2007) StrbohA homologue of NADPH oxidase regulates wound-induced oxidative burst and facilitates wound-healing in potato tubers. Planta, 227, 25-36.

74. Kurusu T., Nishikawa D., Yamazaki Y., Gotoh M., Nakano M., Hamada H., Yamanaka T., Iida K., Nakagawa Y., Saji H., Shinozaki K., Iida H., Kuchitsu

75. K. (2012) Plasma membrane protein OsMCAl is involved in regulation of hypo-osmotic shock-induced Ca influx and modulates generation of reactive oxygen species in cultured rice cells. BMC Plant Biology, 12, 11 (doi:10.1186/1471-2229-12-11).

76. Kwak J.M., Mori I.C., Pei Z.M., Leonhardt N., Torres M.A., Dangl J.L., Bloom R.E., Bodde S., Jones J.D., Schroeder J.I. (2003) NADPH oxidase AtrbohD and AtrbohF Genes Function in ROS-Dependent ABA Signalling in Arabidopsis. EMBOJ., 22, 2623-2633.

77. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage T4. Nature, 221, 680-685.

78. Laloi C., Przybyla D., Apel K. (2006) A genetic approach towards elucidating the biological activity of different reactive oxygen species in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot., 57, 1719-1724.

79. Lamb C., Dixon R.A. (1997) The Oxidative Burst in Plant Disease Resistance. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48, 251-275.

80. Langebartels C., Wohlgemuth H., Kschieschan S., Grun S., Sandermann H.2002) Oxidative burst and cell death in ozone-exposed plants. Plant Physiol. Biochem. 40, 567-575.

81. Larkindale J., Hall J.D., Knight M.R., Vierling E. (2005) Heat stress phenotypes of Arabidopsis mutants implicate multiple signaling pathways in the acquisition of thermotolerance. Plant Physiol., 138, 882-897.

82. Larsson C., Sommarin M., Widell S. (1994) Isolation of highly purified plant plasma membranes and separation of inside-out and right-side out vesicles. Meth. Enzymol., 228, 451-469.

83. Laurenzi M., Tipping A.J., Marcus S.E., Knox J.P., Federico R., Angelini R., McPherson M.J. (2001) Analysis of the distribution of copper amine oxidase in cell walls of legume seedlings. Planta, 214, 37-45.

84. Lee K.P., Kim C., Landgraf K., Apel K. (2007) EXECUTER1- and EXECUTER2-dependent transfer of stress-related signals from the plastid to the nucleus of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 104, 10270-10275.

85. Lin F., Zhang Y., Jiang M. (2009) Alternative splicing and differential expression of two transcripts of nicotine adenine dinucleotide phosphate oxidase B gene from Zea mays. J. Integr. Plant Biol., 51, 287-298.

86. Liu P., Li R.-L., Zhang L., Wang Q.-L., Niehaus K., Baluska F., Samay J., and Lin J.-X. (2009) Lipid microdomain polarization is required for NADPH oxidase-dependent ROS signaling in Picea meyeri pollen tube tip growth. Plant J., 60, 303-313.

87. Liszkay A., van der Zalm E., Schopfer P. (2004) Production of reactive oxygen intermediates (02H202, and OH) by maize roots and their role in wall loosening and elongation growth. Plant Physiol, 136, 3114-3123.

88. Luthje S., Hopff D., Schmitt A.K., ,Meisrimler C.-N., Menckhoff L. (2009) Hunting for low abundant redox proteins in plant plasma membranes. J. Proteomics, 72, 475-483.

89. Ma L., Zhang H., Sun L., Jiao Y., Zhang G., Miao C., Hao F. (2012) NADPH oxidase AtrbohD and AtrbohF function in ROS-dependent regulation of Na+/K+ homeostasis in Arabidopsis under saly stress. J. Exp. Bot., 63, 305-317.

90. Mackerness S., John C.F., Jordan B., Thomas B. (2001) Early signaling components in ultraviolet-B responses: distinct role for different reactive oxygen species and nitric oxide. FEBSLett., 489, 237-242.

91. Mahalingam R., Fedoroff N. (2003) Stress response, cell death and signaling: many faces of reactive oxygen species. Physiol Plantarum, 119, 56-68.

92. Marino D., Andrio E., Danchin E.G., Oger E., Gucciardo S., Lambert A., Puppo A., Pauly N: A (2011) Medicago truncatula NADPH oxidase is involved in symbiotic nodule functioning. New Phytol., 189,580-592.

93. Marino D., Dunand C., Puppo A., Pauly M. (2012) A burst of plant NADPH oxidases. Trends Plant Sci., 17, 9-15.

94. Martinsuo P., Pursiheimo S., Aro E.M., Rintamaki E. (2003) Dithiol oxidant and disulfide reductant dynamically regulate the phosphorylation of light-harvesting complex II proteins in thylakoid membranes. Plant Physiol, 133, 37-46.

95. Maruta T, Noshi M, Tanouchi A, Tamoi M, Yabuta Y, Yoshimura K, Ishikawa T, Shigeoka S. (2012) H202-triggered retrograde signaling from chloroplasts to nucleus plays specific role in response to stress. J. Biol. Chem., 287, 11717-11729.

96. Mason J.T., Kim S.K., Knaff D.B., Wood M.J. (2006) Thermodynamic basis for redox regulation of the Yapl signal transduction pathway. Biochemistry, 45, 13409-13417.

97. May M.J., Vernoux T., Sanchez-Fernandez R. (1998) Evidence for post-transcriptional activation of G-glutamylcysteine synthetase during plant stress responses. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95, 12049-12054.

98. Medda R, Padiglia A, Floris G. (1995) Plant copper-amine oxidases. Phy to chemistry, 39, 1-9.

99. Meinhard M., Rodriguez P.L., Grill E. (2002) The sensitivity of ABI2 to hydrogen peroxide links the abscisic acid response regulator to redox signaling. Planta, 214, 775-782.

100. Miao Y., Laun T.M., Smykowski A., Zentgraf U. (2007) Arabidopsis MEKK1 can take a short cut: it can directly interact with senescence-related WRKY53 transcription factor on the protein level and can bind to its promoter. Plant Mol. Biol., 65, 63-76.

101. Meng T.C., Fukada T., Tonks N.K. (2002) Reversible oxidation and inactivation of thyrosine phosphatase in vivo. Mol. Cell, 9, 387-399.

102. Meskauskiene R., Nater, M., Goslings D., Kessler F., op den Camp R., Apel

103. K. (2001) FLU: A negative regulator of chlorophyll biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 98, 72525-12831.

104. Miller G., Mittler R. (2006) Could heat shock transcription factors function as hydrogen peroxide sensors in plants? Ann. Bot., 98, 279-288.

105. Miller G., Shulaev V., Mittler R. (2008) Reactive Oxygen Signaling and Abiotic Stress. Physiol. Plantarum, 133, 481-489.

106. Miller G., Suzuki N., Ciftci-Yilmaz S., Mittler R. (2010) Reactive oxygen species homeostasis and signaling during drought and salinity stresses. Plant Cell Environ., 33, 453-467.

107. Mittler R. (2002) Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci., 7, 405-410.

108. Mittler R., Vanderauwera S., Gollery M., van Breusegem F. (2004) Reactive oxygen gene network of plants. Trends Plant Sci., 9, 490-498.

109. Mittler R., Vanderauwera S., Suzuki N., Miller G., Tognetti V.B., Vandepoele K., Gollery M., Shulaev V., Van Breusegem F: (2011) ROS signaling: the new wave? Trends Plant Sci., 16, 300-309.

110. Moller I.M. (2001) Plant mitochondria and oxidative stress: electron transport, NADPH turnover, and metabolism of reactive oxygen species. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 52, 561-591.

111. Moller I.M., Jensen P.E., Hansson A. (2007) Oxidative modifications to cellular components in plants. Annu. Rev. Plant Biol., 58, 459—481.

112. Mongrand S., Morel J., Laroche J., Claverol S., Carde J.-P., Hartmann M.-A., Bonneu M., Simon-Plas F., Lessire R., Bessoule J.-J. (2004) Lipid rafts in higher plant cells. J. Biol. Chem., 279, 36277-36286.

113. Monshausen G.B., Bibikova T.N., Weisenseel M.H., Gilroy S. (2009) Ca2+ regulates reactive oxygen species production and pH during mechanosensing in Arabidopsis roots. Plant Cell, 21, 2341-2356.

114. Moons A. (2005) Regulatory and functional interactions of plant growth regulators and plant glutathione S-transferases (GSTs). Plant Hormones, 72, 155202.

115. Morel J., Fromentin J., Blein J.P., Simon-Plas F., Elmayan T. (2004) Rac regulation of NtrbohD, the oxidase responsible for the oxidative burst in elicited tobacco cells. Plant J., 37, 282-293.

116. Morel J., Claverol S., Mongrand S., Furt F., Fromentin J., Bessoule J.J., Blein J.P., Simon-Plas F. (2006) Proteomics of plant detergent-resistant membranes. Mol. Cell Proteomics, 5, 1396-1411.

117. Mori I.C., Schroeder J.I. (2004) Reactive oxygen species activation of plant Ca2+ channels: a signaling mechanism in polar growth, hormone transduction, stress signaling, and hypothetical mechanotransduction. Plant Physiol., 135, 702-708.

118. Morita S., Kaminaka H., Masumura T., Tanaka K. (1999) Induction of rice cytosolic ascorbate peroxidase mRNA by oxidative stress: the involvement of hydrogen peroxide in oxidative stress signaling. Plant Cell Physiol., 40, 417-422.

119. Mou Z., Weihua Fan W., Dong X. (2003) Inducers of plant systemic acquired resistance regulate NPR1 function through redox changes. Cell, 113, 935-944.

120. Muller K., Carstens A.C., Linkies A., Torres M.A., Leubner-Metzger G.2009a) The NADPH-oxidase AtrbohB plays a role in Arabidopsis seed after-ripening. New Phytol., 184, 885-897.

121. Muller K., Linkies A., Vreeburg R.M., Fry S.C., Krieger-Liszkay A., Leubner-Metzger G. (20096) In vivo cell wall loosening by hydroxyl radicals during cress seed germination and elongation growth. Plant Physiol., 150, 18551865.

122. Nakagami H, Kiegerl S, Hirt H. (2004) OMTK1, a novel MAPKKK, channels oxidative stress signaling through direct MAPK interaction. J. Biol. Chem., 279, 26959-26966.

123. Nakagami H., Pitzschke A., Hirt H. (2005) Emerging MAP kinase pathways in plant stress signaling. Trends Plant Sci., 10, 339-346.

124. Nuhse T.S., Bottrill A.R., Jones A.E., Peck S.C. (2007) Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. Plant J., 51, 931-940.

125. Ono E., Wong H.L., Kawasaki T., Hasegawa M., Kodama O., Shimamoto K.2001) Essential role of the small GTPase Rac in disease resistance of rice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 759-764.

126. Palmgren M. G. (1990) An H+-ATPase assay: proton pumping and ATPase activity determined simultaneously in the same sample. Plant Physiol., 94, 882886.

127. Park J., Gu Y., Lee Y., Yang Z. B., Lee Y. (2004) Phosphatidic acid induces leaf cell death in Arabidopsis by activating the Rho-related small G protein GTPase-mediated pathway of reactive oxygen species generation. Plant Physiol., 134, 129136.

128. Paschalidis K.A., Roubelakis-Angelakis K.A. (2005) Sites and regulation of polyamine catabolism in the tobacco plant: correlations with cell division/expansion, cell cycle progression, and vascular development. Plant Physiol., 138,2174-2184.

129. Passardi F., Cosio C., Penel C., Dunand C. (2005) Peroxidases have more functions than a Swiss army knife. Plant Cell Rep., 24, 255-265.

130. Peleg-Grossman S., Volpin H., Levine A. (2007) Root hair curling and Rhizobium infection in Medicago truncatula are mediated by phosphatidylinositide-regulated endocytosis and reactive oxygen species. J. Exp. Bot., 58, 1637-1649.

131. Pietrangeli P., Federico R., Mondovi B., Morpurgo L. (2007) Substrate specificity of copper-containing plant amine oxidases. J. Inorg. Biochem., 101, 997-1004.

132. Pignocchi C., Fletcher J.E., Barnes J., Foyer C.H. (2003) The function of ascorbate oxidase (AO) in tobacco (Nicotiana tabacum L.). Plant Physiol., 132, 1631-1641.

133. Pitzschke A., Djamei A., Bitton F., Hirt H. (2009) A major role of the MEKK1-MKK1/2-MPK4 pathway in ROS signalling. Mol. Plant, 2, 120-137.

134. Pogany M., Rad U., Grün S., Dongö A., Pintye A., Simoneau P., Bahnweg G., Kiss L., Barna B. (2009) Dual roles of reactive oxygen species and NADPH oxidase RBOHD in an Arabidopsis-Alternaria pathosystem. Plant Physiol., 151, 1459-1475.

135. Polidoros A.N., Scandalios J.G. (1999) Role of hydrogen peroxide and different classes of antioxidants in the regulation of catalase and glutathione-S-transferase gene expression in maize. Physiol. Plantarum, 106, 112-120.

136. Potocky M., Jones M.A., Bezvoda R., Smirnoff N., Zarsky V. (2007) Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase are involved in pollen tube growth. New Phytol., 174, 742-751.

137. Prasad T.K., Anderson M.D., Martin B.A., Stewart C.R. (1994) Evidence for chilling-induced oxidative stress in maize seedlings and a regulatory role for hydrogen peroxide. Plant Cell, 6, 65-74.

138. Przybyla D., Ochsenbein C., Laloi C., Kim C., Danon A., Wagner D., Hideg E., Gobel C., Feussner I., Nater M., Apel K. (2003) Rapid induction of distinct stress responses after the release of singlet oxygen in Arabidopsis. Plant Cell, 15, 2320-2332.

139. Queval G., Hager J., Gakiere B., Noctor G. (2008) Why are literature data for H2O2 contents so variable? A discussion of potential difficulties in the quantitative assay of leaf extracts. J. Exp. Bot., 59, 135-146.

140. Razem F.A., Bernards M.A. (2003) Reactive oxygen species production in association with suberization: evidence for an NADPH-dependent oxidase. J. Exp. Bot., 54, 935-941.

141. Reisinger V., Eichacker L. A. (2008) Solubilization of membrane protein complexes for blue native PAGE. J. Proteomics, 71, 277-283.

142. Rentel M.C., Lecourieux D., Ouaked F., Usher S.L., Petersen L., Okamoto H., Knight H., Peck S.C., Grierson C.S., Hirt H., Knight M.R. (2004) OXI1 kinase is necessary for oxidative burst-mediated signaling in Arabidopsis. Nature, 427, 858-861.

143. Sagi M., Fluhr R. (2001) Superoxide production by plant homologues of the gp91phox NADPH oxidase. Modulation of activity by calcium and by tobacco mosaic virus infection. Plant Physiol., 126, 1281-1290.

144. Sagi M., Davydov O., Orazova S., Yesbergenova Z., Ophir R., Stratmann

145. J.W., Fluhr R. (2004) Plant respiratory burst oxidase homologs impinge on wound responsiveness and development in Lycopersicon esculentum. Plant Cell, 16, 616-628.

146. Sagi M., Fluhr R. (2006) Production of Reactive Oxygen Species by Plant NADPH oxidases. Plant Physiol., 141, 336-340.

147. Schagger H. (2006). Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols, 1, 16-23.

148. Shin R., Schachtman D.P. (2004) Hydrogen peroxide mediates plant root cell response to nutrient deprivation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 101, 8827-8832.

149. Simon-Plas F., Elmayan T., Blein J.P. (2002) The plasma membrane oxidase NtrbohD is responsible for AOS production in eliceted tobacco cells. Plant J., 31, 137-148.

150. Simon-Plas F., Perraki A., Bayer E., Gerbeau-Pissot P., Mongrand S. (2011) An update on plant membrane rafts. Curr. Opin. Plant Biol., 14, 1-8.

151. Sirichandra C., Gu D., Hu H., Davanture M., Lee S., Djaoui M. (2009) Phosphorylation of the Arabidopsis AtrbohF NADPH oxidase by OST1 protein kinase. FEBSLett., 583, 2982-2986.

152. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem., 150 (1), 76-85.

153. Song C.J., Steinebrunner I., Wang X., Stout S.C., Roux S.J. (2006) Extracellular ATP induces the accumulation of superoxide via NADPH oxidases in Arabidopsis. Plant Physiol., 140, 1222-1232.

154. Spadaro D., Yun B.-W., Spoel S.H., Chu C., Wang Y-Q., Loake G.J. (2010) The redox switch: dynamic regulation of protein function by cysteine modifications. Physiol. Plantarum, 138, 360-371.

155. Suzuki N., Mittler R. (2006) Reactive oxygen species and temperature stresses: delicate balance between signaling and destruction. Physiol. Plantarum, 126, 4551.

156. Suzuki, N., Miller G., Morales J., Shulaev V., Torres M.A., Mittler R. (2011) Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling. Curr. Opin. Plant Biol., 14, 691-699.

157. Szalai G., Kellos T., Galiba G., Kocsy G.(2009) Glutathione as an antioxidant and regulatory molecule in plants under abiotic stress conditions. J. Plant Growth Regul., 28, 66-80.

158. Takahashi T., Kakehi J. (2010) Polyamines: ubiquitous poly-cations with unique roles in growth and stress responses. Ann. Bot., 105, 1-6.

159. Takahashi F., Mizoguchi T., Yoshida R., Ichimura K., Shinozaki K. (2011) Calmodulin-dependent activation of MAP kinase for ROS homeostasis in Arabidopsis. Mol Cell, 41, 649-660.

160. Takeda S., Gapper C., Kaya H., Bell E., Kuchitsu K., Dolan L. (2008) Local positive feedback regulation determines cell shape in root hair cells. Science, 319, 1241-1244.

161. Terada L.S. (2006) Specificity in reactive oxidant signaling: think globally, act locally. J. Cell Biol., 174, 615-623.

162. Tognolli M., Penel C., Greppin H., Simon P.( 2003) Analysis and expression of the class III peroxidase large gene family in Arabidopsis thaliana. Gene, 288, 129138.

163. Tonon C., Terrile M.C., Iglesias M.J.,. Lamattina L., Casalongue C. (2010) Extracellular ATP, nitric oxide and superoxide act coordinately to regulate hypocotyl growth in etiolated Arabidopsis seedlings. J. Plant Physiol., 167, 540546.

164. Torres M.A., Dangl J.L., Jones J.D.S. (2002) Arabidopsis gp91(phox) homologues AtrbohD and AtrbohF are required for accumulation of reactive oxygen intermediates in the plant defense response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 517-522.

165. Torres M.A. and Dangl J.L. (2005) Functions of the respiratory burst oxidase in biotic interactions, abiotic stress and development. Cur. Opin. Plant Biol., 8, 397403.

166. Torres M.A., Jones J.D., Dangl J.L. (2006) Reactive Oxygen Species Signaling in Response to Pathogens. Plant Physiol., 141, 373-378.

167. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from poly aery lamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354.

168. Tsukagoshi H., Busch W., Benfey N. (2010) Transcriptional regulation of ROS controls transition from proliferation to differentiation in the root. Cell, 143, 606616.

169. Vandenbroucke K., Robbens S., Vandepoele K., Inze D., Van de Peer Y., Van Breusegem F. (2008) H202-induced gene expression across kingdoms: a comparative analysis. Mol. Biol. Evol., 25, 507-516.

170. Vignais P.V. (2002) The superoxide-generating NADPH oxidase: structural aspects and activation mechanism . Cell Mol. Life Sci., 59, 1428-1459.

171. Vranova E., Inze D., Van Breusegem F.V. (2002) Signal transduction during oxidative stress. J. Exp. Bot., 53, 1227-1236.

172. Wittig I., Karas M., Schagger H. (2007) High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol. Cell. Proteomics, 6, 1215-1225.

173. Wong H.L., Pinontoan R., Hayashi K. (2007) Regulation of rice NADPH oxidase by Rac GTPase to its N-terminal extension. Plant Cell, 19, 4022-4034.

174. Xia X.J., Wang Y.J., Zhou Y.H., Shi K., Yu J.Q. (2009) Reactive oxygen species are involved in brassinosteroid-induced stress tolerance in cucumber. Plant Physiol., 150, 801-814.

175. Yoshie Y., Goto K., Takai R., Iwano M., Takayama S., Isogai A., Che F.S.2005) Function of the rice gp91phox homologs OsrbohA and OsrbohE genes in ROS-dependent plant immune responses. Plant Biotechnol., 22, 127-135.

176. Zhang A., Zhang J., Ye N., Cao J., Tan M., Zhang J., Jiang M. (2010) ZmMPK5 is required for the NADPH oxidase mediated self-propagation ofapoplastic H2O2 in brassinosteroid induced antioxidant defence in leaves of maize. J.Exp. Bot., 61,4399-4411.

177. Zimmermann P., Hirsch-Hoffmann M., Hennig L., Gruissem W. (2004) GENEVESTIGATOR. Arabidopsis microarray database and analysis toolbox. Plant Physiol., 136, 2621-2632.

178. Zimmermann P., Hennig L., Gruissem W. (2005) Gene-expression analysis and network discovery using Genevestigator. Trends Plant Sei., 10, 407-409.

Информация о работе

Пиотровский, Михаил Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.05

Диссертация

Участие НАДФН-оксидазы плазмалеммы в генерации супероксид-анион радикала в апопласте - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы