Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Участие эндогенных фенольных соединений в регуляции перекисного окисления липидов в начале инфицирования гороха Rh. leguminosarum при разных температурах
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Участие эндогенных фенольных соединений в регуляции перекисного окисления липидов в начале инфицирования гороха Rh. leguminosarum при разных температурах"

На правах рукописи

Рудиковская Елена Георгиевна

УЧАСТИЕ ЭНДОГЕННЫХ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В РЕГУЛЯЦИИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В НАЧАЛЕ ИНФИЦИРОВАНИЯ ГОРОХА Ш. ^иттоэагит ПРИ РАЗНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ

03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2004

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск

Научные руководители: кандидат биологических наук,

Л.Е. Макарова

доктор биологических наук

А.К. Глянько

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Г.Б. Боровский,

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск

доктор медицинских наук Л.С. Колесниченко, Иркутский государственный медицинский институт, г. Иркутск

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Защита диссертации состоится "2" июня 2004 г. в 14 ч на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 1243. Факс (3952) 510754; E-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан аяАбигЮ-004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук

Г. П. Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Взаимоотношения высших растений и почвенных микроорганизмов Rhizobiaceae являются одной из интереснейших и сложнейших проблем. Некоторые из этих ассоциаций полезны для растений, т.к. способствуют фиксации атмосферного азота. В тоже время, другие формы бактерий, например, Agrobacterium tumefaciens вызывают заболевания. В дополнение к очевидной агрономической важности изучения растительно-бактериальных взаимодействий, интересно, что симбиотическая ассоциация основана на молекулярном диалоге партнеров: передаче сигнальных молекул и активации специфических генных систем. Известно, что ключевой сигнальной единицей растительно-микроорганизменного симбиоза являются молекулы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот (в дальнейшем мы условно объединим их в термин фенольные соединения - ФС). Некоторые из этих ФС, выделяемые в ризосферу корнями растения хозяина, являются хемоаттрактантами, другие участвуют в экспрессии ризобиальных nod-генов (Geurts, Fransen, 1996; Morris et al., 1998; Тихонович, Проворов, 1998).

При инфицировании как патогенными, так и симбиотическими микроорганизмами, в тканях растений повышается уровень перекиси и супероксидного радикала (Аверьянов, Лапикова, 1988; Ramu et al., 2002). Это должно привести к усилению перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Меньшикова, Зенков, 1993). Ограничить или усилить пероксидацию могут липофильные соединения, находящиеся в области мембран, в том числе ФС. Фенольные антиоксиданты эффективно ингибируют Ог", Ог', ОН и индуцированное им ПОЛ (Рогинский, 1988). По современным представлениям, значение имеют два основных механизма влияния ФС на свободно-радикальные процессы в качестве антиокисидантов. Один из них-это перехват свободных радикалов. Он приводит к образованию нерадикальных продуктов. Такого плана процессы происходят при образовании лигнина (Рогинский, 1988) и полимеризации флаванов (Li, Xie, 2000). Второй механизм - это связывание ионов металлов с переменной валентностью, инициирующих "окисление органических соединений (Владимиров, Арчаков, 1974). При взаимодействии с радикалами основную роль играют ароксильные ОН- группы ФС (Рогинский, 1988).

Одни и те же ФС могут проявлять анти- и прооксидантную активность в зависимости от ситуации. Так подщелачивание среды способствует их аутоокислению (Аверьянов, Лапикова, 1988), при этом возникает возможность генерации супероксидных радикалов. В среде окисления, содержащей ионы Fe, некоторые ФС могут

генерации гидроксильных радикалов (Li, Xie, 2002). j НАЦИОНАЛЬНА* ,

I БИБЛИОТЕКА |

I irsfrm

Зависимость проявления окислительно-восстановительных свойств от рНсреды, возможно, будет иметь значение в растительных клетках при взаимодействии с микроорганизмами. Известно, что в числе быстрых реакций при этих взаимодействиях происходит снижение потенциала мембран и изменение рН как во внеклеточном пространстве, так и в цитоплазме поверхностных клеток (Чиркова, 2002; Хадри, Бисселинг, 2002).

Учитывая все вышесказанное, можно предположить, что содержащаяся в чувствительных к инфекции клетках лабильная группа липофильных ФС может оказывать влияние на уровень свободных радикалов и, соответственно, ПОЛ при условиях изменения рН.

Цель и задачи исследования. Целью представляемой работы было изучение роли липофильных фенольных соединений корней этиолированных проростков Pisum sativum в регуляции перекисного окисления липидов на начальном этапе симбиотического взаимодействия с совместимым эндосимбионтом Rhizobium leguminosarum bv. vicea Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. исследовать количественный и качественный состав эндогенных липофильных фенольных соединений корней этиолированных проростков Pisum sativum и его изменения на первом этапе развития межорганизменного взаимодействия с бактериальным симбионтом Rhizobium leguminosarum;

2. изучить влияние температурных условий выращивания растений на количественный и качественный состав и свойства липофильных фенольных соединений корней Pisum sativum bv. vicea;

3. изучить динамику перекисного окисления липидов в корнях Pisum sativum в начальный период после инфицирования его бактериями Rhizobium leguminosarum bv. vicea;

4. изучить анти- и прооксидантные свойства эндогенных липофильных фенольных соединений в системе in vitro;

5. определить возможные пути реализации регуляторных свойств эндогенных липофильных фенольных соединений из корней гороха, в окислительных процессах (хелатирование ионов металлов переменной валентности, скавенгирование свободных радикалов и т.д.) в корнях Pisum sativum на начальных этапах инфицирования Rhizobium leguminosarum bv. vicea.

Научная новизна. Впервые показано обратимое увеличение уровня перекисного окисления липидов в корнях Pisum sativum, в течение первых шести часов после инокуляции Rhizobium leguminosarum: Максимальное накопление продуктов ПОЛ наблюдается в зонах корня, наиболее восприимчивых к проникновению микросимбионта.

Показаны анти- и прооксидантные свойства ФС, выделенных из корней этиолированных проростков гороха, и их изменения на начальных этапах инфекционного процесса, что может регулировать эндогенное ПОЛ в корнях растения-хозяина.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основе

полученных результатов сделан вывод, что увеличение уровня ПОЛ в корнях Pisum sativum в первые часы после инфицирования их микросимбионтом имеет не столько защитный характер, как при патогенезе, сколько регуляторный, обеспечивающий взаимодействие симбионтов.

Изменения в соотношении, анти- и прооксидантных свойств эндогенных ФС при инфицировании растений Rhizobium leguminosarum являются фактором обуславливающим редокс-регуляцию как ПОЛ, так и взаимодействия симбионтов.

На примере изменений в уровне ПОЛ и содержании ФС, показано существенное замедление межорганизменного взаимодействия при пониженной температуре.

Полученные данные вносят вклад в понимание процессов образования симбиотических ассоциаций.

Результаты исследования анти- и прооксидантных свойств ФС гороха могут представлять интерес для медицины и фармакологии.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 8 работ. Результаты исследований были представлены на IV и V съезде физиологов растений (Москва, 1999, Пенза, 2003), а также на научных сессиях СИФИБРа (2000 и 2002)

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической и экспериментальной частей, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа включает 20 рисунков и 5 таблиц. Список литературы включает около 200 источников, в том числе 140 зарубежных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследований. В качестве растительного материала использовали первичные корни проростков гороха {Pisum sativum L.) сорта Марат селекции Тулунской государственной селекционной станции.

Для исследования использовали клубеньковые бактерии Rhizobium leguminosarum bv. vicea L. производственный штамм CIAM 1026 (вирулентный, конкурентоспособный, эффективный). Штамм получен из коллекции ВНИИ с/х микробиологии (Санкт-Петербург, Пушкин).

Семена проращивали по ранее разработанной схеме (Макарова и др., 1998), в кюветах на фильтровальной бумаге, в термостатах либо при в течение 2 суток, либо при 80С в течение 7 суток, считая от момента замачивания до достижения корнем длины в среднем 25-30 мм для выравнивания их физиологического возраста (исходные). Корни инокулировали бактериями Rhizobium leguminosarum bv. vicea L. (инокулят с титром 2 107 клеток / мл среды из расчета 1 мл / корень) путем орошения в кюветах, водным смывом культуры с твердой среды. Контролем для инокулированных растений служили одновозрастные неинокулированные

проростки, выращенные в аналогичных температурных условиях.

ФС выделяли из растительного материала по разработанной методике (Макарова и др., 1998). Образцы корней гороха взвешивали и фиксировали горячим 96%-ным этанолом. ФС экстрагировали 80%-ным кипящим этанолом, при общем расходе 50 мл на 1 г сырой растительной массы. Затем его выпаривали под вакуумом. Из водного остатка, подкисленного до рН 3-4 с помощью НС1, липофильные ФС извлекали этилацетатом (3-4 кратно, при соотношении объемов 1:1). После испарения растворителя в темноте, в токе холодного воздуха при комнатной температуре. ФС перерастворяли в небольшом объеме 96%-ного этанола.

Содержание ФС в исследуемом растворе определяли по стандартной методике (Запрометов, 1968), с помощью реактива Фолина - Дениса. Оптическую плотность измеряли при 720 нм на спектрофотометре СФ-46 («Ломо», Россия). Для построения калибровочной кривой использовали коммерческий препарат кемпферола ("Sigma", США). Содержание ФС выражали в мкг/г сырой массы корня.

Ванилиновую реакцию проводили по методике А.И.Ермакова с соавт (1987) для исследования наличия в составе ФС флаван-3-олов (катехинов) флаван-3,4-олов (лейкоантоцианидинов) и полимерных соединений содержащих в качестве структурных единиц какие либо из выше приведенных соединений. Оптическую плотность измеряли на СФ-46 («Ломо», Россия), при Х=530 нм. Для расчета концентраций использовали калибровочную кривую построенную по (+)-катехину ("Sigma", США). Содержание соединений положительно реагирующих на ванилин, выражали в мкг/г сырой маесь корня.

Для проведения ВЭЖХ использовали микроколоночный жидкостно? хроматограф «Миллихром А-02» (ЗАО ЭкоНова, Новосибирск). Колонка Silasorb SPH C18, 2x75 мм, эффективность не менее 4.000 т.т. Элюенты: А-0,1% ТФУ (трифторуксусная кислота) в очищенной воде; В- 0,1 % ТФУ Е ацетонитриле. Градиент: от 5 до 100%. Б за 2.500мкл. Скорость потока 15С мкл / мин. Детектор: 210, 230, 260, 280, 300, 310, 330, 360 нм. Температура 35°С. Проба: из экстракта ФС, приготовленного вышеприведенным способом выпаривали этанол и перерастворяли в метиловом спирте; объем пробы 5 мкл.

ТБК-реактивные продукты. Определяли по методике описанной (Владимиров, Арчаков, 1974). Для расчета использовали метод учел поглощения раствором одновременно при трех длинах волн (Hodgers e al.,1999). Поглощение измеряли при 440, 532, 600 нм на СФ-56 («Ломо» Россия).

Диеновые конъюгаты определяли по методике Стальной (1977).

Скавенгирование (перехват) супероксидного радикала. Анализ поводился с использованием метода фоторедукции нитрозолевого синего (Li, Xie, 2000).

Хелатирование ионов Fe. Для обнаружения хелатирующих свойств ФС,

использовали модифицированный «дезоксирибозный анализ» (Haliiwell, Gutteridge, 1987), без внесения в реакционную среду ЭДТА (Li, Xie, 2000).

Прооксидантная активность ФС. Эта методика используется для исследования способности ФС активировать Fe3+ до двухвалентного состояния (Haliiwell, Gutteridge, 1987; Li, Xie, 2000).

Для каждого случая было проведено от 2 до 9 независимых экспериментов, каждый по 3-5 биологических и 2-3 аналитических повторностей. Для всех данных приведены стандартные отклонения. Достоверность различия между вариантами определяли с помощью критерия Стьюдента (Р <, 0,5). Корреляционный анализ проводили с помощью критерия Пирсона (Доспехов, 1979; Тейлор, 1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние инфицирования ризобиями на количественный и качественный состав ФС корней гороха

Как показали проведенные эксперименты, неинокулированные корни этиолированных проростков гороха характеризуются высоким содержанием липофильных фенольных соединений - 400-800 мкг/г сыр. массы (по кемпферольиому эквиваленту). Доминирующую их часть составляют соединения, имеющие положительную реакцию на ванилин: флаван-3-олы (катехины). Как показал кислотный гидролиз, особая черта ФС корней гороха па этой стадии развития растения - большое количество олигомерных форм ФС (проантоцианидинов). Среди соединений разделенных методом ВЭХЖ фракционировано три ванилин-положительных соединения, обнаруженных как в комплексе ФС, выделенных из корней гороха выращенных как при оптимальных температурных условиях (22°С), так и при пониженной адаптивной температуре (8°С).

Для исследования влияния развития растения на изменения количественного и качественного состава ФС, использовали корни этиолированных проростков гороха в следующие временные точки: исходные (двухсуточные проростки для оптимальной температуры и 7 суточные для пониженной) и через 6, 12, 24, и 48 часов. Как было установлено, в корнях растения-хозяина, происходят колебания в составе фенольных соединений, связанные с ростом и развитием растений. При этом температура не оказывает существенного влияния на общее содержание ФС, но вызывает качественные изменения в составе. Возможно, это связано с температурной зависимостью работы ферментов ответственных за синтез катехинов, лейкоантоцианидинов и проантоцианидинов (Singh et al., 1997; Winkel-Shirley, 2001). Одним из таких ферментов является дигидрофлавонол-4-редуктаза.

Для исследования влияния инокуляции на фенольный состав растения-

хозяина, также использовали корни этиолированных проростков гороха в следующие временные точки: исходные (двухсуточные проростки для оптимальной температуры и 7 суточные для пониженной) и через 6, 12,24, и 48 часов после инфицирования Rhizobium leguminosarum. В качестве контроля брали одновозрастные неинокулированные растения.

Как показали результаты, инфицирование бактериями Rhizobium leguminosarum является фактором, влияющим на количественный и качественный состав ФС в корнях растения-хозяина (рис.1). При оптимальной температуре выращивания растений, изменения, связанные с инокуляцией, в общем содержании ФС происходят через 12 часов от ее начала. Качественные же изменения, как видно на примере соединений, имеющих положительную реакцию на ванилин, проявляются уже через 6 часов. Методом ВЭЖХ выделено 2 соединения, с положительной реакцией на ванилин, исчезающих через 24 часа после инокуляции. При этом существенно увеличивается концентрация неидентифицированного фенольного соединения.

Рис. 1. Влияние инокуляции микросимбионтом на общее содержание ФС в корнях гороха и компонентов с положительной реакцией на ванилин (1-контроль, 2-инокулированные). 22°С-температуравыращиваниярастений.

Рис. 2. Вчияние инокуляции микросимбионтом на содержание ФС в корнях гороха и компонентов с положительной реакцией на ванилин (1-контроль, 2-

выделенных из корней гороха, нами была проанализирована их способность ингибировать неиндуцированное (спонтанное) окисление лецитина

22°С 8°С

Рис. 7. Влияние липофильных ФС корней гороха на неиндуцированное (спонтанное) окисление соевого лецитина. 22°С и 8аС- температура выращиваниярастений.

В свежеприготовленный раствор лецитина добавляли ФС, инкубировали в течение 5 суток, в темноте, при температуре 22°С. О ПОЛ судили по накоплению ТБК - реактивных продуктов. Контролем служил образец, не содержащий ФС, его антиоксидантную активность принимали за ноль. Активность ФС оценивали в процентах. Результаты экспериментов представлены на рисунке 7.

Установлено, что практически во всех вариантах выращивания растений, выделенные из них ФС в липидной среде в данных условиях проявляли себя как антиоксиданты, уменьшая перекисное окисление лецитина на 80-85%. При этом температура выращивания и инфицирование растений микросимбионом не оказывала существенного влияния на свойства исследуемых соединений.

Можно предположить, что в данной системе фенольные соединения реализуют свою антиоксидантную активность посредством перехвата липидных радикалов (ЯОг) из реакционной среды. Таким способом, например, реализует свою антиоксидантную активность флавоноид дигидрокверцитин (Теселкин и др., 1996).

Влияние ФС на ПОЛ, индуцированное аскорбатом железа

Эксперименты по исследованию активности ФС, выделенных из корней гороха, при индуцированном, окислении лецитина, где в качестве окисляющего агента нами был выбран аскорбат Fe (аскорбиновая кислота +

РеБОД проводили при температуре 22°С в течение 1 часа, перемешивая. Об интенсивности перекисного окисления, как и ранее, судили по накоплению вторичных продуктов деградации липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

Рис. 8. Влияние липофильных ФСкорней гороха на индуцированное окисление соевого лецитина. 22°С и 8°С -температура выращивания растений.

Как оказалось, антиоксидантная активность фракций ФС, может сильно отличаться от аналогичной в предыдущем эксперименте (рис.8). Показано, что существует зависимость антиоксидантной активности ФС от варианта выращивания растений. Выяснено, что, в присутствие индуктора, температурные условия роста растения и инокуляционный процесс влияют на антиоксидантную активность ФС. Можно заметить, что ПОЛ в корнях и антиоксидантная активность ФС в использованной системе взаимосвязаны. Для нсинфицированных растений, выращенных при оптимальной температуре коэффициент корреляции - г = -0,70, а для инфицированных г = 0,70. Можно отметить четкую отрицательную корреляцию между эндогенным ПОЛ и антиоксидантной активностью ФС из корней, выращенных при Для контрольных (включая исходные проростки) г = -0,84, для инокулированных г = -0,94. Эти данные дают основание предполагать, что условия низкой положительной температуры способствуют формированию более мощной антиоксидантной системы, направленой на выживание растений в неблагоприятных для них условиях существовния.

Видимо, свойства ФС, в этом случае могут проявляться не только в перехвате гидроперекисного радикала (как в предыдущем случае), но и при связывании ионов металлов (Yoshino, Murakami, 1998).

Исследование способности ФС перехватывать супероксидный радикал

(Ог1

По современным представлениям, биохимические механизмы токсичности кислорода включают перекисное окисление липидов и генерацию Н2О2 совместно со свободным супероксидным анион-радикалом (Мерзляк, 1999).

такой ситуации уровня ПОЛ. как универсального механизма запуска стресс-реакций, в литературе пока нет. В связи с этим, мы исследовали динамику изменений уровня ПОЛ в корнях проростков гороха в течение первых двух суток от момента инфицирования их Rhiz,obium leguminosarum

Об уровне ПОЛ судили по накоплению первичных (диеновые конъюгаты - ДК) и вторичных продуктов (таких как малоновый диальдегид), реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК - реактивные).

Содержание ДК в корнях гороха, 22°С

I Содержание ТБК-активных продуктов в

корнях гороха, 22°С

-■»-•г!

исх 6 ч 12 ч 24 ч 48 ч

Рис 5. Содержание первичных (ДК) и вторичных (ТБК-реактивных) продуктов ПОЛ в корнях гороха. 1-контроль; 2-инокулированные. 22°С-температура выращивания растений

Проведенные исследования показали (рис.5), что через 6 часов после инокуляции ризобиями, при оптимальной температуре, в корнях растения-хозяина происходит увеличение, примерно в два раза, содержания продуктов перекисного окисления липидов (как первичных, так и вторичных). Из чего

можно заключить, что взаимодействие с симбионтом для растения является

11

стрессовым. Но в тоже время, подобное увеличение недостаточно для констатации окислительного взрыва той интенсивности, которая характерна для взаимодействия растений с фитопатогеном (Low and Merida, 1996). Одновременно с повышением содержания продуктов ПОЛ, а, следовательно, и АФК, в клетках корней, по-видимому, возникают процессы, направленные на снижение их уровня. В итоге, уровень ПОЛ к 12 часам от момента инокуляции становится даже ниже, чем у одновозрастных неинфицированных растений. По истечении 48 часов, если судить по содержанию ДК, или через 24 часа, если брать во внимание ТБК-реактивные продукты, растение по-видимому, выходит из состояния стресса. Об этом свидетельствует выравнивание уровня перекисного окисления липидов в корнях инокулированных и контрольных растений.

В тоже время необходимо отметить, что эти показатели ПОЛ получены для всего корня, а, как известно из литературных данных (Бауэр, 1985; Хадри и Бисселинг, 2002; Акимова и др., 2002), микросимбионт может прикрепляться и проникать только в определенные участки корня. Поэтому, возможно, и уровень ПОЛ будет отличаться в зонах, разных по восприимчивости к бактериям.

В связи с этим, мы более детально исследовали ПОЛ в разных по восприимчивости к микросимбионту, зонах корня, через 6 часов после инокуляции, при 22°С, в связи с тем, что всплеск перекисного окисления приходится именно на это время. Было обнаружено, что наибольшее содержание продуктов ПОЛ наблюдается именно в участках корня с наибольшим количеством прикрепившихся бактерий (Акимова и др., 2002). Таким образом, увеличение уровня ПОЛ в 2,5 раза в восприимчивом участке по сравнению с невосприимчивым, очевидно, не препятствует, а, даже необходимо, так как способствует, сигнальной трансдукции (Suzuki et al., 1997) и образованию симбиотических ассоциаций. Видимо, некоторое увеличение содержания свободных радикалов необходимо для образования симбиоза, во-первых, потому что они могут экспрессировать гены ранней нодуляции в растениях (Ramu et al, 2002). Во-вторых, из-за того, что при этом образуется фитогормон этилен, без которого, в частности, невозможно скручивание корневых волосков для проникновения микросимбионта (van Spronsen et al., 1995; Tanimoto et al., 1995). Как известно, АЦК-синтаза, основной фермент синтеза этилена, активируется именно посредством влияния свободных радикалов (Konce, Kende, 1979; Legge, Tompson, 1983). Этилен может также образовываться непосредственно в результате перекисного окисления линоленовой кислоты (Sandman, Boger, 1982). Отсутствие же адгезии и проникновения микросимбионта в невосприимчивых зонах корня (Акимова и др., 2002) не сопровождается усилением ПОЛ в этом участке. Таким образом, можно предположить, что увеличение уровня ПОЛ в первые 6 часов после инокуляции растения-хозяина микросимбионтом, может быть связано не только с защитными механизмами растения, но и с созданием условий для проникновения бактерий в корневые волоски, и, следовательно, образования симбиотической ассоциации. Это отличает образование

симбиотической ассоциации от патогенеза. Для получения однозначных ответов на эти вопросы, видимо, необходимо провести эксперименты с бактериями, несовместимыми с Pisum sativum, либо микроорганизмами, не вступающими в симбиоз.

Влияние пониженной температуры и инокуляции микросимбионтом на динамику ПОЛ

В растениях, выращенных при пониженной температуре (80С), содержание продуктов ПОЛ значительно ниже, чем в оптимальном температурном варианте (Рис.6). Эти данные соответствуют результатам В.К. Жирова с соавторами (1982), установившим, что при низкой температуре выращивания не происходит повышения уровня ПОЛ в горохе. В этом температурном варианте, некоторое увеличение продуктов ПОЛ, по сравнению с контролем, наблюдается только через 24 часа после инокуляции растений гороха ризобиями.

Рис. 6. Содержание первичных (ЦК) и вторичных (ТБК-реактивных) продуктов ПОЛ в корнях гороха (пониженная температура) Содержание первичных (ЦК) и вторичных (ТБК-реактивных) продуктов ПОЛ в корнях гороха. 1-контроль; 2-инокулированны&С-температуравыращивания.

Если исходить из того, что увеличение уровня ПОЛ необходимо для начальных взаимодействий симбионтов, можно предположить, что в этих условиях оно замедлено. В пользу этого говорят данные и по отсутствию существенных изменений в содержании ФС в растениях при инокуляции в этих условиях. Подтверждают эти предположения и результаты, полученные Г.П. Акимовой с соавторами (2004), которые показывают отсутствие бактерий, прочно прикрепившихся к поверхности корневых волосков.

Таким образом, можно предположить, что при отсутствии изменений в динамике ПОЛ и содержании ФС, связанных с понижением температуры выращивания растений, существенно задерживается образование симбиотической ассоциации.

Исследование окислительных свойств ФС корней этиолированных проростков гороха

В стрессовых условиях, исключающих поступление источников свободных радикалов или энергии для их образования извне, небольшие увеличения содержания АФК и уровня ПОЛ, видимо, могут происходить либо при разобщении окисления-фосфорилирования, либо при сдвиге соотношения антиоксидантов-прооксидантов в сторону прооксидантов (редокс-регуляция) (Кулинский, 1999). Такие изменения, могут происходить в самом растении на тонком гомеостатическом уровне. При этом они не энергоемки в термодинамическом аспекте. В этом отношении особенно интересны вторичные метаболиты, такие как флавоноиды, т.к. они могут быстро изменять состав и свойства в зависимости от внешних условий (например, инфицировании). Известно, что ФС могут реализовывать свою активность различными способами: взаимодействовать с ионами металлов переменной валентности, обрывать цепи окисления, перехватывать супероксидный анион, гидроксильный и перекисный радикалы. Соотношения компонентов с прооксидантной и антиоксидантной активностями в комплексе ФС могут определять - будет ли окислительный стресс прогрессировать, или его удастся блокировать. Логично предположить, что исследуемые нами ФС корней проростков гороха, при наличии анти- и прооксидантных свойств, могут принимать участие в редокс- регуляции.

Поэтому нашей задачей было - изучить анти- и прооксидантную активность ФС корней гороха, находящихся на начальных этапах симбиотического взаимодействия с Rhiz,obium leguminosarum. Как и в предыдущих экспериментах, исследовали ФС, выделенные из корней этиолированных проростков гороха, выращенных при оптимальной (22°С) и пониженной (8°С) температурах, на разных этапах инокуляционного процесса (исходные, 6, 12, 24, 48 часов после инокуляции) и из контрольных неинфицированных одновозрастных растений.

Влияние ФС на ПОЛ при неиндуцированном ПОЛ

На первом этапе исследований антиоксидантных свойств ФС,

14

инокулированные). 8°С-температуравыращиваниярастений.

При неблагоприятных температурных условиях (8°С) изменения в фенольном составе, при инокуляции, менее выражены (рис. 2). Возможно, это связано с уменьшением количества бактерий, прикрепившихся к корням растения-хозяина (Акимова и др., 2004). С другой стороны, возможно, именно отсутствие заметных изменений в составе ФС ограничивает адгезию бактерий на поверхность корневых волосков.

Исследование ФС в разных зонах корня

Проникновение бактерий в корни растения хозяина происходит неравномерно и определяется наличием зон восприимчивости к инфицированию симбионтом. Важную роль в инициации взаимодействия с ризобиями отводят флавоноидам, которые выделяются корнями в ризосферу именно из клеток зоны, где происходит адгезия и проникновение бактерий (Rao, 1990). Вероятно, различия в составе флавоноидов, экскретируемых разными зонами корней должны определяться содержанием эндогенных ФС соответствующих участков корней.

Чтобы подтвердить это предположение мы исследовали содержание липофильных ФС в участках корня растений, подвергнутых инфицированию Rhizobium leguminosarum в течение 24 часов, при 22 С. В качестве контроля использовали одновозрастные неинфицированные проростки. Корни нарезали на 5 мм фрагменты, начиная от кончика. Равноудаленные фрагменты объединяли в отдельные пробы и определяли в них концентрацию ФС (Рис.3).

Содержание ФС !

!

!-•-1

1 2 3 4 5 6 7 8

номер участка от кончика корня

____!

Рис.3. Содержание липофильных ФС в разных зонах корня через 24 часа после инокуляции (1-контроль; 2-инокулированные).

На рисунке видно, что через 24 после инокуляции локализация ФС резко изменяются. То есть микросимбионт оказывает существенное влияние на содержание и распределение ФС в корне растения-хозяина.

Более того, если сравнить участки корня с максимальным количеством

9

бактерий, проникших или прочно связавшихся с поверхностью через 24 часа после инфицирования (Акимова и др, 2002), с показателями наибольшей концентрации ФС в неинокулированных контрольных растениях, то видно, что их локализация совпадает (рис.4). Коэффициент корреляции составляет 0,86. Можно предположить, что из участков с повышенным содержанием ФС более интенсивно происходит выделение флавоноидных хемоаттрактантов, привлекающих микросимбионты к растению-хозяину. Видимо, поэтому и происходит изменение содержания и локализации ФС через 24 часа после инфицирования.

Рис. 4. Количество бактерий прикрепившихся к корню через 24 ч. после инокуляции (2) и содержание ФС в контрольных одновозрастныхрастениях

(1).

Вполне вероятно, что, изменяя концентрацию и свойства ФС, при взаимодействии с бактериями, растение тем самым может ограничивать количество проникающих ризобий. То есть можно предположить, что растение-хозяин с помощью синтезируемых в нем ФС, регулирует проникновение микросимбионта.

Изучение динамики ПОЛ в корнях проростков гороха

при инокуляции их КМгоЬшт leguminosarum

Результаты выше приведенных исследований показывают, что инокуляция гороха микросимбионтом Rhizobium leguminosarum, приводит к изменению фенольного статуса растения-хозяина. В литературе есть также сведения о некотором увеличении уровня АФК (Ramu et al., 1999) и образования этилена (Хадри и др, 2002) на начальном этапе образования ассоциации. Это может свидетельствовать о том, что при взаимодействии растения с симбионтом, также как и при заражении патогеном, могут усиливаться окислительные процессы. При этом данных по изменению в

При наличии следов солей металлов переменной валентности, Ог*" и Н2О2 могут in vitro реагировать корпоративно, с формированием гидроксильного радикала ОН. Образовавшийся радикал может атаковать и повреждать все известные биомолекулы. Некоторые исследователи полагают, что основной, если не весь, эффект Ог" обусловлен формированием ОН in vitro (Владимиров, Арчаков, 1974). О^ ' может быть генерирован посредством фоторедукции флавинов. Подобные реакции выявляются редукцией нитрозолевого синего до голубого формазана. При этом происходит увеличение поглощения при 560 нм, что может отражать концентрации О2 Добавление перехватчика ингибирует формирование голубого формазана. Данные наших экспериментов представлены на рисунке 8.

На представленных на рис. 9 гистограммах видно, что ФС, выделенные из корней проростков гороха обладают большой активностью в перехвате в не липидной среде. Анализируя данные по оптимальной температуре, можно заметить, что в 6 часовом инокулированном варианте, скавенгирующая активность минимальна. А как показано ранее именно на это время приходится увеличение уровня ПОЛ. Затем скавенгирующая активность ФС увеличивается и сравнивается с контрольной. При этом наблюдается тенденция к стабилизации уровня ПОЛ в корнях растения-хозяина.

Ри с 9. Перехватывание (скавенгирование) супероксидного радикала ФС, выделенными из корней гороха разныхтемпературных (22°С, 8°С) вариантов выращивания. 1-контроль; 2- инокулированные. Ноль-контроль без ФС.

Что же касается активности ФС из корней растений, выращенных при пониженной температуре, то через 6 часов после инокуляции, перехватывающая активность резко увеличивается, что, возможно, и вносит свой вклад в отсутствие изменений в уровне ПОЛ. В месте с тем, оказывается, что через 24 и 48 часов после инокуляции активность соответствующих ФС уменьшается по сравнению с контролем, что может приводить к усилению перекисных процессов (см. рис. 5).

Таким образом, можно утверждать, что способность ФС корней гороха

Комплексы ФС, экстрагированные из корней гороха на разных этапах развития, практически всегда демонстрируют сильное скавенгирование (перехват) супероксидного анион-радикала. Такая эффективность, возможно, связана с полимерной природой некоторых компонентов, входящих в состав исследуемых комплексов ФС, наличие которых показано и в нашем случае. Некоторыми исследованиями показано, в подобной системе при небольших концентрациях (до 100 мкг/мл) мономерные катехины имеют меньшую скавенгирующую активность, чем их полимеры (Li, Xie, 2000). Видимо, такой эффект может быть связан с тем, что полимеризация позволяет увеличить редокс-потенциал, а соответственно и антиоксидантную активность,

мономерных соединений (Uchida et. al., 1987; Packer et al., 1999). Полимеризация же флавоноидов часто связана именно со свободнорадикальными процессами, например, действием Н2О2 (Li, Xie, 2000; Владимиров, Арчаков, 1974). При оптимальной температуре выращивания максимальную прооксидантную активность показывают комплексы из 6 часового контрольного варианта. При пониженной температуре, прооксидантная активность ФС увеличивается начиная с 12 часов экспозиции растений. Таким образом, можно утверждать, что такие свойства ФС зависят от инокуляционного процесса и температуры выращивания растений. Тем не менее, сопоставляя анти- и прооксидантную активности ФС в разных системах, можно отметить, что их антиоксидантные свойства более выражены.

Образование ФС комплексов с металлами

Необходимо учитывать, что некоторые соединения ингибируют ПОЛ благодаря своей способности формировать комплекс с ионами железа. Для того чтобы обнаружить хелатирующие свойства соединений, «дезоксирибозный анализ» проводят без классического хелатора железа -ЭДТА.

Интересно, что фракции липофильных ФС, выделенные из корней гороха, не продемонстрировали существенной хелатирующей активности в данной системе. Такие результаты были не очень понятны, так как различными исследователями показана способность ФС к образованию комплексов с ионами металлов. По литературным данным в первую очередь такие комплексы образуют именно катехины (Morel et al., 1994; Ohyoshi et al., 1999), которые в нашем случае являются мажорными компонентами исследуемых экстрактов ФС. Поэтому возникает вопрос: а если железо уже присутствует в составе исследуемых эндогенных соединений корней гороха.

Исследования, проводились на приборе "AAC vario 6" (Analytik Jena) и показали, что изучаемые ФС действительно содержит ионы железа в концентрации не менее 10-2 М /1 М ФС.

Некоторыми авторами (Ловкова и др., 1999) показана положительная корреляция между содержанием железа и флавоноидов в растениях. Способность ФС корней гороха не только хелатировать, но и активировать

перехватывать супероксидный радикал, зависит от температуры выращивания растений и инокуляционного процесса. Эти качества дают им возможность участвовать в редокс- регуляции.

железо, может играть существенную роль в образовании симбиотических ассоциаций (LeVier et al., 1996).

Наличие в изучаемых комплексах ФС связанного железа, вероятно, служит объяснением установленное отсутствия in vitro хелатирующей активности. А способность некоторых компонентов активировать это железо до двухвалентного состояния, может объяснить, почему появляется такой разброс данных при определении антиоксидантной активности ФС. Таким образом, ФС могут регулировать взаимодействие симбионтов за счет своевременного освобождения и активации железа, необходимого для образования ассоциаций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований показали, что корни этиолированных проростков Pisum sativum характеризуются высоким содержанием липофильных ФС, а также доминированием соединений положительно реагирующих на ванилин: флаван-3-олов (катехины) и олигомерных конъюгированных форм между ними и другими соединениями фенольной природы (проантоцианидины).

Инокуляция растений Pisum sativum симбиотическими бактериями Rhizobium leguminosarum, при оптимальной температуре, сопровождается обратимым увеличением уровня ПОЛ в первые 6 часов после инфицирования. При этом максимальное накопление продуктов ПОЛ отмечено в участке корня, для которого характерно наибольшее количество прикрепившихся бактерий. Увеличение уровня ПОЛ именно в восприимчивой зоне корня в первые часы после инокуляции, очевидно, способствует, сигнальной трансдукции (Suzuki et al., 1997) и образованию ассоциаций между симбионтами.

Слабая выраженность изменений в содержании ФС и продуктов ПОЛ в течении 24 часов после инокуляции при пониженной температуре, в отличие от оптимальной, позволяют предположить, что эта температура замедляет процессы инфицирования и через сутки после инокуляции корень практически не готов к взаимодействию с Rhizobium. Это подтверждают данные, полученные в нашей лаборатории (Акимова и др., 2004).

ФС корней гороха могут выступать в роли анти- и прооксидантов. Антиоксидантная активность проявляется в перехвате липидного и супероксидного радикалов. Как прооксиданты ФС, возможно, реализуются при активировании Fe3+ до Fe2+. Видимо, эти свойства зависят от структуры исследуемых соединений, степени полимеризации олигомеров и сочетания

компонентов. В качестве синергатов могут выступать присутствующие в экстрактах аминокислоты. Свойства ФС различаются в разных вариантах выращивания растений. Проведенные исследования позволяют предположить, что анти- и прооксидантная активность исследуемых ФС, проявляемые in vitro, могут реализовываться in vivo. Известно, что при дефиците низкомолекулярных антиоксидантов, накапливаются АФК и нарастает содержание окисленных веществ. Таким образом, окислительный стресс может возникать не только при избытке АФК и оксидативных модификаций макромолекул, но и при недостатке антиоксидантов (не только абсолютного, но и относительного). Соотношение между прооксидантами и антиоксидантами лежит в основе внутриклеточной редокс-регуляции (Кулинский, 1999) и, конечно, не может не влиять на взаимодействие симбионтов при инокуляции растений.

На количественный и качественный состав ФС корней гороха существенно влияет возраст и температура выращивания растений, а также инокуляционный процесс. Результаты исследований также свидетельствуют о, являются одним из факторов, оказывающих регуляторное действие на процессы симбиотического взаимодействия партнеров том, что содержание ФС в клетках корня растения-хозяина может определять адгезию и последующее проникновение микросимбионта. Эта связь является двусторонней, т.к. растение-хозяин быстро реагирует на ризобии, количественными и качественными изменениями в составе ФС.

Таким образом, липофильные ФС корней гороха через изменение количественного и качественного состава и окислительных свойств при инокуляции, являются одним из факторов, участвующих в регуляции начальных этапов симбиоза, обеспечивая как проникновение бактерий в корень, так и необходимую защиту от их избытка.

ВЫВОДЫ

1. Корни этиолированных проростков Pisum sativum характеризуются высоким содержанием липофильных ФС. Наиболее широко представлены соединения с положительной реакцией на ванилин (катехины и проантоцианидины). На количественный и качественный состав ФС корней гороха существенно влияет возраст растения.

2. Пониженная (80С) температура выращивания растений существенно влияет на состав липофильных ФС. При этом общее содержание ФС, у одновозрастных растений низкотемпературного и контрольного вариантов, отличается не значительно.

3. Инокуляция растений гороха Rh. leguminosarum влияет на содержание и состав фенольных соединений в растении-хозяине: существенные изменения в содержании ФС наблюдаются через 12 часов после инокуляции, тогда как изменения в качественном составе заметны уже через 6 часов и

сохраняются на протяжении всей экспозиции (48 часов).

4. Инокуляция значительно влияет на распределение ФС: резкое снижение в зоне, чувствительной к инфекции и увеличение содержания ФС в невосприимчивой зоне.

5. Инокуляция корней проростков гороха Rh. leguminosarum сопровождается обратимым увеличением уровня перекисного окисления липидов в первые 6 часов после инфицирования. Максимальное накопление продуктов ПОЛ при этом происходит в участке корня, восприимчивом к проникновению бактерий.

6. Пониженная температура значительно снижает эффект инокуляции на содержание и состав ФС, а также уровень ПОЛ, что замедляет инфицирование корней растения - хозяина.

7. Липофильные ФС корней гороха, характеризуются сильными антиоксидантными и менее выраженными проокидантными свойствами.

8. Липофильные ФС корней гороха, соотношение и окислительные свойства которых изменяются при инокуляции RЫz,oЫum leguminosarum , являются одним из факторов, оказывающих регуляторное действие на процессы симбиотического взаимодействия партнеров.

Список работ опубликованных по материалам диссертации

1. Макарова Л.Е., Латышева С.Е., Екимова (Рудиковская) Е.Г. Индукция инокуляцией RЫz,oЫum изменений в составе фенольных соединений / IV-й съезд ВОФР / Тез.- Москва.-1999.- Т.1.- С.229.

2. Макарова Л.Е., Екимова (Рудиковская) Е.Г. О перспективах использования в фармакологии фенольных соединений бобовых растений // В сб.: Новосибирск, изд-во Наука.- 2000.-Т.З.- С.43-46.

3. Макарова Л.Е., Екимова (Рудиковская) Е.Г., Латышева С.Е., Миронова Н.В. Влияние инокуляции Rhiz,obium leguminosarum L. и температуры на содержание в корнях проростков гороха фенольных соединений с антиоксидантными свойствами // Растительные ресурсы 2001,- Вып.1.-С.88-95.

4. Макарова Л.Е., Латышева С.Е., Екимова (Рудиковская) Е.Г. Участие эндогенных фенольных соединений в реакции корней проростков гороха на инокуляцию Rhizobium leguminosarum Ь. при разных температурах // Физиология растений.- 2003.- Т.50.- С.234-240.

5. Макарова Л.Е., Акимова Г.П., Соколова М.Г., Рудиковская Е.Г., Лузова Г.Б. Эндогенные фенольные соединения как регуляторы проникновения и размножения Rhiz,obium leguminosarum Ь. при инфицировании корней // Физиология и биохимия культурных растений.- 2003.- Т.35 (3).- С.61-64.

6. Рудиковская Е.Г., Макарова Л.Е. Участие эндогенных фенольных соединений в регуляции перекисного окисления в начальный период инфицирования гороха бактериями Rhiz,oЫum leguminosarum. Межд. Конференция «Физиология растений- основа фитобиотехнологии / Тез. Пенза, Сент., 2003.- С.72.

7. Макарова Л.Е., Рудиковская Е.Г., Глянько А.К. Роль эндогенных липофильных фенольных соединений в перекисном окислении липидов в корнях гороха при инокулировании их RhizoЫium при разных температурах / VI Симпозиум по фенольным соединениям, апрель, 2004.

8. Макарова Л.Е., Рудиковская Е.Г. Роль эндогенных липофильных фенольных соединений в перекисном окислении липидов в корнях гороха при инокулировании их Rhiz,oЫium при разных температурах // Вестник ХНАУ. Серия Биологическая 2004.- (в печати).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рудиковская, Елена Георгиевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Классификация и свойства флавоноидов.

1.1.1. Природа флавоноидов.

1.1.2. Классификация флавоноидов.

1.1.3. Свойства флавоноидов.

1.1.4. Факторы, влияющие на состав ФС в растениях.

1.2. Активные формы кислорода и антиоксидантная защита в растениях.

1.2.1. Общая характеристика и свойства форм активированного кислорода.

1.2.2. Активные формы кислорода в онтогенезе растений.

1.2.3. Участие фенольных соединений в защите от окислительного стресса.

1.2.4. Влияние абиотических и биотических факторов на окислительную активность ФС.

1.2.5. Синергизм ФС с другими антиоксидантами.

1.3. Мутуалистические взаимодействия бактерий с растениями.

1.3.1. Этапы симбиотического взаимодействия.

1.3.2. Эволюционные и генетические аспекты совместимости Rhizobiaceae с растением-хозяином.

1.3.3. Синтез Nod-фактора.

1.3.4. Флавоноиды как коиндукторы нодуляции.

1.3.5. Влияние температуры и других абиотических факторов на симбиоз.

1.4. Иммунные аспекты растительно-бактериального взаимодействия.

1.4.1. Взаимодействия растений с патогеном.

1.4.2. Ответы растений- симбионтов, сходные с защитными реакциями.

1.4.3. Участие ФС в иммунных реакциях растений.

1.5. Выводы из обзора литературы и постановка задач.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Исследование количественного и качественного состава ФС в корнях этиолированных проростков гороха.

3.1.1. Количественный и качественный состав ФС в корнях проростков гороха и влияние температуры выращивания растений.

3.1.2. Влияние роста и развития растения на содержание в корнях ФС.

3.1.3. Влияние инфицирования ризобиями на количественный и качественный состав ФС в корнях гороха.

3.1.4. Исследование ФС в разных зонах корня.

3.3. Изучение динамики ПОЛ в корнях проростков гороха при инокуляции их Rhizobium leguminosarum.

3.3.1. Динамика ПОЛ в корнях, при оптимальной температуре выращивания растений.

3.3.2. Динамика ПОЛ в корнях при пониженной температуре выращивания растений.

3.2. Исследование анти- и прооксидантных свойств ФС корней гороха.

3.2.1. Влияние ФС на неиндуцированное окисление лецитина.

3.2.2. Влияние ФС на окисление лецитина, индуцированное аскорбатом железа.

3.3.3. Исследование способности ФС перехватывать супероксидный радикал.

3.3.4. Исследование прооксидантной активности ФС.

3.3.5. Взаимодействие ФС с ионами металлов переменной валентности.

3.3.6. Исследование окислительной активности маркерных соединений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие эндогенных фенольных соединений в регуляции перекисного окисления липидов в начале инфицирования гороха Rh. leguminosarum при разных температурах"

Взаимоотношения высших растений и почвенных микроорганизмов Rhizobiaceae являются одной из интереснейших и сложнейших проблем. Некоторые из этих ассоциаций полезны для растений, т.к. способствуют фиксации атмосферного азота. В тоже время, другие формы бактерий, например, Agrobacterium tumefaciens вызывают заболевания. В дополнение к очевидной агрономической важности изучения растительно-бактериальных взаимодействий, интересно, что симбиотическая ассоциация основана на молекулярном диалоге партнеров: передаче сигнальных молекул и активации специфических генных систем. Известно, что ключевой сигнальной единицей растительно-микроорганизменного симбиоза являются молекулы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот (в дальнейшем мы условно объединим их в термин «фенольные * соединения», сокращенно - ФС). Некоторые из этих ФС, выделяемые в ризосферу корнями растения хозяина, являются хемоаттрактантами, другие участвуют в экспрессии ризобиальных nod- генов (Geurts, Fransen, 1996; Morris et al., 1998; Тихонович, Проворов, 1998).

При инфицировании как патогенными, так и симбиотическими микроорганизмами, в тканях растений повышается уровень перекиси и супероксидного радикала (Аверьянов, Лапикова, 1988; Ramu et al., 2002). Это должно привести к усилению перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Меньшикова, Зенков, 1993). Ограничить или усилить пероксидацию могут липофильные соединения, находящиеся в области мембран, в том числе ФС. Фенольные антиоксиданты эффективно ингибируют О2", О21, ОН и индуцированное им ПОЛ (Рогинский, 1988). По современным представлениям, значение имеют два основных механизма влияния ФС на свободно-радикальные процессы в качестве антиокисидантов. Один из них- это перехват свободных радикалов. Он приводит к образованию нерадикальных продуктов. Такого плана процессы происходят при образовании лигнина (Рогинский, 1988) и полимеризации флаванов (Li, Xie, 2000). Второй механизм — это связывание ионов металлов с переменной валентностью, инициирующих окисление органических соединений (Владимиров, Арчаков, 1974). При взаимодействии с радикалами основную роль играют ароксильные ОН- группы ФС (Рогинский, 1988).

Одни и те же ФС могут проявлять анти- и прооксидантную активность в зависимости от ситуации. Так подщелачивание среды способствует их аутоокислению (Аверьянов, Лапикова, 1988), при этом возникает возможность генерации супероксидных радикалов. В среде окисления, содержащей ионы Fe, некоторые ФС могут успешно заменять аскорбат при генерации гидроксильных радикалов (Li, Xie, 2002).

Зависимость проявления окислительно-восстановительных свойств от рН среды, возможно, будет иметь значение в растительных клетках при взаимодействии с микроорганизмами. Известно, что в числе быстрых реакций при этих взаимодействиях происходит снижение потенциала мембран и изменение рН как во внеклеточном пространстве, так и в цитоплазме поверхностных клеток (Чиркова, 2002; Хадри, Бисселинг, 2002).

Учитывая все вышесказанное, можно предположить, что содержащаяся в чувствительных к инфекции клетках лабильная группа липофильных ФС может оказывать влияние на уровень свободных радикалов и, соответственно, ПОЛ при условиях изменения рН.

В связи с этим целью представляемой работы было изучение роли липофильных фенольных соединений корней этиолированных проростков Pisum sativum в регуляции перекисного окисления липидов на начальном этапе симбиотического взаимодействия с совместимым эндосимбионтом Rhizobium leguminosarum L. Для выполнения этой цели .были поставлены следующие задачи:

1) исследовать количественный и качественный состав эндогенных липофильных фенольных соединений корней этиолированных проростков Pisum sativum и его изменения на первом этапе развития межорганизменного взаимодействия с бактериальным симбионтом Rhizobium leguminosarum',

2) изучить влияние температурных условий выращивания растений на количественный и качественный состав и свойства липофильных фенольных соединений корней Pisum sativum;

3) изучить динамику перекисного окисления липидов в корнях

Pisum sativum в начальный период после инфицирования его бактериями Rhizobium leguminosarum;

4) показать наличие у липофильных фенольных соединений в системе in vitro наличия анти- и прооксидантных свойств, которые, возможно, вносят определенный вклад в работу антиоксидантных систем растения;

5) определить возможные пути реализации регуляторных свойств различных эндогенных липофильных фенольных соединений в окислительных процессах (хелатирование ионов металлов переменной валентности, скавенгирование свободных радикалов и т.д.) в корнях Pisum sativum на начальных этапах инфицирования Rhizobium leguminosarum.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Рудиковская, Елена Георгиевна

ВЫВОДЫ

1. Корни этиолированных проростков Pisum sativum характеризуются высоким содержанием липофильных ФС. Наиболее широко представлены соединения с положительной реакцией на ванилин (катехины и проантоцианидины). На количественный и качественный состав ФС корней гороха существенно влияет возраст растения.

2. Пониженная (8°С) температура выращивания растений существенно влияет на состав липофильных ФС. При этом общее содержание ФС. у одновозрастных растений низкотемпературного и контрольного вариантов^отличается не значительно.

3. Инокуляция растений гороха Rh. leguminosarum влияет на содержание и состав фенольных соединений в растении-хозяине: существенные изменения в содержании ФС наблюдаются через 12 часов после инокуляции, тогда как изменения в качественном составе заметны уже через 6 часов и сохраняются на протяжении всей экспозиции (48 часов).

4. Инокуляция значительно влияет на распределение ФС: резкое снижение в зоне, чувствительной к инфекции^ и увеличение содержания ФС в невосприимчивой зоне.

5. Инокуляция корней проростков гороха Rh. leguminosarum сопровождается обратимым, увеличением уровня перекисного окисления липидов в первые 6 часов после инфицирования. Максимальное накопление продуктов ПОЛ при этом происходит в участке корня, восприимчивом к проникновению бактерий.

6. Пониженная температура значительно снижает эффект инокуляции на содержание и состав ФС, а также уровень ПОЛ, что замедляет инфицирование корней растения - хозяина.

7. Липофильные ФС корней гороха, характеризуются сильными антиоксидантными и менее выраженными прооксидантными свойствами.

8. Липофильные ФС корней гороха, соотношение и окислительные свойства которых изменяются при инокуляции Rhizobium leguminosarum , являются одним из факторов, оказывающих регуляторное действие на процессы симбиотического взаимодействия партнеров.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований показали, что корни этиолированных проростков Pisum sativum характеризуются высоким содержанием флавон-3-олов (катехины) и олигомерных конъюгированных форм между ними и другими минорными соединениями фенольной природы (проантоцианидины).

На количественный и качественный состав флавоноидов корней гороха существенно влияет возраст растения. Эти изменения в содержании ФС носят колебательный характер. Показано, что пониженная (8°С) температура выращивания растений существенно влияет на содержание и качественный состав липофильных ФС. При этом если общее содержание ФС после 7 суток выращивания при температуре 8°С становится таким же, как и у растений выращенных в оптимальном температурном режиме (22° С) в течение 2 суток, то качественный состав значительно отличается. Возможно, эти изменения в составе ФС связаны не только с замедлением развития растений на холоде, но и с термозависимостью отдельных ферментов, участвующих в метаболизме фенольных предшественников.

Изучение начальных этапов инфицирования растений гороха бактериями Rhizobium leguminosarum показало, что взаимодействие с симбионтом при оптимальной температуре - фактор, существенно влияющий на фенольный статус растения-хозяина. Изменения происходят как в общем содержании ФС, так и в содержании компонентов имеющих положительную реакцию на ванилин. Методом ВЭЖХ выделено два соединения проантоцианидиновой природы, исчезающих при инокуляции. Содержание ФС в разных зонах корня также различается. Зоны повышенного содержания соединений фенольной природы в контрольных проростках совпадают с участками наиболее восприимчивыми для проникновения бактерий (коэффициент корреляции 0,86). Тогда как через 24 часа после инокуляции содержание ФС имеет обратную зависимость: в восприимчивой зоне содержание ФС снижается.

Такие результаты свидетельствуют о том, что содержание ФС в клетках корня растения-хозяина может определять адгезию и последующее проникновение микросимбионта. Эта связь является двусторонней, т.к. растение-хозяин быстро реагирует на ризобии, изменением фенольного статуса.

Инокуляция растений Pisum sativum симбиотическими бактериями Rhizobium leguminosarum, при оптимальной температуре, сопровождается обратимым увеличением уровня ПОЛ в первые 6 часов после инфицирования. При этом максимальное накопление продуктов ПОЛ отмечено в участке корня, для которого характерно наибольшее количество прикрепившихся бактерий. Увеличение уровня ПОЛ именно в восприимчивой зоне корня в первые часы после инокуляции, очевидно, способствует, сигнальной трансдукции (Suzuki et al., 1997) и образованию ассоциаций между симбионтами.

Концентрация продуктов ПОЛ в корнях растений, выращенных при пониженной температуре, в несколько раз ниже, в сравнении с уровнем, отмечаемым у растений, выросших при оптимальной температуре, как в контрольном, так и в инокулированном вариантах. Низкий уровень ПОЛ у проростков, при пониженной температуре, косвенно свидетельствует о холодостойкости исследуемой культуры. Отсутствие изменений в содержании ФС и продуктов ПОЛ после инокуляции при пониженной температуре, в отличие от оптимальной температуры, позволяет предположить, что пониженная температура замедляет процессы адгезии и проникновения микросимбионта в корни растения-хозяина, что подтверждают данные, полученные в нашей лаборатории (Акимова и др., 2004). Они свидетельствуют, что корень, через 7 суток роста при температуре 8°С, еще не готов к взаимодействию с бактериями.

Липофильные фенольные соединения корней гороха, характеризуются высокой окислительной активностью. Продемонстрирована их сильная антиоксидантная активность в липидной среде при спонтанном окислении мембранных фосфолипидов. При индукции окисления аскорбатом железа проявляется большая зависимость антиоксидантных свойств ФС от температуры выращивания растений и инфицирования симбионтом. Показано, что ФС способны образовывать прочные комплексы с ионами металлов переменной валентности и тем самым, видимо, влиять на окислительные процессы. Исследованные ФС, выделенные из корней гороха, могут также перехватывать супероксидный анион-радикал. Скавенгирующая активность ФС также существенно зависит от условий выращивания растений. Прооксидантная же активность исследуемых ФС, видимо, определяется их способностью восстанавливать Fe3+ до активного Fe2+. В связи с присутствием в экстрактах ФС олигомерных компонентов, возможно также автоокисление флаволанов с образованием АФК, которые по некоторым данным необходимы для экспрессии генов нодуляции.

Видимо, окислительно-восстановительная активность ФС существенно зависит от концентрации и свойств индивидуальных компонентов, присутствующих в суммарной фракции. Имеет, конечно же, значение так же их структура, количество гидроксильных групп, сочетание соединений и связанный с этим синергетический эффект. Высокая активность исследуемых ФС, видимо, так же может объясняться тем, что при полимеризации существенно увеличивается суммарный редокс- потенциал соединения.

Высокая потенциальная окислительная активность исследованных ФС и их способность выступать в роли, как антиоксидантов, так и прооксидантов, позволяет предположить их регуляторную в окислительных процессах in vivo. Известно, что при дефиците низкомолекулярных антиоксидантов, накапливаются АФК и нарастает содержание окисленных веществ. Таким образом, окислительный стресс возникает не только при избытке АФК и оксидативных модификаций макромолекул, но и при недостатке антиоксидантов (не только абсолютного, но и относительного). Следовательно, окислительный стресс- это сдвиг к преобладанию прооксидантов над антиоксидантами. Соотношение между прооксидантами и антиоксидантами лежит в ' основе внутриклеточной редокс-регуляции (Кулинский, 1999). Известно, что для жизнедеятельности живого организма, использующего кислород, необходимо наличие соединений, обладающих антиоксидантной активностью.

Попытаемся с точки зрения наших результатов проанализировать первый этап симбиотического взаимодействия. В бобово-ризобиальном симбиозе роль элиситора выполняет Nod-фактор. Восприимчив к нему только определенный небольшой участок корня. Под воздействием Nod-фактора рН цитозоля подщелачивается в течение 15-20 секунд. Изменение рН среды влияет на окислительные свойства ФС и, тем самым, сдвигать баланс между анти- и прооксидантами в сторону прооксидантов. При этом может увеличиваться содержание эндогенных АФК и, соответственно, уровень ПОЛ в восприимчивых зонах корня. Вероятно, увеличение уровня ПОЛ и изменения в составе ФС, наблюдаемые уже через 6 часов после инфицирования, необходимы для образования симбиотической ассоциации. Отсутствие же подобных изменений при пониженной температуре, может служить показателем того, что взаимодействие с симбионтом не происходит, поскольку вероятно растение в силу своего физиологического состояния (замедленный рост) в этих условиях еще не готово взаимодействовать с ризобиями. Вероятно сдвиг редокс-регуляции в сторону прооксидантов, также имеет характер регуляторного действия на процесс формирования симбиотической ассоциации.

Таким образом, липофильные ФС корней гороха через изменение количественного и качественного состава и окислительных свойств при инокуляции, являются одним из факторов, участвующих в регуляции начальных этапов симбиоза, обеспечивая как проникновение бактерий в корень, так и необходимую защиту от их избытка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рудиковская, Елена Георгиевна, Иркутск

1. Аверьянов А. А., Лапикова В.П. Генерация кислородных радикалов фенольными соединениями // Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине, Рига: Мед. Ин-т,- 1988.-С.203-222.

2. Айвазов Б.В. Введение в хроматографию.- М.: Высшая школа.-1983.- 240 с.

3. Акимова Г.П., Соколова М.Г., Нечаева Л.В. Влияние инокуляции Rhizobium leguminosarum на рост корней гороха при пониженной температуре // Физиология растений.- 1999.- 46, №5.- С.806-810.

4. Акимова Г.П., Соколова М.Г., Нечаева Л.В., Лузова Г.Б., Сидорова К.К. Роль пероксидазы во взаимодействиях растений гороха с Rhizobium II Агрохимия.- 2002.- № 12.- С.37-41.

5. Афанасьев И.Б. Свободные радикалы и процессы жизнедеятельности // Кислородные радикалы в химии и биологии.-Минск: Наука и техника, 1984.-С. 13-29.

6. Бандюкова В.А., Чреватый B.C. Антибактериальная активность флавоноидов некоторых видов цветковых растений // Раст. Реурсы.-1987.- Т.23 (4).- С.23-29.

7. Барабой В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов // Успехи современной биологии,- 1991.- Т. 111 (6).-С.923-931.

8. Бауэр В.Г. Инициация заражения бобовых клубеньковыми бактериями // Инфекционные болезни растений. Физиологические и биохимические основы.- М. Агропрмиздат, 1985.- С.69-87.

9. Бриттон Г. Биохимия природных пигментов.- М.: Мир.- 1986.- 422с.

10. Васильева Г.Г., Миронова Н.В., Глянько А.К., Шепотько JI.H. Генерация супероксидных радикалов в проростках гороха при инокуляции азотфиксирующими бактериями разной совместимости // С.-х. биология.- 2001.- № 3.- С.79-83.

11. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Чернавский Д.С. Стресс у растений. М.: Изд-во МГУ, 1993. 145 с.

12. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М., 1974.- 264 с.

13. Воробьев В.А., Замащикова O.JI. Особенности формирования корневых клубеньков гороха при пониженной температуре // Физиол. И биохим. Культ. Растений.- 1987.-Т.19 (2).- С.137-142.

14. Воробьев В.А. Симбиотическая азотфиксация и температура. Новосибирск: Наука, 1998. 126 с.

15. Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции / Под ред. И.А.Тихоновича, Н.А.Проворова.- СПб: Наука.- 1998.- 194 с.

16. Генкель П.А. Физиология жаро- и засухоустойчивости растений. М., Наука, 1982.- 280 с.

17. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений: В 2-х т.-Т.2.- М.: Мир.- 1986.-312 с.

18. Доросинский JI.M. Вопросы экологии клубеньковых бактерий// Успехи микробиологии.- 1975.- Вып. 10.- С.201.

19. Доспехов Б.А. Методика проведения полевого опыта.- М.: Агропромиздат, 1985.-351 с.

20. Доуни Дж.А. Функции ризобиальных генов клубенькообразования // Rhizobiaceae Санкт-Петербург.- 2002,-С.417-434.

21. Жиров В.К., Мерзляк М.Н., Кузнецов JI.B. Прекисное окисление мембранных липидов холодостойких растений при повреждении отрицательными температурами // Физиология растений.- 1982.- Т.29 (6).- С. 1045-1052.

22. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений- М.: Высш. шк., 1968.-213 с.

23. Запрометов М.Н. Новые направления в физиологии растений. М.: Наука, 1985. С. 143-162.

24. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях.- М.: Наука, 1993.- 272 с.

25. Канненберг Э., Реус Б., Форсберг С., Карлсон Р. Липополисахариды и К-антигены: структура, биосинтез и функции // Rhizobiaceae.- Санкт-Петербург.- 2002.- С.143-178.

26. Карпунина Л.В. Значение углевод-белкового узнавания и роль лектинов при формировании различного рода азотфиксирующих систем // Успехи современной биологии.- 2002.- Т. 122 (6).- С.548-556.

27. Комисаренко Н.Ф., Дмитрук С.Е., Комисаренко А.Н. Антигрибковая активность некоторых природных флавоноидов, кумаринов и антрахинонов // Растительные ресурсы.- 1991.- Т.27 (1).-С.27-34.

28. Кузовкина И.Н., Гусева. А.Н., Альтерман И.Е., Карначук Р.А. Образование флавоноидов в pRi Т-ДНК трансформированных корнях шлемника байкальского и способы его регуляции // Физиология растений.- 2001.- Т.48 (4).- С.523-528.

29. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита // Соросовский образовательный журнал.- 1999.- №1.- С.2-7.

30. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х т.- Т.1.- М.: Мир.- 1985.386 с.

31. Ловкова М.Я., Рабинович A.M., Понаморева С.М. и др. Почему растения лечат.- М.: Наука.- 1990.- 256 с.

32. Лутова Л.А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н., Тихонович И.А. Генетика развития растений.- СПб.: Наука.- 2000.- 344-384.

33. Макарова Л.Е., Родченоко О.П. Содержание фенолкарбоновых кислот в клетках корней кукурузы, различающихся по устойчивости к низким температурам // ДАН.- 1984.- Т.279 (5).- С.824-832.

34. Макарова Л.Е. Локализация фенольных соединений в тканях корня кукурузы в условиях низкой положительной температуры // Физиология и биохимия культурных растений.- 1994.- Т.26 (1).- С.45-50.

35. Макарова Л.Е., Лузова Г.Б., Ломовацкая Л.А. Роль эндогенных фенольных соединений в инфицировании Rhizobium leguminosarun корней гороха при низкой температуре // Физиология растений.- 1998.-Т.45 (6).- С.824-832.

36. Максимов О.Б., Ребачук Н.М., Богуславская Л.Б. Скрининг для обнаружения антиоксидантной активности в экстрактах из растений// Растительные ресурсы. 1985. Т.21, вып.2. С. 216-220.

37. Меныцикова Е.Е., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Успехи современной биологии.- 1993.- Т.113. вып.4.- С.442-455.

38. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки // Итоги науки и техники.

39. Сер. Физиология растений / Под ред. И.И. Иванова.-М.-1989.- Т.6.- 165 с.

40. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и жизнедеятельность растений // Соросовский образовательный журнал. 1999, №9, С. 20-26. Методы биохимического исследования растений /А.И Ермаков,

41. B.В.Арсимович, Н.П.Ярош и др.; Под. Ред. А.И.Ермакова.- JI.: Агропромиздат. Ленингр. отд-ие, 1987.-е. 111-116.

42. Проворов Н.А. Происхождение и эволюция бобово-ризобиального симбиоза // Известия АН, серия Биологическая.- 1991.- №1.- С.77-87.

43. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод опредиления малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии.- 1977.- М.: «Медицина».- С.66-68.

44. Тейлор Дж. Введение в теорию ошибок. М.- 1985.- 211 с. Телятьев В.В. Полезные растения Центральной Сибири,- Вост.-Сиб. книжное из-во,- 1985,- 384 с.

45. Теселкин Ю.А., Жамбалова Б. А. Бабенкова И.В. и др Антиоксидантные свойства дигидрокверцитина // Биофизика.- 1996.-Т.41.-вып.З.- С.620-623.

46. Физиология и биохимия сельско-хозяйственных растений. Под.ред. Третьякова Н.Н.// М.: Колос.- 2000.-640 с.

47. Хадри А.-Е., Спайк Г., Бисселинг Т., Бревин Н. Разнообразие процессов образования корневых клубеньков и их инфицирование ризобиями // Rhizobiaceae .- 2002.- Россельхозакадемия: С.-Петербург.1. C.373- 388.

48. Хадри А-Е., БисселингТ. Реакции растения на Nod-факторы // Rhizobiaceae.- 2002,- Россельхозакадемия: С.-Петербург.- С.435-450.

49. Хайнес М., Финан Т. Общая генетика // Rhizobiaceae .- 2002.-Россельхозакадемия: С.-Петербург.- С.41-62.

50. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений.-Изд-во Санкт-Петербургского ун-та.- 2002.- 244 с.

51. Шламан X., Филлипс Д., Кондороши Е. Генетическая организация и транскрипционная регуляция генов ризобий, контролирующих образование клубеньков // Rhizobiaceae .- 2002.- Россельхозакадемия: С.-Петербург.- С.389-416.

52. Эммануэль Н.М., Лясковская Ю.Н. Физико-химические основы применения фенольных соединений в химии и биологии // Фенольные соединения и их биологические функции.- М.: Наука.- 1968.- С.359.

53. Albrecht Н., Yoder J.I., Phillips D.A. Flavonoids promote haustoria formation in the root parasite Triphysaria versicolor // Plant Phisiol. 1999. -Vol.119.- P.585-591.

54. Andersen R.A., Kasperbauer MJ. Effects of near-ultraviolet radiation and temperature on soluble phenols in Nicotiana tabacum И Phytochemistry.- 1971.- Vol.10 (6).- P. 1229-1232.

55. Aruoma O.I., Murcia A.M., Butler J. and al. Evaluation of the Antioxidant and Pro-oxidant actions of gallic acid and its derivationes // J. Agric. Food Chem.- 1993.- Vol.41.- P.1880-1885.

56. Aust S.D., Morehouse L.A., Thomas C.E. Role of metals in oxygen radical reactions // J. Free Rad. Biol. Med.- 1985.-Vol.1, №3.- P.3-25.

57. Baker M.E., Zambrysky P, Staskawicz В., Dinesh-Kumar S.P. Signaling in plant-microbe interactions // Science.- 1997.- Vol.276.- P.726-733.

58. Baron С., Zambryski P.C. The plant response in pathogenesis, symbiosis, and wounding: Variations on a common theme? // Annu. Rev. Genet.- 1995.-Vol.29.- P.107-129.

59. Barz W., Mackenbrock V. Constitutive and elicitation induced metabolism of isoflavones and pterocarpans in chickpea (Cicer arietinum) cell suspension cultures // Plant cell, tissue organ cult.- 1994.-Vol.38 (2/3).- P.199-211.

60. Bate-Smith E.C. Phytochemistry of proantocyanidins // Phytochemistry.- 1975.- Vol. 14.- P. 1107-1113.

61. Bergman K., Gulash-Hoffee M., Hovestadt R.E., Ronco P.G.II., Su L. Physiology of behavioral mutants of Rhizobium meliloti: evidence for dual chemotaxis pathway // J. Bacterid.- 1988.- Vol. 170 (7).- P. 3249-3254.

62. Bohm B.A. // The flavonoids. L.: Chapman and Hall, 1975. P. 442-504.

63. Bors W., Michel C., Schikora S. Interaction of flavonoids with ascorbate and determination of univalent redox potential: a pulse radiolysis study // Free Radic. Biol. Med.- 1995.- Vol.19.- P.45-52.

64. Bousquet J.F., Thimann K. Lipid peroxidation forms ethylene from 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid and operate in leaf senescence // Proc. Natl. Acad. USA.- 1984.- Vol.81 (6).- P.1724-1727.

65. Buettner G.R. The pecking order of free radicals and antioxidants lipid peroxidation alpha tocopherol and ascorbat // Arch. Biochem. Biophis.-1993.- Vol.300.- P.535-543.

66. Byczkowski J.Z., Gessner T. Biological role of superoxide ion-radical // Int. J. Biochem.- 1998.- Vol.20, №6. P.569-580.

67. Caldwell M.M., Robberecht R., Flint S.D. Internal filters: prospects for UV-acclimation in higher plants // Physiol Plant.- 1983.- Vol.58.- P.445-450.

68. Carlson R.W., Price N.P.J., Stacey G. The biosynthesis of rhizobial lipooligosacharide nodulation signal molecules // Mol. Plant-Microbe Interact. —1994.- Vol.7.- P.684-695.

69. Cedergren R.A., Lee J.G., Ross K.L. Common links in the structure and cellular localization of Rhizobium chitolipooligosaccharides and general Rhizobium membrane phospholipid and glycolipid components // Biochemistry.- 1995.- Vol.34.- P.4467-4477.

70. Chumei Li, Bijun Xie. Evaluation of the Antioxidant and Pro-oxidant Effects of tea Catechin Oxypolimers // J. Agric. Food Chem.- 2000.-Vol.48.- P.6362-6366.

71. Dakora F.D., Joseph C.M., Phillips D.A. Alfalfa (.Medicago sativa L.) root exudates contein isoflavonoids in the presence of Rhizobium melilotell Plant Physiol.- 1993.-Vol. 101.-P. 819-824.

72. Decker D.A. Phenolics: prooxidant or antioxidants // Nutr. Rev.- 1997.-Vol.55.- P.396-398.

73. Elstner E.F. Comparison of "inflammation" in pine tree and humans // Oxygen radicals in Chemistry and Biology / Eds. W.Bors, M.Saran, D.Tait.- Berlin, N.Y.: Walter de Gruyter.- 1984.- P. 770-775.

74. Ehrhardt D.W, Wais R., Long S.R. Calcium spiking in plant root hairs responding to Rhizobium nodulation signals // Cell.- 1996,- Vol.85.- P.673-681.

75. Feucht W., Treutter D., Crist E. Flavonoids in grapevine: In vitro accumulation and defence reactions in shoots // Vitis.- 1996.- Vol.35 (3).-P.113-118.

76. Firmin J.L., Wilson K.E., Rossen L. And al. Flavonoid activation of nodulation genes in Rhizobium reversed by other compounds present in plants // Natura.- 1986. Vol.324. - P.90-92.

77. Friend J. The biochemistry of plant phenolic compounds. Oxford: Clarendon press.-1985.- P.367-392.

78. Gebicki J.M., Bielski B.H.J. Comparison of the capacities of the perhydroxyl and superoxide radicals to initiate chain oxidation of linoleic acid // J. Amer. Chem. Soc.-1981.- Vol.103 .-P.7020-7027.

79. Geurts R., Fransen H. Signal transduction in Rhizobium-induced nodule formation // Plant physiol.- 1996.- Vol.l 12 (2).- P.447-453.

80. Hagerman A.T, Riedl K.M., Jones G.A. High molecular weight plant polyphenolics (tannins) as biological antioxidants // J. Agric. Food Chem. -1998.- Vol.46.- P.1887-1892.

81. Hagmann M.L., Heller W., Grisebach H. Induction and characterization of a microsomal flavonoid 3-hydroxylase from parsley cell cultures // Eur: J. Biochem.- 1983.- Vol.134 (3).- P.547-554.

82. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition and desease // Biochem. J.-1984. Vol.219, №1. - P. 1-14.

83. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. The deoxyribose method: a simple "test-tube" assay for "Determination of rate constants for reactions of hidroxyl radical // Analytical Biochem.- 1987.- Vol.164 (4).- P.815-819.

84. Handa B.K., Chexal K.K., Rahman W. Cycadaceae: Occurrence of bisflavones in Zamia// Phytochemistry. 1971.- Vol.l0(2).- P.436.

85. Harborne J.B. // Comparative biochemistry of flavonoids. L.: Acad. Press, 1967. P.383

86. Harborne J.B. // The flavonoids. L.: Chapman and Hall.-1975.- P.1056-1095.

87. Hartwing U.A., Phillips D.A. Release and modification of nod-gene-inducing flavonoids from Alfalfa seeds // Plant Physiol. 1991.- Vol.95(3).-P.804-807.

88. Haslam E. // The biochemistry of plant phenolics. Oxford: Clarendon press. 1985.-P.237-256.

89. Haslam E. // The flavonoids: Advences in research. L.: Chapman and Hall. 1982.-P. 417-447.

90. Heidstra R., Guerts R., Franssen H. Root hair deformation activity of nodulation factor and their fate on Vicia sativa // Plant. Physiol. 1994.-Vol.105.- P.787-797.

91. Hildebrand D.F. Lipoxigenases // Phisiol. Plant.- 1989.- Vol.76.- P.249253.

92. Hirch A.M., Lum M.R., Downie A. What makes the Rhizobia-Legume symbiosis so special? // Plant Physiology. 2001. - Vol.127. - P. 1484-1492.

93. Howieson J.G. Rhizobial persistence and its role in the development of sustainable agricultural systems in Mediterranean environments // Soil Biol. Biochem.- 1985.- Vol.27(4-5).- P.603-610.

94. Jones W.T., Broadhurst R.B., Lyttleton J.W. The condensed tannins of pasture legume species // Phytochemistry. -1976.- Vol.15.- P. 1407-1409.

95. Jovanovic S.V, Steeken S., Tosic V., Marjanovic B. Simic M.G. Flavonoids as antioxidants // J.Am.Chem. Soc. 1994.-Vol.116.- P. 48464851.

96. Kamst E., Pilling J., Raamsdonk L.M. Rhizobium nodulation protein NodC is an important determinant of chitin oligosaccharide chain length in Nod factor biosynthesis // J. bacterial.- 1997.- Vol.179 (7).- P.2103-2108.

97. Knight C.D., Rossen L., Robertson J.G. Nodulation inhibition by Rhizobium leguminosarum multicopy nodABC genes and analysis of early stages of plant infection // J. Bacteriol.- 1986.- Vol.166 (2).- P.553-558.

98. Konce J.R., Kende H. Ethylene formation from 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid in homogenates of etiolated pea seedlings // Planta.- 1979.-Vol.146.- P.293-301.

99. Kosslak R.M., Joshi R.S., Bowen B.A. and al. Strain-specific inhibition of nod gene induction in Bradyrhizobium japonicum by flavonoid compounds // Appl. Environ. Microbiol.-1990. Vol.56(5).- P.1333-1341.

100. Strange K.K., Bender G.L., Djordjevic M.A. Factors determining host recognition in the clover-Rhizobium symbiosis // Mol. Plant-Microbe Interact.- 1990.- Vol.3.- P.214-220.

101. Vier K., Day D.A., Guerinot M.L. Iron uptake by symbiosomes from soybean root nodules // Plant Phisiol.- 1996.- Vol.111 (3).- P. 893-900.

102. Martinez E. Recent developments in Rhizobium genom // Plant and Soil. 1994.- Vol. 161.- P. 11 -20.

103. McClure J.W. Physiology and function of flavonoids. In The Flavonoids. Edited by Harborne J.B.- P.970-1055.- Chapmman and Hall, London.

104. McDougal K.M., Parks C.R. Elevational variation in foliar flavonoids of Quercus rubra L. (Fagaceae) // American journal of botany.- 1984.-Vol.71 (3).- P. 301-308.

105. Medhy M. Active oxygen species in plant defense against patogenens // Plant Phisiol.- 1994.- Vol.105.- P.467-472.

106. Mergaert P., D'aeze W., Geelen D. Biosynthesis of Azorhizobium caulinodans Nod factors. Study of the activity of the Nod ABC proteins byexpression of the genes in Escherichia coli II J. Biol. Chem.- 1995.-Vol.270.- P.29217-29223.

107. Morris P.F., Bone E., Tyler B.M. Chemotropic and contact responses of Phytophthora sojae hyphae to soybean isoflavonoids and artificial substrates // Plant Phisiol.- 1998.- Vol.117.- P. 1171-1178.

108. Morel L., Lescoat G., Cillard P., Cillard J. Role of flavonoids and iron chelating in antioxidant action // Metods Enzimol.- 1994.- Vol. 234.- P.437-443.

109. Natividad C., Carlos E.J., Carlos G.-M. Role of ecological variables in the seasonal variation of flavonoid content of Cistus ladanifer exudates // J. Chem. Ecol.- 1997.- Vol.23 (3).- P.575-603.

110. Neill S.O., Gould K.S. Anthocyanins in leaves: light attenuators or antioxidants? // Functional Plant Biology. 2003.- Vol.30.- P.865-873.

111. Novak K., Lisa L., Skredleta V. Rhizobial nod gene-inducing activity in pea nodulation mutants: dissociation of nodulation and flavonoid response // Phisiol. Plant. 2004.- Vol.120.- Р.546-555/

112. Ohyoshi E., Sakata Т., Kurihara M. Complexation of aluminium with (-)-epigallocathechin gallate studied by spectrophotomrtry // J.of Inorganic Biochemistry.- 1999.- Vol.73.- P.31-34.

113. Oldroud G.E., Engstrom E.M., Long S.R. Ethylene inhibits the Nod factor signal transduction pathway of Medicago trunatula II Plant Cell.-2001.- Vol.13 (8).- P.35-49.

114. Onyilagha J.C., Malhotra В., Elder M., French C.J., Towrs G.H.N. Comparative studies of inhibitory activities of chalcones on tomato ringspot virus (ToRSV) // Can. J. plant pathol.- 1997.- Vol.19 (2).- P.133-137.

115. Packer L, Rimbach G., Virgily F. Antioxidant activity and biologic properties of a procyanidin-rich extract from pine (Pinus maritima) bark, Picnogenol // Free Rad. Biol. Med.- 1999.- Vol.27, N 5-6.- P.704-736.

116. Paiva N.L., Oommen A., Harrison M.J., Dixon R.A. Regulation of isoflavonoid metabolism in alfalfa I I Plant Cell, Tissue and Organ Cult.-1994.- Vol.38 (2-3).- P.213-220.

117. Parniske M., Ahlborn b., Werner D. Isoflavonoid inducible resistance to the phytoalexin glyceollin in soybean rhizobia // J. Bacteriol.- 1991.-Vol.173.- P.3432-3439.

118. Penmetsa V.R., Cook D.R. A legume ethylene-insensitive mutant hyperinfected by its rhizobial and symbiont // Science.- 1997.- Vol.275.-P.527-530.

119. Peters N.K., Long S.R. Alfalfa root exudates and compounds which promoute or inhibit induction of Rhizobium meliloti nodulation genes // Plant Physiol.- 1988.- Vol.88(2).- P.396-400.

120. Peters N.K., Verma D.P.S. Phenolic compounds as regulators of gene expression in plant-microbe interactions // Mol. Plant-Microbe Interact. -1990.- Vol.3(l).- P.4-8.

121. Phillips D.A, Wery J., Joseph C.M. and al. Release of flavonoids and betaines from seeds of seven medicago species // Crop Sci.- 1995.- Vol. 35(3).- P.803-808.

122. Puepke S.G., Bolanos-Vasquez M.C., Werner D. Release of flavonoids by the soybean cultivars Mc Call and Peking and there perception as signals by the nitrogen-fixing symbiont Sinirhizobium fredii II Plant Phisiol.- 1998.-Vol. 117(3).- P.599-608.

123. Ramu S.K., Peng H.M., Cook D.R. Rhizobial nod factor triggers a spatially localized oxidative burst that is implicated in early nodulin regulation. (Absr.). Int. Society for Mol. Plant.-Microb. Interact, St. Paul, MN.-1999.

124. Ramu S.K., Peng H.M., Cook D.R. Nod factor induction of reactive oxygen species production is correlated with expression of the earlynoduline gene ripl in Medicago trancatula II Mol. Plant-Microbe Int.-2002.- Vol. 15, N 6.- P. 522-528.

125. Rao A.S. Root flavonoids I I Bot. Rev. 1990. - Vol.56, N 1.- P.l-84.

126. Rao J.R., Cooper J.E. Soybean nodulating Rhizobia modify nod gene inducers daidzein and genistein to yield aromatic products that can influence gene-inducing activity // Mol. Plant-Microbe Interact.- 1995.- Vol.8 (6).-P.885-862.

127. Ravanel P., Tissut M., Douce P. Platanetin: a potent natural uncoupler and inhibitor of the exogenous NADH dehydrogenase in intact plant mitochondria // Plant Phisiol. -1986,- Vol.80.- P.500-504.

128. Richardson A.E., Djordjevic M.A. Expression of noduation genes inRhizobium and acid-sentivity of nodule formation // Austral. J. Plant Physiol.- 1989.- Vol.16 (4).- P.l 17-129.

129. Rolfe B.G. and Gresshoff P.M. Genetic analysis of legume nodule iniation // Annu Rev. Plant Phisiol Plant Mol. Biol. 1988.- Vol.39.- P.297-319.

130. Roth L.T., Stacey G. Bacterium release into host cells of nitrogen-fixing soybean nodules: the symbiosome membrane comes from three sources // Eur. J.Cell. Biol. 1989. - Vol.49. - P.13-23.

131. Rusterucci C., Stallaert V., Milat M.-L. Relationship between active oxygen species, lipid peroxidation, necrosis, and phytoalexin production induced by elicitins in Nicotiana II Plant Phisiol.- 1996.- Vol.111 (3).-P.885-891.

132. Sandman G., Boger P. Volative hydrocarbons from photosynthetic membranes containing different fatty acids // Lipids.- 1982.- Vol.17 (1).-P.35-41.1..

133. Sanginga N., Danso S.K.A., Zapata E. Field measurements of nitrogen fixation in leguminous trees used in agroforestry systems: influence of 15Nlabeling approaches and reference trees // Biol, fertil. Soils.- 1996,- Vol.23 (1).- P.26-32.

134. Santos R., Herouart D., Sigaud S., Touati D., Puppo A. Oxidative burst in alfalfa- Sinorhizobium meliloti symbiotic interaction // Mol. Plant-Microbe Interactions.- 2001.- Vol.14 (1).- P.86-89.

135. Schreiber W. Action of horseradish peroxidase upon some flavones // FEBS Lett Fed Eur Biochem Soc.- 1974.- Vol.41 (1).- P.50-52.

136. Sequeira L. Plant-bacterial interaction // Cellular interaction.- Springer-Verlag.- 1984.- C. 184-211.

137. Shaw S.L., Long S.R. Nod factor inhibition of reactive oxygen efflux in a host legume // Plant Phis.- 2003.- Vol.132 (4).- 2196-2204.

138. Shen S., Yang X., Zhao В., Xin W. The free radical mechanism of tea poliphenol's pro-oxidant action in vitro // Tea Sci.- 1992.- Vol.12.- P.145-150.

139. Schlaman H.R.M, Okker R.J.H., Lugtenberg B.J.J. Regulation of nodulation gene expression by NodD in rhizobia // J. Bacteriol.- 1992.-Vol. 174 (16).- P.5177-5182.

140. Singh S., McCallum J., Gruber M.Y., Towersw G.H.N., Muir A.D., Bohm B.A., Koupai-Adyazani M.R., Glass A.D.M. Biosynthesis of flavan-3-ols by extracts of Onobrychis viciifolia II Phytochemistry.- 1997.-Vol.44.- P.425-432.

141. Stafford H.A.// Flavonoids Metabolism, CRC Press, Boca Raton, USA, 1990.

142. Storz G., Tartaglia L.A., Ames В .A. Transcriptional regulator of oxidative stress- inducible genes: direct activation by oxidation // Science.-1990.- Vol.248.- P.407-413.

143. Suzuki Y.J., Forman H. J., Sevanian A. Oxidants as stimulators of signal transduction // Free Radic. Biol. Med.- 1997.- Vol.22.- P.269-285.

144. Takahama U. Oxidation of flavonols by hydrogen peroxide in epidermal and guard cells of Vicia faba L. // Plant Cell Phisiol.- 1988.-Vol.29 (3).- P.433-438.

145. Tanimoto M, Roberts K., Dolan L. Ethylene is a positive regulator of root hair development in Arabidopsis thaliana // Plant J.- 1995.- Vol.8 (6).-P.943-948.

146. Tarfhama U. A role of hydrogen peroxide in the metabolism of phenolics in mesophyll cells of Vicia faba L. I I Plant Cell Phisiol.- 1989.-Vol.30 (2).- P.295-301.

147. Timberlake C.F., Bridle P. // The flavonoids. L.: Chapman and Hall. -1975.-P. 214-266.

148. Torel J.,Cillard J., Cillard P. Antioxidant activity of flavonoids and reactivity with peroxyl radical // Phytochemistry.- 1986.- Vol.25.- P.383-385.

149. Vasse J., de Bully., Truchet J. Abortion in infection during the Rhizobium meliloti- Alfalfa symbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reactive reaction // Plant J. 1993.- Vol.4.- P.555-565.

150. Venisse J.S., Gullner G., Brisset M. N. Evidence for the involvement of oxidative stress in the initiation of infection of pear by Erwinia amylovora II Plant Physiol. 2001.- Vol.125.- P.2164-2172.

151. Vierstra R.D., John T.R., Poff K.L. Kaempferol 3-O-galactoside, 7-0-rhamnoside is the major green fluorescing compound in the epidermis of Viciafaba /I Plant Physiol.- 1982.- Vol.69 (2).- P.522.

152. Wang S.Y., Zheng W. Effect of plant growth temperature on antioxidant capacity in strawberry // J. Agric. Food Chem.- 2001.- Vol.49.-P.4977-4982.

153. Werner D. Physiology of nitrogen-fixing legume nodules: compartments and functions // Biological nitrogen fixation. New-York-London. 1992. - P.399-431.

154. Winkel-Shirley B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology // Plant Phisiol.-2001.- Vol.126.- P.485-493.

155. Wollenweber E., Dietz V.H. Occurrence and distribution of free flavonoid aglycones in plant // Phytochemistry. 1981. - Vol.20. - P.869-932.

156. Wong E., Grisebach H. Further studies on the role of chalcone and flavanone in biosynthesis of flavonoids // Phytochemistry. -1969. Vol.8 (8).- P.1419-1426.

157. Xie В., Shi H., Chen Q. Antioxidant properties of fractions and polyphenol constituents from green, oolong and black teas. // Proc Natl. Sci. Counc., Repub. China. 1993.- Vol.17.- P.77-84.

158. Yamasaki H., Grace C.G. EPR detection of phytophenoxyl radicals stabilized by zinc ions: evidence for the redox coupling of plant phenolics with ascorbate in the H202-peroxidase system // FEBS Lett. 1998.-Vol.422.- P.377-380.

159. Yoshino M., Murakami К. Interaction of iron with polyphenolic compounds: application to antioxidant characterization // Anal. Biochem.-1998.- Vol.257.- P.40-44.

160. Zaat S.A.J., Wijffelman C.A., Spank H.P. and al. Induction of the nod A promoter of Rhizobium leguminosarum Sym plasmid pRLlJI by flavonones and flavones I I J. Bacteriol. 1987.- Vol.169.- P. 198-204.

161. Zhang F., Smith D.L. Effects of low root zone temperatures on the early stages of symbiosis establishment between soybeans (Glycine max (L.) Mer.) and Bradyrhizobium japonicum II J. Exp. Bot.- 1994.-Vol.45 (279).-P. 1467-1473.