Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие мускариновых рецепторов третьего типа в опосредовании холинергической регуляции сердца млекопитающих

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Участие мускариновых рецепторов третьего типа в опосредовании холинергической регуляции сердца млекопитающих"

На правах рукописи

ТАПИЛИНА СВЕТЛАНА ВЛАДИМИРОВНА

УЧАСТИЕ МУСКАРИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ ТРЕТЬЕГО ТИПА В ОПОСРЕДОВАНИИ ХОЛИНЕРГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ СЕРДЦА МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.03.01 — Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 Ш 2015

005559626 Москва 2015

005559626

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета (зав. кафедрой - профессор A.A. Каменский) Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова».

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Абрамочкин кандидат биологических наук, старший научный Денис сотрудник кафедры физиологии человека и животных

Валерьевич биологического факультета Федерального

государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова»

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Зиятдинова кандидат биологических наук, доцент, доцент кафедры Нафиса анатомии, физиологии и охраны здоровья человека

Ильгизовна Казанского Федерального Университета.

Азаров Ян доктор биологических наук, доцент, заведующий Эрнестович лабораторией физиологии сердца ФГБУН Института физиологии КомиНЦ УОРАН.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Минздрава России.

Защита диссертации состоится 23 марта 2015 г. в 1530 часов на заседании диссертационного совета Д501.001.93 при биологическом факультете Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, д. 27) и на сайте http://www.bio.msu.ru/.

Автореферат разослан 21 февраля 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Умарова Б.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время изучение регуляции сердечной деятельности развивается высокими темпами, что в первую очередь связано с остро стоящей перед человечеством проблемой сердечно-сосудистых заболеваний. Из всех регуляторных воздействий, которым сердце подвергается в организме, парасимпатические являются, пожалуй, наиболее важными. Нужно отметить, что помимо регуляторных влияний на ритм и амплитуду сердечных сокращений [Удельнов, 1975], многие факты говорят о кардиопротекторном значении парасимпатической регуляции сердца. Например, сердце кошки после атропинизации, т.е. блокирования всех парасимпатических влияний, становится многократно более склонным к возникновению фибрилляции желудочков в результате экспериментальной окклюзии коронарной артерии, чем до атропинизации [Rosenshtraukh et al., 1994]. Нет сомнений в том, что раскрытие механизмов кардиопротекторного действия ацетилхолина (АЦХ) поможет в борьбе с заболеваниями сердца. Уже предложены способы применения защитных эффектов АЦХ в терапии хронических ишемических состояний [Castro et al, 2004; Zimerman et al, 2010]. Поэтому изучение тонких механизмов парасимпатической регуляции сердца является исключительно важной задачей для современной физиологии.

Реализация парасимпатических влияний в миокарде опосредуется метаботропными мускариновыми рецепторами, которые относятся к рецепторам, связанным с G-белками. Традиционно считалось, что единственным функционально значимым типом М-холинорецепторов в миокарде является М2. На это указывали в основном данные разнообразных физиологических и фармакологических исследований. Однако в конце прошлого столетия при помощи методов молекулярной биологии в сердце были обнаружены все 5 типов мускариновых рецепторов, описанных на данный момент в организме. При этом физиологическая роль этих типов М-рецепторов в миокарде до конца не ясна.

Среди прочих типов мускариновых рецепторов особенно выделяются МЗ-рецепторы, поскольку в последнее десятилетие было показано участие именно этого типа в реализации кардиопротекторных влияний. Защитное влияние мускариновых рецепторов 3-его типа показано в условиях ишемических повреждений сердечной ткани, при развитии патологической гипертрофии миокарда, а также при возникновении желудочковых аритмий различного генеза. Кроме того, как сами МЗ-рецепторы, так и основные звенья внутриклеточных каскадов, запускаемых при их активации, являются важными фармакологическими целями для лечения и коррекции заболеваний сердца. Поскольку, несмотря на

широкое применение мышей и крыс в лабораторной практике, в данном отношении эти объекты остаются практически не изучены, выяснение наличия, функциональной значимости, а также определение основных звеньев каскада внутриклеточной сигнализации МЗ-рецепторов в миокарде лабораторных грызунов являются важными задачами. Важно отметить, что в ряде исследований, проведенных на крысах in vivo, были получены свидетельства изменений физиологического ответа на стимуляцию мускариновых рецепторов в ходе постнатального развития [Зефиров и др., 2007, Зиятдинова и др., 2012], что может указывать на существенные вариации рецепторного механизма реализации холинергических влияний на миокард в ходе онтогенеза.

Целью данной работы было определить степень участия МЗ-рецепторов в опосредовании холинергической регуляции электрической активности миокарда млекопитающих (мыши и крысы) на различных стадиях онтогенеза.

В соответствии с целью поставлены следующие задачи:

1. Исследовать действие избирательной стимуляции МЗ-холинорецепторов на параметры электрической активности рабочего предсердного и желудочкового миокарда мыши и крысы, а также синоатриального узла (САУ) мыши.

2. Методом иммуногистохимического окрашивания проверить наличие и определить локализацию М2- и МЗ-холинорецепторов в различных отделах сердца мыши.

3. Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (РВ-ПЦР) сравнить уровень экспрессии генов МЗ- и М2-холинорецепторов в рабочем предсердном и желудочковом миокарде мыши и крысы, а также САУ мыши.

4. На примере предсердного миокарда крысы установить, с какими звеньями фосфоинозитидного каскада внутриклеточной сигнализации связаны наблюдаемые электрофизиологические эффекты активации МЗ-рецепторов.

5. С помощью метода пэтч-кламп проверить возможность участия кальциевого тока L-типа в опосредовании этих эффектов.

6. Сравнить действие избирательной стимуляции МЗ-холинорецепторов на параметры электрической активности рабочего предсердного и желудочкового миокарда новорожденных и трехнедельных крысят с эффектами, обнаруженными на взрослых крысах.

7. Сравнить уровень экспрессии генов МЗ- и М2-холинорецепторов в миокарде новорожденных, трехнедельных и взрослых крыс.

Научная новизна исследования. Впервые при помощи нескольких методик показано наличие и функциональная значимость мускариновых рецепторов третьего типа в рабочем предсердном и желудочковом миокарде мыши и крысы, а также в САУ мыши. Также в данной работе показаны возможные механизмы реализации эффектов избирательной стимуляции МЗ-рецепторов через фосфоинозитидный каскад внутриклеточной сигнализации и снижение амплитуды кальциевого тока L-типа.

В работе впервые показано изменение рецепторного механизма реализации холинергических влияний в сердце в ходе онтогенеза.

Научно-практическая значимость. Полученные данные заметно дополняют имеющиеся сведения относительно механизмов реализации холинергических эффектов в сердце основных лабораторных животных: мыши и крысы. Данные о функционировании МЗ-рецепторов в миокарде представляют важную практическую ценность. Так, например, протеинкиназа С, которая активируется через фосфоинозитидный каскад, запускаемый МЗ-рецепторами, на данный момент является перспективной мишенью для разработки новых лекарственных препаратов для терапии ишемической болезни сердца [Inagaki, Churchill, Mochly-Rosen, 2006], гипертрофии, сердечной недостаточности [Ferreira, Brum, Mochly-Rosen, 2011] и других болезней. То же можно сказать и в отношение самих рецепторов третьего типа, однако разработке этого направления на данный момент мешает отсутствие селективных агонистов МЗ-рецепторов с преимущественным действием на сердце.

Основные положения, выносимые на защиту

1. МЗ-рецепторы присутствуют во всех отделах сердца мыши и крысы. При их селективной активации в рабочем миокарде наблюдается уменьшение длительности потенциала действия, а в синоатриальном узле происходит замедление синусового ритма за счет торможения медленной диастолической деполяризации.

2. Эффекты активации МЗ-рецепторов в значительной степени реализуются через активацию фосфоинозитидного каскада внутриклеточной сигнализации и протенкиназы С, и в частности -через уменьшение кальциевого тока L-типа.

3. В ходе постнатального развития меняется уровень экспрессии МЗ-рецепторов. Их вклад в реализацию холинергических эффектов в миокарде новорожденных животных значительно выше, чем у взрослых.

Публикации. По материалам работы опубликовано 5 статей в журналах рекомендованных ВАК, в том числе 2 в высокорейтинговых международных журналах, и 5 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Апробация материалов диссертации. Результаты данной диссертационной работы были представлены на IX Всероссийской молодежной научной конференции Института физиологии Коми научного центра "Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике" в г. Сыктывкаре, на Международной Студенческой Медицинской Конференции (The Leiden International Medical Student Conference) в г. Лейдене, Нидерланды, а также на V Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения в г. Москва. Работа успешно прошла апробацию на заседаниях кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ.

Структура работы. Материалы диссертационной работы изложены на 168 страницах. Работа состоит из обзора литературы по выбранной теме, описания материалов и методов, использованных при выполнении данной работы, описания результатов и их обсуждения, а также заключения и выводов. Диссертационная работа проиллюстрирована 67 рисунками и 7 таблицами. Список использованной литературы включает 252 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты по изучению эффектов избирательной активации МЗ-рецепторов на миокард, внутриклеточного каскада сигнализации, опосредованного их активацией, и определению роли мускариновых рецепторов в онтогенезе проводились на крысах линии Вистар. Всего в работе было использовано 160 животных. Для экспериментов использовали взрослых крыс (электрофизиологические эксперименты - 94, молекулярно-биологические — 10, пэтч-кламп - 4), новорожденных (электрофизиологические эксперименты - 12, молекулярно-биологические — 14) и трехнедельных крысят (электрофизиологические эксперименты - 12, молекулярно-биологические - 14). Также для определения роли МЗ-рецепторов в опосредовании холинергических влияний в области синоатриального узла, и иммуногистохимических исследований межвенной области правого предсердия в качестве модельного объекта использовались белые беспородные мыши. Было использовано 117 самцов мышей (электрофизиологические эксперименты - 80, иммуногистохимия -22, молекулярно-биологические исследования - 15) весом 18 - 21 грамм.

Препаровка. Выделение сердца и дальнейшая препаровка на двух видах животных выполнялось сходным образом. Животных декапитировапи с помощью гильотины или ножниц, после чего немедленно вскрывали грудную клетку. Сердце выделяли и промывали от крови физраствором с помощью шприца, вставленного в аорту. Сердце помещали в препаровальную ванночку, заполненную физиологическим раствором Тироде. Затем выделяли препараты миокарда.

Для электрофизиологических экспериментов использовались препараты:

• изолированного правого предсердия мыши и крысы, работающего в собственном ритме

• правого ушка мыши и крысы (удалялась межвенная область), работающего в навязанном ритме.

• межвенной области мыши, содержащей САУ (удалялась область правого ушка для того, чтобы снять гиперполяризующее влияние рабочего миокарда на водитель ритма)

• изолированной стенки правого желудочка мыши и крысы.

Микроэлектродная техника регистрации внутриклеточного потенциала. Для регистрации потенциала действия (ПД) использовался классический метод внутриклеточных отведений электрической активности при помощи стеклянных микроэлектродов с сопротивлением 25-50 Мом. В ходе эксперимента по исследованию влияния избирательной активации МЗ-рецепторов сперва проводили аппликацию мускаринового агониста пилокарпина (10"5М). После отмыва апплицировался один или несколько селективных блокаторов М-рецепторов, затем регистрировали действие агониста на фоне блокаторов. При анализе полученных записей определяли длительность ПД на уровне 90% и 50% реполяризации (ДПД50 и ДПД90), в записях, полученных в опытах на САУ, определяли также частоту генерации ПД, скорость медленной диастолической деполяризации (МДД) и максимальную скорость нарастания переднего фронта ПД.

Иммуногистохимическое окрашивание. Окрашивание ткани миокарда проводили на препаратах изолированного правого предсердия и стенки правого желудочка мыши.

В нашей работе иммуногистохимические исследования проводилось в соответствии с протоколом, использованным ранее для исследования препаратов правого предсердия мыши [Liu et al., 2007]. Окрашенные ткани исследовали при помощи лазерного конфокального сканирующего микроскопа Zeiss LSM 510 МЕТА, оснащенного фотоэлектронным умножителем. Использовался

воздушный объектив 10х и маслоиммерсионный с 63х увеличением. Фотофафии делали при помощи камеры LSM 510 Meta, изображения обрабатывали в ImageJ 1.45 (NIH, USA). При обработке изображения флуоресценция вторичных антител, связанных с первичными к Сх43, отмечалась красным псевдоцветом, к М2- или МЗ-холинорецепторам -зеленым псевдоцветом.

При окрашивании были использованы первичные поликлональные антитела (IgGs) фирмы Santa Cruz Biotechnologies, USA в скобках указано разведение: anti-Cx43 - антитела к коннексину Сх43, выработанные в организме кролика против антигена мыши (1:200), anti-M2 - козьи антитела к М2-холинорецепторам мыши (1:100), anti-МЗ - козьи антитела к МЗ-холинорецепторам мыши (1:100).

Для обнаружения локализации первичных IgGs, производилась окраска вторичными IgGs связанными с флуоресцентной меткой (Invitrogen, USA). Для связывания с первичными антителами к коннексину Сх43 использовали антитела, выработанные в организме осла против антигена кролика, конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluro 647 (1:100). Для выявления первичных антител как к М2-, так и к МЗ-рецепторам, использовали ослиные антитела к козьим IgGs, конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluro 488 (1:100).

Полимеразная цепная реакция в реальном времени.

Молекулярно-биологические исследования проводили на препаратах межвенной области, стенке правого желудочка и САУ мыши, а также на образцах рабочего миокарда предсердий и желудочков новорожденных, трехнедельных и взрослых крыс.

Образцы миокарда, использовавшиеся для экспериментов, хранились в реагенте IntactRNA (Евроген, Россия) в морозильной камере при температуре -20°С вплоть до момента непосредственного выделения РНК. Экстракцию РНК проводили реагентом ExtractRNA (Евроген), очистку полученной тотальной РНК осуществляли при помощи фермента ДНКазы I (2 000 е.а./мл, NEB,USA), для проведения реакции обратной транскрипции применяли набор реагентов фирмы Евроген. Все манипуляции проводились в соответствии со стандартной методикой, по протоколам, рекомендованным производителем.

В качестве положительного контроля для РВ-ПЦР использовалась геномная ДНК, выделенная из препаратов печени при помощи набора GeneJet Genomic DNA purification Kit (Thermo Scientific, USA). Праймеры подбирали при помощи программы Primer Premier (Premier BIOSOFT, USA). В работе использовались праймеры к GAPDH (гл и церал ьдегидфосфат дегидрогеназе) и М2-,МЗ-

рецепторампроизводства компаний ДНК-синтез (Россия) и Евроген.

Собственно РВ-ПЦР проводили на приборе BioRad CFX96 с использованием набора реактивов компании Синтол (Россия) и красителя EvaGreen (BIOTIUM, USA). Результаты, полученные в ходе РВ-ПЦР, обрабатывались при помощи программного обеспечения, поставляемого вместе с амплификатором, и программы Microsoft Excel.

Метод пэтч-кламп. Для выделения предсердных и желудочковых кардиомиоцитов животному внутрибрюшинно вводили 100 мкл раствора гепарина (5000 ME/мл), через 20 мин проводили декапитацию и выделение сердца. Затем сердце канюлировали через аорту, канюлю подключали к аппарату для ретроградной перфузии по Лангендорфу. Перфузировали 5-7 мин бескальциевым раствором для выделения кардиомиоцитов, затем 15 мин для желудочковых клеток и 22 мин для предсердных клеток - раствором аналогичного состава с добавлением 12,5 мкМ СаС12 и 0,5 мг/мл коллагеназы II типа (Worthington Biochemicals, USA). После завершения перфузии отделяли желудочковый, либо предсердный миокард, измельчали с помощью ножниц, полученную массу пипетировали 10-15 раз. Суспензию пропускали через нейлоновый фильтр с диаметром пор 100 мкм, после чего центрифугировали (1 мин, 800 об/мин). Осадок ресуспендировали в растворе для выделения с добавлением 12,5 мкМ СаС12 и 10% бычьей сыворотки (FBS). Затем в течение 16 минут проводили кальциевую реинтродукцию - постепенное доведение концентрации кальция в растворе до 1 мМ. Суспензию клеток хранили при комнатной температуре в атмосфере карбогена.

Ионные токи регистрировались стандартным методом пэтч-кламп в конфигурации whole-cell при помощи усилителя Axopatch 200В (Molecular Devices, USA). Кардиомиоциты помещали в экспериментальную камеру (RC-26; Warner Instrument Corp, Brunswick, CT, USA; объемом 150 jil) с постоянным протоком физиологического раствора (состав в ммоль-л'1: 150 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 СаСЬ, 1,2 MgCl2, глюкоза 10, Hepes 10, с pH 7,6 выровненным добавлением NaOH) с температурой 37±0,5°С. Пэтч-пипетки изготовляли из боросиликатного стекла (Sutter Instruments, USA) с помощью горизонтального пуллера Р-1000 (Sutter Instruments, USA) и оплавляли кончики за счет однократного нагрева филамента того же пуллера в течение 2 с. Готовые пипетки заполняли раствором следующего состава (ммоль-л-1): 110 CsOH, 90 аспарагиновая кислота, 10 тетраэтиламмония хлорид, 10 EGT А, 5 MgATP, 5 натрий-фосфокреатин, 0,4 ГТФ-трис, 0,1 лейпептин и 10 Hepes с pH 7,4 выровненным добавлением CsOH. Сопротивление пипеток составляло в среднем 2,8±0,3 МО. Для регистрации кальциевого тока L-типа использовали два протокола изменения мембранного потенциала. Первый протокол: раз в 10 сек предеполяризация до -40 мВ в течение

100 мс, затем — деполяризация до +10 мВ в течение 250 мс, затем возврат к поддерживаемому потенциалу -80 мВ. Предеполяризация позволяла инактивировать каналы быстрого натриевого тока и кальциевого тока Т-типа, поэтому дальнейшая деполяризация приводила к развитию исключительно тока Ь-типа. Второй протокол представлял собой модификацию первого с тем отличием, что амплитуда деполяризации увеличивалась от -30 мВ на 10 мВ с каждым очередным повтором. Максимальное значение деполяризации составляло +40 мВ, после этого протокол останавливался. Первый протокол использовали для наблюдения за развитием эффекта тестируемых соединений, второй применяли для получения вольт-амперных кривых кальциевого тока в контроле и после развития эффекта вещества.

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка проводилась в программе 81а11зйса 6.0. Для оценки достоверности изменения исследуемых параметров под действием мускариновых агонистов по сравнению с величинами этих параметров в контроле, использовали непараметрический критерий Вилкоксона для связанных выборок (обозначение - *, р<0,05). Для оценки достоверности подавления эффектов мускариновых агонистов блокаторами, а также для определения достоверности различия эффектов у животных разных возрастов использовали критерий Манна-Уитни (обозначение - &, р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Доказательства наличия и функциональной активности МЗ-рецепторов в сердце

Эффекты избирательной активации МЗ-рецепторов в рабочем миокарде мыши и крысы

Избирательная активация МЗ-рецепторов достигалась аппликацией мускаринового агониста пилокарпина (10"5М) на фоне блокады М2-рецепторов метоктрамином (10"7М). Для того, чтобы дополнительно проверить, вызваны ли наблюдаемые эффекты именно избирательной активацией МЗ-холинорецепторов, были проведены эксперименты с одновременной аппликацией метоктрамина и антагониста МЗ-рецепторов 4-0АМР (10"8М).

В рабочем предсердном миокарде крысы пилокарпин вызывал выраженное уменьшение ДПД (рис.1). В условиях суммарной активации М2- и МЗ-рецепторов пилокарпином укорочение ПД составило 56,4±7,6% от контрольной длительности на уровне 50% реполяризации и 47,9±8,6% на уровне 90% реполяризации, п=5 (рис. 2). Пилокарпин, апплицированный на фоне метоктрамина, вызывал

достоверное уменьшение ДПД (рис. 2А), которое составило 14,4±2,4% от контрольной ДПД50 и 12,9±1,4% от ДПД90.

Рис.1. Изменение конфигурации ПД в предсердии крысы под действием пилокарпина (А), и на фоне действия метоктрамина (Б). Оригинальные записи из одного репрезентативного эксперимента.

Уменьшение ДПД50

Пилокарпин 10"5М

Уменьшение ДПД90

18 16 14 12

10 8 6 4 2 0 -2

Пилокарпин Ю- М Метоктрамин 10"7 М

Уменьшение Уменьшен ДПД50 ДПД90

| | Пилокарпин кг м

Метоктрамин 10" 4-ОАМР Ю"8 М

М

Рис. 2. Уменьшение ДПД в миокарде предсердий (А) и желудочков (Б) крысы под действием пилокарпина. Влияние блокады М2-рецепторов метоктрамином и одновременной блокады М2- и МЗ-рецепторов метоктрамином совместно с 4-БАМР на эффект пилокарпина.

В желудочковом миокарде крысы в среднем уменьшение ДПД под действием 10"5 М пилокарпина составило 11,3±2,9% от контрольного значения на уровне 50% и 13,3±3,5% на уровне 90% реполяризации (рис. 2Б). При избирательной активации МЗ-рецепторов наблюдалось достоверное уменьшение ДПД в среднем на 5,4±1,4% на уровне 50% и на 6,0±1,3% на уровне 90% реполяризации (рис. 2Б). Таким образом, избирательная стимуляция МЗ-рецепторов в желудочковом миокарде

приводит к укорочению ПД, однако в отличие от миокарда предсердий этот эффект выражен слабее.

В рабочем миокарде мыши под действием избирательной стимуляции МЗ-рецепторов развивались сходные эффекты (рис. 3). В предсердиях при использовании метоктрамина действие пилокарпина на длительность ПД на уровне 50% и 90% реполяризации составляет соответственно 14,1+/-3,63% и 25,3+/-3,84% (п=10), а при одновременном использовании метоктрамина и 4-БАМР уменьшение ДПД50 и ДПД90 полностью подавляется (п=7).

Рис.3 Изменение конфигурации ПД в предсердии мыши под действием пилокарпина (А), и на фоне действия метоктрамина (Б). Оригинальные записи из одного репрезентативного эксперимента.

Аналогичные эффекты наблюдались и в желудочковом миокарде. Таким образом, нами показано, что избирательная стимуляция МЗ-рецепторов в рабочем предсердном и желудочковом миокарде мыши и крысы вызывает достоверное уменьшение длительности ПД. При этом видно, что выбранная нами схема избирательной стимуляции МЗ-рецепторов позволяет получать репрезентативные данные, все эффекты, наблюдаемые при совместной аппликации пилокарпина и метокрамина, практически полностью снимаются применением селективного агониста МЗ-рецепторов 4-ОАМР. Возможные механизмы наблюдаемых эффектов будут рассмотрены ниже.

Эффекты избирательной активации МЗ-рецепторов в узловом миокарде мыши

Для исследования влияний избирательной стимуляции МЗ-рецепторов на параметры ПД пейсмекерных клеток в качестве объекта нами была выбрана мышь, поскольку помимо доступности узловая ткань мыши по некоторым своим характеристикам ближе к ткани САУ человека, чем, например, классический объект подобных исследований - САУ кролика.

1«!

^ -100

40 60 ЕО 100

Метоктрамин 10"7М \/ Пилокарпин 10-5М + \/метоктрамин 10"7М

Время, мс

В нормальных условиях пилокарпин вызывал в САУ мыши типичные холинергические эффекты: замедление ритма,

сопровождающееся уменьшением крутизны МДД (рис. 4, 5). В контроле частота следования ПД составляла 450 - 500 ударов в минуту, тогда как при действии пилокарпина 10 мкМ она падала до 350 - 400 ударов. Замедление ритма происходило в основном за счет уменьшения крутизны МДД (на 37+/-9,8% от нормы) и, кроме того, сопровождалось увеличением скорости нарастания переднего фронта ПД (на 18,4+/-7,3% от нормы). При блокаде М2-рецепторов метоктрамином, позволяющей достичь избирательной активации МЗ-холинорецепторов, все эффекты пилокарпина были выражены значительно слабее, однако даже в этом случае все они были достоверны. Снижение частоты следования ПД происходило всего лишь на 7,3+/-1,5%, скорость МДД уменьшалась на 16,1+/-2,7%, а скорость нарастания переднего фронта ПД увеличивалась на 7,4+/-2,4%.

Рис. 4. Изменение конфигурации ПД в САУ мыши под действием пилокарпина (А), и на фоне действия метоктрамина (Б). Оригинальные записи из одного репрезентативного эксперимента.

-е-

-е-

¡T)

40

30

20 -

10

0

Снижение частоты Замедление МДД

-10

Пилокарпин 10° М

Пилокарпин 10° М Метоктрамин I О"7 М

Увеличение скорости фронта ПД

I i Пилокарпин 10° М '——' Метоктрамин 107 М 4-DAMP 10"s М

Рис. 5. Эффекты избирательной стимуляции МЗ-холинорецепторов в САУ мыши пилокарпином: уменьшение частоты, замедление МДД и увеличение скорости нарастания переднего фронта ПД в норме, и на фоне селективной блокады М2-рецепторов метоктрамином.

Таким образом, полученные нами в электрофизиологических экспериментах результаты позволяют предположить, что МЗ-холинорецепторы могут участвовать в опосредовании типичных холинергических эффектов в пейсмекере сердца мыши. Эти эффекты следующие: замедление ритма САУ, уменьшение крутизны МДД и увеличение скорости нарастания фронта ПД в САУ. Замедление ритма при стимуляции МЗ-рецепторов может быть связано с изменениями работы механизма «кальциевых часов». Путем активации фосфоинозитидного каскада внутриклеточной сигнализации стимуляция МЗ-рецепторов приводит к выходу Са2+ из саркоплазматического ретикулюма через инозитолтрифосфатные рецепторы. Следовательно, уровень кальция в цистернах ретикулюма снижается, а значит и увеличивается время, необходимое для их наполнения до порогового уровня, при котором возникает локальный выброс кальция (JIBK). С другой стороны, активация 1КМЗ может приводить к небольшой гиперполяризации мембраны клеток САУ, которую мы не смогли обнаружить вследствие несовершенства методики. Гиперполяризация с одной стороны способствует замедлению ритма за счет увеличения МДД, с другой стороны делает возможным выход из инактивированного состояния и последующую потенциалзависимую активацию каналов быстрого натриевого тока нейронального типа, присутствующих в клетках центральной части САУ мыши [Maier et al., 2003]. Последнее обстоятельство приводит к увеличению крутизны переднего фронта ПД, наблюдаемому при стимуляции МЗ-рецепторов.

Иммуногиспюхимическое исследование миокарда различных отделов сердца мыши на наличие peifenmopHbix белков М2- и МЗ-

рецепторов

Электрофизиологическими методами мы показали, что МЗ-рецепторы содержаться во всех структурах сердца грызунов. Однако данный подход позволяют лишь косвенно оценить уровень экспрессии рецепторных белков мускариновых рецепторов различных отделах сердца, поскольку разница в уровне выраженности физиологических эффектов также может быть связана с различной интенсивностью работы внутриклеточных каскадов, задействованных в их реализации. Поэтому логичным следующим шагом в нашем исследовании стало использование метода иммуногистохимического окрашивания на наличие М2- и МЗ-холинорецепторов в рабочем предсердном и желудочковом миокарде, а также в области синоатриального узла мыши. В ходе работы использовалось двойное окрашивание препаратов — окраска на соответствующий тип мускариновых рецепторов, и на коннексин 43 (Сх43). Окраска на Сх43, использовалась для определения центральной части САУ, как области, лишенной этого коннексина [Liu et al., 2007].

Наши исследования показали, что как М2- так и МЗ-рецепторы обнаруживаются во всех отделах сердца мыши (данные не приведены). При этом стоит отметить, что в области САУ плотность мускариновых рецепторов в среднем в 2 раза выше, чем в окружающем рабочем миокарде.

На рисунке 6 приведены оригинальные фотографии межвенной области правого предсердия мыши окрашенного на МЗ-рецепторы и Сх43. На представленной фотографии, сделанной при десятикратном увеличении хорошо видна граница между САУ и рабочим миокардом (рис.6,Б), отсутствие окраски на Сх43 в этой области говорит о местоположении центральной части САУ на данном препарате. При этом отчетливо видно, что в центральной области САУ интенсивность зеленой окраски существенно выше, чем в окружающем рабочем миокарде (рис.6,А). По-видимому, плотность рецепторов постепенно снижается в направлении от центра синусного узла к рабочему миокарду. При большем увеличении заметны пучки волокон, экспрессирующих Сх43, которые вдаются и проникают в ткань САУ, клетки которого не прокрашиваются anti-Cx43 (рис.бВ). На границе САУ и рабочего миокарда возникает переходная область, где содержатся клетки обоих типов.

Рис. 6. Иммуногистохимическое окрашивание участка межвенной области правого предсердия на МЗ-рецепторы (А) и Сх43 (Б) -объектив 10х. Виден переход от ткани САУ к рабочему предсердному миокарду. 1 - область САУ, 2 - переходная область, 3 - рабочий миокард.

Измерение уровня экспрессии генов мускариновых рецепторов второго и третьего типа методом РВ-ПЦР в различных отделах сердца крысы и мыши

Поскольку в данном случае при иммуногистохимических исследованиях перед нами встает проблема кросс-реактивности антител из-за высокой гомологии всех подтипов мускариновых рецепторов ^об^сИ е! а1., 2009], результаты иммуногистохимического окрашивания не дают надежных представлений о соотношении количества М2- и МЗ-рецепторов в разных отделах сердца. Поэтому следующим этапом нашей работы стало применение метода РВ-ПЦР, который является значительно более точным.

Так, нами в ходе молекулярно-биологических исследований показано, что продукты генов обоих исследуемых типов мускариновых рецепторов присутствуют во всех отделах сердца крысы и мыши. У обоих видов животных уровень экспрессии генов мускариновых рецепторов в суправентрикулярном миокарде оказался значительно выше, чем в желудочковом. Так у крысы для М2-рецепторов отношение уровня транскрипции в предсердиях (п=6) к уровню в желудочках (п=6) составило 11,47, в то время как для МЗ-рецепторов это отношение составило 5,7. При этом, в сердце мыши наблюдались не столь разительные различия между предсердным (п=6) и желудочковым (п=6) миокардом и отношение для М2-рецепоторов было 2,8, а для МЗ - 4,6.

Также стоит отметить, что относительное количество МЗ-рецепторов в предсердиях и желудочках крысы значительно ниже, чем у мыши (рис. 7). Так, в предсердии крысы МЗ-рецепторы

составили только 0,15% от общей популяции мускариновых рецепторов, в то время как у мыши это значение составило 8,09 %, для желудочков это соотношение было: у крысы 0,42, у мыши 5,09. Наибольший вклад МЗ-рецепторы вносят в работу синоатриального узла (п=6), поскольку их количество в этой области составляет почти 15%. Поскольку электрофизиологические эффекты стимуляции МЗ-рецепторов были сходны по величине у этих видов, остается предположить, что отношение между М2- и МЗ-рецепторам и существенно изменяется у крысы, либо у мыши на посттранскрипционном уровне.

а а о а. о н с

0 я

V

о.

1

т

а

И

а.

2

5? 0,45

а 0,4

£0,35

н с 0,3

я U Q, 0,25

1 (N 0,2

^

« 0,15

X Си 0,1

S 0,05

0 +-

Предсердие Желудочек

САУ Предсердие Желудочек

Рис. 7. Отношение количества мРНК генов МЗ-рецепторов к количеству мРНК М2-рецепторов в различных отделах сердца крысы (А) и мыши (Б).

Таким образом, мы при помощи нескольких методик представили убедительные доказательства в пользу существования и функциональной активности мускариновых рецепторов третьего типа в сердце крысы и мыши.

Механизмы, опосредующие эффекты избирательной стимуляции

МЗ-рецепторов

На следующем этапе работ мы попытались выяснить молекулярные механизмы наблюдаемых эффектов МЗ-стимуляции при помощи внутриклеточной регистрации электрической активности, а так же методом пэтч-кламп в конфигурации whole-cell.

Исследование роли фосфолипазы С в опосредовании эффектов избирательной активации МЗ-рецепторов

Описанные выше эффекты, возникающие при селективной активации МЗ-рецепторов, в частности, ускорение реполяризации можно объяснить активацией особого калиевого тока 1кмз> описанного китайскими коллегами, однако, мы решили проверить возможную роль фосфоинозитидного каскада внутриклеточной сигнализации, запускаемого а-субъединицей Gq-белка.

Ингибитор фосфолипазы С (PLC) U-73122 достоверно снижал выраженность укорочения ПД на уровне 50% реполяризации при избирательной активации МЗ-рецепторов на 60,4%. На уровне 90% реполяризации это снижение также было достоверным и составило 63,5%, то есть эффект стимуляции МЗ-рецепторов при блокировании PLC уменьшался более чем в 2 раза (рис. 8А). Ингибитор PLC неомицин вызывал также уменьшение выраженности эффектов избирательной стимуляции МЗ-рецепторов (рис. 8А). Таким образом, мы показали, что в значительной степени эффект уменьшения ДПД при избирательной активации МЗ-рецепторов обусловлен активацией фосфоинозитидного каскада.

В дальнейшем мы задались целью определить, какая именно часть каскада фосфолипазы С опосредует изменение конфигурации ПД при активации МЗ-рецепторов. Это мог быть как 1Р3, который действует через специфические рецепторы на саркоплазматическом ретикулюме, так и протеинкиназа С (РКС), активируемая DAG. При применении блокатора 1Р3-рецепторов 2-АРВ достоверных изменений эффекта избирательной стимуляции МЗ-рецепторов обнаружено не было (данные не приведены). При аппликации пилокарпина на фоне метоктрамина и блокатора РКС хелеретрина (2х10"6М) укорочение ПД относительно контрольного значения (на фоне метоктрамина и хелеретрина) составило 2,1±1,5% на уровне 50% реполяризации и 3,5±1,2% на уровне 90% реполяризации (рис. 8Б). Отличия от эффекта активации МЗ-рецепторов в отсутствие блокирования РКС достоверны, поэтому можно предположить, что именно РКС участвует в реализации описанных нами эффектов избирательной стимуляции МЗ-рецепторов.

Уменьшение Уменьшение Уменьшение Уменьшение

ДПД50 ДПД90 ДПД50 ДПД90

ВИИ Пилокарпин 10'5М Г-И Пилокарпин 10'5М I | Пилокарпин IО'М I 1 Пилокарпин 10'5М

^^Метоктрамин 10'7М ™™ Метоктрамин 10'7М I-' Метоктрамин 10'7М '-' Мстоктрамин Ю'7М

U-73I22 1(Г6М Неомицин 5х10_4М Хелеретрин 10"8М

Рис.8. Уменьшение ДПД в рабочем миокарде правого предсердия крысы при избирательной активации МЗ-рецепторов пилокарпином в присутствии метоктрамина. Влияние блокаторов фосфолипазы С U-73122 (п=6) и неомицина (п=5) на выраженность эффекта (А). Влияние ингибитора РКС хелеретрина на выраженность эффекта (п=6) (Б).

Действие стимуляции МЗ-холинорецепторов на кальциевый ток в предсердных и желудочковых рабочих кардиомиоцитах крысы

Среди известных путей действия РКС в миокарде фосфорилирование кальциевых каналов L-типа может вести к ослаблению тока ICaL [McHugh et al., 2000; Zhang et al., 1997], который обеспечивает фазу плато ПД в рабочем миокарде желудочков и, в меньшей степени, - предсердий. Можно предположить, что это - один из возможных механизмов описанного нами уменьшения длительности ПД в предсердиях при избирательной стимуляции МЗ-рецепторов. Для подтверждения этого была проведена серия экспериментов с регистрацией IcaL в изолированных желудочковых и предсердных миоцитах крысы методом пэтч-кламп в конфигурации whole-cell.

В предсердных кардиомиоцитах крысы наблюдались значительные эффекты МЗ-стимуляции. Пилокарпин (10"5М) вызывал существенное снижение амплитуды 1саь» регистрируемого при всех тестовых потенциалах (от -30 до +40 мВ, шаг 10 мВ) (рис. 9А). Амплитуда ICaL на +10 мВ снизилась в среднем на 20,1+1,8% от контрольной. Как и в нормальных условиях, аппликация пилокарпина (Ю'^М) приводила к достоверному, хотя и менее выраженному в отсутствие метоктрамина, снижению амплитуды ICaL (рис. 9,10). Оно составило в среднем

12,5±1,57% от контрольной амплитуды тока. В третьей серии экспериментов пилокарпин апплицировали на фоне 10"7М метоктрамина и 10"8М 4-ОАМР. В этих условиях снижение амплитуды 1саь не было статистически значимо (рис. 10).

-40 МВ +10 мВ

Врем»,

1ПП ш ^....... %

/

,/Г 1

Пилокарпин 10"5М

Щ контроль

А г

Метоктрамин 10"7М

+ Пилокарпин 105М Метоктрамин 10"7М

Рис. 9. Влияние мускаринового агониста пилокарпина (А) и избирательной стимуляции МЗ-холинорецепторов на кальциевый ток Ь-типа в предсердных миоцитах крысы (Б). Примеры репрезентативного эксперимента.

25 и

- 20 -

£ Я

о 5

м 2

о а.

а ¡-

= я

15

3

л =

о £

10

О -и

Пилокарпин 10"5 М

Пилокарпин 10" М Метоктрамин 10"7 М

Пилокарпин 10" М Метоктрамин 10"7 М 4-ОАМР 10"8 М

Рис. 10. Уменьшение кальциевого тока Ь-типа в предсердных миоцитах крысы, измеренного при деполяризации до +10 мВ, под действием пилокарпина в нормальных условиях, на фоне блокирования М2-рецепторов, а также совместного блокирования М2-и МЗ-рецепторов. Относительная величина уменьшения 1СаЬ выражена в % от амплитуды 1Саь ДО аппликации пилокарпина (п=9).

В отличие от предсердных кардиомиоцитов, в желудочковых никакого достоверного воздействия пилокарпина на 1Саь обнаружено не было. Аппликация 10"5М пилокарпина на фоне М2-блокатора метоктрамина также не приводила к значимым изменениям 1сл (данные не приведены).

Таким образом, описанное нами воздействие МЗ-стимуляции на конфигурацию электрической активности можно объяснить активацией РКС посредством фосфоинозитидного пути сигнализации и последующим подавлением кальциевого тока, однако это справедливо лишь в отношении предсердного миокарда.

Особенности развития холинергической системы в онтогенезе

Несмотря на обнаружение электрофизиологических эффектов стимуляции МЗ-рецепторов нас не могла не смущать их слабая выраженность по сравнению с общими эффектами мускариновых агонистов. Данный факт указывал на сравнительно минорную роль МЗ-рецепторов в регуляции активности миокарда. Однако в литературе имеются данные, позволяющие предполагать, что на ранних этапах онтогенеза их физиологическая роль гораздо более значима [Зиятдинова et al., 2012]. Нами были проведены эксперименты на предсердном и желудочковом миокарде новорожденных и трехнедельных крысят, поскольку согласно литературным данным доразвитие холинергической системы грызунов происходит в течении первых трех недель жизни [Marvin et al., 1980; Horackova, Slavikova, Byczko, 2000; Fregoso, Hoover, 2012].

Исследование влияния избирательной стимуляции МЗ-рецепторов на параметры электрической активности различных отделов сердца новорожденных и трехнедельных крысят

В предсердном миокарде избирательная стимуляция МЗ-рецепторов вызывает характерные изменения ПД. Наиболее выраженное действие пилокарпин на длительности ПД оказывает в предсердном миокарде взрослых животных. У новорожденных (п=7) и трехнедельных (п=7) крысят эти эффекты выражены слабее в 2,5 и 1,7 раза соответственно (рис. 11А). При сравнении эффектов избирательной стимуляции МЗ-рецепторов в предсердном миокарде становится видно, что эффекты пилокарпина на фоне метоктрамина у новорожденных и трехнедельных крысят также выражены слабее, чем у взрослых животных. Кроме того, у 21-дневных животных эти изменения не являются достоверными.

Однако в желудочках ситуация кардинальным образом отличается от того, что мы наблюдали в предсердиях (рис. 11 Б). Эффекты пилокарпина в желудочковом миокарде новорожденных (п=7) оказались выражены почти в 2 раза сильнее, чем у взрослых животных. При этом у трехнедельных крысят (п=7) уменьшение ДПД происходит на уровне взрослых особей. При избирательной стимуляции МЗ-рецепторов у новорожденных особей эффект пилокарпина превосходит эффекты у взрослых животных почти в 3

раза, в то время как у трехнедельных крысят уменьшения ДПД не наблюдается на уровне как 50%, так и 90% реполяризации.

А 65

о с.

г-

-е--ел

с.

н

а

■е-

■е-

] Новорожде 21-дневные Взрослые Новорожде -21 дневные Взрослые Ч^ нные___уч^ нные___у

"V-

Уменьшение ДПД50

п & р

"V-

Уменьшение ДПД90

Новорожде 21-дневные Взрослые Новорожде 21-дневные Взрослые ""ые___/Ч. иные_ _>

Уменьшение ДПД50

Пилокарпин 10"5М

Пилокарпин 10°М Метоктрамин 10"7 М

Уменьшение ДПД90

Пилокарпин Ю М Метоктрамин I О"7 М

п ,, „ ,, _ 4-ОАМР10"8М

Рис. 11. Сравнение эффектов избирательной стимуляции МЗ-рецепторов в предсердном (А) и желудочковом (Б) миокарде новорожденной, трехнедельной и взрослой крысы, работающем в собственном ритме. Происходит уменьшение длительности ПД на уровне 50% и 90% реполяризации.

Таким образом, наши результаты электрофизиологических экспериментов показывают, что в миокарде новорожденных крысят МЗ-рецепторы играют важную роль в опосредовании холинергических эффектов холиномиметиков в желудочковом миокарде.

Измерение уровня транскрипции генов М2- и МЗ-рецепторов в миокарде крысы на разных стадиях постнаталъного развития

В миокарде новорожденных и трехнедельных крысят синтезируется мРНК как М2-, так и МЗ-рецепторов. При этом относительное количество мРНК МЗ-рецепторов в миокарде новорожденных оказалось в несколько раз выше, чем у трехнедельных и взрослых крыс (рис. 13).

а Ы ч=

£ О- а

в 2 I

Ё о с

3 а « " ° я я- ь « в = о,

4 Ц

О я

« ё.

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

0 -И

Предсердия Желудочки

I | Новорожденные Трехнедельные | | Взрослые крысы

крысы крысы

Рис. 13. Отношение количества мРНК генов МЗ-рецепторов к количеству мРНК М2-рецепторов в предсердиях и желудочках новорожденных (п=6), трехнедельных (п=6) и взрослых крыс (п=6).

Если судить по данным РВ-ПЦР, то МЗ-рецепторы составляют около 0,7% от количества М2-рецепторов в сердце новорожденного крысенка. Это хорошо коррелирует с результатами, полученными в ходе электрофизиологических экспериментов, где было показано, что миокард новорожденных крыс значительно более чувствителен к селективной активации МЗ-рецепторов по сравнению со взрослыми и трехнедельными животными. С другой стороны. МЗ-рецепторы в предсердиях трехнедельных животных составляют лишь 0,23% относительно количества М2-рецепторов, что также подтверждают электрофизиологические данные. Как было показано нами, эффекты селективной активации МЗ-рецепторов в миокарде трехнедельных крысят практически отсутствуют. В отличие от молодых крыс, у

которых вклад МЗ-рецепторов в работу предсердий и желудочков оказался примерно на одном уровне, у взрослых крыс относительный уровень МЗ-рецепторов в желудочках более чем в 2 раза выше, чем в суправентрикулярном миокарде. Однако стоит отметить, что по всей видимости уровни трансляции рецепторных белков в миокарде трехнедельных и взрослых крыс несколько отличаются, поскольку несмотря на достаточную экспрессию генов МЗ-рецепторов у трехнедельных крыс физиологический эффект их активации нам обнаружить не удалось. В то же время, у взрослых животных эффекты избирательной стимуляции МЗ-рецепторов были выражены в достаточной степени.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, в нашей работе было показано наличие и функциональная значимость в сердце лабораторных грызунов мускариновых рецепторов третьего типа. Кроме того, показана их особая роль в регуляции сердечной деятельности в ходе онтогенеза.

Нами при помощи методик РВ-ПЦР и иммуногистохимического окрашивания было показано, что М2- и МЗ-рецепторы присутствуют во всех отделах сердца мыши и крысы. В частности, впервые показано наличие МЗ-рецепторов в области синоатриального узла. Также при помощи внутриклеточной микроэлектродной регистрации ПД нами была подтверждена физиологическая значимость третьего типа мускариновых рецепторов в сердце. Так, при избирательной стимуляции МЗ-рецепторов в рабочем миокарде происходит уменьшение длительности ПД, а в синоатриальном узле это приводит к небольшому замедлению ритма за счет торможения медленной диастолической деполяризации пейсмекерных клеток.

При исследовании внутриклеточных механизмов, которые могут обуславливать наблюдаемые эффекты избирательной стимуляции МЗ-рецепторов в сердце, нами было показано, что помимо активации ранее описанного тока 1кмз [Shi, Wang, Wang, 1999а; Shi et al., 1999; Shi, Wang, Wang, 1999b; Wang et al., 1999; Shi et al., 2004a; Shi et al., 2004b], укорочение деполяризации в значительной степени может быть вызвано активацией протеинкиназы С посредством фосфоинозитидного пути внутриклеточной сигнализации. Также описанное нами воздействие МЗ-стимуляции на конфигурацию электрической активности в предсердном миокарде можно объяснить подавлением кальциевого тока L-типа.

В экспериментах на миокарде новорожденных, трехнедельных и взрослых крыс мы показали особую роль МЗ-рецепторов в работе желудочкового миокарда новорожденных животных, что возможно связано с ранее описанной кардиопротекторной функцией МЗ-

рецепторов [Liu et al., 2004a; Liu et al., 2004b]. Также нами было показано, что относительное количество МЗ-рецепторов в ходе онтогенеза уменьшается и их вклад в работу сердца снижается.

Таким образом, данная работа существенно дополняет представления о механизмах холинергической регуляции сердца лабораторных грызунов. Участие мускариновых рецепторов третьего типа в опосредовании парасимпатических влияний необходимо принимать во внимание в последующих исследованиях механизмов функционирования и регуляции миокарда этих животных, а также при использовании патофизиологических моделей с участием крыс и мышей.

ВЫВОДЫ

¡.Стимуляция МЗ-холинорецепторов приводит к уменьшению длительности ПД в предсердном и желудочковом рабочем миокарде крысы и мыши, а также к замедлению автоматической активности в синоатриальном узле мыши.

2. Во всех этих типах миокарда обнаруживается мРНК как М2-, так и МЗ-холинорецепторов.

3. М2- и МЗ-рецепторы обнаруживаются с помощью окраски мечеными антителами в рабочем и пейсмекерном миокарде мыши.

4. Описанное действие МЗ-стимуляции на электрическую активность в значительной степени опосредуется фосфоинозитидным сигнальным каскадом и протеинкиназой С, и по крайней мере частично связано с уменьшением кальциевого тока L-типа.

5. Эффекты стимуляции МЗ-рецепторов в желудочковом миокарде новорожденных крысят выражены значительно сильнее, чем у взрослых крыс и, в особенности, трехнедельных животных. Это различие обусловлено более выраженной экспрессией гена МЗ-рецепторов в миокарде новорожденных крысят.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЦХ - ацетилхолин, М-рецепторы - мускариновые рецепторы, САУ — синоатриальный узел, РВ-ПЦР - полимеразная цепная реакция в реальном времени, ПД — потенциал действия, ДПД50 и ДПД90 -длительность потенциала действия на уровне 50% и 90% реполяризации, МДД — медленная диастолическая деполяризация, ЛВК — локальный выброс кальция, 1Кмз — калиевый ток, активируемый МЗ-рецепторами, Сх43 - коннексин 43, PLC - фосфолипаза С, РКС -протеинкиназа С, 1Саь- кальциевый ток L-типа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тапилина СВ, Абрамочкин ДВ, Сухова ГС, Розенштраух ЛВ. Холинэргическая невозбудимость в синоатриальном узле мыши. // Доклады Академии Наук - 2010 - Т. 435 - № 5 - С. 703-707

2. Abramochkin DV, Tapilina SV, Sukhova GS, Nikolsky EE, Nurullin LF.

Functional M3 cholinoreceptors are present in pacemaker and working myocardium of murine heart. // Pflugers Archive - 2012 - V.463 - № 4 -P. 523-529

3. Абрамочкин Д.В., Тапилина C.B., Сухова Г.С. Действие избирательной стимуляции МЗ-холинорецепторов на параметры электрической и сократительной активности желудочкового миокарда крысы. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2013

- Т. 154- №9- С. 268-272

4. Abramochkin DV, Tapilina SV, Vornanen M. A new potassium ion current induced by stimulation of M2 cholinoreceptors in fish atrial myocytes. // The Journal of experimental biology - 2014 - V. 217 - № Pt 10-P. 1745-1751.

5. Тапилина C.B., Абрамочкин Д.В.

Различия в чувствительности миокарда новорожденных и взрослых крыс к избирательной стимуляции МЗ-холинорецепторов. // Доклады Академии Наук - 2015 - Т. 159 - №1 - С.11-14

6. Тапилина С.В., Абрамочкин Д.В. Выяснение роли МЗ-холинорецепторов в опосредовании холинэргических эффектов в суправентрикулярном миокарде мыши. // Материалы конференции «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» - г. Сыктывкар 14-16 апреля 2010 - С. 168-170.

7. Tapilina Svetlana. Effects of M3-cholinoreceptors selective activation on murine supraventricular myocardium. // Abstracts on The Leiden International Medical Student Conference (LIMSC) - Leiden, Netherlands, March 16th-20th 2011 - P. 131.

8. Тапилина C.B., Абрамочкин Д.В., Сухова Г.С. «МЗ холинорецепторы - новый посредник в действии ацетилхолина на миокард» // Материалы V Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии кровообращения - г. Москва 31января-3 февраля 2012 г.

9. Абрамочкин Д.В., Тапилина С.В., Ворнанен М. Карбахолин усиливает выходящий ток натрий-кальциевого обменника в рабочих предсердных кардиомиоцитах рыб // Материалы XI всероссийской с международным участием научной школы-конференции "Механизмы адаптации растущего организма к физической и умственной нагрузке"

- г. Казань 22-24 июня 2012 г. - С. 4-5.

10. Abramochkin DV, Tapilina SV, Vornanen M. Stimulation of M2-cholinoreceptors increases the outward current of sodium-calcium exchanger in fish atrial myocytes // Abstracts on IUPS2013 21-23 July 2013 Birmingham, United Kingdom - P. 242-242

Заказ № 59-Р/01/2015 Подписано в печать 20.01.15 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,2

ООО "Цифровичок", Москва, Большой Чудов пер., д.5 ¿Я^ тел. (495)649-83-30

\ С^у) www. cfr. ru; e-mail: zakpark@cfr. ru