Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Повышение устойчивости яровой пшеницы к абиотическим стрессам методами биотехнологии

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Повышение устойчивости яровой пшеницы к абиотическим стрессам методами биотехнологии"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

- а НАР

ч'

НГУЕН ТХИ ЛИ АНЬ

ПОВЫШЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ К АБИОТИЧЕСКИМ СТРЕССАМ МЕТОДАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ

Специальность 03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степенн кандидата сельскохозяйственных наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА.

Научный руководитель — кандидат биологических наук И. Д. Никифорова.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук 3. Б. Шамина, кандидат биологических наук Г. В. Рассадина.

Ведущее учреждение — Московский государственный университет (биологический факультет).

Защита состоится 6 марта 1995 г. в СП? на заседании специализированного ученого совета Д. 120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, г. Москва И-550, ул. Тимирязевская, 49, отдел защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ТСХА.

Автореферат разослан « » февраля 1995 г.

Ученый секретарь

специализи""ияннпгп тпртя —

кандидат

А. С. Лосева

Актуадыюсть проблемы. в современных экологических условиях количество тяжелых металлов в почвах и водах техногенных ландшафтов на несколько порядков превышает фоновые природные концентрации. Кроме того, глобальное потепление климата планеты, вызванное влиянием жизнедеятельности человека, ставит перед селекционерами задачи создания новых форм культурных растений, устойчивых к экстремальным факторам окружаодзй среды (засухе, засолению почв, низким и высоким температурам, ионам тяжелых металлов ). В соответствии с оценками экспертов, по распространенности и опасности для экологических систем тяжелые металлы занимает второе место, уступая только пестицидам и значительно опережая такие широко известные загрязнители, как двуокись углерода и серы.

Проблема фитотоксического действия свинца, кадмия и цинка на корневую систему растений в последние десятилетия интенсивно исследуется учеными разных стран мира, поскольку известно, что не менее половины всего количества тяжелых металлов техногенного происхождения в конечном итоге поступает в почву. .

Известно, что расширению арсеналов методов для повышения генетического разнообразия растений служит привлечение методов биотехнологии.

Исходя из вышеизложенного, особенную актуальность приобретает- работы по изучению влияния ионов кадмия и повышенных температур на рост культивируемых клеток различных видов пше-вицы и созданию на базе сомаклональной вариабельности форм устойчивых к экстремальным факторам окружающей среды. Кроме того, чрезвычайно важным является изучение возможности селекции на клеточном уровне форм, обладающих комплексной устойчивостью к стрессам, основываясь на неспецифической реакции на стресс растительными клетками.

Цель и задачи исследования. Целью дайной работы было Изучение влияния ионов кадмия и температурного стресса на культивируемые клетки двух видов пшеницы(твердой и мягкой). А также, создание новых форм пшеницы, устойчивых к этим стрессам, методами клеточной селекции.

Для достижения поставленных целей было необходимо:

- провести сравнительное изучение влияния теплового стресса на формирование каллусной ткани и рост уже сформированного каллуса у твердых и мягких сортов пшеницы;

- отселектировать клеточные, линии устойчивые к повышенным температурам и получить них растения регенеранты;

• - провести исследование влияния различных концентраций' ионов кадмия на формирование каллусных тканей и рост каллус-ных клеток твердых и мягких сортов пшеницы;

- отселектировать устойчивые к повышенным концентрациям ионов кадмия клеточные линии и получить из них растения регенераты;

- провести лабораторную оценку растений-регенерантов на устойчивость к селектирующему фактору и проанализировать возможность возникновения перекрестной .устойчивости к абиотическим стрессам.

Научная новизна Впервые проведено изучение влияния ионов кадмия и высоких температур на рост и морфогенез в культуре клеток двух видов пшеницы (Trittcum aestivum и Tritlcum durum). Выявлены генотипические различия в ответе кадлусных клеток на тепловой стресс и стресс, вызываемый ионами кадмия. Установлено, что каллусные клетки сорта Безенчукская 139 обладает большей выносливостью к повышенной температуре, но наиболее чувствительны к ионам кадмия. Тогда как, клетки сорта Целинная-21 - более устойчивы к ионам кадмия и чувствитедны к тепловому стрессу. Впервые проведена селекция двух видов пшеницы на клеточном уровне на устойчивость к ионам кадмия и жароустойчивость и из стабильно устойчивых 'клеточных линий получены растения - регенеранты. Методайи индукции каллуса в стрессовых условиях показано, что "ча££ь растений регенеран-тов, полученных из устой<жвых клеточных линий, сохраняют призак устойчивости и передают его следующему поколению. Среди растений-регенерантов выявлены формы, у которых устойчивость к ионам кадмия сочетается с устойчивостью к тепловому стрессу и наоборот.

Практическая значимость. .Созданные в результате работы новые формы твердой и мягкой пшеницы могут служить основой для создания новых сортов, обладающих устойчивостью к ионам

кадмия и жаростойкостью, что позволит сократить потери урожая от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды.

Апробация работы. Результаты исследования представлены на Межвузовской конференции по физиологии растений и .биотехнологии в 1994 году, на конференции молодых учёных Мзсковской сельскохозяйственной академии им. К А. Тимирязева 1993 года, на заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА.

Публикации. -По материалам диссертации опубликована одна работа и подготовлено к печати две статьи.

Объём и структура диссертации. Диссертационная , работа состоит из введения, обзора1 литературм, «зтоднческой части, результатов й оосузяения. Материалы диссертации наложены на ~ítv страницах текста, содержат, /^таблиц, .1 £ рисунков и. Я фотографий. Библиография содержит 2В0 источников отечественной и зарубежной литературы

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ 1ЮСЛЕД0ВАНИЯ

В качестве объектов исследования были использованы сорт яровой гексаплоидной пшеницы (Tntlcum aestlvum) селекции Се-веро-Казахстанского селекционного центра (Каз. НИИЗХ) Целинная -21 , и сорта тетраллоидиой пшеницы - Беаенчукская-139 и Дам-синская-90.

каллусную ткань получали из незрелых зародышей (14-16 дней после цветения) на модифицированной среде Ыурасиге-Скуга (МС) с добавлением 2 мг/л 2.4Д. Следует отметить, что для индукции каллуса использовали зародыши из зерновок расположенных только в средней части колоса. Культивирование проводили <• при температуре 27° С и постоянном освещении. Пересадки на свежую питательную среду осуществляли каждые 4 недели и суб-культивировали только морфогенный каллус. Интенсивность роста каллуса обозначали как относительный рост и определяли, как отношение прироста каллуса к весу экспланта. Бес экспланта обычно составлял 20-30мг. Прирост биомассы в стрессовых условиях выражали как % к контролю, т. е. к росту каллуса данной линии на неселективной сре'де.

Морфогенный потенциал ткани оценивали визуально по шее-

тиОалыюй системе, по которой морфогенным считался каллус, состоящий более чем на ЗОХ из плотных структурированных тканей.

Дня изучения влияния ионов кадмия на рост каллусных тканей или проростков пшеницы использовали сернокислый кадмий CdS04B концентрациях соответствующих содержанию ионов кадмия в литре среды - 10,20,30,40 и 60 иг кадмия. . .

Клеточную селекцию на устойчивость к ионам кадмия проводили по различным схемам. Для отбора клеточных линий, устойчивых к повышенным температурам, каллусные ткани помещали в жидкую питательную среду и прогревали в ультратермостате при температуре 45°С различное время при постоянном перемешивании. После прогревания ткани помешали на агаризованную среду 1С и культивировали в обычных условиях. В дальнейшем прогревание повторяли несколько раз.

Оценку растений-регенерантов на устойчивость к стрессам проводили методами индукции каллуса в стрессовых условиях. Кроме того, устойчивость на уровне проростков определяли по энергии прорастания семян в присутствии 50 мг/л Cd, Жароустойчивость определяли по степени депрессии ростовых процессов после прогревания семян при 66"С 20 минут.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение влияния ионов кадмия на рост каллусной ткани трех сортов пшеницы

Влияние различных концентраций ионов кадмия на рост каллуеных тканей трех сортов пшеницы изучали на тканях, которые находились в условиях in vitro более четырех месяцев. В этом случае мы имели стабильно растущие каллусные ткани, обладающие высокой морфогенной способностью.

Культивирование аксплантов различных сортов пшеницы на средах, содержащих достаточно высокие ( для пшеницы) концентрации 'кадмия в среде (10,20,30 и 40 мг/л) в течение одного месяца дало неожиданный результат (Таблица 1).

Таблица 1.

Влияние кадмия на рост и морфогенез каплусных тканей трех сортов яровой пшеницы

1 ••• • 1 в 1 Д-21 Д-90 В-139 ........ 1

1 А

1 »

1 Р I При- При- При-

1 и | рост рост рост

1 А |каллу 7. к | МП каллу % К МП каллу X к | МП |

1 н |-сов конт. 1 -сов конт. -сов конт. >

| т К «Г) (мг) (иг)

1 к 1373,4 100 | 100 386,6 100 86,6 321,2 100 | 85,8|

1+10,2 +10,2 + 8,5

| 10Сс1 (328,2 87,9| 95.0 300,2 77,6 75,6 351,3 109,4|-

|+ 6,9 + 7,3 + 8,2

| 20Сс1 |324,3 86,81 92.3 298,4 77,2 68,9 356,8 111,11 64,71

К 6,8 + 8,8 +10,1

| ЗОСс! |304,5 81,5| 85,0 265,9 68,8 62,8 289,2 90,0( 58,3|

1+ 5,9 + 6,4 + 7,9

| 40С<1 |195,2 52,71 75,0 218,8 56, б 59,4 258,8 80,6| 44,21

1 1+ 7,3 + 7,9 + 7,4 1 1 |

Известно, что кадмий является одним из наиболее токсичных тяжелых металлов для растений. Однако, в нашем эксперименте повышение концентрации кадмия в среде от 10 до 20 мг/л не приводит к угнетению роста тканей для всех сортов пшеницы. Больше того, данные концентрации стимулировали прирост каллусных клеток сорта Безенчукская 139. Только присутствие 40 мг/л Сё в среде приводит к снижению прироста ткани до 52% от контроля дла сорта Целийная-21 и до Б6Х для сорта Даысинская-

до. Рост клеток сорта Безенчукская-139 в этих условиях инги-бировался только на 20Х.

Анализ морфогенного потенциала тканей, росших в присутствии ионов кадмия показал, что увеличение концентрации кадмия в среде приводит к существенному снижению морфогенной способности тканей сорта Безенчукская-139 (44%) и в меньшей степени влияет на морфогенный потенциал тканей сорта Целинная-21 (75Х).

Таким образом, можно предположить, что рост каллусных тканей сорта Еевенчукская-139 в стрессовых условиях происходит в основном за счет прироста неыорфогенных тканей и возможно, за счет преобладания процессов растяжения над делением клеток. Такое предположение мы можем сделать на основании того, что неморфогенная ткань пшеницы всегда состоит из крупных вакуолизированных клеток. Цэжно предположить также, что мор-фогенные'клетки сорта Целинная-21 проявляют большую устойчивость к ионам кадмия, чем клетки двух сортов твердой пшеницы. На наш взгляд, оценивать ответ культивируемых клеток пшеницы на токсическое действие ионов кадмия правильнее не по весовым характеристикам, а по реакции морфогенных тканей, так как именно в этих тканях происходит большинство делений клеток. Больше того, нас интересуют .клетки, способные делиться в стрессовых условиях, а не переживать их.

Из литературных данных известно, что ионы тяжелых металлов могут ингибировать деление клеток растений. Кроме того, включаясь в клеточную стенку они могут снижать её эластичность. что приводит к угнетению роста растяжением. Известны и различные пути детокснкации йонов тяжелых металлов растительными клетками. Так как мы не изучали биохимичесих и цитологических основ ответа на стресс, вызванный токсическими концентрациями ионов кадкия, мы вынуждены оценивать влияние кадмия на клетки пшеницы только по интегративным процессам роста и морфогенеза. Можно предположить, что в наших экспериментах ионы кадмия в различной степени угнетают процесс деления клеток, но не ингибируют их растяжения.

Пэвторное культивирование тканей в стрессовых условиях (см. диссертацию) подтвердило наше предположение о сортовых

различиях в ответе на стресс, вызванный присутствием в среде ионов кадмия.

Культивирование тканей в течение двух месяцев на кадмий-содеряащих средах показало, что ткани сорта Целинная-21 в присутствии 30 . мг/л кадмия в среде на 76Х состоят из морфо-. генных тканей, тогда как морфогенный потенциал тканей двух других сортов в этих условиях равен нулю. Интенсивность роста этих тканей равняется 50% от контроля.

Таким образом, на основании полученных результатов нами выявлены сортовые различия в ответе на стресс, внзнваешй ионами кадмия в среде.. Исходя .-ив этого, йога» раншровать испытанию сорта пшеницы по устойчивости к ионам кадмия в порядке возрастания: Безенчукская -139, Дамсинская -90, Целинная-21.

Влияние повышенных температур на рост каллуса • трех сортов пшеницы.

Так как в нашу задачу входило сопоставление действия двух стрессов на рост каллусных тканей различных сортов пшеницы (теплового и стресса вызываемого ионами кадмия) для изучения влияния тепловой обработки на каллусные клетки мы помешали каллусные ткани (4 пассаж) в жидкую питательную среду и при постоянном перемешивании прогревали в ультратермостате при температуре 45°С от 1Б до 60 минут. После прогревания эк-епланты поыевдиги на свежую питательную среду (агаризованную) и культивировали как обычно в течении месяца В конце пассажа экспланты взвешивали и определяли интенсивность прироста ткани. Результаты данного эксперимента приведены на рисунке 1.

Из представленных данных видно, что даже пятнадцатиминутное прогревание клеток при 45 "С приводит к значительному снижению ростовых процессов ¡г тканей сортов Дамсинская-90 и Целинная-21 ( на ЗОХ). В то время как клетки сорта Безенчукская- 139 снижают прирост только на 13%. Увеличение времени тепловой обработки каллусных клеток приводит к дальнейшему снижению ростовых процессов.

Интересно, что наблюдаются сортовые различия по динамике угнетения роста тканей а зависимости от времени прогревания.

- 8 -

Рис. 1 Влияние высокой температуры на рост трех сортов яровой пшеницы

Ц-21

д-до —а— 16,...60 время экспозиции

Б-139

0 15 33 45 60

Так для клеток сорта Дамсииская 90 характерно равномерное снижение интенсивности фос*а в зависимости от времени тепловой обработки после (редкого спада, вызванного пятнадцатиминутным прогревание!«. 'Клерки сорта Целинная-21 также резко реагируют на первые '15 минут прогревания, но дальнейшее увеличение времени обработки до 46 минут приводит к снижению ростовых процессов только на 8%. Дополнительные 16 минут прогревания п^иво-^ят к дальнейшему угнетению роста на 12Х. Прогревание 'каллусннх тканей сорта Бевенчукская-139 не приводит к значительному снижению интенсивности ростовых процес-' сов. так :прогревание тканей до 45 минут снижает прирост только на "233;. Увеличение периода прогревания тканей на 15 минут привода к угнетению роста на 202. •

Оценивая полученные данные, мы можем предположить, что при прогревании тканей часть клеток, чувствительных к температурному стрессу, погибает и увеличение времени обработки приводит к увеличению числа погибших клеток. Динамика этого процесса зависит от термотолерантности сорта. Так клетки сорита Безенчукская-139 проявили наибольшую устойчивость к тепло-

вому стрессу.

Морфогенный потенциал (МП) тканей, образовавшихся после прогревания, равномерно снижается с увеличением времени обработки, причем снижение морфогенных потенциалов тканей твердых сортов пшеницы не разлетается между собой. В то время как прогревание тканей сорта Целинная-21 в течение 45 минут приводит к снижению морфогенного потенциала до 40%, причем Ш тканей Безенчукская-139 и Дамсинская-90 составляет 58 и 62% соответственно.

На основании результатов по ингибированию ростовнх процессов и по изменен!«? морфсгеаксго ' потенциала тканей послэ прогревания можно предположить, что морфогенные клетки сорта Целинная-21 более чувствительны к тепловому стрессу, чем морфогенные клетки сортов Бевенчукская-139 и Дамсинская-90.

Таким образом нами установлено, что ¡тетки испытанных нами сортов обладают различной чувствительностью к двум абиотическим стрессам. Так сорт Целинная-21 проявляет большую устойчивость к ионам кадмия, но более чувствителен к тепловому стрессу. "Клетки'твердых сортов пшеницы более устойчивы к тепловому стрессу, чем клетки сорта Целиннйя-21, что подтверждает данные Wang and Nguen ( 1989) о корреляции генотипических различий в термотолера?ггнос?и на клеточном уровне и на уровне целого растения. Ведь известно, что тетраплоидные сорта пшеницы обладают большей жароустойчивостью по сравнению с гек-саллоидными.

Поэтому постановка задачи создания устойчивых к тепловому стрессу растений методами селекции устойчивых клеток представляется совершенно правомерной. Болызе того, существуют исследования, в которых обсуждается возможность приобретения устойчивости к повышенным температурам при клеточной селекции на устойчивость к ионам кадмия (Bin Huang and Р.В.Goldsbrough 1988). . ■

Влияние ионов кадмия на формирование каллусной ткани из незрелых зародышей различных сортов псеницы.

.Нами было изучено влияние сублетальньп: концентраций ио-

нон кадмия на процесс ^дифференциации клеток незрелого заро-дша различных сортов пшеницы. Как уже отмечалось, зкспланта-ми служили зародыши пшеницы на 14-16 день после опыления. Следует отметить, что в это время размеры зародышей составляют примерно 1,6 - 2 мм. и весят они около 5 мг. Результаты изучения влияния ионов кадмия на процесс дедифференциацки приведены в таблице 2,

Следует отметить, что в отсутствии кадмия в среде индукция' каллуса у всех сортов пшеницы происходит со 100 процентной частотой и вес зкспланта в конце пассажа увеличивается в среднем в 13-16 раз в зависимости от сорта. В присутствии ионов кадмия,таклоэ как и в эксперименте о дедифференцированными клетками, не происходит значительного угнетения роста каллус-ной ткани. Увеличение биомассы в конце пассажа для сортов Це-линная-21 и Дамсинская-90 составляет примерно вОХ от контроля. И только для сорта Безекчукская-139 прирост ткани составляет 58Х от контроля, что свидетельствует о его чувствительности к данному стрессу.

Таблица 2.

Индукция каллуса в стрессовых условиях

( ■;■--■ | Контроль | СИ(10МГ/Л) 1

| Сорт (прирост) Хморф. прирост 1 X К | Хморф. )

1 (иг) | халл. 1 (иг) 1 кон. | 1 | калл. |

1 Ц-21 | 69,06 1 | 63,22 £6,16 1 1 1 1 32,78

1 +2,44 1 +3,87 1 у+1,87 1 81,27 | +2,93 |

1 Д-90 I 73,88 1 I 78,60 68,93 1 1 1 1 20,37 . |

| +3,00 | +2,69 1 +2,41 1 79,76 | 1 1 +2,35 I

| Б-139 I 81,33 1 1 73,33 52,36 1 1 1 1 16,51 |

1 . ... I +3,76 | +3,46 1 +2,76 I 68,40 | +1,40 |

Наиболее убедительными данными о генотипических особен- •

- и -

ностях ответа на ионы кадмия, на наш взгляд, такая® как и в случае с культивируемыми клетками пшеницы, являются данные о ыорфогенетических способностях подученных тканей. Мы видим, что морфогенный потенциал тканей твердых сортов пшэницы в отсутствии стресса (78 и 73%) превосходит морфогенный потенциал ткани сорта Целинная-21 (53%). Индукция каллуса в стрессовых условиях (10 мг /л Сс1 ) существенным образом снижает морфогенный потенциал образующихся тканей, особенно у твердых сортов пшеницы. Так, если морфогенный потенциал тканей сорта Целинная -21 в стрессовых условиях снижается на 207., то морфогенный потенциал сортов Даыеинская-30 и Везенчукская-139 «пкватся на 67-58%.

Результаты этого эксперимента подтвердили наше предполо-. жвние о различной чувствительности к ионам кадмия клеток различных сортов пшеницы и, что устойчивость сортов возрастает в ряду Везенчукская-139, Дзмсинская-90, Целинная-21.

Изучение влияния прогревания незрелых зародышей . ' на формирование каллусных тканей.

Для изучения влияния теполового стресса на формирование каллусных тканей незрелыми зародышами трех сортов пшеницы, зародыши на 14-16 день после цветения изолировали в стерильных условиях и инкубировали в жидкой питательной среде 1С в ультратерыотате при температуре 45 С в течение 30 или 60 минут. После чего зародыши помещали на агариэованную среду УО для индукции каллусной ткани и культивировали в течение месяца в обычных условиях. Взвешивание тканей в конце пассажа показало (Таблица 3), что тепловая обработка незрелых зародышей приводит к снилкнию эффективности образования каллусных тканей. Тридцатиминутное прогревание зародышей приводит к игиби-рованию процесса дедифференциации в. большей степени у сорта Безенчукская 139 (67%), чем у двух других сортов. Прогревание в течение часа приводит к дальнейшему угнетению каллуеогене-за, причем индукция каллуса у сортов твердых пшениц угнетается в несколько большей степени, чем у сорта Целинная-21.

Таблица 3.

Влияние высокой температуры на индукцию каллуса

С О Р Т

Контроль!

45вС-30м

45"С-60ы

Прирост калл, («г)

Ш

I При-| | | рост| X к | ¡калл, (контр| I (мг)|

I При-) | Ш | рост| % к | МП (калл. |контр| I (мг)1

Ц-21

Д-90

В-139

69,57129,68(65,33179,53110,93148,11169,15| О +2,16|+2,37|+1,47| |+0,34(+2,53| | 1111111 61,88|55,20|50,16|81,06|35,34(38,40|62,02|28,29 +1,77|+3,34|+3,22| |+2,39(+3,23| |+0,58

I I I I I I I 101,80(98,41168,48|67,27|73,81162,90|61,78|68,18 +3,59(+1,29|+3,68| (+2,03|+3,43( |+3,91

I I I I III

Из представленных в таблице данных видно, однако, . что тепловая предобработка зародышей перед индукцией каллуса существенным образом влияет на морфогенные способности образовавшейся каллусной ткани. Так прогревание зародышей'в течение 30 минут приводит к снювещао морфогенного потенциала у всех сортов примерно на 20*. Тогда ¿сак предобработка в течение часа приводит к снижению морфогенного потенциала у сортов твердых пшениц на 7Х, а у сорта Целинная -21 приводит к образованию только неморфогенного каллуса. Повидимому при прогревании зародышей погибают те клетки, которые дают начало морфогённому каллусу, и вероятно, эти клетки у сорта Целинная-21 более чувствительны к тепловому стрессу.

Результаты данного эксперимента подтверждают наше предположение о том, что клетки сорта Безенчукская-139 превосходят по устойчивости к тепловому стрессу клетки сортов Дам-

синская-90 и Целинная-21.

Клеточная селекция на устойчивость к ионам кадмия.

Основываясь на полученных данных мы провели клеточную селекцию на устойчивость к ионам кадмия на трех сортах пшеницы. Клеточную селекцию проводили по различным схемам. Основным принципом селекции являлось культивирование в стрессовых условиях в течение трех пассажей (первый этап), 8атем второй этап селекции - возврат в неселективные условия (три пассада) и следующие три пассат ¡культивирование в селективных услови-

Таблица 4.

Результат селекции клеточных линий, устойчивых к кадмию

1......... | Сорт (Селективный | фактор Число линий Число рег. раст. 1 | X фертиль. | ¡растений(Я0)

| Б-139 | Юмг/л СИ ! 1 3 I 0 |

1 Д-90 1 | 10мг/Л СИ 3 33 ! Зб.зб |

1 Ц-21 | Юмг/л СИ 1 5 75 | 48,00 |

1 | 20мг/л СИ 1 3 21 | 28,57 |

1 | ЗОмг/Л СИ I 1 3 1 0 |

1 . 1 ......1

ях (третий этап). Шрвый вариант - селекция в мягких селективных условиях, когда культивирование тканей проводили при концентрации 10 мг/л СИ в среде на первом й третьем этапах селекции. Второй вариант селекции состоял в отборе клеточных линий на концентрации 20 мг/л кадмия на первом и третьем этапах селекции. Третий вариант селекции начинался с 'ю мг/л кадмия в сродс, но в дальнейшем концентрация увеличивалась иа 10 мг/л а каждом последующем пассаж (т.е. 20 и 30 мг/л).

После культивирования в неселективных условиях ткани культивировали в присутствии 30 мг/л СИ.

В результате клеточной селекции нами были отобраны устойчивые клеточные линии и получены из них растения-регене-ранты. Результаты селекции приведены в таблице 4.

Из представленных в таблице данных видно, что для сортов твердой пшеницы только мягкие условия селекции позволили выделить клеточные линии способные расти в присутствии ионов кадмия. Больше того, растения-регенеранты, подученные ив устойчивой клеточной линии сорта Бэаенчукская-139 оказались стерилиными. Кроме того, проведение селекции в более жестких условиях на клетках сорта Целинная-21 приводит ^ уменьшению числа отобранных линий (но, вероятно, к повышению вероятности •отбора истинно устойчивых линий) и к возрастанию стерильности полученных растений.

Клеточная селекция на устойчивость к повышенным температурам.

Для отбора клеточных линий, устойчивых к тепловому стрессу мы проводили отбор по различным схемам. Первым вариантом была моношаговая, селекция, когда экспланты в четвертом пассаже подвергали однократному прогреванию ( 45 °С различные периоды времени), после чего культивировали эксплант в обычных условиях в течение месяца и затем переносили на среду для регенерации растений. В этом случае трудно было рассчитывать на отбор устойчивых форм, но этот эксперимент поаволил нам оценить влияние тепловой обработки"на реализацию морфогенети-ческих способностей тканей. Так нами обнаружено, что для сортов Целинная-21 и Беэенчукская-139 прогревание морфогенного каллуса 45 С в.течение 30-45 минут прозволяет повысить выход, растений-регенерантов.

Многошаговая селекция включала трехкратное прогревание, чередующееся с культивированием в обычных условиях. В первом варианте многошаговой селекции ткани прогревали при 45 С трижды по 15 минут. Второй вариант состоял из трехкратного прогревания по 45 минут и третий вариант селекции состоял в

постепенном увеличении времени прогревания т. е. первое прогревание - 15 минут, второе-45 минут и третье -60 минут.

Оценка интенсивности роста каллусных тканей после каэдо-го прогревания (см. диссертацию) показала, что . уже после третьего прогревания, независимо от'длительности, наблюдается тенденция к селекции клеток с повышенной адаптивной способностью. Это выражается в увеличении, прироста ткани в сравнении с интенсивностью роста после предыдущей обработки. В этом случае мы не можем утверждать, что отобрали термотолерантные линии, но «омем говорить об- их повышенных адаптивных способностях. Результаты данного эксперимента проведенного на клетках сорта Целинная -21 приведены в таблице 6. Из представленных данных видно, что ужесточение условий селекции приводит к снижению числа полученных растений-регенерантов.

I . ■

Таблица Б.

Многошаговая селекция клеток сорта Целинная-21

1 | Номер | линий Схема селекции | Число |рег раст. 1 | X фертиль. | |растений(Н0) 1

| Т5 15мин- 0 -15мин- 0 -15ыин -0 1 1 | 22 1 ( 1 72,7 |

| Т4 45мин- 0 -45мин- 0 -45мин -0 1 I 20 1 1 14 1 1 50,0 |

| Т6 1.............. 15мин- 0 -45МИН- 0 -бОмин -0 1 50,0 | ............1

Оценка растений регенерантов методом индукции каллуса в стрессовых условиях.

Как уже отмечалось, анализ растений-регенерантов мы проводили различными косвенными методами. К сожалению ввиду ограниченности во времени нам удалось проанализировать только часть полученных растений-регенерантов. Кроме того, следует

отметить, что мы не могли иметь материал в достаточном количестве для корректной статистической обработки результатов по оценке регенерантов. Мы были вынуждены использовать по 30-50 семян в экспериментах по энергии прорастания и по 20-30 зародышей для индукции каллуса Кроме того, мы понимаем, что оценка растений двумя косвенными методами не позволяет нам говорить об истинной устойчивости, но позволяют оценить тенденцию.

Индукция каллуса из незрелых зародышей растений-регене-рантов в стрессовых условиях позволяет оценить растение-реге-нерант на сохранение признака устойчивости на клеточном уровне и позволяет оценить возможность передачи этого признака потомству.

Мы оценили часть растений регенерантов сортов Целинная -21 и дамсинская-90 на устойчивость к ионам кадмия при индукции каллуса в присутствии 10 мг/л СИ. Результаты проверки представлены на рисунке 2а. Из регенерантов, сорта Ц-21, полученных из трех клеточных линий (К-1, К-2 и К-3), только ре-генерант из линии К-3 способен индуцировать каллус в присутствии 10 мг/л СИ так же, как и в контроле. Эта линия была получена в результате селекции на 20 мг/л СИ. Кроме того, у регенеранта, полученного из устойчивой линии С-2 сорта дамсинская-90 индукция каллуса в стрессовых, условиях превосходит по эффективности каллусогенез в контроле. Это обстоятельство свидетельствует об устойчивости клеток этого регенеранта, а если учитывать, что ткань зародыша является следующим поколением данного регенеранта, то можно утверждать, что устойчивость к ионам кадмия, проявляющаяся на клеточном уровне, наследуется. Следует отметить, что морфогенный потенциал каллусных тканей, образовавшихся в стрессовых условиях, у растений регенерантов превышал контроль.

Для анализа растений, полученных из клеток, способных к делению после трехкратных прогреваний, мы проводили индукцию каллуса из зародышей после прогревания 45 С в течение 30 и 60 минут. Из /представленных на рисунке 26 данных видно, что у полученного из линии Т-4 регенеранта сорта Целинная-21, прогревание зародышей в течение 30 минут не влияет на ИНДУКЦИЮ

Рис. 2а Анализ растений-регекорактов методом индукции каллуса в нормальных и стрессовых условиях

Ц- 21,0-90 К-1,.. .С-2 го

§1

§ о

В! О)

ео

ш

•ю

а)

исходные сорта селективные линии

г

д-а

К-1 к-2

к-з

Ш без Ой @ Юмг/д Сд

У,

у

/, г? —

'к / —

✓ _

— —

__ ' / _

— / —

/ / У /

/ й я — 'л ' / с

СМ с-2

Рис» 26 Анализ растений-регенерантов методом индукции каллуса из зародышей,обработанных высокой температурой

Ц-21 исходный сорт Т-4.Т-6 селективные линии

75

Ш -

45

|эо

о

X 0>

-Й-УХ ■ у

---

■ ; /

V.

■ --

' •■■* У

' У У

' У '' ---

"'У.*'

йконтроль

§Ц45°С,30м экспозиции 0X145°С,60м экспозиции

/ у

• '-'у'

——

У ------

ГЫ1

чч

15

каллуса, а.прогревание в течение 60 минут только немного снижает эффективность каллусогенеза Эта линия была выделена после трёхкратного прогревания каллусных тканей 45 ° С по 45 минут. Тагам образом можно утверждать, что такой способ позволяет отобрать клеточные линии с повышенной термотолерантностью и толерантность на клеточном уровне наследуется.

Оценка растений-регенерантов по энергии прорастания семян в стрессовых условиях.

Для нас было необходимо убедиться в том, что признак устойчивости, отобранный на клеточном уровне, экспрессируется на уровне целого растения. Поэтому устойчивость растений-регенерантов к тепловому стрессу определяли по степени депрессии ростовых процессов после прогревания семян при 56 С 20 мин. ( Волкова и Моткалюк, 1976). На рисунке За представлены результаты такой оценки. Ш обнаружили; что семена регенеран-та сорта Целинная-21, полученного из устойчивой клеточной линии Т-4 и сохранившего признак устойсивости на клеточном уровне, прогревание не ингибирует, а стимулирует ростовые процесса Так длина корня и длина побега после прогревания превосходит не только, контроль, но и исходный сорт. На основании этого можно заключить, что прямая•селекция на устойчивости к тепловому .стрессу на клеточном уровне позволяет сода-вать новые формы. превосходящие по- устойчивости исходный сорт.

Устойчивость к ионам кадмия оценивали по энергии прорастания семян растений регенерантов в присутствии ЙО мг/л СИ и сравнивали сухой вес корней и побегов в контроле и в опыте. Результаты экспериментов показали (Рис.36), что все испытанные растения- регенеранты сорта Целинная-21 обнаруживают признаки устойчивости. У всех регенерантов накопление биомассы в стрессовых условиях превосходят контроль. У регенерантов сорта Дамсинская-90 ионы кадмия не угнетают рост корней, но немного снижают рост проростка, даже у регекеранта, проявившего признаки устойчивости на клеточном уровне (С-2). Конечно, для окончательной оценки растений регенерантов необходимы ис-

Рис. За Анализ растений-регекерантов методом прорастания семян

Щ корни: контроль Ц-21 исходный сорт § корни: 56° С, 20м экспозиции

Т-4,Т-5,Т-б селективные линии ^побеги: контроль

побеги: 56й С, 20м экспозиции

75

« а?

о

си

1*

« а.

Й 15

р:

Х7\

' У

I

ГХу1

>9

У.)

УМ

х>

I

I

У V

I

V

/

Ига

Т-4

Т-5

т-ь

Рис.'36 Анализ растений-регенерантов методом прорастания семян в нормальных и стрессовых условиях

Ц-21,0-90 К-1....С-2

исходные сорта селективные линии

У/7)\ корни воде ¡==) корни в 50мг/л Сс1

побеги в воде Ш побеги в бОмг/л СИ

Е

о „

<ц Ь «

« о

- *

>т

■>4.

- ? _ >

«1 «I

Ц-21 К-1

К-2

К-3

Х)£0 0-1

Рис. 4а Оценка перекрёстной устойчивости Сй-селективных линий

ШЭ корни: контроль . Ц-21,0-90 исходные сорта » £=§ корни: 56" С» 20м экспозиции К-1,,.. 0-2 селективные линии [ЦЦ побеги: контроль

Щ побеги: 66° С, 20м экспозиции

и

о 8

В

Ц-21 К"! К-2

Рис. 46 Оценка перекрёстной устойчивости жаро-селективных линий

^корни в воде Ц-21 исходный сорт § корни в 50мг/л Сс$

Т-4.Т-6 селективные линии ' побеги в воде

Щ побеги в бОмг/л Ой

*—* о

о

питания, позволяющие оценить не только устойчивость, но и продуктивность. Однако уде сейчас можно сказать, что селекция на клеточной уровне на устойчивость к ионам кадмия позволяет отбирать генотипы, способные противостоять токсическому действию ионов кадмия.

Оценка растений-регенерантов на наличие перекрестной устойчивости.

Как мы отмечали ранее, в литературе было сообщение о возможности получения • температуроустойчивых ¡щеточных, линий при отборе на устойчивость к ионам кадмия (Bin Huang and Qoldsbrough, 1988). Пэзтому для нас было важно оценить растения регенеранты на наличие перекрестной устойчивости, то есть, оценить растения, полученные из температуровыносливых линий на устойчивость к ионам кадмия и наоборот. Результаты такой оценки представлены на рисунке 4 (а)и (б). Как видно ив рисунка 4 (а) ни один из регенерантов сорта Целинная-21, полученных из устойчивых к кадмию клеток, не показал устойчивости к повышенным температурам. Одншсо регенеранты сор-га Дамсинская-90 и С-1 и особенно С-2 показали, что повышенные температуры не угнетают ростовых процессов, из чего можно заключить, что у этих форм устойчивость к ионам кадмия сочетается с устойчивостью к повышенным температурам.

Из регенерантов сорта Целинная-21, полученных из темпе-ратуровыносливых клеток, только у растения из линии Т-б накопление биомассы в присутствии ионов кадмия почти не угнетается, что может свидетельствовать в пользу его толерантности к ионам кадмия. Для детального анализа механиамов устойчивости растений-регенерантов необходимы дополнительные исследования.

ВЫВОДЫ

1. На основании изучения влияния ионов кадмия на рост и морфогенез каллусных тканей пшеницы испытанные в данной рабо-

те сорта можно расположить в ряд в порядке возрастания устойчивости: Беэенчукская-139, Дамсинская-90, Целинная-21.

2. Оценка устойчивости к тепловому стрессу на клеточном уровне позволила ранжировать испытанные сорта а порядке возрастания устойчивости: Целинная-21, Дамсинская-90, Беаенчукс-кая-139.

3. Клеточная селекция на устойчивость к ионам кадмия позволяет создавать формы, у которых признак устойчивости эк-спрессируется на клеточном уровне и на уровне целого растения и передётся следующему поколении.

4. Трехкратное прогревание каллусных тканей пшеницы при температуре 46 С в течение 45 минут, чередующееся с субкультивированием в обычных условиях, позволяет создать стабильные, наследуемые температуротолерантные формы.

5. На базе сомаклональной вариабельности возможно создание генотипов с комплексной устойчивостью к абиотическим стрессам.

Публикации.

Нгуен Тхи Ли Ань, Никифорова И. Д. ."Влияние ионов тяжелых металлов( кадмия) на рост и морфогенез каллусных тканей яровой пшеницы", тезисы иежвуаовской конференции по физиологии растений и биотехнологии, Мэсква, 1994.