Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие агглютинина зародыша пшеницы в формировании устойчивости пшеницы к токсическому действию кадмия

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Участие агглютинина зародыша пшеницы в формировании устойчивости пшеницы к токсическому действию кадмия"

На правах рукописи

МУРЗАБАЕВ АЛЬБЕРТ РУСТЕМОВИЧ

УЧАСТИЕ АГГЛЮТИНИНА ЗАРОДЫША ПШЕНИЦЫ В ФОРМИРОВАНИИ УСТОЙЧИВОСТИ ПШЕНИЦЫ К ТОКСИЧЕСКОМУ ДЕЙСТВИЮ КАДМИЯ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О ИЮН 2015 005570046

Уфа-2015

005570046

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Доктор биологических наук, профессор Шакирова Фарида Миннихановна

Тимофеева Ольга Арнольдовна, доктор биологических наук, доцент, зав. кафедрой ботаники и физиологии растений Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Высоцкая Лидия Борисовна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории физиологии растений ФГБУН Уфимского Института биологии РАН

ФГБУН Институт биологии Карельского научного центра РАН

Защита состоится «01» октября 2015 года в «16:00» на заседании диссертационного совета Д 212.013.11 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении «Башкирский государственный университет» по адресу: 450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32, биологический факультет, ауд. 332. Факс: (347)273-67-78, e-mail: disbiobsu^mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет» и на сайте http://wvw.bashedu.ru

Автореферат разослан «_»_2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук М.Ю. Шарипова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Растительный организм в связи с прикрепленностыо к месту обитания вынужден приспосабливаться к изменяющимся условиям внешней среды и развивать широкий спектр защитных реакций, лежащих в основе адаптации к ним, что требует координации функционирования в растениях эффективных систем регуляции метаболической активности клеток. Известно, что первоочередную роль в формировании адаптации растений к неблагоприятным факторам играет гормональная система, которая чутко реагирует на малейшие изменения условий произрастания (Шакирова, 2001; Shakirova et al., 2010). К универсальным ответным реакциям на стрессовые факторы относится накопление АБК, которой отводится ключевая роль в индукции экспрессии генов многих стрессовых, а также присущих норме белков, задействованных в защите растений (Roychoudhury et al., 2013). К таковым, в частности, относится ген, кодирующий агглютинин зародыша пшеницы (АЗП) (Skriver, Mundy, 1990), типичный представитель лектинов злаков, интенсивный синтез и аккумуляция которого наблюдается не только в зародышах в период обезвоживания семян, но и в вегетирующих растениях при воздействии стрессовых факторов биотической и абиотической природы (Cammue et al., 1989; Raikhel, Lee, 1993; Антонюк, Евсеева, 2006; Шакирова, Безрукова 2007; Бабоша, 2008; Jiang et al, 2010).

В связи с ростом техногенного загрязнения среды остро встала проблема исследования молекулярных механизмов устойчивости растений к тяжелым металлам (ТМ), что необходимо для целенаправленного управления этим процессом. В ряду ТМ кадмий рассматривают в качестве наиболее токсичного элемента. Как известно, кадмий, не выполняет в растениях биологических функций, вместе с тем, воздействие его ионов вызывает в растениях окислительный стресс и обезвоживание, что приводит к нарушению протекания важнейших физиолого-биохимических процессов, лежащих в основе роста и развития растений (Серегин, Иванов, 2001; Polle, Schutzendubel, 2003; DalCorso et al., 2008; Gallego et al., 2012). В целом это отражается в торможении ростовых процессов растений, уменьшении урожая и ухудшению его качества (Холодова и др., 2005; Azevedo et al., 2012). Поскольку кадмий вызывает в растениях накопление АБК (Polle, Schutzendubel, 2003; Hsu, Као, 2005), можно было ожидать участия АЗП в АБК-контролируемых защитных реакциях пшеницы в ответ на кадмиевый стресс. Преимущественным местом синтеза и накопления АЗП в проростках являются меристематические ткани корней, из которых он

экскретируется в наружную среду, что дает основание предполагать вовлечение этого лектина в защиту пшеницы от токсического действия кадмия. Цель и задачи исследований. Цель работы состояла в выяснении механизмов регуляции защитного действия АЗП на растения пшеницы в условиях токсического действия ацетата кадмия. Для достижения цели были поставлены следующие задачи.

1) С использованием ингибитора синтеза АБК флуридона выявить роль эндогенной АБК в регуляции вызываемых 1 мМ ацетатом кадмия изменений в:

а) транскрипционной активности гена АЗП в корнях;

б) концентрации АЗП в корнях;

в) интенсивности экскреции лектина в окружающую среду.

2) Выявить иммуногистохимическое распределение АЗП и АБК в подвергнутых воздействию ионов кадмия корнях проростков пшеницы.

3) Исследовать влияние АЗП на про- и антиоксидантный статус растений пшеницы в условиях кадмиевого стресса.

4) Изучить динамику отложения лигнина в клеточных стенках корней пшеницы в условиях кадмиевого стресса и выявить участие экзогенного АЗП в этом процессе.

5) Оценить вклад АЗП в проявление протекторного действия салициловой кислоты на деление клеток корней проростков пшеницы в присутствии или отсутствие флурцдона.

Научная новизна. Впервые продемонстрирована индукция экспрессии АЗП в корнях проростков пшеницы в ответ на обработку ацетатом кадмия и ключевая роль эндогенной АБК в регуляции этого процесса. Получены приоритетные данные о ко-иммунолокализации АБК и АЗП на поперечных срезах корней пшеницы в условиях кадмиевого стресса. Выявлена способность экзогенного АЗП сбалансировано активировать про-/антиоксидантную системы в корнях проростков, задействованных в усилении отложения лигнина в клеточных стенках и укрепление их барьерных свойств, что вносит важный вклад в торможение проникновения кадмия в корни предобработанных АЗП растений и отражается в существенном уменьшении уровня кадмий-индуцированной продукции АФК и, соответственно, снижении активности антиоксидантных ферментов и поддержании интенсивности ростовых процессов растений при стрессе на уровне близком контролю. Выявлено участие АЗП в проявлении защитного действия салициловой кислоты (СК) на растения пшеницы в условиях кадмиевого стресса.

Практическая значимость. Учитывая свойство АЗП экскретироваться в окружающую корни внешнюю среду и выявленную в работе его способность тормозить продвижение ионов кадмия по растению, АЗП может вносить свой вклад в улучшение качества урожая пшеницы. Совокупность полученных результатов свидетельствуют о разнообразии проявлений протекторных свойств АЗП, имеющих большое значение в формировании устойчивости пшеницы как основной хлебной культуры страны, что дополняет и расширяет знания об естественных механизмах устойчивости растений.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Международной научно-практической конференции «Роль классических университетов в формировании инновационной среды регионов» (Уфа, 2009); III Всероссийской школы-конференции «Биомика» (Уфа, 2012); VIII Международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2012); 3-м Международном симпозиуме «Intracellular Signaling and Bioactive Molecules Design» (Lviv, Ukraine, 2012); Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва. 2013); Международной научной конференции и школы молодых ученых «Физиология растений - теоретическая основа инновационных агро- и фитобиотехнологий» (Калининград, 2014). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в журналах из перечня ВАК РФ.

Конкурсная поддержка работы. Исследования поддержаны грантами РФФИ № 11-04-01642-а и РФФИ-Поволжье № 11-04-97051.

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения методов исследовании, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 115 страницах и иллюстрирована 30 рисунками и 4_таблицами. Список литературы включает 168 наименований.

ОБЪЕКТ II ¡МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили проростки яровой пшеницы Triticum aestivum L. сорта Башкирская-26. Семена пшеницы после стерилизации 96%-ным этанолом проращивали в кюветах на фильтровальной бумаге в течение 3-х суток (16-часовой световой день, 15 клк) при 22-24° С. После отделения эндосперма проростки корнями помещали в раствор 2%-ной сахарозы, используемой в качестве питательного раствора (Шакирова и др., 1993), и в зависимости от целей

работы использовали разные постановки опытов. В работе использована предлетальная концентрация кадмия 1 мМ, при которой происходило не только ярко выраженное ингибирование деления клеток, но и существенное замедление роста растений. Предобработанные и необработанные в течение 24 ч флуридоном в концентрации 5 мг/л, предотвращающей новообразование АБК (Шакирова и др., 2009), 4-сут проростки переносили на разные промежутки времени в течение 24 ч на смесь 2%-ной сахарозы и 1 мМ ацетата кадмия Cd(CH3COO)2 в присутствии или отсутствие флуридона. Для оценки роли АЗП в защите растений от кадмия 3-сут проростки помещали на 24 ч на раствор 2%-ной сахарозы, содержащий 28 нМ АЗП в присутствии или отсутствие флуридона, после чего переносили на смесь 2%-ной сахарозы, ацетата кадмия в присутствии или отсутствие флуридона. Контролем служили проростки, инкубированные на растворе 2% сахарозы. Через определенные промежутки времени корни контрольных и опытных проростков фиксировали в жидком азоте для последующей оценки в них физиолого-биохимических показателей. В ряде опытов 3-сут проростки помещали на 24 ч на раствор 2%-ной сахарозы в присутствии или отсутствие флуридона, после чего 4-сут проростки переносили на свежий раствор 2%-ной сахарозы в смеси с АЗП и/или 50 мкМ СК в присутствии или отсутствие флуридона. Митотический индекс (МИ) оценивали с помощью окуляр-микрометра у 2000 клеток апикальной меристемы корней (Безрукова и др., 2012). Содержание фитогормонов и АЗП в одной и той же растительной навеске определяли методом непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (Шакирова и др., 1993). Иммунолокализацию АБК и АЗП с помощью конфокального микроскопа LSM5 (Carl Zeiss, Германия) проводили согласно (Ахиярова и др., 2008) с использованием кроличьих антител против АБК и АЗП и DyLight® 633 антикроличьих антител. Оценку концентрации супероксид анион радикала и пероксида водорода проводили согласно (Minibayeva et al., 2001) и (Bindschedler et al., 2001), соответственно. Активность супероксиддисмутазы (СОД) и пероксидазы определяли согласно (Чевари и др., 1985), а также (Хайруллин и др., 2000). Содержание малонового диальдегида (МДА) определяли согласно (Bezrukova et al., 2008). Определение лигнина проводили с использованием специфического красителя флороглюцина (Фурст, 1979). РНК выделяли согласно (Boothe et al., 1995). Для получения кДНК на основе мРНК гена АЗП проводили реакцию обратной транскрипции с использованием M-MuLV обратной транскриптазы, согласно протоколу поставщика. ПЦР проводили в амплификаторе типа ТП4-ПЦР-01- "Терцик" ("ДНК-Технология", Россия), после чего фрагменты ДНК

фракционировали методом электрофореза в 1-2% агарозном геле или 7% ПААГ. Определение содержания кадмия в пробах проводили методом обратной полярографии (Безрукова и др., 2011). О росте судили по изменению интенсивности деления клеток апикальной меристемы корней и приросту сырой и сухой массы предобработанных АЗП и необработанных лектином проростков, подвергнутых воздействию ацетата кадмия. Для определения сухой массы растительный материал высушивали до воздушно-сухого состояния при 70° С.

Опыты проводили в не менее чем в трех биологических и четырех-пяти аналитических повторностях. В иллюстрациях представлены средние арифметические значения и ошибки средних. Статистическую обработку проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ряду АБК-контролирумых белков пшеницы АЗП отводится особое место, поскольку он является типичным представителем лектинов злаков, присущих растениям в ходе всего онтогенеза, при этом наиболее существенные изменения в уровне этого лектина наблюдаются в неблагоприятных условиях, вызывающих накопление АБК (Cammue et al., 1989, Шакирова и др., 1993; 2003; Шакирова, Безрукова, 2007).

Экспрессия АЗП в корнях проростков пшеницы. Поскольку АЗП является АБК-регулируемым белком, нами проведен сравнительный анализ влияния ацетата кадмия на динамику транскрипции гена АЗП в корнях необработанных и предобработанных флуридоном проростков, его содержания, а также уровня экскреции лектина в наружную среду. Выявлено, что воздействие кадмия привело к быстрой двукратной активации транскрипции гена АЗП в корнях пшеницы, тогда как предобработка проростков флуридоном предотвратила вызываемое кадмием увеличение содержание мРНК АЗП в корнях и способствовала поддержанию этого показателя на уровне контроля (рис. 1а).

Анализ содержания АЗП в корнях, подвернутых действию ацетата кадмия, выявил более чем двукратное увеличение содержания лектина с максимумом на 3 ч, которому предшествовало увеличение содержания АБК, тогда как предобработка растений пшеницы ингибитором биосинтеза АБК флуридоном предотвратила вызываемое кадмием накопление АЗП (рис. 16).

Полученные результаты согласуются с данными об АБК-зависимом стресс-индуцированном накоплении АЗП в вегетируюших растениях пшеницы при воздействии разнообразных стрессовых факторов (Шакирова, Безрукова, 2007) и

подтверждают ключевую роль АБК в индукции синтеза и накопления АЗП, что свидетельствует об участии этого лектина в защитных реакциях растений пшеницы, запускаемых АБК в ответ на кадмиевый стресс.

(а) 250 □ Контроль BCd EJ(«>n)+Cd 300 Г 1 7

i | 200 - В т 5 250 -

| fe 150 Н В I | | 200 -

li-r| г| гр •

8. 1 2 3 123579

Веюмя. ч Время, ч

Рис. 1. Влияние 1 мМ ацетата кадмия на динамику транскриптов мРНК АЗП (а) и содержания АБК (графики - 1, 2) и лектина (гистограммы - 3, 4) (б) в корнях 4-сут проростков пшеницы, необработанных и предобработанных в течение 24 ч 5 мг/л флуридоном

Экскреция лектина в наружную среду. Поскольку АЗП характеризуется свойством экскретироваться в окружающую корни среду (Шакирова, Безрукова. 2007), можно было ожидать, что обратимое стресс-индуцированное накопление АЗП в корнях будет сопровождаться интенсификацией его выхода в среду инкубирования проростков. Так, данные, приведенные на рис. 2, демонстрируют существенное усиление экскреции АЗП из обработанных кадмием проростков в наружную среду в сравнении с контрольным уровнем. В то же время в варианте опыта с предобработкой ингибитором синтеза АБК флуридоном концентрация АЗП в среде соответствует уровню контрольных растений (рис. 2).

Рис. 2. Концентрация АЗП в среде инкубирования 4-сут предобработанных и необработанных 5 мг/л флуридоном проростков пшеницы, подвергнутых воздействию 1 мМ ацетата кадмия

АЗП в корнях проростков, подвергнутых влиянию кадмия, и в среде инкубирования растений (рис. 1 и 2) указывает на то, что значительный выход АЗП в окружающую среду происходит на фоне снижения вызванного стрессом накопления АЗП в корнях.

(Фл)+Сс1

Сопоставление динамик содержания

Ко-иммунолокализация АЗП и АБК в тканях корней 4-сут проростков пшеницы, подвергнутых воздействию кадмия. Как показано выше, кадмий-индуцированная регуляция экспрессии АЗП обусловлена стресс-индуцированным накоплением АБК. Для лучшего понимания их взаимодействия интересно было проанализировать локализацию АЗП и АБК в растительных тканях в условиях кадмиевого стресса.

Рис. 3. Влияние 1 мМ ацетата кадмия на иммуногистохимическое распределение АБК (а-в) и АЗП (г-е) в начале зоны растяжения корней 4-сут проростков пшеницы: а, г -контроль; б, д - 7 ч кадмия; в, е - 24 ч АЗП + 7 ч кадмия. В вариантах без предварительного воздействия специфических антител АБК и АЗП не выявлялись.

С помощью конфокальной лазерной микроскопии нам впервые удалось провести сравнительный анализ иммунолокализации АЗП и АБК на поперечных срезах в начале зоны элонгации корней проростков пшеницы, подвергнутых воздействию кадмия. Из рис. 3 видно, что кадмий вызывает интенсификацию накопления АБК преимущественно в клетках ризодермы, перицикла, сосудах мета- и протоксилемы и менее выраженное дискретное свечение в клетках первичной коры и стеллярной паренхимы (рис. За-в). В тоже время предобработка АЗП оказывает защитный эффект на растения, о чем свидетельствует существенно меньший уровень стресс-индуцированного накопления АБК (рис. Зв). Это четко проявляется в иммуногистохимическом распределении гормона в тканях корней, которые характеризуются пониженной дискретной иммунофлуоресценцией гормона в ризодерме и первичной коре и повышенной - в клетках центрального цилиндра, что указывает на то, что в этом варианте опыта АБК, главным образом, сосредотачивается в области сосудов мета- и протоксилемы (рис. За-в). Иммуногистохимический анализ АЗП вывил, что кадмий вызвал сходное по

локализации с АБК усиление иммунофлуоресценции АЗП в ризодерме, клетках первичной коры, перицикле, мета- и протоксилеме (рис. Зг-е). Ко-локализация АБК и АЗП в тканях корней растений пшеницы, подвергнутых воздействию кадмия, демонстрирует вовлечение лектина в спектр АБК-контролируемых защитных реакций растений пшеницы на этот стресс.

Влияние предобработки АЗП на рост и гормональный статус растений пшеницы при стрессе. Основываясь на полученных ранее данных об участии АЗП в регуляции деления клеток кончиков корней растений пшеницы, как в норме, так и при засолении (ЗЬаЫгоуа й а1., 2004; Вен-цкоуа е1 а1., 2008), важно было выяснить, проявляет ли экзогенный АЗП способность оказывать защитный эффект на ростовые процессы проростков в условиях кадмиевого стресса.

(а)

6

5 4

13

2

1

О

□ Контроль ШСс*

И(АЗП)+Сс1

ш

(б) 50

2 г

'8 д 30

О О 20 Й о о О-

10

м

(В) 5

2

й & о о. о. с 1

Ш

Рис. 4. Влияние 1 мМ ацетата кадмия в течение 24 ч на МИ корней (а), прирост сырой (б) и сухой (в) массы предобработанных и необработанных АЗП (28 нМ) 5-сут проростков пшеницы.

Результаты, приведенные на рис. 4, демонстрируют явный протекторный эффект предобработки АЗП на проростки, который проявился в уменьшении уровня ингибирующего действия кадмия на митотическую активность апикальной меристемы корней, а также прирост сырой и сухой массы растений.

Как известно, ключевую роль в регуляции роста растений играет гормональная система, которая чутко реагирует на малейшие изменения условий произрастания (ЗЬаИгоуа е1 а!., 2010; КоЬН е1 а1., 2013), в том числе, на воздействие кадмия (Кароог, ВИапЗша], 2014; У1еЬ\л^ег, 2014). В связи с этим интересно было в сравнительном аспекте проанализировать перестройки в балансе фитогормонов необработанных и предобработанных АЗП проростков пшеницы в ходе воздействия кадмия, о которых судили по коэффициентам отношений концентраций ИУК и цитокининов к уровню АБК.

Из рис. 5а видно, что коэффициенты отношений ИУК/АБК в корнях необработанных АЗП проростков в ходе стресса стабильно низкие, что обусловлено как резким обратимым накоплением АБК, так и драматическим падением уровня ИУК. В то же время в корнях предобработанных АЗП проростках эти показатели существенно выше, что связано с меньшей амплитудой вызываемых кадмием изменений в содержании как АБК, так и ИУК (рис. 5а).

(а)

1

0,8

£ 0,6 > 0,4 0,2

(б)

Контроль

-Сс! —л— (АЗП)+С(1

0,8 г

ш 0,6 -<

§■0,4

0,2

О -

Время, ч

Время, ч

Рис. 5. Влияние предобработки 28 нМ АЗП в течение 24 ч на коэффициенты отношений содержания ИУК к АБК (а) и цитокининов к АБК (б) в корнях 4-сут проростков пшеницы в ходе воздействия 1 мМ ацетата кадмия

Динамика изменений коэффициентов отношений содержания цитокининов к АБК в корнях предобработанных и необработанных АЗП растений заметно отличается от таковых ИУК к АБК (рис. 56). Постепенное увеличение этого показателя в ходе опыта у необработанных АЗП проростков связано как с обратимым накоплением АБК, так и заметным восстановлением уровня цитокининов в корнях в ходе стресса. Важно отметить, что в корнях АЗП-предобработанных растений коэффициенты отношения цитокинины/АБК существенно выше, более того, в конце опыта этот показатель соответствует уровню контроля (рис. 56). Ранее было выявлено, что сама обработка АЗП вызывает быстрое кратковременное накопление АБК с максимумом на 1 ч и более стойкое увеличение содержания ИУК и особенно цитокининов, что отражается в реализации его рост-стимулирующего эффекта на проростки (вИаИшуа ег а1., 2004). Вероятно, вследствие этого предобработанные АЗП растения характеризуются меньшей амплитудой вызываемых кадмием сдвигов в балансе гормонов, что отражается в меньшем уровне повреждающего действия кадмия на рост. Таким образом, в основе проявления защитного действия предобработки

АЗП на ростовые процессы растений пшеницы при стрессе лежит предотвращение в них резких перестроек в гормональной системе.

Влияние предобработки АЗП на состояние про-/антиоксидантного статуса проростков при кадмиевом стрессе. Известно, что стрессовые факторы смещают про-/антиоксидантный статус растений за счет усиления продукции активных форм кислорода, что отражается в торможении их роста (Тарчевский, 2002). Из данных, приведенных на рис. 6 и 7, видно, что кадмий вызывает существенные сдвиги в состоянии про- и антиоксидантной систем в проростках пшеницы в сравнении с контролем, связанные с накоплением АФК и последующей активацией антиоксидантных ферментов, что согласуется с имеющимися в литературе сведениями (Gallego et al., 2012). Так, в ответ на обработку кадмием в 4-сут проростках происходит резкое накопление супероксид радикала с максимумом на первый час инкубации (рис. 6а) и последующая активация супероксиддисмутазы с максимумом на 2 ч (рис. 66).

(а) 30

5 25 || 20 го о

О -1С

сг о. 15 g

О

о I 10

а

5 О

О

5

Время, ч

Рис. 6. Динамика содержания супероксид радикала (а) и активности супероксиддисмутазы (б) в необработанных и предобработанных АЗП 4-сут проростках пшеницы в ходе воздействия 1 мМ ацетата кадмия.

(а) 6

(б) ю

Г

12 3 5

о. с; Ф «U с ю

fe 1 <

А

Время, ч

Время, ч

Рис. 7. Динамика концентрации пероксида водорода (а) и активности пероксидазы (б) в необработанных и предобработанных АЗП 4-сут проростках пшеницы в ходе инкубирования на среде, содержащей 1 мМ ацетат кадмия.

Вместе с тем, предобработанные АЗП проростки характеризуются значительно меньшим уровнем кадмий-индуцированной генерации супероксид радикала и активации СОД (рис. 6), вероятно, благодаря предадаптирующему эффекту лектина, который, в частности, проявляется в кратковременном усилении продукции АФК в ходе предобработки растений АЗП. Сходный характер кадмий-индуцированных сдвигов относительно контроля наблюдался и в балансе пероксида водорода и пероксидазы, хотя максимумы каждого из его составляющих проявлялись на 1 ч позже (рис. 7а, б). И вновь у предобработанных АЗП проростков уровень вызываемого кадмием накопления АФК и активации пероксидазы был существенно ниже, что также является свидетельством меньшей степени повреждающего действия стрессора на предобработанные АЗП растения пшеницы. Действительно, из рис. 8 видно, что воздействие кадмия вызывает в сравнении с контролем резкое накопление МДА в корнях проростков, что многократно продемонстрировано на разных растительных объектах (Muñoz et al., 2008), тогда как корни предобработанных АЗП растений характеризуются заметно меньшим уровнем этого показателя.

120 100

1

'I 80

-О

£ 60 i 40 ^ 20 0

Рис. 8. Влияние предобработки АЗП на концентрацию МДА в корнях 5-сут проростков пшеницы, подвергнутых 1 мМ ацетату кадмия в течение 24 ч

Конпроль

(A3n)+Cd

Выявленная способность АЗП активировать антиоксидантные ферменты играет важную роль в подготовке растений пшеницы к последующим стрессовым воздействиям, вследствие чего АЗП-предобработанные проростки испытывают меньшее по уровню повреждающее действие неблагоприятных факторов. Влияния АЗП на отложение лигнина в базальной части корней пшеницы в условиях кадмиевого стресса и распределение токсических ионов по тканям. Судя по литературным данным, зрелые ткани экзодермы и эндодермы ограничивают радиальный транспорт передвигающихся по апопласту корня ионов кадмия (Van Belleghem et al., 2007; Серегин, Кожевникова, 2008). Поскольку

лигнификация клеточных стенок корней вносит важный вклад в укрепление их барьерных свойств в отношении ТМ (Ьедиеих е1 а1., 2010), интересно было в сравнительном аспекте сопоставить интенсивность отложения лигнина на продольных срезах базальной части корней 4- 7-сут предобработанных и необработанных АЗП проростков пшеницы и подвергнутых воздействию ацетата кадмия с использованием красителя флороглюцина (Ьециеих е1 а1., 2010).

Отложение лигнина в клеточных стенках базальной части корней контрольных проростков четко регистрировалось лишь в возрасте шести суток, хотя окраска слабой интенсивности проявлялась и на пятые сутки (табл. 1).

Таблица 1. Динамика накопление лигнина в базальной части корней предобработанных и необработанных АЗП проростков пшеницы после 24 ч воздействия 1 мМ ацетата кадмия на 4-сут проростки пшеницы

Вариант Возраст, сутки

4 5 6 7

Контроль - +/- + +

АЗП +/- + ++ + +

Ацетат кадмия + ++ + +

АЗП+ацетат кадмия ++ +++/- +++

Примечание. Знак «-» указывает на отсутствие окрашивания, «+/-» -очень слабое окрашивание, «+» - слабое окрашивание, «++» - сильное окрашивание, «+++/-» -нарастание сильного окрашивания, «+++» - очень сильное окрашивание.

Внесение в среду инкубирования 4-сут проростков ацетата кадмия на 24 ч ускоряло отложение лигнина, которое сначала регистрировалось в клеточных стенках центрального цилиндра корня, а спустя сутки после удаления кадмия из среды и в близлежащих к нему клетках перицикла. Эти результаты согласуются с данными о том, что кадмий индуцирует отложение лигнина в оболочках клеток корней (Hsu, Као, 2005). Вместе с тем обнаружено, что сама предобработка 3-сут проростков АЗП также способствовала ускорению образования лигнина в оболочках клеток центрального цилиндра 4 - 5-сут проростков, а у 6-сут - в области первичной коры (табл. 1). В связи с этим уже через сутки воздействия кадмия (5-е сут) в варианте опыта с предобработкой АЗП наблюдалось дополнительное накопление лигнина в клеточных стенках в области центрального цилиндра и его отложение в области первичной коры, а после удаления кадмия из среды (6-е сут) оно усиливалось (табл. 1). Обсуждая эти результаты, важно отметить, что сама обработка АЗП вызывает в корнях проростков пшеницы

транзиторное накопление сначала АБК, а затем и существенное увеличение уровня эндогенных цитокининов (ЗЬаклгоуа е1 а1., 2004), которые, как известно, также задействованы в регуляции формирования лигнина (вио й а1., 2005).

Таким образом, важный вклад в АЗП-индуцированное повышение устойчивости проростков пшеницы к кадмию вносит его способность еще до воздействия стрессора ускорять отложение лигнина в клеточных стенках корней, которое, однако, реализуется на фоне рост-стимулирующего действия АЗП в ходе предобработки (БЬаклгоуа е1 а1., 2004).

В связи с выявленной интенсификацией лигнификации клеточных стенок в корнях предобработанных АЗП проростков под действием кадмия, способствующей их укреплению, интересно было исследовать локализацию кадмия в тканях корней пшеницы гистохимическим методом с применением дитизона (Серегин, Иванов, 1997). Проведенный анализ показал, что в корнях необработанных АЗП проростков кадмий откладывался преимущественно в клеточных стенках всех тканей корня (рис. 9). Поскольку АЗП-индуцированное отложение лигнина в базальной части корней проростков и дополнительная активация этого процесса в присутствии кадмия способствовала укреплению их клеточных стенок, то, неудивительно, что в этом варианте опыта кадмий выявлялся только в ризодерме и наружных слоях первичной коры. Это, вероятно, способствовало ограничению передвижения токсических ионов в сосуды ксилемы и уменьшению уровня их накопления в побегах (рис. 9; 10).

УЬ-**:'

ывГ] Рис. 9. Распределение кадмия в базальной части корней 5-сут проростков пшеницы: а - контроль; б -^уЛ 1 мМ ацетат кадмия 24 ч; в -ёРИР предобработка АЗП за сутки до стресса 50.0 рм

(а) (б) (в)

Полученные результаты служат еще одним экспериментальным доказательством предадаптирующего эффекта АЗП на растения пшеницы к последующему воздействию токсических ионов кадмия. Важный вклад в регуляцию лигнификации клеточных стенок, вероятно, вносят эндогенные цитокинины, содержание которых существенно возрастает в ходе предобработки АЗП (8Ьак1гоуа й а1., 2004), что, в свою очередь, может способствовать

поддержанию содержания этих гормонов в корнях предобработанных лектином и подвергнутых воздействию кадмия проростков пшеницы на уровне близком контролю (рис. 5).

То, что предварительная обработка АЗП препятствует проникновению ионов кадмия в растения, подтвердил анализ концентрации кадмия в проростках. Так, выявлено, что концентрация кадмия в корнях предобработанных АЗП проростков на 40% ниже, чем необработанных лектином, а в побегах - более чем в два раза меньше (рис. 10). Следовательно, предобработка проростков АЗП способствует ускорению отложения лигнина в клеточных стенках корней и тем самым укреплению их барьерных свойств, что вносит важный вклад в торможение проникновения ионов кадмия в корни и в надземную часть.

Рис. 10. Концентрация кадмия в корнях (а) и побегах (б) 5-сут предобработанных и необработанных АЗП проростков пшеницы, подвергнутых воздействию 1 мМ ацетата кадмия в течение 24 ч

Таким образом, нами выявлено, что предадаптирующий эффект АЗП включает в себя такие процессы, как активация про-/антиоксидантной системы и усиление барьерных свойств клеточных стенок корней пшеницы за счет интенсификации отложения лигнина, что, в целом, отражается в меньшем повреждающем эффекте токсических ионов кадмия на растения. Вклад АЗП в индуцированную салициловой кислотой устойчивость пшеницы к токсическому действию ионов кадмия. С целью снижения уровня повреждающего действия токсических ионов, а также повышения урожайности растений, общепринята обработка фитогормонами, сочетающими в себе свойства стимуляторов роста и индукторов защитных реакций (ЗЬакггоуа е1: а1., 2010). Салициловая кислота, являющаяся эндогенным регулятором роста и развития фенольной природы, в последнее время привлекает большое внимание с целью

Сс|

(АЗП)+Сй

Сй

(АЗП)+Сс1

повышения устойчивости и урожайности культурных растений (Науа1 е1 а1., 2010; БЬакноуа й а1„ 2013; Мшга, Тас1а, 2014).

Ранее было выявлено, что обработка СК в концентрации 50 мкМ сочетает в себе свойства рост-стимулятора и индуктора устойчивости пшеницы к абиотическим стрессам, реализация которых, вероятно, обусловлена быстрым параллельным транзиторным накоплением АБК и ИУК на фоне отсутствия изменений уровня цитокининов (БЬакцоуа й а!., 2003). Нужно отметить, что активно исследуются механизмы защитного действия СК на культурные растения при кадмиевом стрессе (МешаИу ег а1., 2003; Науа! « а1., 2010; ЯЪакноуа е1 а1., 2013; Масленникова и др., 2013; Ве1каШн е1 а1., 2014). Поскольку АЗП является АБК-регулируемым белком, логично было предположить, что обработка СК опосредованно через АБК способна индуцировать экспрессию АЗП. Для проверки этого предположения нами проведены опыты по анализу уровня АЗП в обработанных СК в присутствии или отсутствие флуридона растениях пшеницы.

Рис. 11. Динамика содержания АЗП в корнях 4-сут проростков пшеницы в ходе обработки 50 мкМ СК или смесью СК и 5 мг/л флуридона

5 7

Время, ч

Данные, приведенные на рис. 11, демонстрируют постепенное 1.5-кратное обратимое накопление АЗП в корнях проростков пшеницы в ходе обработки СК с максимумом на 3-5 ч, тогда как присутствие флуридона в среде предотвращает вызываемое СК увеличение уровня АЗП. Полученные результаты указывают на вовлечение СК в регуляцию содержания АЗП и ключевую роль эндогенной АБК в этом процессе.

Из рис. 12 видно, что ацетат кадмия вызвал более чем двукратное транзиторное накопление АБК в корнях пшеницы с максимумом на первые 2 ч, тогда как в корнях предобработанных СК растений кадмий-индуцированное увеличение уровня АБК было заметно ниже, что может служить показателем меньшей степени повреждающего действия стресса на них. Вместе с тем при совместной с СК предобработке растений пшеницы флуридоном сдвигов в уровне эндогенной АБК в корнях в ответ на кадмий не наблюдалось (рис. 12а).

1.6

□ Контроль ИСК

□ (Фл) СК

II

Л О *3

(а)

8 300 го

г 250 о

2 200

^ 150 х

ш ЮО

<

50

□ Контроль

□ (СК)КМ

О) о(СК)«а 0 (Фл+СК)+Сс! (8) 2

-О-Контроль - -О- - <а

- --д-- - (ск)«м --х • - (Фл+ск)«а

'Л

-5-,

■ -%------Х -. Ъ

—5-5-

Время, ч

Рис. 12. Динамика содержания АБК (а), транскриптов АЗП (б) и АЗП (в) в корнях предобработанных 50 мкМ СК или смесью 1 мг/л флуридона и СК 4-сут проростков в ходе воздействия ацетата кадмия

Накопление АБК является характерным ранним ответом растений на кадмиевый стресс, что приводит к закрытию устьиц и торможению поглощения и транспорта воды, что отражается в задержке роста и развития растений (ОаГСогво е1 а1, 2008). Вместе с тем АБК играет ключевую роль в индукции экспрессии широкого спектра чувствительных к ней белков, задействованных в защите клеток от повреждающего действия стрессовых факторов, вызывающих обезвоживание (ЫаказЫта, Yamaguchi-SЫnozaki, 2013). К таковым, в частности, относится АЗП (8кпуег, МипсЗу, 1990; Саттие ег а1., 1989), поэтому неудивительно, что на фоне накопления АБК наблюдалась активация транскрипции гена АЗП и последующее двукратное транзиторное увеличение концентрации лектина в корнях проростков, подвергнутых воздействию ацетата кадмия (рис. 126, в), которое сопровождалось усилением его экскреции в наружную среду (рис. 13), так что уже через 7 ч воздействия кадмия содержание АЗП в среде вдвое превышало значение контроля.

40

з 30

'20

10

Рис. 13. Влияние предобработки 50 мкМ СК на концентрацию АЗП в среде инкубирования 4-сут предобработанных и необработанных 5 мг/л флуридоном проростков пшеницы через 7 ч воздействия 1 мМ ацетата кадмия на них

Контроль Сс1

(СК)+Сс1 (Фл+СК) +Сс1

В предобработанных СК и подвергнутых стрессу растениях, как и при анализе АБК, уровень транскрипционной активности гена АЗП и содержание лектина в корнях были существенно ниже (рис. 126, в), что отразилось и в уменьшении почти на 50% содержания лектина в среде (рис. 13). В варианте опыта

с предобработкой СК в смеси с флуридоном в условиях стресса показатели концентрации лектиновых мРНК и содержания АЗП в корнях оставались на уровне близком контролю вследствие предотвращения под влиянием ингибитора вызываемого ацетатом кадмия накопления АБК (рис. 12). Такая же картина наблюдалась и при анализе уровня лектина в среде инкубирования проростков (рис. 13).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что активация транскрипции гена АЗП и обратимого накопления лектина в корнях предобработанных СК проростков при воздействии ацетата кадмия, а также экскреции белка в наружную среду в область корневого чехлика обусловлена поддержанием в этих растениях повышенной концентрации АБК.

Ранее было показано участие АЗП в стимуляции деления клеток апикальной меристемы корней в норме (Безрукова и др., 2004), в предотвращении стресс-индуцированного торможения деления клеток кончиков корней, а также в ускорении восстановления роста клеток корней делением в пост-стрессовый период (Кильдибекова и др., 2004; Веггико\а е1 а!., 2008). Для оценки вовлечения АЗП в проявление защитного эффекта СК на ростовые процессы растений в необработанных и предобработанных СК в присутствии или отсутствие флуридона проростках пшеницы проведен анализ МИ корней в условиях кадмиевого стресса.

7 г

6 -

Контрогъ Сс1 (СК)+Сс1 (Фл+СК)+Сс1 (АЗП^СМ (Фл+АЗП) (ФтСЮ (ФтСК)

+Сс1 +СсИ-АЗП +Ссйтлиадин

Рис. 14. Митотический индекс апикальной меристемы корней 4-сут проростков пшеницы, предобработанных 50 мкМ салициловой кислотой или 28 нМ АЗП, после 7 ч инкубации на 1 мМ ацетате кадмия в присутствии или отсутствие 28 нМ АЗП или 28 нМ глиадина. 3-сут проростки инкубировали 24 ч на среде, содержащей СК или АЗП в присутствии или отсутствие 5 мг/л флуридона.

Из рис. 14 видно, что кадмий оказывает негативный эффект на МИ корней, тогда как предобработка СК способствует поддержанию митотической активности клеток кончиков корней в условиях кадмиевого стресса на уровне близком

контрольному варианту. Сходные результаты получены и в варианте опыта с предобработкой АЗП и эти данные согласуются с полученными ранее о предотвращении под влиянием АЗП вызываемого засолением ингибирования деления клеток апикальной меристемы корней пшеницы (Кильдибекова и др., 2004). Вместе с тем, инкубирование проростков, предобработанных АЗП в смеси с флуридоном, полностью предотвратило проявление его защитного эффекта на МИ корней при стрессе, так же как и в варианте опыта с совместной с флуридоном предобработке СК и последующем воздействии кадмия (рис. 14). Внесение же в среду инкубирования предобработанных смесью СК с флуридоном растений совместно с ацетатом кадмия АЗП способствовало поддержанию МИ корней на уровне близком контролю или предобработанных АЗП растений при воздействии ацетата кадмия (рис. 14). Выявленный эффект является следствием обработки именно АЗП, поскольку запасной белок пшеницы глиадин не оказал защитного действия на деление клеток корней предобработанных смесью СК и флуридона растений в условиях стресса (рис. 14). Следовательно, вызываемая салициловой кислотой АБК-опосредованная транзиторная экспрессия АЗП, сопровождаемая его экскрецией в окружающую корни среду, может вносить важный вклад в развитие как предадаптирующего к возможным стрессовым ситуациям действия СК, так и защитного эффекта СК на растения пшеницы в условиях кадмиевого стресса.

Одним из преимущественных мест синтеза АЗП является меристематическая ткань корней пшеницы, из которой он экскретируется в область корневого чехлика и окружающую корни наружную среду. В связи с этим, можно было ожидать, что этот лектип, становясь как бы экзогенным белком, может оказывать влияние на рост и сгресс-устойчивость пшеницы. В работе с использованием ингибиторного анализа нами впервые продемонстрировано АБК-опосредованное усиление экспрессии АЗП в корнях проростков и интенсификацию его экскреции во внешнюю среду в ответ на воздействие токсических ионов кадмия. Выявлено, что важный вклад в проявление предадаптирующего и защитного эффектов АЗП на растения в условиях кадмиевого стресса вносит его способность активно воздействовать на состояние гормональной и про-/антиоксидантной систем и, как следствие, участвовать в укреплении барьерных свойств клеточных стенок корней. Это отражается в торможении поступления токсических ионов в ткани корней и сосуды ксилемы, что, в свою очередь, препятствует транспорту кадмия в побеги и способствует

поддержанию ростовых процессов растений при стрессе на уровне, близком контролю. Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что ЛЗП вносит важный вклад в развитие АБК-контролируемой устойчивости растений пшеницы к кадмиевому стрессу.

ВЫВОДЫ

1. Впервые продемонстрирована ключевая роль эндогенной АБК в регуляции индукции экспрессии АЗП в корнях проростков пшеницы в ответ на кадмиевый стресс и его экскреции в окружающую корни среду.

2. Ко-иммунолокализация АБК и АЗП на поперечных срезах корней проростков пшеницы, преимущественно в клетках ризодермы и центрального цилиндра, в норме и в условиях стресса позволила впервые визуализировать роль АБК в контроле содержания АЗП. Выявлено, что воздействие ацетата кадмия вызывает пропорционально резкое усиление иммунофлуоресценции гормона и лектина в тканях, тогда как предобработка АЗП способствует поддержанию заметно меньшего по уровню накопления как АБК, так и АЗП при стрессе.

3. Выявлена способность экзогенного АЗП снижать уровень вызываемой ацетатом кадмия продукции АФК и, как следствие, уменьшать уровень активности антиоксидантных ферментов в этих условиях, что указывает на вовлечение про-/антиоксидантной систем в спектр защитного действия АЗП на растения и отражается в поддержании интенсивности ростовых процессов растений при кадмиевом стрессе на уровне близком контролю.

4. Важный вклад в реализацию защитного действия АЗП на проростки пшеницы в условиях кадмиевого стресса вносит его способность укреплять барьерные свойства клеточных стенок корней, что способствует торможению проникновения кадмия в растения.

5. Получены приоритетные данные о вовлечении эндогенного АЗП в реализацию АБК-опосредуемой индукции салициловой кислотой устойчивости пшеницы к токсическому действию ионов кадмия.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ

1. Безрукова, М. В. Участие лектина в формировании устойчивости пшеницы к токсическому действию кадмия / М. В. Безрукова, Р. А. Фатхутдинова,

А. Р. Лубянова, А. Р. Мурзабаев, В. В. Федяев, Ф. М. Шакирова // Физиология растений.-2011.-Т. 58.-№6.-С. 907-914.

2. Шакирова, Ф. М. Участие лектина в индуцированной салициловой кислотой устойчивости пшеницы к кадмию и роль АБК в регуляции его уровня / Ф. М. Шакирова, М. В. Безрукова, Р. А. Юлдашев, Р. А. Фатхутдинова, А. Р. Мурзабаев // Доклады РАН. - 2013. Т. 448. № 5.- С. 618-620.

3. Мурзабаев, А. Р. Защитные механизмы растений в ответ на токсическое действие ионов кадмия / А. Р. Мурзабаев, М. В. Безрукова, Ф. М. Шакирова // Агрохимия. -2014. -№ 10. - С. 83-93.

Публикации в сборниках u материалах конференций

4. Безрукова, М. В. Участие АЗП в формировании устойчивости пшеницы к ацетату кадмия / М. В. Безрукова, Р. А. Фатхутдинова, А. Р. Мурзабаев, Ф. М. Шакирова // Материалы международной научно-практической конференции «Роль классических университетов в формировании инновационной среды регионов». Уфа: РИЦ БашГУ. - 2009. - С. 35-38.

5. Безрукова М.В. Участие лектина пшеницы в укреплении барьерных свойств клеточных стенок в ответ на воздействие ионов кадмия / М. В. Безрукова, Р. А. Фатхутдинова, А. Р. Мурзабаев, Ф. М. Шакирова // Материалы докладов VIII Международного симпозиума «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты». Москва, - 2012. - С. 238-239.

6. Мурзабаев А. Р. Влияние лектина пшеницы на особенности протекания митоза при воздействии ацетата кадмия / А. Р. Мурзабаев, М. В. Безрукова, Р. А. Фатхутдинова // Материалы III Всероссийской школы-конференции. Биомика. Уфа. 2012. - Т. 3. -№ 1. - С. 76-78.

7. Bezrukova М. V. Role of lectin in salicylic acid-induced resistance of wheat to cadmium acetate / M. V. Bezrukova, R. A. Fatkhutdinova, A. R. Murzabaev, D. R. Maslennikova, F. M. Shakirova // the 3th International Symposium Intracellular Signaling and Bioactive Molecules Design. 17-23 September, Lviv, Ukraine. Book of Abstracts.-2012-P. 111.

8. Безрукова M. В. Ко-иммунолокализация АЗП и АБК в связи с устойчивостью пшеницы к токсическим ионам / М. В. Безрукова, А. Р. Мурзабаев, Ф. М. Шакирова // Материалы Международной научной конференции и школы молодых ученых. Часть II Калининград. - 2014. - С. 58-60.

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю д.б.н., проф. Ф. М. Шакировой, а также сотрудникам лаборатории молекулярных механизмов устойчивости растений к стрессам к.б.н. М. В. Безруковой, к.б.н. P.A. Фатхутдиновой, к.б.н. Ч. Р. Аллагуловой, к.б.н. А. М. Авальбаеву, к.б.н. Д. Р. Масленниковой, к.б.н. P.A. Юлдашеву за неоценимую поддержку, постоянное внимание к работе и помощь в ходе ее выполнения и обсуждения результатов.

Подписано в печать 11.05.15 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 80 экз. Заказ 072. Гарнитура «ТипезЫеиНотап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 5, т/ф: 27-27-600, 27-29-123