Физиологическое значение фенольных соединений при формировании бобово-ризобиального симбиоза в неблагоприятных условиях

Макарова, Людмила Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физиологическое значение фенольных соединений при формировании бобово-ризобиального симбиоза в неблагоприятных условиях
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Физиологическое значение фенольных соединений при формировании бобово-ризобиального симбиоза в неблагоприятных условиях"

884689102

На правах рукописи

Макарова Людмила Евгеньевна

Физиологическое значение фенольных соединений при формировании бобово-ризобиального симбиоза в неблагоприятных условиях

03.01.05 - Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 3 СЕН ?Л10

ИРКУТСК-2010

004609102

Работа выполнена в лаборатории физиологии устойчивости растений Учреждения Российской академии наук Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск

Научный консультант: д.б.н., профессор В.К. Войников

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Озолина Н.В.

доктор биологических наук . Новикова Т.Н.

доктор химических наук, профессор Бабкин В. А.

Ведущая организация:

Институт физиологии растений им К.А. Тимирязева РАН, г. Москва

Защита состоится «7» октября 2010 г. в 10 ч на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, Иркутск, а/я 317, ул. Лермонтова, 132. Факс (3952) 51-07-54; e-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Сибирском институте физиологии и биохимии растений

СО РАН.

Автореферат разослан <£&> 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г. П, Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

По экономической значимости бобовые растения семейства Fabaceae (подсемейства Mimosoideae, Caesalpinoideae, Papilionoideae) ставят на второе место после злаковых культур (ван Беркум, Эрдли, 2002). Это объясняется не только пищевой и технической ценностью представителей подсемейства Papilionoideae, но и их значением для агросистем, где они являются поставщиками форм азота, доступных для соседствующих с ними растительных культур, неспособных ассимилировать атмосферный азот самостоятельно.

Формирование бобово-ризобиального симбиоза представляет собой цепь морфо-физиологических процессов у обоих симбионтов и во многом зависит от успешности прохождения его начальных этапов, которые в настоящее время остаются еще недостаточно изученными, особенно при неблагоприятных условиях. Познание физиолого-биохимических механизмов начальных этапов взаимодействия симбионтов может способствовать разработке мер, направленных на существенное повышение эффективности симбиоза.

Триггерами симбиотических взаимодействий являются специфические фе-нольные соединения, синтезируемые растением-хозяином. Они выступают в качестве сигнальных молекул со стороны растения и способствуют активизации микросимбионта: вызывают хемотаксис, экспрессию nod- генов, размножение ризобий в ризосфере и ризоплане. Второй аспект действия фенольных соединений - участие в процессах ауторегуляции, связанных с контролированием инфекционных процессов, формированием примордий клубеньков, ноду-ляцией. Такая роль может быть отведена как эндогенным фенольным соединениям растений, участвующим в контролировании проникновения ризобий в ткани корня, так и входящим в состав семенных и корневых экссудатов, регулирующих концентрацию микросимбионта в ризосфере, от которой может зависеть число формирующихся на корнях клубеньков (Мишустин, Шильнико-ва, 1973).

Системы ауторегуляции бобового растения, вероятно, призваны обеспечивать строго нормированное проникновение бактерий в определенные корневые локусы и формирование количества клубеньков, соответствующего энергетическим возможностям растения. Поэтому ауторегуляция нодуляции имеет особое значение для растения в неблагоприятных условиях его существования. При этом роль растительных фенольных соединений, способных участвовать в системах контролирования начала взаимодействий и инфицирования в условиях действия неблагоприятных внешних факторов (низких температур, недостатка освещения и др.), остается практически неизученной. Выявленные особенности изменения в обмене и свойствах растительных фенольных соединений в неблагоприятных для симбиоза условиях позволят прогнозировать активность формирования симбиоза и будут содействовать поиску способов его регуляции при действии неблагоприятных факторов.

Цель и задачи исследования. Цель работы: изучение роли фенольных соединений в регуляции начальных этапов формирования симбиоза между бобовыми растениями и КЫ:оЫит при неблагоприятных для его становления условиях температуры, освещения.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить влияние абиотических факторов (температуры, условий гидрокультуры) на обмен фенольных соединений в корнях проростков гороха в связи с инокуляцией их ЯЫгоЫит.

2. Выяснить роль эндогенных фенольных соединений в контролировании инфицирования корней гороха бактериями ЛШгоЫит в условиях разных температур.

3. Изучить локализацию фенольных соединений в корневых тканях после инфицирования клубеньковыми бактериями корней растений при разных температурах.

4. По показателям ПОЛ определить температурную зависимость проявления защитных реакций в корнях проростков гороха после инокуляции их ризо-биями и изучить участие в регуляции ПОЛ эндогенных фенольных соединений.

5. По характеру взаимодействия эпидермальных клеток корня с ИЫ-оЫит установить локализацию участков корней, различающихся по восприимчивости к микросимбионту, у проростков, испытывавших действие разных температур.

6. Изучить влияние температуры на ПОЛ после инокуляции ЯМгоЫит в различных по восприимчивости к микросимбионту участках корней.

7. Изучить влияние температуры на обмен фенольных соединений и выяснить характер их участия в защитных реакциях корневых клеток в различающихся по чувствительности к ИМгоЫит участках корней проростков гороха.

8. Изучить особенности экссудации корнями фенольных соединений и участия их в регуляции численности бактерий КЫ:оЫит в ризосфере в зависимости от температуры и освещения.

9. Оценить роль эндогенных фенольных соединений в контролировании инфицирования корней проростков бобовых растений в светонезависимый период их развития и роль фенольных соединений, выделяемых корнями в ризосферу, в регуляции взаимодействия симбионтов на стадии преинфекции и в последующие периоды после инокуляции в зависимости от условий освещения и температуры среды.

Положения, выдвигаемые на защиту;

• Активизация метаболизма фенольных соединений в корнях бобовых при инфицировании КМ:оЫит в неблагоприятных условиях свидетельствует об их участии в ауторегуляции инфекционного процесса.

• В контролировании колонизации корней ризобиями важная роль принадлежит лабильной и химически активной группе «растворимых» фенольных соединений, присутствующих в периферических слоях корневого кортекса.

• Содержание, состав и физиолого-биохимические свойства «растворимых» липофильных компонентов, а также степень связывания с клеточными стенками определяют приоритетные механизмы участия феноль-ных соединений в защитных реакциях клеток зон корней с различной восприимчивостью к ЯЫ:оЫит.

• Факторы внешней среды оказывают влияние на количественный и качественный состав фенольных соединений в корневых экссудатах растения-хозяина, изменяя направленность их воздействия на размножение клубеньковых бактерий при колонизации корня.

Научная новнзна

Впервые приведены доказательства важной роли фенольных соединений растения-хозяина в ауторегуляции инфицирования корней бобового растения в неблагоприятных условиях.

Впервые представлены данные, свидетельствующие об участии фенольных соединений, выделяемых корневыми клетками во внешнюю среду, в регуляции размножения ризобий в различные периоды после инокуляции ими корней бобового растения и об изменениях этой регуляции под влиянием абиотических факторов.

Впервые показано, что механизмы реализации протекторных функций фенольных соединений зависят от восприимчивости корневых клеток к 1Ш:оЫит. Однако они могут различаться и в разных участках восприимчивых к инфицированию зон корней, при этом характер участия фенольных соединений в защитных реакциях в указанных зонах зависит от температуры выращивания.

Впервые в составе эндогенных и выделяемых корнями во внешнюю среду фенольных соединений гороха выявлены Ы-фенил-2-нафтиламии и сложные эфиры орто-фталевой кислоты. Предполагается, что высокоактивный и высоко-липофильный М-фенил-2-нафтиламин способен участвовать в регуляции уровня АФК в корневых клетках. В составе корневых экссудатов гороха это вещество вместе со стильбеном и эфирами орто-фталевой кислоты могут выполнять роль аллелопатических веществ, подавляющих почвенную микрофлору, включая бактерии ЯЫ:оЫит.

Использованные методические приемы исследования состава фенольных соединений и примененные автором схемы выращивания растений позволили разработать новое перспективное направление и получить принципиально новую информацию о регуляторной роли фенольных соединений при формировании бобово-ризобиального симбиоза.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты вносят существенный вклад в познание механизмов ауторегуляции инфицирования бобовых растений 11Ш:оЫит и роли в этих механизмах фенольных соединений корней растения-хозяина.

Результаты показывают, что характер участия фенольных соединений в реакциях на инфицирование ЯМ:оЬшт определяется особенностями обмена

фенольных соединений в различающихся по чувствительности к ризобиальной инфекции участках корней, зависимого от температуры выращивания.

В составе корневых экссудатов гороха выявлены конкретные ароматические вещества - К-фенил-2-нафтиламин, стильбен, сложные эфиры орто-фталевой кислоты аллелопатического действия на микрофлору почвы, в том числе подавляющих размножение их микросимбионтов - клубеньковых бактерий.

Апробация работы: Основные результаты работы докладывались на международном Симпозиуме «Signal system of plant cell» (Москва, 2001), Всероссийских научных конференциях «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2007), «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009), Втором международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), «VII международном симпозиуме по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2009), а также на научных сессиях Сибирского института физиологии и биохимии растений (1994,1996,1998,2000,2002,2004,2006).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 45 работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследований, результатов и обсуждения, заключения и выводов, а также списка цитируемой литературы, включающего 469 источников (в том числе 327 на иностранных языках) и Приложения. Работа изложена на 328 страницах, содержит 76 рисунков (11 из них в Приложении) и 16 таблиц (6 из них в Приложении).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Приводятся данные, характеризующие начальные этапы формирования симбиоза между бобовыми растениями и Rhizobium и факты о важной роли фенольных соединений, синтезируемых растением-хозяином, в становлении симбиоза.

Наиболее изучена роль фенольных соединений в период преинфекции. Установлено, что фенольные соединения, находящиеся в составе экссудатов набухающих семян и выделяемые корнями, выполняют функцию хемоапрактантов и запускают цепь метаболических процессов у бактерий, направленных на синтез Nod-факторов - сигнальных молекул со стороны микросимбионта (Coronado et al., 1995; Buffard et al., 1996; Кравченко и др., 1998; Hirsch et al., 2001; Dakora, 2003). Фенольные соединения семенных и корневых экссудатов могут оказывать влияние на размножение микросимбионта (Hartwig et al., 1991).

С синтезом сигнальных молекул появляется у бактерий возможность к адгезии на поверхности корней (стеблей), образованию инфекционных нитей, несущих для бактерий протекторную функцию от агрессивных компонентов растительных клеток и позволяющих им проникать во внутренние слои растительного органа к месту их дальнейшего поселения.

Приведены данные, свидетельствующие о влиянии абиотических факторов на формирование симбиоза. Предположено, что темпы формирования симбиоза связаны с изменениями в обмене фенольных соединений в клетках растения-хозяина, которые одинаково зависимы от внешних воздействий.

Обсуждается необходимость ауторегуляции процессов нодуляции, сопряженных с проявлением защитных реакций у растений и роль в ней фенольных соединений. Приведенные данные позволяют отметить ряд общих черт, а также отличия в характере проявлений защитных реакций у растений при патогенезе и симбиозе.

Показано, что фенольные соединения в защитных реакциях могут выступать в качестве сигнальных молекул, индуцирующих защитные реакции (Dixon, Paiva, 1995; Dixon et al., 2002), имеют отношение к проявлению сверхчувствительности, участвуют в формировании физического барьера для фитопатогенов, при поранении (Dixon et al., 2002). Ряд синтезируемых растениями фенольных соединений являются фитоалексинами, подавляющими микрофлору (VanEtten et al., 1994; Mert-Turt, 2002).

Важная функция фенольных соединений, имеющая отношение к защитным реакциям - это участие в регуляции уровня окислительных процессов, на которые они могут влиять, выступая в качестве анти- или прооксидантов в ферментативных и неферментативных реакциях (Рогинский, 1988; Меныцикова, Зен-ков, 1993; Pourcel et al., 2007).

М.В. Кения с соавт. (Кения и др., 1993) низкомолекулярные компоненты клеток с антиоксидантными свойствами, в числе которых фенольные соединения, отнесли к «истинным антиоксидантам», способным, при вступлении в реакцию с АФК, образовывать либо молекулярные продукты, либо радикалы с меньшей реакционной способностью.

Приведены сведения, указывающие, что механизмы влияния фенольных соединений на окислительные процессы в неферментативных реакциях многообразны, определяются структурой фенольных соединений, наличием у них химически активных функциональных групп. Отмечено, что степень активности фенольных соединений определяют все присутствующие в реакционной среде компоненты, различающиеся по активности в перехватывании свободных радикалов.

Обосновывается необходимость проведения исследований, связанных с изучением роли фенольных соединений в контролировании инфицирования корней бобового растения бактериями Rhizobium в неблагоприятствующих симбиозу условиях. Отмечено, что для оценки значения фенольных соединений в контролировании инфицирования бобового растения бактериями Rhizobium необходимо исследование роли эндогенных фенольных соединений в защитных реакциях и фенольных соединений, выделяемых растением во внешнюю среду в контролировании размножения микросимбионта. Обозначена важность исследований участия фенольных соединений в указанных процессах для условий, в которых затормаживается формирование симбиоза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследований. Объектом исследования служили растения гороха (Pisum sativum L.) сорта Марат селекции Тулунской государственной селекционной станции (Иркутская область). Исходным растительным материалом были этиолированные проростки, длина корней которых составляла 2,5-3,0 см. Их выращивали в термостатах с температурой 22 °С (оптимальная), либо 8 °С (пониженная). Рост этих проростков от момента замачивания семян и до начала экспериментов происходил в течение 2 сут при 22 "С, 7 сут - при 8 °С.

В экспериментах, где исследовались фенольные соединения корневых экссудатов, рост растений происходил в условиях гидрокультуры. Исходными, в зависимости от температуры, также были 2-х или 7- сут проростки. Сосуды с растениями помещали в камеру типа "Илка" N6 ("VEB, Elektro-Anlagenbau", Германия) с 16-тичасовым фотопериодом при температурах 22/14 °С (день / ночь) или 9 °С (круглосуточное действие). Интенсивность освещения в обоих вариантах выращивания на уровне сосудов составляла около 7 клк, влажность воздуха в камере - около 60 %. При изучении экссудации фенольных соединений в отсутствии освещения растения экспонировали в термостате с температурой 22 °С. Питательную среду, на которую помещали растения, содержавшую микроэлементы и сменявшуюся ежедневно, готовили на прокипяченой дистиллированной воде по (Jonson et al., 1966). Инокулят вносили в питательную среду 1 раз, в 1-е сутки эксперимента.

Для инокуляции растений и изучения ростовой активности фенольных соединений использовали культуру клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viceae, штаммов 245a (получен из ВНИИ зернобобовых культур, Орел), или 250а - CIAM 1026 (получен из ВНИИ с/к микробиологии, Пушкин - С.-Петербург).

Методы исследований

Определение биологической активности фенольных соединений гороха по их влиянию на размножение Rhizobium. Показателем биологической активности фенольных соединений в наших экспериментах было их влияние на один из важных процессов для симбиоза - размножение микросимбионта.

Действие фенольных соединений, содержащихся в экстрактах, на размножение Rhizobium оценивали по изменению оптической плотности суспензии бактерий (А 590)- Измерения оптической плотности проводили в течение 1-2 суток каждые 8 ч, затем 16 ч, или, наоборот, через 16 ч, затем 8 ч, начиная от момента внесения в среду бактерий. Характер режима наблюдений зависел от цели эксперимента. Измерения осуществляли против тех же сред, но без бактерий: 1) содержащих фенольные соединения (для эксперимента) и 2) без фенольных соединений (для контроля). Концентрация фенольных соединений в тестовых средах составляла 2 мкг/ мл. Она была оптимальной для сравнения биологической активности изучаемых веществ и подобрана экспериментально (Макарова и др., 1998).

Для определения количества бактерий, вносимых в жидкую среду в начале экспериментов, и установления концентрации их в культуральной среде в раз-

ные периоды опытов из водных сред отбирали бактериальные суспензии и высевали на твердую среду по методу (Теппер и др., 1979). По числу образовавшихся при этом колоний устанавливали число живых колонийобразующих клеток в мл среды.

Микроскопические исследования. Для наблюдений за реакцией корневых волосков в ответ на инфицирование клубеньковыми бактериями и нодуля-ционными процессами, а также для анализа распределения в тканях корней фе-нольных соединений применяли метод световой микроскопии. Во всех случаях окрашивание препаратов осуществляли витальным красителем крезиловым голубым по (Kartush, 1975; Scott, Peterson, 1979).

Методы выделения фенольных соединений. Фенольные соединения из растительного материала, выделяли по разработанной ранее схеме (Макарова и др., 1998), основанной на принципах, изложенных в работе (Мийдла и др., 1975). Фенольные соединения, входящие в состав корневых экссудатов, извлекали этилацетатом из водной среды (питательного раствора), подкисленной 2 н HCl до pH 3,0-4,0. После удаления этилацетата в токе холодного воздуха остаток растворяли в небольшом объеме 96 %-го этанола.

Определение содержания фенольных соединений в экстрактах из корней и корневых экссудатов. Количество фенольных соединений в исследуемом экстракте определяли с реактивом Фолина-Дениса по стандартной методике (Запрометов, 1974). Для определения количества ванилин-положительных соединений реакцию проводили согласно методики в руководстве (Луковнико-ва, Ярош, 1987). Содержание эндогенных фенольных соединений выражали в мкг/г сырой массы корня, а количество экссудируемых корнями фенольных соединений рассчитывалось в мкг на растение.

Методы разделения и исследования состава фенольных соединений. Состав фенольных соединений исследовали с применением методов хроматографии на бумаге, в тонком слое, на колонке с Sephadex LH-20, капиллярного электрофореза, УФ-, ИК-, ХМС-, ЯМР -спектроскопии, по цветным реакциям с реагентами, дающими специфическую окраску с определенными группами фенольных соединений. При идентификации исследуемые фенольные соединения сопоставляли с аутентичными образцами.

Исследование активности фенольных соединений в свободно - радикальных процессах. Исследование антиоксидантных свойств фенольных соединений проводили в растворах и на хроматограммах, используя липидосо-держащие системы.

При изучении активности фенольных соединений в отношении ингибиро-вания ПОЛ использовали методику из работы (Li, Xie, 2000), основанную на определении содержания ТБК - реактивных продуктов. В качестве окисляемого субстрата использовали раствор соевого лецитина в концентрации 1 мг/ мл в 10 мМ трис-НС1 трис-HCl буфере с pH 7.4. Концентрацию исследуемых фенольных соединений (40 мкг/мл) оптимизировали по калибровочному графику для (-)-эпикатехина. Объемы вносимых экстрактов рассчитывали по показателям оптической плотности в результате реакции с реактивом Фолина - Дениса и ко-

личество вносимых фенольных соединений было эквивалентным 40 мкг кемп-ферола, по которому строили калибровочный график. Соответствующие продукты ПОЛ определяли по (Hodges et al., 1999). Содержание ТБК-активных продуктов выражали в нмоль / мг лецитина.

Выявление фенольных анти- и прооксидантов хроматографическим методом осуществляли методом обесцвечивания p-каротина (Максимов и др., 1985).

Определение перекисного окисления липидов в экстрактах из корней гороха. Определение содержания эндогенных ТБК - реактивных продуктов в целых корнях проводили, основываясь на методиках (Стальная, Гаришвили, 1977; Hodges et al., 1999). Определение ПОЛ в отрезках корней проводилось в соответствии с руководством (Hodges et al., 1999).

Статистическая обработка. Повторность экспериментов была 3-5 кратная, при трех биологических и 3-5 аналитических повторностях, в зависимости от используемого метода. При статистической обработке материала использовали общепринятые характеристики: среднеарифметические значения, стандартное или квадратическое отклонение от среднего значения, коэффициент корреляции, критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Влияние условий выращивания на нодуляцию корней гороха

При выполнении исследований растения выращивали по схемам, соответствующим поставленным в работе задачам. Роль эндогенных фенольных соединений в начальные периоды взаимодействия симбионтов изучали на проростках, произраставших на влажной фильтровальной бумаге в темноте, в термостатах с разными температурами. Исследования проводились в период роста растений, не требующего освещения. Способ выращивания позволял пронаблюдать начальные моменты взаимодействия симбионтов, однако его нельзя было применять при изучении более поздних этапов симбиоза. Выращивание растений на фильтровальной бумаге, смоченной водопроводной водой при отсутствии света позволяло инфицированному ризобиями растению образовывать на корнях клубеньки (Макарова и др., 2004). Однако полного цикла нодуляции в этих условиях достичь было невозможно. Нодуляция в этих условиях характеризовалась малочисленностью клубеньков на корнях. Отсутствие света вызывало ослабление растения, что приводило к его заболеванию и гибели до наступления стадии созревания клубеньков.

Разработанный автором и примененный в работе способ выращивания растений в гидрокультуре (Макарова, 2001) позволил выполнить поставленные задачи при изучении роли фенольных соединений корневых экссудатов в формировании симбиоза в зависимости от периода после инфицирования их Rhizo-bium, а также от температуры и освещения. Он позволял быстро и в любой период извлекать из водной среды фенольные соединения, выделенные растениями из корневых клеток. Условия выращивания позволяли прохождению полного цикла нодуляции, но имели некоторые минусы. Так, по сравнению с условиями выращивания растений в песчаной культуре, выращивание растений в

100 мкм

условиях гидрокультуры замедляло нодуляцию при оптимальном температурном режиме в 2 раза, а при пониженной температуре - в 6 раз.

Микроскопические исследование зависимости от температуры реакции корневых клеток и локализации фенольных соединений в тканях корней проростков гороха при инокуляции Rhizobium

Реакция клеток при инокуляции Rhizobium в разных частях корней при 22 и 8 "С

Для определения локализации восприимчивых и невосприимчивых к ризобиальной инфекции зон через 24 ч после инокуляции методами микроскопии прослеживали взаимодействия эпи-дермальных клеток в разных частях корней, росших при 22 и 8 °С.

На поверхности корней по скоплениям бактерий определяли области адгезии, появления корневых волосков, прослеживали за изменением размеров корневых волосков и развитием деформаций, возникающих при воздействии на них микросимбионта (рис. 1, 2), выявляли участки, где наблюдались признаки проникновения бактерий - возникновение инфекционных нитей внутри корневых волосков.

Температура влияла на скорость роста корня, на длину зоны корневых волосков и на размеры корневых волосков. Замедленный рост корней при пониженной температуре являлся причиной меньших, чем при температуре 22 °С размеров зоны корневых волосков и заторможенного роста и развития корневых волосков.

При обеих температурах зона адгезии, со скоплениями ризобий на поверхности эпидермальных клеток и между начинающими рост корневыми волосками, при-

100 мкм

Рис. 1. Микрофотоснимки корневых волосков в разных участках инокулированных Rhizobium корней проростков гороха, выращенных при 22 °С.

Корневые волоски в участках на расстояниях 1015 (А), 15-20 (Б), 20-25 (В) мм от кончика корня, длина которого составляла 45,0 мм. Стрелками указаны инфекционные нити с ризобиями.

100 мкм

холилась на участок, расположенный приблизительно на расстоянии 3-10 мм от кончика корня. Первые выступы эпидермальных клеток, дающие начало корневым волоскам, при температуре 22 °С появлялись примерно на расстоянии 4-5 мм от кончика корня, при 8 °С - на расстоянии 8-10 мм.

Температура влияла на форму корневых волосков в начале их роста. Так, при 22 °С корневые волоски, достигавшие размеров 10-20 мкм, имели коническую форму, и с переходом к дальнейшему росту они приобретали цилиндрическую форму с закругленным апикальным концом. При 8 °С конусовидная форма корневых волосков по достижении ими размеров около 20-30 мкм чаще переходила в грибовидную, затем в цилиндрическую. В этих условиях небольшая искривленность поверхности корневых волосков возникала даже при отсутствии взаимодействия их с ризобиями (в контроле, рис. 2А).

Первые деформации корневых волосков на поверхности корней, росших при 22 °С, наблюдали на расстоянии около 8-10 мм от кончика корня. Здесь и далее, приблизительно до 22-25 мм (от кончика корня), слабые деформации корневых волосков проявлялись в основном небольшими поперечными перетяжками, изгибами в апекапьной части корневых волосков (рис. 1А, 1Б). Начиная с 22-25 мм, корневые волоски достигали довольно больших размеров (до 200 мкм), хотя и среди них располагались более мелкие по размеру корневые волоски (60-90 мкм) (рис. 1В). В этой зоне средней протяженности 5-9 мм у корневых волосков обнаруживали наиболее зримые деформации, в некоторых корневых волосках наблюдали небольшие инфекционные нити (рис. 1 В), свидетельствующие о начале процесса проникновения ризобий.

Не обнаружено признаков взаимодействий симбионтов в областях корней, содержавших до инокуляции зрелые корневые волоски, а также в прилегающей к основанию корня области длиной около 20,0 мм, где отсутствовали корневые волоски.

Рис. 2. Корневые волоски на корнях проростков гороха, выращенных при 8 °С.

А - неинфицированные растения. Микрофотоснимок получен на расстоянии 12-13 мм от кончика корня. Длина корня составляла 36,0 мм. Б - инфицированные бактериями Мг^гоЫит растения. Микрофотоснимок получен на расстоянии 15-16 мм от кончика корня, Длина корня составляла 36 мм. Стрелка указывает на инфекционную нить с ризобиями.

При 8 °С начало зоны деформаций корневых волосков приходилось на 9,0 ± 1,0 мм от кончика корня, протяженность ее при длине корня 31-34 мм, составляла 5-7 мм, где присутствовали корневые волоски разных размеров: от 10-20 до 60-80 мкм. Лишь при длине корней 35-36 мм, на расстоянии 16,0 ± 1,0 мм от кончика корня обнаруживали зону проникновения длиной 1,5 ± 0,5 мм. В этой зоне присутствовало небольшое количество корневых волосков длиной от 90-120 мкм, внутри которых обнаруживались инфекционные нити (см. рис. 2Б).

Влияние температуры на локализацию фенольных соединений в тканях корней проростков гороха

Гистохимическими исследованиями прослежено распределение фенольных соединений в тканях инокулированных и неинокулированных ризобиями корней проростков гороха, росших при температурах 22 и 8 °С. Примененный витальный краситель (крезиловый голубой) на фенольные соединения, оказался хорошим индикатором на фенольные соединения «этилацетатной» фракции и позволил констатировать сосредоточенность этих соединений преимущественно в верхних слоях корневого кортекса, то есть на пути продвижения в ткани инфекционных нитей. Средняя концентрация этих соединений в корнях в 45-80 раз превышала максимальную концентрацию, оказывающую положительное действие на размножение ризобий. Благодаря такой локализации и высокой концентрации в клетках данные фенольные соединения способны вызвать гибель ризобий, оказывающихся вне инфекционной нити при ее разрушении по каким-либо причинам.

Высокая концентрация фенольных соединений в корневых клетках, инги-бирующая размножение клубеньковых бактерий, вероятно, имеет отношение к системе защиты растений, призванной предотвращать прямое инфицирование указанными бактериями корневых клеток на пути прохождения инфекционных нитей.

Не выявлено существенных различий в распределении обсуждаемых фенольных соединений по тканям в корнях проростков гороха после инокуляции их ризобиями. Температура влияла в основном на распределении окраски по тканям в апекальных участках корней (0-5 мм от кончика корня), содержащих меристематические и растягивающиеся клетки: здесь расширялась зона окрашиваемых клеток в коре и к 5-му мм в области формирования сосудистых пучков интенсивно окрашивались еще и клетки стели.

Исследование состава фенольных соединений в корнях и корневых экссудатах растений гороха, подверженных действию абиотических факторов и НЫгоЬшт

Влияние ШйгоЫит, температуры и субстрата для выращивания на состав фенольных соединений в корнях гороха

Изменения в метаболизме фенольных соединений имеют отношения не только к реакции растений на действия абиотических факторов, но и к инфици-

рованию их ЯЫгоЫит. В качестве доказательств о влиянии инокуляции ИЫ:о-Ыит и температуры на обмен фенольных соединений в корнях проростков гороха были изменения в содержании трех их групп. Две из них входили в число «растворимых», или «свободных» компонентов, извлекаемых из экстрактов при помощи этилацетата и н-бутанола, третья представляла фенольные соединения, высвобождаемые из растительных остатков после кислотного гидролиза. Влияние изученных факторов сказывалось на содержании перечисленных выше групп фенольных компонентов и соотношениях между ними.

Ощутимее изменялись состав и содержание фенольных соединений после перенесения исходных проростков на водную среду с освещением. При этом при оптимальной температуре сильнее всего возрастало содержание «растворимых» фенольных соединений, экстрагируемых этилацетатом (липофильных). В условиях пониженной температуры при меньшем возрастании содержания «растворимых» фенольных соединений среди них увеличивалась доля компонентов, экстрагируемых н-бутанолом.

При обеих температурах в условиях гидрокультуры инокуляция приводила к снижению содержания в корнях фенольных соединений этилацетатной фракции, а при выращивании проростков на влажной фильтровальной бумаге - к небольшому его возрастанию.

Определение степени участия «растворимых» фенольных соединений в начальных. процессах взаимодействий симбионтов

Для сравнения степени участия указанных выше двух групп «растворимых» фенольных соединений в симбиозе исследовали их активность в отношении размножения ризобий (Макарова и др., 1998) и в ингибировании перекис-ного окисления липидов (Макарова и др., 2001).

Данные, указывают на различную активность в размножении ризобий (биологическая активность) фенольных комплексов этилацетатной и н-бута-нольной фракций (на рис. 3 и 4 и других ФС - фенольные соединения).

Биологическая активность фенольных соединений этилацетатной фракции различалась у корней проростков одинаковой стадии развития, подвергавшихся действию разных температур (см. рис. 3). Она изменялась по мере роста проростков, после инокуляции ЯкЬоЬшт и в разные периоды после этой инокуляции (Макарова и др., 2003).

Контролируя содержание в культуральной среде живых ризобиальных клеток, мы выявили прямую зависимость эффективности фенольных соединений этилацетатной фракции в размножение ризобии от их концентрации. Однако по достижении некоторых пределов концентрации этих соединений в среде выращивания (>10-15 мкг /мл среды) дальнейшее ее увеличение интенсифицировало деструктивные процессы, приводившие к уменьшению числа живых бактериальных клеток (Макарова и др., 1998).

0.14 0,12 0.1

••контроль

• 25 ОС

-1©С

Длительность экспозиции, ч

Рис. 3. Влияние ФС этнлацетатной фракции, выделенных из пеинфицнрованных (исходных) корней проростков гороха, выращенных при 25 и 9 "С, на размножение Д. 1е%и.гтпо$агит в минимальной среде при температуре 25 "С.

Рис. 4. Влияние ФС бутанолыюй фракции, выделенных из неинфицироваиных (исходных) корней проростков гороха, выращенных при 25 и 9 "С, на размножение Д. leguminosarum в минимально» среде при температуре 25 °С.

Концентрация ФС в среде 2 мкг/мл. Обозна- Концентрация ФС в среде 2 мкг/мл. Обозначения: контроль (среда без ФС); 25 °С и 9 "С - чения те же, что на рис. 3. среда, содержавшая ФС из корней проростков, росших, соответственно, при 22 и 9 °С. СЮмо - оптическая плотность культуральной среды при длине волны 590 нм.

Рост бактерий в присутствии фенольных соединений, экстрагированных н-бутанолом, мало отличался от такового в среде без фенольных соединений (см. рис. 4). Это подтвердили результаты целого ряда экспериментов, где исследовали бутанольные экстракты фенольных соединений, выделенных из корней растений разных вариантов выращивания. Фенольные соединения «бута-нольной» фракции не вносят вклад и в системы антиоксидантной защиты. К такому заключению привели результаты анализа соединений этой фракции на хроматограммах, обработанных р-каротином и этиллинолеатом: среди них не выявлялись как прооксиданты, так и антиоксиданты фенольной природы.

Температура и инокуляция влияют на состав и свойства эндогенных «растворимых» фенольных соединений этилацетатной фракции. Доказательством могут служить данные для экстрактов, выделенных через 24 ч после инокуляции из корней проростков гороха, росших при разных температурах (рис. 5). Они свидетельствует о различиях в составе и биологической активности экстрактов фенольных соединений, о которых можно судить по показателям количества фенольных соединений, элюируемых в различные периоды с колонки, заполненной 8ерЬас1ех ЬН-20, и их активности в размножении ризобий, тестировавшейся в модельных системах.

По-видимому, изменения в составе наиболее химически активной и лабильной группы «растворимых» фенольных соединений, экстрагируемой при помощи этилацетата могут влиять на ход формирования симбиоза. Эти изменения обусловлены совместным действием на растения температуры и ризобий.

8°С, 8 сут, неинокулированные

£I

13 5 7

11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 N фракции

8°С, 8 сут, 1 сут инокуляции

Рис. 5. Относительное содержание во фракциях, после элюирования с колонки с 5ер11а(1е\ ЬН-20 «растворимых» фенольных соединений (ФС), экстрагированных этилацетатом из растений разных вариантов выращивания, и влияние их на размножение ЯМгоЫит в минимальной жидкой среде.

% ФС (линия) - относительное содержание от общего количества элюированных с колонки ФС. Столбики - эффект ФС на рост ризобий. Представлены средние значения из 3-х независимых экспериментов, ошибки составляли 5-20 % от средних значений.

Характеристика состава эндогенных и экссудируемых корневыми клетками фенольных соединений, экстрагируемых при помощи этилацетата

В этилацетатных экстрактах из корней и их экссудатов выявлены представители изофлавонов, флавонов, флаванонов, катехинов, стильбенов, халконов, оксикумаринов, оксикоричных и оксибензойных кислот.

В обсуждаемых экстрактах количественно преобладали «неподвижные» в водных системах, высоколипофильные ароматические вещества. Мажорными компонентами этих экстрактов были конъюгаты различной сложности (установлено результатами гидролитического разложения изолированных компонентов в кислой или щелочной среде), часть из которых содержали изофлавоны (биоханин А, генистеин, даидзеин, формононетин). В составе некоторых изо-флавон-содержащих конъгогатов присутствовали ванилин-положительные фе-нольные соединения.

Многие фенольные компоненты комплексов веществ, экстрагируемых при помощи этилацетата, одинаково присутствовали в корневых клетках и в экссудатах. Это свидетельствует об их высокой лабильности и способности к перемещению через плазмалемму корневых клеток. В тех и других экстрактах находили ликвиритигенин и его конъюгат. В составе корней и их экссудатов обнаружены ранее неустановленные у бобовых растений соединения. Одно из них первоначально обозначенное как вещество «X» (Макарова и др., 2005, 2007), идентифицировано как М-фенил-2-нафтиламин (рис. 6).

Í*

't-V'ff'KffiMylk-S-ii^íH .щ. ц, чцгщлрщ. ^ ид irs-1-х-1-1-1-1-i-«,

№ uf i

If. ГА I .1«

Рис. б. УФ-, ИК-, масс- и ЯМР- спектры, характеризующие структуру выделенного из корневых экссудатов растений гороха \-фснил-2-нафтил амина.

1 - УФ- спектр в 96%-ном этаноле; 2 - ИК-спектр,соединения, нанесенного с помощью капилляра на пластинку «KRS-5»; 3 - Масс-спектры образца, выделенного из корневых экссудатов растений гороха (А), и Ы-фенил-2-нафтиламина (Б) из электронной библиотеки (Mass Spectral Database); 4 - ЯМР- спектр 13Cjmod М-фенил-2-нафтиламина, выделенного из корневых экссудатов растений гороха, в CDCI3 (по оси абсцисс - м.д., величина химического сдвига).

Второе, условно обозначенное как вещество «К», по данным масс-спектрометрии, представлено 2 компонентами: наиболее вероятно, дибутило-вым и диоктиловым эфирами орто-фталевой кислоты (рис. 7).

Рис. 7. УФ-спектр вещества «К» и полученные на ГХМС Shimadzu GP-5050A хро-матограмма и масс-спектры его компонентов.

1 - УФ-спектр вещества «К» в 96 %-iiom этаноле; 2 - пики дибутилового (1пик) и диок-тилового (2 пик) эфиров орто-фталевой кислоты: по оси абсцисс - время выхода, в мин, по оси ординат - интенсивность сигнала; За, 36 - масс-спектры, соответственно,дибутилового и диоктилового эфиров о-фталевой кислоты: по оси абсцисс- m/z, по оси ординат -1 отн, % (относительная интенсивность сигнала, в %%).

Имели место и различия в составах эндогенных и выделяемых в ризосферу фенольных соединений. Так, лишь в составе эндогенных соединений был обнаружен конъюгат апигенина. Представители флаванонов, нарингенин и эриодик-тиол, были изолированы из корневых экссудатов. Только в корневых экссудатах, и при этом в очень малых количествах, в свободном виде обнаружены изо-флавоны. Существенно отличался состав фенольных кислот. Присутствие свободных фенольных кислот в составе экссудатов фиксировали в редких случаях. В некоторых вариантах выращивания выявлены эфиры п-кумаровой или феру-ловой кислот.

Изучение антиоксидантной и биологической активности некоторых фенольных соединений, представленных в корнях и корневых экссудатах гороха По способности предотвращать окислительный распад ß-каротина, обнаружена высокая антиоксидантная активность в липофильных системах N-фенил-2-нафтиламина и нескольких фенольных соединений, среди которых более заметными были конъюгат биоханина А и халкон. Вещество «К» не обладало антиоксидантной активностью.

В модельных экспериментах 1Ч-фенил-2-нафтиламин, соединение стильбе-новой природы и сложноэфирные соединения орто-фталевой кислоты показали себя ингибиторами размножения ризобий, а свободные изофлавоны - стимуляторами данного процесса.

Предполагается, что высокая степень липофильности М-фенил-2-нафтиламина, вещества «К» и соединения стильбеновой природы позволяет находиться им в области биомембран и при инфицировании выходить за их пределы и подавлять микрофлору. Кроме того, Ы-фенил-2-нафтиламин способен участвовать в снижении окислительных процессов в клетках корней, усиливающихся при проникновении в них микроорганизмов, а также под влиянием абиотических стрессоров (Максимов, Черепанова, 2006; Уавве ее а!., 1993).

ре

1 ФС мз иеипок,г 2 3

Влияние ИЫгоЫит и температуры на состав этилацетатной фракции «растворимых» фенольных соединений в различных участках корней этиолированных проростков гороха

Получены доказательства различий в составе «растворимых» фенольных соединений этилацетатной фракции в 5-миллиметровых участках корней, расположенных последовательно на разном удалении от их апексов, у инокулированных и не-инокулированных Юхко-Ышп этиолированных проростков гороха, росших при 22 и 8 °С. Рис. 8 и 9 свидетельствуют о влиянии инокуляции и температуры на состав неподвижных в 5 %-ной уксусной кислоте фенольных соединений в клетках разных участков корней через 1 сут после инокуляции. В этилацетатных экстрактах данная группа фенольных компонентов доминировала по массе над подвижными в водных системах фенольными соединениями.

Из числа подвижных в водных системах фенольных компонентов предметом более детальных исследований были свободные фенольные кислоты

Рис. 8. Фотография ТСХ с неподвижными в водных системах фенольными соединениями из разных участков корней проростков гороха, произраставших при 22 °С, после просмотра в УФ-свете+пары N113.

Разделение производилось в системе Т:Д:У (90:25:4). Стрелки указывают направление продвижения растворителя. Цифрами обозначены номера 5-миллиметровых участков, считая от апекса корня, из которых экстрагировали фенольные соединения.

ФС яз нмокулированных корнем

Ииуьр

(ФКК). Несмотря на низкое содержание ФКК в растительных тканях, их относят к физиологически высокоактивным соединениям клеток, способным оказывать влияние на метаболические системы.

В корнях гороха был идентифицирован ряд ФКК: бензойная, п-оксибензойная, ванилиновая, галловая, гентизиновая, салициловая, <; -резорциловая (2,6- диоксибензойная), транс-феруловая. транс-п-кумаровая.

Результаты анализа с

применением метода капиллярного электрофореза указывали на присутствия в экстрактах орто-кумаро-вой кислоты, что не подтвердилось результатами других методов анализа. Данные ХМС-исследо-ваний позволили проследить изменения в корневых участках состава ФКК. Состав ФКК неодинаков в различных частях корней. Он изменялся под влиянием инокуляции и температуры среды даже в одинаково расположенных от кончика корня участках.

В некоторых случаях изменения в составе фе-нольных кислот наблюдали за счет гентизиновой и (;-резорциловой (2,6- диок-сибензойной) кислот, образующихся из салициловой кислоты, вероятно, пу-

ФС ма неинокулированных корней

JiH

>T\

Рис. 9. Фотография ТСХ с неподвижными в водных системах фенолъными соединениями из разных участков корней проростков гороха, произраставших при 8 °С, после просмотра в УФ-свете+пары ЧН*.

Система, применявшаяся для разделения фенольных соединений: Т:Д:У (90:25:4). Обозначения те же, что на рис. 8.

тем скавенгирования последней ОН-радикалов, повышение уровня которых к клетках возможно вследствие усиления окислительных процессов (Dixon et al„ 2002). Не во всех участках корней, особенно у неинокулированных проростков, обнаруживались п-оксибензойная, феруловая и п-кумаровая кислоты.

Выявленные различия в составе фенольных соединений в участках иноку-лированных и неинокулированных корней объясняют неодинаковость физиоло-го-биохимических свойств комплексов фенольных соединений в разных частях корнеЙ и изменения этих свойств после инокуляции и под влиянием температуры.

Влияние Rhizobium, света и температуры на состав фенольных соединений в корневых экссудатах растений гороха

Данные литературы указывают на влияние абиотических факторов на состав фенольных соединений, представленных в корневых экссудатах, опреде-ляеющих начальные этапы взаимодействия симбионтов (Cho, Harper, 1991; Graham, 1991; Dakora et al„ 1993; Novak et al., 1994; Lawson, 1996).

Общее число фенольных компонентов в их корневых экссудатах растений гороха варьировало в разные периоды их роста и развития, изменялось после инокуляции корней Rhizobium, зависело от температуры и освещения. В экссудатах преобладали коньюгаты, содержавшие изофлавоны, катехины, халконы, ликвиртигенин, обнаруживались проантоцианидины. В минорных количествах присутствовали свободные изофлавоны: биоханин А, гепистеин, даидзеин, формононетин. При этом, биоханин А был постоянным компонентом всех экстрактов, остальные изофлавоны выявлены не во всех экстрактах. Постоянным компонентом экссудатов был свободный ликвиритигенин и его конъюгат. В следовых количествах в экстрактах находили нарингенин.

На составе фенольных соединений в корневых экссудатах растений гороха сказывались условия для роста растений, их возрасти и влияние ризобий. Так, при оптимальной температуре и освещении в экссудатах выявили эриодиктиол, а в условиях темноты обнаружено 2 соединения, отсутствовавших в них при освещении. Предварительно одно из них отнесено к стильбенам, второе - к халконам. В отсутствии света через 1 сут после инокуляции в них находили свободные п-кумаровую и феруловую кислоты, обнаруживаемые в другие периоды роста в тех же условиях в составе эфиров. В отдельные периоды в экссудатах инокулированных растений, росших при пониженной температуре на свету, выявлены свободные феруловая и ванилиновая кислоты.

В экссудатах проростков, произраставших в темноте, обнаружено 2 соединения, отсутствовавших при освещении. Предварительно одно из них отнесено к стильбенам, второе - к халконам.

От света и температуры зависело время появления в экссудатах азотсодержащего соединения М-фенил-2-нафтиламина (Макарова и др., 2005, 2007). Не во все периоды наблюдений в экссудатах присутствовали сложноэфирные соединения орто-фталевой кислоты.

Качественные различия состава фенольных соединений между экстрактами корневых экссудатов, возникающие под влиянием освещения и температуры, указывают на регуляторную роль этих соединений в ризосфере на протяжении длительного времени симбиотических отношений между бобовым растением и Rhizobium.

Изучение роли фенольных соединений в размножении Rhizobium в ризосфере в изменяющихся условиях среды

От света и температуры зависит формирование симбиоза между бобовыми растениями и Rhizobium. Вероятно, фенольные соединения, выделяемые корнями в ризосферу, являются важным звеном в формировании симбиоза. Их регу-ляторные возможности в данном процессе зависимы от света и температуры.

Отмечена зависимость лос/-гениндуцируюшего действия фенольных соединений, представленных в корневых экссудатах, от света (Lawson et al., 1996), от возраста растений (Maxwell et al., 1989; Hartwig et al., 1990; Maxwell, Phillips, 1990; Novak et al., 1994). Изменчивость во времени nod-ген индуцирующего действия фенольных соединений, вероятно, имеет определенный биологический смысл. Вероятно, это один из механизмов, позволяющих растению регулировать взаимоотношения с микросимбионтом в зависимости от его собственного обмена, подверженного ритмичности, связанной с его ростом и развитием. Тем более это становится важным в условиях стрессов, когда, вероятно усиление высвобождения в ризосферу фенольных соединений, блокирующих индукцию ризо-бильных nod-генов (Maxwell, Phillips, 1990). При стрессе не исключается накопление фенольных ингибиторов размножения микросимбионтов, обусловливающих снижение их численности в ризосфере. Таковыми, по результатам наших исследований, в экссудатах гороха могут быть М-фенил-2-нафтиламин, вещество стильбеновой природы и сложные эфиры орто-фталевой кислоты.

По нашим представлениям, отражением изменений в составе фенольных соединений корневых экссудатов являются показатели ростовой активности в отношении микросимбионта в модельных системах, о которых будет сказано ниже.

Влияние температуры на экссудацию корнями гороха фенольных соединений и их биологическую активность

Исследования на проростках гороха, произраставших в условиях освещения при разных температурах, показали, что выделение в ризосферу фенольных соединений и изменение их активности в размножении ризобий неравномерно во времени и зависят от условий произрастания растений.

Рис. 10. Влияние температуры на выделение фенольных соединений инфицированными и неинфнцнрованными ЯЫгоЫит корнями растений гороха, росшими в условиях освещения.

Обозначения: сплошной линией указаны данные для инокулированных, прерывистой -для неинокулированных Д/г. ¡ецшптояагшп растений. 22/14 °С (а) и 9 °С (б) - температуры при выращивании растений. По оси абсцисс - длительность экспозиции, в сут.

Эксперименты по изучению роли температуры в экссудации фенольных соединений корнями гороха проводили при освещении (интенсивность 7 клк) и при разных температурных режимах (см. Методику). Данные рис. 10, 11 свидетельствуют, что растение может контролировать размножение ризобий в ризосфере бобового растения в разные периоды после инокуляции. Оно лимитирует

11600 I 1*00

активность размножения либо путем уменьшения количества выделяемых корнями фенольных соединений в ризосферу, либо путем снижения общей (результирующей) биологической активности присутствующих в экссудатах фенольных соединений.

Вероятно, это один из путей инги-бирования низкой температурой начальных этапов симбиоза, который обусловлен ее влиянием на инфицирование корней бобовых растений, приводящим к уменьшению численности микросимбионта в ризосфере.

Эта регуляция концентрации микросимбионта в ризосфере осуществляется в основном благодаря снижению экскретирования корнями фенольных соединений и в меньшей степени за счет снижения их биологической активности.

При пониженной температуре имеется связь уменьшения экссудации фенольных соединений корнями в ризосферу с замедленным в этих условиях ростом растений.

Особенности экссудации фенольных соединений корнями гороха при отсутствии света

Негативное влияние темноты на формирование симбиоза между ЮиюЫит и бобовыми растениями начинается на уровне ризосферы. В темноте корнями выделяется значительно меньше фенольных соединений, чем при аналогичном температурном режиме в условиях освещения (сравните рис. 10а, 11а, 12а).

123456789 10 сут

Рис. 11. Влияние фенольных соединений, выделенных из корневых эксудатов растений, росших при разных температурных режимах в условиях освещения, на размножение Л. legumi-поватт в минимальной жидкой среде.

Концентрация ФС в среде 2 мкг / мл. Обозначения такие же, как на рис. 9.

Рис. 12. Количество фенольных соединений, выделяемых корнями ннокулированных и неинокулированных Юг'поЫит растений гороха, росших при отсутствии освещения (а) и влияние их на размножение Ши Ы^иттошит в минимальной жидкой среде (б). % - рост бактерий, относительно контроля (контроль - среда без фенольных соединений). Сплошная линия - инокулированные, прерывистая - неинокулированные ЯК 1е%иттозагит растения. По оси абсцисс - длительность экспозиции в сут.

При выращивании растений гороха в темноте фенольные компоненты их корневых экссудатов могут содействовать увеличению числа ризобий в ризосфере в 1-е сутки после инокуляции благодаря усиленному их выходу из корневых клеток и повышенной ростстимулирующей активности (рис. 12). В последующие периоды после инокуляции их стимулирующее влияние на размножение микросимбионта почти линейно снижается.

Защитные реакции корневых клеток гороха при инокуляции Rhizobium в условиях действия разных температур

Защитные реакции, возникающие в ответ на инфицирование растений микроорганизмами, как при патогенезе, так и симбиозе, связывают с повышением уровня активных форм кислорода (АФК). Данные авторов (Ramu et al., 1999, 2002; Soto et al.,2006) свидетельствуют, что окислительный стресс у растения-хозяина индуцируют специфические Nod - факторы микросимбионта. Он имеет место и, по-видимому, неизбежен при инфицировании совместимыми бактериями, хотя, механизмы образования АФК и их физиологическая роль в начальные периоды инфицирования остаются неясными (Hérouart et al., 2002).

Указывать на проявления защитных реакций, сопряженных с повышением уровня АФК, могут показатели перекисного окисления липидов (ПОЛ), отражающих степень деструктивных процессов клеточных биомембран (Zhirov, Merzlyak, 1983; Мерзляк, 1989; Барабой, 1991; Меныцикова, Зенков, 1993; Курганова и др., 1997). Изменения в уровнях ПОЛ в наших экспериментах подтверждают реакцию корневых клеток на инфицирование ризобиями.

Активными регуляторами уровней АФК и ПОЛ являются фенольные соединения, антиоксидантные свойства которых легко меняются благодаря изменениям в их составе под влиянием внешних воздействий. Фенольные соединения могут реализовать свою активность в регуляции окислительных процессов различными путями; взаимодействовать с ионами металлов переменной валентности, обрывать цепи окисления, скавенгировать супероксидный анион, гидроксильный и перекисный радикалы. От соотношения компонентов с про-оксидантной и антиоксидантной активностями в комплексах фенольных соединений будет зависеть дальнейший ход окислительного стресса в клетках: его прогрессирование или блокировка.

Участие фенольных соединений в защитных реакциях корневых клеток также может проявляться увеличением содержания «растворимых» химически активных фенольных соединений, подавляющих развитие микрофлоры, и усилением связывания с клеточными стенками, способствующим формированию физического барьера для бактерий.

Динамика изменения уровня ПОЛ и роль в его регуляции липофильных фенольных соединений в корнях после инокуляции Rhizobium в условиях разных температур

Изменения уровня ПОЛ в клетках корней у инфицированных и неинфици-рованных клубеньковыми бактериями растений происходят с возрастом, что

показано данными по содержанию в этих корнях ТБК-реактивных продуктов (рис. 13).

Варианты: исх - исходные проростки; 6 ч., 12 ч., 24 ч., 48 ч. - время экспозиции после инфицирования. Обозначения сплошной и прерывистой линиями, соответственно, для инфицированных и неинфицированных бактериями ЯЫгоЫит проростков. По оси ординат указаны средние значения содержания в 1 г сырой массы корня ТБК-реактивных продуктов ПОЛ из трех независимых экспериментов ± стандартные отклонения для них.

Нами установлены различия в характере проявления защитных реакций на инфицирование у растений, выращенных при температурах 22 и 8 °С (см. рис. 13). Так, при температуре 22 °С через 6 ч после инфицирования происходит существенное усиление ПОЛ, а через последующие 6ч- его снижение. После инокуляции в условиях оптимальной температуры одновременно с повышением содержания АФК в клетках корней, по-видимому, возникали активные процессы, направленные на снижение их уровня и, соответственно, ПОЛ. В итоге, уровень ПОЛ к 12 ч от момента инокуляции оказывался даже ниже, чем у одно-возрастных неинфицированных растений. Через 24 и 48 ч, прошедшие с момента инокуляции, по-видимому, окислительные процессы в корнях у инфицированных и неинфицированных растений приближались к единому уровню, о чем говорят мало отличающиеся показатели ПОЛ.

При закаливающей для гороха температуре (8 °С) уровень ПОЛ в большей части вариантов выращивания низкий, его изменения с возрастом растения и в ответ на инфицирование, в сравнении с оптимальными условиями температуры, запаздывали во времени и выражены слабо. При 8 °С усиление ПОЛ происходило через 24 ч после инокуляции, а через 48 ч оно немного снижалось, но при этом в инокулированных корнях показатели ПОЛ были выше, чем в контроле.

По-видимому, низкие показатели ПОЛ, слабо выраженное их изменение при инокуляции имеют отношение к замедленному инфицированию корней гороха при температуре 8 °С. И, наоборот, высокий уровень ПОЛ, быстрое его изменение в ответ на инокуляцию способствуют ускоренному развитию симбиоза в условиях оптимальной для растений гороха температуры (22 °С).

Результатами наших исследований, приведенных в диссертации и в публикациях (Макарова, Рудиковская, Собенин, 2004; Макарова, Рудиковская, Ла-

тышева, 2006 и др.), показано, что фенольные соединения, экстрагируемые при помощи этилацетата, являются активными компонентами антиоксидантных систем, влияют на уровень ПОЛ. Степень их влияния на окислительные процессы изменяется в различные периоды роста и развития растения, под воздействием температуры, инокуляции. Изменения в ПОЛ при температуре 8 °С позволяют предположить, что низкая положительная температура, не оказывающая повреждающего действия на растения, способствуют формированию более мощной антиоксидантной системы, включающей в себя фенольные соединения, деятельность которой способствует выживанию растений в малоблагоприятных для них условиях существования.

Наряду с механизмом регуляции уровня ПОЛ, определяемого радикал-скавенгирующими свойствами липофильных фенольных соединений, просматривается путь регуляции уровня ПОЛ этими соединениями, связанный с изменением их концентрации в клетках. Так, при 22 °С заметное возрастание ПОЛ в корнях через 6 ч от начала инокуляции сопряжено со столько же заметным уменьшением содержания «растворимых» липофильных фенольных соединений (рис. 14). Очевидна связь возрастания содержания тех же соединений через 12 ч после инокуляции со снижением ПОЛ. При низкой температуре минимальная концентрация обсуждаемых фенольных соединений в корнях инокули-рованных и неинокулированных корней через 12 ч от начала эксперимента совпадала с максимальным уровнем ПОЛ, выявленным для того же периода.

Рис. 14. Влияние температуры на содержание в корнях «растворимых» липофильных фенольных соединений в различные периоды после инокуляции кЫюЫит.

22, 8 °С - температуры, при которых выращивали растения. По оси абсцисс указаны периоды определения содержания фенольных соединений. Сплошные линии-данные для инокулированных, прерывистые - для неинокулированных (контроль) корней.

Исследуя состав фенольных соединений, мы проследили за изменением содержания в корнях ванилин-положительных фенольных соединений (рис. 15). Многих из их представителей относят к высокоактивным участникам свободно-радикальных процессов. Очень низкие коэффициенты корреляции явились основанием для заключения, что, при обеих температурах выращивания у неино-

купированных растений уровень ПОЛ слабо зависит от содержания указанной группы фенольных соединений. После инокуляции возникает высокая зависимость ПОЛ от содержания ванилин-положительных соединений. Однако при температуре 22 "С эта зависимость отрицательная (г=-0,93), при 8 °С - положительная (г=1,0). Последнее служит основанием для предположения о присутствии в инокулированных корнях среди ванилин-положительных соединений в первом случае активных антиоксидантов, а во втором случае - компонентов с прооксидантными свойствами.

1000 900 800 700 800 500 400 300 200 100

Иех. 8 ч 12ч 24ч Д8ч _ Варианты выращивания

Рис. 15. Влияние температуры на содержание в корнях в различные периоды после инокуляции НИпоЫит «растворимых» липофильных фенольных соединений с положительной реакцией на ванилин.

Обозначения те же, что к рис. 13.

По-видимому, не только содержание, но и состав ванилин-положительных соединений имеет значение в регуляции ПОЛ. Известно, что положительную реакцию, выражающуюся появлением красной окраски с ванилиновым реактивом, способны давать флаван-3-олы (катехины), флаван-3,4-диолы (лейкоанто-цианидины), олигомерные вещества (например, проантоцианидины), дигидро-халконы, а также некоторые флаваноны и флаванонолы (Sarkar, Howarth, 1976). Интенсивность окраски с ванилиновым реагентом у перечисленных соединений неодинакова, как неодинаковы у них и антиоксидантные свойства (Huang, Frankel, 1997). Подтверждением чему служат и результаты наших исследований. В экстрактах из гороха и его корневых экссудатов нами выявлено 2 сложных по составу коныогата, которые наряду с окрашиваемым ванилиновым реагентом флавоноидным фрагментом содержат изофлавоны. Только один из этих конъю-гатов, а именно содержавший биоханин А, проявлял высокую антиоксидантную активность в липофильной системе, второй, включавший даидзеин, оказался неактивным.

Возможно, различия в составе ванилин-положительных соединений в исследованных экстрактах и были причиной неоднозначно проявившейся зависимости между показателями их содержания (см. рис. 15) и ПОЛ (см. рис. 13), определенной по коэффициентам корреляции, отражающими степень их взаимозависимости во времени.

Исследование проявлений реакции на инокуляцию Rhizobium клеток в разных участках корней через 1 сут от ее начала при 22 и 8 "С

На этапе прикрепления ризобий к корневым клеткам и начала их проникновения в корневые волоски происходит ослабление защитных реакций в отдельных участках корней (Lohar et al., 2007), вследствие чего создаются условия для проникновения и размножения в их клетках микросимбионта (Bhu-vaneswari et al., 1981; Акимова и др., 2002; Макарова и др., 2003).

Как уже было сказано выше, показателями реакции могут служить данные о ПОЛ, зависящие от уровня АФК в растительных клетках. По современным представлениям, АФК при бобово-ризобиальном симбиозе могут играть роль прямых бактериальных ингибиторов, а также являются сигнальными интерме-диатами, участвующими в активации защитных систем растения. Роль феноль-ных соединений в этих системах может заключаться в усилении окислительных процессов. Это возможно при снижении их радикал - скавенгирующей активности и концентрации в клетках.

Роль «растворимых» липофильных фенольных соединений в защитных реакциях растительных клеток мы видели также в предотвращении прямого инфицирования корневых клеток ризобиями при случайном высвобождении этих бактерий из инфекционных нитей в корневые клетки, либо при проникновении их в области поранений корневых тканей (Vasse et al.,1993). В данном случае проявлением защитных реакций при инфицировании является увеличение содержания в клетках "растворимых" фенольных соединений (Keller et al., 1996). Высокие концентрации этих веществ имеют негативный эффект на ризобии (Макарова и др., 1998).

Прямому проникновению ризобий в корневые клетки могут препятствовать естественные физические барьеры, каковыми служат клеточные стенки, усиленные путем внедрения в них фенольных соединений и образования с их участием полимеров - лигнина и лигниноподобных веществ (Dixon, Paiva, 1995; Buffard et al., 1996; Dixon et al., 2002; Максимов, Черепанова, 2006). Данный защитный механизм при инфицировании растений микроорганизмами действует в апопласте, где прошедшие через плазмалемму фенольные соединения образуют эфирные связи с углеводными компонентами клеточных стенок и между собой, формируя указанные выше полимеры (Whitmore, 1974; Grisebach, 1977; Vance et al., 1978; Fry, 1979; 1982; Pourcel, 2007).

Для того, чтобы выяснить, как сказывается влияние температуры на проявление защитных реакций в зонах с разной восприимчивостью к ризобиальной инфекции, в своих исследованиях мы использовали проростки гороха, росшие при разных температурах, у которых через 24 ч от начала инокуляции в корнях распознавалась локализация этих зон. Показателями реакции были изменения ПОЛ, содержания «растворимых» липофильных фенольных соединений и их антиоксидантной активности, содержания связанных с клеточными стенками фенольных соединений, которые определяли в 5-миллиметровых отрезках корня, полученных последовательно вдоль его длины, начиная с апекальной части.

Температурные условия сказывались на активности ПОЛ в участках корней проростков гороха (рис. 16): при температуре 8 °С она была ниже, чем при 22 °С.

Инокуляция вызывала усиление активности ПОЛ в одних участках корней и ослабляла данный процесс в других областях корня. Эти изменения, возникшие в процессе развития реакции на инокуляцию ШцоЫит, происходили на фоне изменений в содержании «растворимых» липофильных фенольных соединений и их антиоксидантной активности в липидосодержащих системах (рис. 17-18).

Характерно, что при обоих температурных режимах наибольшее возрастание ПОЛ происходило в 1-м участке, представляющем собой растущую часть корня, содержащего мери-стематические и растягивающиеся клетки. Примечательно, что здесь же после инокуляции заметно возрастало содержание «растворимых» липофильных фенольных соединений с одновременным повышением их антиоксидантной активности (см. рис. 17-18) и усиливалось связывание фенольных соединений с клеточными стенками (рис. 19). Очевидно, этот участок корня наиболее недоступен для инфицирования ризобиями, в достаточно большом количестве поселяющихся на поверхности его зпидермальных клеток (Макаго-уа й а1., 2004).

Картина изменения всех перечисленных выше показателей в зоне корневых волосков более разнообразна у проростков, росших при 22 °С, чем у проростков, росших при 8 °С. Это объясняется разной протяженностью данной зоны у корней, зависящей от температуры при их росте. У корней, росших при 22 °С, отдельные этапы роста корневых волосков и развития их реакции на ризобии более четко пространственно разделены по длине корня. Практически все выше перечисленные явления взаимодействия корневых волосков с клетками указанных бактерий мы наблюдали у корней, росших при 8 °С, в короткой зоне корневых волосков.

Интересна реакция клеток участков 2 при 22 °С и 3 при 8 °С, которые входили в зону адгезии и начинающих рост корневых волосков. По-видимому, клетки этих участков ответственны за экссудацию фенольных соединений в ризосферу, поскольку после инокуляции в них наблюдалось ощутимое снижение содержания «растворимых» фенольных соединений (см. рис. 17, 18). Падение

Рис. 16. ПОЛ в различных участках инокулн-рованных и неинокулированных корней при разных температурах через 1 сут от начала эксперимента.

Обозначения: 22,и, 22,н, 8,и, 8,н - инокулиро-ванные и неинокулированные ЯИкрЫшп 1е£шт-пошгит Ьу. \чсеае корни проростков гороха, произраставшие, соответственно, при 22 и 8 °С. № участка корня длиной 5 мм, начиная от кончика корня.

концентрации этих соединений вместе со снижением их антиоксидантной активности, вероятно, явились причиной достаточно заметного возрастания здесь уровня ПОЛ (см. рис. 16-18), указывающего на проявление защитной реакции, связанной с возрастанием уровня АФК.

инокул.

Рис. 17. Содержание "растворимых" липофильных фенольных соединений и их антиоксидантная активность (в лнподо-содержащей системе окисления) в участках корней проростков гороха, произраставших при 22 "С.

Обозначения: сплошной линией показано содержание ФС; прерывистой линией указан % ингибирования ПОЛ, вычисленный относительно среды без ФС и определенный по накоплению ТБК-реактивных продуктов. Сокращение: н/ин, инокул. - неинокулированные и инокули-рованные растения.

Рис. 18. Содержание "растворимых" липофильных фенольных соединений и их антиоксидантная активность (в ли-подосодержащей системе окисления) в участках корней проростков гороха, произраставших при 8 °С.

Обозначения те же, что на рис. 17.

Следует отметить, что после инокуляции степень усиления ПОЛ в обсуждаемом участке зоны адгезии, в сравнении с неинфицированными растениями аналогичного температурного варианта, оказывается выше у проростков, росших при 8 °С.

В зоне корневых волосков, где нами замечены проявления реакции корневых волосков (в виде разной степени искривлений) и начало проникновение ри-зобий в эти корневые волоски (при 22 °С участки 3-7, при 8 °С - участок 4), изменения ПОЛ либо слабые, либо практически отсутствовали (см. рис. 16).

При обеих температурах после инокуляции в указанных участках корней антиоксидантная активность «растворимых» липофильных фенольных соединений существенно снижалась. Это снижение могло бы способствовать столь

же существенному возрастанию ПОЛ. Однако в большей части участков корней при температуре 22 °С этого не происходило. В участках 4 и 5 у этих корней возрастанию ПОЛ, очевидно противодействовало заметное возрастание концентрации обсуждаемых фенольных соединений. Это говорит о вероятном механизме ингибирования ПОЛ, связанном с изменением концентрация этих веществ в растительных клетках. Сложно объяснить роль тех же фенольных соединений в ингибировании ПОЛ в 6 и 7 участках корней, росших при 22 °С, и в 4-м участке корней, росших при 8 °С. Здесь можно констатировать одновременное заметное снижение содержания и антиоксидантной активности «растворимых» липофильных фенольных соединений, но при этом усиление ПОЛ здесь либо слабо снижается (6 участок, 22 °С), либо немного возрастает (7 участок при 22 °С и 4 участок при 8 °С). Все это позволяет предположить у клеток этих участков корней включение в систему сдерживания активности ПОЛ наряду с обсуждаемыми фенольными соединениями нефенольных компонентов. Причем, значение последних в ингибировании ПОЛ, по-видимому, более весомо,

чем значение фенольных соединений.

У проростков, росших при оптимальной температуре, в участках 4 и 6 зоны корневых волосков, очевидно, возрастала роль другого пути защиты от инфицирования при участии фенольных соединений, который связан с усилением связывания фенольных соединений с клеточными стенками (см. рис. 19). При пониженной температуре такого характера реакция в аналогичной зоне практически не проявлялась.

Клетки неинфицируемого участка 8 корней, росших при 22 °С, реагировали на инокуляцию небольшим снижением уровня ПОЛ и отсутствием изменений показателей, касающихся фенольных соединений (см. рис. 16, 17, 19). При пониженной температуре в неинфицируемом участке 5 изменений после инокуляции в уровне ПОЛ не происходило, но снижалась антиоксидантная активность «растворимых» липофильных фенольных соединений (см. рис. 16, 18, 19). По-видимому, в неинфицируемых участках базальной части корней основную защитную функцию играют фенольные соединения клеточных стенок. По сравнению с соседними, восприимчивыми к

22* С

Номер участи корня

«*С

ССО -

460

0-1-.---.-,-

12 14В

Номер учаспа корня

Рис. 19. Содержание "нерастворимых" фенольных соединений в участках корней проростков гороха, произраставших при 22 и 8 °С.

Сплошная линия - инокулированные, прерывистая - неинокулированные Юхко-Ыит корни.

ризобиальной инфекции участками, здесь содержание фенольных соединений, связанных с клеточными стенками, выше и не изменяется после инокуляции корней клубеньковыми бактериями.

Результаты, приведенные в разделе, позволили сделать вывод, что виды механизмов участия фенольных соединений в защитных реакциях при инфицировании ризобиями в разных областях корней имеют отношение к степени восприимчивости их клеток к данной инфекции и обусловлены особенностями метаболизма в них фенольных соединений. Температура оказывает наибольшее влияние на метаболизм фенольных соединений в восприимчивых к инфекции участках корней, изменения в метаболизме отражаются на характере и степени участия этих соединений в регуляции инфицирования корней бобового растения ризобиями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучены аспекты действия фенольных соединений в формировании симбиоза бобовых растений с ЛЫгоЫит: 1) регуляция численности микросимбионта в ризосфере после инокуляции в зависимости от температуры и освещения; 2) участие в защитных реакциях корневых клеток, противодействующих прямому инфицированию их ризобиями. Результаты исследований показывают реакцию корней бобового растения на инфицирование их Шг'цоЫит, модифицирующуюся под влиянием абиотических факторов.

Участие фенольных соединений в становлении симбиотических отношений можно представить в виде схемы, показанной на рис. 20, которая основана

Рис. 20. Схема взаимодействия симбионтов при участии фенольных соединений, синтезируемых корнями растения-хозяина.

на данных литературы и результатов нашей работы (красным цветом обозначен круг вопросов, в решение которых внесен вклад нашими исследованиями). Она показывает участие фенольных соединений во взаимодействии симбионтов на двух этапах: преинфекции и начала проникновения ризобий в корневые волоски.

Впервые показано значение фенольных соединений корневых экссудатов в контролировании растением инфицирования через регуляцию численности микросимбионта в его ризосфере после инокуляции в неблагоприятных для симбиоза условиях. Этот этап регуляции симбиоза обуславливается модификациями количества выделяемых корневыми клетками фенольных соединений и их ростовой активности за счет присутствующих в их составе фенольных компонентов, воздействующих на размножение ризобий.

Фенольные соединения, находящиеся в корнях, в период адгезии ризобий на поверхности эпидермальных клеток корня и начала проникновения ризобий в корневые волоски участвуют в защитных системах, предотвращающих прямое инфицирование преобладающей части их клеток. Впервые показано, что степень участия фенольных соединений в разных видах защитных реакций: в регуляции уровня АФК, укреплении клеточных стенок неодинакова в различных областях корней и может изменяться под влиянием температуры, действующей на растения. То есть, механизмы участия фенольных соединений в защитных реакциях зависят от степени восприимчивости клеток к инфекции КЫ-:оЫит и от температурных условий. Это доказывает, что эндогенные фенольные соединения призваны обеспечить строго нормированное проникновение бактерий в определенные корневые локусы и формирование количества клубеньков, соответствующего энергетическим возможностям растения.

ВЫВОДЫ

1. Изменения в обмене фенольных соединений в клетках корней проростков гороха, возникающие под влиянием температуры, условий выращивания в гидрокультуре и инокуляции ЯкЬоЫшп, оказывают существенное влияние на ход формирования симбиоза.

2. Эндогенные фенольные соединения могут принимать участие в проявлении защитных реакций на инокуляцию корней ЯЬЬоЫит: 1) как регуляторы активности свободнорадикальных процессов; 2) как вещества, подавляющие размножение микросимбионтов в клетках корня; 3) при формировании физического барьера для ризобий.

Механизмы реализации протекторных функций фенольных соединений неодинаковы в зонах корней, различающихся по восприимчивости к ЯЫ;оЫит.

3. Приоритетная роль в процессе формирования симбиоза принадлежит «растворимым» липофильным фенольным соединениям, что подтверждается их высоким содержанием и преимущественной локализацией в периферичеких слоях корневого кортекса. Им принадлежит ведущая роль в контролировании колонизации корней ризобиями и значение их возрастает при неблагоприятных для симбиоза условиях.

4. Представленные в корнях комплексы фенольных соединений содержат химически активные компоненты, большей частью относящиеся к высоколи-пофильным веществам. В их числе конъюгаты различных по структуре флаво-ноидов (изофлавонов, ликвиритигенина, апигенина и др.), соединения стильбе-новой (предположительно) природы, ТЧ-фенил-2-нафтиламин, сложные эфиры орто-фталевой кислоты, ликвиритигенин, оксикумарин, свободные оксибензой-ные и оксикоричные кислоты. Возникающие под влиянием температуры и ри-зобиальной инфекции изменения химико-биологической активности фенольных комплексов обусловлены изменениями в их составе.

5. «Растворимые» липофильные фенольные соединения корневых клеток обладают радикал-скавенгирующими свойствами и могут участвовать в регуляции уровня ПОЛ. К числу активных скавенгеров относятся мажорные компоненты фенольных комплексов корневых клеток - №фенил-2-нафтиламин и некоторые конъюгаты изофлавонов.

6. Динамика изменений ПОЛ и его интенсивность после инокуляции КЫ-гоЫит свидетельствуют, о том, что у проростков гороха в условиях пониженной температуры защитные реакции выражены слабее и развиваются медленнее, чем при оптимальной температуре. Это связано с более активной ролью «растворимых» липофильных фенольных соединений в регуляции уровня ПОЛ при пониженной температуре.

7. Состав липофильных фенольных соединений в корневых клетках и корневых экссудатах растений гороха сходен, что говорит об их способности проникать через плазмалемму и включаться в регуляцию размножения ризобий в ризосфере. В экссудатах гороха стимулировать размножение НЫ:оЫит поэагит могут свободные изофлавоны, ингибировать Ы-фенил-2-нафтиламин, соединение стильбеновой природы и сложноэфирные соединения орто-фтапевой кислоты.

8. Изменение количества и состава фенольных соединений в корневых экссудатах является одним из механизмов регуляции численности клубеньковых бактерий в ризосфере и зависит от возраста растений, условий произрастания, а также от периода после инокуляции.

9. Основные аспекты действия фенольных соединений в формировании симбиоза бобовых растений с ЯЫгоЬшт, включая контролирование численности микросимбионта и участие в защитных реакциях растений, в том числе в зависимости от внешних воздействий, представлены в обобщающей схеме.

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендуемых для публикации ВАК РФ:

1. Макарова Л.Е., Лузова Г.Б., Ломоватская Л.А. Роль эндогенных фенольных соединений в инфицировании ЯЫгоЫит 1е^тто$агит корней гороха при низкой температуре И Физиол. растений. 1998. Т. 45. С. 824-832.

2. Макарова Л.Е. Влияние условий выращивания на нодуляцию растений гороха при заражении их бактериями 1Ш:оЫит ¡е^ттояагит II Агрохимия. 2001. № 12. С. 24-28.

3. Макарова Л.Е., Екимова Е.Г., Латышева С.Е., Миронова Н.В. Влияние инокуляции Rhizobium leguminosarum и температуры на содержание в корнях проростков Pisum sativum L. фенольных соединений с антиоксидантными свойствами // Раст. ресурсы. 2001. Вып. 1. С. 88-95.

4. Макарова JI.E. Изучение влияния низкой температуры и условий гидрокультуры на содержание фенольных соединений в корнях гороха в связи с инокуляцией Rhizobium leguminosarum // Сибирский экологический журнал. 2002. Вып. 2. С. 243-247.

5. Макарова Л.Е., Латышева С.Е., Екимова Е.Г. Участие эндогенных фенольных соединений в реакции корней проростков гороха на инокуляцию Rhizobium leguminosarum при разных температурах // Физиол. растений. 2003. Т. 50. С. 291-298.

6. Макарова JI.E., Рудиковская Е.Г. Роль фенольных соединений из корневых экссудатов в размножении Rhizobium leguminosarum в ризосфере гороха при разных температурах. // Агрохимия. 2003. № 8. С.61-65.

7. Макарова JI.E., Соколова М.Г., Акимова Г.П., Лузова Г.Б., Нурминский В.Н. Инфицирование и нодуляции этиолированных растений гороха, инокулирован-ных R. leguminosarum bv.viceae // Агрохимия. 2004. № 12. С. 29-35.

8. Макарова Л.Е., Нурминский В.Н. Влияние температуры на локализацию «свободных» фенольных соединений в тканях корней и деформацию корневых волосков у инокулированных Rhizobium проростков гороха // Цитология. 2005. №6. С. 519-525.

9. Глянько А.К., Макарова Л.Е., Васильева Г.Г., Миронова Н.В. Участие перекиси водорода и салициловой кислоты в бобово-ризобиальном симбиозе // Известия РАН (сер. биологическая). 2005. № 3. С. 245-249.

10. Макарова Л.Е., Рудиковская Е.Г., Латышева С.Е. Протекторная роль эндогенных фенольных соединений в процессе инфицирования корней гороха бактериями Rhizobium при разных температурах // Агрохимия. 2006. № 2. С. 51-57.

11. Глянько А.К., Акимова Г.П., Соколова М.Г., Макарова Л.Е., Васильева Г.Г. Защитно-регуляторные механизмы при развитии бобово-ризобиального симбиоза//Прикладная микробиология и биохимия. 2007. Т. 43. № 3. С. 289-297.

12. Макарова Л.Е., Латышева С.Е., Путилина Т.Е. Влияние фенольных соединений, выделяемых корнями растений гороха (Pisum sativum L.) в условиях выращивания без освещения, на размножение Rhizobium // Прикладная микробиология и биохимия. 2007. Т. 43. № 4.429-434.

13. Глянько А.К., Акимова Г.П., Макарова Л.Е., Соколова М.Г., Васильева Г.Г. Окислительные процессы на начальных стадиях взаимодействия клубеньковых бактерий (Rh. leguminosarum) и гороха (Pisum sativum L.) // Прикладная микробиология и биохимия. 2007. Т. 43. № 5. С. 576-582.

14. Рудиковская Е.Г., Федорова Г.А., Дударева Л.В., Макарова Л.Е., Рудиков-ский А.В. Влияние температуры выращивания на состав фенольных соединений в корнях гороха И Физиол. растений. 2008. Т. 55. С. 793-797.

Рецензируемые журналы:

15. Макарова JI.E., Акимова Г.П., Соколова М.Г., Рудиковская Е.Г., Лузова Г.Б. Эндогенные фенольные соединения как регуляторы проникновения и размножения Rhizobium при инфицировании корней гороха // Физиол. биох. культ, раст. 2003. Т. 35. № 3. С. 234-240.

16. Макарова Л.Е., Рудиковская Е.Г., Собенин A.M. Роль эндогенных липо-фильных фенольных соединений в перекисном окислении липидов в корнях гороха при инфицировании их Rhizobium при разных температурах // Вестник Харьковского аграрного университета, сер. Биология. 2004. № 2(5). С. 57-64.

17. Glyanko А.К., Makarova L.E., Mironova N.V., Vasilieva G.G., Luzova G.B. Impact of salicilic acid on symbiotic relations between peas and Rhizobium legumi-nosarum bv. viceae // Academic Open Internet Journal. 2003. V. 10. Part 2.

18. Глянько A.K., Макарова Л.Е., Лузова Г.Б., Миронова Н.В., Васильева Г.Г. Влияние салициловой кислоты на симбиотические взаимоотношения гороха с Rhizobium leguminosarum bv. viceae П Физиол. биохим. культ, растений. 2004. Т. 36. №2. С. 124-130.

19. Glyanko А.К., Makarova L.E., Mironova N.V., Vasilieva G.G., Luzova G.B. impact of salicilic acid on symbiotic relations between peas and Rhizobium leguminosarum bv. viceae // Pakistan Journal of biological sciences. 2004. V. 7(3). P. 431-435.

20. Makarova L.E., Akimova G.P., Sokolova M.G., Luzova G.B., Rudikovskaya E.G., Nurminsky V.N.. Role of endogenous phenolic compounds under infection of pea roots by Rhizobium leguminosarum bv. viceae II Academic Open Internet Journal. 2004. V. 12. Part 2.

21. Макарова Л.Е., Латышева C.E., Путилина Т.Е. Влияние фенольных соединений, выделяемых корнями растений гороха (Pisum sativum L.), на размножение Rhizobium в ризосфере // Вестник Харьковского аграрного университета, сер. Биология 2005. № 2(7). С. 42-49.

22. Makarova L.E., Nurminsky V.N. Temperature impact on the deformation of roots hairs with Rhizobium inoculated pea seedlings // Academic Open Internet Journal. 2005. V. 15. Part 2.

Тезисы и материалы конференций:

23. Макарова Л.Е., Екимова Е.Г., Латышева С.Е. Индукция инокуляцией Rhizobium изменений в составе фенольных соединений в корневых экссудатах гороха при разных температурах II Тезисы докладов IV съезда Общества физиологов растений России, Москва, 4-9 октября 1999 г. С. 229.

24. Макарова Л.Е., Екимова Е.Г. О перспективе использования в фармоколо-гии фенольных соединений бобовых растений // Материалы международной научно-практической конференции «Флора, растительность и растительные ресурсы Забайкалья. Чита, 2000. Т. 3. С. 43-46.

25. Latysheva S.E., Makarova L.E. The role of endogenous phenolic compounds in inducing Rhizobium leguminosarum proliferation // International Symposium «Signaling systems of plant cells» Moscow. Russia. 2001. P. 82.

26. Макарова Л.Е. Изучение влияния низкой температуры и условий гидрокультуры на содержание фенольных соединений в корнях гороха в связи с их

инокуляцией Rh. Ieguminosarum // Тезисы докладов международной конференции «Актуальные вопросы экологических исследований физиологии растений в XX веке». Сыктывкар, 2001. С. 273-274.

27. Макарова JI.E., Рудиковская Е.Г. Участие эндогенных фенольных соединений в регуляции перекисного окисления липидов в начальный период инфицирования гороха бактериями Rhizobium leguminosarum // Тезисы докладов Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехно-логии». V съезд ОФР. Пенза, 2003. С. 72.

28. Глянько А.К., Макарова JI.E., Васильева Г.Г., Миронова Н.В., Лузова Г.Б. Участие перекиси водорода и салициловой кислоты в бобово-ризобиальном симбиозе // Там же. С. 175.

29. Glyanko А.К., Makarova L.E., Mironova N.V., Vasilieva G.G., Luzova G.B. Role of salicylic acid and hydrogen peroxide in legume- Rhizobia symbiosis // 11-th Internatonal Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions. St.-Petersburg, Russia. 2003. P. 296.

30. Makarova. L.E. Effect of plant growth temperature on Rhizobia growth capacity of phenolic compounds from pea root exudates // Там же. P. 301.

31. Глянько A.K., Макарова Л.Е. Возможное участие салициловой кислоты в бобово-ризобиальном симбиозе // Тезисы докладов VI симпозиума по феноль-ным соединениям. Москва. 2004. С. 22.

32. Макарова Л.Е. Роль фенольных соединений в размножении Rhizobium в ризосфере растений гороха в зависимости от условий их выращивания // Там же. С. 53.

33. Макарова Л.Е., Рудиковская Е.Г., Глянько А.К. Роль эндогенных липо-фильных фенольных соединений в перекисном окислении липидов в корнях гороха при инфицировании их Rhizobium при разных температурах // Там же. С. 54.

34. Рудиковская Е.Г., Макарова Л.Е., Дударева Л.В., Федорова Г.А., Рудиков-ский A.B. Влияние температуры выращивания на фенольный состав корней гороха // Материалы Всероссийской научной конференции «Стрессовые белки растений». 2004, Иркутск. С. 100-103.

35. Макарова. Л.Е. Роль фенольных соединений в защитных реакциях корневых клеток бобовых растений при инфицировании Rhizobium // Тезисы докладов Второго международного симпозиума «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете». Казань, 2006. С. 76-77.

36. Макарова Л.Е. Физиологичекое значение фенольных соединений в процессе становления симбиоза бобовых растений с Rhizobium в условиях пониженной температуры // Материалы Всероссийской конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды». Иркутск, 2007. С. 160-163.

37. Макарова Л.Е., Дударева Л.В., Соколова H.A., Рудиковская Е.Г. Изучение влияния инокуляции Rhizobium на состав фенольных кислот в различных участках этиолированных корней проростков гороха, произраставших при разных температурах // Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды. Материалы Всероссийской конференции. Иркутск, 2009. С. 284-287.

38. Макарова JI.E., Смирнов В.И., Клыба Л.В., Назарова A.B., Путилина Т.Е. Изоляция и идентификация аллелопатического соединения Т\'-фенил-2-нафтиламина из Pisum sativum // Там же. С. 287-290.

39. Макарова Л.Е., Смирнов В.И., Клыба Л.В. Роль аллелопатических фенольных соединений корневых экссудатов гороха в формировании симбиотических отношений с Rhizobium при неблагоприятных условиях среды // Материалы VII международного симпозиума по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты. 2009, Москва. С. 158-159.

Подписано к печати 17.06.2010 г. Формат 60*84/16. Объем 2,3 п.л. Тираж 150 экз. Заказ № 484. Издательство Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Макарова, Людмила Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Начальные этапы взаимодействия между бобовыми растениями и ЯЫгоЫит.

1.1.1. Экссудация фенольных соединений корнями бобовых растений при взаимодействии их с ЛЫгоЫит.

1.1.2. Регуляторная роль фенольных соединений, синтезируемых бобовыми растениями, в инициации симбиоза с ЯМ-гоЫит.

1.1.3. Влияние фенольных соединений на размножение бактерий

1.1.4. Влияние абиотических факторов на начальные этапы симбиоза.

1.2. Ауторегуляция нодуляции, сопряженная с проявлениями защитных реакций у растения, роль в ней фенольных соединений

1.2.1. Реакции растительных клеток, связанные с инфицированием их микроорганизмами.

1.2.2. Защитные реакции в ассоциациях бобовые растения -ЯШгоЫит, как составляющая ауторегуляции нодуляци-онного процесса. Пути преодоления защитных систем ризобиальными клетками.

1.2.3. Механизмы антиоксидантной защиты.

1.2.3.1 Участие фенольных соединений в поддержании прооксидантно-антиоксидантного равновесия в растительных клетках.

I 3 Выводы из обзора литературы. Постановка целей и задач диссертационной работы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Схемы выращивания растений.

2.2.1 Выращивание растений на фильтровальной бумаге.

2.1.2. Выращивание растений в гидрокультуре и на песке.

2.2. Бактериальные культуры и методы оценки влияния фенольных соединений, синтезируемых в корнях гороха, на их размножение.

2.2.1. Получение культуры бактерий.

2.2.2. Определение биологической активности фенольных соединений гороха по их влиянию на размножение ЯЫго-Ыит.

2.3. Микроскопические исследования.

2.4. Методы выделения, количественного и качественного анализа содержания фенольных соединений.94

2.4.1. Выделение фенольных соединений из тканей корней и корневых экссудатов.

2.4.2. Определение содержания фенольных соединений в экстрактах корней и корневых экссудатов.

2.4.3. Методы разделения и исследования состава фенольных соединений.

2.4.3.1 Хроматография на бумаге.

2.4.3.2 Хроматография в тонком слое.

2.4.3.3 Применение колоночной хроматографии.

2.4.3.4 Проведение цветных реакций.

2.4.3.5 Исследование флуоресцентных реакций фенольных соединений.

2.4.3.6 Применение ультрафиолетовой спектроскопии.

2.4.3.7 Применение инфракрасной спектроскопии.

2.4.3.8 Исследование состава фенольных соединений методом капиллярного электрофореза.

2.4.3.9 Применение метода хромато-масс-спектро-метрии.

1.4.3.10 Применение ЯМР-спектроскопического анализа.

2.5. Исследование активности фенольных соединений в свободно -радикальных процессах.

2.5.1. Изучение влияния фенольных соединений на ПОЛ.

2.5.2. Выявление фенольных анти- и прооксидантов хромато-графическим методом.

2.6. Определение ПОЛ в экстрактах из корней гороха.

2.7. Статистическая обработка.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Влияние условий выращивания в проводимых экспериментах на нодуляцию корней гороха.

3.2. Микроскопические исследование зависимости от температуры реакции корневых клеток и локализации фенольных соединений в тканях корней проростков гороха при инокуляции Rhizobium.

3.2.1. Реакция клеток при инокуляции Rhizobium в разных частях корней при 22 и 8 °С.

3.2.2. Влияние температуры на локализацию фенольных соединений в тканях корней проростков гороха.

3.3. Исследование состава фенольных соединений в корнях и корневых экссудатах растений гороха, подверженных действию абиотических факторов и Rhizobium.

3.3.1. Влияние Rhizobium, температуры и субстрата для выращивания на состав фенольных соединений в корнях гороха.

3.3.2. Определение степени участия «растворимых» феноль-ных соединений в начальных процессах взаимодействий симбионтов.

3.3.3. Характеристика состава эндогенных и экссудируемых корневыми клетками фенольных соединений, экстрагируемых при помощи этилацетата.

3.3.3.1 Изофлавоны

3.3.3.2 Птерокарпаны.

3.3.3.3 Стильбены.

3.3.3.4 Халконы.

3.3.3.5 Флаваноны.

3.3.3.6 Флаван-З-олы (катехины).

3.3.3.7 Флавоны и флавонолы.

3.3.3.8 ! Оксикумарины.

3.3.3.9 Фенольные кислоты.

3.3.3.10 Идентификация фенольных компонентов, ранее неизвестных у бобовых культур.

3.3.3.11 Изучение антиоксидантной и биологической активностей некоторых фенольных соединений, представленных в корнях и корневых экссудатах гороха.

3.3.3.12 Влияние Rhizobium и температуры на состав этилацетатной фракции «растворимых» фенольных соединений в различных участках корней этиолированных проростков гороха.

3.3.3.13 Влияние Rhizobium, света и температуры на состав фенольных соединений в корневых экссудатах растений гороха.

3.4. Изучение роли фенольных соединений в размножении КЫго

Ыит в ризосфере в изменяющихся условиях среды.

3.4.1. Влияние температуры на экссудацию корнями гороха фенольных соединений и их биологическую активность.

3.4.2. Особенности экссудации фенольных соединений корнями гороха при отсутствии света.

3.5. Защитные реакции корневых клеток гороха при инокуляции КЫгоЫит в условиях действия разных температур.

3.5.1. Динамика изменения уровня ПОЛ и роль в его регуляции липофильных фенольных соединений в корнях гороха после инокуляции КЫгоЫит в условиях разных температур.

3.5.2. Исследования проявлений реакции на инокуляцию КЫгоЫит у клеток в разных участках корней через 1 сут от ее начала при 22 и 8 °С.

3.5.2.1 Изменения уровня ПОЛ в различающихся по чувствительности к ризобиальной инфекции участках корней.

3.5.2.2 Изучение роли фенольных соединений в защитных реакциях клеток различных по чувствительности к КЫгоЫит зон корней.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиологическое значение фенольных соединений при формировании бобово-ризобиального симбиоза в неблагоприятных условиях"

Из многообразия почвенных микроорганизмов особое внимание исследователей привлекают бактерии семейства Rhizobiaceae в связи с их способностями вступать в симбиоз с представителями широко распространенной группы бобовых растений и вызывать у них нодуляцию.

Бобово-ризобиальный симбиоз наиболее изучен из всех типов симбиозов растений с микроорганизмами. Это обусловлено практической ценностью указанного типа симбиоза и относительной легкостью исследований процесса его формирования на разных этапах.

По экономической значимости бобовые растения ставят на второе место после злаковых культур (ван Беркум, Эрдли, 2002). Это объясняется не только пищевой и технической ценностью этих культур, но и их значением для агросистем, где они являются поставщиками форм азота, доступных для соседствующих с ними растительных культур, неспособных ассимилировать атмосферный азот самостоятельно. А поскольку азот лимитирует рост культурных растений, то уникальные возможности бобовых растений в симбиозе с бактериями семейства Rhizobiaceae ассимилировать N2 считают не менее важным процессом, чем фотосинтез (Newbould, 1989). Об этом говорят данные, приведенные в публикации (Newton, 1994), согласно которым общая мировая биологическая фиксация азота составляет 17.2-107 т/год. При этом продуктивность симбиотической азотфиксации составляет 100-400 krn /га в сезон (Newton, 1994; Вэнс, 2002).

Для сохранения экологического равновесия в природе, а также для обеспечения населения необходимым количеством сельскохозяйственной продукции требуется поиск способов поддержания интенсивности биологической азотфиксации на высоком уровне.

Вступив в симбиотические отношения, бобовые растения формируют клубеньки на корнях, а иногда и на стеблях (Sesbania), а внедрившиеся в клетки растения бактерии семейства Rhizobiaceae, после превращения в неподвижные бактероиды, становятся способными связывать молекулярный азот атмосферного воздуха, преобразуя его в форму, доступную для метаболизации его растением. Это явление было открыто в 1888 году голландским ботаником-микробиологом М. Бейеринком (цит. по Мишустин, Шильникова, 1968, с. 14).

В своем обзоре Ф.Д. Дакора отметил, что наряду с ассимиляцией N2 бобовые растения и их микросимбионты вносят в экосистемы большой вклад другого плана, на который обращается меньшее внимание (Dacora, 2003). Ризобии (роды Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Allorhizo-bium, Sinorhizobium и Mezorhizobium) продуцируют химические молекулы, которые могут влиять на развитие растений. В числе этих молекул фито-гормоны, липохитоолигосахаридные Nod- факторы, люмихром, рибофлавин, Н2, выделяемый при участии бактероидной нитрогеназы. Накапливаясь в почве, Nod- факторы могут стимулировать прорастание семян, рост бобовых и небобовых растительных культур, повышать их урожайность. Очень низкие концентрации люмихрома, который могут синтезировать ри-зобиальные бактерии и в условиях культуры, также стимулируют рост и накопление биомассы растений. Бобовые растения высвобождают феноль-ные соединения в ризосферу, чем способствуют выздоравлению почв.

Формирование симбиотических отношений между клубеньковыми бактериями и бобовыми растениями представляет собой цепь морфофи-зиологических процессов у обоих симбионтов. Начало взаимодействий имеет место в ризосфере растения-хозяина. Триггерами этих взаимодействий являются специфические фенольные соединения. Они выступают в качестве сигнальных молекул со стороны растения и способствуют активизации микросимбионта: вызывают хемотаксис, экспрессию nod- генов, размножение в ризосфере и ризоплане. В ответ бактерии синтезируют ли-похитоолигосахариды (Nod-факторы), запускающие последовательность процессов, обеспечивающих прикрепление, проникновение бактерий, образование клубеньков. Данный этап взаимодействия — этап преинфекции, очевидно, должен быть чувствителен ко всем изменениям, происходящим в составе фенольных соединений, экссудируемых корнями.

После прикрепления к поверхности корневых клеток дальнейшей путь продвижения бактерий к сайту инфекции, осуществляемого благодаря инфекционным нитям, проходит через клетки эпидермы и коры (Schnitze, Kondorosi, 1998; Хадри и др., 2002) с высоким содержанием фенольных соединений (Scott, Peterson, 1979; Макарова, Родченко, 1985; Макарова, 1994). Роль присутствующих здесь фенольных соединений может быть связана с защитными реакциями, направленными на противодействие прямому инфицированию клеток корня (Vasse et al., 1993).

С увеличением содержания фенольных соединений в клетках коры во время инфицирования ризобиями связывают также появление локальных скоплений ИУК, способствующих инициации митотических процессов в коре, предшествующих формированию примордий (Schultze, Kondorosi, 1998; Hirschetal., 2001).

При выяснении функционального значения эндогенных фенольных соединений в процессах инфицирования и нодуляции, являющихся составляющими при становлении симбиоза, следует изучить их участие в контролировании числа и локальности формирующихся на корнях клубеньков. Это контролирование обеспечивают системы ауторегуляции, способствующие строго нормированному проникновению бактерий в определенные корневые локусы и формированию количества клубеньков, соответствующего энергетическим возможностям растения. Ауторегуляция нодуляции должна иметь особое значение для растения в неблагоприятных условиях его существования.

Большое значение в осуществлении деятельности систем ауторегуляции имеют фенольные соединения. Они участвуют в защитных реакциях растительных клеток, ограничивающих возможность проникновения бактерий внутрь клеток, вероятно, через регуляцию уровня активных форм кислорода как внутри клеток, так и в их клеточных стенках (Perdrino et al., 1989; Takahama, 1989; Low, Merida, 1996; Wojtaszek, 1997). Роль феноль-ных соединений в укреплении клеточных стенок связана с лигнификацией (Buffard et al., 1996). Кроме того, фенольные соединения могут влиять на размножение микросимбионта (Hartwig et al.,1991; Макарова и др., 1998), что особенно важно при колонизации ризобиями корней.

Механизмы реализации протекторных функций с участием фенольных соединений, вероятно, различны в восприимчивых и невосприимчивых к инфекции участках корней. Это может быть связано с особенностями обмена фенольных соединений в клетках корней на разных фазах их роста и развития (Макарова, 1985; 1994).

Очевидны 2 основных аспекта влияния фенольных соединений на начальные этапы формирования симбиотических отношений между бобовыми растениями и Rhizobium. Первый связан с ролью выделяемых растением во внешнюю среду фенольных соединений, их участием в аттракции, поверхностной колонизации корней, активировании генома микросимбионта, приводящего к синтезу сигнальных молекул со стороны последнего. Второй аспект действия фенольных соединений - участие в процессах, связанных с формированием примордий клубеньков, контролированием эндогенных инфекционных процессов. Естественно, такая роль может быть отведена только эндогенным фенольным соединениям.

Метаболизм фенольных соединений у растений и формирование бо-бово-ризобиального симбиоза зависят от факторов внешней среды (Школьник, Смирнов, 1983; Воробьев, 1998; Макарова и др., 1998; Bedna-rec et al., 2003;Макарова 2007). Поэтому актуальными являются исследования, направленные на выяснение значимости для симбиоза трансформаций в метаболизме и свойствах (химической и биологической активности) синтезируемых корнями фенольных соединений, происходящих при изменяющихся условиях сосуществования симбионтов. Возможно, в первую очередь все изменения в метаболизме фенольных соединений будут сказываться на составе экссудируемых корнями в ризосферу фенольных соединений, определяющих начало и характер взаимодействий симбионтов.

Вопрос о роли фенольных соединений в системах контролирования начала взаимодействий и инфицирования в условиях действия неблагоприятных внешних факторов (низких температур, недостатка освещения и др.) остается в числе неизученных. На выяснение этого вопроса направлены исследования в представляемой ниже работе, которые будут содействовать поиску способов регуляции формирования симбиоза в неблагоприятных условиях.

Работа выполнена в лаборатории физиологии устойчивости растений Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск).

Автор выражает искреннюю благодарность всем сотрудникам лабораторий физиологии устойчивисти растений и физиологии клетки за помощь в работе и поддержку, сотрудникам лаборатории физических методов исследования, обеспечившим проведение ряда экспериментов, сотрудникам Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского, участвовавших в работе, связанной с идентификацией неизученных ранее у растений гороха соединений.

Список применяемых в работе сокращений: АФА- активные формы азота АФК- активные формы кислорода ГМДС - гексаметилдисилоксан ДСК-диазотированная сульфаниловая кислота ДПНА — диазотированный п-нитроанилин ИК- инфракрасный ИУК - индолил-3-уксусная кислота

КБ, КГ, КД, КФ —конъюгаты, соответственно, биоханина А, генистеина, даидзеина, формононетина

МД- мегадальтон

МДА- малоновый диальдегид

НАДФН- никотинамидадениндинуклеотидфосфат

ПОЛ — перекисное окисление липидов

СФ - спектрофотометр

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ТСХ- тонкослойная хроматография

ТХУ- трихлоруксусная кислота

УДФ - уридиндифосфат

УФ - ультрафиолетовый

ФАЛ- фенилаланинаммоний-лиаза

ФЭК- фотоэлектроколориметр

ФС- фенольные соединения

ЭИ- электронная ионизация

ЭПС - экзополисахарид

ЯМР- ядерный магнитный резонанс

LPS - липополисахарид (англ.)

Положения, выдвигаемые на защиту:

• Активизация метаболизма фенольных соединений в корнях бобовых при инфицировании ЯЫгоЫит в неблагоприятных условиях свидетельствует об их участии в ауторегуляции инфекционного процесса.

• Содержание, состав и физиолого-биохимические свойства «растворимых» липофильных компонентов, а также степень связывания с клеточными стенками определяют приоритетные механизмы участия фенольных соединений в защитных реакциях клеток зон корней с различной восприимчивостью к КЫгоЫит.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Бобовые растения относят к семейству Fabaceae, которое подразделяется на три подсемейства {Mimosoideae, Caesalpinioideae и Papilionoideae), включающих 672 рода, которые представлены 16000-19000 видами (ван Беркум, Эрдли, 2002). Способность бобовых растений к симбиотрофному питанию азотом осуществляется благодаря образованию особой структуры- клубенька, где происходит фиксация атмосферного азота.

Клубеньки представляют собой группу определенным образом организованных растительных клеток, часть которых, так называемые «сим-биосомы», содержат бактероидные формы ризобий, благодаря которым растения получают возможность переводить двухатомный азот в первичные, доступные для него формы азотсодержащих молекул - глутамина и аспарагина (клевер, люцерна, горох) (Atkins et al., 1984; Проворов, Арон-штам, 1991).

Каждый вид или биотип ризобий вступает в симбиоз с определенным кругом растений-хозяев. Это объясняется комплементарностью генетических систем бактерий и растительных культур (Борисов и др., 1998; Хадри и др., 2002). Установлено, что одну группу бобовых растений могут ноду-лировать ризобии, представители разных видов и родов (Хадри и др., 2002). Вследствие этого возник термин «группа перекрестной инокуляции», который подразумевает под собой классы штаммов ризобий, ноду-лирующих данную группу растений. В настоящее время определен ряд групп перекрестной инокуляции, где включены различные виды бобовых растений и комплементарные им виды клубеньковых бактерий (Борисов и др, 1998; Хадри и др., 2002). Так установлено, что нодуляцию корней сои могут вызывать бактерии, являющиеся представителями родов Bradyrhizo-bium и Sinorhizobium (Борисов и др, 1998). Для примененных в наших исследованиях растений гороха (Pisum sativum L.) комплементарным является вид клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae.

Процесс формирования симбиотических взаимоотношений бобовых растений с Rhizobium подразделяют на 3 основных этапа (Борисов и др., 1998): преинфекция; инфицирование растений и формирования клубеньков; функционирование клубеньков.

Участие фенольных соединений в формировании симбиотических отношений, по-видимому, происходит на уровне корневых экссудатов и в периоды проникновения микросимбионта в ткани корней, инфицирования и функционирования сформировавшейся в клубеньках азотфиксирующей системы (Желюк, Лобова, 1973; Long, 1989; 2001; Rao, 1990; Buffard et al., 1996; Кравченко и др., 1998). В местах образования примордий клубеньков биосинтез фенольных соединений, по всей вероятности, существенно снижается (Buffard et al., 1996), но присутствие фенольных соединений здесь отмечали (Matheus et al., 1998). В сформированных клубеньках констатировали заметное увеличение содержания фенольных соединений (Желюк, Лобова, 1973), которое, возможно, происходит за счет клеток, не входящих в область бактероид-содержащих тканей (Vasse et al., 1993).

Наиболее изучена роль фенольных соединений в периоды преинфек-ции. В указанный период фенольные соединения экссудатов набухающих семян и выделяемые корнями выполняют функцию хемоаттрактантов и запускают цепь метаболических процессов у бактерий, направленных на синтез Nod-факторов - сигнальных молекул со стороны микросимбионта (Coronado et al., 1995; Buffard et al., 1996; Кравченко и др., 1998; Hirsch et al., 2001; Dakora, 2003).

С синтезом сигнальных молекул у бактерий появляется возможность к адгезии на поверхности корней (стеблей) и проникновению в ткани корня внутри инфекционных нитей. Последние несут протекторную функцию для бактерий, изолируя их от агрессивных компонентов растительных клеток, позволяют проникать во внутренние слои растительного органа к месту их дальнейшего поселения. В данный период в регуляции колонизации ризобиями корневых клеток могут иметь значение эндогенные фенольные соединения, роль которых, вероятно, напрямую связана с процессами ау-торегуляции нодуляции.

Поскольку в представляемой работе основное внимание было направлено на изучение роли фенольных соединений в начальный период, включающий этап преинфекции и начало проникновения ризобий в ткани корня, то в настоящей главе основное внимание будет уделяться исследованиям, проведенным в основном на данных этапах.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Макарова, Людмила Евгеньевна

ВЫВОДЫ

1. Изменения в обмене фенольных соединений в клетках корней проростков гороха, возникающие под влиянием температуры, условий выращивания в гидрокультуре и инокуляции ЯЫгоЫит, оказывают существенное влияние на ход формирования симбиоза.

2. Эндогенные фенольные соединения могут принимать участие в проявлении защитных реакций на инокуляцию корней ЯЫгоЫит: 1) как регуляторы активности свободнорадикальных процессов; 2) как вещества, подавляющие размножение микросимбионтов в клетках корня; 3) при формировании физического барьера для ризобий.

Механизмы реализации протекторных функций фенольных соединений неодинаковы в зонах корней, различающихся по восприимчивости к ЯЫгоЫит.

4. Представленные в корнях комплексы фенольных соединений содержат химически активные компоненты, большей частью относящиеся к высоколипофильным веществам. В их числе конъюгаты различных фла-воноидов (изофлавонов, ликвиритигенина, апигенина и др.), соединения структуре флавоноидов (изофлавонов, ликвиритигенина, апигенина и др.), соединения стильбеновой (предположительно) природы, 1Ч-фенил-2-нафтиламин, сложные эфиры орто-фталевой кислоты, ликвиритигенин, ок-сикумарин, свободные оксибензойные и оксикоричные кислоты. Возникающие под влиянием температуры и ризобиальной инфекции изменения химико-биологической активности фенольных комплексов обусловлены изменениями в их составе.

5. «Растворимые» липофильные фенольные соединения корневых клеток обладают радикал-скавенгирующими свойствами и могут участвовать в регуляции уровня ПОЛ. К числу активных скавенгеров относятся мажорные компоненты фенольных комплексов корневых клеток - 1М-фенил-2-нафтиламин и некоторые конъюгаты изофлавонов.

6. Динамика изменений ПОЛ и его интенсивность после инокуляции ЯЫгоЫит свидетельствуют, о том, что у проростков гороха в условиях пониженной температуры защитные реакции выражены слабее и развиваются медленнее, чем при оптимальной температуре. Это связано с более активной ролью «растворимых» липофильных фенольных соединений в регуляции уровня ПОЛ при пониженной температуре.

7. Состав липофильных фенольных соединений в корневых клетках и корневых экссудатах растений гороха сходен, что говорит об их способности проникать через плазмалемму и включаться в регуляцию размножения ризобий в ризосфере. В экссудатах гороха стимулировать размножение ЯЫгоЫит leguminosarum могут свободные изофлавоны, ингибировать 14-фенил-2-нафтиламин, соединение стильбеновой природы и сложноэфир-ные соединения орто-фталевой кислоты.

9. Основные аспекты действия фенольных соединений в формировании симбиоза бобовых растений с ]1ЫгоЫит, включая контролирование численности микросимбионта и участие в защитных реакциях растений, в том числе в зависимости от внешних воздействий, представлены в обобщающей схеме.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для определения роли фенольных соединений в регуляции начальных этапов формирования симбиоза между растениями гороха и Rhizobium при неблагоприятных условиях внешней среды исследования проводили в двух основных аспектах - изучали участие в инфицировании эндогенных фенольных соединений и выделяемых корневыми экссудатами во внешнюю среду, поэтому схемы выращивания растений различались. Данные схемы соответствовали поставленным задачам и предусматривали возможность сравнения изменений исследуемых показателей у испытывавших действие разных температур растений одинакового физиологического возраста.

Количество бактерий, проникающих в клетки бобового растения, должны достигать определённой величины. Растение препятствует проникновению избытка ризобий и сдерживает их агрессивность путем включения защитных механизмов (Vasse et al., 1993; Spaink, 1995; Хадри, Бис-селинг, 2002). Включая защитные механизмы, растение регулирует процессы инфицирования корней и нодуляции.

К проявлениям защитных реакций относят усиление ПОЛ, увеличение содержания «растворимых» и связанных с клеточными структурами фенольных соединений (Мерзляк, 1989; Барабой, 1991; Dixon, Paiva, 1995; Buffard et al., 1996). При этом в регуляции уровня ПОЛ могут принимать активное участие фенольные компоненты клеток, которые в зависимости от ситуаций (рН среды, присутствующих совместно с ними веществ, в частности, ионов металлов с переменной валентностью и др.) могут выступать в качестве анти- или прооксидантов (Аверьянов, Лапикова, 1988; Ро-гинский, 1988; Меныцикова, Зенков, 1993).

Изменения в метаболизме фенольных соединений, возникающие под влиянием любого фактора служат косвенным подтверждением их участия в физиолого-биохимических процессах растений, связанных с реакцией на действие этого фактора. Исходя из этого, мы проследили за изменением содержания трех групп эндогенных фенольных соединений. Две из них входили в состав «растворимых» компонентов клеток. Их последовательно экстрагировали при помощи этилацетата и н-бутанола. Третья фракция представляла группу фенольных соединений, связанных с клеточными стенками. Изменения в содержании и соотношении трех указанных групп фенольных соединений мы расценили как свидетельства изменений в метаболизме эндогенных фенольных соединений, позволившие подтвердить участие фенольных соединений в формировании симбиоза в изменяющихся условиях среды.

При изучении роли фенольных соединений в регуляции взаимодействий симбионтов мы основывались на наших суждениях, что эффективными здесь будут лабильные высоколипофильные, химически активные вещества. Таким требованиям, согласно нашим данным, отвечала одна из двух групп фенольных компонентов из фракции «растворимых» веществ. Было установлено, что активными в размножение ризобии и регуляции ПОЛ являются фенольные соединения «этилацетатной» фракции, а фе-нольные соединения бутанольных экстрактов оказались практически неактивными. Это послужило основанием для того, чтобы в дальнейшем сосредоточить все внимание на исследовании роли в симбиозе фенольных соединений, экстрагируемых при помощи этилацетата, входящих в группу веществ повышенной липофильности.

На высокую значимость «растворимых» фенольных соединений этил-ацетатной фракции при взаимодействии симбионтов указывают и результаты гистохимических исследований. Применив витальный краситель (крезиловый голубой) на фенольные соединения, оказавшийся хорошим индикатором на фенольные соединения «этилацетатной» фракции, мы установили, что данные соединения сосредоточены преимуществено в верхних слоях корневого кортекса, то есть на пути продвижения в ткани инфекционных нитей. Средняя концентрация этих соединений в корнях в 45

80 раз превышала максимальную концентрацию, оказывающую положительное действие на размножение ризобий. Благодаря такой локализации и высокой концентрации в клетках «растворимые» фенольные соединения этилацетатной фракции способны вызвать гибель ризобий, оказавшихся вне инфекционной нити, позволяющей проникать им в область гиподер-мальных кортикальных клеток корней растения-хозяина, участвующих в формировании клубеньков.

Высокая концентрация фенольных соединений в корневых клетках, ингибирующая размножение клубеньковых бактерий, вероятно, имеет отношение к системе защиты растений, призванной предотвращать прямое инфицирование указанными бактериями корневых клеток на пути прохождения инфекционных нитей.

Мы не выявили существенных различий в распределении обсуждаемых фенольных соединений по тканям в корнях проростков гороха после инокуляции их ризобиями. Влияние же температуры сказывалось в основном на распределении окраски по тканям в апекальных участках корней (0-5 мм от кончика корня), содержащих меристематические и растягивающиеся клетки. Здесь расширялась зона окрашиваемых клеток в коре, а к 5-му мм довольно интенсивно окрашивались еще и клетки стелы в области формирования сосудистых пучков.

Получены доказательства влияния температуры и инокуляции на состав группы фенольных компонентов, экстрагировнных нами при помощи этилацетата.

В составе указанной группы фенольных соединений нами установлено присутствие конъюгатов изофлавонов (некоторые из них содержали ванилин-положительные компоненты), конъюгата апигенина, катехинов, соединений халконового и стильбенового типа, оксикумарина, ликвиритиге-нина и его конъюгата, азотсодержащего ароматического соединения - >1-фенил-2-нафтиламина, дибутилового и диоктилового эфиров ортофталевой кислоты. В малых количествах присутствовали свободные окси-коричные (феруловая, п-кумаровая, о-кумаровая) и оксибензойные кислоты (бензойная, п-оксибензойная, ванилиновая, салициловая, гентизиновая, д- резорциловая, галловая).

Примечательным является присутствие в корнях проростков гороха при оптимальной температуре гентизиновой и q-резорциловой кислот, а в корнях, испытывавших действие пониженной температуры, - только <;-резорциловой кислоты. По данным литературы, обе эти кислоты являются производными салициловой и могут образовываться путем скавенгирова-ния ею ОН-радикалов (Richmond et al., 1981; Belles et al., 1999; Dixon, Paiva,1995).

Согласно многочисленным данным литературы, большинство из обнаруженных нами соединений можно отнести к высокоактивным веществам, способным влиять на метаболомные системы корневых клеток и в том числе на формирование симбиоза между бобовыми растениями и Rhizo-Ыит. Отчасти это подтверждено и результатами наших исследований. Показано, что ряд фенольных соединений, из числа обнаруженных у растений гороха и отнесенных нами к числу мажорных компонентов, могут оказывать влияние на уровень ПОЛ. К таким соединениям относятся 1чГ-фенил-2-нафтиламин и некоторые конъюгаты изофлавонов. Тот же ]\Г-фенил-2-нафтиламин, соединение стильбеновой природы и сложноэфирные соединения орто-фталевой кислоты, встречавшиеся в составе эндогенных компонентов корней и в корневых экссудатах, ингибировали размножение ри-зобий in vitro.

При разных температурах через 6, 12, 24, 48 ч после инокуляции Rhi-zobium были прослежены изменения показателей ПОЛ на уровне всего корня. Показано, что динамика изменения ПОЛ и степень его усиления после инфицирования зависит от температуры, при которой росли проростки. Показатели ПОЛ свидетельствовали, что быстрее и интенсивнее развивались защитные реакции в корневых клетках при температуре 22 °С. Данный процесс стабилизировался в корнях через 24 ч после инокуляци. В условиях температуры 8 °С, не оказывающей повреждающего действия на растения, защитные реакции, связанные с изменением уровня АФК, замедлены и менее выраженный максимум активности ПОЛ обнаруживается через 24 ч после инокуляции.

По коэффициентам корреляции, рассчитанным по показателям анти-оксидантной активности «растворимых» фенольных соединений этилаце-таной фракции и ПОЛ, установлено, что при оптимальной температуре регуляция активности ПОЛ обсуждаемыми соединениями возможна только в неинфицированных корнях. При пониженной температуре она вероятна в корнях как инфицированных, так и неинфицированных проростков.

Показано, что существуют возможности реализации антиоксидантной активности тех же фенольных соединений в нелипидных системах (Руди-ковская, 2004), что должно сказываться на общем уровне АФК в клетках, и, вероятно, на интенсивности ПОЛ.

В условиях низких температур особенно чувствительным к действию низкотемпературного фактора является период инфицирования, включая проникновение ризобий в корневые волоски, рост и ветвление инфекционных нитей (Gibson, 1971; Kumarasinghe, Nutman, 1979; Linch, Smith, 1994; Zhang, Smith, 1994; Воробьев, 1998; Макарова, 2001).

При изучении роли эндогенных фенольных соединений в защитных реакциях корневых клеток при инфицировании корней ризобиями интересным является этап взаимодействия симбионтов, когда в корнях начинают выявляться зоны, различающиеся по чувствительности к микросимбионту. При этом имеются возможности для оценки реакции корней, испытывавших действие разных температур. Работая в таком направлении, мы с помощью светового микроскопа проследили за особенностями взаимодействий эпидермальных клеток корней с ризобиями через 24 ч после инокуляции, выявляя зоны адгезии, корневых волосков, неинфицируемые участки корней. После этого исследовали изменения после инокуляции показателей реакции биохимическими методами в пятимиллиметровых участках корней, нарезанных последовательно в направлении от апекса корня к его основанию.

Результаты микроскопических исследований позволили заключить, что вследствие ингибирования низкой температурой роста корней и корневых волосков медленно увеличивается площадь зоны, где корневые волоски способны допустить проникновение в них бактерий. За 24 ч наблюдений, прошедшие от начала инокуляции, при температуре 8 °С у корней проростков протяженность зоны корневых волосков была короче в 5-6 раз аналогичной зоны, корней, рост которых проходил при оптимальной температуре - 22 °С.

При оптимальной температуре в зоне корневых волосков наблюдали все этапы взаимодействия корневых волосков с микросимбионтом. В их числе появления у волосков небольших изгибов, перетяжек, возникновение скручиваний, затем появление внутри корневых волосков инфекционных нитей. Выделялся участок, отличавшийся присутствием на нем корневых волосков, достигавших в длину 200 мкм и выглядевших пустыми, и участок с зрелыми корневыми волосками, не вступающими во взаимодействие с ризобиями (Не1<Мга е1 а1., 1994). При пониженной температуре на поверхности корней обнаруживались в основном начинающие рост корневые волоски. Часть из них при достижении размеров более 20 мкм проявляли реакцию на ризобиальную инфекцию в виде искривлений и лишь в небольшой части корневых волосков, достигших длины 90-120 мкм, нами были выявлены инфекционные нити.

В качестве показателей реакции, определяемых биохимическими методами, были ПОЛ, содержание липофильных «растворимых» фенольных соединений и их активность в ингибировании ПОЛ, содержание фенольных соединений, связаных с клеточными стенками, которые мы получали для проростков гороха, росших при разных температурах.

8 "С

Рис. 64. Изменения через 24 ч после инокуляции ЛЫгвЫит в показателях ПОЛ, содержания и антиоксидантной активности «растворимых» липофильных, количества связанных с клеточными стенками фенольных соединений в клетках различных участков корней, росших при температурах 22 и 8 °С.

По оси ординат даны соотношения одноименных показателей в равноудаленных от кончика корней участках у инокулированных и неинокулированных проростков, росших при одинаковых температурах. Положительные значения указывают на увеличение, отрицательные — на снижение значений относительно неинокулированных (контрольных) проростков.

Рисунок 64, обобщающий результаты исследования показателей реакции клеток в разных участках корней, иллюстрирует альтернирующий характер их изменений вдоль корня. Значения на рисунке отражают степень и направленность изменений показателей после инокуляции в участках корней. Они показывают, что, так или иначе, клетки различных участков корней могут противодействовать прямому инфицированию. В одних случаях благодаря увеличению уровня АФК, который определяют степень антиоксидантной активности и накопления в тканях «растворимых» фе-нольных соединений. Другим путем противодействия инфекции является усиление клеточных стенок при помощи внедрения в их состав фенольных полимеров, то есть формирования физического барьера для ризобий. Негативным для проникновения ризобий является и существенное увеличение в корневых клетках содержания «растворимых» фенольных соединений, способных ингибировать размножение бактерий.

По-видимому, к числу наиболее защищенных от инфицирования участков относится апикальная часть корней, где сосредоточены меристема-тические и растягивающиеся клетки. При обеих температурах здесь реакция клеток на инокуляцию была одинаковой: после инокуляции усиливалось ПОЛ, чему, по-видимому, не могло противодействовать повышение содержания «растворимых» липофильных фенольных соединений и возрастание их антиоксидантной активности. В этих участках корней усиливались также процессы связывания фенольных соединений с клеточными стенками.

При обеих температурах сходным был характер проявлений защитных реакций в участке с начинающими рост корневыми волосками, который при 22 °С расположен на расстоянии 5-10 мм, а при 8 °С - на расстоянии 915 мм от кончика корня.

Примечательно, что после инокуляции в тканях этих участков заметно снижалась концентрация «растворимых» липофильных фенольных соединений. Возможно, это снижение, обусловлено экссудацией данных веществ во внешнюю среду. Такое предположение может иметь подтверждение. Так, данные литературы указывают, что наибольшее значение для экспрессии wcxi-генов микросимбионта имеют фенольные соединения, выделяемые корнями в области растущих корневых волосков (Redmond et al., 1986; Peters, Long, 1988). В этой же области предполагают наличие участков, ответственных и за выделение корнями ингибиторов экспрессии ризо-биальных яос/-генов (Redmond et al., 1986).

Исходя из сказанного выше, можно предположить, что участки корней, где практически одинаковым образом после инокуляции изменялись все изученные нами показатели, включая уменьшение в их тканях концентрации «растворимых» липофильных фенольных соединений, входят в состав зоны адгезии, отвечающей за экссудацию фенольных соединений, обладающих аттрагирующим и активирующим действием в отношении микросимбионта.

Можно также отметить, что усиление ПОЛ в ряде участков сопряжено с ослаблением антиоксидантной активности «растворимых» липофильных фенольных соединений.

Механизм противоположно направленного влияния тех же фенольных соединений на уровень ПОЛ просматривается после инокуляции при 8 °С в зоне адгезии, в участке, расположенном на расстоянии 5-10 мм от кончика корня. Здесь небольшое снижение антиоксидантной активности компенсируется существенным возрастанием их содержания, что в итоге понижало ПОЛ.

К числу неинфицируемых относятся зоны зрелых корневых волосков и базальная часть корней. В нашем случае это участок 8 у корней, росших при 22 °С и участок 5 у корней, росших при 8 °С. Независимо от инокуляции, в клетках этих участков повышено содержание фенольных соединений, связанных с клеточными структурами. Данная группа фенольных соединений, совместно с лигнином, содержание которого характерно для дифференцированных клеток (Акимова, Маричева, 1980), по-видимому, обеспечивают защиту от проникновения в эти клетки ризобий.

Особенностью реакции на инокуляцию у клеток обсуждаемых участков является зависимость от температуры тенденции изменений в них изученных показателей. При 22 °С происходит небольшое усиление связывания фенольных соединений с клеточными стенками, а при 8 °С — снижение этого процесса.

Таким образом, механизмы реализации протекторных функций у фенольных соединений различались в инфицируемых и неинфицируемых областях корней, а также в разных участках корневых зон, предрасположенных к инфицированию. По-видимому, эти механизмы обеспечивают локальность инфицирования корневых клеток ризобиями. При этом в одних участках корней это может проявляться полным запретом инфицирования, в других возникают возможности для инфицирования корневых клеток с последующим формированием клубеньков.

Сравнивая после инокуляции состав фенольных соединений в исследуемых участках инфицированных и неинфицированных корней проростков, росших при разных температурах, мы констатировали различия в их составе в основном за счет наиболее липофильной группы данных компонентов, являющихся мажорными в составе этилацетатной фракции. Из чего можно заключить, что эффект изученных нами экстрактов фенольных соединений на ПОЛ зависел от состава представленных в них компонентов. Это согласуется с данными авторов, доказавшими зависимость эффективности фенольных соединений в ингибировании ПОЛ от их структурного разнообразия и количества в реакционной среде (Osawa et al., 1987; Cas-telluccio et al., 1995; Watanabe et al., 1998; Hodges et al., 1999; Kähkönen et al., 1999; Li, Xie, 2000). Эффект действия на ПОЛ отдельно взятого фе-нольного соединения может определяться его сруктурой (Castelluccio et al., 1995; Mitchell et al, 1998; Li, Xie,2000).

Приведенные результаты подтверждают известные в литературе факты неодинаковой реакции корневых клеток в разных частях корня на инфекцию ризобиями (Roughley, 1970; Соколова, 2001; Акимова и др., 2002; Lohar et al., 2007). Возможно, сочетание тех или иных видов проявлений защитных реакций имеют отношение к локальности взаимодействий корневых клеток с ризобиями. В частности, это касается фенольных соединений, метаболизм которых может иметь особенности в инфицируемых и неинфицируемых участках корней, и даже в отдельных областях зоны инфицирования. Эти особенности, по-видимому, предопределяют специфичность взаимодействий ризобий с корневыми клетками в зонах адгезии, возникновения деформаций корневых волосков и в зонах корневых волосков, где происходит проникновение ризобий, находящихся внутри инфекционных нитей.

Начальный период взаимодействия симбионтов, или период преин-фекции, происходит в ризосфере корней растения, куда поступают синтезируемые в корнях и экскретируемые во внешнюю среду обоими симбионтами разнообразные вещества, призванные влиять на ход симбиотических отношений. Состав этих веществ, вероятно, должен меняться по мере смены этапов формирования симбиоза: от узнавания, хемотаксических перемещений и до образования первых клубеньков.

Инициируются взаимодействия симбионтов фенольными соединениями, высвобожденными корневыми клетками в ризосферу. От этих фенольных соединений зависит активизация бактерий, выражающаяся экспрессией у них nod-тшов (nodABCD) ответственных за синтез сигнальных молекул - Nod-факторов. Nod-факторы запускают у растения-хозяина целый комплекс физиолого-биохимических процессов, связанных с прикреплением ризобий к корневым клеткам и проникновением их в возникшие корневые образования: клубеньки.

При инфицировании корней бобового растения большое значение имеет численность клубеньковых бактерий в ризосфере (Мишустин, Шильникова, 1973). Численность ризобий в ризосфере определяется условиями для их размножения.

Одним из сильнодействующих факторов, влияющих на размножение бактерий и инфицирование ризобиями бобовых растений, является температура (Мишустин, Шильникова, 1973; Воробьев, 1998; Макарова и др., 1998).

Размножение Rhizobium относят к иооЮ-независимым процессам (Hartwig et al., 1991). Не установлено, служат ли фенольные соединения корневых эксудатов источником углеводов для размножающихся бактерий или индукторами /to-генов (Margolin, Long, 1994), контролирующих их размножение. Известно лишь, что от структуры фенольных соединений зависит их влияние на размножение клубеньковых бактерий (Hartwig et al., 1991) и их метаболизация с помощью данных бактерий (Cooper, Rao,

1995).

Влияние инокуляции на содержание фенольных соединениий в корневых экссудатах, оказывающих эффект на процесс размножения клубеньковых бактерий, в настоящее время не изучено. Тем не менее, показано ее влияние на состав в корневых экссудатах флавоноидов (Lawson et al.„

1996).

В разные периоды после инокуляции изучали влияние температуры и света на количество экссудируемых корнями фенольных компонентов и их ростовую активность в среде с ризобиальной культурой.

Следует отметить сходство состава фенольных соединений, экстрагированных этилацетатом из корневых экссудатов с составом аналогичной группы эндогенных компонентов. В наибольшей мере это сходство выявлялось при сравнении наиболее липофильной их части, характеризующейся неподвижностью на хроматограммах в водных системах. Это говорит о лабильности представителей данной группы и их участии в оперативном реагировании на действие разных факторов.

К таким соединениям, очевидно, относится Н-фенил-2-нафтиламин, который вначале мы выявили в составе корневых экссудатов, а затем в числе эндогенных компонентов.

В отличие от комплексов эндогенных фенольных соединений такие же комплексы из экссудатов содержали свободные изофлавоны, наринге-нин и эриодиктиол, но в малых количествах.

По нашим данным, изофлавоны могут оказывать стимулирующий эффект на размножение ризобий. Эриодиктиол и нарингенин отнесены к специфическим индукторам nod-генов R. leguminosarum (Peters, Long, 1988). В составе экссудатов присутствовали проантоцианидины и ряд ароматических веществ, химическую структуру которых не удалось установить.

Различия в составе фенольных соединений в корневых экссудатах возникали по мере роста растений, в зависимости от условий температуры и под влияние инокуляции.

Обнаруженную нами в 1-е сут эксперимента реакцию проростков на инокуляцию ризобиями, выражающуюся почти двукратным, в сравнении с одновозрастными контрольными растениями, усилением экссудации фенольных соединений в ризосферу, возможно, следует связывать со снижением содержания эндогенных фенольных соединений в зоне, где происходит взаимодействие с клубеньковыми бактериями на этапе адгезии. Таковым является участок, на поверхности которого имеются начинающие рост корневые волоски, а в клетках его при инфицировании снижается содержание фенольных соединений. По всей вероятности, именно из клеток обсуждаемой корневой зоны в основном происходит экссудация фенольных соединений в ризосферу (Peters, Long, 1988), способствуя привлечению к ним ризобий и их адсорбции на поверхности корня (Makarova et al., 2004).

Целесообразной может быть регуляция численности бактерий в ризосфере после первой волны инфицирования корней, поскольку избыточное для растения инфицирование может привести к возрастанию энергетических затрат на формирование клубеньков и негативно сказываться на жизнедеятельности самого растения, как это происходит в случаях с суперклубеньковыми мутантами (Сае1апо-Апо11ез, ОгеБзЬк^, 1991).

Полученные результаты позволяют высказать предположение о лимитировании размножения ризобий в ризосфере бобового растения вскоре после инокуляции. Оно может обусловливаться снижением биологической активности комплекса фенольных соединений, представленного в корневых экссудатах и уменьшением их содержания в ризосфере в отдельные периоды после инокуляции.

Результаты исследований позволяют заключить, что путем варьирования количества фенольных соединений и их состава в корневых экссудатах растения могут регулировать численность бактерий в ризосфере в разные периоды их роста и развития, а также в разные периоды после инокуляции. Показано, что при пониженной температуре лимитирование численности бактерий в прикорневой зоне возможно путем снижения количества и изменения состава высвобождаемых корневыми клетками фенольных соединений. Аналогичным путем может снижаться инфекционная нагрузка на растения и при выращивании их в таких неблагоприятных для симбиоза условиях, как отсутствие освещения.

В составе корневых экссудатов могут присутствовать аллелопатиче-ские фенольные вещества, регулирующие размножение ризобий. Показано, что к снижению численности клеток микросимбионта в ризосфере могут иметь отношение некоторые фенольные соединения. К ним отнесены Ы-фенил-2-нафтиламин, сложноэфирные соединения орто-фталевой кислоты и соединение стильбеновой природы, выявленные нами в корневых экссудатах и показавшие себя ингибиторами размножения ризобий. Даже невысокие их концентрации способны были ингибировать размножение ризо-бий в минимальной жидкой среде.

Таким образом, полученные результаты позволяют дополнить имеющуюся в научной литературе информацию о роли фенольных соединений в регуляции начальных этапов инфекционного процесса при формировании симбиоза между бобовыми растениями и КЫгоЫыт. Их участие в становлении симбиотических отношений можно представить в виде схемы на рисунке 65, составленной на основе литературных данных и результатов наших исследований,отраженных в этой схеме красным цветом и связанных с выяснением наиболее важных аспектов участия фенольных соединений в ауторегуляции инфицирования корней бактериями ЯЫгоЬшт в зависимости от условий выращивания растения. В частности, впервые показано значение фенольных соединений корневых экссудатов в контролировании растением инфицирования через регуляцию численности микросимбионта в его ризосфере после инокуляции и в неблагоприятных для симбиоза условиях. Регуляции симбиоза на этом этапе обуславливается модификациями количества выделяемых корневыми клетками фенольных соединений и их ростовой активности за счет присутствующих в их составе фенольных компонентов, воздействующих на размножение ризобий.

Фенольные соединения, присутствующие в корнях, участвуют в защитных системах, предотвращающих прямое инфицирование преобладающей части их клеток. Впервые показано, что степень участия фенольных соединений в разных видах защитных реакций: в регуляции уровня АФК, в укреплении клеточных стенок неодинакова в различных областях корней и может изменяться под влиянием температуры, действующей на растения. То есть, механизмы участия фенольных соединений в защитных реакциях зависят от степени восприимчивости клеток к инфекции КЫго

ПРЕИНФЕКЦИЯ

ЯЫгоЫит 1е£итто$агит Ьу. угсгае

Рис. 65. Схема взаимодействия симбионтов при участии фенольных соединений, синтезируемых корнями растения-хозяина.

Ыит и от условий температуры. Это доказывает, что эндогенные феноль-ные соединения призваны обеспечить строго нормированное проникновение бактерий в определенные корневые локусы и формирование количества клубеньков, соответствующего энергетическим возможностям растения.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Макарова, Людмила Евгеньевна, Иркутск

1. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. Генерация кислородных радикалов фенольными соединениями в связи с иммунитетом растений // Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Рига: Рижский мед. ин-т, 1988. С. 203-222.

2. Акимова Г.П., Маричева Э.А. Процесс дифференцировки клеток кончика корня кукурузы при пониженной температуре // Особенности физиологических процессов у растений при низких положительных и низких температурах. Якутск: Якутский университет, 1980. С. 3-11.

3. Акимова Г.П., Верхотуров В.В., Соколова М.Г., Нечаева Л.В., Лузова Г.Б. Изменение активности и каталитических свойств пероксидазы корней гороха на начальных этапах инфицирования Rhizobium legumi-nosarum // Агрохимия. 2004а. № 1. С.86-90.

4. Акимова Г.П., Соколова М.Г., Нечаева Л.В. Влияние Rhizobium legu-minosarum на рост корней гороха при пониженной температуре // Фи-зиол. растений. 1999. Т. 46. № 5. С. 806 -810.

5. Акимова Г.П., Соколова М.Г., Нечаева Л.В., Лузова Г.Б., Сидорова К.К. Роль пероксидазы во взаимодействиях растений гороха с Rhizobium II Агрохимия. 2002. №12. С.37-41.

6. Акимова Г.П., Соколова М.Г., Нечаева Л.В., Лузова Г.Б., Сидорова К.К. Роль ИУК и пероксидазы в инфицировании растений гороха с разной степенью нодуляции // Физиология и биохимия культ, растений. 2005. Т. 37. № 1. С. 58-65.

7. Айвазов Б.В. Введение в хроматографию. 1983. М.: Высшая школа. 240 с.

8. Андреева И.Н., Свардж К., Козлова Г.И., Рейхман Л.А. Изменение ультраструктуры и азотфиксирующей активности клубеньков сои под влиянием затопления // Физиол. растений. 1987. Т. 34. Вып. 3. С. 528532.

9. Бандюкова В.А., Казаков А.Л. Успехи в химии природных изофлаво-ноидов // Химия природных соединений. 1978. № 6. С. 669-689.

10. Барабой В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов // Успехи совр. биологии. 1991. Т. 111. Вып. 6. С. 923-931.

11. Беллами Л. Инфракрасные спектры молекул. М.: ИЛ, 1957. 444 с.

12. Берестецкий В.А. Методические рекомендации по получению новых штаммов Rhizobium leguminosarum и оценки их эффективности. Л.: ВНИИСХМ, 1976. 31 с.

13. Блажей А., Шутый Л. Фенольные соединения растительного происхождения. 1977. М.: Мир. 240 с.

14. Бревин Н. Колонизация клеток и тканей Rhizobium: структура и развитие инфекционных нитей и симбиосом // Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями. / Под ред. Г.

15. Спайнка, А. Кондороши, П. Хукаса. Пер с англ. под ред. И.А. Тихоновича, Н.А. Проворова. С.-Петербург: ВНИИСХМ, 2002. С. 451-464.

16. Бранд Д.,Эглинтон Г. Применение спектроскопии в органической химии / Под ред. Корнилова М.Ю., Чуйгука В.А. М.: Мир, 1967. 279 с.

17. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. 252 с.

18. Воробьёв В.А. Симбиотическая азотфиксация и температура. Новосибирск: Наука, 1998. 126 с.

19. Воробьев В.А., Замащикова O.JI. Особенности формирования корневых клубеньков гороха при пониженной температуре // Физиол. и биохим. культ, растений. 1987. Т. 19. Вып. 2. С. 137 142.

20. Георгиевский В.П., Комиссаренко Н.Ф., Дмитрук С.Е. Биологически активные вещества лекарственных растений / Под ред. Т.П. Березовской. Новосибирск: Наука, Сибирское отделение, 1990. 312 с.

21. Глянько А.К., Акимова Г.П., Соколова М.Г., Макарова JI.E.,, Васильева Г.Г. Защитно-регуляторные механизмы при развитии бобово-ризобиального симбиоза // Прикл. микробиол. и биохимия. 20076. Т. 43. JVb 3. С. 289-297.

22. Глянько A.A., Васильева Г.Г. Особенности действия активных форм кислорода и азота при бобово-ризобиальном симбиозе // Вестник харьковского национального ун-та. Сер. Биология. 2007. Вып.З (12). С. 27-41.

23. Глянько А.К., Макарова Л.Е., Лузова Г.Б., Миронова Н.В., Васильева Г.Г. Влияние салициловой кислоты на симбиотические взаимоотношения гороха с Rhizobium leguminosarum bv. viceae II Физиол. биохим. культ, растений. 2004. Т. 36. № 2. С. 124-130.

24. Глянько А.К., Макарова Л.Е., Васильева Г.Г., Миронова Н.В. Участие перекиси водорода и салициловой кислоты в бобово-ризобиальном симбиозе // Известия Академии наук (сер. биологическая). 2005. № 3. С. 245-249.

25. Глянько А.К., Макарова Л.Е., Лузова Г.Б., Васильева Г.Г., Миронова Н.В. Влияние салициловой кислоты на симбиотические взаимоотношения гороха и Rhizobium leguminosarum bv. viceae II Физиол. и биохим. культурн. растений. 2004. Т. 36. № 2. С. 124-130.

26. Граскова И.А., Антипина И.В., Потапенко О.Ю., Войников В.К. Динамика активности внеклеточных пероксидаз суспензионных клеток картофеля при патогенезе кольцевой гнили // Докл. РАН. 2004. Т. 399. № 4. С. 567-570.

27. Дмитриев А.П. Сигнальные молекулы растений для активации защитных реакций в ответ на биотический стресс // Физиол. растений. 2003. Т. 50. № 3. С. 465-474.

28. Евстратова Р.И., Запесочная Г.Г. Ы-фенил-2-нафтиламин из Centaurea salonitana II Химия природных соединений. 1977. Т. 13. № 4. С. 583.

29. Ермаков А.И., Ярош Н.П. Определение алкалоидов и гликозидов // Методы биохимического исследования растений / Под ред. А.И. Ермакова. Л.: Агропромиздат. Ленингр. отд-е, 1987. С. 298-351.

30. Жанаева Т.А.,Кривощекова О.Е., Семенов А.А., Минаева В.Г. N-фенил-2-нафтиламин из цветов Burleurum aureum II Химия природных соединений. 1989. Т. 25. № 3. С. 377.

31. Желюк В.М., Лобова М.А. Динамика фенольных соединений в онтогенезе люпина в связи с инокуляцией клубеньковыми бактериями // Физиол. и биохим. культ, растений. 1973. Т. 5. Вып. 5. С. 516-521.

32. Жизневская Г.Я., Троицкая Т.Н., Бороденко Л.И., Измайлов С.Ф. Пе-роксидаза и каталаза в корневых клубеньках кормовых бобов при эффективном и неэффективном симбиозе с ризобиями // Физиол. и биохим. культ, растений. 2001. Т. 33. № 4. С. 285-290.

33. Жиров В.Л., Мерзляк М.Н., Кузнецов Л.В. Перекисное окисление мембранных липидов холодостойких растений при повреждении отрицательными температурами//Физиол. растений. 1982. Т. 29. Вып. 6. С. 1045- 1052.

34. Загоскина Н.В., Олениченко H.A., Чжоу Юньвэй, Живухина Е.А. Способность различных сортов пшеницы (Triticum aestivum L.) к образованию фенольных соединений // Прикладная биохимия и микробиология. 20056. Т. 41. № 1.С. 113-116.

35. Запрометов М.Н. Биохимия катехинов. М: Наука, 1964. 296 с.

36. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и методы их исследований // Биохимические методы в физиологии растений / Под ред. O.A. Пав-линова. М.: Наука, 1971. С. 185-207.

37. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М.: Высшая школа, 1974. 214 с.

38. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: Распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука, 1993. 272 с.

39. Зейкель М.Л. Выделение и идентификация фенольных соединений в биологических материалах // Биохимия фенольных соединений / Под ред. Харборна Дж. Перевод под ред. Эмануэля Н.М.М.: Мир, 1968. С.34.69.

40. Евстратова Р.И., Запесочная Г.Г. 1М-фенил-2-нафтиламин из Centaurea salonitana // Химия природных соединений. 1977. № 4. С.582.

41. Ермаков А.И., Ярош Н.П. Определение эстрогенных изофлавонов // Методы биохимического исследования растений / Под ред. А.И. Ермакова. Л.: Агропромиздат, 1987. С. 331-333.

42. Кемптер Г. Основной практикум по органической химии / Пер. с не-мецк. д.х.н. В.М. Потапова. М.: Мир, 1973. 208 с.

43. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.К. Роль низкомолекулярных ан- тиоксидантов при окислительном стрессе // Успехи совр. биологии. 1993. Т. 113. Вып. 4. С.456-470.

44. Кефели В.И. Природные ингибиторы роста и фитогормоны. М.: Наука, 1974. 253 с.

45. Костюк В.А., Потапович А.И. Роль анион- радикала кислорода в процессах ауто- и фотоокисления флавоноидов растений // Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Рига: Рижский мед. ин-т, 1988. С. 45-54.

46. Кулинский В.И. Активные формы уислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита // Соросовский образовательный журнал. 1999. № 1. С.2-1.

47. Курганова JI.H., Веселов А.П., Гончарова Т.А., Синицына Ю.В. пере-кисное окисление липидов и антиоксидантная система защиты в хло-ропластах гороха при тепловом шоке // Физиология растений. 1997ю Т. 44. № 5ю С. 725-730.

48. Куприянович Ю. Н., Медведева С. А., Рохин А. В., Каницкая JI. В. Ре-гиоселективность реакций полимеризации феруловой кислоты под действием оксидазных ферментов // Биоорг. химия. 2007. Т. 33 №5. С. 555-562.

49. Лаанест Л.Э., Маргна У.В. Влияние температуры на активность фени-лаланин-аммиак-лиазы (К.Ф. 4.3.1.5) в проростках ржи и гнечихи // Физиология и биохимия культ, растений. 1974. Т. 6. Вып. 4. С. 386390.

50. Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

51. Луковникова P.A., Ярош Н.П. Определение витаминов и других биологически активных веществ //Методы биохимического исследования растений / Под ред. А.И. Ермакова. Л.: Агропромиздат. Ленингр. отд-е, 1987. С.85-122.

52. Ляхович В.В., Вавилин В.А., Зенков Н.К., Меныцикова Е.Б. Активная защита при окислительном стрессе. Антиоксидант-респонсивный элемент // Биохимия. 2006. Т. 71. Вып. 9. С. 1183-1197.

53. Макарова Л.Е. Локализация фенольных соединений в тканях корня кукурузы в условиях низкой положительной температуры // Физиол. и биохим. культ, растений. 1994. Т. 26. Вып. 1. С. 45-50.

54. Макарова Л.Е. Влияние условий выращивания на нодуляцию растений гороха при заражении их бактериями Rhizobium leguminosarum // Агрохимия. 2001. № 12. С. 24-28.

55. Макарова Л.Е. Изучение влияния низкой температуры и условийгидрокультуры на содержание фенольных соединений в корнях гороха в связи с инокуляцией Rhizobium leguminosarum II Сибирский экологический журнал. 2002. № 2. С. 243-247.

56. Макарова Л.Е, Латышева С.Е, Екимова Е.Г. Участие эндогенных фенольных соединений в реакции корней проростков гороха на инокуляцию Rhizobium leguminosarum при разных температурах // Физиол. растений. 20036. Т. 50, № 2. С.291-295.

57. Макарова Л.Е, Латышева С.Е, Путилина Т.Е. Влияние фенольных соединений, выделяемых корнями растений гороха {Pisum sativum L.), на размножение Rhizobium в ризосфере // Вестник Харьковского аграрного университета. 2005. № 2(7). С. 42-49.

58. Макарова Л.Е, Латышева С.Е, Путилина Т.Е. Влияние фенольных соединений, выделяемых корнями растений гороха {Pisum sativum1.) в условиях выращивания без освещения на размножение Rhizobium II Прикл. Микробиол. и биохимия. 2007. Т. 43. № 4. 429-434.

59. Макарова JI.E., Лузова Г.Б., Ломоватская Л.А. Роль эндогенных фенольных соединений в инфицировании Rhizobium leguminosarum корней гороха при низкой температуре // Физиол. растений. 1998. Т. 45. N6. С. 824-832.

60. Макарова Л.Е., Нурминский В.Н. Влияние температуры на локализацию «свободных» фенольных соединений в тканях корней и деформацию корневых волосков у инокулированных Rhizobium проростков гороха // Цитология. 2005. № 6. С. 519-525.

61. Макарова Л.Е., Родченко О.П. Содержание фенолкарбоновых кислот в клетках корней сортов кукурузы, различающихся по устойчивости к низким температурам // Докл. АН СССР. 1984. Т. 274. № 5. С. 1272 1276.

62. Макарова Л.Е., Рудиковская Е.Г. Роль фенольных соединений из корневых экссудатов в размножении Rhizobium leguminosarum в ризосфере гороха при разных температурах // Агрохимия. 2003. № 8. С.61-65.

63. Макарова Л.Е., Рудиковская Е.Г., Латышева С.Е. Протекторная роль эндогенных фенольных соединений в процессе инфицирования бактериями Rhizobium leguminosarum корней проростков гороха при разных температурах // Агрохимия. 2006. № 2. С. 51 -57.

64. Макарова Л.Е., Рудиковская Е.Г., Собенин A.M. Роль эндогенных липофильных фенольных соединений в перекисном окислении липидов корней гороха при инфицировании их Rhizobium в разных температурных условиях // ВХНАУ. 2004а. Вып. 2(5). С. 57-64.

65. Макарова Л.Е., Соколова М.Г., Акимова Г.П., Лузова Г.Б., Нур-минский В.Н. Инфицирование и нодуляции этиолированных растений гороха, инокулированных R. leguminosarum bv.viceae II Агрохимия. 20046. № 12. С. 29-35.

66. Максимов О.Б., Ребачук Н.М., Богуславская Л.Б. Скрининг для обнаружения антиоксидантной активности в экстрактах из растений // Раст. ресурсы. 1985.Т.21, вып. 2. С.216-220.

67. Максимов И.В., Черепанова Е.А. Про-/антиоксидантная система и устойчивость растений к патогенам // Успехи современной биологии. 2006. Т. 126. № 3. С. 250-264.

68. Мацек К. Проявляющие реактивы // Хроматография на бумаге / Под ред. И.М. Хайса, К. Мацека. М.: ИЛ, 1962. С. 719-794.

69. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Успехи современной биологии. 1993. Т. 113, вып. 4. С. 442-455.

70. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки // Итоги науки и техники, сер. Физиология растений. Т.6. / Под ред. И. И. Иванова. М., 1989. 165 с.

71. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. Т. 2. 1980. М.: Мир. 606 с.

72. Мийдла Х.И., Аометс Э. Влияние минерального питания и влажности почвы на содержание фенольных соединений в коре корней саженцев яблони в связи с почвоутомлением // Агрохимия. 1970. № 2. С. 11181130.

73. Мийдла Х.И., Халдре Ы., Сависаар С. Фенолкарбоновые кислоты в листьях яблони // Учен, записки Тартуского университета. 1975. Т.4. Вып. 363. С. 3-13.

74. Минаева В.Г. Флавоноиды в онтогенезе растений и их практическое использование / Под ред. М.Н. Запрометова. Новосибирск: Наука СО, 1978. 255 с.

75. Минибаева Ф.В., Гордон Л.Х. Продукция супероксида и активность внеклеточной пероксидазы в растительных тканях при стрессе // Фи-зиол. растений. 2003. Т. 50. № 3. С. 459-464.

76. Мишустин E.H., Шильникова В.К. Биологическая фиксация атмосферного азота. 1968. М.: Наука. 531 с.

77. Мишустин E.H., Шильникова В.К. Клубеньковые бактерии и инокуля-ционный процесс. М.: Наука, 1973. 288 с.

78. Новикова Т.И. Структурно-функциональные особенности бобово-ризобиального симбиоза // Автореф. Дисс. на соиск. уч. степени д.б.н. Новосибирск: Центр, сибирский бот. сад СО РАН, 2004. 32 с.

79. Олениченко H.A., Загоскина Н.В. Ответная реакция озимой пшеницы на действие низких температур: образование фенольных соединений и активность L-фенилаланин-аммиак-лиазы // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. Т. 41. № 6. С. 681-685.

80. Парпиева Г., Норбаев Н. Изучение фенолов и хинонов в растительных выделениях под влиянием у-радиации // Физиологи и биохимия культ, растений. 1978. Т. 10. № 4. С. 431-433.

81. Петров К.А. Природные регуляторы роста растений криолитозоны // Автореф. дисс. доктора биол. наук. Иркутск. СИФИБР. 2001. 48 с.

82. Плохинский H.A. Биометрия. 1970. М.: МГУ. 367 с.

83. Полевой В.В. Фитогормоны. JL: Изд-во ЛГУ. 1982. 249 с.

84. Полякова Л.В. Изменение содержания фенольных соединений в проростках горца забайкальского при низкой температуре // Физиология растений. 1979ю Т. 26. Вып. 3. С. 638-640.

85. Потапович А.И., Костюк В.А., Терещенко С.М., Афанасьев И.Б. Антиокислительная активность флавоноидов в системе микросомального перекисного окисления // Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Рига: Рижский мед. ин-т, 1988. С. 187-190.

86. Проворов H.A., Аронштам A.A. Генетика симбиотической азотфикса-ции у клубеньковых бактерий // Итоги науки и техники, сер. микро-биол. Т. 23. М.: ВИНИТИ. 1991. С. 3-97.

87. Прохазка Ж. Фенолы и ароматические кислоты // Хроматография на бумаге / Под ред И.М. Хайса, К. Мацека. М.: ИЛ, 1962. С. 301- 333.

88. Пустовойтова Т.Н. Влияние завядания и почвенной засухи на эндогенные регуляторы роста растений мезафитов // Физиология растений. 1972. Т. 19. Вып. 3. С. 622-628.

89. Пустовойтова Т.А. Рост растений в период засухи и его регуляция. В кн.: Проблемы засухоустойчивости. М.: Наука, 1979. С. 129-165.

90. Разумова М.В. Методические рекомендации для определения веществ фенольной природы / Методы определения фитогормонов и фенолов в семенах. JL: Наука, 1979. С. 61-71.

91. Родченко О.П., Маричева Э.А., Акимова Г.П. Адаптация растущих клеток корня к пониженным температурам. Новосибирск: Наука, Сибирское отделение, 1988. 147 с.

92. Розум JI.B., Сидорова Т.М., Чигрин В.В. Гликозидазная активность листьев пшеницы и устойчивость к ржавчине // Физиол. растений: 1983. Т. 30(2). С. 384-388.

93. Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты: реакционная способность и эффективность. М.: Наука, 1988. 247 с.

94. Рудиковская Е.Г. Участие эндогенных фенольных соединений в регуляции перекисного окисления липидов в начале инфицирования гороха Rh. leguminosarum при разных температурах // Автореф. дисс. канд. биол. наук. Иркутск. СИФИБР. 2004. 22 с.

95. Рудиковская Е.Г., Макарова JI.E., Дударева JI.B., Федорова Г.А., Ру-диковский A.B. Влияние температуры выращивания на фенольный состав корней гороха // Стрессовые белки растений / Материалы Всероссийской научной конференции. Иркутск, 2004. С. 100-103.

96. Рудиковская Е.Г., Федорова Г.А., Дударева JI.B., Макарова J1.E., Руди-ковский A.B. Влияние температуры выращивания на состав фенольных соединений в корнях гороха // Физиол. растений. 2008. Т.55. № 5. С. 793-797.

97. Сигелман Г.В. Исследования по физиологии биосинтеза фенолов // Биохимия фенольных соединений / Пер. с англ. под ред. акад. Н.М. Эммануэля. М.: Мир, 1968. С. 340-354.

98. Сильверстейн Р, Басслер Г., Моррилл Т. Спектрометрическая идентификация органических соединений / Пер. с англ. М.: Мир. 1977. 590 с.

99. Словарь органических соединений / Под ред. И.Н. Хейльброна, Г.М. Бэнбери. 1949, М.: ИЛ. Т. 3. 977 с.

100. Соколова М.Г. Физиологические особенности начальных этапов инфицирования корней гороха Rhizobium leguminosarim при разных температурах// Автореферат канд. дисс. Иркутск, 2001. 21 с.

101. Софронова В.Е, Петров К.А. Новый фенольный ингибитор роста из почек Duschekia fruticosa (Purp.) Pouzar // Раст. ресурсы. 2002. Т. 38. Вып. 1. С.91-97.

102. Софронова В.Е, Петров К.А. Роль стильбенов в устойчивости ольховника к стрессам криолитозоны // Сибирский экологический журнал. 2007. Т. XIV. № 1.С. 95-101.

103. Стальная И.Д, Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового ди-альдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977.С. 66-68.

104. Султанходжаев М.Н., Таджибаев М.М. Фенил-Р-нафтиламин из трех видов растений // Химия природных соединений. 1976. Т. 12. № 3. С. 406.

105. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток. М.: Наука. 2002. 294 с.

106. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. М.: Колос, 1979. 250 с.

107. Хайс И.М. Положение и форма пятен // Хроматография на бумаге / Под ред. И.М.Хайса, К. Мацека. М.:ИЛ, 1962. С. 142 -155.

108. Харборн Дж. Б. Фенольные гликозиды и их растпространение в природе // Биохимия фенольных соединений / Пер. с англ. под ред. акад. Н.М. Эммануэля. М.: Мир, 1968. С. 109-139.

109. Харборн Дж. Б. Фенольные соединения // Хроматография. Практическое приложение метода / Под ред.Э.М. Хефтмана. М.: Мир. 1986. Ч. 2. С. 240-246.

110. Харборн Дж.Б., Симмондс Н.У. Распространение фенольных аглико-нов в природе // Биохимия фенольных соединений / Пер. с англ. под ред. акад. Н.М. Эммануэля. М.: Мир, 1968. С. 70-108.

111. Четвериков А.Г., Калмансон А.Э., Харитоненков И.Г., Блюмфельд JI.A. Исследование методом ЭПР свободных радикалов в биологических объектах, возникающих во время протекания ферментативных реакций //Биофизика. 1964. Т. IX. Вып. 1. С. 18-24.

112. Чигрин В.В., Розум J1.B., Запрометов М.Н. Фенолкарбоновые кислоты и лигнин в листьях устойчивых и восприимчивых сортов яровой пшеницы при заражении стеблевой ржавчиной // Физиол. растений. 1973. Т. 20. Вып. 5. С. 942-948.

113. Школьник М.Я., Крупникова Т.А., Давыдова В.Н. Влияние недостатка бора на содержание оксикоричных кислот // Физиол. растений. 1972. Т. 19. Вып. 6. С. 1240-1244.

114. Школьник М.Я., Смирнов Ю.С. О причинах повышения содержания фенольных соединений при избытке и недостатке минеральных элементов. // Растения в экстремальных условиях минерального питания / Л.: Наука, 1983. С. 140-148.

115. Шрайнер Р., Фьюзон Р., Кёртин Д., Моррилл Т. Идентификация органических соединений. М.: Мир, 1983. 703 с.

116. Altenburger R., Brak W., Greco W.R., Groot M., Jung K., Ovari A., Riedl J., Schwab K., Küster E. On the Mode of Action of N-Phenyl-2-naphthylamine in Plants // Environ. Sei. Technol. 2006. V. 40. No. 19. P. 6163-6169.

117. Alvarez M.E., Pennell R.I., Meijer P.-J., Ishikawa A., Dixon R.A., Lamb C. Reactive oxygen intermediates mediate a systemic signal network in the establishment of plant immunity // Cell. 1998. V. 92. No.6. P. 773-784.

118. Apel K., Hirt H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction // Ann. Rev. Plant Biology. 2004. V. 55. P. 373-399.

119. Arora A., Nair M.G., Strasburg G.M. Antioxidant Activities of Isoflavones and Their Biological Metabolites in a Liposomal System // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1998. V. 356. No. 2. P. 133-141.

120. Aruoma O.I., Evan P.J., Kaur H., Halliwell B. An evaluation of the antioxidant and potential pro-oxidant properties of food additives and of Trolox C, vitamin E, and probucol // Free Radical Res. Commun. 1990. V. 10. No.2. P. 143-157.

121. Arrese-Igor C., Royuela M., Aparicio-Tego P.M. Responses of nodulated legumes to oxygen deficience // Interacting Stresses on Plants in Changing

122. Climate / Eds. Michael D.J., Colin R.B. NATO ASi Series. Series I: Global Environmental Change.Springer, 1993. V. 16. P. 423-432.

123. Atkins C.A., Pate J.S., Shelp B.J. Effect of short-term N2 deficiency on N metabolism in legume nodules // Plant Physiol. 1984.V. 76. No.3. P. 705710.

124. Bais A., Murphy P.J., Dry I.B. The Molecular regulation of stilbene phytoa-lexin biosynthesis in Vitis vinifera during grape berry // Australian Journal of plant Physiology. 2000. V. 27. No. 5. P. 425-433.

125. Baker C.J., Roberts D.P., Mock N.M., Whitaker B.D., Deahl K.L., Aver'yanov A.A. Apoplast redox metabolism: Synergistic phenolic oxidation and a novel oxidative burst // Physiological and Molecular Plant pathology. 2005. V. 67. No. 6. P. 296-303.

126. Balasubashini M.S., Rukkumani R., Viswanathan P., Menon Y.P. Ferulic acid alleviates lipid peroxidation in diabetic rats // Phytothr. Res. 2004. V. 18. No. 4. P. 310-314.

127. Baldridge W. H., Kurennyi D. E., Barnes S. Calcium-Sensitive Calcium Influx in Photoreceptor Inner Segments // J Neurophysiol. 1998. V.79. No. 6. P. 3012-3018.

128. Barz W., Mackenbrock U. Constitutive and elicitation induced metabolism of isoflavones and pterocarpans in chickpea (Cicer arientinum) cell suspension cultures // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1994. V. 38. No. 2-3. P. 199-211.

129. Baudouin E., PieuchotL., EnglerG., PaulyN., Puppo A. Nitric Oxide Is Formed in Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti Functional Nodules //Molecular Plant-Microbe Interactions. 2006. V. 19. No. 9. P. 970-975.

130. Bednarek P, Franski R, Kerhoas L, Einhorn J, Wojtaszek P, Stobiecki M. Profiling changes in metabolism of isoflavonoids and their conjugates in Lupinus albus treated with biotic elicitor // Phytochemistry. 2001. V. 56. No.l.P. 77-85.

131. Belles J.M, Garro R, Fayos J, Navarro P, Primo J, Conejero V. Gentisic Acid As a Pathogen-Inducible Signal, Additional to Salicylic Acid for Activation of Plant Defenses in Tomato // MPMI. 1999. V. 12. No.3. P. 227235.

132. Besseau S, Hoffmann L, Geoffroy P, Lapierre C, Pollet B, Legranda M. Flavonoid Accumulation in Arabidopsis Repressed in Lignin Synthesis Affects Auxin Transport and Plant Growth // The Plant Cell. 2007. Vol. 19. No. LP. 148-162,

133. Bhuvaneswari T.V, Turgeon B.G, Bauer W.D. Early Events in the Infection of Soyean {Glycine max L.Merr.) by Rhizobium japonicum. Localization of Infectible Root Cells. // Plant Physiology. 1980. V. 66. No.6. P. 1027-1031.

134. Bhuvaneswari T.V., Bhagwat A.A, Bauer W.D. Transient Susceptibility of Root Cells in Four common Legumes to Nodulation by Rhizobia // Plant Physiol. 1981. V. 68. No.3. P. 1144-1149.

135. Bladergroen M.R, Spaink H.P. Genes and signal molecules involved in therhizobia—Leguminoseae symbiosis // Curr Opin Plant Biol. 1998. V.l. No.4. P.353-359.

136. Bligh EG, Dyer WJ. Rapid Method of Totel Lipid Extraction and Purification //Can J Biochem Physiol 1959. V. 37. No.8. P.911-917.

137. Blilou I., Ocampo J.A., Garcia-Garrido J.M. Resistence of pea roots to en-domycorrhizal fungus or Rhizobium correlates with enhanced levels of endogenous salicylic acid // Journal of Experimental Botany. 1999. V. 50. No. 340. P. 1663-1668.

138. Blumwald E., Aharon G.S., Lam B. C.-H. Early signal transduction pathway in plant-pathogen interactions // Trends plant Sci. 1998. V. 3. Issue 9, P. 342-346.

139. Boerjan W., Ralph J., Baucher M. Lignin Biosynthesis // Annu. Rev. Plant Biology. 2003. V. 54. P. 519-546.

140. Bois E., Lieutier F. Phenolic response of Scots pine clones to inoculation with Leptographium wingfieldii, a fungus associated with Tomicus pinipe-dra II Plant Physiol. Biochem. (Paris). 1997. V. 35. No. 11. P. 819-825.

141. Bolwell G.P. Role of active species and NO in plant defense responses // Curr. Opin. Plant Biol. 1999. V. 2.No. 4. P. 287-294.

142. Bolwell G.P., Dixon R.A. Membrane-bound hydroxylases in elicitor-treated bean cells: Rapid induction of the synthesis of prolyl hydroxylase and a putative cytochrome P-450 // Europ. J. Biochem. 1986. V. 159. N 4. P. 163-169.

143. Bors W., Foo L.Y., Hertkorn N., Michel C., Stettmaier K. Chemical Studies of Proanthocyanidins and Hydrolyzable Tannins // Antioxidants& Redox Signaling. 2001. V. 3. No. 6. P. 995-1008.

144. Bors W., Michel C., Stettmaier K. Electron Paramagnetic Resonance Studies of Radical Species of Proanthocyanidins and Gallate Esters // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2000. V. 374. No. 2. P. 347-355.

145. Bottomley W., Smith H., Galston A.W. Flavonoid complexes in Pisum sativum — III. : The effect of light on the synthesis of kaempferol and guer-cetin complexes //Phytochemistry. 1966. V. 5. No. l.P. 117-123.

146. Breuil A. C., Adrian M., Pirio N., Meunier P., Bessis R., Jeandet P. Metabolism of stilbene phytoalexins by Botrytis cinereœ. 1. Characterization of a resveratrol Dehydrodimer // Tetrahedron Lett. 1998. V. 39. No.7. P. 537540.

147. Buffard D., Esnault R., Kondorosi A. Role of plant defence in alfalfa dur ing symbiosis // World Journal of Microbiology & Biotechnology. 1996. V. 12. No. 2. P. 175-188.

148. Caetano-Anollès G., Christ-Estes D.K. Baurer W.D. Chemotaxis of Rhi-zobium meliloti to the plant flavon luteolin requires functional nodulation genes // J. Bacteriology. 1988. V. 170. No.7. P. 3164-3169.

149. Caetano-Anollès G., Gresshoff P.M. Plant genetic control of nodulation // Annual Review of Microbiology. 1991. V. 45. P. 345-382.

150. Cameron R.K. Salicilic acid and its role in plants defense responses: what do we really know? // Physiological and Molecular Plant Pathology. 2000.1. V. 56. No. l.P. 91-93.

151. Carlson R.E., Dolphin D.H. Chromatographic analysis of isoflavonoid accumulation in stressed Pisum sativum 11 Phytochemistry. 1981. V. 20. No. 9. P. 2281-2284.

152. Carlson R.E., Dolphin D.H. Pisum sativum stress metabolites: two cinna-mylphenols and 2'-methoxychalcone // Phytochemistry. 1982. V. 21. No. 7. P. 1733-1736.

153. Cactelluccio C., Paganga G., Melikian N., Bolwell G.P., Pridham J., Sampson J., Rice-Evans C. Antioxidant potential of intermediates in phe-nylpropanoid metabolism in higher plants // FEBS Letters. 1995. V. 368. No. LP. 188-192.

154. Chang C., Damiani I., Puppo A., Frendo P. Redox Changes during the Le-gume-Rhizobium Symbiosis // Molecular Plant. 2009. V. 2. No. 3. P. 370377.

155. Cheinier V., Souquet J.-M., Kontek A., Moutounet M. Anthocyanin degradationin oxidizing grape musts // J. Sci. Food Agric. 1994. V. 66. No. 3.P. 283-288.

156. Chen, Z. X., Silva, H., Klessig D. F. Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid // Science. 1993. V. 262. No. 5141. P. 1883-1886.

157. Cheng I.F., Breen K. On the ability of four flavonoids, baicilein, luteolin, naringenin, and quercetin, to suppress the Fenton reaction of the iron-ATP complex// Biometals. 2000. V. 13. No. 1. P. 77-83.

158. Cho M.-J., Harper J.E. Effect of Inoculation and Nitrogen on Isoflvonoid Concentration in Wild-Type and Nodulation-Mutant Soybean Roots // Plant Physiol. 1991. V. 95. No.2. P. 435-442.

159. Clark-Lewis W. Leucoanthocianins and Leucoanthocyanidins // The Chemistry of Flavonoid Compounds / Eds Geissman T.A. Oxford; L.; N.Y.; Paris: Pergamon Press, 1962. P.217-247.

160. Cloffi G., Morales E.L., Braca A., De Tommasi N. Antioxidant chalcone glycosides and flavanones from Maclura (Chlorophora) tinctoria I I Journal of Natural Products. 2003. V. 66. No. 8. P. 1061-1064.

161. Colliver S.P., Morris P., Robbins M.P. Differential modification of flavo-noid biosynthesis with an antisense chalcone synthase construct in transgenic Lotus cordiculatus // Plant Mol. Biol. 1997. V. 35. N 4. P. 509-522.

162. Commoner B., Townsend J., Pake G. Free radicals in biological materials //Nature. 1954. V. 174. N4432. P. 689-691.

163. Cook D., Dreyer D., Bonnet D., Howell M., Nony E., VandenBosh K. Transient induction of a peroxidase gene in Meicago trunculata precedes infection by Rhizobium meliloti II Plant Cell. 1995. V. 7. No. 1. P. 43-55.

164. Cooper J.E., Rao J.R. Localized Changes in Flavonoid Biosynthesis in Roots of Lotus pedunculatus after Infection by Rhizobium loti II Plant Physiol. 1992. V. 100. No. 1. P. 444-450.

165. Cooper J.E., Rao J.R Flavonoid Metabolism by Rhizobia and Products // Symbiosis. 1995. V. 19. No. 2-3. P. 91-98.

166. Cooper J.E., Rao J.R, Everaert E., De Cooman L. Flavonoid Metabolism by rhizobia // Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications / Proc. 10-th International Congress on Nitrogen Fixation.St.Petersburg, Russia, 1995. P. 277-292.

167. Coronado C., Zuanazzi J.A.S., Sallaud C., Quirion J.-C., Esnault R., Hus-son H.-P., Kondorosi A., Ralet P. Alfalfa Root Flavonoid Production Is Nitrogen Regulated // plant Physiol. 1995. V. 108. No.2. P. 533-542.

168. Cosio E.G., Feger M., Miller C.J., Antelo L., Ebel J. High-affinity binding of fungal beta-glucan elicitors to cell membranes of species of the plant family Fabiaceae II Planta. 1996. V. 200. P. 92-99.

169. Crawford N.M. Mecanisms for nitric oxide synthesis in plants // Journal of Experimental Botany. 2006. V. 57. No. 3. P. 471-478.

170. Creasy L.L. Sequence of development of autumn coloration in Euonimus II Phytochemistry. 1974. V. 13. No. 8. P. 1391-1394.

171. Cruickshank I.A.M., Dudman W.F., Peoples M.B., Smith M.M. Elicitation of Pisatin in Pea {Pisum sativum L.) By Copper-Asparagine Complexes // Australian Journal of Plant Physiology. 1961. V. 14. No. 5. P. 549-559.

172. Cullimore J.V., Ranjeva R., Bono J.-J. Perception of lipo-chitooligosaccharidic Nod factors in legumes // Trend in Plant Science. 2001. V. 6. No. l.P. 24-30.

173. Dacora F.D. Defining new roles for plant and rhizobial molecules in sole and mixed plant cultures involving symbiotic legumes // New Phytologist. 2003. V. 18. No. LP. 39-49.

174. Dacora F.D., Joseph C.M., Phillips D.A. Alfalfa (Medicago sativa L.) Root Exudates Contain Isoflavonoids in the Presence of Rhizobium melilo-ti II Plant Physiol. 1993. V. 101. No. 3. P. 819-824.

175. D'Arcy -Lameta A. Study of soybean and lentil root exudates. II. Identification of some polyphenolic compounds, relation with plantlet physiology //Plant and Soil. 1986. V. 92. No. LP. 113-123.

176. D'Arcy-Lameta A. Study of soybean and lentil root exudates. III. Influence of soybean isoflavonoids on the growth of rhizobia and some rhizos-pheric microorganisms II Plant and Soil. 1987. V. 101. No. LP. 267-272.

177. Das D.K., George A., Liu X., Rao P.S. Detection of hydroxyl radical in the mitochondria of ischemic-reperfused myocardium by trapping with salicylate // Biochemical and Biophysical research Communications. 1989. V. 165. No. 3. P. 1004-1009.

178. Delledonne M., Xia Y., Dixon R.A., Lamb C. Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance // Nature. 1998. V.394. No. 6693. P. 585588.

179. Dempsey D.A., Shah J., Klessig D.F. Salicylic acid and disease resistance in plants. Crit Rev Plant Sci. 1999. V. 18.No 4. P. 547-575.

180. DiCenzo G.L., VanEtten H.D. Studies on the late steps of (+) pisatin biosynthesis: evidence for (-) enantiomeric intermediates // Phytochemistry. 2006. V. 67. No. 7. P. 675-683.

181. Dixon R.A., Achnint L., Kota P., Liu C.-J., Reddy M.S.S., Wang L. The phenylpropanoid pathway and defence- a genomics perspective // Molecular Plant Pathology. 2002. V. 3 No 5. P. 371-390.

182. Dixon R.A., Paiva N.L. Stress-Induced phenylpropanoid metabolism // Plant Cell. 1995. V. 7. No. 11. P. 1085-1097.

183. Djorjevic M.A., Gabriel D.W., Rolfe B.G. Rhizobium: the refined parasite of legumes ? // Annu.Rev. Phytopathol. 1987a. V. 25. P. 145-168.

184. Djorjevic M.A., Redmond J.W., Batley M., Rolfe B.C. Clovers secrete specific phenolic compounds which either stimulate or repress nod geneexpression in Rhizobium trifolii I I EMBO J. 1987b.V. 6. No. 7. P. 11731179.

185. Downie J.A. Infection Heresy // Sience. 2007. V. 316. No. 5829. P. 12961297.

186. Eckardt N.A. The Role of Flavonoids in Root Nodule Development and Auxin Transport in Medicago truncatula II The Plant Cell. 2006. V. 18. No. 7. P. 1539-1540.

187. Eigen E, Blitz M, Gunsberg E. The detection of some naturally occurring compounds on paper chromatograms // Arch. Biochem. Biophys. 1957. V. 68. No.2 . P. 501-502.

188. Ehrhardt D.W, Wais R, Long S.R. Calcium spiking in plant root hairs responding to Rhizobium nodulation signals // Cell. 1996. V. 85. No. 5. P. 673-681.

189. Elstner EF, Heupel A. Formation of hydrogen peroxide by isolated cell walls from horseradish {Armoracia lapathifolia Gilib.) // Planta. 1976. V.130. No 2. P. 175-180.

190. Felle H.H, Kondorosi E, Kondoroi A, Schultze M. yow Alfalfa Root Discriminate between Nod Factors and Oligochitin Elicitors // Plant Physiol., 2000. V. 124. No.3. P. 1373-1380.

191. Ferguson B.J., Mathesius U. Signaling Interactions During Nodule Development // Journal of Growth Regulation. 2003. V. 22. No. l.P. 47-72.

192. Ferrer J.L., Jez J.M., Bowman M.E., Dixon R.A., Noel J.P. Structure of chalcone synthase and the molecular basis of plant polyketide biosynthesis //Natur. Struct. Biol. 1999. V. 6. N 8. P. 775-784.

193. Firmin J.L., Wilson K.E., Rossen L., Jonston A.W.B. Flavonoid activation of nodulation genes in Rhizobium reversed by by other compounds present in plants // Nature. 1986. V. 324. No. 6092. P. 90-92.

194. Freidenberg K., Wernges K. Catechins and Flavonoid Tannins // The Chemistry of Flavonoid Compounds / Eds Geissman T.A. Oxford; L.; N.Y.; Paris: Pergamon Press, 1962. P.197-216.

195. Fry S.C. Phenolic compounds of the primary cell wall and their possible role in the hormonal regulation of growth // Planta. 1979. V. 146. No. 3. P. 343 -351.

196. Fry S.C. Phenolic components of the primary cell wall. Feruloylated dis-accharides of D-galactose and L-arabinose from spinach polysaccharide // Biochem. J. 1982. V. 203. No.2. P. 493-504.

197. Furuya M., Thomas R.G. Flavonoid Complexes in Pisum sativum. II. Effects of Red and Far-Red Light on Biosynthesis of Kaempferol Complexes and on Growth in Etiolated Plumules // Plant Physiol. 1964. V. 39. No.4. P. 634-642.

198. Gamas P., de Billy, Truchet G. Symbiosis-specific expression of two Medicago truncatula nodulin genes, MtNl and MtN13, encoding products homologous to plant defense protein // Mol. Plant-Microbe Interact. 1998. V. 11. No 5. P. 393-403.

199. Geissman T.A. The Chemistry of Flavonoid Compounds. Oxford, N.Y.: Pergamon Press. 1962. 666 p.

200. Geurts R., Franssen H. Signal Transduction in Rhizobium-Induced Nodule Formation // Plant Physiol. 1996. V. 112. No. 2. P. 447-453.

201. Gibson A.H. Factors in the physical and biological environment affecting nodulation and nitrogen fixation by legumes // Plant and Soil. 1971. Special Volume: Biological Nitrogen Fixation in Natural and Agricultural Habitats. P. 139-152.

202. Gianinazzipearson V., Dumasgaudot E., Gollotte A., Tahirialaoui A., Gia-ninazzi S. Cellular and molecular defence-related root responses to invasion by arbuscular mycorrhizal fungi // New Phytologist. 1996. V. 133. P. 45-57.

203. Giles E.D.O., Engstrom E.M., Long S.R. Ethylen Inhibits the Nod Factor Signal Transduction Pathway of Medicago truncatula II The Plant Cell. 2001. V. 13. No. 8. P. 1835-1849.

204. Giles E.D.O., Downie J.A. Coordinating Nodule Morphogenesis with Rhi-zobial Infection in Legumes // Annu. Rev. Plant Biol. 2008. V. 59. P. 519546.

205. Gonzalez J.E., Reuhs B.L., Walker G.C. Low molecular weith EPS II of Rhizobium meliloti allows nodule invasion in medicago sativa // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996. V. 93. No 16. P. 8636-8641.

206. Goodwin R.H., Pollock B.M. Ultraviolet absorption spectra of coumarin derivatives // Arch. Biochem. Biophys. 1954. V. 49. No l.P. 1-6.

207. Goto M., Hayashi H., Miyahara I., Hirotsu K., Yoshida M., Oikawa T. Crystal Structures of Nonoxidative Zinc-dependent 2,6-Dihydroxybenzoate (y-Resorcylate)Decarboxylase from Rhizobium sp.

208. Strain MTP-10005 // The Journal of Biological Chemistry.V. 281, No. 45. P. 34365-34373

209. Grab D., Loyal R., Ebel J. Elicitor-induced phytoalexin synthesis in soybean cells: Changes in the activity of chalcone synthase mRNA and total population of translatable mRNA // Arch. Biochem. And Biophys. 1985. V. 243. N2. P. 523-529.

210. Graf E. Antioxidant potential of ferulic acid // Free Radic. Biol. Med. 1992. V. 13. No. 4. P. 435-438.

211. Graham T.L. Flavonoid and isoflavonoid Distribution in Developing Soybean Seedling Tissues and Seed and Root Exudates // Plant Physiol. 1991. V. 75. No. 2. P. 594-603.

212. Graham T.L., Graham M.Y. Glyceollin Elicitors Induce Major but Distinctly Different Shifts in Isoflavonoid Metabolism in Proximal and Distal Soybean Cell Populations // Mol. Plant-Microbe Interact. 1991a. V. 4. No. l.P. 64-68.

213. Graham T.L., Graham M.Y. Cellular Coordination of Molecular Responses in Plant Defense // Mol. Plant-Microbe Interact. 1991b. V. 4. No 5. P. 415-422.

214. Graham T.L., Graham M.Y. Role of hypersensitive cell death in conditioning elicitation competency and defense potentiation // Physiological and Molecular Plant Pathology. 1999. V. 55. No.l. P. 13-20.

215. Grassmann J., Hippeli S., Elstner E.F Plant's defence and its benefits for animals and medicine: role of phenolic and terpenoids in avoiding oxygen stress. // Plant Physiol. Biochem. 2002. V. 40.No. 6-8. P. 471-478.

216. Gripenberg J. Flavones // The Chemistry of Flavonoid Compounds / Eds Geissman T.A. Oxford; L.; N.Y.; Paris: Pergamon Press, 1962. P. 406440.

217. Grisebach H. Biochemistry of Lignification//Naturwissenschaften. 1977. V. 64.No.12. .P. 619-625.

218. Gross G.G., Janse C., Elstner E.F. Involvement of malate, monophenols and the superoxide radical in H2O2 formation by isolated cell walls fom horseradish {Armoracia lapathifolia Gilib.) // Planta. 1977. V. 136. No. 3. P. 271-276.

219. Gutteridge J. M.C., Halliwell B. Free Radicals and Antioxidants in the Year 2000. A Historical Look to the Future // Annals New York Academy of Sciences. 2000. V. 899. P. 136—147.

220. Guyot S., Vercauteren J., Cheynier V. Structural determination of colourless and yellow dimers resulting from (+)-catechin coupling catalysed by grape polyphenoloxidase // Phytochemistry. 1996. V. 42. No 5. P. 12791288.

221. Hadwiger L.E., Schwochou M.E. Ultraviolet Light-induced Formation of Pisum and Phenylalanine Ammonia Lyase // Plant Physiol. 1971. V. 47. No. 4. P. 588-590.

222. Halliwell B. Reactive Species and Antioxidants. Redox Biology Is a Fundamental Theme of Aerobic Life // Plant Physiology. 2006. V. 141. No. 2. P. 312-322.

223. Hartwig U.A., Josef C.M., Phillips D.A. Flavonoid released naturally from alfalfa seeds enhance growth rate of Rhizobium meliloti II Plant Physiol. 1991. V. 95. N3. P. 797-803.

224. Hartwig U.A., Maxwell C.A., Joseph C.M., Phillips D.A. Chrysoeriol and1.teolin Released from Alfalfa Seeds Induce nod Genes in Rhizobium me-liloti II Plant Physol. 1990. V. 92. No. 1. P. 116-122.

225. Havir S.A., Reid P.D., Marsh H.V. 1-Phenylalanine ammonia-lyase (maize). Evidence for a common catalytic site for 1-phenylalanine and 1-tirosine // Plant Physiol. 1971. V. 48. No. 2. P. 130-136.

226. Heidstra R., Geurts R., Franssen H., Spaink H.P., van Kämmen A., Bissil-ing T. Root Hair Deformation Activity of Nodulation Factors and Their Fate on Vicia sativa II Plant Physiol. 1994. V. 105. No. 3. P. 787-797.

227. Heijnen C.G., Haenen G.R., van Acker F.A., van der Vijgh W.J., Bast A. Flavonoid as peroxynitrite scavengers: the role of the hydroxyl groups. // Toxicol In Vitro. 2001. V. 15. No. 1. P. 3-6.

228. Hernández I., Alegre L., Munné-Bosch S. Enhanced oxidation of flavan-3-ols and proanthocyanidin accumulation in water-stressed tea plants // Phytochemistry. 2006. V. 67. No. 11. P. 1120-1126.

229. Hippeli S., Heiser I., Elstner E.F. Activated oxygen and free oxygen radicals in pathology: New insights and analogies between animals and plants // Plant Physiol. Biochem. 1999. V. 37. No. 3. P. 167-178.

230. Hirsch A.M., Lum M.R., Downie J.A. What Makes the Rhizobia-Legume Symbiosis So Special? // Plant Physiol.2001. V. 127. No. 4. P. 1484-1492.

231. Hogg N., Kalyanaraman B. Nitric Oxide and Low-Density Lipoprotein

232. Oxidation // Free Rad. Res. 1998. V. 28. No. 6. P. 593-600.

233. Horowitz R.M., Jurd L. Spectral Studies on Flavonoid Compounds. II. Isoflavones and Flavanones // The Journal of Organic Chemistry. 1961. V. 26. N 7. P.2446 -2450.

234. Huang S.-W., Frankel E.N. Antioxidant Activity of Tea Catechins in Different Lipid Systems // J. Agr.Food Chem. 1997. V. 45. No.16. P. 30333038.

235. Huang X., Kiefer E., von Rad U., Ernst D., Foissner I., Durner J. Nitric oxide burst and nitric oxide-dependent gene induction in plants // Plant Physiol. Biochem. 2002. V. 40. No. 6-8. P. 625-631.

236. Ibrahim R. K., Towers G. H. N. Conversion of Salicylic Acid to Gentisic Acid and o-Pyrocatechuic Acid, all Labelled with Carbon-14, in Plants // Nature. 1959. V. 184. No. 4702. P. 1803.

237. Ibrahim R. K., Towers G. H. N. The Identification, by Chromatography, of Plant Phenolic Acids // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1960. V. 87. No.l.P. 125-128.

238. Jabs T., Dietrich R.A., Dangl J.L. Iniciation of runaway cell death in an Arabidopsis mutant by extracellular superoxide // Sience. 1996. V. 273. Issue 5283, P. 1853-1856.

239. Jacobs M., Rubery P.H. Naturally occurring auxin transport regulator // Science. 1988. V. 241. No. 4863. P. 346-349.

240. Jones W.T. Broadhurst R.B., Littleton J.W. The Condensed Tannins of Pasture Legume Species // Phytochemistry. 1976. V. 15.No.9. 1407-1409.

241. Jonson G.V., Evans H.J., Ching T. Enzymes of the Glyoxylate Cycle in

242. Rhizobia and Nodules of Legumes // Plant Physiol. 1966a. V. 41. No. 8. P. 1330-1336.

243. Jonson G.V, Mayer P.A, Evans H.J. A cobalt requirenment for symbiotic growth of Azolla filiculoides in the absence of combined nitrogen // Plant Physiol. 1966b.V.41. №> 5. P. 825-855.

244. Jun Y, Limin W, Walzem R. L, Miller E.G., Pike L.M, Patil B. S. Antioxidant activity of citrus limonoids, flavonoids, and coumarins // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2005. V. 53. No. 6. P. 2009-2014.

245. Jurd L. Spectral properties Flavonoid Compounds // The Chemistry of Flavonoid Compounds / Eds Geissman T.A. Oxford; L.; N.Y.; Paris: Per-gamon Press, 1962. P.107-155.

246. Jurd L, Llorowitz R.M. Spectral Studies on Flavonoid Compounds. III. Polyhydroxychalcones // The Journal of Organic Chemistry. 1961. V. 26. No. 7/P. 2561-2563.

247. Kahkonen M.P, Hopia A.I, Vuorela H.J, Rauha J.-P, Pihlaja K, Kujala T.S, Heinonen M. Antioxidant Activity of Plant Extracts Containing Phenolic Compounds // J. Agric.Food Chem. 1999. V. 47. No. 10. P. 3954-3962.

248. Kartush B. Simultaneous Demonstration of Separate Phases with Different Phenol Content in the Leaf Epidermis Cells of Salix alba L. // Protoplasma. 1975. V. 86. No.4. P. 371-379.

249. Kawano T., Muto S. Mechanism of peroxidase actions for salicylic acid-induced generation of active oxygen species and an increase in cytosolic calcium in tobacco cell suspension culture // J. Exp. Bot. 2000. V. 51. No. 345. P. 685-693.

250. Kim S.-J., Kim S.-I., Han Y.-S. Isolation and Identification of Antimicrobial Compound from Green Laver (Enteromorpha Linza) // Corean Journal of Gerontology. 1997. V. 7. No. 3. P. 70-76.

251. Koeppen B.H. An improved method for the detection of flavanones on paper chromatograms // J. Chromatography. 1965. V. 18. P. 604-605.

252. Kondorosi E., Gyuris J., Schmidt J., John M., Duda E., Hoffmann B., Schell J., Kondorosi A. Positive and negative control of nod gene expression in Rhizobium meliloti is required for optimal nodulation // EMBO J. 1989.Y.8. No. 5. P. 1331-1340.

253. Kosslak R.M., Bookland R., Barkei J., Paaren H.E., Appelbaum E.R. Induction of Bradyrhizobium japonicum common nod genes by isoflavones isolated from Glycine max // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. No. 21. P. 7428-7432.

254. Krzaczek W., Krzaczek T. Phenolic acids of native species of Rosa L. genus in Poland // Acta Societatis Botanicorum Poloniak. 1979. V. XLVIII, N2. P. 327-336.

255. Kumari M.V.R., Yoneda T., Hiramatsu M. Scavenging activity of beta-catechin on reactive oxygen species generated by photosensitization of riboflavin // Biochemistry & Molecular Biology International. 1996. V. 38. No. 6. P. 1163-1170.

256. Lamb C., Dixon R.A. The oxidative burst in plant desease resistence // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. V. 48. P. 251-275.

257. Langebarteles C., Wohlgemuth H., Kschieschan S., Grün S., Sanderemann H. Oxidative burst and cell death in ozone-exposed plants // Plant Physiol. Biochem. 2002. V. 40. No 6-8. P. 567-575.

258. Lapcik O., Hill M., Cemy I., Lachman J., Al-Maharik N., Adlercreutz H., Hampl R. Immunoanalysis of isoflavonoids in Pisum sativum and Vigna radiata. II Plant Science. V. 148. No. 2. P. 111-119.

259. Larronde F., Gaudillere J.P., Krisa S., Decendit A., Deffleux G., Merillon J.M. Airborne Methyl Jasmonate Induces Stilbene Accumulation in Leaves and Berries of Grapevine Plants // Am. J. Enol. Vitic. 2003. V. 54. No l.P. 63-66

260. Larson R.A. The antioxidants of higher plants // Phytochemistry.l988.V. 27, N4. P. 969-978.

261. Laughton M.J., Halliwell D., Evans P.J., Robin J., Hoult S. Antioxidant and pro-oxidant actions of plant phenolics quercetin, gossypol and myrice-tin //Biochem. Pharmacol. 1989. V. 38. No. 17. P.2859-2865.

262. Lawson C.G.R., Rolfe B,G., Djordjevic M.A. Rhizobium Inoculation Induces Condition-dependent Changes in the Flavonoid Composition of

263. Root Exudates from Trifolium subterraneum // Austr. J. of Plant Physiol. 1996. V.23.P. 93-101.

264. Léon J., Yalpani N., Raskin I., Lawton M.A. Induction of benzoic acid 2-hydroxylase in virus-inoculated tobacco // Plant Physiol 1993. V.103. No.2. P. 323-328.

265. Ley J .P., Bertram H.-J. Synthesis of Lipofilic Clovamide Derivatives and their Antioxidative potential against Lipid Peroxidation // J. Agrie. Food Chem. 2003. V.51. No. 16. P. 4596-4602.

266. León J., Lawton M.A., Raskin 1. Hydrogen Peroxide Stimulates Salicylic Acid Biosynthesis in Tobacco // Plant Physiol. 1995.V. 108. No.4. P. 1673-1678.

267. Levine A., Tenhaken R., Dixon, R., Lamb C. H202 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response // Cell. 1994. V. 79. No. 4. P. 583-593.

268. Lewis N.G., Yamamoto E. Lignin: occurrence, biogenesis and biodégradation // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1990. V. 41. P. 455496.

269. Ley J.P., Bertram H.-J. Synthesis of lipophilic Clovamide Derivatives and their Antioxidative Potential against lipid Peroxidation // J.Agrie. Food Chem., 2003. V. 51. No. 16. P. 4596-4602.

270. Li B., Xie C. Evaluation of the Antioxidant and Pro-oxidant Effects of Tea Catechin Oxypolymers // J. Agrie. Food Chem. 2000. V. 48. No. 12. P. 6362-6366.

271. Liggins J., Bluck L.J.C., Coward W.A., Bingham S.A. Extraction and Quantification of Daidzein and Genistein in Food // Analytical Biochemistry. 1998. v. 264. No. 1. P. 1-7.

272. Lohar D.P., Haridas S., Gantt J.S., VandenBosch K.A. A transient decrease in reactive oxygen species in roots leads to root hair deformation in the legume-rhizobia symbiosis //New Phytologist. 2007. V. 173. No.l. P.39.49.

273. Long S.R. Rhizobium- Legume Nodulation: Life Together in the Underground // Cell. 1989. V. 56. No. 2. P. 203-214.

274. Long S.R. Genes and Signals in the Rhizobium Legume Symbiosis // Plant Physiol. 2001. V. 125. No.l . P. 69-72.

275. Long S.R, Staskawicz B.J. Procaryotic plant parasites // Cell. 1993. V. 73. No. 5. P. 921-935.

276. Lopez J. C., Grasso D.H., Frugier F., Crespi M.D., Aguilar M.O. Early Symbiotic Responses Induced by Sinorhizobium meliloti ilvC Mutants in Alfalfa // Molecular Plant-Microbe Interactions. 2001.V. 14. No. 1, P. 5562.

277. Low P.S., Merida J.R. The oxidative burst in plant defence: Function and signal transduction // Physiologia Plantarum. 1996. V. 96. Issue 3. P. 533542.

278. Lynch D.H., Smith D.L. Soybean Glycine max (L.) Merr. nodulation and N2 fixation as affected by period of exposure to a low root zone temperature // Physiol. Plantar. 1993. V. 88. P. 212-220.

279. Lynch D.H., Smith D.L. The effects of low root zone temperature stress on two soybean Glycine max. genotypes when combined with Bradyrhi-zobium strains of verying geografic origin 11 Physiol. Plantarum. 1994. V. 90. No. l.P. 105-113.

280. Lynn D.G., Chang M. Phenolic signals in cohabitation: implications for plant development // Annu. Rev. Plant Physiol. 1990. V. 41. P. 497-526.

281. Mahalingam R., Fedoroff N. Stress response, cell death and signaling: themany faces of reactive oxygen species // Physiologia Plantarum. 2003. V. 119. No. l.P. 56-68.

282. Malik A, kuliev Z.A, Akhmedov U.A, Vdovin A.D., Abdullaev N.D. new oligomeric proanthocyanidine from Ziziphus jujube /I Chemistry of natural Compounds. 2002. V. 38. No. 1. P. 40-42.

283. Margolin W, Long S.R. Rhizobium meliloti contains a novel second homolog of cell division gene ftsZ // Journal of Bacteriology. 1994. Vol. 176. N 7. P. 2033-2043.

284. Margna U, Laanest L, Margna B, Otter M, Vainjarv T. The influence of temperature on the flsvonoids in Buckwheat andsome other plant seedling // Известия АН ЭССР. Биология. 1972. Т. 22.№ 2. С. 163-174.

285. Matheus U. Flavonoids induced in cells undergoing nodule organogenesis in white clover are regulators jf auxin breakdown by peroxidase // Journal of Experimental Botany. 2001. V. 52. Special Issue. P. 419-426.

286. Mathiesen L, Malterud K.E, Sund R.B. Antioxidant activity of fruit exudates and C-methyled dihydrochalcones from Myrica gale И Planta Medica. 1995. V. 61. No. 6. P. 515-518.

287. Maxwell C.A., Hartwig U.A., Joseph C.M., Phillips D.A. A Chalcone and Two Related Flavonoids Released from Alfalfa Roots Induce nod Genes of Rhizobium meliloti II Plant Physol. 1989. V. 91. No. 3. P. 842-847.

288. Maxwell C.A., Phillips D.A. Concurrent Synthesis and Release of nod-Gene-Inducing Flavonoids from Alfalfa Roots // Plant Physiol. 1990. V. 93. No. 4. P. 1552-1558.

289. Mert-Tiirk F. Phytoalexins: Defences or just a response to stress? // Journal of Cell and Molecular Biology. 2002. V. 1. No. 1. P. 1-6.

290. Metodiewa D., Jaiswal A.K., Cenas N., Dickancait E., Segura-Aguilar J. Quercetin may act as a cytotoxic prooxidant after its metabolic action to se-miquinone and quinoidal product // Free Radical Biology & Medicine. 1999. V. 26. No. 1-2. P.107-116.

291. Mira L., Fernandez M.T., Santos M., Rocha R., Florencio M.H., Jennings K.R. Interactions of flavonoids with iron and copper ions: a mechanism for their antioxidant activity // Free Radic. Res. 2002. V. 36. No. 11. P. 11991208.

292. Miranda C., Cristobal L., Stevens J.F., Ivanov V., McCall M., Frei B., Deinzer I., Buhler D.R. Antioxidant and Prooxidant Actiions Prenylated and Nonprenylated Chalcones and Flavanones in vitro // J. Agr. Food Chem. 2000. V. 48. No.9. P. 3876-3884.

293. Mitchell J.H., Gardner P.T., McPhail D.B., Morrice P.C., Collins A.R., Du-thie G.G. Antioxidant Efficacy of Phytoestrogens in Chemical and Biological Model Systems // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1998. V. 360.No. l.P. 142-148.

294. Mittler R., Schulaev V., Sescar M., Lam E. Inhibition of programmed cell death in tobacco plants during a pathogen-induced hypersensitive response at low oxygen pressure // Plant Cell. 1996. V. 8. No. 11. P. 1991-2001.

295. Newbould P. The use of nitrogen fertilizer in agriculture. Where do we go practically and ecologically? // Plant and Soil. 1989. V. 115. No. 1. P. 297311.

296. Newton W. E. Nitrogen fixation: some perspectives and prospects// Proc. 1st European. Nitrogen Fixation Conference. Szeged, 1994. P. 1-6.

297. Niehaus K., Kapp D., Piihler A. Plant defense and delaed infection of alfalfa pseudonodules induced by an exopolysaccharide (EPS 1) deficient Rhizo-bium meliloti mutant // Planta. 1993. V.190. No. 3 .P. 415-425.

298. Novak K., Kropacova M., Havlicek V., Skrdleta V. Isoflavonoid Phytoalexin Pisatin is not Recognized by the Flavonoid Receptor NodD of Rhizobium leguminosarum bv. viciae // Folia Microbiol. 1995. V. 40. No. 5. P. 535540.

299. Novak K., Skrdleta V., Nemcova M., Lisa L. Optimization of Rhizobial nod gene-inducing Activity Assay in Pea Root Exudate // Folia Microbiologics 1994. V.39. No. 3. P. 208-214.

300. Novak K. Production of phytoalexin in pea roots // Interrelationships between Microorganisms and Plants in Soil. Czechslovakia, 1987 / Eds. V. Vancura, F. Kunc. Prague: Academia, 1989. P. 63-66.

301. Oldroyd G. E. D., Engstrom E. ML, Long S. R. Ethylene Inhibits the Nod Factor Signal Transduction Pathway of Medicago truncatula // Plant Cell. 2001. V 13. No 8. P. 1835-1849.

302. Ollis W.D. The isoflavonoids // The Chemistry of Flavonoid Compounds / Eds Geissman T.A. Oxford; L.; N.Y.; Paris: Pergamon Press, 1962. P.353-405.

303. Osawa T., Ide A., Su J.-De, Namiki M. Inhibition in vitro of Lipid Peroxidation by Ellagic Acid // J. Agric. Food Chem. 1987. V. 35. No. P. 808-812.

304. Overmayer K., Brosche M., Kangasjarvi J. Reactive oxygen species and hormonal control of cell death // Trends in Plant Science. 2003. V. 8. No. 7. P. 335-342.

305. Packer L., Rimbach G., Virgili F. Antooxidant activity and biologic properties of a proantocyanidin-rich extract from pine (Pinus maritima) bark, pyc-nogenol // Free Radical Biology & Medicine. 1999. V. 27. No. 5/6. P. 704724.

306. Parniske M., Zimmermann C., Cregan P.B. Hypersensitive reaction of nodule cells in the Glycine max sp./ Bradyrhizobium japonicum symbiosis oc-cure at the genotype specific level // Bot Acta. 1990. V. 103. No. 1. P. 318320.

307. Pedreno M.A., Barcelo A.R., Sabater F., Munos R. Control by pH of Cell

308. Wall Peroxidase Activity Involved in Lignification // Plant Cell Physiol. 1989. V. 30. No. 2. P. 237-241.

309. Penmetsa R.V., Cook D. A legume ethylene-insensitive mutant hyperin-fected by its rhizobial symbiont // Science. 1997. V.275. No.5299. P. 527530.

310. Perrin D.R., Bottomley W. Pisatin: an Antifungal Substance from Pisum sativum L. //Nature. 1961. V. 191. No. 26. P.76-77.

311. Perrin D.R., Bottomley W. Studies of Phytoalexins. V. The Structure of Pisatin from Pisum sativum L. // J. Amer.Chem.Soc. 1962. V. 84. No. 10. P.1919-1922.

312. Perrin D.R.,Cruickshank I.A.M. The antifungal activity of pterocarpans towards Monilinia fructicola // Phytochemistry. 1969. V. 8. No. 6. P. 971-978.

313. Perrin D.D., Perrin D.R. The N.m.r. Spectrum of Pisatin // J. Amer.Chem.Soc. 1962. V. 84. No. 10. P. 1922-1925.

314. Peters N.K., Frost J.W., Long S.R. A Plant Flavone Luteolin, Induces Expression of Rhizobium meliloti Nodulation Genes // Science. 1986. V. 233. No. 4767. P. 977-986.238.

315. Peters N., Long S.R. Alfalfa Root Exudates and Compounds which Promote or Inhibit Induction of Rhizobium meliloti Nodulation Genes // Plant Physiol. 1988. V. 88. No. 2. P. 396-400.

316. Pinard E., Gaudry M., Henot F., Thellend A. Asimmetric Total Synthesis of-Pisatin, A Phytoalexin From Garden peas (Pisum sativum L.) I I Tetraherdron Letters. 1998. V. 39. No. 18. P. 2739-2742.

317. Phillips D.A., Tsai S.M. Flavonoid as plant signals to rhizosphere microbes // Mycorrhiza. 1992. V. 1. No.2. P. 55-58.

318. Pueppke S.G., VanEnnen H.D. Identification of Three New Pterocarpans (6a,l la-Dihydro-6i/-benzofuro3,2-c.[l]benzofurans) from Pisum sativum infected with Fusarium solani f.sp .pisi II J.Chem.Soc. 1975. V. LP. 946948.

319. Pourcel L., Routaboul J.-M., Cheynier V., Lepiniec L., Debeaijon I. Flavonoid oxidation in plants: from biochemical properties to physiological functions // Trends in Plant Science. 2007. V. 12. No. 1. P.29-36.

320. Prithiviraj B., Souleimanov A., Zhou X., Smith D.L. Differetial response of soybean (Glycine max (L.) Merr.) genotypes to lipo-chito-oligosaccharide Nod BjV (Ci8.i MeFuc) // Journal of Experimental Botany. 2000. V. 51. No. 353. P. 2045-2051.

321. Psotova J., Lasovsky J., Vicar J. Metal-chelating properties, electrochemical behavior, scavenging and cytoprotective activities of six natural phe-nolics II Biomed. Paperts. 2003. V. 147. No. 2. P. 147-153.

322. Ramu S.K., Peng H.M., Cook D.K. Nod Factor Induction of Reactive Oxygen Species Production Is Correlated with Expression of the Early Nodulin Gene ripl in Medicago truncatula I I Mol. Plant-Microbe Interac. 2002. V. 15. No 6. P. 522-528.

323. Rao A.S. Root Flavonoids I I The Botanical Review. 1990. V. 56. No. 1. P. 1-84.

324. Rao J.R., Cooper J.E. Soybean Nodulating Rhizobia Modify nod Gene Inducers Daidzein and Genistein to Yield Aromatic Products that Can Influence Gene-Inducing Activity // Mol. Plant-Microbe Inyeract. 1995. V. 8. No. P. 855-862.

325. Rasmussen J.B, Hammerschmidt R, Zook M.N. Systemic induction of salicylic acid accumulation in cucumber after inoculation with Pseudomonas syringae pv. syringae II Plant Physiology. 1991. V. 97. No. 4. P. 13421347.

326. Redmond J.W, Batley M, Djorjevic M.A, Innes R.W, Kuempel P.L, Rolfe B.G. Flavones induce expression of nodulation genes in Rhizobium //Nature. 1986. V. 323. No. 6089. P. 632-635.

327. Rice W.A., Olsen P.E, Collins M.M. Symbiotic effectiveness of Rhizobium meliloti at low root temperature // Plant and Soil. 1995. V.170. No.2. P. 351-358.

328. Rice-Evans C, Miller N, Paganga G.Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acid // Free Radical Biology & Medicine. 1996. V. 20. No. 7. P. 933-956.

329. Rice-Evans C., Miller N., Paganga G. Antioxidant properties of phenolic compounds // Trends in Plant Science. 1997. V. 2. No. 4. P. 152-159.

330. Richardson A.E., Djordjevic M.A., Rolfe B.G., Simpson R.J. Expression of nodulation genes in Rhizobium and acid sensitivity of nodule formation //Aust. J. Plant. Physiol. 1989.16. No. 1. 117-119.

331. Richmond R., Halliwell B., Chauhan J., Darbre A. Superoxide-dependent Formation of Hydroxyl Radicals: Detection of Hydroxyl Radicals by the Hydroxylation of Aromatic Compounds // Analitical Biochemistry. 1981. V. 118. No 1. P. 328-335.

332. Rojo E., Solano R., Sanches-Serano J. Interaction Between Signaling Compounds Involved in Plant Defense // New Phytologist. 2004. V. 22. No. l.P. 82-98.

333. Rolfs C. H., Schon H., Steffens M. and Kindl H. Cell-suspension culture of Arachis hypogaea L.: model system of specific enzyme induction in secondary // Planta. 1987. V. 172. No. 2. P. 238-244.

334. Roughley R.J., Dart P.J., Nutman P.S., Clarke P.A. The Infection of Trifo-lium subterraneum Root hairs by Rhizobium trifolii II Journal of Experimental Botany. 1970. V. 21. No. 66. P. 186-194.

335. Sagone A.L., Husney R.M. Oxidation of salicylates by stimulated granulocytes: evidence that these drugs act as free radical scavengers in biological systems // Journal of immunology. 1987.V. 138. No.7. P. 2127-2183.

336. Sanchez-Casas, Klessig D.F. A Salicylic Acid-Binding Activity and a Sa-licylic-Inhibitable Catalase Activity Are Present in a Variety of Plant Species // Plant Physiol. 1994. V. 106. No.4. P. 1675-1679.

337. Sandermann H.J., Ernst E., Heller W., Langebarteles C. Ozone: an abiotic elicitor of plant defence // Trends Plant Sei. 1998. V. 3.No. 2. P. 47-49.

338. Santos R., Herouart D., Sigaud S., Touati D., Puppo A. Oxidative Burst in Alfalfa-Sinorhizobium meliloti Simbiotic Interaction // Molecular Plant-Microbe Interactions. 2001. V. 14. No. 1. P. 86-89.

339. Sarkar S.K., Howarth R.E. Specificity of the Vanillin Test for Flavonols // J.Agric. Food Chem. 1976. V. 24. No 2. P.317-320.

340. Sato T., Fujikaki H., Ohtake N., Sueyoshi K., Takahashi T., Sato A., Ohyama T. Effect of exogenous salicylic acid on nodule formation of hypernodulating mutant and wild type of soybean // Soil Sei. Plant Nutr. 2002. V. 48. No. 3. P. 413-420.

341. Shi D.Y., Han L.J., Sun J., Wang Y., Yang Y.C., Shi J.G., Fan X. Chemical constituents from marine alga Chaetomorpha basiretorsa II Zhongguo Zhong Yao Za Zhi., 2005. V. 30. No. 5. P. 347-350.

342. Schlaman H.R.M., Spaink H.P., Okker R.J.H., Lugtenberg B.J.J. Subcellular localization of the nodD gene product in Rhizobium leguminosarum II J. Bacteriol.1989. V. 171. No. 9. P. 4686-4693.

343. Schmidt P.E., Parniske M., Werner D. Production of the phytoalexin gly-ceollin I by soybean roots in response to symbiotic and pathogenic infection//Bot. Acta. 1992. V. 105. No. P. 18-25.

344. Schraudner M., Moeder W., Wiese C., Van Camp W., Inze D., Langebartels C., Sandermann H.J. Ozone-induced oxidative burst in the ozone biomonitor plant, tobacco Bel W3 // Plant J. 1998. V. 16. No. 2.P. 235-245.

345. Schultze M., Kondorosi A. Regulation of Symbiotic Root Nodule Development // Annu. Rev. Genet. 1998. V. 32. P. 33 57.

346. Schiitte H.-R. Secondary plant substances. Special topics of the phenyl-propanoid metabolism // Progress in Botany. 1978. V. 40. P. 126-149.

347. Scott M.G., Peterson R.L. The root endodermis in Ranunculus acris. II. Histochemistry of the endodermis and the synthesis of phenolic compounds in roots // Canadian Journal of Botany. 1979. V. 57. No. 9. P. 1063-1077.

348. Shaw S.L., Long S.R. Nod Factor Elicits Two Separable Calcium Responses in Medicago truncatula Root Hair Cells // Plant physiology. 2003a. V. 131. No. 3.P. 976-984.

349. Shaw S.L., Long S.R. Nod factor inhibition of reactive oxygen efflux in host legume // Plant Physiology. 2003b. V. 132. No.4. P. 2196-2204.

350. Shimokoriyama M. Flavanones, Chalcones and Aurones // The Chemistry of Flavonoid Compounds / Eds Geissman T.A. Oxford; L.; N.Y.; Paris: Pergamon Press, 1962. P.286-316.

351. Siekel M.K. Chromatographic Separation, Isolation and Identification and Identification of Flavonoid Compounds // The Chemistry of Flavonoid Compounds / Eds Geissman T.A. Oxford; L.; N.Y.; Paris: Pergamon Press, 1962. P. 34-69.

352. Soto V., Sanjuan J., Olivares J. Rhizobia and plant-pathogenic bacteria: common infection weapons // Micribiology. 2006. V. 152. No.l 1. P. 31673174.

353. Spaink H.P. The molecular basis of infection and nodulation by Rhizobia: the ins and outs of sympathogenesis // Annu. Rev. Phytopathology. 1995. V. 33. P. 345-368.

354. Stafford H.A. Flavonoid metabolism. 1990. Boca Raton: CRC Press, USA. 318 p.

355. Staehelin C., Schultze M., Kondorosi E., Mellor R.B., Boiler T., Kondoro-si A. Structural modifications in Rhizobium meliloti Nod factors influence their stability against hydrolysis by root chitinases // Plant J. 1994. V. 5. No. 3. P. 319-330.

356. Swain T. The Identification of Coumarins and Related Compounds by Filter-paper Chromatography // The Biochamical Journal. 1953. V. 53. No. 2. P. 200-208.

357. Swain T. Secondary compounds as protective agents // Annu. Rev. Plant Physiology. 1977. V. 28. P. 479-501.

358. Takahama U. Oxidation of Flavonols by Hydrogen Peroxide in Epidermal and Guard Cells of Viciafaba L. // Plant Cell Physiol. 1988. V. 29. No. 3. P. 433-438.

359. Takahama U. A Role of Hydrogen Peroxide in the Metabolism of Phenolic Mesophyll Cells of Viciafaba L. // Plant Cell Physiol. 1989. V. 30 (2). P. 295-301.

360. Tawaraya K., Hashimoto K., Wagatsuma T. Effect of root exudate fractions from P -deficient and P-sufficient onion plants on root colonisation by the arbuscular mycorrhizal fungus Gigaspora margarita II Micorrhiza.1998. V. 8. P. 67-70.

361. Tebayaschi S.-i., Ishihara A., Tsuda M., Iwamura H. Induction of clova-mide by jasmonic acid in red clover // Phytochemistry, 2000. V. 54. No. 4.P. 387-392.

362. Traykova M., Kostova I. Coumarin Derivatives and Oxidative Stress // International Journal of Pharmocology. 2005. V. 1. No. 1. P. 29-32.

363. Tsuchiya H., Sato M., Iinuma M., Yokoyama J., Ohyama M., Tanaka T., Takase I., Namikawa I. Inhibition of the growth of cariogenic bacteria in vitro by plant flavanones // Experientia. 1994. V 50. N 9. P. 846-849.

364. Tropf S., Lanz T., Rensing S.A., Schroder J., Schroder G. Evidence that stilbene synthase have developed from chalcone synthases several times in the course of evolution // J. Mol. Evol.1994. V. 38. N 6. P. 610-618.

365. Truchet G., Roche P., Lereouge P., Vasse J., Camut S., de Billy C.F., Prome J.-C., Denarie J. Sulphated lipo-oligosaccharide signals of Rhizo-bium meliloti elicit root nodule organogenesis in alfalfa // Nature. 1991. V. 351. No. 6328. P. 670-673.

366. Turetskaya R., Kefeli V., Kutacek M., Vackova K., Tschumakovski N., Krupnikova T. isolation and Some Physiological Properties of Natural plant Growth Inhibitors // Biologia Plantarum. 1968. V. 10. No. 3. P. 205221.

367. VanEtten H.D., Masfield J.W., Bailey J.A., Farmer E.E. Two Classes of Plant Antibiotics: Phytoalexines versus "Phytoanticipins"// The Plant Cell. 1994. V. 6. N9. P. 1191-1192.

368. Van Spronsen P. C., Tak T., Rood A.M.M., van Brussel A.A.N., Kijne J.W., Boot K.J.M. Salicylic Acid Inhibits Indeterminate-Type Nodulation But Not Determinate-Type Nodulation // MPMI. 2003.Vol. 16. No. 1. P. 83-91.

369. Van Sumere C.F., Parmentier F., Teuchy H. Quantitative paper chromatographic determinations: II. Phenolic acids, especially vanilic acid and phydroxybenzoic acid//J. Chromatography. 1961a. V.6. P. 481-483.

370. Van Sumere C.F., Teuchy H., Parmentier F. Quantitative paper chromatographic determinations: I. Coumarins and phenolic acids, especially escu-letin, daphnetin and ferulic acid // J. Chromatography. 1961b. V.6. P. 484485.

371. Vance C.P., Kirk T.K., Sherword R.T. Lignufication as a mechanism of desease resistance // Annu. Rev. Phytopathol. 1978. V. 18. P. 259-288.

372. Vasse J., Billi F., Truchet G. Abortion of infection during the Rhizobium we/z'/oiz-alfalfa symbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reaction I I The Plant Journal. 1993. V.4. No. 3. P.555-566.

373. Vattem D.A., Ghaedian R., Shetty K. Enhancing health benefits of berries throgh phenolic antioxidant enrichment: focus on cranberry // Asia Pac J.Clin Nutr. 2005. V. 14. No. 2. P. 120-130.

374. Vijn I., das Nevas L., van Kommen A., Franssen IT., Bisseling T. Nod factors and nodulation in plants // Science. 1993. V. 260. P. 1764-1765.

375. Vijn I., Martinez-Abarca F., Yang W.-C., das Nevas L., van Brüssel A., van Kämmen A., Bisseling T. Early nodulin gene expression during Nod factor-induced process in Vicia sativa II The Plant Journal. 1995. V. 8. No. l.P. 111-119.

376. Volpin H., Burdman S., Castrosowinski S., Kapulnik Y., Okon Y. Inoculation with Azospirillum increased exudation of rhizobial nod-gene inducers by alfalfa roots I I Molecular Plant-Microbe Interactions. 1996. V. 9. No. 5. P. 388-394.

377. Wais S. J., Keating D. H., Long S. R. tructure-Function Analysis of Nod Factor-Induced Root Hair Calcium Spiking in Rhizobiwra-Legume Symbiosis//Plant Physiology. 2002. V. 129. No.l. P.211-224.

378. Walker S.A., Viprey V., Downie J.A. Dissection of nodulation signaling using pea mutants defective for calcium spiking induced by Nod factors and chitin oligomers // PNAS. 2000. V. 97. No. 24. P. 13413-13418.

379. Wallace J.W, Markham K.R. Apigenin and amentoflavone glycosides in the psilotaceae and their phylogenetic significance // Phytochemistry. 1978. V. 17. No. 8. P. 1313-1317.

380. Wang J, Sporns P. MALDI-TOF MS Analysis of Isoflavones in Soy Products // J. Agric. Food Chem. 2000. V. 40. No. 12. P. 5887-5892.

381. Wasson A.P, Pellerone F.I, Matheus U. Silencing the Flavonoid Pathway in Medicago truncatula Inhibits Root Nodule Formation and Prevents Auxin Transport Ragulation by Rhizobia // The Plant Cell. 2006. V. 18. No.7.P. 1617-1629.

382. Watanabe M, Ohshita Y, Tsushida T. Antioxidant compounds from buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) hulls // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1997. V. 45. No. 4. P. 1039-1044.

383. Wei H.C, Cai Q.Y, Rahn R.O. Inhibition of UV light-and Fenton reaction-induced oxidative DNA damage by the soybean isoflavone genistein // Carcinogenesis. 1996. V. 17. No. 1. P. 73-77.

384. Weiergang I, Hipskind J.D, Nicholson R.L. Synthesis of 3- deoxyantho-cyanidin phytoalexins in sorghum occurs independent of light // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1996. V. 49. N 6. P. 377-388.

385. Weissenbock G, Hedrich R, Sachs G. secondary Phenolic Products in Isolated Guard Cell, Epidermal Cell and Mesophyll Cell Protoplasts from Pea (Pisum sativum L.) Leaves: Distribution and Determination // Protoplasma. 1986. V. 134. No. 2-3. P. 141-148.

386. Whetten R.W, MacKay J.J, Sederoff R. Recent advances in understanding lignin biosynthesis // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. V. 49. P. 585-609.

387. Wingender R, Rohrig H, Horicke C, Wing D, Schell J. Differential regulation of soybean chalcone synthase genes in plant defense, symbiosis and upon environmental stimuli. // Mol. Gen Genet. 1989. V. 218. No. P. 315-322.

388. Whitbred J.M., Schuler M.A. Molecular Characterization of CYP73A9 and CYP82A1 P450 Genes Involved in Plant Defense in Pea II Plant Physiology. 2000. V. 124. No. 1. P. 45-58.

389. Whitmore F. W. Phenolic Acids in Wheat Coleoptile Cell Walls // Plant Physiol. 1974. V 53. No. 6. P. 728-731.

390. Wojtaszek P. Oxidative burst: an early plant response to pathogen infection // Biochem. J. 1997. V. 322. No.3. P. 681-692.

391. Wollenweber E., Dietz V.H. Occurrence and distribution of free flavonoid aglycones in plants // Phytochemistry. 1981. V. 20. No.5. P. 869-932.

392. Wu Z.B., Zhang S.H., Wu X.H., Cheng S.P., He F. Allelopathic interactions between Potamogeton maackia Microcystis aeruginosa // Allelopathy Journal. 2007. V. 20. No. 21 P. 327-338.

393. Yamamoto K., Etsuo N. Interaction of with iron: antioxidant and proox-idant effects of a — tocopherol in the oxidation of lipids in aqueous dispersions in the presence of iron // Biochimica et Biophysica Acta. 1988. V. 958 No. l.p. 19-23.

394. Yang W.-C., Cramers H.C.J.C., Hogendijk P., Katinakis P., Wijffelman C.A., Franssen H., Kämmen A., Bisseling T. In-situ localization of chal-cone synthase mRNA in pea root nodule development // The Plant Journal. 1992. V.2. No 2. P. 143-151.

395. Zaat S.A.J., Wijffelman C.A., Spaink H.P., van Brüssel A.A.N., Okker

396. R.J.H., Lugtenberg B J.J. Analysis of the major inducer of the Rhizobium nodA promoter from Vicia sativa root exudates and their activity with different nod genes // Plant Mol. Biol. 1989. V. 13.No. 2. P. 175-188.

397. Zang L.-Y., Cosma G., Gardner H., Shi X., castranova V., Vallyathan V. Effect of antioxidant protection by p-coumaric acid on low-density lipoprotein cholesterol oxidation // Am. J. Physiol Cell Physiol. 2000. V. 279. No. 4. P. 954-960.

398. Zhang F., Smith D.L. Effects of low root zone temperatures on the early stages of symbiosis establishment between soybean Glycine max (L.) Merr. and Bradyrhizobium japonicum I I J. Exp. Bot. 1994. V. 45. № 279. P. 1467- 1473.

399. Zhirov V.K., Merzlyak M.N. Cultivation of pea plants (Pisum sativum L.) at low temperature decreases lipid peroxidation induced by freezing-thawing // Plant Sci. Lett. 1983. Vol. 30. N2.P.185-191.

400. Zhu Y., Pierson III L.S., Hawes M.C. Induction of Microbial Genes for Pathogenesis and Symbiosis by Chemicals from Root Border Cells // Plant Physiol. 1997. V. 115. No. 4. P. 1691-1698.

401. Zottini M., Costa A., De Michele R., Ruzzene M., Carimi F., Schiavo F.L. Salicylic acid activates nitric oxide synthesis in Arabidopsis II Journal of Experimental Botany. 2007. Vol. 58, No. 6. P. 1397-1405.

Информация о работе

Макарова, Людмила Евгеньевна
доктора биологических наук
Иркутск, 2010
ВАК 03.01.05

Диссертация

Физиологическое значение фенольных соединений при формировании бобово-ризобиального симбиоза в неблагоприятных условиях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Физиологическое значение фенольных соединений при формировании бобово-ризобиального симбиоза в неблагоприятных условиях - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы