Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие высокой температуры и нематоцидов на организмы почвенных нематод Caenorhabditis Elegans и Caenorhabditis Briggsae

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Действие высокой температуры и нематоцидов на организмы почвенных нематод Caenorhabditis Elegans и Caenorhabditis Briggsae"

На правах рукописи

лШ/

КОЛСАНОВА РУФИНА РИФКАТОВНА

ДЕЙСТВИЕ ВЫСОКОЙ ТЕМПЕРАТУРЫИ НЕМАТОЦИДОВ НА ОРГАНИЗМЫ ПОЧВЕННЫХ НЕМАТОД С А Е1УОЯНА ВйГт ЕЬЕвА№ И С А ЕЫОЯНА ВШТК ВМСвЯАЕ

Специальность 03.02.08-Экология (биологические науки)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород - 2014

005559159

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной экологии обособленного подразделения Государственного научного бюджетного учреждения «Академия наук Республики Татарстан» - «Институт проблем экологии и недропользования» (ИПЭН АН РТ)

Научный руководитель

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной экологии ИПЭН АН РТ Калинникова Татьяна Борисовна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор кафедры прикладной экологии Института экологии и природопользования Казанского Федерального Университета Степанова Надежда Юльевна

доктор биологических наук, доцент кафедры физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского Дерюгина Анна Вячеславовна

Ведущая организация

Институт биологии внутренних вод РАН (п. Борок, Ярославская обл.)

Защита диссертации состоится «24» декабря 2014 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.12 при Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского (ННГУ) по адресу: 603950, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, д. 23, корп. 1, биологический факультет.

E-mail: dis212.166.12@gmail.com

факс: (831)462-30-85

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ННГУ по адресу: diss.unn.ru/425, с авторефератом - в сети Интернет на сайте ВАК России по адресу: http://vak2.ed.gov.ru/catalogue.

Автореферат разослан «

А

ноября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.С. Снегирева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Необходимость исследования экологии нематод в первую очередь определяется широким распространением паразитических нематод (около 30 тыс. видов) в организмах человека, животных и растений и, как следствие, огромным ущербом, который наносят эти нематоды животноводству, растениеводству и лесному хозяйству (Стройков, 2005; Вышковский, 2010).

Опасность паразитических нематод усугубляется современным глобальным изменением климата Земли, которое сдвигает температурные ниши этих животных в природе и может ускорять их генетическую адаптацию к антигельминтным средствам (Имашева, 1999; Mori, 1999; Kaplan, 2004; Калиникова и др., 2006).

В настоящее время во многом остаются открытыми вопросы как о причинах нарушения функций организмов нематод, таких как поведение, размножение и выживаемость, превышением физиологического оптимума температуры, происходящего как при изменении сезона, так и при изменении климата, так и о механизмах адаптации к этому превышению. Также неизвестно, какое влияние оказывает превышение физиологического оптимума температуры на толерантность организмов нематод, как паразитических, так и свободноживущих к действию антигельминтных средств и инсектицидов, используемых в сельском хозяйстве.

Свободноживущие почвенные нематоды Caenorhabditis elegans (Maupas, 1900) и Caenorhabditis briggsae (Briggs, 1946), являющиеся объектами исследования в молекулярной биологии и генетике (Brenner, 1974; Robertson, 2004), могут быть удобными модельными организмами для изучения механизмов толерантности организмов беспозвоночных как к умеренному, так и экстремальному превышению физиологического оптимума температуры окружающей среды. В экспериментах с этими нематодами может быть исследовано и возможное влияние превышения физиологического оптимума температуры на толерантность организмов нематод, как свободноживущих, так и паразитических к таким антигельминтным средствам как агонисты никотиновых рецепторов ацетилхолина, широко используемые в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве (Lewis, 1980; Sleigh, 2010).

Целью диссертационной работы явилось исследование механизмов толерантности организмов почвенных нематод С. elegans и С. briggsae к высокой температуре среды и нематоцидам - агонистам никотиновых рецепторов ацетилхолина.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Выяснить возможную роль холинергической системы в такой адаптивной форме поведения С. elegans как избегание неблагоприятной, но переносимой организмом высокой температуры окружающей среды;

2. Провести сравнительный анализ действия нематоцидов - агонистов никотиновых рецепторов ацетилхолина на поведение нематод двух близкородственных видов - С. elegans и С. briggsae;

3. Изучить зависимость толерантности организма С. elegans к нематоцидам -агонистам никотиновых рецепторов ацетилхолина от умеренного и экстремального повышения температуры окружающей среды;

4. Изучить влияние экстремальной высокой температуры на холинергическую

систему С. elegans для проверки предположения о том, что эта система является мишенью тепловых нарушений функций организмов нематод; 5. С использованием фармакологического и мутантного анализа исследовать возможную роль холинергической, серотонинергической и дофаминергической систем в толерантности поведения С. elegans к высокой температуре окружающей среды.

Научная новизна работы.

• В экспериментах с почвенными нематодами С. elegans и С. briggsae впервые показано, что кратковременное повышение температуры в диапазоне от +28°С до +33°С, вызывает активацию холинергических синапсов, принимающих участие в локомоции нематод, увеличением чувствительности никотиновых рецепторов ацетилхолина. Эта активация адаптивна, так как известной приспособительной формой поведения С. elegans к неблагоприятному повышению температуры в этом диапазоне является избегание локальной среды с высокой температурой, а активация холинергических синапсов может повышать скорость этой формы локомоции.

• Впервые показано, что высокая плотность особей в лабораторной популяции С. elegans формирует новое состояние организмов нематод, проявляющееся в снижении порога теплового стресса, вызывающего сенситизацию никотиновых рецепторов ацетилхолина.

• Показано, что следствием адаптивной активации холинергических синапсов С. elegans умеренным тепловым стрессом и высокой плотностью особей в популяции является сильное снижение толерантности к нематоцидам, механизмом токсического действия которых является гиперактивация холинергических синапсов (ингибирование ацетилхолинэстеразы или гиперактивация никотиновых рецепторов).

• Показано, что результатом эволюции нематод рода Caenorhabditis явилось появление различий никотиновых рецепторов ацетилхолина у С. elegans и С. briggsae и, как следствие, качественных различий толерантности к нематоцидам.

• Показано, что экстремальная высокая температура, в отличие от умеренного теплового стресса, нарушает функции холинергической системы С. elegans ингибированием секреции ацетилхолина, которое является причиной теплового нарушения поведения нематод.

• Впервые показано участие серотонинергической и дофаминергической систем в регуляции резистентности организма С. elegans к гипертермии.

• Мутантным анализом выявлены три гена, регулирующие устойчивость организма С. elegans к экстремальной высокой температуре (ген мускаринового рецептора gar-Ъ, ген переносчика серотонина mod-5 и ген рецептора серотонина ser-

4).

• Впервые показано, что нервная система стала самой чувствительной мишенью действия экстремальной высокой температуры на организмы Metazoa уже на ранней стадии их эволюции у таких простых организмов как круглые черви.

Практическая ценность.

• Разработанная в диссертации новая высокочувствительная методика определения токсичности нематоцидов может быть использована для определения

толерантности свободноживущих почвенных нематод к действию новых поколений органических пестицидов.

• Выявленная зависимость увеличения нематоцидной активности умеренным и экстремальным повышением температуры может быть использована для повышения эффективности защиты почвы от паразитических нематод.

• Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс Института экологии и природопользования Казанского федерального университета при чтении лекций и проведении практических занятий по дисциплинам "Биологический мониторинг" и "Экология человека" для студентов IV курса по специальности экология.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Холинергическая система играет ключевую роль как в приспособлении организмов почвенных нематод к неблагоприятному, но переносимому организмом повышению температуры, так и в устойчивости организма к действию экстремальной высокой температуры среды.

2. Адаптивная реакция холинергической системы нематод на повышение температуры окружающей среды и чрезмерно высокую плотность особей в популяции заключается в увеличении чувствительности никотиновых рецепторов ацетилхолина, и поэтому вызывает сильное снижение толерантности к действию пестицидов, токсическое действие которых направлено на холинергическую систему.

3. В ходе эволюции нематод рода Caenorhabditis появились различия в организации никотиновых рецепторов ацетилхолина, выявляющиеся в различиях толерантности к действию нематоцидов — агонистов этих рецепторов.

4. Нервная система нематод является мишенью негативного влияния экстремальной высокой температуры среды на организмы, и регуляция устойчивости поведения С. elegans к гипертермии осуществляется в противоположных направлениях серотонином, при его связывании с SER-4 рецептором, и дофамином.

Личный вклад автора: участие в постановке задач исследования; проведение экспериментов, статистическая обработка полученных результатов и их обобщение; участие в написании научных статей; формулирование выводов. Соавторами статей по теме диссертации являются научный руководитель, к.б.н. Калинникова Т.Б., заведующий лабораторией экспериментальной экологии, д.б.н., проф. Гайнутдинов М.Х., а также коллеги из ИПЭН АН РТ (к.б.н. Тимошенко А.Х., к.б.н. Гайнутдинов Т.М., Белова (Осипова) Е.Б.), принимавшие участие в экспериментах и обсуждениях.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на итоговой научной конференции КФУ (2008-2010, 2012), на Всероссийской заочной конференции "Актуальные проблемы науки и образования" (г.Чебоксары, ноябрь 2010 г.), на III Международной научно-практическая конференции "Молодежь и наука XXI века" (г. Ульяновск, ноябрь 2010 г.), на III Международной научно-практической конференции "Биоэлементы

(фундаментальные основы и практический опыт применения биоэлементов в медицине, пищевой промышленности экологии и сельском хозяйстве)" (г. Оренбург,

ноябрь 2011г.), а также на Всероссийской научно-практической конференции "Естественно-научные исследования: состояние, проблемы и перспективы" (г.Чебоксары, 2012 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, в их числе 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и глава в книге, изданной в издательстве Nova Science Publishers в г. Нью-Йорк.

Диссертационная работа выполнена в области факториальной экологии в рамках госбюджетной темы лаборатории экспериментальной экологии ИПЭН АН РТ в течение 2010-2012 гг. и соответствует специальности 03.02.08 - экология.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, основных выводов и заключения, библиографического списка, включающего 212 источников, в том числе 194 на иностранных языках. Работа изложена на 133 страницах (из которых 111 страниц основного текста), содержит 1 таблицу и 32 рисунка.

Благодарности. Работа выполнена в лаборатории экспериментальной экологии обособленного подразделения Государственного научного бюджетного учреждения «Академия наук Республики Татарстан» - «Институт проблем экологии и недропользования» (ИПЭН АН РТ) под руководством к.б.н. Т. Б. Калинниковой, которой автор выражает глубокую благодарность за помощь, советы и научные консультации на всех этапах проведения исследования. Автор глубоко благодарен и признателен д.х.н. профессору В.З. Латыповой за внимание к работе и замечания по рукописи автореферата, а так же за советы при окончательном оформлении работы.

Автор так же выражает глубокую благодарность сотрудникам лаборатории экспериментальной экологии, принявшим участие в экспериментах и обсуждениях (зав. лаб., д.б.н., профессору М.Х. Гайнутдинову, к.б.н. Т.М. Гайнутдинову, к.б.н. А.Х. Тимошенко, Е.Б. Беловой (Осиповой)). Автор выражает благодарность также д.х.н. P.P. Шагидуллину за полезное обсуждение. Автор благодарен родным и близким за всестороннюю помощь, поддержку и понимание.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе представлен обзор современных исследований действия на организмы животных таких факторов среды, как высокая температура, пестициды и такие загрязнители окружающей среды, как ацетальдегид и ионы марганца.

Вторая глава посвящена объектам и методам исследования. Объекты исследования - свободноживущие почвенные нематоды Caenorhabditis elegans и Caenorhabditis briggsae. В работе использовались линия Caenorhabditis briggsae AFI6 (Fodor, 1983); и девять линий Caenorhabditis elegans: линия дикого типа N2 Bristol (Brenner, 1974); линия МТ9772 mod-5(n3314) с мутацией гена переносчика серотонина, осуществляющего обратный захват серотонина серотонинергическими нейронами (Ranganathan et al., 2001); линии JD217 (gar-3(vu78')), RB756 (gar-2(ok520)) и RB896 (gar-l(ok755)) с нуль-мутациями генов рецепторов ацетилхолина GAR-3, GAR-2 и GAR-1 соответственно (Steger, Avery, 2004; Bany, 2003) линии DAI814 (ser-1(ок345)), RB745 (ser-4(ok512)) и MT9668 (mod-l(okl03)) с нуль-мутациями генов рецепторов серотонина; линия IPE1 с низкой теплоустойчивостью поведения. Линии

С. briggsae AF16 и С. elegans N2, JD217, МТ9772, RB756 и RB896, DA1814, RB745, МТ9668 получены из Caenorhabditis Genetic Center и Gene Knockout Project at OMRF, являющегося частью International С. elegans Gene Knockout Consortium. Линия IPE1 получена в лаборатории экспериментальной экологии ИПЭН АН РТ путем искусственного отбора на низкую теплоустойчивость поведения.

Нематод выращивали при +22°С в чашках Петри со стандартной средой выращивания нематод (СВН) (3 г/л NaCl, 17 г/л бактоагар, 2,5 г/л бактопептон, 5 мг/л холестерин, 1ммоль СаС12, 1 ммоль MgS04, 25 мл/л калийфосфатный буфер (pH 6,0)), засеянной Е. coli ОР50 (Brenner, 1974).

Эксперименты проводились с нематодами, инкубированными индивидуально в 1 мл NG буфера (Brenner, 1974). Показателями нарушений поведения высокой температурой среды левамизолом, пирантелом, никотином и ингибитором ацетилхолинэстеразы алдикарбом являлись нарушения координации локомоторных мышц, необходимой для синусоидальных движений тела при плавании, индуцированном механическим стимулом (встряхиванием пробирки с червем), и полная потеря способности червей к плаванию. В каждом варианте эксперимента использовано 30 нематод.

При исследовании влияния плотности особей на поведение С. elegans 300 или 1500 нематод одного возраста предварительно переносили в чашки Петри диаметром 40 мм с СВН и Е. coli ОР50 и через 20 часов инкубации при +23°С использовали в эксперименте.

В сравнительном исследовании действия пирантела и левамизола на поведение С. elegans и С. briggsae эти нематоциды растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) при конечной концентрации ДМСО в среде равной 0,5 %.

Для адаптации С. elegans к действию высокой температуры использовали тепловую закалку (инкубация в водяной бане с температурой +32 или +33°С в течение 1 ч с последующим восстановлением червей в течение 1 ч при +23°С) или кратковременную (30-120 мин) экспозицию к постоянной высокой температуре, переносимой С. elegans (+28 - +30°С).

Изучение токсичности ионов марганца или 6-гидроксидофамина (6-OHDA) проводили путем 30-минутной инкубации нематод при 25°С в среде, содержащей 6-OHDA (15 ммоль) или сульфат магния (20 ммоль) с последующим перенесением нематод в чашки Петри с агаром и Е. coli ОР50 и инкубацией в течение 48 часов.

Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами: рассчитывали средние арифметические величины и доверительный интервал. Оценку достоверности произвели с использованием t-теста Стьюдента. Статистический анализ проводили с использованием программ Statistica 8.

В третьей главе представлены результаты экспериментов, а также их обсуждение. Глава состоит из 3 подразделов, каждый из которых посвящен исследованию механизмов действия следующих факторов среды на организм С. elegans: 1) умеренной (переносимой) температуры; 2) высокой температуры, превышающей физиологический оптимум; 3) нематоцидов - агонистов никотиновых рецепторов ацетилхолина.

Адаптация организмов С. elegans и С. briggsae к умеренному тепловому стрессу

С. elegans и С. briggsae обитают в верхних слоях почвы, подверженных сильным изменениям температуры и влажности при сезонных и климатических колебаниях температуры воздушной среды. Следовательно, С. elegans является удобным модельным организмом для изучения механизмов адаптации пойкилотермных животных как к умеренному, переносимому организмом превышению физиологического оптимума температуры, так и к экстремальному увеличению температуры среды, вызывающему нарушения функций и тепловую гибель животных (Kelty, 2002; Armstrong, 2006).

Известно, что холинергическая система, приобретенная организмами Metazoa на ранней стадии эволюции, играет ключевую роль во всех основных функциях организмов, как человека, так и всех животных, включая С. elegans (Sattelle, 2009).

Вследствие этого одной из задач работы явилась проверка гипотезы, предполагающей, что адаптивная реакция организма С. elegans на умеренное, но неблагоприятное повышение температуры среды включает в себя изменения функций холинергической системы. Для проверки этой гипотезы был использован методический подход, который успешно применяется последние двадцать лет для изучения молекулярных механизмов функций холинергической системы С. elegans (Arneric et al., 2007), но не использовался ранее для изучения возможной роли этой системы в адаптации С. elegans к негативным изменениям факторов окружающей среды. Этот подход, специфичный для С. elegans, заключается в том, что изменения состояния холинергической системы в интактном организме С. elegans выявляются фармакологическим (токсикологическим) анализом локомоции, который включает в себя регистрацию изменений чувствительности локомоции к ингибитору ацетилхолинэстеразы - алдикарбу и агонистам никотиновых рецепторов ацетилхолина - левамизолу и никотину (Tabet, 2006; Tomizawa, 2003; Sleigh, 2010).

Как показано на рисунке 1, в экспериментах с С. elegans линии N2, выращенными в оптимальных условиях среды (Brenner, 1974), повышение температуры с +23°С до +30°С вызывает небольшое увеличение чувствительности плавания, индуцированного механическим стимулом, к действию алдикарба. Последний, ингибируя ацетилхолинэстеразу, увеличивает концентрацию ацетилхолина в организме и, как следствие, нарушает поведение нематод гиперактивацией н-холинорецепторов. В то же время повышение температуры с +30°С до +33°С, вызывает сильное увеличение чувствительности С. elegans к алдикарбу (рис.1).

Известно, что повышение чувствительности локомоции С. elegans к алдикарбу свидетельствует об активации холинергических синапсов, принимающих участие в регуляции локомоции, которая может быть следствием стимуляции секреции ацетилхолина нейронами или повышения чувствительности к ацетилхолину н-холинорецепторов в нейронах и мышцах (Jospin et al., 2009).

100 90 80

i

I ¡ 60

" 150

— E3

s з

3

4

§ s

° 14»

3 S

я | ¡ 30

и

20 10 -

*** £

□ 23°

□ 33°

*** i

0 8 16

Концентрация алдикарба

32

Рис. 1. Влияние температуры на чувствительность поведения С. elegans к алдикарбу. ••• -разница с контролем (среда без алдикарба) достоверна при р < 0,001; *** - разница с контролем (температура +23°С) достоверна при р < 0,001.

Были проведены эксперименты, в которых исследовано влияние кратковременного (15 минут) умеренного теплового стресса на чувствительность поведения С. elegans к действию агонистов никотиновых рецепторов ацетилхолина нематод левамизола и никотина. Как показано на рисунке 2, чувствительность поведения С. elegans к действию левамизола и никотина умеренно увеличивается повышением температуры с +23°С до +30°С и очень сильно повышением температуры с +30°С до +33°С. Следовательно, переносимый организмом С. elegans тепловой стресс вызывает быстрое увеличение чувствительности н-холинорецепторов. Выявленная нами in vivo активация холинергических синапсов не может быть проявлением теплового нарушения функций организмов почвенных нематод, и поэтому является компонентой приспособительной реакции организма на тепловой стресс.

мкмоль 0 175 350 700 Концентрации никотина

□ 23"С

□ 30°С

□ зз°с

А

16 32 64

Концентрация левамизола

мкмоль 128

Рис. 2. Влияние температуры на чувствительность поведения С. е/е^ага к никотину и левамизолу.

••• - разница с контролем (температура +23°С) достоверна при р < 0,001;

*** - разница с контролем (среда без никотина и левамизола) достоверна при р < 0,001.

Известно, что для организма С. elegans, так же, как для организмов других видов, неблагоприятным изменением окружающей среды является превышение оптимальной численности популяции, которое может оказывать сильное влияние на организмы особей как социальными сигналами, так и конкуренцией за пищу (Riddle, Albert, 1997; Mohri et al., 2005). Поэтому мы предположили, что не только тепловой стресс, но и повышенная плотность особей в лабораторной популяции С. elegans вызывает сильные изменения чувствительности н-холинорецепторов. В наших экспериментах сравнивалась чувствительность поведения С. elegans к левамизолу и никотину после 20-часовой инкубации нематод в чашках Петри с низкой (п = 300) и чрезмерно высокой (п = 1500) плотностью особей одного возраста.

□ Низкая плотность

популяции П Высокая плотность

23 "С 28 °С 30 "С 33 "С Температура

Минуты 50 -| 45 -

I 40-

II 35 -

О 30 ^

я 25 | 20 "

| 15 -

о 10

с

5 -

0

♦

71

23 °С

□ Низкая плотность популяции

□ Высокая плотность

популяции ***

30 °С 33 °с Температура

Рис. 3. Влияние теплового стресса и плотности особей на чувствительность поведения С. elegans к действию левамизола (А) и алдикарба (Б).

♦♦♦ - разница с контролем (низкая плотность популяции) достоверна при р < 0,001;

••• - разница с контролем (температура +23°С) при высокой плотности популяции

достоверна при р < 0,001;

*** - разница с контролем (температура +23°С) при низкой плотности популяции достоверна при р < 0,001; ** - разница достоверна при р < 0,01; * - разница достоверна при р < 0,1.

Как показано на рисунке 3, эффект высокой плотности особей в условиях этого эксперимента проявляется как в небольшом, но достоверном повышении чувствительности поведения С. е^ап5 к действию левамизола при температуре +23 °С, так и в снижении порога теплового стресса, который вызывает сильную сенсибилизацию поведения к активации н-холинорецепторов левамизолом. В экспериментах с червями, предварительно инкубированными 20 часов при низкой плотности особей (п = 300) сильное повышение чувствительности к левамизолу выявляется при температуре выше +30°С. При предварительной инкубации червей в условиях высокой плотности (п = 1500) этот эффект теплового стресса выявляется уже при температурах от +28°С до +30°С (рис. 3). Следовательно, высокая плотность особей является фактором среды, который вызывает небольшое увеличение чувствительности н-холинорецепторов и сильное снижение порога теплового стресса эффективного для сенситизации н-холинорецепторов.

Корреляция изменения стрессовыми условиями среды чувствительности поведения к агонистам н-холинорецепторов (рис. 2, 3) и ингибированию ацетилхолинэстеразы (рис. 1, 3) показывает, что высокая плотность особей и тепловой стресс сенситизируют н-холинорецепторы не только к левамизолу и никотину, но и к повышенному уровню ацетилхолина.

Хорошо известной адаптивной формой поведения С. elegans, индуцируемой неблагоприятным повышением температуры среды, является избегание локальных участков с высокой температурой, проявляющееся в миграции червей к участкам с комфортной температурой среды, которая ослабляет или предотвращает негативное влияние гипертермии на организм (Woodbury et al., 2004; Chatzigeorgiou et al., 2010; Liu et al., 2012). Ключевым параметром этой формы поведения, дополнительно к направлению локомоции, является ее скорость. Результаты наших экспериментов показывают, что причиной повышения скорости локомоции С. elegans тепловым стрессом является сенситизация н-холинорецепторов, и как следствие, активация холинергических синапсов, регулирующих локомоцию.

Известно, что у С. elegans реакция избегания среды с высокой температурой индуцируется стимуляцией термосенсорных нейронов (PVD, FLP и AFD) в диапазоне температур от +27°С до +33°С (Chatzigeorgiou et al., 2010; Liu et al., 2012; Mohammadi et al., 2013), совпадающим с диапазоном для сенситизации н-холинорецепторов (рис. 2). Поэтому очевидно, что молекулярные и клеточные механизмы восприятия термосенсорной информации для активации холинергических синапсов те же, что и для реакции избегания высокой температуры среды.

Двумя возможными причинами сенсибилизации С. elegans к повышению температуры среды высокой плотностью особей являются: 1) действие феромонов, которое у личинок II возраста вызывает переход в диапаузу (Riddle, Albert, 1997), но может оказывать влияние и на организмы взрослых нематод; 2) повышенная конкуренция за пищу, так как даже кратковременный дефицит пищи вызывает у С. elegans сильные изменения функций нервной системы (Mohri et al., 2005). В то же время, высокая плотность особей вызывает значительное повышение чувствительности н-холинорецепторов и в отсутствии теплового стресса (рис. 4). Поэтому возможно, что активация холинергических синапсов сенситизацией н-холинорецепторов является неспецифической реакцией организма С. elegans на ухудшение окружающей среды.

В связи с тем, что левамизол, никотин и алдикарб используются как антигельминтные средства и инсектициды, а С. elegans является удобным модельным организмом для изучения их действия на организмы паразитических нематод (Sattelle, 2009), результаты этой работы могут иметь и прикладное значение. Во-первых, известным методом борьбы с корневыми паразитическими нематодами и личинками насекомых-вредителей является соляризация (тепловая обработка) почв. Усиление токсического действия пестицидов - агонистов н-холинорецепторов и алдикарба, являющегося как нематоцидом, так и инсектицидом, повышением температуры предполагает высокую эффективность совместного действия соляризации почвы и ее обработки агонистами н-холинорецепторов. Во-вторых, зависимость чувствительности к левамизолу и алдикарбу от плотности особей у С. elegans

показывает, что эта зависимость должна учитываться в борьбе с паразитическими нематодами и насекомыми при использовании агонистов н-холинорецепторов.

Исследование устойчивости организмов С. elegans и С. briggsae к действию нематоцидов

Известно, что при использовании агонистов никотиновых рецепторов ацетилхолина в качестве нематоцидов в ветеринарии происходит адаптация популяций паразитических нематод к их токсическому действию за счет появления новых генетических вариантов на уровне никотиновых рецепторов ацетилхолина (Martin, 1996; Kim, 2001; Ни, 2009). Чрезвычайная сложность н-холинорецепторов, состоящих из 5 субъединиц, и наличие не менее 29 генов этих субъединиц (Chatzigeorgiou et al., 2010; Liu et al., 2012) позволяет предположить, что эволюция н-холинорецепторов нематод происходит и в природе. В соответствии с этим предположением находятся результаты наших экспериментов, в которых сравнивалась чувствительность поведения двух близкородственных видов нематод С. elegans и С. briggsae к токсическому действию нематоцидов - агонистов н-холинорецепторов левамизолу и пирантелу. Как показано на рисунке 4, у С. briggsae, по сравнению с С. elegans, повышена чувствительность поведения к действию левамизола, развивающемуся во времени, но понижена чувствительность к действию пирантела.

Противоположно направленные различия чувствительности к левамизолу и пирантелу у С. elegans и С. briggsae (рис. 4) могут быть объяснены результатами исследований никотиновых рецепторов ацетилхолина L-субтипа, проводившихся методами молекулярной биологии и молекулярной генетики, которые показали существование вариантов подтипов н-холинорецепторов, у которых отсутствует корреляция чувствительности к пирантелу и левамизолу (Bartos et al., 2006).

Концентрация левамизола Концентрация ппрантела

Рис. 4. Нарушения поведения С. elegans и С. briggsae левамизолом и пирантелом после 30-минутной экспозиции.

*** - разница с контролем (линия N2 С. е/е^ага) достоверна при р < 0,001; ** - разница достоверна при р < 0,01;

••■ - разница с концентрацией 30 мкмоль левамизола А (пирантела Б) достоверна при р < 0,001; •• - разница достоверна при р < 0,01.

Качественные различия чувствительности к левамизолу и пирантелу у С. elegans и С. briggsae показывают, что никотиновые рецепторы ацетилхолина изменяются в ходе эволюции даже в пределах одного рода нематод. Возможно, что это связано с температурными условиями существования С. elegans и С. briggsae, так как дикая линия С. elegans получена из популяции, обитающей в средних широтах, а линия С. briggsae, напротив, из популяции, обитающей в тропиках (Brenner, 1974; Fodor, 1983).

Устойчивость поведения С. elegans к действию экстремальной высокой температуре окружающей среды

Адаптация высших беспозвоночных к неблагоприятному, но переносимому их организмами превышению физиологического оптимума температуры включает в себя не только формирование адаптивных форм поведения, таких как избегание локальных участков с высокой температурой, но и адаптивные изменения физиологического состояния организма, повышающие его толерантность к действию экстремального теплового стресса, который может вызывать обратимые нарушения функций организма и его гибель (Kelty, 2002; Armstrong, 2006). Две известные формы адаптаций высших беспозвоночных к действию экстремальной высокой температуры - это акклимация к действию постоянной высокой температуры и тепловая закалка организма (преадаптация к гипертермии), которая осуществляется экспрессией генов стрессовых белков (белки теплового шока, антиоксидантные белки и др.) сублетальной высокой температурой (Feder, 1999; Robertson, 2004; Hoffmann, 2006).

11

1 час при +33°С — ] час 1 час при +33°С - 2 при +23°С часа при +23°С

Рис. 5. Эффективность адаптации С. elegans к экстремальному повышению температуры от тепловой закалки.

*** _ разница с контролем (без тепловой закалки) достоверна при р < 0,001.

Как показано на рисунке 5, тепловая закалка организма С. е/е^ая5 экспозицией к температуре +33°С в течение 1 часа с последующим восстановлением червей при +23°С в течение 1 часа вызывает увеличение резистентности поведения к действию

Минуты

120 ■

£ Э

•U 5

п

Контроль

экстремальной высокой температуры +36°С. Известно, что в условиях этого эксперимента в организме С. elegans происходит экспрессия генов стрессовых белков (белки теплового шока) (Feder, 1999).

В то же время нами выявлена неизвестная ранее адаптация С. elegans к повышению температуры среды. Эта адаптация не является тепловой закалкой организма, так как происходит при повышении температуры среды, подпороговой для экспрессии генов стрессовых белков (Robertson, 2004; Feder, 1999). Эта адаптация развивается в течение 30 — 120 минут (рис. 6 А) экспозиции нематод к температуре от +28°С до +30СС (рис. 6 Б), поэтому ее нельзя рассматривать и как акклимацию к высокой температуре, которая происходит в течение дней и недель. В связи с тем, что повышение температуры в этом диапазоне в результате стимуляции термосенсорных нейронов (PVD, FLP и AFD) индуцирует реакцию избегания среды с высокой температурой (Chatzigeorgiou et al., 2010; Liu et al., 2012; Mohammadi et al., 2013), наиболее вероятным объяснением повышения резистентности поведения к гипертермии является непрерывная стимуляция термосенсорных нейронов с поступлением не идентифицированных нервных или нейроэндокринных сигналов в систему нейронов, регулирующих локомоцию С. elegans. В связи с отсутствием литературных данных о таком быстром повышении устойчивости организмов к температурным экстремумам умеренным повышением температуры, возможно, что выявленная нами закономерность адаптации специфична для простых организмов нематод.

mhhvim

§ 3 100

с

■ä о . 90

С S « 80

и + к « ь 70

I d Й

i -s S 60

III50

а 1 s 40 Ii зо

a

Минуты

Минуты

90'

О/, в

•а г ;

80

в Се

Я

5 +

2 V

70 -60 50 40

0 30 60 90 120 Время предварительной инкубации при температуре +30°С

8 в

ш

30

пл

23°С 26°С 28°С

30»С

Температура двухчасовой предварительной адаптации к повышенной температуре

Рис. 6. Эффективность адаптации С. elegans к экстремальному повышению температуры двухчасовой экспозицией к повышенной температуре.

*** _ разница с контролем (без предварительной адаптации) достоверна при р < 0,001.

Известно, что нервная система является самой чувствительной мишенью действия экстремальной высокой температуры на организмы человека, позвоночных и высших беспозвоночных (Cossins, Bowler, 1997). В то же время остается открытым вопрос о механизмах тепловых нарушений функций и тепловой гибели простых многоклеточных организмов, таких как круглые черви, появившихся на ранней стадии эволюции Metazoa. Решение этого вопроса с использованием в качестве модельного организм почвенной нематоды С. elegans являлось одной из задач работы.

В связи с тем, что одной из причин теплового нарушения функций организма у рыб является ингибирование гипертермией секреции ацетилхолина, возможно, что и поведение С. е/е£аих нарушается вследствие ингибирования этой секреции.

Одной из возможных причин тепловых нарушений поведения С. е/е£атю является нарушение функций холинергической системы, регулирующей локомоцию нематод при оптимальной температуре среды.

Для проверки этой гипотезы были проведены эксперименты, в которых исследовалось влияние на терморезистентность поведения С. еЫ^апя ингибитора ацетилхолинэстеразы - неостигмина, который используется в медицине для повышения концентрации ацетилхолина при его дефиците в организме человека (ТаЬе1, 2006).

Как показано на рисунке 7, введение в среду инкубации неостигмина вызывало повышение термостабильности плавания С. е^ат. Результаты этих экспериментов показали, что гипертермия вызывает в организме С. е^ат состояние с дефицитом ацетилхолина, которое компенсируется ингибированием ацетилхолинэстеразы неостигмином.

Рис. 7. Действие неостигмина и атропина на теплоустойчивость поведения С. elegans при постоянно высокой температуре +36°С.

*** - разница с контролем (среда без неостигмина и атропина) достоверна при р < 0,001; ** -разница достоверна при р < 0,01; * - разница достоверна при р < 0,1; ••• - разница с контролем (среда с атропином без неостигмина) достоверна при р < 0,001; •• - разница достоверна при р < 0,01; • - разница достоверна при р < 0,1.

Возможными механизмами нарушения поведения С. е/е^ада дефицитом ацетилхолина, вызванным гипертермией, является ослабление стимуляции никотиновых рецепторов ацетилхолина и снижение активации метаботропных мускариновых рецепторов ацетилхолина, сопряженных с Б-белками.

Как показано на рисунке 7, протекторный эффект ингибитора ацетилхолинэстеразы неостигмина блокируется антагонистом м-холинорецепторов атропином, а введение в среду агонистов м-холинорецепторов пилокарпина и карбахола повышает резистентность поведения С. е1е%ат к действию экстремальной высокой температуры (рис. 8). Напротив, введение в среду агониста н-холинорецепторов левамизола снижает термостабильность поведения, причем эффективные концентрации этих

агонистов были ниже, чем для нарушения поведения С. elegans при температуре +23°С (рис. 9). Результаты этих экспериментов показывают, что негативное влияние дефицита ацетилхолина на поведение С. elegans при гипертермии обусловлено дефицитом стимуляции м-холинорецепторов, а не н-холинорецепторов.

В геноме С. elegans идентифицированы три гена (gar-1, gar-2 и gar-3), сходные с генами м-холинорецепторов позвоночных (Lee, 2000; Park, 2003; Kim,2008; Steger, 2006). Эктопическая экспрессия этих генов в клетках млекопитающих показала, что продукты генов gar-1, gar-2 и gar-3 являются рецепторами ацетилхолина, сопряженными с G-белками.

U Минуты

□ без атропина

□ с атропином

контроль

с карбахолом с пилокарпином

Рис. 8. Действие пилокарпина, карбахола и атропина на теплоустойчивость поведения С. е1е^ат при действии постоянно высокой температуры +36°С.

Примечание. Концентрация пилокарпина - 0.7 мкмоль, концентрация карбахола - 5 мкмоль, концентрация атропина - 1 мкмоль.

*** - разница с контролем (среда без карбахола и пилокарпина) достоверна при р < 0,001; ••• - разница с контролем (среда без атропина) достоверна при р < 0,001.

Минуты

S о 80

в Я

и =

О- я

ш и

г «60

к Ч

s е

я *

= 40

а й X о О X

0 ю

1 s2

Я о S с

В. U

S3

16 32

Концентрация левамизола

Рис. 9. Чувствительность термотолерантности С. elegans к левамизолу при действии постоянной температуры +36°С.

Для идентификации м-холинорецептора С. elegans, определяющего чувствительность теплоустойчивости функций нервной системы к протекторным эффектам пилокарпина и неостигмина, были проведены эксперименты, в которых сравнивалась чувствительность к неостигмину и пилокарпину у червей дикой линии N2 и трех линий червей с мутациями по одному из трех генов (gar-1, gar-2 и gar-3), продуктами которых являются м-холинорецепторы.

Мпнуты DN1

□ GAR-1

□ GAR-2

□ GAR-3

О 0,1 0,8

Концентрация пнлпкаршша

□ N2

□ GAR-1 В GAR-2

□ GAR-3

0 0,1 0,7

Концентрация неостнгмпна

Рис. 10. Чувствительность термотолерантности С. е1е§ат дикой линии N2 и трех линий червей с мутациями по одному из трех генов (£аг-1, ёаг-2 и gar-3) к пилокарпину и неостигмину при действии высокой температуры +36°С.

*** - разница с контролем (линия N2) достоверна при р < 0,001; ** - разница достоверна при р < 0,01;

••• - разница с контролем (среда без пилокарпина и неостигмина) достоверна при р < 0,001.

Как показано на рисунке 10, у червей мутантных линий RB896 и RB756, у которых отсутствуют функции генов соответственно gar-1 и gar-2, чувствительность к протекторному эффекту пилокарпина, проявляющемуся в повышении теплоустойчивости поведения, мало отличается от чувствительности к пилокарпину червей С. elegans дикой линии N2.

Напротив, в экспериментах с мутантной линией С. elegans JD217, у которой отсутствует экспрессия гена gar-3, пилокарпин не оказывает влияния на теплоустойчивость поведения С. elegans {рис. 10).

Следовательно, м-холинорецептор GAR-3 необходим для повышения теплоустойчивости поведения С. elegans пилокарпином, которое сохраняется при отсутствии у червей м-холинорецепторов GAR-1 или GAR-2.

Как показано на рисунке 10, у червей линии с нуль-мутацией гена рецептора GAR-3 отсутствует и чувствительность теплоустойчивости поведения к ингибитору ацетилхолинэстеразы неостигмину, в то время как у червей линий с нуль-мутациями генов рецепторов GAR-1 и GAR-2 эта чувствительность выявляется. Следовательно, м-холинорецептор GAR-3 необходим для повышения теплоустойчивости поведения С. elegans не только действием агониста м-холинорецепторов пилокарпина, но и ингибированием ацетилхолинэстеразы неостигмином.

Нервная система является основной мишенью действия гипертермии на организмы человека и животных из-за высокой чувствительности большинства нейронов и синаптических связей между ними к значительному превышению физиологического оптимума температуры (Bouchama, Knöchel, 2001; Robertson, 2004; Robertson, 2004). Поэтому обнаруженное нами ингибирование секреции ацетилхолина экстремальной высокой температурой может быть не единственной причиной теплового нарушения функций организма С. elegans. Известно, что серотонин и дофамин принимают участие в большинстве основных функций организмов человека и С. elegans. Поэтому нами было проведено исследование возможной роли серотонина и дофамина в устойчивости к экстремальной высокой температуре такой важной функции организма С. elegans как локомоция.

Одним из подходов к выяснению функций серотонина в организме С. elegans является исследование влияния экзогенного серотонина на различные формы поведения нематод (Hartig, 1997; Carre-Pierrat, 2006; Buhot, Martin, 2000; Carnell, Illi, 2005). Особенностями организма С. elegans и других нематод являются: 1) отсутствие проницаемости кутикулы для многих токсикантов и лекарств; 2) чрезвычайно низкая скорость обмена между внутренней средой организма и окружающей средой через кишечник. Этим объясняются высокие концентрации серотонина (7-30 ммоль), вызывающие у С. elegans стимуляцию пищевого поведения, ускорение откладки яиц и снижение двигательной активности нематод (Hartig, 1997; Carre-Pierrat, 2006; Buhot, Martin, 2000; Carnell, Illi, 2005). В то же время при оптимальной температуре среды серотонин в диапазоне концентраций 2-8 ммоль не оказывает влияния на плавание С. elegans, индуцированное механическим стимулом, но, как показано на рисунке 11, снижает устойчивость этой формы поведения к действию постоянной высокой температуры +36°С.

%

■S в «j я

u g

ca ч

ê s.

ê I

I 1 w g 2 = s

e я

£

100 90 80 70 60 50 -40 30 20 10 0

□ N2 ït, a,„od-l(okl03)

□ ser-l(ok345)

□ ser-4(ok512)

2 4 8

Концентрация серотонина

Рис. 11. Чувствительность теплоустойчивости поведения нематод линии N2 зег-1(ок345), зег-4(ок512) и тос1-1 (окЮЗ) к действию серотонина.

*** - разница с контролем (среда без серотонина) достоверна при р < 0,001.

M инуты

80 -,

N2 mod-5 (п 3314) ser-4 (ok 512)

□ Среднее время появления ошибок моторной программы

плавания при +36°С ■ Среднее время потери способности к плаванию при +36°С

Рис. 12. Влияние мутаций генов mod-5(n3314) и ser-4(ok512) на теплоустойчивость поведения С. elegans.

*** - разница с контролем (линия N2) достоверна при р < 0,001; ** - разница с контролем (линия N2) достоверна при р < 0,01.

Результаты наших экспериментов показали, что не только экзогенный серотонин, но и повышение концентрации серотонина во внутренней среде организма С. elegans, которое происходит при мутации гена переносчика серотонина mod-5, снижает теплоустойчивость поведения (рис. 12). У С. elegans серотонин активирует несколько типов рецепторов, таких как SER-1, SER-4, SER-7 и MOD-1, причем связывание серотонина этими рецепторами может вызывать противоположно направленные изменения функций организма (Hartig, 1997; Buhot, Martin, 2000; Carnell, Uli, 2005; Carre-Pierrat, 2006).

Поэтому для идентификации рецепторов серотонина, необходимых для регуляции теплоустойчивости С. elegans, были проведены эксперименты, в которых сравнивали чувствительность поведения к серотонину в условиях повышения температуры до +36°С у нематод линии дикого типа N2 и у нематод трех линий с мутациями одного из трех генов рецепторов серотонина (яег-1, $ег-4 и тос1-1).

Результаты этих экспериментов показали, что нуль-мутации генов .чег-1 и тос1-1 этих рецепторов не оказывают влияния на чувствительность теплоустойчивости поведения С. е^ат к серотонину (рис. 11). В то же время у нематод линии с мутацией гена $ег-4 почти полностью отсутствует чувствительность к действию серотонина, проявляющемуся в снижении теплоустойчивости (рис. 11). Как показано на рисунке 12, нуль-мутация гена зег-4 повышает теплоустойчивость поведения С. е1с^ат и в отсутствии серотонина в среде. Эти данные показывают, что активация рецептора 8ЕЯ-4 не только экзогенным, но и эндогенным серотонином регулирует теплоустойчивость поведения С. е^ат ее снижением. В связи с тем, что ген зег-4 экспрессируется у С. е^ат только в нейронах (Сагте-Р1егга1с1 а1., 2006) очевидно, что высокая теплоустойчивость поведения и снижение ее чувствительности к экзогенному серотонину у нематод линии $ег-4 являются следствием прекращения модуляции серотонином синапсов в системе нейронов, регулирующей локомоцию.

Для проверки гипотезы, предполагающей, что не только холинергическая и серотонинергическая, но и дофаминергическая системы регулируют теплоустойчивость поведения С. е^аю, были проведены эксперименты, в которых исследовалось влияние на теплоустойчивость поведения нематод 6-гидроксидофамина.

Таблица 1

Влияние ионов марганца и 6-гидроксидофамина на теплоустойчивость плавания СаепогИаЬсИИя е1е%ат и ее чувствительность к дофамину

Условия эксперимента Среднее время потери червями способности к плаванию, индуцированному механическим стимулом, при действии температуры +36°С, мин

Дофамин, мкмоль

0 30 60 90

Контроль 45,3±1,0 53,1±1,8 ** 58,6±2,3 *** 56,2±2,4 ***

после 30-минутной экспозиции к Мп2+ 28,4±0,6 — 56,5±1,2 *** 61,3±2,5 *** 60,5±2,3 ***

после экспозиции к б-ОРГОА 29,7±0,5 ••• 58,2±1,5 *** 60,4±1,8 *** 63,2±2,7 ***

••• - разница с контролем (без экспозиции к Мп2+ и 6-01ША) достоверна при р < 0,001; *** - разница с контролем (среда без дофамина) достоверна при р < 0,001; ** - разница достоверна при р < 0,01;

Известно, то 6-гидроксидофамин вызывает селективную дегенерацию дофаминергических нейронов (8е«1уагу сЧ а1., 2009). Как показано в таблице 1,

6-гидроксидофамин вызывает снижение теплоустойчивости поведения С. elegans, а введение в среду дофамина, напротив, ее повышает. Причем, в среде с дофамином полностью нивелируются различия между контрольными нематодами и нематодами, подвергнутыми воздействию 6-гидроксидофамина.

Сходное с 6-гидроксидофамином действие на теплоустойчивость поведения С. elegans оказывает 30-минутная экспозиция нематод в среде с 30 ммоль хлорида марганца с последующим 48-часовым восстановлением. Действие ионов марганца проявлялось в снижении теплоустойчивости С. elegans, которое восстанавливалось введением в среду дофамина (Табл. 1). Результаты этих экспериментов находятся в соответствии с тем, что основным проявлением нейротоксичности ионов марганца в организмах человека и грызунов является селективная дегенерация дофаминергических нейронов.

Снижение теплоустойчивости поведения С. elegans нейротоксическим действием 6-гидроксидофамина, ионами марганца и ее повышение дофамином (Табл. 1), показало, что дофамин принимает участие в регуляции термотолерантности С. elegans в направлении противоположном ее регуляции серотонином. Эти результаты находятся в соответствии с представлениями о регуляции поведения беспозвоночных серотонином и дофамином в оптимальных температурных условиях среды, которые заключаются в том, что в большинстве случаев серотонин и дофамин изменяют поведение беспозвоночных в двух противоположных направлениях (Schafer, Kenyon, 1995; Sawin et al., 2000).

ВЫВОДЫ

1. Показано, что адаптивная реакция С. elegans и С. briggsae на неблагоприятное, но переносимое организмом повышение температуры среды (от +28° до +33°С) включает в себя быстрое (минуты) увеличение чувствительности никотиновых рецепторов в холинергических синапсах, принимающих участие в регуляции локомоции, и относительно медленное (часы) увеличение толерантности организма к действию экстремальной высокой температуры среды (36°С).

2. Увеличение чувствительности никотиновых рецепторов ацетилхолина умеренным тепловым стрессом и высокой плотностью особей в популяции С. elegans адаптивно при действии природных факторов среды, так как является механизмом увеличения скорости избегания нематодами локальных сред с высокой температурой, но вызывает сильное снижение толерантности организма к токсическому действию пестицидов вызывающих гиперактивацию холинергических систем нематод и насекомых (алдикарб, левамизол и никотин).

3. Качественные различия чувствительности поведения С. elegans и С. briggsae к нематоцидам - агонистам никотиновых рецепторов ацетилхолина левамизолу и пирантелу показали, что эволюция нематод даже в пределах одного рода изменяет никотиновые рецепторы ацетилхолина.

4. Показано, что у простых организмов нематод так же, как у высших беспозвоночных, нервная система является мишенью нарушения функций целого многоклеточного организма высокой температурой.

5. С использованием фармакологического и мутантного анализа показано, что одной из причин теплового нарушения поведения С. elegans является ингибирование секреции ацетилхолина нейронами, вызывающее состояние с дефицитом ацетилхолина, которое компенсируется частичным ингибированием ацетилхолинэстеразы и активацией мускаринового рецептора ацетилхолина GAR-3, являющегося гомологом м-холинорецепторов млекопитающих.

6. Показано участие серотонинергической и дофаминергической систем в регуляции устойчивости организма С. elegans к действию экстремальной высокой температуры, и идентифицированы два гена, принимающих участие в этой регуляции: ген переносчика серотонина mod-5(n3314) и ген рецептора серотонина ser-4(ок512).

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Колсанова, P.P. Действие левамизола и пирантела на поведение почвенных нематод Caenorhabditis elegans и Caenorhabditis briggsae / P.P. Колсанова, A.X. Тимошенко, M.X. Гайнутдинов, Т.Б. Калинникова // Ученые записки Казанского университета. Серия Естественные науки. - 2011. - Т. 153, кн. 2. - С. 180-189.

2. Калинникова, Т.Б. О нейротоксичности марганца в питьевой воде из подземных источников /, О.Ю. Тарасов, P.P. Колсанова, М.Х. Гайнутдинов // Георесурсы. - 2011. -№5.-С. 31-34.

3. Колсанова, P.P. Сенсибилизация организма нематоды Caenorhabditis elegans к действию левамизола повышением температуры среды / P.P. Колсанова, М.Х. Гайнутдинов, Т.Б. Калинникова // Ветеринарный врач. - 2011. - № 5. - С. 57-60.

4. Колсанова, Р. Р. Влияние ионов Мп2+ на устойчивость поведения свободноживущей почвенной нематоды Caenorhabditis elegans к тепловому стрессу / P.P. Колсанова, М.Х. Гайнутдинов, Т.Б. Калинникова // Вестник ОГУ. - 2011. - № 15. - С. 64-66.

5. Калинникова, Т.Б. Действие ацетальдегида на организмы свободноживущих почвенных нематод Caenorhabditis elegans линий N2 и IPE1 / Т.Б. Калинникова, А.Х. Тимошенко, P.P. Колсанова, C.B. Захаров, М.Х. Гайнутдинов, P.P. Шагидуллин // Токсикологический вестник. - 2012. — № 4. - С. 45—48.

6. Калинникова, Т.Б. О роли гена рецептора серотонина SER-4 в теплоустойчивости поведения Caenorhabditis elegans / Т.Б. Калинникова, P.P. Колсанова, P.P. Шагидуллин, Е.Б. Осипова, М.Х. Гайнутдинов // Генетика. - 2013. - Т. 49 - № 3. - С. 415-419

Публикации в тематических сборниках и трудах конференций:

7. Kalinnikova, T.B. Caenorhabditis elegans as a convenient model organism for understanding heat stress effects upon intact nervous system / T.B. Kalinnikova, R.R. Kolsanova, M.Kh. Gainutdinov // Heat stress: causes, treatment and prevention / Eds Josipovic S., Ludwig E. N.Y.: Nova Science Publishers, 2012. P. 113-140.

8. Gainutdinov, M.Kh. Comparison of Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae for thermo tolerance features / M.Kh. Gainutdinov, A.Kh. Timoshenko, R.R Kolsanova, T.M. Gainutdinov, T.B. Kalinnikova // The Worm Breeder's Gazette. - 2010. - V. 18, № 2. -

P. 20.

9. Gainutdinov, M.Kh. Influence of sensory deprivation on Caenorhabditis elegans swimming / M.Kh Gainutdinov, A.Kh.Timoshenko, R.R.Kolsanova, T.M. Gainutdinov, T.B. Kalinnikova // The Worm Breeder's Gazette. - 2010. - V. 18, № 3. - P. 15.

10. Колсанова, P.P. Действие агонистов мускариновых рецепторов ацетилхолина и неостигмина на теплоустойчивость поведения почвенной нематоды Caenorhabditis elegans / P.P. Колсанова, Е.Б. Осипова, Т.Б. Калинникова, М.Х. Гайнутдинов // Проблемы современной науки. Вып. 3. - Ставрополь, 2012. - С. 3-9.

11. Калинникова, Т.Б. Характеристика новой линии Caenorhabditis elegans с измененной чувствительностью поведения к ацетальдегиду и этанолу / Т.Б. Калинникова, P.P. Колсанова, Е.Б. Осипова, М.Х. Гайнутдинов // Естественнонаучные исследования: состояние, проблемы и перспективы. Материалы всероссийской научно-практической конференции. - Чебоксары, 2012. - С. 19-29

12. Колсанова, P.P. Нервная система как возможная мишень действия нематоцидов-агонистов п-холинорецепторов L-субтипа / P.P. Колсанова, А.Х. Тимошенко, М.Х. Гайнутдинов, Т.Б. Калинникова // Актуальные проблемы науки и образования. Материалы Всероссийской заочной конференции. — Чебоксары, 2010. - С. 85-89.

13. Колсанова, P.P. Действие пирантела и левамизола на поведение почвенной нематоды Caenorhabditis elegans / P.P. Колсанова, Е.Б. Осипова, А.Х. Тимошенко // Молодежь и наук XXI века. Материалы III Международной научно-практической конференции молодых ученых. - Ульяновск, 2010. - С. 207-209.

14. Kalinnikova, T.B. Acetylcholine Deficiency in Caenorhabditis elegans Induced by Hyperthermia Can Be Compensated by ACh-esterase Inhibition or Activation of GAR-3 mAChRs/ T.B. Kalinnikova, R.R. Shagidullin, R.R. Kolsanova, E.B. Osipova, S.V. Zakharov, M.Kh. Gainutdinov // Environment and Natural Resources Research. - 2013. - V. 3, № 3. -P. 98-113.

15. Колсанова, P.P. Сенситизация н-холинорецепторов как новый механизм адаптации почвенной нематоды Caenorhabditis elegans к действию теплового стресса и высокой плотности особей в популяции / P.P. Колсанова, Т.Б. Калинникова, Е.Б. Белова, М.Х. Гайнутдинов // Сборник научных трудов Института проблем экологии и недропользования. - Казань, 2014. - С. 134-145.

16. Калинникова, Т.Б. Влияние социальных сигналов, температуры среды и серотонина на поведение и теплоустойчивость Caenorhabditis elegans в условиях сенсорной депривации / Т.Б. Калинникова, P.P. Колсанова, Е.Б. Белова, М.Х. Гайнутдинов // Сборник научных трудов Института проблем экологии и недропользования. - Казань, 2014 - С. 110-121.

17. Калинникова, Т.Б. О роли ацетальдегида в действии этанола на нервную систему свободноживущей почвенной нематоды Caenorhabditis elegans / Т.Б. Калинникова, P.P. Колсанова, Е.Б. Белова, М.Х. Гайнутдинов // Сборник научных трудов Института проблем экологии и недропользования. — Казань, 2014. - С. 122-133.

Подписано в печать 22.10.2014 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать цифровая. Усл. печ. л. - 1. Заказ № 197/10 Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства Казанского университета 420008, г. Казань, ул. Профессора Нужина, 1/37 Тел.: (843) 233-73-59, 292-65-60