Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие 6-метилурацила в регуляции пероксидного окисления липидов - основа его биологического действия

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Участие 6-метилурацила в регуляции пероксидного окисления липидов - основа его биологического действия"

РГ6 од

_ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

1 и \лГ.<!

ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. Н.Н.СШЕНОВА

На правах рукописи

ТАРАН Юрий Петрович

УЧАСТИЕ б-МЕТИПУРАЩША В РЕГУЛЯЦИИ ПЕРОКСВДОГО 0КИСЛЙШ ЛИПИДОВ - ОСНОВА ЕГО БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

03.00.02. - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

/

Москва 1993

Работа выполнена в Институте химической физики юл. академика Н.Н.Семенова РАН. /

Научный руководитель: кандидат химических наук

старший научный сотрудник Л.Н.Шишкина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Н.П.Пальмина

кандидат химических наук доцент С.А.Силаева

Ведущая организация: Биологический факультет

Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится 1993 г. в У-f час

на заседании Специализированного совета Д 002.26.07. при Институте химической физики РАН по адресу: II7977, Москва, ул.Косыгина, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИХФ РАН.

Автореферат разослан "Л8" ШуьеиЛ! 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

М.А.Смотряева

ондая характеристика работы

I

Актуальность исследования.

Общепризнано, что на клеточном уровне универсальной системой регуляции метаболизма является биологическая мембрана. От состава и физико-химических свойств составляющих ее липидов зависят активности мембраносвязаных ферментов и рецепторов, пассивная и активная проницаемость и другие свойства мембран. Липиды способны легко окисляться, поэтому в организме существуют специальные системы регуляции пероксидного окисления липидов (ПОЛ). На уровне мембран . важнейшей является физико-химическая система /Вурлакова и др., 1976; аР,, 1979/, которая регулируя интенсивность

ПСи, влияет и на функции мембран и ее компонентов.

Известно, что для многих биологически активных Ееществ как эндогенного происхождения, так и фармакологических существуют специфические мишени, расположенные внутри клетки либо на мембранах. Однако в любом случае вещество прямо или опосредовано будет влиять на структурно-функциональные свойства мембран. Отсюда вытекает, что биологически активное Еещество наряду со своим специфическим действием пояет елиять и на ПОЛ. за счет воздействия на мембранные компоненты физико-химической системы его регуляции. Действительно, появляется все большее число данных, что в осноге биологического действия ряда фармакологических препаратов, которые нельзя отнести к числу эффективных антиоксидантов, лежит, в ; том числе, и влияние на интенсивность ПОЛ.

С этой точки зрения большой интерес представляет 6-метилура- . цил (МУ), яеляющийся аналогом природных пиримидинов, ко в силу своего строения / , 1952/ неспособный

включаться в синтез нуклеиновых кислот /Русаков и др., 1977/. ЫУ обладает большим разнообразием биологических и терапевтических свойств, что, однако, не исключает наличие у него ведущего или определяющего механизма действия на молекулярно-клеточном уровне. К настоящему Бремени этот механизм не установлен. Не существует также более менее приемлемого объяснения всей совокупности биологических сеойств препарата. С другой стороны, близость фармакологических свойств антиоксидантов и МУ, в частности, противовоспалительных и биосинтетических, указывает на наличие определенного сходстза е их механизме действия.

Действительно, к началу настоящего исследования были известны немногочисленные работы, посвященные изучению антиокспдантных

свойств МУ /РусакоЕ и др., 19ь1; Ыышкин и др., 19Ьк:; Кузнецов и др., 19Ь7/. Однако е них лишь затронута проблема взаимосвязи биологических свойств и способности препарата елиять на интенсивность ПО.1:. Недостаточно изучены антиоксидантные свойства МУ ¡п. уИкс и механизм их реализации на уровне организма. Поэтому более глубокое и комплексное исследование антиоксидантных свойст препарата не только приблизило бы нас к пониманию механизма его действия, но и расширило бы сферу его применения в качестве лечебно-профилактического средства.

Цель у. задачи исследования.

Целью настоящей работы было комплексное изучение как антиоксидантных свойств ЫУ в модельных системах различной степени сложности, так и его способности елиять на системы регуляции ПСш. в норме к при действии повреждающих факторов.

Ь соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить антиоксидантные свойства МУ е модельных системах различной степени сложности:

а) метклолеатная окислительная модель;

б) суспензия изолированных митохондрий печени;

в) срезы переживающей мышечной ткани.

2. Исследовать закономерности влияния препарата на некоторы звенья физико-химической и ферментативной систем регуляции ПОЛ в органах и тканях интактных животных.

3. Изучить влияние внутрибрюшинного введения НУ на заживление ран и состояние параметров физико-химической системы регуляции ПОЛ в печени и эритроцитах животных при термических ожогах.

4. Исследовать профилактическое и терапевтическое действие препарата на выживаемость животных при остром облучении и его Елияние на показатели систем регуляции ПИ: при профилактическом введении препарата облученным животным.

Научная новизна полученных результатов.

Ьпервые исследована антиокислительная активность (аоа) МУ на метилолеатной окислительной модели. Показано, что по этому па раметру препарат значительно уступает ионолу е эквивалентной ко^. центрации. Обнаружено, что ноа 1,'У зависит от скорости зарождения свободных радикалов метилолеата и концентрации препарата.

При исследовании действия Ш' на некоторые показатели физике

химической и ферментативной систем регуляции ПОЛ у животных б нср^е обнаружено повышение активности супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы в печени и фазные изменения аоа липидов органов и тканей. Установлено, что масштаб и динамика изменений аОА липидов печени зависят от исходного уровня этого показателя. Обнаружено влияние препарата на состав и содержание фосфолипидов (Фд) в органах.

Выявлено лечебное действие МУ при его шутрибрюшинном введении животным с термическими повреждениями кожи и профилактическое - при облучении ионизирующей радиацией. Установлено, что препарат нормализует состояние физико-химической системы регуляции ПОЛ, а при облучении также повышает активность СОД в печени и эритроцитах. Впервые показано, что радиомодифицирующее действие ЫУ зависит от исходного антиоксидантного статуса животных и времени ЕЕедения препарата. Установлена длительность последействия МУ как в норме, так и при действии повреждающих факторов.

Совокупность полученных данных позволила выдвинуть гипотезу о том, что в основе биологического действия-МУ лежит влияние на системы регуляции свободно-радикального окисления.

Практическое значение работы.

Научно-практическое значение полученных результатов лежит в существенном углублении наших представлений о механизме действия МУ, что может расширить область,его применения н качестве лечебно-профилактического средства. Ь частности, препарат может более активно использоваться в качестве радиопрстектсрного средства. Результаты подчеркивают значимость систем регуляции метаболизма и ПОЛ, е том числе, з реализации биологических свойств препарата, их исходного состояния в индивидуальной чувствительности и реактивности к препарату, что делает необходимым предварительную диагностику и индивидуальный подход к установлению способов и доз введения МУ.

Структура работы.

Диссертация состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и указателя литературы. Глава I - обзор литературы, глава 2 -материалы и методы, глава 3 - результаты собственных исследований и их обсуждение. Работа содержит 1ь таблиц, 2Ь рисунков и • графиков. Б диссертации использованы 230 литературных источник6е, из которых 130 отечественных.

Автор выражает искреннюю благодарность к признательность за помощь в проведении отдельных экспериментов и обсуждении результатов сотрудникам лаборатории патофизиологии повреждений опорно-двигательного аппарата ЦНИИТО им. К.Н.Приорова, Центральной науч но-исслсдоЕательской лаборатории Ш.'А им. И.М.Сеченова и лаборато рии экспериментальной хирургии Кемеровского медицинского институ та.

Апробация работы.

Материалы и основные положения диссертации доложены на 1У конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1992 г) и на симпозиуме "Механизмы действия сверхмалых доз" (Москва, 1992 г.). По матери ала-/ диссертации опубликовано 4 работы и I статья находится в пе чати.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Б работе использовано 100 белых беспородных крыс обоего пол массой 1В0-220 г и около 1100 мышей линий ЬАЬЬ.к 5НК такие обоего пола массой 17-23 г.

I. Экспериментальные модели.

АОА липидов и МУ как индивидуального химического вещества определяли на метилолеатной модели /Бурлакова к др., 1975/ при температуре окисления 37°С.

Митохондрии выделяли из печени крыс 16c/i^^-e¿<^^tг.J /Уодг-воот. , 1950/. Интенсивность ПОЛ в суспензии митохондрий регулировали температурой, перемешиванием среды и добавлением РеЗО^ • 7 Н^О (20 мкМ) и аскорбата N а (200 мкМ). дыхание митохондрий регистрировали полярографически с помощью закрытого платинового электрода кларковского типа на полярографе 1Р-7е (Чехия).

Ь качестве модели изолированной переживающей ткани использовали тонкие (~I мм) срезы бедренной мышцы кролика или кусочки диафрагмальной мышцы крыс площадью около I см4. Срезы инкубировали на марле, смоченной физиологическим раствором. Интенсивност ПОЛ задавали температурой инкубации. Скорость потребления тканью регистрировали полярографически в специальной ячейке /Эп-штейн, 1974/ на полярографе РА-2 (Чехия).

Оког наносили струей горячей водь; ( ~70°С) б течение 7 сек на предварительно выщипанную кону спины крыс, что давало оког ША-ШБ степени. Площадь рак измеряли планиметрическим методом /Фенчин, 1979/.

Мышей облучали однократно на рентгеновской установке РУТ-200-20-3 в дозе 129 млл/кг (5,0 Гр), с Ь до 10 час утра. Ьыжие-шими считались животные, прошЕшие после облучения не менее 30 суток.

Содержание лейкоцитов в периферической крови определяли унифицированным методом в камере Горяева /Меньшиков, 19Ь7/.

Ьо Есех случаях МУ жиеотным вводили однократно внутрибрю-шинно е виде водного 0,5 ^ раствора. Контрольны.! животным вводили эквивалентный объем дистиллированной воды.

2. Методы определения биофизических и биохимических показателей.

Липидь! из гомогенатов органов и тканей выделяли по методу Блая и Дайера в модификации 1£йтса /1975/.

Содержание пероксидоь б липидах определяли иодометрически /Березин, 1953/. Интенсивность ПШ определяли по содержанию продуктов, взаимодействующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АГ1), по методу /Стальная и Гаришвили, 1977/ в модификации, заключающейся в добавлении 10 мкл 0,01 л спиртового раствора ионола.

Анализ состава и содержания ФЛ в липидных экстрактах гомогенатов тканей проводили с помощью одномерной тонкослойной хроматографии на силикагеле й или G , ClIA) по методам /Хиггинс, 1990/ с незначительными модификациями.

Общий холестешн в липидах опседеляли по методу /dp-е , 1950/."

Количество о(. -токоферола в липидах измеряли спектрофлуориметри-чески по ! Ъи-^а^ , 1959/ на спектрофлуориметре ¿5Р-Ь50 {ftLta.-cPuL , Япония) на длине еолнк возбуждения 295 нм и испускания 323 нм.

Белок в пробах определяли биуретоЕш методом Меньшиков, 1967/. Экстинкцию раствороЕ измеряли на длине волны 540 нм.

Каталазную актиЕность определяли по методу Королюка с со-авт. /19ЬЬ/.

Активность СОД определяли' по методу / fHista. and J^cta-Uch. , 1972/, основанному на ингибировании ферментом превращения адреналина в адренохром. Измерения проводили на программируемом спектрофотометре Зц-50 ( ¡Ье^Ятсиъ. , США) на длине волны 460 нм в автоматическом режиме при 30°С. Активность СОД рассчитывали по кинетическш кривы.! экстинкции растЕороЕ адреналина е зависимости от количества добавленного белка.

Результаты обрабатывали по общеприняты.', методам Дакин, 1980/

РЕЗУЛЬТАТЫ ^ССЛ^ОЬ/йЛ. ОБСУЩЦй.й

I. ¿^^^ок'лэ антпсгси^ачтнь™" с^оГ^т г. т ¡о дельных системах гаг--личной степени сложности.

На модели жидкосазного гомогенного окисления метилолеата исследованы антиоксидантные свойства МУ в зависимости от интенсивности окисления метилолеата и концентрации препарата.

9' 6

10

Рис. I. лОА^МУ в концентрации

Ю"° М/ыл в зависимости от скорости зарождения свободных радикалов метил олеата.

По оси абсцисс - скорость зарождения свободных радикалов, »Ю^ М/час.л; по оси ординат - АСА.10" часмл/М.

На рис.1 приЕедены данные зависимости АОа 15У от скорости зарождения свободных радикалов метилолеата. Ьндна пропорциональная зависимость между эт;ми показателями. Очевидно, она вызвана высокой активностью радикалов препарата, поскольку известно, что ан-тиоксиданты с высокой Ь^, в частности «¿.-токоферол, также поеы-шают свои антиоксидантные свойства с увеличением скорости зарождения свободных радикалов /Бурлакова и др., 1992/. С другой стороны, нельзя отрицать роли кето-енольной таутомерии, присущей урацилу и его производным / схл.с1 , 19ЬЗ,

1964; оТ^илЛ^а, о£. , 19дЬ/. Ьозможно при повышении скорос-

ти окисления метилолеата происходит смещение равновесия дикетон-ная форма ^ кетоенольные фориы вправо за счет участия последних в реакциях со свободными радикалами и удаления из реакционной системы.

Исследована зависимость антиоксидантных сеойсте ¡¿У от его концентрации пр'л зксокоГ; скорости окисления метилолеата (рис.2). Ьидко, что их рост наблюдался только до концентрации Ю-' М/л, а при более высоких имело место снижение относительной разности Яй ивдукиии окисления метилолеата. Очевидно и ь этом случае причина такой зависимости лежит в высокой активности радикалов МУ, спо-

0,3

о,2 0,1 о

Ркс. 2. Относительная разность периодов индукции окисления метилолеата в зависимости от концентрации МУ.

По оси абсцисс -концентрация МУ в метилолеате, М/л; по оси ординат -относительная разность периодов индукции окисления метилолеата,

(тг-<г0)/тг0

Ю-7 Ю"5

10'

-о

/

/

/

/

собствущих продолжению цепи окисления. Возможно также, что при более высоких концентрациях происходит образование ассоииатов молекул МУ, снижающее концентрацию более эффективной молекулярной формы препарата. Способность урацила и его аналогов формировать ассоциаты, по крайней мере, в водных растворах хорошо известна / У^о. е£ оС., 1968/.

Сравнение АОА ионола и МУ в эквивалентных концентрациях (Ю-^ и М/л) показало, что е целом активность исследуемого препарата примерно на дЕа порядка низе (£ = 0,025 и 0,044 соответственно для двух концентраций). Кроме того, исследования на метилолеатной модели не обнаружили у МУ антипероксидных свойств.

Рис. 3. Кинетика накопления ТЕл-АП б суспензии изолированных митохондрий печени крыс

По оси абсцисс - время инкубации, мин; по оси ординат - Тт-АП,нМ/мл

1 - контроль

2 - МУ 4,6 мкМ/мг белка

3 - МУ 22,9 мкМ/мг белка

4 - фенозан К+ 4,4 мкМ/мг белка

Содержание митохондрий 1,73 мг/мл Среда - трис НС1 (рН 7,4) +

- ö -

Ь отличие от метилолеата суспензия митохондрий гетерогенна и обладает совокупностью сложных мембранных и ферментных систем. Исследования действия МУ в концентрациях 2 т 23 мкМ/мг белка на интенсивность Ilüji в этой системе показало, что в малых концентрациях препарат ингибировал накопление ТБК-лП лишь при спонтанном окислении при комнатной температуре. Этот эффект снимался при добавлении солей железа и повышении температуры до 37°С. МУ снижал интенсивность ПОЛ при максимальной его активации только в концентрации 23 мкМ/мг- белка митохондрий. Как видно из данных рис.3, в этой концентрации препарат снижал приблизительно на 30 ?> как скорость накопления ТьК-АП (3,0 нМ/мл-мин по сравнению с 4,5] так и его стационарный уровень. Ь то же Бремя в этих условиях фенозан К+ полностью ингибировал HCL.. Снижение антиоксидантных сеойсте МУ при некоторых условиях окисления и концентрациях препарата связано с его способностью повышать в митохондриях содержание свободного ионизированного кальция /Поролло, 1967/, что может приводить к усилению ПОЛ /Савов и др., Iöoö; Бабижаев, 19Ь8/.

Наиболее сложной биологической моделью е наших исследованиях были срезы мышечкой ткани млекопитающих, способные в течение определенного времени сохранять функциональные свойства интактньп тканей /Гаврглюк и Сафронов, 19сЗ/. При 37°С в изолированных сре^ зах происходило существенное повышение интенсивности ПОЛ. На рисунке 4 представлены данные по влиянию {/¡У и фенозана К+ на относительное содержание ТъК-дП в срезах ткани в зависимости от времени инкубации. Ьидно, что на протяжении 4-х часов антиоксидант-ный эффект МУ был сопоставим с действием антиоксиданта. Перерас-

Рис.4. Влияние эквимолярных кон центраций МУ и фенозана К+ (3,7 мй.1/мл среды инкубации) на относительно содержание ТЕК-ЯП в срезах мышцы кролика.

По оси абсцисс - время инкубации, час; по оси ординат - содержание ТБК-.ЛП в срезах ткани с препарате по отношению к ткани без препарат на данный срок инкубации, %%.

120'

60

40

+

Ь «

i

0-2

1

2-4

4-7

чет содержания препаратов на белок мышечной ткани при условии равномерного распределения вещества дает величину около 40 нМ/мг. Поэтому можно считать, что по сравнению с митохондриями активность МУ как антиоксиданта возрастала приблизительно на три порядка.

Таким образом, исследования на метилолеатной модели и в суспензии митохондрий показали, что по своим антиоксидантным свойствам МУ значительно уступает синтетическим антиоксиданта«. Однако в условиях структурно и функционально более сложных систем, какими являлись изолированные ткани, обнаружено значительное повышение ингибиторных свойств МУ, которые по эффективности становятся сопоставимыми с действием антиоксидантов. Другими словами, в сложных биологическим системах существуют условия для более полной реализации МУ своих анткоксидантных свойств.

2. Влияние МУ на некоторые компоненты систем регуляции ПОЛ орга-

. Изучение действия МУ иг \zlvo проводили на гомогенатах органов мышей линий ВА1В и 5НК, поскольку качественные и количественные характеристики гокогенатов отражают в целом реакцию органа на воздействие и дают интегральную оценку состояния их систем

низма. в норке.

2

Рис.5. Влияние МУ (50 мг/кг) на аОА липидов печени мышей линий ЬАЬБ и 5НК.

-I

О

I

По оси абсцисс - время после еведения препарата, час; По оси ординат - разность между уровнем АОА липидов опытных жиеотных и уровнем АОА липидов интактных животных, •10 ^ , час-мл/г

Сплошная линия - БНК;

Пунктир - ВА:Ш

к - р < 0,05 хч - р < 0,01

-3

О 20 40 60

8 .-«-. / \

Рис.6. Влияние !.!У (ЬО кг/гг)

/'

4

\

ч

на АОА липидов печени (I), селезенок (2) и эритроцитов (3) мышей линии iSHK.

О

По оси абсцисс - время после ЕЕедения препарата, сут; По оси ординат - аОаоп - аОАИ] часмл/г

IHT

-4

О

5

10

15

регуляции ПОЯ. Выбор тканей и органов обусловлен их важности для жизнедеятельности организма.

Выбранная доза 50 мг/кг (0,4 мкЫ/г ткани или приблизительно 4 нМ/мг белка) близка к тем, которые применялись другими исследователями в качестве однократной. Кроме того, антпэксиданты б сходных дозах оказывают выраженный эффект на состояние физико-химической системы регуляции ПОД.

На рис. 5 и б приЕедены данные по влиянию МУ на уровень АСа липидов (один из основных параметров состояния физико-химической системы регуляции ПО); /Бурлакова и др., 1975/) органов и тканей мышей линий BaLB и ¡ЗНК, различающихся по исходному уровню этого показателя. Ь частности, АОА липидов печени интактных мышей была минимальна у LALb (700+Б0 чае-мл/г) и максимальна у SHK (2350+^ 550 для рис.5 и 6050+IBB0 для рис.6 соответственно). Видно, что изменения AUA липидов характеризовались фазностью, а величина и знак отклонений в разных тканях были различны и зависели от времени после введения МУ. Оказалось также, что при сходстве динамики масштаб изменений аОа липидов печени зависел от исходного уро-еня этого показателя. Данные указывают, что изменения АСА липидов печени близки к тем, которые наблюдаются при введении антиокси-дантов е относительно больших дозах (30-100 мг/кг) /БурлакоЕа и др., 1975/. Кроме того, из данных таблицы I /БурлакоЕа и др., 1975/, куда мы поместили и данные наших экспериментов, видно, что эффект действия 1£У полностью сопоставим с действием ионола.

'Габлица I.

Изменения относительной лОА липидов печени мышей через час после

введения препаратов.

Препарат Доза, МГ/КГ £ £ х с ; t/ji/кг ! 1 i A0Aon А0А_ on

Аидинт hklt АОА инт SHi.

30 I i 0,13 i 1,2 -

Ионол 60 I 0,26 i 1,5 -

100 I 0,45 ! 2,2 -

МУ 50 0,025 1 0,01 i 1,15 2,55

Поскольку взаимосвязь АОА липидов и их состава доказана, по крайней мере, на уровне мембран /дристархова и др., 1975; Виг£сь-(г&\га е1~с£., 1979/и не вызывает сомнений роль липидов,особенно Фя в регуляции внутриклеточного метаболизма / Ил-^Сп. , 1970;

ef а19&Э/, было исследовано действие той же дозы ¡3' на содержание и состав £.1 е гсмогенатах печени, селезенок и эритроцитах. Ь таблице 2, е частности, приведены данные по печени через 2-е сут после введения препарата мышам 5НК, у которых МУ оказывал наибольшее воздействие на уровень АОл липидов. 113 таблицы видно,

Таблица 2.

Изменения АОА липидов и состава i'Ji печени мышей ЗНК через 2-е сут после введения препарата. (Фракции даны в %% от суммы ФЛ).

Исследуемый парапет;

Интактные животные

лшвотные с МУ

1. аОа, час-мл/г

2. Сумма iSJi, мг/100 мг лнпиид.

3. лизофосфатидилхолин

4. Сфингомиелин

5. ¿осфатидилхолин

б Оосфатлдилинозит + фос^атидилсерин

7. Оосфатидилэтаноламин

Cj Кардиолипин + фосфатидная кислота

9. ФХ/ОЭ, (JiOiJI/TOSJ;)

3410+1570 8210+820 *

57,5+1,8 61,6+1,2

2,8+0,3 2,4+0,2

4,1+0,3 3,6+0,3

55,5+0,6 49,1+1,4 **

7,4+0,7 11,8+0,4 **

26,9+0,4 29,9+1,7

3,3+0,1 3,2+0,3

2,06 (0,60) 1,64 (0,81)

что 1.1У вызывал изменения состава СЛ, особенно это касалось содержания объединенной фпакиии фосфатидилинозита и фосфатидилсерина. Основные фракции ¿л - фосфатидилхолин (£>л) и фосфатидилэтанолашн ('53) - изменялись под действием препарата в меньшей степени. Следует отметить, что при повышении уроБня AÜA липидов на 2-е сутки снижалось соотношение 5Х/£Э,а отношение более легко окисляемых к более трудно окисляемым фракциям i?Ji Uü£i/T0&i) напротив повышалось. Обнаруженная в гомогенате печени взаимосвязь между уровнем а0а липидов и составом Sil при действии МУ характерна и для действия синтетических антиоксидантов на уровне внутриклеточных мембран /Аристархова и др., 1976/.

На животных двух видов исследовано действие МУ в той же дозе на активность некоторых ферментов антиоксидантной защиты организма. Так, через 4 час после введения препарата в 3,5 раза повышалась активность каталазы и в 2,5 активность СОД в гомогенате печени крыс. Б печени мышей активность СОД менялась е меньшей степени. Это -видно из -рисунка 7, где сопоставлены изменения АОА липидов "й "активности 'СОД в гомогенате печени мышей. Следует выделит! более быструю и выраженную реакцию АОА липидов по сравнению с ферментом. Кроме того, изменения параметра физико-химической системы регуляции nCUi были длительными.

Таким образом, изменения АОА липидов и их состава подтверждают возможность участия МУ в регуляции ПОЛ через физико-химическую систему, а посредством этого и на другие процессы внутриклеточного метаболизма. Ьлияет препарат и на систему ферментов антиоксидантной защиты, однако это действие может быть опосредованным.

300

Рис.7. Влияние МУ (50 мг/кг)

200

на АОА липидов (I) и активность СОД (2) в гомогенате печени мы-

шей SHK.

100

О

5

10

15

По оси абсцисс - время после введения препарата, сут; По оси ординат - значения параметров по отношению к интак-тным животным, %%.

3. Ьлияние МУ на системы регуляции ПОЛ при действии повреждающих

¿акторрр.

Для подтверждения гипотезы о Еедущей роли антиоксидантных свойств препарата в реализации его биологического действия важю было сопоставить лечебный эффект препарата с теми изменениями, которые он вызывает в системах регуляции ПСих. С этой целью иссле-доЕали влияние МУ при действии таких повреждающих факторов, которые приводят к активации свободно-радикального окисления.

Ь частности, исследовали действие МУ в дозах 50 и 2,7 мг/кг, вводимых Енутрибрюшинно, на заживление ожогоеых ран и состояние некоторых параметров физико-химической системы регуляции ПОЛ в тканях, непосредственно ожогом не затронутых. Лечебный эффект такого способа введения препарата проявился в достаточной степени. На рис. ЬА приведены данные по влиянию МУ в дозе 50 мг/кг на уровень АОА липидов печени и эритроцитов через сутки после нанесения ожога. Ьидно, что препарат нормализовал этот показатель, который существенно возрастал у обожженных животных. Препарат также нормализовал состав £Л в печени, а в эритроцитах повышал долю более легко окисляемых фракций ФЛ не только по сравнению с обожженными животными без лечения, но даже по отношению к интакт-ному контролю.

Длительность последействия МУ обнаружена и в условиях патологии. На рис. 8В еидно, что даже через 26 суток после нанесения ожога и введения однократной дозы МУ (2,7 мг/кг) отмечался более еысокий уровень АСА липидов з печени. По-видимому, препарат стимулирует длительные адаптационные сдвиги е системах регуляции ПОЛ е ответ на повреждающий фактор. Это предположение в еще большей степени нашло СБое подтверждение при изучении действия МУ на зки-

(А)

(I)

К МУ

(2) 1

(Б)

Рис.Ь. А. Ьлияние МУ (50 мг/кг)

на уровень АОА липидов печени (I) и эритроцитов (2) крыс через сутки после нанесения ожога.

Б. Влияние МУ (2,7 мг/кг) на уровень АОА липидов печени через 28 сут п/ожога.

оси абсцисс А0Аоп-А0л15НТ ) • Ю'

-3

П

еотных, подвергнутых острому лучевому поражению.

Таблица 3.

Ьлияние МУ (50 мг/кг за сутки до облучения 5,0 Гр) на Екживаемост! мышей ЬАЬЬ и БНК в зависимости от исходного уровня лОА липидов в печени и селезенках.

Линия мышей вывивших особей 1 АОА липидов

Печени Селезенок

ЬАЬВ 1 Контроль ! 0 МУ ! 2,3+3,3 700+В0 -2360+60

БНК ! Контроль ! 32,5+7,4 МУ * 62,5+6,0 *** 4030+1560 -1460+470

ххх - р <0,001

Многочисленные исследования показывают, что радиорезистентность животных определяется в том числе и состоянием систем регуляции ПО)) /Шишкина и др., 1у74; Бурлакова и др., 19В5/. С другой стороны, эффективность действия препарата также зависит от исходного актиоксидантного статуса, по крайней мере, липидов печени. Ь сеязи с этим, исследовано действие МУ в дозе 50 мг/кг, введенного за сутки до облучения б дозе 5,0 гр, на выживаемость мышей в зависимости от исходного антиоксидантного статуса в органах.

75

50

25

О

Контроль

Рис.9. Зависимость выживаемости мышей 5НК, облученных в дозе 5,0 Гр, от времени введения МУ (50 мг/кг) по отношению к моменту облучения.

По оси абсцисс - время;

По оси ординат - % выживших особей

I сут I час '25 2 час До облучения мин После облучения

Ь таблице 3 представлены данные по влиянию МУ на выживаемость мышеП линий ЪлИЬ и 5НК. Ьллно, что менее радиорезистентнке мыши Ьа1ь до оолучения имели более низкие уровни аОа липидов печени и селезенок по сравнению с БНК. МУ, введенный за сутки до облучения существенно повыпал резистентность мышей йНЬ, практически не оказывая влияния на ЬАЬВ. Эти результаты, очевидно, можно угязать с более высоки:.; исходным антиоксидантньы статусом мышей йНК и большей их чувствительностью к препарату (рис.5). Однако у мышей с еще большей выживаемостью в контроле, что косвенно может свидетельствовать об их более высоком антиоксидантном статусе, МУ при введении за сутки до облучения вызыезл некоторый сенсибилизирующий эффект (см. рис. 9). Имеющееся, на первый взгляд, противоречие можно объяснить двухфазностью изменений АОА липидов при введении актиоксидактоЕ в относительно больших дезах и, е том числе МУ. На Ееличину радиозащитного эффекта оказывает влияние фаза снижения уровня АОА липидов, которая тем ниже, чем выше концентрация антиоксиданта /Бурлакова и др., 1975/. Ь данном случае для более радиорезистентных мышей (рис.9), по-видимому, было характерно особенно длительное и значительное снижение аОА липидов, что и приводило к исчезновении радиозацктнего эффекта.

Радисзащитное действие препарата при профилактическом введении (за I час) сменялось мощным сенсибилизирующим эффектом, если МУ вводили через ¿5 мин и 2 часа после облучения (рис.9). Эти данные еще раз убедительно доказывают, что в основе радиомодифици-рующего действия исследуемого препарата лежит его влияние на физико-химическую систему регуляции ПОЛ. Б самом деле, наши результаты хорошо согласуются с известными данными о радиосенсибилизи-рукяцих свойствах актиоксидантов, введенных в первые 2-4 часа после облучения /Бурлакова и др., 1975/. Это связано с тем, что,по-&ц ЗЕЫшение АОА липидов в первые часы после облучения препятствует формированию даК-иембраннсго комплекса, необходимого для репарации поврежденной ДОК /Бурлакова и др., 1975; Шишкина и Бурлакова, 1983/.

Таким образом, взаимосвязь радиомодифицирующих и антиокси-дантньп: свойств МУ подтверждаем' его участие в регуляции процессе в ПС.1! и ьажность исходного состояния систем актнексидантной защиты в реализации биологического эффекта препарата.

Детально изучено действие МУ на некоторые показатели ПОЛ и систем его регуляции в органах жиеотных при таких условиях, когда

-6-

-12-

10

20

(Ь)

30

\

М

Рис. 10. Ьлияние МУ (50 мг/кг за I сутки до облучения в дозе 5,0 Гр) на относительное содержание ТЕК-АГ1 (А), АОА липидов (Б) и активность СОД (Ь) в гомогенате печени мышей БНК.

По оси абсцисс - время после облучения, сут

По оси ординат (а) - ТБл-аЛ0г/ ТБК-дП

инт

По оси ординат (Б) - (а0Аоп-А0Аи • Ю-3.

По оси ординат (Ь) - С0Доп С0\нт

1 - контрольная группа облу-

ченых мышей

2 - облученные мыши с препара

том

Примечание. Органы брали у животных, выжиеших к данному сроку после облучения.

ю

20

30

радиозащитный эффект препарата был достаточно высок (60 %). Данные по влиянию МУ на относительное содержание продуктов ПОЛ, АО)

к активность СОД в гомсгенате печени ^ышей БНК, облученных к доге 5,0 Гр, приведены на рис. 10. Видно-, что на 14-е и 22-е сутки препарат снижал содержание ТБК-аи, МУ нормализовал уровень л0л липидов печени, который существенно снижался в контрольной группе облученных мышей особенно к 32-м суткам. Препарат значительно стимулировал активность СОД в течение первых 2-х недель.

Таким образом, можно выделить следующие особенности радио-модифишрующего действия МУ: I) действие препарата существенно зависит от исходного антиоксидантного статуса животных; 2) Радио-модифицирующее действие МУ зависит от времени его введения по отношению к облучению; 3) Препарат стимулирует активность СОД (возможно это относится и к другим ферментам антиоксидантной защита); 4) МУ модифицирует физико-химическую систему регуляции ПОЛ: снижает уровень АОА липидов в более ранние сроки после облучения, способствуя более полно" репарации Д&., и повышает в последующие, что стимулирует процессы биосинтеза в поврежденных органах и тканях; 5) препарат обладает выраженным и длительны!.! последействием и оказывает наибольшее влияние при облучении Ийпечень, важнейшим орган' поддержания гомеостаза б организме.

Результаты наших исследований и литературные данные обобщенно отражены на гипотетической схеме механизма действия МУ на уровне целостного организма.

шьода

1. Ка метилолеаткой модели и в суспензии изолированных митохондрий показано, что МУ обладает слабыми антиоксидантными свойствами, значительно уступающими синтетическим антиоксидантам и зависящими от условий окисления и концентрации препарата. Обнаружено значительное повышение актиоксидантных свойств МУ б более сложной модели срезов мышечной ткани, в которой по степени ингибиро-вания вторичных продуктов ПОЛ препарат лишь незначительно уступал фенозану К4. Обнаружен эффект усиления ингибиторных сеойств МУ при активации ПОЛ.

2. Б экспериментах 1п в норме показано, что НУ модифицирует физико-химическую и активирует ферментативную системы регуляции ПОЛ. Динамика и масштаб изменений АСА липидов печени за-еисят от исходного уровня этого показателя и аналогичны тем, которые возникают при введении антиоксидантов в относительно больших дозах. МУ влияет на состав и содержание в исследованных органах и тканях. Ь печек:; изменения состава £Л сзаимссвязаны с

б-МЕШУРАЦШ

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ

СИСТЕМА РЕГУЛЯЦИИ

ПОЛ

АОА липидов

состав липидов

витамин Е

витамин С

I ОШЕН НУЮ1ЕОТВДОВ I

I мочевая кислота

МЕТАЛЛЫ \ перемени, валентн.1,

СИСТША ФЕНШТОЬ АНТИОКСДЦАНТОБ

СОД катал аза глютатионпероксидаза

НАДПОЧЕННИКИ1 катехоламины |\

„2+

| фосфолипаза

±

ИНТЕНСИВНОСТЬ ПОД

Физико-химические свойства и функциональная активность мембран клеток, тканей и органов

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ

ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ США МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ 6-МЕШУРАЦША НА УРОШЕ ЦЕНОСТНОГО ОРГАНИЗМА

уровнем АОа липидов таким же образом, как и при введении синтетических антиоксидантоЕ. Ьлияние препарата на уровень АОА липидов ео всех органах и тканях характеризуется длительны/ последействием.

3. Обнаружено терапевтическое действие однократной внутри-брюшинной дозы 1ДУ на заживление ожоговых ран, которое проявляется также в нормализации уровня АОА липидов и их состава в печени и эритроцитах.

4. Показано, что радиомодифицирующее действие препарата существенно зависит от времени его введения по отношению к облучению и от исходного антиоксидантного статуса липидов ОРГЛНС& •Животных. 3 основе радиозащитного действия МУ лежит нормализация физико-химической системы регуляции ПОЛ и активация активности СОД в печени и эритроцитах животных. Обнаружена длительность последействия препарата и в условиях патологии. МУ не влиял на степень выраженности лейкопении облученных мышей.

5. Совокупность проведенных исследований позволяет с определенной уверенностью утверждать, что одной из основ биологической, эффективности МУ является его участие в регуляции систем антиок-сидантной защиты организма. При этом надо отметить, что являясь относительно слабым антиоксидантом е модельных системах, МУ оказывает воздействие на внутриклеточный метаболизм, сравнимое по масштабам и дозам с синтетическими актиоксидантами. Однако, по-видимому, выраженность изменений параметров систем регуляции ПСй при введении МУ в большей степени зависит от их исходного состояния, чем при введении в организм эффективных антиоксидантов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЫЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шишкина Л.Н., Таран Ю.П., Елисеева C.B., Булгаков В.Г. Влияние 6-метилураиила на окислительные реакции в модельных системах различной степени сложности. // Изв. Академии Наук, сер. биол., 1992. -КЗ. - С. 350-357.

2. Таран Ю.П., Шишкина JI.H. Антиоксидантные свойства 6-ме-тилурацила в системах ин витро и ин виво. /'/ Тез. докл. 1У конф. "Биоантиоксидант", 2-4 июня 1992, M., T.I, С. 104-105.

3. Таран Ю.П., Шишкина Л.Н. Влияние 6-метилурашла на некоторые показатели системы регуляции пероксидного окисления липидов в организме. // Вопр. мед химии, 1993. - Т.39. - И.- С. 37-41.

4. Таран ii.Il., Шишкина Л.Н. Исследование противолучевого действия 6-метилурацила // Радиобиология, 1993. - Т.33. - Ьып. 2.

Тираз 100 экз.