Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитологическая характеристика эпителиальной клеточной культуры MDCK (Madine-Darby Canine kidney cells) с использованием новых биосенсоров

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Цитологическая характеристика эпителиальной клеточной культуры MDCK (Madine-Darby Canine kidney cells) с использованием новых биосенсоров"

На правах рукописи

БОЛАЕВА КЕРМЕН ВАЛЕРИЕВНА

«Цитологическая характеристика эпителиальной клеточной культуры MDCK (Madine-Darby Canine kidney cells) с использованием новых

биосенсоров»

03.03.04 - клеточная биология, цитология и гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 1 OKI 2013

Астрахань - 2013

005536487

Работа выполнена на кафедре химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Калмыцкий государственный университет» Министерства образования и науки РФ. |

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Алтуфьев Юрий Владимирович ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет», кафедра физиологии и морфологии человека и животных.

Официальные оппоненты: Сентюрова Людмила Георгиевна,

доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздрава России, зав. кафедрой медицинской биологии;

Федорова Надежда Николаевна,

доктор медицинских наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный технический университет», кафедра гидробиологии и общей биологии.

Ведущая организация: ФГАОУ ВПО «Южный федеральный

университет»

Защита состоится «23» ноября 2013 года в 10-00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу: 414000, г.Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

Автореферат разослан« » • 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Классические методы биохимии v и молекулярной биологии активно развиваются, но из-за достижения ими предела чувствительности и усложнения протокола все более актуальной задачей становится создание новых оригинальных биосенсорных систем и молекулярных биосенсоров и разработка стандартизованных методик их использования (Staagengaard et al. 2008; Heiskanen et al. 2010). Принципиально новый подход к изучению живых систем, с использованием кварцевых пьезокристаллов, описанный в представленной работе, позволяет изучать клеточные культуры в режиме реального времени без разрушения объекта исследования при высокой чувствительности.

Эпителиальная клеточная культура MDCK (Madine-Darby canine kidney cells) широко используется различными исследователями в качестве модельной системы эпителиальных тканей (Горшков, 2009; Madine and Darby, 1965; Ridley et al., 1995).

Важно было исследовать клеточную культуру не статично, а в динамике биохимического процесса, который может быть вызван действием химических реагентов, таких как гепатоцитный ростовой фактор (HGF) и блеомицин. In vivo сигнальный путь HGF/c-Met играет важную роль в эмбриогенезе, ангиогенезе (процессе формирования новых кровеносных капилляров), регенерации органов и образовании раковых опухолей (Schmidt et al., 1995; Uehara et al., 1995). Блеомицин — гликопептид обладающий антиопухолевыми свойствами (Ortiz et al,. 1998), эффект блеомицина на ДНК связывают с началом процесса апоптоза (Hagimoto et al., 1997). Механизм его цитотоксического действия связан со способностью инициировать фрагментацию молекул ДНК, нарушение ее спиралевидной структуры, торможение деления клетки, оксидативный окислительному стрессу, воздействующему на митохондрии и последующий апоптоз (Yanamadala et al., 2007; Larkin et al., 2008; Kawanishe et al., 2007; Umezawa, 1974). Исходя из всего вышеперечисленного, блеомицин является перспективным реагентом для инициации апоптоза в MDCK клетках.

Блеомицин и HGF участвуют в биохимических процессах, являющихся центральными при изучении онкогенеза, что и определило их выбор для исследования динамических процессов, которым подвергается клеточная культура MDCK. С другой стороны, в последние годы широко изучается белок карбоксиангидраза-9 (CAIX), потенциальный маркер на наличие гипоксийных опухолей в организме. Известно, что гипоксийные состояния тканей сопровождаются снижением значения рН. Поэтому в работе была изучена зависимость цитоплазматического рН от кислородного режима культивации и уровня CAIX.

Благодаря активизации CAIX, кислотность цитоплазмы повышается до физиологически нормальной, в то же время избыток протонов понижает кислотность межклеточной среды, что снижает жизнеспособность окружающих опухоль здоровых тканей и вызывает в них механические разрывы, позволяя раковой опухоли развиваться. Было также показано (Svastova et al., 2007), что CAIX параллельно снижает клеточную адгезию Е-кадгерина, что способствует увеличению миграции клеток и увеличению образования метастазов.

Повышенное содержание CAIX также связывают с плохим прогнозом выживания пациентов, и высоким уровнем вероятности образования метастазов (Pastorekova et al., 2008; Pastorekova and Zavada, 2004; Pastorek et al., 2008; Chiche et al., 2009).

Таким образом, поиск и разработка методологии изучения клеточной культуры клеток MDCK является крайне актуальной темой современной онкологии, над которой работают многочисленные коллективы.

СТЕПЕНЬ РАЗРАБОТАННОСТИ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ характеризуется недостаточной изученностью методик, которые могли бы дать адекватную цитологическую характеристику в условиях in vitro. Несмотря на то, что существует большое количество разнообразных биосенсоров, лишь малая часть из них представляет собой проточные циркулирующие системы, которые являются наиболее перспективными для исследования клеточных культур (Staagengaard et al., 2008). В литературе отсутствуют сведения о биосенсорных системах, где принцип проточной системы комбинируется со встраиваемыми кварцевыми пьезокристаллами. Кроме того, выбор эпителиальной клеточной культуры MDCK в качестве объекта исследований определялся ее крайней неизученностью, хотя известно, что именно для клеток такого происхождения проблема влияния механического стресса наиболее актуальна.

Калориметрические биосенсоры, к которым относится SNARF-1 являются малоизученным типом биосенсоров. Кроме того, наш интерес привлекла группа молекулярных биосенсоров, в частности SNARF-1. Биосенсоров такого типа известно сравнительно мало, при этом по разным причинам их потенциал не используется до конца. На сегодняшний день отсутствует стандартизованная методика определения активности белка CAIX в клетках.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Разработать стандартизованные протоколы использования проточной циркулирующей биосенсорной системы на основе кварцевого пьезокристалла и измерения цитоплазматического рН.

2. Установить закономерности опухолевых процессов на культуре MDCK (Madine-Darby canine kidney cells.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Разработать стандартизованную методику использования новой впервые сконструированной проточной биосерсорной системы на основе кварцевого пьезокристалла для культивации и описания клеточной культуры MDCK.

2. Разработать стандартизованную методику определения цитоплазматического рН в клетках MDCK при помощи молекулярного биосенора SNARF-1.

3. Дать характеристику некоторых цитологических показателей клеточной культуры во время процесса адгезии клеток MDCK на поверхности

пьезокристалла, процесса блеомицин-индуцированного апоптоза и процесса движения клеток под воздействием гепатоцитного ростового фактора.

4. Сопоставить изменения клеточной культуры MDCK во время процессов адгезии, апоптоза и передвижения в условиях стандартного клеточного инкубатора и проточной биосенсорной системы.

5. Оценить влияние механического стресса, создаваемого током жидкости через микрореактор биосенсорной системы на выживание и морфологию клеточной культуры MDCK.

6. Исследовать активность белка карбоксиангидразы-9, как показателя степени выживаемости раковых клеток при помощи измерения цитоплазматического рН.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ.

В данной работе впервые с использованием оригинальной стандартизованной методики исследованы процессы адгезии, пролиферации, апоптоза на примере клеточной культуры MDCK. Цитологические изменения были описаны при помощи оптической микроскопии и импеданс спектрометрии в условиях циркулирующей проточной биосенсорной системы на основе пьезокристалла.

Впервые были сопоставлены изменения, происходящие с клеточной культурой MDCK в условиях стандартного клеточного инкубатора и в условиях циркулирующей проточной биосенсорной системы.

Работа вносит значительный вклад в изучение влияния механического стресса на развитие клеточной культуры MDCK и на такие биологические процессы как адгезия, апоптоз и движение клеток.

Впервые была разработана и использована стандартизованная методика определения цитоплазматического рН в трансфектантах клеточной культуры MDCK. При этом впервые значение цитоплазматического рН использовали для определения активности белка карбоксиангидразы-9 на примере клеток MDCK в условиях кислородного голодания и в присутствии ингибиторов белка карбоксиангидразы-9.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Результаты исследования позволяют в дальнейшем расширить использование биосенсорных проточных систем на основе кварцевого кристалла для исследования цитологических параметров различных клеточных культур. Особенно это актуально для исследования клеточных культур, которые in vivo подвергаются постоянному механическому стрессу со стороны физиологических жидкостей, в то время как в условиях стандартного клеточного инкубатора полностью отсутствует данный элемент моделирования условий.

Результаты исследования носят инновационных характер и могут быть внедрены в цитологическую практику для изучения опухолевых клеточных культур в режиме онлайн, без разрушения клеток.

Предложенная методика может быть использована для экспресс-анализа влияния химических веществ на цитологические показатели эпителиальных

клеточных культур.

При помощи разработанной методики определения активности белка

карбоксиангидразы-9, являющегося потенциальным онкогенным маркером,

возможно оценивать противоопухолевый потенциал различных химическим

веществ. „ _

Кроме того, материалы диссертации включены в курс лекции по биохимии

и молекулярной биологии, для студентов-биологов факультета педагогического

образования и биологии Калмыцкого государственного университета.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1 Процессы, включающие в себя перестройку цитоскелета клеточной культуры MDCK могут быть охарактеризованы при помощи биосенсорнои

системы на основе пьезокристалла.

2 В результате взаимодействия клеточной культуры MUCK, с блеомицином происходит изменение жесткости мембраны, что вызывает открепление клетки от субстрата, и, следовательно, повышение значения сигнала. Одновременно происходит изменение формы клеток, характерное для

процесса апоптоза.

3. Гепатоцитный ростовой фактор оказывает влияние на процессы

адгезии клеточной культуры MDCK.

4 Изменения в клетках MDCK под воздействием блеомицина и гепатоцитного ростового фактора в условиях как проточной биосенсорнои системы так и в условиях стандартного клеточного инкубатора на поверхности чашек Петри носят однонаправленный характер.

5 Значение цитоплазматического рН клеток MDCK находится в зависимости от концентрации кислорода, а также от присутствия белка карбоксиангидразы-9.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы доложены и обсуждены:

на 9-й Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук и возможности трансляционной медицины в решении актуальных проблем здравоохранения», Астрахань 2013 г; на онлаин-конференции «Биотехнология: взгляд в будущее», Казань, 2013 г; на межрегиональной конференции Калмыцкого государственного университета, Элиста 2012 г; международной конференции Eurosensors 2009, Лозанна, Швейцария, 2009; международной конференции IEEE Sensors, Лечче, Италия, 2008; Международной конференции Eurosensors 2008, Дрезден, Германия, 2008.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 156 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследовании, глав собственных исследований, обсуждения, выводов, научно-практических

рекомендаций и списка использованной литературы. Указатель литературы включает в себя 160 иностранных и 23 отечественных источника. Приложения включают в себя 127 рисунков и диаграмм, 1 таблицу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа представляет собой экспериментальное исследование, выполненное с использованием оригинальной биосенсорной системы, клеточной культуры MDCK и ее трансфектантов, методов оптической и флуоресцентной микроскопии, калориметрических методов.

Материалом исследования служила клеточная культура MDCK (Madin Darby canine kidney cells) Tet-Off Cell Line, тип II (Y.Altschuler&K.Mostov, U.C. San Francisco) характеризуются экспрессией контролируемого тетрациклином трансактиватора (tTA). Система с высокой экспрессией гена, которая получается трансфекцией стабильной клеточной линии, при помощи плазмиды, производящей интересующий ген, под контролем соответствующей TRE (Tet response element). Трансфектанты MDCK-MN и MDCK-neo, были получены котрансфекцией MDCK при помощи pSG5C-MN плазмиды содержащей человеческую MNCA9 cDNA или негативный контроль pSV2neo (Svastova et al., 2003; Pasorek et al., 1994).

Клетки культивировались в DMEM (Dubecco's Modified Eagle Medium) медиуме, с добавлением 10% (объем) питательного серума FC S (Fetal Calf Serum), 1% (объем) смеси пенициллина и стрептомицина (100 юнитов и 0,1 мг соответственно) (все Sigma), - далее «стандартный питательный медиум». В отдельных экспериментах добавляли 10 мМ HEPES. Клеточная культура высаживалась в пластиковые чашки Петри. Все типы чашек Петри инкубировались в стандартном клеточном инкубаторе. В случае если эксперименты проводились в условиях кислородного голодания, через 24 ч после формирования конфлуэнтного слоя для клеток создавались условия гипоксии при помощи Ñapeo 7000 инкубаторе (2% 02, 5% С02, сбалансированные N2) на 48 ч или 24 ч.

Экспериментальные исследования проводились в 4 вариантах по 3 повторам.

В работе использовалась оригинальная биосенсорная система с 4 вмонтированными кварцевыми пьезокристаллми диаметром 8 мм, биореактор выполнен из полипропилена. Условия, создаваемые для клеточной культуры: 37°С, давление 0,6 бар. Такие параметры как плотность клеточной суспензии и скорость подачи питательного медиума варьировали.

Части системы были соединены друг с другом пластиковыми микрокапиллярами с радиусом 0,5 и 0,8 мм. Для получения данных от кварцевого резонатора использования импеданс анализатор Agilent4395A FIA Agilentmaster с системой настройки 43961А. Для поддержания постоянной температуры использовали Burster Kelvimat 4322, Julabo НЕ (модель F32). Для контроля температуры внутри термоизолирующего кожуха использовали температурный сенсор типа Pt 100, класса В. Пьезокристалл, покрытый золотом, присоединялся к импеданс анализатору при помощи двух электродов.

Клеточная культура MDCK культивировалась в биосенсорной системе как было описано (Болаева, 2013).

В течение всего хода эксперимента каждую минуту при помощи конфокального микроскопа, фиксировали состояние поверхности кварцевого кристалла с культивируемыми на его поверхности клетками. Результаты взаимодействия клеточной культуры с пьезокристаллом представляли в виде диаграмм изменения величин fnlax и Gmax, чей спектр фиксировался каждую минуту в течение всего эксперимента.

Для инициации апоптоза в клетках MDCK при помощи блеомицина в условиях биосенсорной системы и чашек Петри использовали стандартизованную методику (Болаева, 2013).

Для стимуляции гепатоцитным ростовым фактором использовали стандартизованную методику (Jacobs et al., 2008). Для создания механического стресса от перемешивания жидкости использовали шейкер.

Молекулярный сенсор SNARF-1 использовали для определения цитоплазматического pHi MDCK-MN, MDCK-neo в режимах гипоксии и нормоксии.

Измерение pHi проводили после 48 часовой реакции MDCK-MN, MDCK-neo с ингибиторами карбоксиангидразы-9, или после реакции клеток с гомосульфанил амидом с использованием эфира карбокси-семинафторода-флуор-1 -ацетоксиметила (SNARF-1) (Invitrogen, Carsbad, СА). Надосадочная жидкость удалялась из чашек Петри, и клетки инкубировались в буферном растворе А, с растворенным в нем в концентрации ЮцМ SNARF-1 в течение 15 мин при 37°С без доступа света (300 мкл буферного раствора А в чашке Петри). После инкубации, клетки трижды промывались PBS, добавлялся буферный раствор А, и измерялось поглощение флуоресценции при ext/em = 514/580, 514/640. Для определения pHi отношение значения флуоресценции при 514/580 к значению флуоресценции 514/640 соотносили к калибровочной кривой.

Для получения значений рН использовали калибровку при помощи нигерицина. К клеткам добавлялся SNARF-1 аналогично описанной выше процедуре, потом клетки трижды промывались PBS и добавлялся калибровочный буфер при рН 6,4; 6,8; 7; 7,4; 7,8; 8, содержащий 10 цМ нигерицин и 100 мМ КС1, после инкубации в течение 7 минут измерялось значение флуоресценции при ext/em = 514/580, 514/640. На основании полученных данных строился калибровочный график. Благодаря нигерицину выравнивалось рН внутри и снаружи клетки, и в предположении о том, что мы знаем рН калибровочного буфера при заданной температуре, можно использовать калибровочный график для вычисления измеряемых рН.

Полученные значение обрабатывали при помощи стандартного пакета прикладных программ STATISTICA 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Адгезия клеток.

Для изучения процесса адгезии клетки MDCK высаживались на поверхность кварцевого кристалла. Как видно из рис.1 сразу после помещения суспензии в биореактор клетки имеют округлую форму, через 10 мин 16 клеток, видимых на поверхности, увеличивают свою адгезивную площадь и начинают присоединяться к поверхности кристалла. Через 20, 60, 80 и 100 мин после высаживания клеток количество адгезированных клеток уменьшилось. На рис.2, и рис.3 видно, что, проанализировав подвижность группы из 7 клеток в течение первых 100 мин, мы делаем вывод о том, что амплитуда движения

отдельных клеток достигает 100 нм.

Сравнивая данные оптической микроскопии с изменениями сигнала импеданс-анализатора, присоединенного к кварцевому пьезокристаллу (рис. 4), сделали вывод о том, что плато, наблюдаемое в начале эксперимента (Fres = 9 93* 106 Gmax= 1,73*10'3), которое соответствовало пропусканию питательного медиума через систему с постоянной скоростью 0,25 мл/час, в течение 26 мин следующих за добавлением клеточной суспензии сменялось падением сигнала обеих рассматриваемых величин. Fres изменялась на 200 Hz, a Gmax на 0,03 S. Очевидно, падение сигнала происходит на первом этапе за счет изменения массы клеток, осаждающихся на поверхность кристалла, а на втором этапе, объясняется процессом адгезии клеток на поверхность кристалла (Jacobs et al., 2007).

Очевидно, что адгезия клеток вызывает изменение резонансной частоты кварцевого резонатора в сторону уменьшения. После того как клетки адгезировались, начинается процесс пролиферации, который успешно идет при скорости потока питательного медиума 0,25 мл в час при температуре 37°С и давлении 0,6 бар и сопровождается дальнейшим уменьшением значений резонансной частоты и кондуктивного максимума.

Взаимодействие с блеомицином.

В результате воздействия на клетки, культивируемые в биореакторе в течение 16 ч блеомицина, как видно из рис.5, через 2,5 ч клетки начинали менять форму, на их поверхности появлялись апоптозные пузырьки, их форма становилась более очерченной благодаря меньшему примыканию к поверхности биосенсора. Через 6 ч количество клеток не менялось, но клетки становились более продолговатыми и количество апоптозных пузырьков увеличивалось. Через 20 ч после добавления блеомицина клетки оставались адгезированными к поверхности, но по периметру каждой из клеток наблюдалось повторение контуров клетки апоптозными пузырьками. В промежуток времени от 20 ч до 30 ч внешний вид и количество клеток на поверхности оставались неизменными. На рис.6 показано изменение сигнала импеданс-анализатора: после добавления блеомицина в концентрации 100 мЮ/мл характер снижения величины сигнала пролиферационной кривой не менялся в течение часа, далее наблюдалось падение сдвига резонансной частоты на 100 Гц в течение 1,5 ч, и постепенный рост в течение следующих 3,5 ч. Ответ сигнала от пьезокристалла свидетельствовал о влиянии блеомицина на

вискоэластичные свойства клеток и слоя окружающей их жидкости. После прекращения пропускания блеомицина через камеру, вид кривой возвращался к виду, который наблюдался до добавления реагента. Также наблюдались изменения кондуктивного максимума - во время пропускания блеомицина наблюдался рост значений от -3 до 0, который сопровождался резким падением после завершения стимуляции блеомицином. Мы не наблюдали различий между клеточным ответом в 4 параллельных микрореакторах биочипа.

Взаимодействие с гепатоцитным ростовым фактором.

Зависимость параметров кварцевого пьезокристалла от состояния клеточной культуры в результате стимуляции клеток, культивируемых в биосенсорной системе гепатоцитным ростовым фактором представлена на рис. 7. Видно, что после добавления ростового фактора наблюдались следующее изменение сигнала: падение с 9982810 до 9982790 в течение 150 мин и далее рост до 9982910 в течение следующих 180 мин. Таким образом можно говорить том, что описанное в литературе поведение клеток - а именно увеличение адгезивной поверхности на первом этапе за которым следует образование ламеллоподий и уменьшение адгезивной поверхности нашли свое отражение в эксперименте в условиях проточной циркулирующей биосенсорной системы.

Эксперимент, в котором клеточный монослой не завершен, позволил отследить передвижение клеток, и сравнить результаты с экспериментами на поверхности чашки Петри, как это показано на рис. 8. Был сделан вывод о том, что в случае биосенсорной системы не происходило расхождение клеток от других клеток колонии. Видно, что количество клеток в случае биореактора увеличилось через 6 ч, 20 ч, однако морфология клеток не изменилась и расхождение клеток друг от друга не произошло, как это наблюдалось для параллельного эксперимента на поверхности чашки Петри.

Влияние механического стресса, создаваемого током жидкости на выживание и цито-морфологические свойства MDCK клеток, культивируемых в биореакторе.

Использование проточных биосенсорных систем для культивации и исследования клеточных культур неотъемлемо связано с пониманием влияния механического стресса на биохимические процессы в эпителиальных клеточных культурах. На рис. 10 сравнивалось, как различается внешний вид клеток, в случае культивации в отсутствие механического стресса на поверхности кварцевого кристалла, покрытого золотом и на поверхности чашки Петри. В обоих случаях клетки компактно были упакованы в колонии. Лишь отдельные клетки по краям колонии имели зачатки ламеллоподий.

Изменения морфологии клеток, культивируемых в условиях проточной циркулирующей системы в течение 20 ч, сопоставили с изменениями в параллельном эксперименте, где клетки культивировались на поверхности чашки Петри в течение 20 ч и затем подвергались механическому стрессу в течение 4 ч. Был сделан вывод о том, что конструкция биоректора, скорость тока жидкости и тип поверхности на которой культивировались клетки, оказывают влияние на морфологию и подвижность клеток.

«

,<5Ь

ч ,,

г о

• * ■»> ч

л 1

I 4 'Л ' Л

I Ч ^ » > ,

я :

Ич

I

Рис I М1УСК клетки, высаженные в концентрации 200000 клето« в мл суспензии в течение первых черо 0.10,20,60,80,100 мин Итмеритель - 400 рм

I ^ 9 4 «

с —

Рис 2 МГХГК клетки черет 0. 10.20, 60, 80. 100 мин после высаживании на поверхности квариеною кристалла Измеритель - 200 цм

I. 1С— я—

ТЕ

1*1Им* А

т

Г"

Рис 3 Расположение клеток через 0. 10, 20. 60, 80, 100 мин после высаживания Траектории движения клеток МОСК. культивируемых на поверхности биореаюора А-Д - индивидуальные клетки колонии в ратных временных точках

Рис 4 Изменение рскмвшсиоИ частот ни »ре»» процессов алгети, пролиферации. клеточного юлодаиия в отсутствии питательного серума и деадгони клеток МРСК

Рис 5. Клеточная культура MDCK-II в мнкрореакторе во врем« пролиферации н после введения блеомиинпа (100 мК) мл) A. с ра гу после введения клеток ■ биореактор и начала культнванцнн клето«, Б 5 ч послс начала культивации. В 16 ч после начала культи«ации. добавление блсомицииа. Г 2.5 ч нос. к: добавления блсомицина. Д 6 ч после добавления блеомицина. К 20 ч после л оба ».тени» блсомицина И мертель • 2S0 |iu

Рис 6 Итмснснкс сдвига реюнансной частоты (Fres) н конлуктианото максимума (Gmax) ■ 4 бнореакторах

(QCR1-QCR-«)

Freí

Рис 7 График изменения реюнансной частоты (Fres) и кондуктмвного максимума (Отах) в эксперименте по таимолеАствию клеток с гспатпиитиим ростовым

фактором

■ >ч in I —-----

!

Рнс 10 MDCK-II клетки к\.тьтивирмотся • биорсакторе. одновременно живые клетки светатс» в

на поверхности пьетосристалла (1.2), на кленом флуоресцентном свете, мертвые в красном

поверхности пластиковой чашки Петри Ипкршсль- 120 jim

(3.4). ■ условиях механического стресса в

течение 20 ч (2). механического стресса ■

течение 4 ч после 20 ч культивации (4). и а

отсутствии механического стресса в течение

24 ч (1,3) Итмеритель - 150 цм

> « о.«в

тоскчы

Рис II Значения цнтоолаз-т.^коп, рН . мспсп МОСК-МЫ и МОСК-пео.

помощи ЗМАШЧ. после культинанин в режиме нормального и помикмюго содержит« кислорода

• Р< 0,05 (и-*ригсрий)

Сравнивая клетки, культивируемые на поверхности одного типа, можно отметить следующие сходные черты, проявляющиеся в клетках под воздействием механического стресса: клетки расходятся друг от друга, у них появляются ламеллоподии, форма клеток становится более вытянутая.

На рис 9 представлено количество погибших клеток в монослое после культивации клеток в течение 5. 20, 24 ч. Видно, что, несмотря на то, что механический стресс, создаваемый током жидкости, характер материалов, и состав питательного медиума влияют на появление некрозных клеток, данные условия не являются критичным для возможности культивации клеточной культуры в биосенсорной системе. Наличие некрозных клеток в любом монослое том числе не подвергающегося механическому стрессу клеток являстся.

и<*ппп1лование молекупяпного бносенсора ИХА!^-! для измерения

пи-топлазматнческого рП трансфекщ1т0н1^^

Результаты измерения рН показали (рис.11), что в условиях пониженного содержания кислорода наблюдается понижение иитоплазматического рН. по сравнению с культивацией в нормальных условиях. Также можно отметить что в случае гипоксии рН МЭСК-пео ниже, чем \1DCK-MN, этот факт согласуется предполагаемой ролью белка карбоксиангидразы-9 в поддержании физиологического значения рН в условиях недостатка кислорода.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований разработаны оригинальные стандартизованные методики описания клеточной культуры МПСК при помощи двух различных биосенсоров, основанных на принципах морфометрнчсского измерения. При помощи разработанных методик была изучена эпителиальная клеточная культура МОСК. Было показано, что конструкция оригинальной проточной бносенсорной системы со встроенным пьезокристаллом позволяет минимизировать механический стресс, создаваемый током жидкости, и позволяет эпителиальным клеткам сохранять свои свойства.

выводы

1. Разработан оригинальный стандартизованный метод биосенсорной системы на основе пьезокристалла позволяющий обеспечить выживание и пролиферацию клеток MDCK: плотность сажаемой клеточной суспензии - 400 тыс. клеток в мл, время посадки — 2 мин, состав питательного медиума — 10% FCS, 1% пенициллина/стрептомицина, отсутствие HEPES, скорость потока питательного медиума 0,25 мл в час.

2. Разработан оригинальный стандартизованный метод с применением молекулярного биосенсора SNARF-1, позволяющий получить сопоставимые с описанными в литературе результаты: калибровка с использованием буферов с заданными значениями рН и нигерицина в концентрации 4% (по объему), измерение сдвига флуоресцентного поглощения, определяемого значением цитоплазматического рН в соответствии с методикой.

3. Показано, что в течение первых 180 мин после высаживания клеточной суспензии, одновременно с процессом адгезии происходит активное передвижение клеток MDCK по поверхности субстрата по описанной нами траектории. Расстояние, на которое может перемещаться отдельная клетка, достигает 100 нм.

4. После 5-часовой стимуляции клеток MDCK блеомицином в проточной биосенсорной системе наблюдается падение сигнала резонансной частоты импеданс-анализатора, соединенного с пьезокристаллом в интервале от 20 до 120 Гц. Через 2,5 ч происходит изменение формы клеток, через 6 ч — увеличение количества апоптозных пузырьков, располагающихся по периметру каждй клетки. Через 20 ч клеточные колонии распадаются на отдельные клетки, происходит уменьшение клеточного объема.

5. В результате взаимодействия клеток MDCK с гепатоцитным ростовым фактором наблюдается увеличение адгезивной площади клеток, что может быть прослежено по падению сигнала резонансной частоты импеданс-анализатора на 20 Гц в течение 300 мин после начала стимуляции. В течение следующих 325 мин наблюдается повышение резонансной частоты на 110 Гц. Данные оптической микроскопии показывают, что клетки приобретают вытянутую форму через 6 ч после начала стимуляции.

6. Изучение блеомицин-индуцированного апоптоза продемонстрировало аналогичные изменения в клетках MDCK, культивируемых как в условиях проточной биосенсорной системы, так и в условиях стандартного клеточного инкубатора на поверхности чашек Петри. В то время как стимуляция клеток гепатоцитным ростовым фактором в изучаемых условиях вызывает различную подвижность клеток.

7. Механический стресс, создаваемый током жидкости через биореактор, приводит к изменению формы клеток, что, однако, не является критическим фактором для роста и развития клеточной культуры.

8. Значение цитоплазматического рН клеток MDCK находится в зависимости от концентрации кислорода, а также от присутствия белка карбоксиангидразы-9. В режиме гипоксии величина цитоплазматического рН

клеток MDCK-MN составила 7,73 что на 0,21 ниже аналогичного значения в режиме нормального содержания кислорода. Для MDCK-neo эта разница составила 0,30 с величиной значения цитоплазматического рН клеток в режиме гипоксии 7,67.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Использование в цикле лекций по общей цитологии, гистологии и эмбриологии.

2. Методика изучения адгезивной способности клеток может быть предложена в медицинской практике для экспериментальной работы в плане проверки возможности использования цитостатиков при исследованиях онкологических заболеваний.

3. Методика определения активности карбоксиангидразы-9 может быть применена во время поиска новых антиопухолевых препаратов, ингибирующих действие карбоксиангидразы-9.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Jacobs Т, Bolaeva К, Kahne Т, Naumann М, Hauptmann P. Real-time analysis of hepatocyte growth factor induced cell motility with quartz crystal resonators. Proc. 7th IEEE Sensors Conference 2008. - pp 246-249.

2. Jacobs, G. Cama, K. Bolaeva, M. Naumann, P. Hauptmann. Impact of flow-through regime on the cultivation of epithelial cells on quartz crystal resonators in micro fluidic channels. Procedia Chemistiy 1 (2009), pp. 365-368

3. G. Cama, K. Bolaeva, T. Jacobs, M. Hartmann, S. Hirsch, M. Naumann, P. Hauptmann. Influence of statistical variations in cell distribution on the proliferation kinetics of Madin-Darby canine kidney cells on quartz crystal resonator. Procedia

Chemistry 1 (2009), pp. 373-376 .

4 T Jacobs T, Bolaeva K, Kahne T, Naumann M, Hauptmann P. Online adhesion analysis of hepatocyte growth factor stimulated cells with resonant biosensor. Proceedings of the XXII Eurosensors Conference (2008), pp 1185-1188.

5. Болаева K.B. Оптимизация метода использования биочипа на основе кварцевого пьезокристалла для онлайн анализа клеточной культуры MDCK-II // Материалы межрегиональной конференции «Актуальные проблемы современной химии», 12-14 мая 2012. - С. 120-125.

6. Болаева, К.В. Цитологическое описание клеточной культуры MDCK-II (Madine-Darby canine kidney cells) в различных стадиях апоптоза при помощи биосенсора на основе кварцевого кристалла // Естественные науки. - 2013. - № 3. С. 61-74.

7. Болаева, К.В. Настинова Г.Э. Изучение влияния ароматических сульфонамидов, потенциальных ингибиторов карбоксиангидразы-9 на жизнеспособность и уровень кислотности цитоплазмы клеток MDCK (Madine-Darby canine kidney cells) // Естественные науки. - 2013. - № 3. С. 75-85.

8. Болаева, К.В. Цитологическая характеристика изменений, происходящих с клеточной культурой MDCK-II под воздействием гепатоцитного ростового

фактора в условиях механического стресса // Материалы онлайн-конференции «Биотехнология: взгляд в будущее», 12-14 апреля 2013. — С. 120-125.

9. Болаева, К.В. Изучение эффективности ингибирования карбоксиангидразы-9 - потенциального биомаркера на наличие опухолей, развивающихся при недостатке кислорода // Материалы 9 международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук и возможности трансляционной медицины в решении актуальных проблем практического здравоохранения», 6-8 мая 2013. — С. 37-42.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

1. MDCK (Madine-Darby Canine kidney cells) - эпителиальная культура протоков печени женской особи спаниеля;

2. MDCK-MN - клеточная культура MDCK, стабильно производящая человеческий белок карбоксиангидраза-9;

3. MDCK-neo - клеточная культура MDCK, не производящая человеческий белок карбоксиангидраза-9;

4. HEPES (4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтаносульфоновая кислота)-буферный раствор;

5. FCS (Fetal calf serum) - питательный состав для клеточных культур.

Подписано к печати 15.10.2013 Заказ 2268. Тираж 90 экз.

_ __ Усл. печ. л. 1,0

Издательство Калмыцкого государственного университета 358000, г.Элиста, ул.Пушкина, 11

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Болаева, Кермен Валериевна, Астрахань

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ АСТРАХАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

04201452545 На пРавах Рукописи

Болаева Кермен Валериевна

Цитологическая характеристика эпителиальной клеточной культуры MDCK (Madine-Darby Canine kidney cells) с использованием новых

биосенсоров

Специальность 03.03.04 Клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -д.б.н., проф. Алтуфьев Ю.В.

Астрахань - 2013

Содержание работы

стр.

Введение 4-11

Глава I. Обзор литературы 11-62

1.1. Биологическая характеристика клеточной культуры MDCK и ее 11-15 трансфекгантов

1.2. Биосенсоры, их применение в сочетании с методами микроскопии для 15-38 цитологической характеристики живых клеточных культур

1.3. Процессы, вызывающие перестройку цитоскелета эпителиальных клеток и 38-41 привлечение биосенсоров для их описания

1.4.1. Изменения цитоскелета под воздействием гепатоцитного ростового 41-45 фактора

1.4.2. Перспективы исследования процесса апоптоза при помощи биосенсоров 45-53

1.5. Использование молекулярного биосенсора SNARF-1 для измерения 53-59 цитоплазматического рН в живых клеточных культурах как метод изучения активности карбоксиангидразы-9

1.6. Биологическое значение механического стресса для клеточных культур и его 59-62 влияние на биохимические процессы

1.7. Заключение 62 Глава II. Материалы и методы 63-78

11.1. Культивация эпителиальной клеточной культуры MDCK и ее 63-65 трансфекгантов в условиях клеточного инкубатора

11.2. Культивация эпителиального клеточной культуры MDCK в условиях 65-70 проточной биосенсорной системы

11.3. Метод оптической и флуоресцентной микроскопии 70-72

11.4. Инициирование апоптоза в клетках MDCK при помощи блеомицина 72-73

11.5. Стимулирование клеток MDCK при помощи гепатоцитного ростового 73-74 фактора

11.6. Использование молекулярного сенсора SNARF-1 для определения 75-78 цитоплазматического рН

Приложение 1 79-83

Глава III. Цитологическая характеристика эпителиальной клеточной 84-100 культуры MDCK (Madine-Darby Canine kidney cells) с использованием

проточной биосенсорной системы на основе кварцевого пьезо-кристалла и с привлечением молекулярного биосенсора SNARF-1

III. 1. Характеристика процессов адгезии и пролиферации клеточной культуры 84-100 MDCK-II а поверхности кварцевого кристалла

Приложение 2 101-136

111.2. Характеристика процесса апоп гоза в клеточной культуре MDCK 137-146 Приложение 3 147-164

111.3. Характеристика изменений в клеточной культуре MDCK под воздействием 165-171 гепатоцитного ростового фактора

Приложение 4 172-188

111.4. Механический стресс как фактор влияющий на изменения свойств 189-193 клеточной культуры MDCK

Приложение 5 194-210

111.5. Влияние белка карбоксиангидразы 9 на изменение свойств трансфектантов 211-219 клеточной культуры MDCK в условиях нормального и пониженного содержания кислорода. Ингибирование белка карбоксиангидраза-9 как фактор, влияющий на изменение свойств трансфектантов клеточной культуры MDCK

Приложение 6 220-249

Заключение 249-252

Выводы 252-253

Научно-практические рекомендации 254

Список сокращений 255-257

Список литературы 258-277

ВВЕДЕНИЕ

Эпителиальная клеточная культура MDCK (Madine-Darby Canine kidney cells) широко используется различными исследователями в качестве модельной системы эпителиальных тканей (Горшков, 2009; Madine and Darby, 1965; Ridley et al., 1995). Эпителиальная ткань, выполняя множество функций в организме, является удачной моделью исследования для межклеточных взаимодействий. Животные клетки в пределах одного эпителиального монослоя активно взаимодействуют друг с другом и другими тканями, и изучение данных взаимодействий представляет собой интересную задачу. Термин «межклеточные взаимодействия» может относиться к любому случаю, когда клетка или группа клеток испытывает влияние со стороны других клеток, находящихся поблизости. Например, реакцию эмбриональных клеток на присутствие других клеток можно заметить сразу, наблюдая под микроскопом живые клетки в культуре. Так, клетки ранних зародышей амфибий на всей поверхности образуют псевдоподии, пытаясь прилипнуть к другим клеткам. Другим примером является «контактное торможение» - процесс, во время которого фибробласты - вытянутые веретеновидные клетки, встречающиеся в соединительной ткани, теряют свою подвижность после соединения с другой клеткой (Abercrombie and Heysman, 1954). В отличие от них клетки нервного гребня, из которых образуются нервные ганглии и меланофоры, отталкиваются от друг от друга; если такую клетку поместить в культуру, и она будет оставаться в одиночестве, она не будет передвигаться, если же к ней добавить аналогичную клетку, клетки начинают двигаться в противоположные стороны (Twitty and Niu, 1948). Ясно, что взаимодействие друг с другом клетки осуществляют как при помощи непосредственного контакта с соседними клетками посредством межклеточных контактов, так и при помощи сигнальных протеинов - интерлейкинов. Другими сигналами клетке о присутствии и состоянии клеток по соседству являются продукты

метаболизма, выделяемые в питательный медиум во время развития клеточной культуры. В случае фибробластов это взаимодействие носит механический характер, а в случае клеток нервного гребня - химическое (Дыокар, 1978). При изучении действия на клеточную культуру MDCK (Madine-Darby Canine kidney cells) гепатоцитного ростового фактора, клетки, образующие плотную клеточную колонию, начинают движение друг от друга (Comoglio et al., 1996).

Эпителиальные клетки особенно зависят от общего состояния клеточного слоя - широко известно торможение роста эпителиальной ткани после достижения клеточным слоем конфлуэнтности. Другой пример взаимодействия клеток - зарастание раны, нанесенной эпителиальному монослою, скорость затягивания повреждения зависит от наличия ростовых факторов (Kunito et al., 1996).

Интересно, если мы вернемся к вопросу клеточной пролиферации, что клеточная культура, культивируемая в инкубаторе, имеет лаг фазу - то есть после пересадки количество клеток в культуре падает до 60% от высаженного количества. После двух дней, когда заканчивается восставновление клеточных контактов, повреженных во время трипсииизации и происходит стабилизация цитоскелета, начинается экспоненциальный рост клеточной культуры со временем удвоения количества клеток 11 ч (Percell Biolytica).

Только межклеточным взаимодействием может быть также объяснен феномен того, что при определнных условиях (например, при наличии некоторых ростовых факторов), клетки продолжают делиться после достижения конфлуентности с образованием трубкообразных и мешкообразных 3D структур (Whitesell et al., 1981).

Можно даже отметить, что в некоторых случаях, когда плотность пересаживаемых клеток слишком мала и у клеток нет возможности контактировать с соседними клетками, вообще не происходит начала

пролиферации клеток, несмотря на то, что выполняются объективные факторы, необходимые для деления клеток — то есть наличие питательных веществ и комфортная температура культивации (III.3).

Для того чтобы понять, каким образом может повлиять на развитие клеточной культуры, например, частичное удаление сигнальных протеинов из области медиума, примыкающей непосредственно к клеточному слою, в данной работе сравниваются случаи культивации MDCK клеток в условиях стандартного клеточного инкубатора и в проточном режиме биосенсорной системы со встроенным пьезо-кристаллом.

При изучении клеток MDCK, культивируемых в монослое и в виде колоний, становится ясно, что морфология клеток зависит от наличия соседних клеток, в то время как одиночные клетки имеют фибробластоподобную структуру (можно отметить, что такую же структуру клетки приобретают под воздействием гепатоцитпого ростового фактора), в монослое же они меньше по размеру и имеют округлую форму. Другой характерной особенностью является размер клеток: в случае если в распоряжении клеток имеется свободное пространство, в течение первых двух дней после пересадки клеточной культуры, размер клеток размер больше по сравнению с культурой, которая культивируется в течение нескольких дней.

Каково будет влияние межклеточных взаимодействий на перестройку цитоскелета и таким образом на сигнал кварцевого резонатора, к которому примыкает клетка. Важно понимать, что свойства отдельных клеток и клеток, образовавших монослой, могут различаться.

Межклеточные взаимодействия находятся в сильной зависимости от биохимических процессов, протекающих в клетке - например, процесс апоптоза вызывает перестройку цитоскелета и уменьшение количества филаментов, при помощи которых клетки соединяются друг с другом (Pelling et al., 2009).

Клетки взаимодействуют друг с другом и изменяют свойства межклеточного пространства - примером является увеличение кислотности межклеточной жидкости при попадании клетки в условия кислородного голодания (Swietach et al., 2008, Svastova et al., 2004). Такой белок как карбоксиангидраза 9, например, выполняя в организме транспортного мембранного белка, также опосредованно влияет на количество и качество Е-кадгсрина, ослабляя межклеточные контакты клеток и таким образом увеличивая их подвижность (Svastova et al., 2008). Таким образом, изучение процессов, происходящих в MDCK клетках и связанных с функцией белка карбоксиангидразы также входит в круг исследуемых в настоящей работе вопросов.

В настоящей работе наряду с информацией, получаемой от кварцевого биосепсора, для наблюдения за отдельными клетками и клеточными культурами применяются несколько видов микроскопии, в том числе метод флуоресцентной микроскопии и методы фазовой контрастной и конфокальной микроскопии.

В связи со всем вышеперечисленным, целью данного исследования является исследовать цитологические особенности культуры клеток MDCK (Madine-Darby canine kidney cells) и влияние на нее некоторых веществ при помощи проточной циркулирующей биосенсорной системы на основе кварцевого пьезокристалла и молекулярного биосенсора SNARF-1. Для достижения цели исследования решались следующие задачи:

1. Разработать стандартизованную методику использования новой впервые сконструированной проточной биосерсорной системы на основе кварцевого пьезокристалла для культивации и описания клеточной культуры MDCK.

2. Разработать стандартизованную методику определения цитоплазматического рН в клетках MDCK при помощи молекулярного биосенора SNARF-1.

3. Дать характеристику некоторых цитологических показателей клеточной культуры во время процесса адгезии клеток МОСК на поверхности пьезокристалла, процесса блеомицин-индуцированного апоптоза и процесса движения клеток под воздействием гепатоцитного ростового фактора.

4. Сопоставить изменения клеточной культуры МОСК во время процессов адгезии, апоптоза и передвижения в условиях стандартного клеточного инкубатора и проточной биосенсорной системы.

5. Оценить влияние механического стресса, создаваемого током жидкости через микрореактор биосенсорной системы на выживание и морфологию клеточной культуры МОСК.

6. Исследовать активность белка карбоксиангидразы-9, как показателя степени выживаемости раковых клеток при помощи измерения цитоплазматического рН.

Научная новизна исследования. В данной работе впервые с использованием оригинальной стандартизованной методики исследованы процессы адгезии, пролиферации, апоптоза и на примере клеточной культуры МОСК. Цитологические изменения были описаны при помощи оптической микроскопии и импеданс спектрометрии в условиях циркулирующей проточной биосенсорной системы на основе пьезокристалла.

Впервые были сопоставлены изменения происходящие с клеточной культурой МОСК в условиях стандартного клеточного инкубатора и в условиях циркулирующей проточной биосенсорной системы.

Работа вносит значительный вклад в изучение влияния механического стресса на развитие клеточной культуры МОСК и на такие биологические процессы как адгезия, апоптоз и движение клеток.

Впервые была разработана и использована стандартизованная методика определения цитоплазматического рН в трансфектантах клеточной культуры

MDCK. При этом впервые значение цитоплазматического рН использовали для определения активности белка карбоксиангидразы-9 на примере клеток MDCK в условиях кислородного голодания и в присутствии ингибиторов белка карбоксиангидразы-9.

Апробация результатов исследования. Основные результаты диссертационного исследования обсуждались и получили положительную оценку на производственных совещаниях ФГБОУ «Калмыцкий государственный университет» (2011-2013 гг.), доложены на международных и региональных конференциях (2008-2013 гг.), в том числе на международной конференции IEEE Sensors, Лечче, Италия, 2008; на международной конференции Eurosensors 2008, Дрезден, Германия, 2008. на международной конференции Eurosensors 2009, Лозанна, Швейцария, 2009; на межрегиональной конференции Калмыцкого государственного университета, Элиста, 2012 г; на онлайн-конференции «Биотехнология: взгляд в будущее», Казань, 2013 г; 9 международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук и возможности трансляционной медицины в решении актуальных проблем практического здравоохранения» (Астрахань, 2013). Защищаемые положения:

1. Процессы, включающие в себя перестройку цитоскелета клеточной культуры MDCK могут быть охарактеризованы при помощи биосенсорной системы на основе пьезокристалла.

2. В результате взаимодействия клеточной культуры MDCK с блеомицином происходит изменение жесткости мембраны, что вызывает открепление клетки от субстрата, и, следовательно повышение значения сигнала. Одновременно происходит изменение формы клеток, характерное для процесса апоптоза.

3. Гепатоцитный ростовой фактор оказывает влияние на процессы адгезии клеточной культуры MDCK.

4. Изменения в клетках МЭСК под воздействием блеомицина и гепатоцитного ростового фактора в условиях как проточной биосенсорной системы так и в условиях стандартного клеточного инкубатора на поверхности чашек Петри носят однонаправленный характер.

5. Значение цитоплазматического рН клеток МОСК находится в зависимости от концентрации кислорода, а также от присутствия белка карбоксиангидразы-9.

Глава I. Обзор литературы

1.1. Биологическая характеристика клеточной культуры MDCK и ее трансфектантов

MDCK (Madine Darby Canine kidney cells) является широко используемой эпителиальной клеточной культурой, была выделена в 1958 г из транспортного эпителия почек взрослой здоровой женской особи кокер-спаниеля и сохраняет его основные свойства. Исследуемая клеточная культура характеризуется высокими адгезивными свойствами к поверхности, на которой она культивируется (Madine & Darby, 1965). В виде монослоя клеточная культура формирует функциональный транспортный эпителий. Клеточная мембрана клеток поляризована на базолатеральную и апикальную части (Whitesell et al., 1981). Выделение данной культуры из собирательных трубочек почек было вызвано необходимостью изучения транспорта воды и солей в почках, и по важнейшим морфофункицональным параметрам монослой данной клеточной культуры сходен с эпителием собирательных трубок, из которых она была выделена. Линия MDCK представлена уплощенными клетками, формирующими функционально плотный эпителий с высоким трансэпителиальным сопротивлением, что является свойством водонепроницаемых эпителиев. Толщина слоя составляет 3-5 мкм. (Barker, Simmons, 1981; Richardson et al., 1981, Hull et al., 1976; Misfeldt et al., 1976; Kreisberg, Wilson, 1988). Данная клеточная культура рассматривается в качестве хорошей модели периферийных нефронов (Su et al., 2007).

Монослой клеток прекращает рост после того как клетки выстилают всю предоставленную поверхность, и их плотность достигает 3*105 клеток на см2. При этом было показано, что апикальная поверхность завершенного монослоя не способна адгезироваться с отдельными клетками или поверхностями. При этом если клетки высаживались в большей концентрации, они образовывали многослойные структуры. В данном случае клетки проявляют транспортную активность, проявляя способность

проводить соли и воду по вертикали, в верхние слои в случае, если формируются многослойные структуры данных клеток. Также была показано, что скорость адгезии клеток друг к другу зависит от температуры эксперимента - при 6°С скорость выше чем при 20°С (Whitesell et al., 1981).

Апикальная поверхность клеток содержит микроворсинки, между клетками содержатся выраженные зоны межклеточных контактов: плотные, промежуточные контакты и десмосомы. В базальной части клетки соединяются друг с другом базальными отростками цитоплазмы. Актиновые микрофиламепты обнаружены под апикальной мембраной, в области апикальных контактов, в областях межклеточных контактов и в виде пучков в цитоплазме. В некоторых клетках обнаружены ламеллоподии. Появление ламеллоподий характерно для отдельных клеток, находящих�