Участие адапторных белков RIL и TRIP6 в организации актинового цитоскелета и злокачественной трансформации

Гурьянова, Ольга Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Участие адапторных белков RIL и TRIP6 в организации актинового цитоскелета и злокачественной трансформации
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Участие адапторных белков RIL и TRIP6 в организации актинового цитоскелета и злокачественной трансформации"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАД М.М. ШЕМЯКИНА II Ю А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

ГУРЬЯНОВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

Участие адаиторных белков ШЬ и ТМР6 в организации актиново1 о цитоскелета и злокачественной трансформации

03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 lf.hU 2007

МОСКВА, 2007

003059764

Работа выполнена в Группе экспрессии белковых факторов роста и дифференцировки Института биоорганической химии им акад М М Шемякина иЮА Овчинникова РАН

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ведущая организация

кандидат биологических наук Е.И Фролова

доктор биологических паук, профессор А.Б. Вартапетян

доктор биологических наук Н.Л Лазаревич

Институт молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится « 30 » мая 2007 года в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д 002 019 01 в Институте биоорганической химии им акад ММ ШемякинаиЮА Овчинникова РАН по адресу 117997, Москва, у ч Миклухо-Маклая, д 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им акад М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Автореферат разослан «2.5 »

. 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор химических наук, профессор

В.А. Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность шоблемы

В свете многочисленных исследований последних лет некогда принятая точка зрения, что актиновый цитоскелет - просто статическая структура, обеспечивающая поддержание формы клеток, выглядит чрезмерным упрощением Состояние актинового цитоскелета модулирует активность многих сигнальных каскадов, его интактность - необходимое условие внутриклеточного транспорта органелл Реорганизация актинового цитоскелета играет основную роль в процессах адгезии и миграции клеток, а также при их злокачественной трансформации В связи с этим выявление конкретных механизмов регуляции состояния цитоскелета, а также поиск и всестороннее изучение белков, вовлеченных в эти процессы, является одним из приоритетных направлений современной молекулярной и клеточной биологии Ключевую роль в интеграции сигнальных каскадов и тонкой регуляции их взаимодействий играют ЫМ-доменные цитоскелет-ассоциированные адапторные белки, представителями которых являются продукты генов ШЬ и ТШР6 Изучение функциональных особенностей этих адапторных белков весьма актуально и может пролить свет на многие аспекты клеточной физиологии и опухолевой прогрессии, открывает широкие перспективы для детального реконструирования механизмов их участия в реорганизации актинового цитоскелета в норме и патологии и закладывает основы для разработки в будущем новых подходов к диагностике и лечению рака

Цели и задачи исследования

Основной целью данной работы явилось исследование функциональных особенностей цитоскелет-ассоциированных ЫМ-доменных белков ТШРб и ШЬ, их влияния на реорганизацию активного цитоскелета, на морфологию и физиологию клеток, а также их возможное влияние на инвазивные свойства опухолевых клеток

В ходе исследования были поставлены следующие задачи

1 Изучение влияния уровня экспрессии ТЫРб на морфологические и функциональные особенности клеток линий карцином

2 Изучение морфологических и функциональных особенностей клеток линий карцином с измененным уровнем экспрессии ЫЬ

3 Анализ уровня экспрессии ЮЬ в опухолях различного гистогенеза, в частности при раке молочной железы

4 Выявление роли доменов белка ЫЬ при его взаимодействии с альфа-актинином, и их влияние на состояние актинового цитоскелета

5 Определение функционального мотива белка Я1Ц влияющего на стабильность белкаШЦ и исследование механизма его деградации

В методической части работы были поставлены задачи по оптимизации упаковки лентивирусных частиц для повышения эффективности транедукции экспрессионных кассет в клетки-мишени и по совершентствованию структуры РНК-шпильки для наиболее эффективной РНК-интерференции в рамках лентивирусной экспрессии

су 7

Научная новизиа и практическая ценность работы

Адапгорные белки играют центральную роль в сборке крупных сигнальных комплексов и таким образом регулируют адгезию, пролиферацию и трансформацию клеток В экспериментальной части диссертационной работы был проведен функциональный анализ адапторных белков TRIP6 и RIL Белок TRIP6 имеет в своем составе три LIM-домена, нами впервые показано, что подавление экспрессии его гена приводит к появлению стресс-фибрилл, перестройке фокальных контактов, потере Е-кадгерина и развитию фенотипа, сходного с эпителиально-мезенхимной трансформацией

Второму адапторному белку RIL посвящена основная часть работы, сконцентрированная на изучении функциональных особенностей его гена RIL кодирует PDZ-LIM-доменный белок, который участвует в реорганизации актинового цитоскелета В экспериментах по сверхэкспрессии RIL показано, что, с одной стороны, ускоряется пролиферация клеток и увеличивается скорость их миграции С другой стороны, происходит усиление адгезии клеток, что, по-видимому, повышает их зависимость от субстрата Изучены особенности экспрессии RIL в образцах злокачественных новообразований различного гистогенеза Установлено, что экспрессия RIL подавлена в значительной части проанализированных образцов рака молочной железы и линиях опухолевых клеток того же происхождения Выявлена корреляция между подавлением RIL, сохранением клетками эпителиальной морфологии и активацией сигнального каскада трансформирующего ростового фактора бета (TGFß) при раке молочной железы

RIL участвует в регуляции динамики актинового цитоскелета за счет стабилизации взаимодействия актина с а-актинином он влияет на процессы клеточной адгезии и миграции В работе исследована роль структурных доменов в составе RIL в реорганизации актинового цитоскелета Установлено, что в составе LIM-домена RIL имеется дополнительный участок связывания с а-актинипом, и именно LIM домен ответственен за заякориваше а-актинина-1 на актиновом цитоскелете, образование толстых актиновых фибрилл и повышение степени полимеризации актина в результате ингибирования его разборки

В диссертационной работе проведен детальный анализ аминокислотной последовательности измененного LIM-домена RIL, который позволил выявить в нем вариант PEST-мотива, описанный нами впервые Выполненные эксперименты убедительно показали, что соответствующие изоформы RIL весьма нестабильны и подвергаются деградации в протеасомах

Эффективное введение и стабильная экспрессия конструкций в клетках различного происхождения - один из важнейших методов молекулярной биологии и генетики, примененных в данной работе, и часто является лимитирующей стадией исследований В отличие от трансфекции, использование лентивируса позволяет заражать даже неделящиеся клетки и обеспечивает стабильную экспрессию конструкции В методической части представленной работы проведена оптимизация упаковки лентавирусных частиц Тестирование двух наборов вспомогательных плазмид и вариация их соотношений позволили повысить эффективный титр вируса в 20 раз по сравнению с методикой, использованной ранее

РНК-иетерференция, вызванная короткими шпилечными РНК (shPHK), является мощным инструментом для идентификации фенотипов, связанных с недостаточностью экспрессии индивидуальных генов Оптимальная структура РНК-шпильки важна для эффективного подавления гена-мишени и

минимизации неспецифических эффектов, особенно при низкой копийности экспрессионной кассеты в клетке В методической части диссертации было показано, что в контексте лентивирусной экспрессии наиболее эффективной является простая структура РНК-шпильки с 21-нуклеотидным стеблем

Полученные результаты обеспечивают широкий спекгр направлений для дальнейших научных исследований, а также для их практического применения В частности, уровни экспрессии TRIP6 и RIL могут рассматриваться как потециальные маркеры интенсивной прогрессии, имеющие прогностическую ценность, по меньшей мере при раке молочной железы Оптимальная структура РНК-шпильки для РНК-интерференции в сочетании с высокой эффективностью упаковки лентивирусных частиц может быть использована при разработке неранжированных shPHK-библиотек PEST-мотив альтернативных изоформ RIL может найти применение в генной инженерии при получении дестабилизированных белков, например, при создании высокочувствительных репортерных конструкций

Апробация диссертант

Материалы диссертации были доложены на 44-й ежегодной конференции Американского общества клеточной биологии (ASCB) (Вашингтон, декабрь 2004 г), специальной конференции по раковым исследованиям Американской ассоциации раковых исследований (AACR) «Advances m Breast Cancer Research Genetics, Biology and Clinical Applications» (JIa Хойя, сентябрь 2005 г), конференции молодых ученых (ИБХ РАН, Москва, февраль 2006 г), конференции Европейского общества генетики человека (Амстердам, май 2006 г ), VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю А Овчинникова, (ИБХ РАН, Москва, октябрь 2006 г) и на совместном научном коллоквиуме группы экспрессии белковых факторов роста и дифференцировки и группы трансгеноза в Институте биоорганической химии им М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН (Москва, декабрь 2006 г )

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 142. страницах машинописного текста, содержит рисунков и j[_ таблиц, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов Список литературы цитиругт ПI работу

Основное содержание работы 1 Оптимизация упаковки псевдовирусных частиц

Преимущество лентивирусной доставки генетического материала заключается в возможности заражения неделящихся клеток, что позволяет достигать трансдукпии 100% клеток Однако для достижения такого уровня требуется оптимизация основных этапов трансдукции Высокие титры лентивирусных препаратов позволяют избежать в ряде случаев процедуры концентрирования вирус-содержащей ростовой среды, а также работать со значительно разведенными супернатантами, что снижает неспецифические эффекты, связанные с действием токсических продуктов метаболизма клеток-продуцентов Получение высоких титров также сокращает материальные затраты при проведении экспериментов

Для оптимизации упаковки псевдовирусных частиц была использована лентивирусная конструкция pLU-CMV-EGFP, экспрессирующая зеленый флуоресцентный белок под контролем раннего промотора цитомегаловируса (CMV), и два варианта упаковочных плазмид, pCMVAR8 2, (от IМ Verma, The Salk Institute, Jla Хойя, США), или pGagl и pRev2, (от J G Sodroski, Dana Farber Cancer Institute, Бостон, США) Вирусные частицы псевдотипировали белком G оболочки вируса везикулярного стоматита с помощью конструкции pVSV-G Были протестированы различные соотношения плазмцц-упаковщиков Для оценки титра полученных псевдовирусных частиц клетки Н1299 заражали разведенными препаратами вируса и подсчитывали долю флюоресцентных клеток с помощью проточной цитометрии Было установлено, комплект плазмид pGagl и pRev2 обеспечивает более высокие титры по сравнению с pCMVARS 2 Наиболее эффективным было найдено соотношение плазмид pLU-GFP pGagl pRev2 pVSV-G = 1 2 4 1, что позволяет повысить титр вируса в 15-20 раз по сравнению с исходной методикой, основанной на равном соотношении плазмид. Именно такое соотношение плазмид-помощников было использовано в данной работе для упаковки лентивирусных конструкций

2 Оптимизация структуры РНК-шпильки для РНК-иитерфереиции

Эффективность подавления экспрессии РНК-мишени зависит не только от выбора специфического участка на этой мРНК, но и от эффективности узнавания shPHK процессируюшими ферментами, важную роль при этом может играть характер шпилечной структуры, которая соединяет комплементарные участки shPHK Мы протестировали четыре различных варианта дизайна шпилечных структур на основе трех 22-нуклеотидных последовательностей, гомологичных мРНК р53, в контексте лентивирусной системы доставки в клетки (рис Ja, б)

(l) "shPHK" - базовая конструкция для экспрессии шпильки с 22-нуклеотидным стеблем, (и) "миРНК" - к базовой шпильке добавлен короткий стебель с некомплементарными нуклеотидами, (ui)"mir-30 фланк" - к предыдущей структуре добавлены 50-нуклеотидные участки шпильки mir-30 человека, (iv) "U6 лидер" - к предыдущей структуре добавлена лидерная последовательность промотора U6

Для определения эффективности подавления р53 была использована репортерная линия HeLa LC5, в которой бета-галактозидаза синтезируется под контролем р53-регулируемого промотора Максимальное подавление р53 наблюдалось при использовании наиболее простого (базисного) варианта структуры РНК (шпилька с 22-нуклеотидным стеблем) (рис 1в) Анализ экспрессии р53 на уровне мРНК с помощью ОТ-ПЦР, а также относительного числа копий интегрированной ДНК провируса (методом ПЦР-амплификапии его сегмента WPRE с геномной ДНК трансдуцированных клеток) полностью подтвердил предыдущий результат (рис 1г) Интересно отметить, что эти конструкции подавляют экспрессию р53 более чем на 90%, даже несмотря на значительную вариацию числа интегрированных копий ДНК провируса

Таким образом, было установлено, что в контексте лентивирусной экспрессии наиболее эффективное подавление мРНК-мишени достигалось с помощью «классической» структуры РНК-шпильки, использованной для РНК-интерференции Именно такие шпильки, далее обозначающиеся как siPHK, будут использованы для подавления экспрессии генов RIL и TRIP6 в последующей части работы

RSV-5'LTR

ihPHK

iKKVNNNWHJVHN ' A

шаввиш^ jr.

миРЦК

Ik'Lit LC'S

mir-30 фмнк

О'

■JiPHE willlk [.^niijfji

H pi3

Ц WPRF

иблнцср

IW«r ГТУ-30 1Г К

Рис. 1. Оптимизация структуры РНК-шпильки, a - Карта вектора pSIH-Puro для экспрессии shPHK. б - Структура шпилек РНК, экспрессиругащихся с соответствующих конструкций. Черными стрелками показаны места расщеллеюя ферментам Dicer, серыми - Drosti а в -Эффективность подавления р53 с помощью различных РНК-шпилек в репортерньгх клеттах HeLa LC5. экспр&ссирующих ген р-галактгаидазы под контролем р53-регулируемого промотора. Уровень р-галактозздаэы в контрольных (необработанных) клетках принят за 100%. г - Анализ экспрессии р53 на уровне мРНК в тех же клетках методом ОТ-ПЦР. Копийность интегрированных конструкций оценивалась с помощью ПЦР-амплификзции участков WPRE на матрице геномной ДНК клеток,

3. Влияние шменення уровня экспрессии генов TRIP6 и RIL на морфологию и физиологию клеток карцином

Для изучения и уточнения функций генов TRIP6 и RJL сначала было решено исследовать влияние изменения их уровня экспрессии на степень распластанности клеток, образование межклеточных и фокальных контактов и скорость миграции клеток. Для траязиентной и стабильной гиперэкспрессии этих белков были созданы конструкции pLA-CMV-TR!P6 и pLA-CMV-R.IL на основе лентивируса. Для подавления экспрессии мРНК RIL и TRIP6 использовали феномен РНК-интерференции и создали конструкции pLSLPw-siTRTP6-l, pL-SLPw-siTR]P6-2. а также plSI.Pw-siRIL-1 и pLSLPw-siRIL-2. Эта плазмнды и контрольные конструкции pLSLPw (вектор) и pLSLPw-siE6 (siРНК к гену Е6„ отсутствующему в изучаемых клетках) были упакованы в ленти вирусные частицы и гран еду цированы г: клетки линии А431. Относительное количество мРНК генов TRIP6 и RIL определяли методом Нозерн-блот анализа (данные не приведены). Конструкция pLSLPw-siTRIP6-2 более эффективно подавляла экспрессию соответствующей мРНК, поэтому именно она использована в последующей работе, где будет называться siTRIP6. При тестарованин двух различных siRIL стало очевидно, что siRIL-l более эффективно подавляет мРНК соответствуют; го гена, поэтому для последующей работы была выбрана именно конструкция pLSLPw-siRIL-1. в

дальнейшем называемая 8Ж11_.

Для изучения эффектов подавления экспрессии Т/Ш'6 нами были получены стабильные клеточные линии с введенными эЛЩРб и з!Еб (в качестве контроля) на основе культур А549 (карцинома легкого) и Л431 (эпидермоидная карцинома) (рис.2).

При световой микроскопии клеточных культур А549 и А431 с подавленной при помощи 51 РНК экспрессией ТШР6 были обнаружены заметные изменения в морфологии этих клеток (рис. 26). Контрольные клетки А549-з1Е6 сохра!гяли межклеточные контакты, а также высокую степень рашластанностц, лискоидную или полигональную форму. Клетки А549 с введенной 5]ТК1Р6 приобрели веретенообразную или звездчатую форму, степень их рас пласта еш ости снизилась, появились протяженные стабильные участки края, что выражалось в увеличении соотношения квадрата периметра клеток к их площади (рие,2е). При подавлении ТК1Р6 многие клетки приобрели

siTRIPfi

Рис.2. Изменение морфологии клеток линии А549 на фоне подавления TRIP6 o помощью

siPHK. В клетки А431 (а) или А549 (б, в) вводили лентивирусный вектор pLSLPw, содержащий либо контрольную s¡E6, либо siPHK к TRIPS, а - Эффективность подавления экспрессии TRIP6 оцешвапи с помощью нозерн-блот гибрццгаации и вестерн-блот анализа. Также оценивали изменение уровня белка Е-кадгерина. 6 - изменение морфологии клеток А549 на фоне подавления TRIP6. Первый столбец - фазово-контрастная микроскопия: второй столбец -окраска полимерюованного зшна FITC-коньютрованным фаллоидином; третий столбец -детекция фокальных контактов антителами к лаксиллину; последний столбец - окраска межклеточных контактов антителам к Е-кадгерику. е - Соотношение квадрата периметра клеток к их площади, вналиэировали по 30 случайных клеток из контрольной и опытной групп с помощью программы Image Pro.

gapiïh

impû

Ь-кпдгешш

II!H

фибробластогюдобный поляризованный фенотип, характерный для Мигрирующих клеток с образованием ламеллоиодии на переднем крае и четко

различимыми телом и хвостом Такие изменения, происходящие параллельно с потерей эпителиальных маркеров, характерны для эпителиально-мезенхимальной транзиции Обращает на себя внимание большое количество взаимно-перекрещивающихся клеток, что может свидетельствовать о потере ими контактного торможения Подобные морфологические изменения наблюдались и в клетках культуры А431 с введенной siPHK к TRIP6

В основе поддержания и изменения формы клеток и их локомоции лежит цитоскелет Чтобы проследить изменения актинового цитоскелета при подавлении TRIP6 была проведена окраска клеток FITC-конъюгированным фаллоидином - алкалоидом, специфически связывающимся с полимеризованным актином (рис 26) В клетках А549 с введенным siTRIP6 обнаружено увеличение числа и длины стресс-фибрилл при их практически полном отсутствии в контроле (siE6) От развития тракций в актиновом цитоскелете зависит формирование фокальных контактов Для их выявления методом иммунофлюоресценции были использованы антитела к паксиллину В контроле (siE6) фокальные контакты равномерно распределялись по всему периметру клетки В клетках с подавленным TRJP6, наоборот, формировались крупные фокальные контакты, расположенные редко по периметру Уменьшение числа фокальных контактов, их реорганизация характерны для усиления злокачественности клеток карцином Другой признак такого усиления - потеря межклеточных контактов, что было выявлено при иммунофлюоресцентном окрашивании клеток с введенным siTRIP6 антителами, узнающими Е-кадгерин. Потеря клетками эпителиального маркера Е-кадгерина на фоне подавления TRIP6 была также подтверждена Вестерн-блот анализом (рис 2а)

Для изучения эффектов измененной экспрессии RIL были получены стабильные клеточные линии с введенными кДНК RIL и siRIL, а также pLA (пустой вектор) и siE6 в качестве контроля на основе культур клеток А549 (карцинома легкого) и А431 (эпидермоидная карцинома) При световой микроскопии этих клеток были обнаружены яркие изменения их фенотипа по отношению к контролям (рис За) Так, клетки, гиперэкспрессировавшие RIL, приобрели веретенообразную или звездчатую форму, напоминающую мезенхимальный миграторный фенотип, степень их распластаншсти снизилась Клетки, в которых экспрессия RIL была подавлена с помощью siPHK, наоборот, превратились в округлые и стали значительно более распластанными по сравнению с контролем (siE6)

Далее мы проанализировали экспрессию эпителиального маркера Е-кадгериш в клетках с измененной экспрессией RIL методом непрямой иммунофлюоресценции Подавление RIL с помощью siPHK повышало интенсивность окрашивания в области межклеточных контактов, в то время как клетки, гиперэкспрессировавшие RIL (слитый с эпитопом Flag), теряли межклеточные контакты, что говорит о повышении степени злокачественности клеток (рис 36)

Появление локомоторного фенотипа, реорганизация актинового цитоскелета и фокальных контактов у клеток с подавленной экспрессией TRIP6 и изменения фенотипа у клеток с измененной экспрессией RIL позволили предположить, что такие морфофизиологические изменения могут повлиять на способность клеток к миграции В качестве модели использовали клетки А549 в связи с их высокой способностью к миграции С помощью пластиковой микропипетки наносилась линейная «рана» на монослой клеток, затягивание

Рие.З. Изменение морфологии клеток линии А549 на фоне измененной экспрессии RIL. В

клетки вводили RIL (а) пни FlagRIL (б] или подавляли экспрессию эрогенного RIL с помощью siPHK. Для контроле вводили пустой вектор и контрольную siPHK к гену Е6 вируса папилломы человека, а - Фазово-контрастная микроскопия. 6 - Клетки с указанными конструкциями выращивали на покровных стекпак до плотности 70% от монослоя, а затем фиксировали и флюоресцентно окрашивали антителами, узнающими 6-кадгерин и Fiag. Отчетливо видно, что клетка, экспрессирующэя FlagRIL, не образует межклеточных контактов.

которой за счет миграции клеток регистрировали спустя 20 часов.

Клетки А549 с введенным 51ТК1Рб мигрировали в «рану» вдвое быстрее, чем контрольные (рис.4л), ¡Слетки, гиперэкспрессировавшие ШЦ также затягивали рану значительно бысгрее контрольных; подавление »се /о';., наоборот, приводило к значительному снижению скорости миграции (рис. 46).

. I

1>' К Т МП siT.f, Jill, siKIl,

■ ^ в?-' и %' 1 й 1 я ш ■ I 1

: ■ -щ -■-•да -Л ■ S О' ■ ]

Рис.4. Миграция клеток А549 в эксперименте по заживлению краны». На монослои клеток, экспрессирующих зИЗДА к Е6 или ТЯ1Р6 (а) или пустой вектор, $1Е6, Ш!. или (5), с помощью пластиковой микропипетки наносили ринейную краиуи, затягивание которой за счет миграции клеток регистрировали спустя 20 ч. Представлены гистограммы нормализованной по контролю (з^А к Е6 (а) или пустой вектор (6}) миграции ± стенд, откп. Обобщены данные двух независимых экспер и ментов, каждый - в трех повторах. Нижняя панель - типичный вид «раны» в момент начала эксперимента (0 ч., верхний ряд) и через 20 ч. [нижний ряд); фазово-конгрзстная микросколия.

Феномены изменения морфологии и скорости миграции клеток на фоне измененных уровней экспрессии ТШРб и ШЬ говорят о связи экспрессии этих белков с динамикой актинового цитоскелета и модуляции ассоциированных с ним сигнальных каскадов, которые могут влиять и на скорость пролиферации клеток Для проверки этого предположения клетки линий А549 и Н1299 с введенными ТЫР6, эгЛИРб, МЬ, бтЯП, а также пустым вектором и 51Е6 для контроля высевали на 12-луночные планшеты по 1 5x104 клеток на лунку в двух повторах, а затем их количество каждый день дважды считали в камере Горяева.

По результатам предыдущих опытов клетки с подавленным ТШРб проявили себя как претерпевшие эпителиально-мезенхимальную трансформацию (ЭМТ) по сравнению с контролем (фибробластоидная морфология, перестройка актинового цитоскелета, потеря межклеточных контактов и увеличение скорости миграции) Ожидалось, что и в этом эксперименте эти клетки поведут себя как более злокачественные В данном эксперименте скорость пролиферации на фоне подавления ТШРб была незначительно ниже контроля, в то время как именно гиперэкспрессия ТШРб приводила к заметному ускорению деления (рис 5а) При гиперэкспрессии ШЬ, наоборот, степень злокачественности клеток повышалась Об этом свидетельствовали мезенхимо-подобный фенотип этих клеток и увеличение скорости их миграции Скорость деления этих клеток также была достоверно выше, чем в контроле У клеток же с подавленным ШЬ, наоборот, скорость роста (как и миграции в предыдущем эксперименте) значительно падала (рис 56) Аналогичный эксперимент с использованием линии клеток Н1299 подтвердил полученные результаты

Рис 5 Влияние 7Я/Р6 и КЯ. на скорость пролиферации клеток В клетки А549 транслировали ТИР6 и эГТгаРб (а) или и (б), для контроля использовали клетки, ин-фицированнье пустым

де«,0 д»*1 де«.2 Д***. 3 дм* 4 Д9»*0 де*. 1 дв«,2 Де*ь 3 дел 4 ВбКТОрОМ ИЛИ Б|Е6 РЭВНЫб

количества клеток высевали на 12-луночные планшеты в двух повторах и каждый день считали Эксперимент повторяли дважды На графиках отражено увеличение числа клеток по отношению к 0 дню Количество клеток каждого образца в 0 день принято за единицу

Следующим шагом в изучении функции TRIP6 был анализ влияния его измененной экспрессии на клоногенную экспансию в условиях отсутствия прикрепления к субстрату - важную особенность трансформированных клеток, необходимую для успешного метастазирования Действительно, на фоне siTRIPô клетки линии H1299 образовывали почти вдвое больше колоний в полужидкой среде по сравнению с контролем, а гиперэкспрессия TRIP6, наоборот, приводила к двукратному подавлению роста в условиях анойкиса (данные не приведены)

Аналогичный эксперимент для изучения роли RIL в этой модели метастазирсвания показал, что гиперэкспрессия RIL не привела к увеличению числа колоний, хотя они и были более крупными по сравнению с контролем На фоне же siRIL колонии были многочисленными, хотя и мелкими (данные не показаны) Другими словами, повышение экспрессии RIL не приводит к

независимости от субстрата - особенности высокометастагических клеточных культур. Для того, чтобы напрямую проверить это предположение, мы проанализировали влияние гиперэкспрессии RIL на способность клеток к прикреплению к различным субстратам.

Для оценки способности клеток к прикреплению были выбраны клеточные линии эпителиального (293Т} и неэпителиального (U20S) происхождений, чтобы подтвердить универсальность наблюдаемых эффектов. С помощью прямой трансфекции в клетки вводили RIL и пустой вектор для контроля и оценивали адгезию к различным субстратам (фибриноген, фибронектин, культуральный пластик) (рис.6). Было убедительно показано, что повышение экспрессии R1L достоверно усиливает адгезию клеток вне зависимости от их происхождения.

N •• _ „ е

3(Хг ич:|«щ >.I"р - -О

Ï : sa . Kg . |..öa . »«*>»;.......„..........

g ""it 1 §г<Ю [рви 1 _

Г a fl Г" , I.....

I: 1 J 1 i::ill............il

■ ЯН .......e....... - »......

Рис.6. Гиперэкспрессия RIL усиливает адгезию клеток мезенхимзльного и эпителиального происхождения, В клетки линий U20S {а,6] и 293Т (в) трансакцией вводили R1L и пустой вектор в качестве контроля, а затем высаживали на планшеты, при необходимости предварительно покрытые фиброндаином или фибриногеном. а.в - Гистограммы нормализованной по контролю [пустой вектор) адгезии клеток. б - Фазово-контрэстная микроскопия клеток U20S, прикрепившихся к субстрату (фибриногену). Эксперименты проводили в трех повтора* как минимум дважды.

Эти результаты полиостью согласуются с данными о другом белке подсемейства ALP Mystique. Подобно RH, в нашей работе. Mystique усиливает аягезию клеток, делая их более зависимыми от субстрата, что в конечном итоге ведет к ннгнбнровапню роста клеток а условиях анойкиса. Таким образом, возможная роль RIL в процессе злокачественной трансформации остается неясной и будет уточнена в следующей части работы.

4. Возможная роль RIL при раке .молочной железы

Состояние цитоскелета сопряжено с функционированием ряда сигнальных путей и влияет на процессы деления клеток и их злокачественную трансформацию. В этом свете представляет интерес уточнение потенциальной роли RÎL в канцерогенезе.

Впервые RJL был охарактеризован как ген, экспрессия была подавлена в фибробластах крысы, трансформированных Rax или Raf, и восстанавливалась в фенотипических ревертантах, Есть сообщение о подавлении экспрессии RIL в 90% проанализированных биопсий рака простаты за счет аберрантного гиперметипировання промоториой области. Такое «поведение» позволило отнести RIL к потенциальным опухолевым супреесорам, С другой стороны, па модели куриных фибробластов, трансформированных V'Jun, экспрессия RIL не только повышалась, но и напрямую коррелировала со степенью

злокачественности клеток, т.е. RIL проявлял себя как потенциальный онкоген

Для определения возможной роли RIL в злокачественной трансформации проведен анализ Экспрессии его МРНК в образцах злокачественных новообразований из разных органов по сравнению с окружающей нормальной тканью методом Нозерн-гибридизации с Cancer Profiling Array 1 (BD Clontech) (241 пара образцов «опухоль/норма» из S тканей человека). Было обнаружено, что уровень экспрессии RH был подавлен в 2 и более раз в 43% (23 из 53) образцов злокачественных опухолей молочной железы. Тенденция к снижению экспрессии мРНК RIL была также отмечена для опухолей яичника (38%, 6 из 16 пар образцов), почки (35%, 7 из 20 пар) и легкого (29%, 6 из 21) (рис.7)

Tlí.v мы

и;;м| ел кщщрчиа!

¿müv ::*• . _ .

желета й tUi*' *

куаМая ^ it» , , 1ЖМ

пппкл н шка

почка у и- *í .::rt :

MKOí ¡J

jíirnnn: i»« ' Л ■ -IS* »ltin.il

млтиг

м^да и

ЛЧфЧИМ й МВШЛ а ; rtssrr "f. Г?':'

шпеэ ® ЫГ.ЦЯ ti * 1Л ♦ rtmi

¡мслечнад и * -H« » • ii* * *»

: iíWu (i

отжпиинич Корча' Опухоль

Ш »хк?«ая >вг ьгзэ □ wares »tire

s жч1/дсг

siw« в фямм ччша s щетоыщ желе»

Рис.7. Экспрессия мРНК RIL в человеческих опухолях различного происхождения по сравнению с нормальными тканями. Нозерн-анализ образцов тотальной РНК, представленных на миироланели Cancer Profiling Array I {BD Ctontech), с помощью RfL-специфического зонда. Все з.начен/я нориапиюваны по мРНК GAPDH. а - Вид ауторадиограииы ишропамепи (0 - образен тотальной РНК из опухоли; Н - из окружающей морфологически нормальной ткани от того же пациента). 6-Доля пэр «норма:опухолы>, в которых экспрессия мРНК RIL в опухоли подавлена в 2 и более раз (НТО > 2), не изменена (0.5 < НЮ < 2) или повышена в 2 и более раз (HJO < 0.5) Пунктиром выделена область ауторадиограммы блота (а) и столбчатой диаграммы (б), соответствующие парам «норма:опухоль» из молочной железы.

Для независимого подтверждения этих данных был проанализирован уровень RIL в панели из 8 линий клеток карцином молочной железы человека. В четырех случаях из 8 экспрессия R1L оказалась ниже уровня детекции, в остальных 4 клеточных линиях уровень R1L был сравним с контролем (рис. 8 а, б).

Сопоставление статуса R1L с морфологией клегок позволило показать, что высокий уровень экспрессии RJL коррелирует с повышенной агрессивностью культур рака молочной железы MDA-MB-231, -435S, -436 и ВТ-474 (рис.8в). Клетки этих линий характеризуются звездчатой или веретенообразной формой, слабой степенью адгезии и рас пластан н ости, высокой скоростью роста и видимым отсутствием межклеточных контактов. Малоагресспвные клеточные линии MCF-7, ВТ-20. T-47D и MDA-MB-468 с недстектируемым уровнем RIL, наоборот, сохраняют эпителиальную морфологию и межклеточные контакты. Анализ экспрессии эпителиального

маркера Ё-надгерина подтвердил эффекты, наблюдаемые на уровне клеточной морфологии Клетки линий МОЛ-МВ-231, -4358, -436 и В~-474 не экспресс и ру ют Е-кадгерин (методами и м мувоблоттинга и ОТ-ПЦР) и не имеют межклеточных контактов (непрямая иммунофлюоресценция, дан[|ыс не приведены), т.е. подверглись эпителиально-мезенхим ной трансформации, которая является необходимым условием высокой степени агрессивности эпителиальных опухолей Линии МСР-7, ВТ-20, Т-47Л и МГЗА-МВ-468, наоборот, сохраняли высокие уровни Е-кадгерина, межклеточные контакты и эпителиальный фенотип (рис.8). Тем не менее, ни эктопическая экспрессия Ь н малоагрессивных культурах клеток рака молочной -железы, ни подавление его экспрессии в высоко агрессивных линиях с помощью коротких Интерферирующих РНК не привела к реверсии фенотипов или изменению статуса Е-кадгерина (данные не приведены). На этом основании была выдвинута гипотеза, что обратная корреляция между экспрессной этих двух белков - следствие их коре гулянии одним сигнальным каскадом, на поиск которою были нацелены последующие эксперименты.

i -

■

; ^ т i

........ ...::, ......\

---1

б.

= ^ 3 R ? S о 3 g

? 3 с

¡1 3 § ? Sft g Ч т

о Tut,« si с

iSsis«^ а 5 £ < "f < Am

RIL

Екядг*Р*в SI«i

PPIA

ОТ-ПЦР

■ :, ---_]

- !

i HIL

| Е-юдгеркн

[ TCF-pl фос£х> Silimj2

(s.r4i5'45?l р-аЕТИН

9k ч fi T т i1* £ £ T

Вестерн-

is % i I ' -i анмиз

k § a 3 §

([сркичняч культура

эпшадия молочной железы

MDA-MB-Ш MDA-MB-435S MD A-MEM 36 ВТ-4 74

mm L' MM

|У H шшЧА A Г' " ' ' ' ■ IS /-TN. v ■ — ;

___M CFJ______В_Т-_20_____T-47D____MDA-MEM6S_>

Рис.8, Экспрессия R1L и особенности морфогогии и ситнальных каскадов пииий шатен рака молочной железы человек, а-Экспрессия mPHKRIL, Е-кадгерина и Slug по,сани,1м ОТ-ПЦР. 6 - Веетерн-блот анализ экспрессии белков RIL, Е-кадгерина, трансформирующего фактора роста 5ета (TGFp) и активированного Smad2. в - Морфология клеток использованных |^льтур опухолей молочной железы и первичного эпителия. Световая микроскопия. Черной рамкой обозначены культуры клеток с высокой экспрессией RIL, серым пунктиром -линии, где экспрессия RIL недетектт^уема.

Известно, что экспрессия Е-кадгерина регулируется па уровне транскрипции трсми бепками-репрессорамк Snail, Slug и Twist, которые в свою очередь являются компонентами TGFfi/R.-, NFkB-, ERK- или р-катсиш-зависимых сигнальных путей. Ныла выявлена корреляция экспрессии RIL и

транскрипционного репрессора Slug, обратно коррелировавшие с уровнем мРНК Е-кадгерина (рис 8а) (данные для Snail и Twist не приведены), причем эти события не зависели ни от NFkB, ни от ERK, ни от ß-катенинового каскадов (данные не показаны) При иммуноблот-анализе в тотальных белковых экстрактах малоагрессивных клеточных линий рака молочной железы была детектирована процессированная форма TGFßl, выполняющего в нормальных условиях функцию сигнала к дифференцировке Связывание

трансформирующего фактора ß со своим рецептором приводит к фосфорилированию, гетеродимеризации и транспорту в ядро белка Smad2, транскрипционного фактора, ответственного за активацию генов-мишеней сигнального каскада TGFß Выявление фосфоршшрованной формы Smad2 подтвердило факт активации TGFß в этих клетках (рис 86) При этом тотальные количества Smad2 во всех исследованных клетках были сравнимыми (данные не показаны)

Таким образом, наблюдается тенденция к подавлению экспрессии RIL в злокачественных новообразованиях молочной железы и опухолевых клеточных линиях того же происхождения, что сопровождается активацией сигнального каскада, инициируемого TGFßl, и сохраненной экспрессией эпителиального маркера Е-кадгерина Известно, что сверхэкспрессия близкородственного белка Mystique увеличивает зависимость клеток от субстрата RIL может иметь аналогичный эффект, а его выключение способствовать независимости клеток от прикрепления и более эффективному метастазированию При снятии проблемы зависимости от адгезии с помощью какого-либо другого механизма может происходить отбор клеток с повышенной экспрессией RIL, что будет способствовать усилению их миграции и пролиферации, повышая агрессивность опухоли

5 Роль альтернативных изоформ RIL в реорганизации актинового цитоскелета

Альтернативно сплайсированные варианты RIL были впервые описаны Башировой с соавт полноразмерный транскрипг RIL (все 7 экзонов), транскрипт II (altCterm), где LIM домен заменен коротким альтернативным пептидом, транскрипт III (APDZ) с ущербным PDZ-доменом и транскрипт IV (APDZaltCterm), который представляет собой комбинацию двух предыдущих вариантов На сегодняшний день функция альтернативно-сплайсированных форм RIL остается неясной

Известно, что PDZ-домен ALP-подобных белков взаимодействует с а-актининами - структурными белками актиновых фибрилл Для изучения роли различных доменов белка RIL при его взаимодействии с а-актинином-1 были получены конструкции для экспрессии различных изоформ RIL, слитых с эпитопами Flag, НА или зеленым флуоресцентным белком GFP Также получен контрольный делеционный мутант с удаленными 6 и 7 экзонами, кодирующими LIM-домен Экзогенно-введенный а-актинин-1, меченый Flag, был коиммунопреципитирован с изоформами RIL, слитыми с эпитопом НА В этом эксперименте с а-актинином-1 коиммунопреципитировались не только варианты RIL, имеющие PDZ домен (изоформы I, II и делеционный мутант), но и изоформа III - вариант с отсутствующим PDZ доменом, но сохранным LIM (рис 9а) Эти результаты были полностью подтверждены реципрокной ко-иммунопреципитацией эндогенного а-актинина с изоформами RIL, меченными Flag (рис 96)

Эти данные могут быть интерпретированы следующим образом. 1 RIL и а-акгннин in vivo могут образовывать тройственный комплекс с неизвестным^) белком(ами), для образования которого необходим LIM-домен R!L 2. RÍL может иметь альтернативный сайт взаимодействия с а-актинииом. В пользу последнего варианта говорит недавняя идентификация у родственного белка ALI1 так называемого ZAS Р-подобно го мотива, связывающего и-актинин и отличного от PDZ-домена.

J íáis i

яргкмзгнтит

---- - -

•

Flii(

ET: Яле (и вктниинИ

IP: Пну СяюфарммКН,}

Рис.9. RIL взаимодействует с а-актинином-1 как своим PD2-, так и LIM-домен ом. а - В клетки линии 293Ттрансфецировали конструкции, экспрессировавшие Flag-a-aHHKHn-1 v изоформы RIL, слитые о эпитопом НА. репрессировали 24 час,, з затем клетки лизировали и Еыделенные белки иммунопреципитировали за Flag-эпитоп. Для иммуноблот-анализэ брали 1/203 лизитов и 1/4 преципитатов. Также был проведен контрольный эксперимент, чтобы убедиться, что изофер-мы RIL, меченные НА, не имеют неспецифического взаимодействий с М2-анто-Р1ад-агарозой, использованной для преципитации (данные не приведены), б- В клетки 293Т прямой трансфертен вводили указанные изоформы RIL, слитъе с эпитопом Flag, и проводили иммунспреципита-циго, как в предыдущем эксперименте.

Следующим шагом была проанализирована субклеточная локализация изо форм R1L но отношению к эндогенному а-актинину (рис.10) и полимеризованпому актину (данные не представлены) в клетках U20S. Полноразмерный RIL ко лежал ¡повал с я как с акгиновымн волокнами, так и с а-актинином. вызывая образование толстых фибрилл или актиновых агрегатов (рис!05). Этот эффект значительно усиливался в случае с вариантом Ш (делегирован PDZ-домен, LIM-домеи интактный); происходило разрушедае; актинового цнтоскелета, актин и а-актинин окрашивались в виде крупных глыбок, вкрапленных в днффузно распределенный RIL (рис. 1(1?). Варианты RIL без LIM домена вне зависимости от наличия или отсутствия PDZ домена локализовались преимущественно днффузно в цитоплазме или в ви;;с тонкой паутины, не вызывая значитсльньк изменений ци гоархнтектуры (рнсЮзДе),

Таким образом, интактный I.1M домен необходим для колокализации RIL с а-актиннном и вызывает существенные перестройки актинового цитоскелета а-Актшшны являются основными белками, образующими поперечные сшивки актиновых волокон. Анализ распределення а-акгинина между свободной и актин-связанной формами дает важную информацию о состоянии актинового цнтоскелета в клетке, его стабильности и степени полимсризоваиности Ранее было показано, что RIL усиливает взаимодействие а-актинина с полимеризованпым актином. Следовательно, наличие и состояние

будут во многом определять взаимоотношения а-акта и ни а с цитоске летом. Роль отдельных доменов в этих процессах до последнего времени оставалась неизученной.

«ummul (uff-kil ,-«№ijl í'jltkll . uh'-iul

__.>rtt Ifta i____'.I ГI i 7,\i

GFi>

м Щ 11! щ О i®

Рис, 10. Изучение локализации RIL и а-актинина в клетке. В клетки U20S прямой трансакцией вводили пустой вектор (а) или изофермы RIL, слитые с GFP для упрощения визуализации (верхний ряд): полноразмерный RIL (б). RILaltCterm (изоформа II, в), RILAPDZ (изоформа III, г), RILÜPDZaItCterm (изоформа IV, ö) или RILALIM(¿6-7) (контрольный делеционный мутант, е). Клеш рассаживали на покровные стекла, давали распластаться а течете ночи, фиксировали холодным метанолом и проводили окраску антителами к а-актинину-1 (нижний рад). Б качестве вторичных антител использовали антитела к мышиным иммуноглобулинам, меченные TRITC.

Анализ распределения изоформ RIL и а-актинина между детергент-нерастворимой (ядра, мембраны и цнтоскелст) и детергент-растворимой (цитозоль) фракциями (рис.1 is, необработанные клетки) полностью подтвердил данные, полученные с помощью непрямой флюоресценции. Полноразмерный RfL относительно равномерно распределялся между цитоскелет-ассоцииро ванной и цито зольной фракциями (дорожки 2 и 9), однако он вызывал перераспределение а-актинина в сторону актин-связанного состояния (ср. дорожки 7 и 8). Изоформа R1L с отсутствующим PDZ-, но интактным L1M-доменом тоже детектировалась как в растворимой, так и нерастворимой фракциях, однако наблюдался значительный сдвиг в сторону связывания с цитоскелетом (ср. дорожки 4 и 10), По всей видимости, именно этим объясняется значительная перестройка актина с тенденцией к аггрегаши и коллапсу в таких клетках (см. рис. 1 fe). Варианты RJL, не имеющие LIM-домена, локализуются в щггозоле и на состояние а-актинина значительного влияния не оказывают (см. дорожки 3 н 9, 5 и 11, б и 12), что согласуется с данными непрямой и ммун о флюоресценции (pnclOe.ó.e). Таким образом, именно интактный 1ЛМ-домсп RIL ответственен за рекрутировапне а-актинина на актиновый цитоскелет.

Перераспределение а-актинина-1, белка, обеспечивающего стабильность актиновых волокон, из цитозольной в цитоскслет-евязанную форму может приводить к сдвш-у баланса между полимеризованным и деполимеризованным актином. Анализ соотношения фибриллярного и глобулярного актина в детер rei it-раствор и мой н нерастворимой фракциях значительных сдвигов не выявил в связи с недостаточной чувствительностью метода. Альтернативным более чувствительным методом является конфокальная микроскопия. Клетки U20S с введенными изоформами RIL, слитыми с Rag, параллельно окрашивали фаллоидином Ййехиометрическн взаимодействует с фибриллярным (Ф) актином) и ДНКазой I (стехи о метрически связывает глобулярный (Г) актин-мономер), Клетки, экспресс!фучощне введенные конструкции, выявляли окраской на Flag О соотношении Ф и Г актнна в клетках судили по

интсгративной интенсивности сигналов от фаллоидина и ДНК азы I, э кс пери ментальные (трансфецировашшс вариантами RJL) клетки сравнивали в контрольными (неэкспрессирующимн) в том же поле зрения (рис.11а). ¡3 соответствии с предыдущими результатами, изоформы RIL с интактиым LIM-доменом приводили к накоплению поли мери зо ванного актина, о чем судили по увеличению Ф/Г- соотношения, другие варианты R.1L, где L1M домен отсутствовал, на степень полимеризации актина не влияли (рис.116).

а Bt*Tft( ПцйЛ. Fh^RlL *ИС«гЛП__ FIBRIL iFD Ъ FlacRIL üFOZiUiCtenn гщщь йЫМ(Лб-7<х)

Ф%ГГМН<Л>И щ N * hw / Щ&- щ • У

ДККШЯ I га в % ■щ 1 ; ф * .1

i-tSt

.. LÄ^-.JBäL.^JBiL, / &

4? IT ..

+ * v

■ TU

Ь I Z I | I 5

Hi? i 5 S ;

Hl III Sil!i!

— t-

ИГОбрДбйТ.

-» mm — — * w л IL-IHHKII

иршдаа^й ^ мъ'гнн

Рис.11.

UM домен RIL отвечает за повышение степени полимеризации актина. а,6 - В клетки линии U20S прямой трансфекцией вводили изоформы RIL, меченные эпитопом Flag, и экспрессировали в течение 24 ч. Клетки фиксировали в цитоске-лет-сохранжщем буфере к окрашивали одновременно FITC-коньюшро-ваиным фалпоиденэи, ДНКажл I. меченой флуорохромом AlexaFluor 594 и знти-F lag-энтител амл; в качестве вторичных использовали антитела к иммуноглобулинам кролика, меченгые AlexaFluor 350. Оптические срезы делали через 0.5 мкм через всю толщину клеток и интегрировали. О соотношении фибриллярного (Ф) и глобулярного (Г) актина в клетках судили по интенсивности свечения фаллоидина и ДНКээы I. соответственно, а - Общий вид окрашенных клеток. Клетки с введенным* изоформами RIL показаны стрелками, б - Относительное соотношение Ф и Г актина в исследованных клетках. В качестве стандарта использовали нетрансфецированные клетки в том же поле зрения. Анализировали не менег 10 пар экспрессирующге* и контрольных клеток. Ф/Г-соотношекие в контрольных клетках принята за 1, результаты представлены в виде среднего ± доверительный интервал, е - В клетки линии 293Т прямой трансфекцией вводили изоформы RIL, меченные эпитопом Flag, При необходимости клетки обрабатывали латрункулином А (500 нМ, 15 мин) или иртохзпааином Б (2 миМ, 30 кик) и лизировапи и буфере с детергентом Triton Х-100 в концентрации 0.5%, нерастворимую фракцию лизировали 2% SDS. Анализировали уровни RIL (антителами к Flag}, о-акгинина и актина методом Вестерн-блот анализа.

В клетке актиновыс волокна претерпевают постоянную сборку с одного конца и разборку с другого Бадане этих двук процессов позволяет поддерживать постоянную длину фибрилл, а также обеспечивает транспорт

многих актин-связанных белков, заякоренных на актине сигнальных комплексов и органелл Сдвиг баланса в сторону полимеризованпого актина под действием ШЬ может происходить либо за счет ускорения сборки фибрилл, либо за счет ингибирования их разборки Чтобы различить эти два процесса, клетки с различными изоформами ШЬ были обработаны латрункулином А (секвестрирует актин-мономер, тем самым блокируя сборку) или цитохалазином Б (имеет сложный механизм действия, в основном расщепляет актиновые волокна, способствуя их деполимеризации), после чего подвергнуты фракционированию, как описано выше (рис 1 Ов) Изоформы ШЬ с сохранным иМ-доменом приводили к накоплению в детергент-нерастворимой (т е цитоскелет-связанной) фракции как а-актинина, так и актина (рис 10«, ср дорожки 1 и 3, 5 в обработанных клетках), что говорит в пользу подавления деполимеризации актина В то же время, изоформы ШЬ, в которых 1ЛМ-домен отсутствовал, к значительным сдвигам не приводили Эти результаты были подтверждены иммунофлюоресценцией (данные не показаны)

Таким образом, взаимодейсвие 1ЛМ-домена ШЬ с а-актинином является функционально-значимым и ответственно за их колокализацию и перераспределение обоих белков на актиновый цитоскелет, а также повышение степени полимеризации актина в клетке за счет ингибирования его разборки

В таблице 1 просуммированы роли изоформ ШЬ и доменов в составе ШЬ в реорганизации актинового цитоскелета

Таблица 1 Роль изоформ RIL и доменов в составе RIL в организации ашнового цитоскелета

Эксперимент Ва рианты RIL Комментарии

полно-размер altCter APDZ APDZ altCter ALIM

взаимодействие с а-актинином ++ +++ + - +++ PDZ связ сильно LIM - слабо

кол окал изация с а-актинином + - + - - необходим LIM домен

перераспределение а-актинина на актинов цитоскелет + - + - - необходим LIM домен

соотношение Фибр/Глоб актина т = Т = = LIM повыш степень полимериз актина

де полимеризация актина блокир = блокир = = LIM блокирует деполимер актина

6 Пептид С-конца альтернативных форм RIL является сигналом протеасомнон деградации

Прямая трансфекция плазмид в клетки обеспечивает настолько высокие уровни экспрессии экзогенно-введенных конструкций, что клетки оказываются перегруженными синтезированными с них белками Лентивирусная трансдукция, наоборот, обеспечивает относительно физиологический уровень экспрессии трансгена При такой трансдукции две изоформы RIL (варианты II и IV, имеющие альтернативный С-концевой пептид) не детектировались ни иммуноблотгингом (рис 12а), ни непрямой иммунофлюоресценцией (данные не показаны), хотя экспрессия их мРНК значительно не различалась (рис 126) Было сделано предположение, что альтернативный карбокси-концевой пептид RIL-изоформ II и IV содержит дестабилизирующий сигнал Для проверки этой

гипотезы методом генной инженерии была получена конструкция для экспрессии БОИ1, слитого с С-концевым участком дестабилизированных изоформ Fi.IL Такая модификация ЕСГР значительно снизила интенсивность флюоресценции, его количество в клетке и время полужизни При неизменном уровне мРНК (рис.13й-г).

[i'.< J . р h . Г

ь d d

з ч § Я

11 !

Ses

и >t -î

& d = с d

от-ni it i i i i i j

Рис.12. Выявление коротко* и вущих форм RIL, Клетки А549 транслировали указанными конструкциями и инкубировали а течение 43 ч а - количества белка разпкнных иаоформ RJU, слитых с Flag, анализировали методом иммуноблоттинга в тотальных лизатах. б - Количества мРНК раымчных сглайс-изоформРИ (ОТ-ПЦР).

от-лгнг f /¿р.

[{.. . rV4 ..*п :,

-— l-dtt

Рис.13- Альтернативный С-концевой пептид RIL дестабилизирует гетерологичные белки, а-г - В клетки А549 транслировали просто EGFP, EGFP-RILaltCterm и пустой еектср. а-уровень мРНК анализировали ОТ-ПЦР. б " " .! 1 ' - количества белков оценивали методом иммуноблоттинга;

использовали антитела, специфичные GFP. е - флюоресцентная микроскопия клеток экспрессирующих просто EGFP или EGFP-RILaltCterm. г - время полужизни белков EGFP и EGFP-RILaltCterm. Транслированные клетки высевали на 12-луночные планшеты и обрабатывали цикпогексимидом а концентрации ! ми)мл в течение указанного времени: необработанные клетки (0 ч) использовали в качестве контроля. Количества исследуемых белков определяли методом Вестерн-блоттикга с антителами, уэнающищ GFP. д,е - В клетки Н1299 прямой траисфекцией вводили конструкции Luc-stop, Luc-RILaltCterm и Luc-RIL-СИ ke д -Активность люцифераэы анализировали через 24 ч. е - Клетки обрабатывали цикпогексимидом (2 мкг/ил) и лиэировали через обозначенные промежутки времени. О количестве люцифераэы судили по ее ферментативной активности. Эксперименты повторили дважды а трех повторах.

Аналогичный эксперимент был проведен с модификацией люциферазы. В конструкцию, кодирующую яюциферазу (Luc-stop), на 3'-конце от ее ОРС в той же рамке клонировали исследуемый участок RIL (Luc-RILaltCterm), или тот же участок со сдвигом рамки считывания (Luc-RlL-CIikc). Контрольная последовательность (Luc-RIL-Clike) на стабильность люциферазы значительно не влияла, тогда как альтернативный С-концевой пептид RJL (Luc-RILaltCteim)

снижал уровень хемилтоминесненции более, чем в 100 раз, а время полужизни фермента н 10 раз (рис. 13d.e). Таким образом, альтернативный С-терминальный пептид RJL оказался дестабилизирующим сигналом.

Известно, что многие низкостабильные белки содержат так называемый TEST-мотив, который при экспонировании узнается ЕЭгубиквитин-лигазами, что приводит к деградации белка в протеаеоыах. Ранее мы установили, что альтернативиьй С-терминалышй пептид RIL способен дестабшшзирсвшъ белки. Анализ аминокислотного состава этого пептида полностью соответствовал всем отличительным характеристикам PEST-мотива (рис, 14а). Обработка клеток ингибитором протсасом MG-I32 привела к накоплению нестабильных изоформ RIL (рис. 146. ср, дорожки 3 и 9, 5 и 11), подтвердив таким образом, что альтернативный С-концевой пептид RIL вызывает протеасомную деградацию белка

... М L Е А <9 Е <$ Olf S R II G (ÍX|)@(T) I А (?) С А V (?) А А-СООН

i 3 У * 5 6 7 5 9 10 II 13

£ 5

' \ т Я> ! - а

С í í ? 5 а с 5

„ - 3 I 3 1 # й S | g I

i I!SISfililí

■гцрртропиь« м;; M;

последовательность карбокси-концееого участка дестабилизированных изоформ RIL. Овалами выделены йминонлепоты, характерные для PEST-WiTwana; фпгнкируюи^е ашгадкислотысбсзна-чены курсивом; аминокислоты, которые также могут принимать участие в формировании сигнала, подчеркнуты, б - В клетки линии А549 были транедуцированы указанные иэоформы RIL, меченое Flag. Клетки обрабатывали ингибитором протеасом MG-132 (10 мкМ} в течение 4 ч., затем лиэировали и количества изоформ RIL анализировали методом иммунэблоттинга, исгопь-зовали антитела к эпитогту Flag.

Таким образом, было убедительно продемонстрировано, что две изоформы RIL дестабилизированы за счет имеющегося у ним PEST-мотива, вызывающего деградацию в протеасомах.

Выводы

1 Подавление экспрессии гена TRIP6 в линиях клеток карцивои приводит к реорганизации актинового цитоскелета и другим морфологическим и функциональным сдвигам, характерным для эпителиально-мезенхимальной транзиции.

2. Повышенная экспрессия RIL в линиях клеток карЦНЮМ индуцирует мезенхимнын фенотип, пролиферацию клеток и повышает скорость их миграции При этом гиперэкспрессия RIL усиливает адгезию клеток как эпителиальной, так и неэпителиальной природы. Подавление экспрессии

RIL, наоборот, приводит к появлению признаков, характерных для менее агрессивного опухолевого фенотипа

3 При анализе экспрессии RIL в образцах злокачественных опухолей молочной железы человека и культурах клеток того же происхождения выявлена тенденция к подавлению RIL При этом высокий уровень RIL коррелирует с более агрессивным опухолевым фенотипом

4 При исследовании роли RIL в регуляции динамики актинового цитоскелета внутри LIM-домена RIL выявлен дополнительный сайт, обеспечивающий взаимодействие RIL с а-актинином Показано, что LIM домен RIL рекрутирует а-актинин на актиновый цитоскелет и повышает степень полимеризации актина за счет подавления его деполимеризации

5 В составе альтернативного С-концевого пептида двух изоформ RIL выявлен PEST-мотив, приводящий к дестабилизации этих белков посредством их протеасомной деградации

6 В методической части работы установлено оптимальное соотношение компонентов упаковочной смеси, позволившее увеличить эффективный титр получаемых вирусных препаратов в 15-20 раз В результате масштабного тестирования различных дизайнов РНК-шпильки для осуществления подавления экспрессии генов посредством РНК-интерференции установлено, что наиболее эффективней является «классическая» структура шпильки с 22-нуклеотцдным стеблем

Список работ, опублнковашых по теме диссертации

1 OA Гурьянова, А А Саблина, П М Чумаков, Е И Фролова. 2005 Подавление экспрессии гена TRIP6 приводит к перестройке актинового цитоскелета в линиях клеток карцином человека Молекулярная биология 39,905-909

2 OA Гурьянова, М Маханов, А А Ченчик, П М Чумаков, Е И Фролова 2006 Оптимизация полногеномной неупорядоченной клонотеки малых шпилечных РНК «в одной пробирке» на основе лентивектора» Молекулярная биология 40(3), 448-459

3 Guryanova О А, Chumakov Р М, Frolova ЕI 2004 TRIP6 down-regulation induces cytoskeleton changes and increases malignant phenotype Molecular Biology of the Cell 15(suppl), 252a. Abstracts The American Society for Cell Biology 44th Annual Meeting December 4-8,2004, Washington, DC

4 Guryanova OA, Sablina AA, Chumakov PM, Frolova EI 2005 Potential Role of Adapter Protein RIL in Mammary Tumorigenesis Advances in Breast Cancer Research Genetics, Biology and Clinical Applications (An AACR Special Conference in Cancer Research), September 21-25, 2005, La Jolla, США.

5 Гурьянова О A, Чумаков П М, Фролова Е И 2006 Скрининг полногеномных библиотек siPHK "в одной пробирке" проблемы и решения Тезисы докладов конференции молодых ученых, ИБХ РАН, февраль 2006

6 OA Guryanova, Р М Chumakov, ЕI Frolova 2006 Interaction of isoform products of the RIL gene with a-actinin and its potential role in actm cytoskeleton rearrangement European Human Genetics Conference, May 6-9, 2006, Amsterdam, Нидерланды

7 Гурьянова О A, Фролова E И 2006 Функциональное исследование RIL VIII чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова, 25-27 октября 2006, Москва - Пущино

Подписано в печать 18 04 2007 г Исполнено 19 04 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 389 Тираж 100экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гурьянова, Ольга Александровна

Список сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы.

1.1. Адапторные белки.

1.1.1. Особенности LIM-доменов.

1.1.2. Характеристика PDZ-доменов.

1.2. Ген TRIP6.

1.3. Ген RIL.

1.3.1. RIL - представитель семейства белков ALP/Enigma.

1.3.2. Происхождение и эволюционная консервативность семейства ALP/Enigma

1.3.3. Геномная организация гена RIL человека.

1.3.4. Альтернативные транскрипты гена RIL человека.

1.3.5. Эволюционная консервативность RIL.

1.3.6. Анализ экспрессии RIL и других членов семейства ALP/Enigma в различных тканях.

1.3.7. Репертуар взаимодействий белка RIL.

RIL взаимодействует с протеинтирозинфосфатазой PTP-BL.

Краткая функциональная характеристика PTP-Bas/PTP-BL.

RIL взаимодействует с LIM-доменным белком TRIP6.

1.3.8. Роль RIL в поддержании структуры актиновых стресс-фибрилл.

Краткая характеристика а-актининов.

1.3.9. Транспортная функция RIL.

1.3.10. Возможное участие RIL в злокачественной трансформации.

1.3.11. Данные о дифференциальной экспрессии RIL, полученные с использованием микропанелей олигонуклеотидов.

1.4. Лентивирусная система экспрессии.

1.5. РНК-интерференция.

II. Материалы и методы.

II. 1. Работа с культурами эукариотических клеток.

II. 1.1. Клеточные линии, использованные в работе, и их культивирование.

II. 1.2. Трансфекция.

II.1.3. Упаковка лентивирусных частиц.

II. 1.4. Очистка вирионов и трансдукция.

И. 1.5. Определение эффективного титра вирусных частиц и множественности заражения клеток.

II. 1.6. Оценка скорости клеточного деления.

II. 1.7. Определение скорости миграции клеток.

Метод «зарастания раны».

Оценка подвижности клеток с помощью трансмиграционных камер.

II. 1.8. Измерение клеточной адгезии.

II. 1.9. Колониеобразование в полужидкой среде.

ПЛ. 10. Проточно-цитометрический анализ.

II.2. Работа с плазмидной ДНК и клонирование.

11.2.1. Получение химически компетентных клеток E.coli.

11.2.2. Трансформация химически компетентных клеток E.coli.

11.2.3. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК.

11.2.4. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции.

11.2.5. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей.

И.2.6. Лигирование ДНК.

II.2.7. Векторы и плазмидные конструкции, использованные в работе.

II.2.8. Получение конструкций, экспрессирующих немеченые белки и белки, слитые с эпитопами Flag, НА, GFP.

11.2.9. Получение конструкций для экспрессии РНК-шпилек для РНК-иитерференции.

11.2.10. Получение репортерных конструкций.

11.3. Выделение и анализ РНК.

11.3.1. Выделение РНК, фракционирование и перенос на мембраны.

11.3.2. Нозерн-блот анализ.

11.3.3. ОТ-ПЦР.

11.3.4. Выделение и анализ мРНК, связанной полисомами.

11.4. Методы выделения и анализа белков.

11.4.1. Получение тотальных клеточных лизатов.

11.4.2. Получение Triton Х-100-растворимой и нерастворимой фракций.

11.4.3. Фракционирование белков, перенос на мембрану и иммунодетекция.

11.4.4. Иммунопреципитация.

11.4.5. Иммунофлюоресценция.

11.4.6. Определение соотношения полимеризованного и неполимеризованного актина с помощью конфокальной микроскопии.

11.4.6. Колориметрическое измерение активности р-галактозидазы (ONPG-окрашивание).

11.4.7. Измерение активности люциферазы.

11.4.8. Оценка времени полужизни белка.

III. Результаты и обсуждение.

III. 1. Оптимизация некоторых методов.

III. 1.1. Оптимизация упаковки псевдовирусных частиц.

III. 1.2. Оптимизация структуры РНК-шпильки для РНК-интерференции.

111.2. Влияние измененного уровня экспрессии TR1P6 и RIL на морфологию и физиологию клеток карцином.

111.2.1. Тестирование конструкций для экспрессии shPHK, специфичных генам TRIP6 и RIL.

111.2.2. Подавление экспрессии гена TRIP6 приводит к изменению морфологии клеток.

111.2.3. Изменение уровня экспрессии гена RIL влияет на морфологию клеток.

111.2.4. Влияние изменения уровней экспрессии TRIP6 и RIL на скорость миграции клеток.

111.2.5. Экспрессия TRIP6 и RIL и скорость пролиферации клеток.

111.2.6. Экспрессия TRIP6 и RIL по-разному влияет на способность клеток к росту в условиях анойкиса.

111.2.7. Гиперэкспрессия RIL усиливает адгезию клеток.

111.2.8. Возможные механизмы эффектов, наблюдаемых при подавлении экспрессии TRIP6.

111.3. Возможная роль RIL при раке молочной железы.

111.3.1. Анализ экспрессии мРНК RIL в опухолях человека.

111.3.2. Экспрессия RIL в культурах клеток рака молочной железы человека.

111.3.3. Статус RIL обратно коррелирует с экспрессией эпителиального маркера Е-кадгерина в культурах клеток рака молочной железы.

111.3.4. Изучение механизмов регуляции экспрессии RIL и Е-кадгерина при раке молочной железы.

111.4. Роль альтернативных изоформ RIL в реорганизации актинового цитоскелета

111.4.1. Изучение взаимодействия RIL с а-актинином.

111.4.2. Альтернативные варианты RIL имеют различную локализацию в клетке

111.4.3. Изоформы RIL меняют распределение а-актинина-1 между цитоскелет-ассоциированным состоянием и цитозолем.

111.4.4. RIL повышает степень полимеризации актина за счет своего LIM домена

111.4.5. LIM домен RIL ингибирует разборку актиновых волокон.

III.5. Карбокситерминальный пептид альтернативных форм RIL является сигналом протеасомной деградации.

111.5.1. Выявление короткоживущих форм RIL.

111.5.2. Альтернативный С-концевой пептид RIL дестабилизирует гетерологичные белки.

111.5.3. Альтернативный С-концевой пептид RIL содержит PEST-мотив - сигнал протеасомной деградации.

Выводы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие адапторных белков RIL и TRIP6 в организации актинового цитоскелета и злокачественной трансформации"

Недавнее завершение проекта «геном человека» параллельно с определением полной первичной структуры геномов многих других организмов, а также накопление большого массива данных об экспрессируемых последовательностях ставят перед исследователями принципиально новые задачи по обобщению, классификации и структурированию этой информации. Определение функций отдельных генов, поиск функциональных связей между ними, объединение их в функциональные цепочки, а затем и в функциональные сети -приоритетное направление современных молекулярной биологии и молекулярной генетики. Ключевую роль в интеграции сигнальных каскадов и тонкой регуляции их взаимодействий играют LIM-доменные цитоскелет-ассоциированные адапторные белки, представителями которых являются продукты генов RIL и TRIP6.

В свете многочисленных исследований последних лет некогда принятая точка зрения, что актиновый цитоскелет - просто статическая структура, обеспечивающая поддержание формы клеток, выглядит чрезмерным упрощением. Состояние актинового цитоскелета модулирует активность многих сигнальных каскадов; его интактность - необходимое условие внутриклеточного транспорта органелл. Реорганизация актинового цитоскелета играет основную роль в процессах адгезии и миграции клеток, а также при их злокачественной трансформации. В связи с этим выявление конкретных механизмов регуляции состояния цитоскелета, а также поиск и всестороннее изучение белков, вовлеченных в эти процессы, является одним из приоритетных направлений современной молекулярной и клеточной биологии. Изучение функциональных особенностей цитоскелет-ассоциированных белков RIL и TRIP6 может пролить свет на многие аспекты клеточной физиологии и опухолевой прогрессии, открывает широкие перспективы для детального реконструирования механизмов их участия в реорганизации актинового цитоскелета в норме и патологии и закладывает основы для разработки в будущем новых подходов к диагностике и лечению рака.

Основной целью данной работы явилось исследование функциональных особенностей цитоскелет-ассоциированных LIM-доменных белков TRIP6 и RIL, их влияния на реорганизацию актинового цитоскелета, на морфологию и физиологию клеток, а также их возможное влияние на инвазивные свойства опухолевых клеток.

В ходе исследования были поставлены следующие задачи:

1. Изучение влияния уровня экспрессии TRIP6 на морфологические и функциональные особенности клеток линий карцином.

2. Изучение морфологических и функциональных особенностей клеток линий карцином с измененным уровнем экспрессии RIL.

3. Анализ уровня экспрессии RIL в опухолях различного гистогенеза, в частности при раке молочной железы.

4. Выявление роли доменов белка RIL при его взаимодействии с альфа-актинином, и их влияние на состояние актинового цитоскелета.

5. Определение функционального мотива белка RIL, влияющего на стабильность белка RIL, и исследование механизма его деградации.

В методической части работы были поставлены задачи по оптимизации упаковки лентивирусных частиц для повышения эффективности трансдукции экспрессионных кассет в клетки-мишени и по совершентствованию структуры РНК-шпильки для наиболее эффективной РНК-интерференции в рамках лентивирусной экспрессии.

I. Обзор литературы 1.1. Адапторные белки

Основная отличительная черта адапторных белков - наличие нескольких доменов, обеспечивающих белок-белковые взаимодействия. Белки этого класса служат основой для образования крупных сигнальных комплексов, отвечая за правильное проведение сигнала. Они диктуют специфичность межмолекулярных взаимодействий, внутриклеточную локализацию отдельных белков и целых комплексов и могут модулировать активность своих белков-партнеров [1].

Отсутствие у TRIP6 и RIL собственной ферментативной активности, а также наличие PDZ (у RIL) и LIM-доменов (у TRIP6 и RIL) - мотивов, ответственных за белок-белковые взаимодействия, - позволяют отнести их к классу адапторных белков. Рассмотрим структуру и функции этих двух доменов более подробно.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гурьянова, Ольга Александровна

Выводы

1. Подавление экспрессии гена TRIP6 в линиях клеток карцином приводит к реорганизации актинового цитоскелета и другим морфологическим и функциональным сдвигам, характерным для эпителиально-мезенхимальной транзиции.

2. Повышенная экспрессия RIL в линиях клеток карцином индуцирует мезенхимный фенотип, пролиферацию клеток и повышает скорость их миграции. При этом гиперэкспрессия RIL усиливает адгезию клеток как эпителиальной, так и неэпителиальной природы. Подавление экспрессии RIL, наоборот, приводит к появлению признаков, характерных для менее агрессивного опухолевого фенотипа.

3. При анализе экспрессии RIL в образцах злокачественных опухолей молочной железы человека и культурах клеток того же происхождения выявлена тенденция к подавлению RIL. При этом высокий уровень RIL коррелирует с более агрессивным опухолевым фенотипом.

4. При исследовании роли RIL в регуляции динамики актинового цитоскелета внутри LIM-домена RIL выявлен дополнительный сайт, обеспечивающий взаимодействие RIL с а-актинином. Показано, что LIM домен RIL рекрутирует а-актинин на актиновый цитоскелет и повышает степень полимеризации актина за счет подавления его деполимеризации.

5. В составе альтернативного С-концевого пептида двух изоформ RIL выявлен PEST-мотив, приводящий к дестабилизации этих белков посредством их протеасомной деградации.

6. В методической части работы установлено оптимальное соотношение компонентов упаковочной смеси, позволившее увеличить эффективный титр получаемых вирусных препаратов в 15-20 раз.

7. В результате масштабного тестирования различных дизайнов РНК-шпильки для осуществления подавления экспрессии генов посредством РНК-интерференции установлено, что наиболее эффективной является «классическая» структура шпильки с 22-нуклеотидным стеблем.

Благодарности

Хочу поблагодарить своего научного руководителя Елену Ивановну Фролову за предоставление интереснейшей темы для разработки.

Свою искреннюю благодарность хочу выразить Петру Михайловичу Чумакову (лаб. Пролиферации клеток Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН) за моральную поддержку и ценные советы в ходе работы и за предоставленные реактивы.

Слова особой признательности хотела бы высказать в адрес Анны Саблиной, которая научила меня многим методам и без чьей поддержки эта работа не была бы выполнена так скоро. Я благодарю Романа Кондратова за критические замечания и стимулирующие дискуссии, а также Ольгу Разоренову и Александра Гаспарьяна за помощь в подготовке материалов к защите. Я благодарна членам лабораторий Е.И.Фроловой, П.М.Чумакова и А.В.Гудкова за поддержку, а также всем, кто мне помогал в ходе работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гурьянова, Ольга Александровна, Москва

1. Flynn D.C. 2001. Adaptor proteins. Oncogene. 20, 6270-6272.

2. Kadrmas J.L., Beckerle M.C. 2004. The LIM domain: from the cytoskeleton to the nucleus. Nat. Rex. Mol. Cell Biol. 5, 920-931.

3. Dawid I.B., Breen J.J., Toyama R. 1998. LIM domains: multiple roles as adapters and functional modifiers in protein interactions. Trends Genet. 14,156-162.

4. Wang Y., Gilmore T.D. 2001. LIM domain protein Trip6 has a conserved nuclear export signal, nuclear targeting sequences, and multiple transactivation domains. Biochim. Biophys. Acta. 1538,260-272.

5. Tanaka Т., Soriano M.A., Grusby M.J. 2005. SLIM is a nuclear ubiquitin E3 ligase that negatively regulates STAT signaling. Immunity. 22,729-736.

6. Ungureanu D., Silvennoinen O. 2005. SLIM trims STATs: Ubiquitin E3 ligases provide insights in the regulation of cytokine signaling. Science's STKE, 304, pe49.

7. Capilli A.D., Schultz D.C., Rauscher III F.J., Borden K.L. 2001. Solution structure of the PHD domain from the KAP-1 corepressor: structural determinants for PHD, RING and LIM zinc-binding domains. EMBOJ. 20,165-177.

8. Pawson Т., Nash P. 2003. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300,445-452.

9. Fanning A.S., Anderson J.M. 1999. PDZ domains: fundamental building blocks in the organization of protein complexes at the plasma membrane. J. Clin. Invest. 103,767-772.

10. Pallen M.J., Ponting C.P. 1997. PDZ domains in bacterial proteins. Mol. Microbiol. 26,411413.

11. Ponting C.P. 1997. Evidence for PDZ domains in bacteria, yeast, and plants. Protein Sci. 6, 464-468.

12. Harris B.Z., Lim W.A. 2001. Mechanism and role of PDZ domains in signaling complex assembly. J. CellSci. 114, 3219-3231.

13. Fan J.-S., Zhang M. 2002. Signaling complex organization by PDZ domain proteins. Neurosignals. 11,315-321.

14. Hung A.Y., Sheng M. 2002. PDZ domains: structural modules for protein complex assembly. J. Biol. Chem. 277,5699-5702.

15. Besprozvanny I., Maximov A. 2001. Classification of PDZ domains. FEBS Lett. 509, 457462.

16. Songyang Z., Fanning A.S., Fu C., Xu J., Marfatia S.M., Chishti A.H., Crompton A., Chan A.C., Anderson J.M., Cantley L.C. 1997. Recognition of unique carboxyl-terminal motifs by distinct PDZ domains. Science (Washington D.C.) 275, 73-77.

17. Van den Berk L.C.J., van Ham M.A., te Lindert M.M., Walma Т., Aelen J., Vuister G.W., Hendriks W.J.A.J. 2004. The interaction of PTP-BL PDZ domains with RIL: an enigmatic role for the RIL LIM domain. Mol. Biol. Rep. 31, 203-215.

18. Ponting C.P., Phillips C., Davies K.E., Blake D.J. 1997. PDZ domains: targeting signaling molecules to sub-membranous sites. Bioessays. 19,469-479.

19. Nourry C., Grant S.G.N., Borg J.-P. 2003. PDZ Domain Proteins: Plug and Play! Science's STKE. re7.

20. Jelen F., Oleksy A., Smietana K., Otlewski J. 2003. PDZ domains common players in the cell signaling. Acta Biochim. Pol. 50, 985-1017.

21. Yi J., Beckerle M.C. 1998. The human TRIP6 gene encodes a LIM domain protein and maps to chromosome 7q22, a region associated with tumorigenesis. Genomics. 49, 314-316.

22. Murthy K.K., Clark K., Fortin Y., Shen S.-H., Banville D. 1999. ZRP-1, a zyxin related protein, interacts with the second PDZ domain of the cytosolic protein tyrosine phosphatase hPTPlE. J. Biol. Chem. 274,20679-20687.

23. Wang Y., Gilmore T.D. 2001. LIM domain protein Trip6 has a conserved nuclear export signal, nuclear targeting sequences, and multiple transactivation domains. Biochim. Biophys. Acta. 1538,260-272.

24. Yi J., Kloeker S., Jensen C.C., Bockholt S., Honda H., Hirai H., Beckerle M.C. 2002. Members of the zyxin family of LIM proteins interact with members of the pl30Cas family of signal transducers. J. Biol. Chem. 277, 9580-9589.

25. Sanz-Rodriguez F., Guerrero-Esteo M., Botella L.-M., Banville D, Vary C.P.H., Bernabeu C. 2004. Endoglin regulates cytoskeletal organization through binding to ZRP-1, a member of the LIM family of proteins. J. Biol. Chem. 279, 32858-32868.

26. Lai Y.-J., Chen C.-S., Lin W.-C., Lin F.-T. 2005. c-Src-mediated phosphorylation of TRIP6 regulates its function in lysophosphatidic acid-induced cell migration. Mol. Cell. Biol. 25, 5859-5868.

27. Lee J.W., Choi H.-S., Gyuris J.,Brent R., Moore D.D. 1995. Two classes of proteins dependent on either the presence or absence of thyroid hormone for interaction with the thyroid hormone receptor. Endocrinology. 9,243-254.

28. Li L., Bin L.H., Liu Y., Chen D., Zhai Z., Shu H.B. 2005. TRIP6 is RIP2-associated common signaling component of multiple NF-кВ activation pathways. J. Cell Sci. 118, 555563.

29. Kiess M., Scharm В., Aguzzi A., Hajnal A., Klemez R., Schwarte-Waldhoff I., Schafer R. 1995. Expression of ril, a novel LIM domain gene, is down-regulated in HRAS-transformed cells and restored inphenotypic revertants. Oncogene. 10, 61-68.

30. Cuppen E., Gerrits H., Pepers В., Wieringa В., Hendriks W. 1998. PDZ motifs in PTP-BL and RIL bind to internal protein segments in the LIM domain protein RIL. Mol. Biol. Cell. 9, 671-683.

31. Xia H., Winokur S.T., Kuo W.L., Altherr M.R., Bredt D.S. 1997. Actinin-associated LIM protein: identification of a domain interaction between PDZ and spectrin-like repeat. J. Cell Biol 139,507-515.

32. Wang H., Harrison-Shostak D.C., Lemasters J.J., Herman B. 1995. Cloning of a rat cDNA encoding a novel LIM domain protein with high homology to rat RIL. Gene. 165,267-71.

33. Kotaka M., Ngai S.M., Garcia-Barcelo M., Tsui S.K., Fung K.P., Lee C.Y., Waye M.M. 1999. Characterization of the human 36-kDa carboxyl terminal LIM domain protein (hCLIMl). J. CellBiochem. 72,279-285.

34. Bashirova A.A., Markelov M.L., Shlykova T.V., Levshenkova E.V., Alibaeva R.A., Frolova E.I. 1998. The human RIL gene: mapping to human chromosome 5q31.1, genomic organization and alternative transcripts. Gene. 210, 239-245.

35. Torrado M., Senatorov V.V., Trivedi R., Fariss R.N., Tomarev S.I. 2004. Pdlim2, a novel PDZ-LIM domain protein, interacts with a-actinins and filamin A. Invest. Ophlh. Vis. Sci. 45, 3955-3963.

36. Kang S., Xu H., Duan X., Liu J.-J., He Z., Yu F., Zhou S., Meng X.-Q., Cao M., Kennedy G.C. 2000. PCD1, a novel gene containing PDZ and LIM domains, is overexpressed in several human cancers. Cancer Res. 60, 5296-5302.

37. Wu R.Y., Gill G.N. 1994. LIM domain recognition of a tyrosine-containing tight turn. J. Biol. Chem. 269,25085-25090.

38. Boden S.D., Liu Y., Hair G.A., Helms J.A., Hu D., Racine M., Nanes M.S., Titus L. 1998. LMP-1, a LIM-domain protein, mediates BMP-6 effect on bone formation. Endocrinology. 139,5125-5134.

39. Kuroda S., Tokunaga C., Kiyohara Y., Higuchi O., Konishi H., Mizuno K., Gill G.N., Kikkawa U. 1996. Protein-protein interaction of zinc finger LIM domains with PKC. J. Biol. Chem. 271,31029-31032.

40. Zhou Q., Ruiz-Lozano P., Martone M.E., Chen J. 1999. Cypher, a striated muscle-restricted PDZ and LIM domain-containing protein, binds to alpha-actinin-2 and protein kinase C. J. Biol. Chem. 214,19807-19813.

41. Faulkner G., Pallavicini A., Formentin E., Comelli A., Ievolella C., Trevisan S., Bortoletto G., Scannapieco P., Salamon M., Mouly V., Valle G., Lanfranchi G. 1999. ZASP: a new Z-band alternatively spliced PDZ-motif protein. J. Cell Biol. 146,465-475.

42. Passier R., Richardson J.A., Olson E.N. 2000. Oracle, a novel PDZ-LIM domain protein expressed in heart and skeletal muscle. Mech. Develop. 92,277-284.

43. Vallenius Т., Scharm В., Vesikansa A., Luukko K., Schafer R., Makela T.P. 2004. The PDZ-LIM protein RIL modulated actin stress fiber turnover and enhances the association of alpha-actinin with F-actin. Exp. Cell Res. 293,117-128.

44. Andersen O., Ostbye Т.К., Gabestad I., Nielsen C., Bardal T. 2004. Molecular characterization of a PDZ-LIM protein in Atlantic salmon (Salmo salar): a fish ortholog of the alpha-actinin-associated LIM-protein (ALP). J. Muscle Res. Cell Motil. 25, 61.

45. Szpirer C., Szpirer J., Riviere M., Hagnal A., Kiess M., Scharm В., Schafer R. 1996. Chromosomal assignment of three rat and human U-rev genes, putative tumor suppressors, down-regulated in malignantly #&4S-transfonned cells. Mamm. Genome. 7, 701-703.

46. Venter J.C., Adams M.D., Myers E.W., et al. 2001. The sequence of the human genome. Science. 291,1304-1351.

47. Lander E.S., Linton L.M., Birren В., et al. 2001. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921.

48. Subramanian G., Adams M.D., Venter J.C., Broder S. 2001. Implications of the human genome for understanding human biology and medicine. J. Am. Med. Assn. 286,2296-2307.

49. Modrek В., Lee С. 2002. A genomic view of alternative splicing. Nat. Genet. 30,13-19.

50. Kopelman N.M., Lancet D., Yanai I. 2005. Alternative splicing and gene duplication are inversely correlated evolutionary mechanisms. Nat. Genet. 37,588-589.

51. Huang C., Zhou Q., Liang P., Hollander M.S., Sheikh F., Li X., Greaser M., Shelton G.D., Evans S., Chen J. 2003. Characterization and in vivo analysis of splice variants of Cypher. J. Biol. Chem. 278,7360-7365.

52. Niederlander N., Fayein N.A., Auffray C., Pomies P. 2004. Characterization of a new human isoform of the enigma homolog family specifically expressed in skeletal muscle. Biochem. Biophys. Res. Co. 325,1304-1311.

53. Pomies P., Macalma Т., Beckerle M.C. 1999. Purification and characterization of an alpha-actinin-binding PDZ-LIM protein that is up-regulated during muscle differentiation. J. Biol. Chem. 274,29242-29250.

54. Zhou Q., Chu P.-H., Huang C., Cheng C.-F., Martone M.E., Knoll G., Shelton G.D., Evans S., Chen J. 2001. Ablation of Cypher, a PDZ-LIM domain Z-line protein, causes a severe form of congenital myopathy. J. Cell Biol. 155,605-612.

55. Lasorella A., Iavarone A. 2006. The protein ENH is a cytoplasmic sequestration factor for Id2 in normal and tumor cells from the nervous system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 4976-4981.

56. Ueki N., Seki N., Yano K., Masuho Y., Saito Т., Muramatsu M.-a. 1999. Isolation, tissue expression, and chromosomal assignment of a human LIM protein gene, showing homology to rat Enigma homologue (ENH). J. Hum. Genet. 44,256-260.

57. Jo K., Rutten В., Bunn R.C., Bredt D.S. 2001. Actinin-associated LIM protein-deficient mice maintain normal development and structure of skeletal muscle. Mol. Cell. Biol. 21, 1682-1687.

58. Altherr M.R., Bengtsson U., Markovich R.P., Winokur S.T. 1995. Efforts toward understanding the molecular basis of fascioscapulohumeral muscular dystrophy. Muscle Nerve. 2, S32-S38.

59. Vallenius Т., Luukko K., Makela T.P. 2000. CLP-36 PDZ-LIM protein associates with nonmuscle alpha-actinin-1 and alpha-actinin-4. J. Biol. Chem. 275,11100-11105.

60. Kotaka M., Lau Y.-m., Cheung K.-k., Lee S.M.Y., Li H.-y., Chan W.-y., Fung K.-p., Lee C.-y., Waye M.M.Y., Tsui S.K.W. 2001. Elfin is expressed during early heart development. J. Cell. Biochem. 83,463-472.

61. Guy P.M., Kenny D.A., Gill G.N. 1999. The PDZ domain of the LIM protein Enigma binds to beta-tropomyosin. Mol. Biol. Cell. 10, 1973-1984.

62. Krause A., Zacharias W., Camarata Т., Linkhart В., Law E., Lischke A., Miljan E., Simon H.-G. 2004. Tbx5 and Tbx4 transcription factors interact with a new chicken PDZ-LIM protein in limb and heart development. Dev. Biol. 273,106-120.

63. Camarata Т., Bimber В., Kulisz A., Chew T.-L., Yeung J., Simon H.-G. 2006. LMP4 regulates Tbx5 protein subcellular localization and activity. J. Cell Biol. 174,339-348.

64. Vallenius T. 2004. Characterization of actin stress fibers: involvement of PDZ-LIM adapter proteins and the novel Clikl kinase. Academic dissertation.

65. Maeno-Hikichi Y., Chang S., Matsumura K., Lai M., Lin H., Nakagawa N., Kuroda S.,л .

66. Zhang J.-f. 2003. A PKCe-ENH-channel complex specifically modulates N-type Ca channels. Nat. Neurosci. 6,468-475.

67. Wu R.-y., Durick K., Songyang Z., Cantley L.C., Taylor S.S., Gill G.N. 1996. Specificity of LIM domain interactions with receptor tyrosine kinases. J. Biol. Chem. 271, 15934-15941.

68. Frey N., Olson E.N. 2002. Calsarcin-3, a novel skeletal muscle-specific member of the calsarcin family, interacts with multiple Z-disc proteins. J. Biol Chem. 277,13998-14004.

69. Erdmann K.S. 2003. The protein tyrosine phosphatase PTP-Basophil/Basophil-like: interacting proteins and molecular functions. Eur. J. Biochem. 270,4789-4798.

70. Nelson W.J., Nusse R. 2004. Convergence of Wnt, p-catenin, and cadherin pathways. Science. 303, 1483-1487.

71. Hermann L., Dittmar Т., Erdmann K.S. 2003. The protein tyrosine phosphatase PTP-BL associates with the midbody and is involved in the regulation of cytokinesis. Mol. Biol. Cell. 14,230-240.

72. Cuppen E., van Ham M., Wansink D.G., de Leeuw A., Wieringa В., Hendriks W. 2000. The zyxin-related protein TRIP6 interacts with PDZ motifs in the adaptor protein RIL and the protein tyrosine phosphatase PTP-BL. Eur. J. Cell Biol. 79, 283-293.

73. Taylor K.A., Taylor D.W., Schachat F. 2000. Isoforms of a-actinin from cardiac, smooth, and skeletal muscle form polar arrays of actin filaments. J. Cell Biol. 149,635-645.

74. Honda K., Yamada Т., Endo R., Ino Y., Gotoh M., Tsuda H., Yamada Y., Chiba H., Hirohashi S. 1998. Actinin-4, a novel actin-bundling protein, associated with cell motility and cancer invasion. J. Cell Biol. 140,1383-1393.

75. Broderick M.J.F., Winder S.J. 2005. Spectrin, a-actinin, and dystrophin. Adv. Protein Chem. 70, 203-246.

76. Otey C.A., Carpen 0. 2004. a-Actinin revisited: a fresh look at an old player. Cell Motil. Cytoskel. 58,104-111.

77. Fu S.-l., Waha A., Vogt P.K. 2000. Identification and characterization of genes upregulated in cells transformed by v-Jun. Oncogene. 19,3537-3545.

78. Vanaja D.K., Ballman K.V., Morlan B.W., Cheville J.C., Neumann R.M., Lieber M.M., Tindall D.J., Young C.Y.F. 2006. PDLIM4 repression by hypermethylation as a potential biomarker for prostate cancer. Clin. Cancer Res. 12,1128-1136.

79. Welsh J.B., Sapinoso L.M., Su A.I., et al. 2001. Analysis of gene expression identifies candidate markers and pharmacological targets in prostate cancer. Cancer Res. 61, 59745978.

80. Yu Y.P., Landsittel D., Jing L., et al. 2004. Gene expression alterations in prostate cancer predicting tumor aggression and preceding development of malignancy. J. Clin. Oncol. 22, 2790-2799.

81. Mills J.C., Syder A.J., Hong C.V., Guruge J.L., Raaii F., Gordon J.I. 2001. A molecular profile of the mouse gastric parietal cell with and without exposure to Helicobacter pylori. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98,13687-13692.

82. Liu C., Goshu E., Wells A., Fang C.-M. 2003. Identification of the downstream targets of SIM1 and ARNT2, a pair of transcription factors essential for neuroendocrine cell differentiation. J. Biol. Chem. 278,44857-44867.

83. Gerhardinger С., Costa МБ., Coulombe M.C., Toth I., Hoehn Т., Grosu P. 2005. Expression of acute-phase response proteins in retinal Miiller cells in diabetes. Invest. Ophth. Vis. Sci. 46,349-357.

84. Emi N., Friedmann Т., Yee J.K. 1991. Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus. J. Virol. 65,1202-1207.

85. Lin S., Gaiano N., Culp P., Burns J.C., Friedmann Т., Yee J.K., Hopkins N. 1994. Integration and germ-line transmission of a pseudotyped retroviral vector in zebrafish. Science. 265,666-669.

86. Coffin J.M., Hughes S.H., Varmus H.E. Retroviruses. 1997. CSHL Press.

87. Nguyen Т.Н., Oberholzer J., Birraux J., Majno P., Morel P., Trono D. 2002. Highly efficient lentiviral vector-mediated transduction of nondividing, fully reimplantable primary hepatocytes. Mol. Ther. 6,199-209.

88. Pfeifer A., Ikawa M., Dayn Y., Verma I.M. 2002. Transgenesis by lentiviral vectors: Lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99,2140-2145.

89. Brummelkamp T.R., Bernards R., Agami R. 2002. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296,550-553.

90. Barton G.M., Medzhitov R. 2002. Retroviral delivery of small interfering RNA into primary cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99,14943-14945.

91. Dykxhoom D.M., Novina C.D., Sharp P.A. 2003. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4,457-467.

92. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391,806-811.

93. Ngo H., Tschudi C., Gull K., Ullu E. 1998. Double-stranded RNA induces mRNA degradation in Trypanosoma brucei. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95,14687-92.

94. Yang S., Tutton S., Pierce E., Yoon K. 2001. Specific double-stranded RNA interference in undifferentiated mouse embryonic stem cells. Mol. Cell. Biol. 21, 7807-16.

95. Hutvagner G., McLachlan J., Pasquinelli A.E., Balint Ё., Tuschl Т., Zamore P.D. 2001. A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA. Science. 293, 834-838.

96. Moss E.G. 2002. MicroRNAs: hidden in the genome. Current Biology. 12, R138-R140.

97. Bartel D.P. 2004. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297.

98. Berstein E., Caudy A.A., Hammond S.M. Hannon G.J. 2001. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409, 363-366.

99. Caplen N.J., Parrish S., Imani F., Fire A., Morgan R.A. 2001. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 9742-9747.

100. Lee Y., Ahn C., Choi H., Kim J., Yim J., Lee J., Provost P., Radmark O., Kim S., Kim V.N. 2003. The nuclear Rnase III Drosha initiates microRNA processing. Nature. 425,415-419.

101. Hammond S.M., Bernstein E., Beach D., Hannon G.J. 2000. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature. 404,293-296.

102. Carmell M.A., Xuan Z., Zhang M.Q., HannonG.J. 2002. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16,2733-2742.

103. Sledz C.A., Williams B.R.G. 2005. RNA interference in biology and disease. Blood. 106, 787-794.

104. Hammond S.M. 2005. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829.

105. Sui G., Soohoo C., El Bashir A., Gay F., Shi Y., Forrester W.C., Shi Y. 2002. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99,5515-5520.

106. Paddison P.J., Caudy A.A., Bernstein E., Hannon G.J., Conclin D.S. 2002. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958.

107. Cullen B.R. 2005. Induction of stable RNA interference in mammalian cells. Gene Ther. 16.

108. Inoue H., Nojima H., Окауаша Н. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96,23-28.

109. Silva J.M., Sachidanandam R., Hannon G.J. 2003. Free energy lights the path toward more effective RNAi. Nat. Genet. 35, 303-305.

110. Lukyanov К.A., Chudakov D.M., Fradkov A.F., Labas Y.A., Matz M.V., Lukyanov S. 2006. Discovery and properties of GFP-like proteins from nonbioluminescent anthozoa. Method. Biochem. Analysis. 47,121-138.

111. Chomczynski P. 1992. One-hour downward alkaline capillary transfer for blotting of DNA and RNA. Anal. Biochem. 201,134-139.

112. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т., Strategies for cloning in plasmid vectors, in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, C. Nolan, Editor. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York. p. 1.53-51.73.

113. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402.

114. Small J.V. 1981. Organization of actin in the leading edge of cultured cells: Influence of osmium tetroxide and dehydration on the ultrastructure of actin meshworks. J. Cell Biol. 91, 695-705.

115. Cramer L., Mitchison T.J. 1993. Moving and stationary actin filaments are involved in spreading of postmitotic PtK2 cells. J. Cell Biol. 122, 833-843.

116. Cramer L.P., Briggs L.J., Dawe H.R. 2002. Use of fluorescently labeled deoxyribonuclease I to spatially measure G-actin levels in migrating and non-migrating cells. Cell Motil. Cytoskeleton. 51,27-38.

117. Yee J.K., Miyahora A., LaPorte P., Burns J.C., Friedmann T. 1994. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91,9564-9568.

118. Zeng Y., Wagner E.J., Cullen B.R. 2002. Both natural and designed micro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells. Mol. Cell. 9,1327-1333.

119. Lagos-Quintana M., Rauhit R., Lendeckel W., Tuschl T. 2001 Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science. 294, 853-858.

120. Cullen B.R. 2005. RNAi the natural way. Nat. Genets. 37,1163-1165.

121. Thiery J.P. 2002. Epithelial-mesenchymal transitions in tumor progression. Nat. Rev. Cancer. 2,442-454.

122. Bogenrieder Т., Herlyn M. 2003 Axis of evil: molecular mechanisms of cancer metastasis. Oncogene. 22, 6524-6536.

123. Mareel M., Leroy A. 2003. Clinical, cellular, and molecular aspects of cancer invasion. Physiol. Rev. 83,237-276.

124. Копнин Б.П. 2000. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза. Биохимия. 65, 5-33.

125. Bouton A.H., Riggins R.B., Bruce-Staskal P.J. 2001. Functions of the adapter protein Cas: signal convergence and determination of cellular responses. Oncogene. 20, 6448-6458.

126. Yun M.-S., Kim S.-E., Jeon S.H., Lee J.-S., Choi K.-Y. 2005. Both ERK and Wnt/(3-catenin pathwys are involved in Wnt3a-induced proliferation. J. Cell Sci. 118, 313-322.

127. Lin A.W., Barradas M., Stone J.C., van Aelst L., Serrano M., Lowe S.W. 1998. Premature senescence involving p53 and pl6 is activated in response to constitutive MEK/MAPK mitogenic signaling. Genes Dev. 12,3008-3019.

128. Lin A.W., Lowe S.W. 2001. Oncogenic ras activates the ARF-p53 pathway to suppress epithelial cell transformation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5025-5030.

129. Brenner A.J., Paladugu A., Wang H., Olopade О. I., Dreyling M.H., Aldaz C.M. 1996. Preferential loss of expression of pl6lSK4a rather than pl94RF in breast cancer. Clin. Cancer Res. 2,1993-1998.

130. Foster S.A., Wong D.J., Barrett M.T., Galloway D.A. 1998. Inactivation of pl6 in human mammary epithelial cells by CpG island methylation. Mol. Cell. Biol. 18,1793-1801.

131. Bachelder R.E., Yoon S.-O., Franci C., Garcia de Herreros A., Mercurio A.M. 2005. Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription; implications for the epithelial-mesenchumal transition. J. Cell Biol. 168,29-33.

132. Conacci-Sorell M., Simcha I., Ben-Yedidia Т., Blechman J., Savagner P., Ben-Ze'ev A. 2003. Autoregulation of E-cadherin expression by cadherin-cadherin interactions: the roles of p-catenin signaling, Slug, and МАРК. J. Cell Biol. 163, 847-857.

133. Yang J., Mani S.A., Donaher J.L., Ramaswamy S., Itzykson R., Come C., Savagner P., Gitelman I., Richardson A., Weinberg R.A. 2004. Twist, a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 117, 927-939.

134. Yang J., Mani S.A., Weinberg R.A. 2006. Exploring a new twist on tumor metastasis. Cancer Res. 66,4549-4552.

135. Yue J., Mulder K. 2001. Transforming growth factor-p signal transduction in epithelial cells. Pharmacol. Therapeut. 91,1-34.

136. Kaminska В., Wesolowska A., Danilkiewicz M. 2005. TGF beta signalling and its role in tumor pathogenesis. Acta Biochim. Pol. 52,329-337.

137. Klaavuniemi Т., Ylanne J. 2006. Zasp/Cypher internal ZM-motif containing fragments are sufficient to co-locolize with a-actinin Analysis of patient mutations. Exp. Cell Res. 312, 1299-1311.

138. Klaavuniemi Т., Kelloniemi A., Ylanne J. 2004. The ZASP-like motif in actinin-associated LIM protein is required for interaction with the a-actinin rod and for targeting to the muscle Z-line. J. Biol. Chem. 279,26402-26410.

139. Henderson J.R., Pomies P., Auffray C., Beckerle M.C. 2003. ALP and MLP distribution during myofibrillogenesis in cultured cardiomyocytes. Cell Motil. Cytoskel. 54,254-265.

140. Haugland R.P., You W., Paragas V.B., Wells K.S., DuBose D.A. 1994. Simultaneous visualization of G- and F-actin in endothelial cells. J. Histochem. Cytochem. 42, 345-350.

141. Pomies P., Pashmforoush M., Vegezzi C., Chien K.R., Auffray C., Beckerle M.C. 2007. The cytoskeleton-associated PDZ-LIM protein, ALP, acts on serum response factor activity to regulate muscle differentiation. Mol. Biol. Cell. 18,1723-1733.

142. Spector I., Braet F., Shochet N.R., Bubb M.R. 1999. New anti-actin drugs in the study of the organization of the actin cytoskeleton. Microsc. Res. Techniq. 47,18-37.

143. Schoenenberger C.-A., Steinmetz M.O., Stoffler D., Mandilova A., Aebi U. 1999. Structure, assembly, and dynamics of actin filaments in situ and in vitro. Microsc. Res. Techniq. 47, 38-50.

144. Taunton J. 2001. Actin filament nucleation by endosomes, lysosomes and secretory vesicles. Curr. Opin. Cell Biol. 13,85-91.

145. Spector I., Braet F., Shochet N.R., Bubb M.R. 1999. New anti-actin drugs in the study of the organization and function of the actin cytoskeleton. Microsc. Res. Techniq. 47,18-37.

146. Rechsteiner M., Rogers S.W. 1996. PEST sequences and regulation by proteolysis. Trends Biochem. Sci. 21,267-271

Информация о работе

Гурьянова, Ольга Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.03

Диссертация

Участие адапторных белков RIL и TRIP6 в организации актинового цитоскелета и злокачественной трансформации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы