Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетическое изучение района 44F-45D хромосомы 2 DROSOPHILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетическое изучение района 44F-45D хромосомы 2 DROSOPHILA MELANOGASTER"



САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕ|ЩЫЙ УН^СРСИ^^/

,/ \ у'Па ¡(цймх рукописи

УДК 575.

.1.59(^1

КОНЕВ Александр Юрьевич

ЩГГОГЕНКП1ЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАЙОНА 44Р- 450 ХРОМОСОМЫ 2 ОКОБОРНИА МЕЫтОЛЯТЕК

Специальность 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ ПЕТЕРБУРГ 1995

Работа выполнена в лаборатории генетики эукариот Отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики РАН, г. Гатчина.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, с.н.с.

Ю.М. Хромых.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук , профессор В.А. Гвоздев,

доктор биологических наук , профессор ПЛ. Шварцман.

Ведущая организация: ВНИИ разведения и генетики сельскохозяйственных животных Российской сельскохозяйственной Академии наук.

Защита диссертации состоится 1995 г. в час. на

заседании специализированного совета Д 063.57.21 по защите

диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: Санкт-Петербург, Университетская наб. , д. 7/9, СПбГУ, кафедра генетики и селекции, 199034.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан " 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

' I

Актуальность проблемы. Цитогенетическое изучение конкретных районов хромосом дрозофилы является фундаментальным подходом к исследованию структурно-функциональной организации индивидуальных генов и генома в целом. Разработанные на дрозофиле методы цнтогенстического анализа предоставляют уникальные возможности для исследования генетического содержания отдельных участков хромосом, мутабильности генов, точного картирования локусов. и, в конечном счете, для сопоставления генетической, цитологической и молекулярной карт определенных районов генома. Такой анализ позволяет значительно расширить круг локусов, доступных для генетического и молекулярного исследования, изучения их функционирования в развитии. Применение этого подхода не только существенно облегчает клонирование и анализ генов, но и создает предпосылки для изучения явлений, связанных с хромосомным уровнем организации генетического материала, в частности, эффекта положения генов (ЭП).

Район 44F-45D хромосомы 2 Drosophila mdemogaster совершенно не пучен в цитогенетическом отношении. Между тем, исходя из данных генетического картирования, именно в этой области расположен ген радиочув-ггвительности rad(2)201. Мутация этого гена rad(2)20lGl , обусловливаю-цая чувствительность развивающихся особен к летальному действию тонизирующей радиации, выделена и детально охарактеризована в нашей габоратории [Варенцова, Захаров, 1976, Хромых,1982]. Сведения об организации и функционировании генов репарации у дрозофилы крайне )граничены,и их анализ представляет несомненный интерес.

Цели работы. Предпринятое нами исследование района 44F-45D пре-тедовало 2 основные цели: создать необходимые цитогенетические предпо-:ылки для дальнейшего клонирования гена rad(2)201 и охарактеризовать >анее не изученный район генома. Обнаруженные в ходе работы особен-юсти спектра радиационно-индуцнрованных перестроек заставили нас об-¡атиться к изучению мутагенеза в данной области и к исследованию эффекта юложения. Таким образом, задачами работы были: I. Возможно более очно локализовать ген rad(2)201; 2. Исследовать спектр мутаций, шдуцируемых ионизирующей радиацией в районе 44F-45D; 3. Иденти-эицировать и охарактеризовать существенные гены области 44F-45C. 4. 1зучнть ЭГ1 генов в хромосомных перестройках в районе 44F-45D.

Научная новизна и значимость работы. Впервые детально охарактерн-опан ранее не изученный район генома дрозофилы 44F-45D. С исполью-анием различных систем селекции мутации получена большая коллекция ромосомных перестроек, в том числе депеций, легальных мутаций и mvi;i-1ИЙ гена white, ннсертнронапного в эту попасть и соскше 1'-)чем<чпа Оо-

I

нарушены необычные особенности спектра выявляемых радиационно-ин-дуцированиых перестроек хромосом: преобладание гетерохроматиновых перестроек и относительно низкая частота делений. Проведен цитогенети-ческий и молекулярный анализ радиацнонно-индуцированных мутаций X-хромосомного гена white, ннсертированного в новую геномную позицию.

С высокой точностью ■ локализован ген радиочувствительности. В районе 44F2-3;45C5-6 идентифицировано 18 жизненно-важных локусов. Определены их цитологическая локализация и порядок; описаны феногенети-ческие характеристики мутаций. Выявлено 6 генов существенных для эмбрионального развития, включая ранее не изученный гаплочувствительный локус Notopleural и новый ген, вовлеченный в контроль сегментации эмбрионов. Цитогенетически картирован относящийся к классу сегмент-полярных генов локус lines, показана его роль в имагинальном развитии.

Исследование гетерохроматиновых перестроек обнаружило, что все они вызывают ЭП прилежащих к точке разрыва генов, а район 44-45 высоко восприимчив к возникновению ЭП. Впервые проведенное специальное исследование вторичных перестроек, приводящих к усилению ЭП, обнаружило, что расстояние между разнесенными блоками гетерохроматнна существенно для проявления этого эффекта.

Практическая ценность работы. Исследование тонкой структуры района 44F-45C позволяет упростить дальнейший анализ генов этой области генома. Полученная в ходе работы коллекция мутаций перспективна для изучения различных аспектов генетического контроля развития дрозофилы позволяет создать оригинальные генетические модели для исследования эффекта положения генов. Часть этой коллекции передана в международный центр линий дрозофилы и уже используется в 4-х лабораториях.

Апробация работы. Материалы диссертации были изложены ■ ■ на б-м Всесоюзном совещании по биологии и генетике дрозофилы, Одесса, 1989; на 6-м Всесоюзном совещании по микродозиметрии, Канев, 1989; на б-м съезде ВОГиС им.Вавилова, Минск, 1993; на 13 Европейской конференции по дрозофиле, Агия Пелагия, Греция, 1'993, на 35 Ежегодной конференции по дрозофиле, Чикаго, США, 1994.

Публикации.По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на Ijy страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и приложения; содержит % таблиц и 15 рисунков. Список литературы включает 262 названия, из которых Зф на русском языке.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ В работе использованы: 1) радиочувствительная линия rad(2)201GI ;

2

линии: 2) Canton-S; 3) CyO/L ; 4) cn bw; 5) bvv; 6) cn bw; e 7) ciD/eyD !) XYL-YSX, y2su(wa)wa/0/C(l)RM,y v bb н 9) YSX-YL,In(l)En y/0/C(l)RM,y ' bb; T(Y;2)B190,y+/CyO ( см. LindsIey.Grell,1968); 10) линия P[(\v,ry)A-

1]020, содержащая, инсернию гена white в составе Р-элемента в область 45D Levis et al.,1985]; линии, содержащие мутации гена lines - 11 )Iinyl2-ЗО/СуО;

2) linIIv39/CyO; 13)полученная нами доминантная мутация. Plane (Pia, >астопыренные крылья), связанная с инверсией ln(2LR)Pla (40F;60AB). Сультуры поддерживали на стандартной среде при 25°С.

Для индукции мутаций в зрелых спермиях, облученных самцов скрещи-1али с 3-5- дневными самками;' через 3 сут родителей удаляли. Мутации шдуцировали у-лучами в дозе 45 Гр f'Co мощность дозы 15 Гр/мин). В )яде экспериментов самцов облучали нейтронами со средней энергией 0,8 ЛэВ в дозе 10 Гр; мощность дозы - 0,3 Гр/мин. Основные использованные 1ля выделения мутаций схемы скрещиваний показаны на рис.1. Цитологический анализ полученных мутаций проводили на окрашенных

1а

р

1 О-' '-><¿2

+ 0,0 I

—}—

г

Cfi Df(2*)Npt ¿1

«л Of{l*)*,1 bw

1Ъ

р$: .99:

ln(2LR)PJo

суо |

с» [Л5]

X о:

'« i' -vj

(•> 45]

■ь г____

ОО—7

* CK (J 45] w en [J 45}

CyO

ki(nn)eto

W

1С Л

p 9— * 6

?

C/O !n(ZfVG7?

CyO

* $"

Id ^

• Ыыуъ ^ . ъ

Рр = == X ö — - 1 :

+ » <X> I 7 СУО

CyV

ln(2)w45-73* ln(2)w4S-73n

CyO i.,(Zl*)M* Ofl

Pnc.l. Схемы скремшвлний для получения мутаций в районе 44Г-45Г). цегоорсеином лаписмых препаратах слюнных желсг Для нчппифнканич

перестроек с разрывом в области хромоцентра проводили генетически! анализ псевдосцепления выделенных мутаций с локализованными : хромосомах 3 и 4 маркерами е, еу° и ciD.

Блот-i ибридпзационный анализ мутаций инсертированного гена \ проводили по стандартной методике [Маниатис,1984], используя клониро ванные фрагменты гена white : дистальный - EcoRl-BamHl (7,5 тнп) и про кснмальный - BamHl-EcoRl (8,0 тнп), а также фрагменты Sail-Sail (1,5 i 0,7тпп), включающие большую часть дистальных экзонов и интронов, j Hindlll-BamHl (2,2 тнп), включающий проксимальный интрон гена w.

Для анализа комплементации мутации rad(2)201Gl с выделенным! делениями и перестройками, самок линии rad скрещивали с самцами несущими тестируемую мутацию. Развивающиеся культуры облучали ] возрасте 96±12 час у-лучами в дозе 15Гр.

При проведении комплементацнонного анализа летальных мутаций, от были разделены на группы с помощью соответствующих делеций и внутр! каждой такой группы и с мутациями соседних групп выполняли вс возможные скрещивания типа Ll/Cyo*L2/Cyo (L-летали). Скрещивани: проводили в обоих рецнпрокных направлениях. Анализировали не мене 200 потомков.

Для определения эффективного летального периода мутантов (L), oco6ei генотипа L/+ скрещивали с гемизиготными самцами. Учитывали частот; вылуплення личинок и имаго.

Статистическую обработку результатов проводили по критерию х2 используя программу Statgraphics.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение радиационно индуцированных мутаций в районе 44F-45D.

Выделение мутаций в структурно-нормальных хромосомах. Поскольк; район 44 - 45 никогда не изучался в цитогепетическом отношении, необхо димо было получить коллекцию мутаций, и, прежде всего, делеций, в окру жающей ген радиочувствительности- области генома. Для получения мута ций использовали ионизирующую радиацию - мутаген, высоко эффектов ный в индукции как хромосомных перестроек, так и генных мутаций. Пер роначальный отбор мутаций проводили по появлению чувствительности i легальному действию ионизирующей радиации в гетерозиготе с мутацие! rad(2)201Gl. Проанализировав 8000 у-облученных хромосом мы отобрал! одну делецпю области 44F2-3;45C5-6. Полученная делеция обозначен! Dl'(2R)Npl. поскольку она обладает доминантным феиотипическим прояв лением (задержка развития, расширенные крылья, уменьшенньи Н'Моптевральные. гумеральные, предшовные и претарзальные щетинки)

4

щентичиым фенотипу выделенной Бриджесом в этой же области и ¡последствии утерянной делецни Notopleural (Np) [Bridges et ul., 1936]. Деяния Df(2R)Npl определила границы непосредственно интересующего нас кшона хромосомы и была использована для дальнейшего выделения мутаций по схеме, применяемой для генетического "насыщения" района рис.1а). В результате анализа 18700 хромосом мы выделили 85 мутаций, не сомплементирующнх летальный эффект Df(2R)Npl; 70 из них легальны, 15 --ипоморфные летальные мутации. Из 85 мутантов 24 ¡¡мели хромосомные ¡ерестройки в области 44F-45C (см. рис.2,3). В спектре выявленных ¡ерестроек обращают на себя внимание преобладание (62%) гетерохроматиновых перестроек ( одна точка разрыва - в интервале 44F-45C, л другая - в >бласти хромоцеитра) и малая доля делений (4.2%). При г/гом, точки ¡азрывов гетерохроматиновых перестроек распределены неравномерно (см. шс.2).

Далее для выделения ¡утацнй использовали [инию P[(w,ry)-A-R]020, :одержащую инсерцию в >бласть 45D последова-ельности локуса white w) дли¡loй 11.7 тпн, обес-¡ечивающей нормальное фоявление гена. Отби-)aлl¡ мутантов по шеертированному гену w рис. 1 b); мутации индуцировали у-лучами, либо ¡ейтронами. Проанали-ировав 83100 у-облу-[енных хромосом,

ггобрали 20 фертильных 1утантов. В варианте с юлучением нейтронами нализ 155270 особей Г103- Рис.2.Локалнэция точек разрывов хромосомных пере-олил выделить 11 муган- СТР>,СК в 44F-45D. Пределы, в которых карги-

_ рованы точки разрывов, показаны заштрихованными ных линии. Lредн гетерохроматиновых) и незанприхованппмм

ТОбраннЫХ мутаций 9 (для эухроматиновых перестроек) прямоую'п.никамн. вязаны с хромосомными

ерестройками, имеющими точку разрыва в области 45П5-Х (рис 2.

In(?)w45-13ti ln(7R}w4573n in{7)w45-75n lnG)w4i.7Sn TfJ 1IW4S2XI

C=3 lnO")»<S-<t3

Г J^.JjCn I mtMir.u l tn(iR)csa

<==Oln(2LR}GT D=> ln(2R) G79

I И tn{lR/G43

a ind)G?i • и ln(7R)073

DWIRJGI ] ln{2R104 I InfWlGn 11пО"/0$3 I //У2ЧС72 I ln(2R)G)7 0=S>'niJffJCi J 4m/TiY.2}GS 3lnf7R)G3i

КпДОЮН

4n(7RfGSO IHUCS1 E=0 ln(2R JOS» -mf T(Y.?:3>C,7t

обозначены "\v45-" с индексом g для у-индуцированных и п - для вызванных нейтронами мутаций) и 6 - с делециями (рис.3). Как и при выделении летальных с ОГ(2^1\'р 1 мутаций, среди неделеционных перестроек преобладали гетерохроматиновые (7 из 9). При этом только 3 такие перестройки в районе инсертнрованного гена вызывали мозаичный фенотип; в 4х - инактивация на фенотнпическом уровне была полной. Частоты возникновения делений в области 44-45 при индукции мутаций \у как у-лучнми (2,4* 10 5), так и нейтронами (2,6*10 3) существенно ниже описанных в литературе для делеций гена в Х-хромосоме, полученных при использовании тех же доз излучений [А1ехапёгоу, 1982, Разипк « а1.1987]. Учитывая эти особенности мутагенеза, представлялось интересным исследовать спектр мутационных событий на внутрилокусном уровне. С помощью блот-гибриднзационного анализа мы изучили 21 мутацию, включая 7 обменных перестроек. Анализ мутаций без цитологически видимых изменений выявил 3 делецин (у-инду-цированные): одну - всей инсертированной последовательности и 2 делецин внутри большого интрона гена \у. Хромосомные перестройки, в которых область 4505-8 соединяется с эухроматином , имеют точку разрыва внутри гена; в гетерохроматиновых перестройках, включая инактивирующие ген, изменений его последовательности не выявляется. Сравнение результатов цитогенетического и молекулярного анализа радиационно-индуцированных \у - мутаций в 45м районе и в области нормальной локализации гена [РаБПпк й а1.1987, Александров, Александрова, 1990 ] показывает, что спектр генных мутаций практически не изменился. В то же время, на хромосомном уровне выявляются резкие различия - среди мутаций в районе 45Б меньше многолокусных делеций и проходящих через последовательность гена обменных перестроек.

Таким образом, при использовании 2х систем селекции мутаций в районе 44-45 наблюдались сходные особенности спектра выявляемых радиационно-индуцированных мутаций: относительно высокая доля гетерохроматиновых перестроек и низкая - делеций и перестроек с участием эухроматиновых районов хг омосом.

Выделение мутаций в перестройках с участием гетерохроматпна.

Низкая частота делеций в районе 44Р-450, индуцируемых ионизирующей радиацией в хромосомах нормальной структуры заставила нас обратиться к поиску более эффективных для отбора нехваток систем получения мутаций. Такие возможности предоставило выделение гетерохроматиновых перестроек с разрывами в различных точках интересующего нас интервала хромосом),1. В нерпой серии опытов с помощью у-лучей индуцировали вторичные мутаиип в хромосоме, содержащей инверсию 1п(2)050 (40;45В8-

6

С1), Отбирали мутантов, проявляющих неполную комплементацию в сочетании с другой инверсией • 1п(2Я)С72 (4!;45Л13-В1), точка разрыва которой смещена влево от разрыва 1п(2)050 (рис. 1с). В результате скрип-

111ЩПМ1111 ...........

5 ЛйШ ИШН ОДЙВДШЙ

45 А

Г.)! <

выделили 25 мутаций, среди которых 4 делении. Частота нехваток на порядок превышала таковую при индукции мутаций в неперестроенной хромосоме. Аналогичный подход использовали для по-

-0

[>1(2}ЦЫрЗ ■ Г>Г!?.К)Ырв

ШЗХ/Л'Ы ОГ(2Я)Ыр5

ппгщено-з! ОЦ2ЩшН-ЗОп лучения мутаций в ин

-а В112Я)Ы5- нч

-а 17Г(2Я1«--Н-31п 0!(2К)*73-1 ПЦ2К)*73-2 ОГ(2Р)ССЗ-7] Пр/2;Г/Св-1 Щ2Я)^73-3 1И12Я)-и45-41п ложйшя ВГ!2Я1«г73-7 Щ21!)\г73-9

вертированной хромосоме 1п(2)\у45-73п (41; 4505-8) , вызывающей мозаичный эффект по-гена \у (рис.Ы). Проашлн-зировав 92000 особей, Рнс.З.Локализацня делеций и дупликации Т(2;У)Сб-1 на ци- мы получили 28 му-гологической карте области 44-45 хромосомы 2. Прямоу- т;шхных ЛИ|1ИЙ с Г)елой ■ольниками покапаны пределы, а которых картированы точ-

<» разрьшоп. Для делеииИ, полученных в тетерохроматино- окраской глаз. В 5 зых перестройках,прямоугольники заштрихованы. случаях в инвертиро-

ванном участке хромосомы возникли перекрывающиеся с ОЦ2Я)Ыр1 делении. С помощью рекомбинации гетерохроматиновых инверсий 1п(2)С63 и 1п(2)\у45-73п была подучена синтетическая нехватка ОГ(2Я)С63-73. Наконец, в потомстве у-эблученных самцов, несущих транслокацию Т(У;2)С6, отбирали перевоссоединения хромосом У и 2. Была выделена сложная перестройка Г(У;2;3)С6-1 (ЫО-П; Ы4-15: 41:45ВЗ-4;76А6-В1). Несущие ее самцы мот передавать жизнеспособным потомкам У-хромосому со вставкой участка 41-45ВЗ, как с остальной частью транелокациопного комплекса, так и вместе с хромосомами 2 и 3 нормальной структуры. В последнем случае пошикап туп.чикапия.

До.тепиоииос купированно юна ралиочупешмюльнпеш.

В реллыаю всех жеперпмептов но выдечежио мутапнй в районе М! -45 фомосомм нам мтч'п, попчип. ко'пекппю ш I *> мгр^крт тппмщ ■< ч

делеций и I дупликации (рис.3), позволяющую провести подробный анализ этой области генома и, в частности, картировать ген радиочувствительности. Анализ комплементации мутации гас1(2)20Ю1 с делениями позволил локализовать этот геи в интервале 45ВЗ;45В5 - между левыми точками разрывов ОГ(2!1)С63-73п и 0{"(2Я)\у45-47п. Локализация была уточнена с помощью дупликации Ор(2;У)С6-1 (41;45ВЗ-4;Ы0-11;Ы4-15), введение которой в геном гомозигот по мутации гас!(2)20Ю1 восстанавливало их радиоустойчивость. Таким образом, мы картировали локус радиочувствительности в районе тонкого диска 45ВЗ, что создает возможность его молекулярного клонирования с помощью прогулки по хромосоме.

Изучение жизнспно-важпых локусов района 44Р-45С хромосомы 1.

Одной из основных задач данной работы было исследование генетическсо содержания района 44Р2-3;45С5-6, определяемого границами

8 о

О о

о О О

о о о

А о о о о

о о

о о □ о о

ООО ЕЕЗ? О

ею о о о а* сел» о Я

О ЕРО О О П О ЕЮ О ООО Ы'Д и

о езю о о □ □ ею ооо ста по она о о с*

Р 44Гс (Ип Гс)Гс1 ГеМр 45АоАЬАс Ас! АВа АВЬ гаЬ Во ВЬ Вс (Са СЬ) згд 3 | I | II |Ш|1У| V |У1рт1ртШ|1Х| X | Х1| XII | XIII ¡XIV

Нр1_

%р4 __

Ыр5 —

С50-31

ч45- 15д, *45-30п

*45-31п

*73-1

»73-2

С 63-73

> 1)р(2;У)С6-1

¥/73- 7

Рнс.5. Цнтогенетическая карта района 44Р2-3;45С5-6. А) Карта комплементации. Б) Названия локусов; в скобках - локусы,порядок которых не известен. В) Интервалы, определяемые границами делеций Г) Границы делеций и дупликации на генетической карте.

О - мутации без цитологически видимых изменений П - эухроматиновые перестойки ЕЛ - гетерохроматиновые

перестройки

Цифрами обозначены перестройки: 1)Т(2,3)С11 2)1п(2Я)013 3)1п(2Я)С88 4)1п(2Я)С43 5)1п(2)07| 6)1п(2Я)С73 7)1п(2К)С63 8)1п(2Я)С72 9)1п(2)С7 |0)1п(2К)О32 П)Т(У:2)аб 12)1п(Ж)П25 13)Гп(2Н>С50 14)1п(2)С51 15)Т(У;2;3)021

делсции Df(2R)Npl. С помощью 14 делений и дупликации исследуемая область была разделена на 14 последовательных интерпалов. Анализ 62 цитологически нормальных и связанных с эухроматиновыми перестройками мутаций позволил разбить их на 18 групп комплементации, для которых определены цитологическая локализация и порядок (см.рис.4). За двумя исключениями, все эти мутации ведут себя как моногенные; результаты реципрокных скрещиваний идентичны; комплементационная карта носит простой неперекрывающийся характер. Для представителей каждой из этих групп определен летальный период. Описаны фенотипы особей на стадиях реализации деталей, морфологические проявления полулетальных мутаций и эффекта положения жизненно-важных генов. Исходя из данных комплементациониого и феногенетнческого анализа мы полагаем, что выделенные летальные и снижающие жизнеспособность особей мутации идентифицируют 18. индивидуальных локусов района 44F2-3;45C5-6.

Шесть локусов района 44F2-3;45C5-6 существенны для эмбрибнального развития, летальные мутации остальных генов приводят к гибели на личиночной стадии. Мутации одного локуса оказались аллелями известного [Nusslein-Voihard et al.,1984], но не локализованного ранее гена lines (lin), детерминирующего развитие переднего и заднего концов эмбриона и полярность внутри каждого сегмента. Анализ мозаичного фенотипа при ЭП гена lin показал, что он функционирует и в постэмбрногенезе, контролируя дорзо-вентральную полярность при развитии ножных имагинальных дисков. Эмбриональными леталями являются мутации гаплочувствительного локуса Notopleural, доминантное проявления которых (изменение размера и формы тех или иных щетинок торакса) аллелеспецифнчно. Мутации гена 1(2)45АВ вызывают апериодические дефекты эмбриональной сегментации: отсутствие 3-го торакального и 2-го брюшного сегментов и нарушения в 6-ом. Среди генов, мутации которых детальны на стадии личинки, интересен !(2)45Аа (мутантный фенотип - не окукливающаяся личинка, по.ипенпые хромосомы крупнее нормальных).

Четыре дополнительные группы комплементации летальных мутаций, образованы исключительно гетерохроматинопыми перестройками.

Эффект положения генов п перестройках района 44F-45D.

Различные гетерохроматиновые перестройки ' в районе 44F2-3:45C5-fi проявляют сходные особенности комплементации с мутациями жнтемно-важных генов: 1. неполная комплементация с мутациями ря.ча

приближенных к тсрохроматнну локусов; 2. выживающие гетерошттие особи мтаично проявляют локус - специфические морфологические аномалии: 3 ре'кие рапнчия рпулматоп рсниирокных скреншпмнии (как

>1

правило, эффект перестройки проявляется значительно сильнее в случае, когда она переходит в геном зиготы от сами;!); 4. различное проявления эффекта у самцов и самок - у последних инактивация гена обычно выражена сильнее. Такие особенности, наблюдавшиеся только у гетерохроматиновых перестроек, свидетельствовали о том, что они вызывают эффект положения существенных генов. Действительно, инактивация приближенных к гегерохроматину локусов супрессировалась введением в геном дополнительной У-хромосомы. Для 4 перестроек наблюдалось и родительское влияние У-хромосомы в геноме несущей перестройку самки на ЭП у ее потомков с нормальным набором половых хромосом. Все 15 гетерохроматиновых перестроек, отобранных как летали с ОГ(2Я)Ыр1, проявляют ЭП. Более того, 9 из них являются У-супрессируемыми деталями, т.е. их собственный летальный эффект в гемизиготе также обусловлен ЭП. ЭП оказавшихся приближенными к гетеро^роматину генов района 44И-45С наблюдается также в делениях - производных 1п(2К.)\у45-73. ЭП распространяется на дистанцию в 1 - 7 генов от точки разрыва (см. рис.5). Распространение ЭП не выглядит монотонным на уровне феногипического анализа. Тем не менее, в большинстве перестроек наиболее сильной инактивации подвергается ближайший к точке разрыва локус, и именно ЭП ближайшего гена выявляется при скрещиваниях в обоих направлениях. Для генов, удаленных от точки разрыва, ЭП нередко выявляется только у самок и только в одном направлении скрещиваний. Влияние направления скрещивания может быть обусловлено как истинным родительским влиянием на проявление ЭГ1 в перестройке, так и являться следствием материнско-зиготического взаимодействия [[1оЬЫп5,1983], т.е. отражать особенности экспрессии подвергающихся ЭП генов. Во всех случаях, кроме 1п(2С)050, инактивация распространяется только в одну сторону от точки разрыва.

ЭП возникает во всех перестройках, переносящих инсертнрованный ген \у к гетерохроматину. Полная инактивация гена в 4х перестройках является экстремальным проявлении ЭП мозаичного типа, поскольку введение дополнительной У-хромосомы приводит к появлению мозаичного фенотипа.

Тот факт, что все гетерохроматиновые перестройки в районе 44Р-450,

отобранные без какой-либо селекции по мозаичному фенотипу, вызывают

ЭГ1, является весьма необычным и свидетельствует о высокой

восприимчивости данного района к ЭП. Для сравнения - только'4 из 38

летальных гетерохроматиновых перестроек в 5 интервалах Х-хромосомы

вызывали ЭП [1.еГеуге,\\'аткт5,1986]. У-супрессируемые летали очень редки в

ш

Мутации

|Га| ^¡п®*!?-^! Гс/, Гв*|Мр", |Ао?|АЬ(Ас'| Ас^

3 1л(?Я)С<3

В0|А8Ь| ВО|ПЬ| ВС|

| со |сь|йгд|

Езаьггка!

гскг.^г/

' сдадд—ГДЕ

ЕВ1

г.: :.,;„

¿Е?ЕЯ ¡ЕШ ¿БЮНЯ&Зм

Рне.5. Схематическое изображение комплементации гетерохроматиновых перестроек с летальными мутациями в районе 4-'Р2-3;45С5-6. Обозначения: результаты показаны отдельно для самок (1,3) и самцов (2,4) при различных направлениях скрещиваний- 1,2 -перестройка приходит от самца; 3,4 - от самки. Двойным квадратом показана локализация точки разрыва на генетической карте:черным-для летальных перестроек, штрихованным - для У-супрессируемых легален. Степень проявления ЭП : а-нет эффекта; б-выживаемость нормальная, видимые аномалии; в- выживаемость гетерозигот достоверно отличается от дикого типа, но больше 60% от ожидаемой; г- выживаемость от 60 до 25%; д- меньше 25%, е- меньше 5% от ожидаемой.

аутосомах - нами без специального отбора получено 9 таких мутаций. С высокой восприимчивостью к ЭП может быть связано и преобладание гетерохроматиновых среди всех выявленных намн перестроек, поскольку они отбирались по мутантному фенотипу. Ни в одном из исследований, в которых хромосомные перестройки выявляли по изменению сцепления, супрессии кроссинговера, влиянию на расхождение хромосом, либо по морфологии хромосом нет указаний на предпочтительное воссоединение района 44Р-450 с гетерохроматином.

С целью исследования возможных причин высокой чувствительности района 44Р-450 к ЭП мы обратились к изучению вторичных перестроек инверсии 1п(2)С50. Оба разнесенных этой перестройкой блок;) [сгсро.хро-

магина вызывали ЭП: наряду с сильным ЭП,распространяющимся от инвертированного блока в теломерном направлении, слабой инактивации подвергался и перенесенный к 2Ь-гетерохроматину ген 1(2)45Вс. В 19 производных In(2)G50, отобранных по понижению жизнеспособности в гетерознготе с In(2R)G72, неполная комплементация с ln(2R)G72 была обусловлена ЭГ1, Частота, возникновения этих перестроек была очень высокой, они составляли подавляющее большинство (19/25) отобранных с помощью In(2R)G72 мутаций, что свидетельствовало о том, что в них происходит скорее усиление слабого ЭП, распространявшегося в исходной инверсии от 2Ь-гетерохроматина, чем возникновение эффекта de novo. С тем, чтобы исследовать распространение ЭП, анализировали комплементацию перестроек - производных In(2)G50 с мутациями 10 локусов района 45AB-44F, прилежащих к 2Ь-блоку исходной инверсии и локуса 1(2)45Са, расположенного справа от другого блока гетерохроматина. В большинстве вторичных перестроек усиления ЭП гена 1(2)45Са не происходит. События, приводящие к появлению ЭП генов района 45АВ можно разделить на 5 классов (рнс.6): I. в 8 из 19 перестроек небольшой фрагмент эухроматина из области 45В8 - 44E-44F помещен между двумя гетерохроматиновыми блоками; в 2х случаях (рис.6,Ib) такая структура хромосомы возникла в результате вторичных перестроек с исключительно эухроматиновымн точками разрывов; II. к прилегающему к 2Ь-гетерохроматину фрагменту 45В8-45А10 присоединяется концевой сегмент 3R-xpoMocoMbi; III. перестройки с точками разрыва в гетерохроматине хромосом 2 и 3; IV. замена всего 2L-плеча на короткий сегмент 3R-xpoMoeoMbi; V. изменения не известны.

В одной из перестроек - T(2;3)G50-19 все 10 генов, заключенных между двумя блоками гетерохроматина, проявляют ЭП, т.е. все гены интервала 45АВ вполне восприимчивы к ЭП (см.рис.7). При этом, сильной инактивации подвергаются гены вблизи обоих окаймляющих эухроматниовын фрагмент 44F11-45B8 блоков гетерохроматина. Картина комплементации остальных производных In(2)G50 перестроек с мутациями генов района 45АВ сходна .с наблюдаемой для перестроек, полученных как летали с Df(2R)Np.l (см.рис,5,7). Несмотря на то, что перестройки отобраны с помощью In(2R)G72, наиболее сильная инактивация выявляется не для генов, расположенных в районе ее точки разрыва (1(2)45АВа и 1(2)45АВЬ), а для ближайшего к точке разрыва инверсии In(2)G50 локуса 1(2)45Вс. Это едина пенный т еп района 45АВ, ЭП которого выявляется в обоих направлениях скрещиваний. Инактивации наиболее удаленных oí точки patpima исходной перестройки i сноп не обнаруживается. Таким обраюм, по шт.х iipoinmvuiMx ln(2)G50 перестройках (кроме I СМ к ¡so |Ч| )||

Тип

изменения Локализация точек разрывов

1а

1Ь

1с ».

^ I

—»»гита—■—

О»

Новый аорядок

♦ 1 «С1

Точки

Перестройки разрывов и» 60 1п(2)£5а я 1п(2)40, /555-С1

Т(2:3)<л50~19 Т(2;3)050~32 Т(2;3)С5Э~8 Т(2;3)С50-27 Т(2,3)050-2

Гр(2.2)С50~26 Тр(2;2)С50-17

44П1-Л1,ЗЬ*1

4402-5.3Ь<А 44йЗ-5,ЗЬ* 44С6-7,ЗЬд*

44С2-Л,46П>-5 44АВ-е1,4и2-ВГ

3339- ¡2;41 42А5-М144£г-П

Гр(2,2)С50-2в

Т(2;3)С50- 17 ж-ъШ*-*.**«-* мае

• 1 - Т00НМ-*4 и 1Ш - 7СШвв> 21

Т(2;3}С5С-Т(2;3)С50- Г Т(2;3)С53-3 Црелпололлтелыю Т(2,3)С50-30 Ц2;3)С5а-2*

40, ЗМ 43,ЗН^ 40. ЗН«1

2н»1,* 73,3н»г,8*3 270,4С£,2Н4КЗН»1

IV

V

Обоэна чения.

, - Эугромгпок»ыв учлспсм хромосом,

«шва - Гетеросронатмноаыв участки хромосомы 2.

- Гггеротрометиповые участки хромосомы 3. Досимкша р«>ры*ов. — - Рвсттростр* некие ЭЛ.

Г(2:3)С50-4 40Л.95Г

!п(2}С50-7 1п(2)С$0-9

2)050-25 1п(2)С50-29

• - В «егсгерч* случллх оересгрснхм Оолы слс&аас, чей прълстлшлено ни рнсунх«, Стр+лх* оосядоэадгг ориентацию фрагментом отмоемтельнб нормАльмссо аорял'ш хромосом. Учлстхч хромосом оомялы «в ш иисштмОа.

•• - По* и* ни ТОЛЬ КО новые точки рязрыьоь.

Рмс.в. Схемэтическов юовраженне структуры

перестровх - гтрэдп»одмых 1гч(2)С50.

распространяется на гены района 45 А В в одном и том же направлении от

существовавшей в исходной перестройке эу/гетерохрома-типовой границы.

Следовательно, в перестройках, помещающих короткий эухроматиновый фрагмент между двумя гетерохроматиновыми блоками, происходит усиление эффекта, вызываемого исходным, неизмененным блоком 2Ь-гетерохроматина. Воздействие другого, приближенного гетерохроматинового блока является дистанционным и именно уменьшение расстояния, отделяющего индуцирующий ЭП блок от других- это тот фактор, который модифицирует проявление эффекта. При этом, если 2 разнесенных исходной инверсией блока гетерохро-матина оказываются сближенными в результате реинверсии (1Ь на рис.6), увеличивается, инактивиру-ющий эффект обоих блоков -усиливается и ЭП гена 1(2)45С'а. Цитологический анализ одной из таких перестроек - Т(2;3)С50-26 (рис.6), в которой фрагмент 45В8-44С4;46|'3-45С1 заключен между теми же, что и

Нерестропки Мутации

I>' и/ло и' АВо' «л1 Во' вь V

■ I I ....... I тЯ

ШИ2 ЦЦ

111

IV

1(2,3)050-2

1а

Ю п§

ГГ1 -,-г-р-ч—[-,■■ езЦ ива

1а П[1

□ он

о®

о®

>-1.Л.1~1..1-"; ■■■■■■ I -.1.71ИИ Г|(

а а

Д - ») • I «ЩКИРСЯИТКИОНИ (р*нмиы, Оотикши М)ОМ11Ч*НК| - еы рил. 6.

1-мг.. 7. Схематическое и«обр**ениь номплгммпшаии 1п(?>0Г»0 производных с летальными муталиями в райсм»

Ц2,3)аО~27

муао-п

в In(2)G50, блоками гетерохроматина, выявил распространение ком-пактизации от обоих точек соединения с гетерохроматином, но перекрывания компактизаций, распространяющихся во встречных направлениях, не происходит даже в условиях, усиливающих проявление ЭП - у самцов ХО.

Таким образом, исследование вторичных перестроек выявило, что расстояние, на которое удален от остального гетерохроматина индуцирующий ЭП блок гетерохроматина, является очень существенным фактором, модифицирующим проявление ЭП эухроматиновых генов. Известно, что дистанция, разделяющая гетерохроматиновые блоки, - важнейший фактор, определяющий возникновение ЭП генов, в норме расположенных в гетеро-хроматине [Хвостова,1939, Wakimoto,Hearn,1990, Eberl et аК, 1993]. ЭП таких генов возникает, если они отнесены на расстояние больше четверти эухроматинового плеча хромосомы. Предполагается, что для поддержания нормальной экспрессии гетерохроматиновых генов важна определенная локализация их в ядре и ассоциация с остальным гетерохроматином. Перемещение в проксимальные эухроматиновые районы не вызывает ЭП гетерохроматиновых генов, поскольку сохраняется возможность агрегации с гетерохроматином. На наш взгляд, этот же фактор может модифицировать п способность отделенных гетерохроматиновых блоков индуцировать инактивацию эухроматиновых генов. Район 44F-45D относится как раз к проксимальному эухроматину и, возможно, именно поэтому гетерохроматиновые перестройки в этом районе обладают высокой способностью вызывать ЭП.

ВЫВОДЫ

1) С использованием различных систем селекции мутаций выделено 19 делеций, 1 дупликация, 53 неделеционные перестройки, 53 мутации жизненно-важных генов района 44F-45C и 16 мутаций гена white, инсертированного в область 45D в составе Р-элемента.

2) Анализ мутаций, отобранных по влиянию на жизнеспособность и по вменению проявления инсертированного гена white, выявил сходные

особенности спектра радиационно-индуцированных мутаций: относительно высокую долю гетерохроматиновых перестроек и низкую -делеций и перестроек с участием эухроматиновых районов хромосом.

3) С помощью делеций и дупликации локус радиочувствительности картирован с максимально возможной для световой микроскопии точностью - в области диска 45ВЗ хромосом слюнных желез.

4) В районе 44F2-3;45C5-6 идентифицировано 18 жизненно-важных локусов, определены их цитологическая локализация, порядок и онтогенетические характеристики.

5) Обнаружено, что псе выделенные в изучаемой области гетерохрома-

15

типовые перестройки вызывают ЭП прилежащих к точке разрыва генов, а район 44-45 обладает высокой восприимчивостью к ЭП.

6) Исследование вторичных перестроек, приводящих к усилению ЭП, позволяет заключить, что расстояние, на которое удален от остального гетерохроматина индуцирующий ЭП блок гетерохроматина, является существенным фактором, модифицирующим ЭП эухроматиновых генов.

Список работ опубликованных по теме диссертации.

1.Конев А.Ю., Варенцова Е.Р., Саранцева С.В., Хромых Ю.М. Цито-генетический анализ участка хромосомы, содержащего ген радиочувствительности дрозофилы. 1. Изучение радиационного мугагенеза в районе 4445 хромосомы 2 Drosohpilamelanogaster.-TznmKa. 1991. Т.27, С.77-87.

2. Конев АЛО., Варенцова Е.Р., Хромых Ю.М. Цитогенетический анализ участка хромосомы, содержащего ген радиочувствительности дрозофилы. 2. Влияние прицентромерного гетерохроматина на мутагенез района 44-45 хромосомы 2. - Генетика. 1991. Т. 27. С.667-675.

3. Анащепко В. А., Саранцева С. В., Конев А.Ю. Молекулярно-генетический анализ радиационно индуцированных мутаций гена white, инсертированного в район 45D второй хромосомы Drosophila melanogasler.-Доклады Академии наук СССР, 1992.Т.322. С. 161-165

4. Конев А.Ю., Варенцова Е.Р., Левина В.В., Саранцева С.В., Хромых Ю.М. Цитогенетический анализ участка хромосомы, содержащего ген радиочувствительности дрозофилы. Цитогенетическое картирование гена радиочувствительности. Генетика, 1994.Т.30. N1.

5.Конев А.Ю..Варенцова Е.Р., Хромых Ю.М. Цитогенетический анализ участка хромосомы, содержащего ген радиочувствительности дрозофилы. Изучение жизненно-важных локусов района 44F-45D хромосомы 2. Генетика, 1994. T.30.N1.

6. Konev A.Yu., Varentsova E.R. Levina V.V., Khromykh Yu.M. Changes in expression of the drosophila radiosensitivity gene brought into vicinity of heterochromatin. Soviet-American symposium: "Structure of eucaryotic genome and regulation of their expression", Abstracts, Tbilisi, P. 59-60, 1989.

7. Konev A.Yu., Varentsova E.R. and Khromykh Yu. M."Cytogenetic analysis of the region of the drosophila genome with enhanced sensitivity to position effect variegation." 13 European Drosophila Research Conference, Abstracts. Aghia Pelagia, Greece, 1993.

8. Konev A.Yy. Proximity dependent interaction between hcterocliromatic regions may be important for the euchromatic loci position effect variegation. 35th Annual Drosophila Conference. Chicago, 1994.

16