Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетический и биохимический анализ одиннадцати клеточных линий лимфом Бёркитта

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетический и биохимический анализ одиннадцати клеточных линий лимфом Бёркитта"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

КАРПОВА Мария Борисовна

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ И БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОДИННАДЦАТИ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ ЛИМФОМ БЁРКИТТА

специальность : 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета и в Центре молекулярной медицины Каролинского университетского госпиталя (Швеция)

Научные руководители: профессор, доктор биологических наук

Смирнов Александр Фёдорович,

доктор Бенгт Шерифф Фадиль (Швеция)

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук

Воробцова Ирина Евгеньевна

доктор биологических наук Паткин Евгений Львович

Ведущее учреждение: ГУН НИИ онкологии

им. проф. H.H. Петрова МЗиСР

Защита состоится " '¿¿¿О&СЛЯ^- 2005 г. в. JL

часов на

заседании Диссертационного совета Д.212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан "¿£¿2" /<^--2005 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.212.232.12 кандидат биологических наук

JI.A. Мамон

sn k nn

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Механизмы злокачественной трансформации и способы борьбы с раковыми клетками в течение длительного времени являются предметом активного изучения. В настоящий момент, когда известно, что широко используемые в лечении рака химиотерапевтические препараты действуют на опухолевые клетки через индукцию клеточной гибели (апоптоз), основные усилия исследователей сконцентрированы в области изучения молекулярных основ этого процесса (Herr and Debatin, 2001; Johnstone et al, 2002). Апоптоз является важным механизмом поддержания гомеостаза тканей в организме, и нарушения в его реализации играют значительную роль в развитии раковых заболеваний и устойчивости опухолей к химиотерапии (Kroemer, 1997).

Одним из широко распространённых раковых заболеваний является лимфома Бёркитта. Лимфома Бёркитта - это разновидность В-лимфом, которая была описана в 50-е годы прошлого века британским хирургом Денисом Бёркиттом, и в последствии заболевание было названо его именем. Изначально опухоли были обнаружены, как эндемическое заболевание в Центральной Африке, где британские доктора традиционно несли гуманитарную миссию (Burkitt, 1983). Заболевание очень быстро привлекло к себе интерес исследователей, и на его примере были решены многие проблемы в исследовании рака. Например, осуществлено лабораторное культивирование раковых клеток гематопоэтического ряда, изучено влияние на развитие раковых заболеваний инфекции вирусом Эпштейна-Барр (EBV), разработан метод Q-окрашивания хромосом, описана одна из первых реципрокных транслокаций, характерных для ракового заболевания, - "Бёркитт транслокация" t(8;14), а также, описаны механизмы раковой трансформации, задействованные при этой транслокации (Epstein et al, 1966; Zech, 1971; Manolova et al, 1979). Основным материалом в исследованиях механизмов апоптоза и химиоустойчивости являются клеточные линии опухолей человека, так как их использование позволяет применять в отношении клеток человека экспериментальные виды терапии. Многие клеточные линии лимфом Бёркитта культивируются с 1960-х годов и о них накоплено много разносторонней информации, однако очень часто эта информация является устаревшей. Так, например, цитогенетическая характеристика этих клеточных линий была проведена с помощью G-окрашивания, в то время как сейчас исследователям стали доступны несравнимо более точные методы.

Кроме того, за прошедшие годы были обнаружены десятки новых белков, участвующих в апоптозе, и гораздо более детально описаны сигнальные пути этого процесса, информация о продукции которых отсутствует для многих линий (Debatin et al, 2002). Детальные исследования нарушений апоптотического аппарата и молекулярных основ химиоустойчивости клеточных линий опухолей человека позволит создать новые поколения противораковых препаратов, что приведёт к прогрессу в лечении раковых заболеваний. В частности, позволит безоперационно добиваться регрессии опухолей.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена выявлению новых хромосомных перестроек в линиях лимфом Бёркитта и изучению молекулярных

механизмов развития устойчивости этих клеточных лщщй к апоптозу.

В исследовании были поставлены следующие задачи:

1. Повести кариотипирование 11-ти клеточных линий лимфом Бёркитга с помощью современных молекулярно-цитогенетических методов: мультиплексной количественной флуоресцентной ПЦР (QF-ПЦР), спектрального кариотипирования (SKY), флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и сравнительной геномной гибридизации (CGH).

2. Определить степень химиоустойчивости используемых клеточных линий в ответ на стандартный апоптотический агент - этопозид.

3. Определить эффект от воздействия экспериментального химиотерапевтического агента - бетулиновой кислоты на клетки лимфом Бёркитга.

4. Охарактеризовать уровень продукции белков-ингибиторов апоптоза (с-ТАР1, C-IAP2, Survivin и XIAP) в используемых клеточных линиях.

Научная новизна и практическая ценность исследования. В работе впервые, в соответствии с современными цитогенетическими возможностями, проведено кариотипирование 11 -ти широко распространённых клеточных линий лимфом Бёркитта. Показано, что большинство линий являются химиоустойчивыми в отношении стандартного химиотерапевтического агента - этопозида. Продемонстрировано, что в 44% химиоустойчивые линии несли умножения генетического материала в локусе 3q25-qter и в 55% - в локусе 7qll.2-q22. Впервые определён эффект воздействия на клетки этих линий экспериментального химиотерапевтического соединения - бетулиновой кислоты. Определено, что бетулиновая кислота вызывает массовую, но неапоптотическую клеточную гибель во всех исследованных линиях. В работе исследованы некоторые молекулярные особенности клеточных линий лимфом Бёркитта, которые могут быть ответственны за развитие химиоустойчивости этих линий. Показано, что химиоустойчивые линии характеризуются способностью к поддержанию высокого уровня белка Survivin после воздействия этопозидом. Таким образом, проведённые исследования вносят вклад в изучение механизмов развития химиоустойчивости и связи этих механизмов с цитогенетическими особенностями раковых клеток. Данные работы имеют практическое значение, поскольку полученный современный молекулярно-цитогенетический паспорт исследованных линий может служить основой для объяснения различных биохимических особенностей этих линий. Апробация работы. Результаты работы были представлены на 3-ей Швейцарской конференции по Апоптозу (Берн, Швейцария, 2004), на 2,-ой межвузовской научной конференции студентов и молодых учёных "Актуальные медико-биологические проблемы" (Ижевск, 2005) и на Всероссийском съезде лимфологов (Санкт-Петербург, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на f jy страницах и содержит 25 рисунков и 12 таблиц. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материал и методы, а также результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, состоящего из источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Клеточные линии. В' работе были использованы 11 B-клеточных линий лимфом Бёркитта, доступrtb*ix в коллекции клеточных линий Центра микробиологии и биологии

опухолей Каролинского института (Стокгольм, Швеция). В качестве контрольной использовали известную химиочувствительную Т-клеточную линию Jurkat, приобретённую в Европейской Коллекции Клеточных Линий (European Collection of Cell Cultures, ECCC, Salisbuiy, United Kingdom) (см. табл. 1).

Таблица 1. Общие характеристики использованных в работе клеточных линий

Клеточная линия Пол ТР53-статус Ранее опубликованный кариотип EBV-статус Литературный источник

A ka ta Ж Мутация 46,Х0д(8ц-,14я+),+20 + Takada et al, 1991

BL-28 M Дикий тип 46,XX,1(8,14),аир(1)(я23-ч25), 19я+ - Lenoir et al, 1982, Ehlin-Henriksson et al, 1987

BL-41 м Мутация 48(42-49),ХУ,+7,-13,+2таг^(8)(ц24), 1(8,14)(я24,я32),аег( 15Ж13,15)(ч 13 ,р И), аёё(17)(р12) - Lenoir et al, 1982, Ehlin-Henriksson et al, 1987

Oaudi м Мутация 46(45-48)ХУ/ХХУ,+7, -9,К8,14)(Ч24,Ч32) + Klein el al, 1968, Nadkarni et al, 1969

DG75 м Дикий тип 46,ХУ,14ц+ - Ben-Bassat et al, 1977

Jurkat м п 87(78-91 ),ХХ,- У,-У,-5,-16,-17,-22, Ш(2)(р21 )Ме1(2)(р23)х2/ 1аеш,аег(5)(5,10)(ч 11 ,р 15),с1е1(9)(р 11) - Schneider et al, 1977

Mutu I 9 Мутация Несёт характерную транслокацию 1(8,14) + Gregory et al, 1990

Mutu III 9 Мутация Несет характерную транслокацию 1(8,14) + Gregory etal, 1990

Namalwa п Мутация ХХ,1р+,Ч+ (¿ир! 1 ц),Зц+,6ц-,+7,1(8,14),1пу 10, 13я+,-15,16я+,-21,-22, + до 6 маркерных хромосом - Klein etal, 1972

Rael п Мутация нет доступных сведений + Klein et al, 1972

Raji М Мутация 89(80-91 )<4п>ХХУУ,-4,-9,-12,-16, -18, -21, +3таг,3(1(1(4)^35),асИ(6)№7)х2, К8,14)(Ч24,Ч32),(1ег(8Ж8,14)(я24,я32), а(1(1(8)Ср12),ае1(9)(р23), аег(14)1(8,14)(Ч24,ц32) + Pulvertaft, 1964, Pulvertaft, 1965

Ramos м Мутация 49 ХУ, 1(6,17), 1(7,16), 1(8,14), +7, +2 маркерные хромосомы - Klein et al, 1975, Ehlin-Henriksson et al, 1987

'"'"- данные не известны

Молекулярно-цитогенетические методы. Анализ происхождения клеточных линий провели с помощью мультиплексной количественной флуоресцентной ПЦР (QF-ПЦР) (Pertl et al, 1999; Hulten et al, 2003). Кариотипирование проводили с использованием методов спектрального кариотипирования (SKY), сравнительной геномной гибридизации (CGH) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) (du Manoir et al, 1993; Kallioniemi et al, 1993; Schröck et al, 1996) по протоколам, предоставленным фирмами-производителями реагентов. Подробное описание этих методов приводится в работе.

Апоптотические стимулы. В качестве апоптотических стимулов в работе использовали этопозид и бетулиновую кислоту (БК). При характеристике степени устойчивости клеточных линий к воздействию этопозида использовали стандартные условия: среда с добавлением сыворотки (10%), 24 часа, 6 мкг/мл (Fadeel et al, 1999). При изучении эффекта воздействия бетулиновой кислоты использовали ранее опубликованные условия: инкубация в течение 6 часов в среде без сыворотки с концентрацией бетулиновой кислоты 10 мкг/мл (Ehrhardt et al, 2004). В качестве дополнительных условий воздействия в экспериментах с бетулиновой кислотой применяли пре-инкубацию клеток с общим ингибитором каспаз zVAD-fmk (benryloxycarbonyl-Val-AIa-Asp (VAD) -^Iuoromethyl&etone): 30 минут, 10 мкМ (Fadeel et al, 1999); и воздействие этопозидом в сходных с бетулиновой кислотой условиях: среда без сыворотки, 6 часов, 6 мкг/мл.

Методы проточной цитометрии. При анализе апоптотических изменений в клетках применяли известные методы проточной цитометрии: анализ содержания ДНК, анализ активации каспазы-3, анализ презентации фосфатидилсерина на поверхности клеток и анализ фронтального светорассеяния клеток. В этих экспериментах использовали коммерческие растворы йодида пропидия (Beckton Dickinson), антител против активной каспазы-3, связанных с флуорохромом FITC (Beckton Dickinson) и FITC-связанного белка Аннексин-V (Boehringer Mannheim) При необходимости клетки фиксировали либо в 70% ледяном спирте, либо с использованием растворов Cytofix/Cytoperm™ и Perm/Wash™ (Beckton Dickinson). Все манипуляции с клетками проводили в соответствии с протоколами фирм-производителей упомянутых реагентов. Анализ флуоресценции проводили на цитофлуориметре FACS Calibur при помощи программного обеспечения CellQuest (Beckton Dickinson). Подробное описание этих методов приводится в тексте диссертации.

Анализ морфологических изменений в клеточных ядрах. Для того, чтобы проследить наличие пикнотических ядер в ответ на воздействие апоптотическими стимулами из культуры клеток готовили цитологические препараты осаждая клетки на предметные стёкла с использованием центрифуги Shandon™Cytospin® 3 (Thermo Electron Corporation). После просушивания препараты окрашивали раствором DAPI (0,15 мг/мл) и анализировали на флуоресцентном микроскопе.

Анализ энзиматической активности каспаз -3 и -7. Энзиматическая активность каспаз -3 и -7 оценивалась по силе свечения высвобождаемого аминометилкумарина (АМК) при специфическом энзиматическом расщеплении флуорогенного субстрата для упомянутых каспаз Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-AMK (Thornberry, 1994). Иммуноблоттинг. Белки разделяли в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). Концентрирующий гель (рН=6,8) содержал 4% полиакриламида, разделяющий (рН=8,8) - 14%, сила тока составляла 20 мА (Laemmli,

1970). После разделения белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану методом полусухого переноса при напряжении 80 В в течение 1 часа (Towbin et al, 1979). Относительное количество нанесённого на гель белка определяли по окрашиванию мембран Ponseau S. Затем мембраны обрабатывали коммерческими антителами к белкам-ингибиторам апоптоза с1АР-1 и сГАР-2 (R&D Systems), XIАР (BioSite) и Survivin (Cell Signalling Technology), в разведениях, рекомендованных производителями. В качестве вторичных использовали антитела, меченные пероксидазой хрена (Santa Cruz Biotechnology). Детекцию сигналов и количественную оценку всех изображений проводили с помощью анализатора изображений Image Reader LAS-1000 при использовании программного обеспечения Image Gauge (Fujifilm).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Кариотипирование клеточных линий лимфом Бёркитта

В исследовании использовали широко распространённые 11 B-клеточных линий лимфом Бёркитта: Akata, BL-28, BL-41, Daudi, DG-75, Mutu I, Mutu III, Namalwa, Rael, Raj i и Ramos. Одной из основополагающих характеристик клеточных линий является кариотип, поэтому, при появлении более точных молекулярно-цитогенетических методов, необходимо постоянно проводить дополнение имеющихся сведений о кариотипах линий. Кариотипирование представляет собой сложный и трудоёмкий процесс и, чтобы избежать включения в исследование контаминированных культур клеток, перед его началом нами был проведён анализ уникальности происхождения выбранных клеточных линий с помощью мультиплексной количественной флуоресцентной ПЦР (QF-ПЦР). В последние годы исследование клеточных линий всё чаще сталкивается с проблемой их контаминации, то есть проблемой заноса в клеточную культуру клеток другой линии и их разрастания. На сегодняшний день контаминированными являются 15-20% всех клеточных линий лейкемий и лимфом. Такая контаминация, в случае гематопоэтических клеток, чаще всего осуществляется быстро растущими и неприхотливыми клетками линии Jurkat (Drexler, 2003). Полученные в ходе QF-ПЦР анализа данные подтвердили уникальность генотипов десяти клеточных линий: Akata, BL-28, BL-41, Daudi, DG-75, Jurkat, Namalwa, Rael, Raj i и Ramos, в то время как генотипы линий Mutu I и Mutu III, полученных от одного пациента, были идентичны (результаты приведены в диссертации). Так же в ходе анализа нами были выявлены и исключены из дальнейшего исследования два образца, контаминированные клеточной линией Jurkat.

После окончательного отбора образцов клеточных линий было проведено их спектральное кариотипирование (SKY). SKY - это метод, который позволяет различать 22 аутосомы и половые хромосомы X и Y. Результаты спектрального кариотипирования позволили нам выявить 41 численную аномалию и 63 структурные аберрации, в том числе среди структурных аберраций были выявлены 45 транслокаций, 8 делеций и 9 дупликаций, большинство из которых ранее не были описаны (рис. 1). Все клеточные линии несли специфичную для лимфом Бёркитта транслокацию t(8;14)(q24;q32) и, как правило, ещё одну дополнительную аберрацию. Общее число аберраций на кариотип клеточной линии варьировало от 2-х до 11-ти, при наибольшем их числе в кариотипе линии Namalwa. Ни одна из структурных аберраций, кроме транслокации t(8;14)(q24;q32), не встречалась во всех 11-ти B-клеточных линиях. Однако, были

Akata главная линия | ^ хр 11 л I клональные аберрации ' dor<3; 22) drr(15; 1»)

der(2: 13) der<4; 11) Я • ■ Я; .хр. 14 шщ dcr(8; 14) i ж, ■ В -,р2° «II do""> И' • Д! '.«р. 15 Ы. - хр. 13 dcr{14; 15) dcr(13. 20) х 2 BL-28 № ♦ 13 •i С4 derIS; 14)

В|-41 я .р.. .и,- 4Пг ""10 И1 И XP4 1131... 7 UI " ЩЛ ' Хр dor(4; К) der(4; 7) der<8: 10) Jvp,í *Bl:::;4 §01- В*-:- di»r(8; 14) d«r(3. 1S> der(3; 17)

ОаисП главная линии »□• II» ЕВ« *И|::г + 7 клональные аберрации к R dor{2; 15)

ОС-75 главная линия и сублиния ¡<1отх2 ¿ег(4; 1«) "^ег^в: 14) Mutu 1 . □ Y::: der{»; 14) □ □ □ + ?0

Namalwa главная линия

хр. 3 <р 5

qi i т

derf3: 5)

fdü,"V- íflM: tlf.

• «Р 2 der(3; 10) der(3; 12)

хр 12

der(2; •)

*p 1 B^flS 1 клональные Ш хр17*ИШ I аберрации

der| 1: 17) dor(i5; 15) |

der(«; 14) x 2

f ■*•<* » D9 Z «

der< 1: 2)

lt>r{15, 1«)

Рае1

главная линия

m

d*r(l; 14)

0

H cter(9; 15)

p Я

%

H<T¡ - xp IT

сублиния ¡dem, +20

t»Q ig

- *p 7 *p 11

Ка]| линия основатель

П I

■I Нпг(7)1(7.11)

4сг(4)1(4:1) _ ——

»□< ::: »в

В.

dor(4)!(4:1)

•во:::

dcr|14)l(».14)

Sil.

id*r{tHq10)l(12:«)

EL

хр. 6 • хр 21

d«f(21)t(G;21)

главная линия idemx2,-6,t(16,17) хр. 16 хр. 17

gt

dcr(16)t(16 17)

сублиния

id<«m*2.-6.1(16)

^ ВЩ хп 16

Mutu III n вр 4 П -o

клональнм* аберрации lili» *P 4 ^r i ! *р6

„ j'f-.P-M Ы -хр.1« *У "-«Р-.З

ГТ1 dor(4: 14: 20) dor{6:13)

_ •М' dc-r(4: 14: 20)

•■I d"f|| 0|:;:г *тгр15

• xp. 8 UЩ . хр ie

dcr(t; 14) x 2 dor( 15; 16)

РаГЛОЭ главная линия 1 линия основатель

1|И;Сг в»::.- и:

Ц| d^^^(Э: 13) I аог(В; 14) .7

Й.П2:7) -..<3:13; 17) | <1о.(7; 16)

•0! -хр/ ¡Й-.Р-Ю ^ '

Рис. 1. Аберрации, выявленные методом Чк\ в исспе юванных В-клегочных линиях

На рис\ нке представлены только аберрантные хромосомы Для каждого деривата приведены видимое глазом изображение (слева) негатив от ОАР1-окра-шивания (в центре) и классификационные цвета программы БкуХче^ 2 I (справа) Подписями обозначены ччастки хромосом, вовлечённых в транслокации приведены краткие описания дериватов Кроме аберраций в основных попутяциях приведены аберрации клонов, побочных линий и линий основатели

обнаружены аберрации, которые встречались по несколько раз, включая транслокации с вовлечением хромосом 3, 4, 7, 13, 17 и трисомию хромосомы 20. Также, была выявлена субпопуляционная структура некоторых линий и установлены эволюционные отношения между внутрилинейными популяциями. В целом следует отметить цитогенетическую гетерогенность и сложность исследованных линий. Кариотипы даже тех линий, которые имели сходные генотипы по данным QF-ПЦР анализа, отличались по данным спектрального кариотипирования. Следует особо отметить различие кариотипов у линий Muta I и Mutu III, полученных от одного пациента. SKY анализ позволил нам определить происхождение всех маркерных хромосом. Однако точная цитогенетическая локализация структурных аберраций представляла некоторое затруднение, в связи с этим была проведена сравнительная геномная гибридизация (CGH). CGH - это метод, основанный на совместной гибридизации геномной ДНК контрольного и экспериментального образцов, что позволяет определить, какие участки хромосомного набора присутствуют в избытке, а какие - в недостатке. Сопоставление полученных нами результатов SKY и CGH позволило локализовать большинство точек разрыва выявленных хромосомных аберраций. Дополнительные копии целых хромосом были свойственны хромосомам 7 и 20, избыточный генетический материал участков хромосом был отмечен на длинных плечах хромосом 3, 13, и 16, а также, на коротком плече хромосомы 2. Потери генетического материала выявлены на коротких плечах хромосом 3 и 17, и на длинном плече хромосомы 4. Описано шесть участков многократного умножения генетического материала в районах 3q21-qter (BL-41), 3q25-qter (Ramos), 5pter-qll.2 (Akata), 7ql0-q32 (Ramos), 13ql4-qter (Akata) и целой хромосомы 20 (Akata). Кроме этого, были выявлены районы, наиболее часто подверженные умножениям генетического материала: 2pl6-pter, 3q25-qter, 7qll.2-q22, 13ql4, 13q31, 16ql2.1-q21; и потерям ДНК: Зр14 и 17р. После анализа результатов SKY и CGH невыясненным оставалось происхождение всех участков хромосом, образующих дериват хромосомы 8 в линии Raj i. SKY анализ показал, что эта маркерная хромосома является метацентрической и вовлечена в транслокацию с участием хромосом 8 и 12, в то время как CGH анализ выявил более сложную её структуру. В связи с этим была проведена флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с использованием набора проб, подобранных к районам хромосом, которые могли быть вовлечены в образование деривата хромосомы 8. Что позволило нам определить структуру аберрантной хромосомы 8 линии Raji как Íder(8)(ql0)t(8;12)(q22;pll.2)t(8;14)(q24;q32).

Таким образом, использования целого комплекса молекулярно-цитогенетических методов: спектрального кариотипирования, сравнительной геномной гибридизации и флуоресцентной гибридизации in situ, нами были установлены полные кариотипы всех исследованных клеточных линий (табл. 2).

Таблица 2. Полные кариотипы одиннадцати B-клеточных линий лимфом Ьбркипа

Клеточная линия Кариотип

Akata 47,X,-X,t(4,11 )(pl6 3,q 13),+i(5)(p 10),t(8,14)(q24,q32),der( 13)t(2,13)(p12,p 11), der( 14,15)(q 10,q 10),+der(20)t( 13,20)(q 14,q 13 3)x2[ 18]/47,idem,t(3,22)(q29,q 11 )[3]/47, idem,der( 15)t( 15,18)(q22r",q23'')[4]

BL-28 47,XY,t(8,14)(q24,q32),dup(12)(q22q24 I),del(13)(q21q22),+ 13,dup(16)(pll 2pl3 1)[18]

BL-41 45,XY,der(2)t(2,16)(q35,qI2),del(3)(ql3 2q13 3),der(4)t(4,18)(ql3,q''),+der(7)t(4,7)(q21 ,p21), der(8)t(8,10)(p23,ql 1 2),t(8,14)(q24,q32),-10,dup(13)(ql4q31),der(15)t(3,15)(q21,pll 1), der( 17)t(3,17)(q21 ,p 11 2),-18[ 19]

Dandi 47,XY,+7,t(8,l 4)(q24,q32)[26]/47,idem,der(2)t(2,l 5)(q34'>,q22'>)[2]

DG-75 46,XY,der(4)t(4,18)(q31 3,q 12),t(8,14)(q24,q32)[ 19]/92,idemx2[6]

Mutu I 46,XY,t(8,14)(q24,q32),+20

Mutu III 58~79,XXY,+Y,-1 ,+2,-2,+i(2)(p 10),+i(3)(q 10),-4,der(4)t(4, HXqW), der(4)(4,14,20)(q'>,q'?,q''),-5,+6,-6,der(6,13)^^),+7^ир(8)(р2 lq23), -8,t(8,l 4)t(q24,q32)x2,-9,+10,-10,+11,-1112,+del( 12)(q''),-!3,-I4,+ I6, +der( 16)t( 15,16)(q 19,q24),-17,-18,+19,-19,+20,+21,-21 ,+22,-22[cp27]

Namalwa 47,X,-Y,,dup(l)(q 12q25),t(2,8)(p 11 ,q24 3),del(3)(pl 1 Ip21),der(3)t(3,5)(q29,q22'>), del(5)(q22'>),+7,t(8,14)(q24,q32),der( 10)t(3,10)(q26 2,pl5 3),der(12)t(3,12)(q24,pl3 3), del( 14)(q 13q22),+der( 14)t(8,14)(q24,q32),der( 15)t( 15,15)(p 11 ,q24), ins( 17,1 )(p 11 ,p22p31 )[6]/47,idem,-der( 10)t(3,10)(q26 2,p 15 3),+10, -der( 15)t( 15,15)(p 11 ,q24),der( 15)t( 1,15)(p?,p 11 )[4]/47,idem,-t(2,8)(q 11 ,q24 3), der(2)t( 1 ДХр^р 11 ),der(8)t(2,8)t(p 11 ,q24 3)[2]

Rael 44,X,-Y'>,del(9)(q21 q22),der(9,17)(pl 0,p 10),t(8,14)(q24,q32),der(9,15)(ql0,q 10),-17,i(l 7)(q 10)[ 12]/45,idem+20Г91

Raji 48,XY,der(4)t(l ,4)(p36 1 l,q35),der(7)t(7,l l)(q22 l,pl5 4), ider(8)(q 10)t(8,12)(q22 ,p 11 2)t(8,14)(q24,q32), der( 14)t(8,14)(q24,q32),+20,der(21 )t(6,21 )(q 13q26,p 10),[ 14]/ 95,XXYY,der(4)t(l,4)(p36.1 l,q35),-6,der(7)t(7,ll)(q22 l,pl5 4), ider(8)(ql0)t(8,12)(q22,pl 1 2)t(8,14)(q24,q32),der(14)t(8,14)(q24,q32), der( 16)t( 16,17)(q 11 ,q23 2),+20,der(21 )t(6,21 )(q 13q26,p 10),[28]/ 95,XY,der(4)t(l,4)(p36 1 l,q35),-6,der(7)t(7,l l)(q22 l,pl5 4), ider(8)(q 10)t(8,12)(q22,p 11 2)t(8,14)(q24,q32), der(14)t(8,14)(q24,q32),i(16)(ql0),+20,der(21)t(6,21)(ql3q26,pl0),[3][cp45]

Ramos 45,X,-Y,del(3)(pl4pl4),t(8,14)(q24,q32),psu dic(7,16)(p 11 ,p 13),der( 17)t(3,13,17)(q25 ,q31 q 14,p 11 1)[15]/ 48,idem,+der(7)t(2,7)(pl6,q32),der( 13)t(3,13)(q25 ,q31),+17,+20[24]

В целом, с помощью молекулярно-цитогенетического анализа было локализовано большинство структурных аберраций, выявленных в ходе спектрального кариотипирования. Не удалось локализовать 21 точку разрыва, так как они были вовлечены в сбалансированные аберрации, либо располагались в сублиниях и клонах, поэтому не могли быть доступны для обнаружения методом CGH.

Метод спектрального кариотипирования используется при клинической диагностике острых детских лимфобластных лейкозов уже восемь лет, так как позволяет выявлять прогностически важные аномалии не выявляемые традиционными цитогенетическими методами, такими как G-окрашивание (Nordgren et ai, 2001; Nordgren el al, 2002; Veldman et al, 1997). Некоторые клеточные линии, использованные в данной работе, были выделены до внедрения в практику молекулярно-цитогенетических методов и ранее полученные кариотипы этих линий были получены методом G-окрашивания (см. табл. 1) Это объясняет тот факт, что многие сложные аберрации, такие как der(3; 13; 17) в линии Ramos или der(4;14;20) в линии Mutu III, не были отмечены в предыдущих исследованиях. Сложность описанных нами кариотипов поднимает один из спорных вопросов в изучении клеточных линий - вопрос о стабильности их кариотипов. Предыдущие исследования показали, что, несмотря на десятилетия культивирования, клеточные линии могут оставаться кариотипически

стабильными при условии бесстрессового культивирования (Macville et al, 1999). Однако, при стрессе, или ведении селективного отбора на устойчивость к антибиотикам, кариотип клеточной линии может значительно измениться (Knutsen et al, 2000; Bylund et al, 2004). В нашем исследовании также имеется подтверждение этого факта. Кариотипы клеточных линий Mutu I и Mutu III, полученных от одного пациента, значительно различались. При выделении этих линий был применен отбор по признаку программы латентности вируса EBV, что, очевидно, оказало большое влияние на конституцию их кариотипов. Транслокация t(8;14)(q24;q32) с вовлечением онкогена с-тус является цитогенетической "визитной карточкой" лимфом Бёркитта и это было одним из первых хромосомных нарушений, найденных в раковых опухолях (Dalla-Favera et al, 1982; Taub et al, 1982). После описания этой транслокации в лимфомах Бёркитта было выявлено несколько дополнительных характерных генетических событий, включая делеции 17р и мутации в гене р53 (Farrell et al, 1991; Gaidano et al, 1991), транслокации или мутации гена BCL6, расположенного на длинном плече хромосомы 3 (Baron et al, 1993; Capello et al, 1997). Несмотря на известную прогностическую значимость дупликаций длинного плеча хромосомы 1 (Douglass et al, 1980; Gurtsevitch et al, 1988; Kornblau et al, 1991; Zimonjic et al, 2001), в нашей работе только линия Namalwa несла данную аберрацию хромосомы 1 (локус Iql2-q25). Однако, нами были отмечены другие часто встречающиеся аберрации, включая трисомии хромосом 7 и 20, транслокации с вовлечением хромосом 3, 13 и 17. Все эти аберрации были ранее описаны в различных типах первичных опухолей и клеточных линий. Так, например, при изучении цитогенетических особенностей клеточных линий неходжкинских лимфом были отмечены частые изменения баланса генетического материала в локусах 3q, 7р, 7q, 13q и 17р (Mehra et al 2002), а в недавнем исследовании детских лимфом Бёркитта была выявлена прогностическая значимость хромосомных аберраций с участием локуса 13q32 (Lones et al, 2004). Сравнение кариотипов клеточных линий с кариотипами первичных опухолей представляет особую важность, так как дает представление о том, насколько адекватно клеточные линии могут представлять опухоли, из которых они были выделены. 2. Химиоустойчивость клеточных линий к этопозиду

Этопозид - это широко используемый в клинической практике химиотерапевтический препарат (другие названия: вепезид, VP16), действующий на опухолевые клетки через блок топоизомеразы-2, что вызывает апоптоз. Одним из финальных событий клеточной гибели являются фрагментация ДНК и активация через протеолиз основного исполнительного фермента апоптоза - каспазы-3. Следовательно, по количеству ДНК в клетках и присутствию активной каспазы-3 можно определить наличие апоптоза. Поэтому, для того чтобы установить степень химиочувствительности исследуемых клеточных линий нами были использованы два метода, основанных на проточной цитометрии:

1) метод окрашивания йодидом пропидия, позволяющий определить по содержанию ДНК процент умирающих клеток, которые формируют собой популяцию клеток в фазе Sub-Gl;

2) метод иммуноокрашивания антителами, специфичными к активной форме каспазы-3, меченными флуорохромом FITC, позволяющий определить долю клеток с активированной каспазой-3.

Результаты анализа представлены в таблице 3. При сравнении ответов клеток

лимфом Бёркитта и клеток контрольной линии Jurkat B-клеточные линии разделили на: а) химиочувствительные (Akata, BL-28); б) химиоустойчивые (BL-41, Daudi, DG-75, Mutu I, Mutu III и Raji); и в) промежуточно-химиоустойчивые (Namalwa, Rael и Ramos).

Таблица 3. Анализ химиоустойчивости 11 клеточных линий лимфом Бёркитта в ответ на воздействие этопозида_____

Клеточная линия Число клеток в фазе Sub-Gl, % Число клеток с активной каспазой-3, % Заключение

Контроль Этопозид Контроль Этопозид

Akata 8 + 1,2 23 ± 1,2 8± 1,2 56 ±2,1 Химиочувствительная линия

BL-28 8 + 2,1 26 ±2,1 6± 1,3 70+1,3 Химиочувствительная линия

BL-41 6 ±2,0 9 + 2,0 6± 1,1 13 ±2,2 Химиоустойчивая линия

Daudi 3± 1,1 6± 1,2 6± 1,1 20 ±2,1 Химиоустойчивая линия

DG-75 2± 1,1 3 ± 1,3 26 + 3,2 6± 1,4 Химиоустойчивая линия

Mutu I 8± 1,4 12+1,5 8± 1,3 18 ±2,8 Химиоустойчивая линия

Mutu III 6± 1,1 9± 1,4 19± 1,7 16 ±9,1 Химиоустойчивая линия

Namalwa 4± 1,1 32 ± 1,7 11 ± 1,9 42 ± 1,9 Промежуточно -химиоустойчивая линия

Rael 9 ±2,3 18 + 2,4 11 ± 1,4 30 + 3,7 Промежуточно -химиоустойчивая линия

Raji 10 + 2,2 12 ± 2,1 4± 1,2 6 ± 2,1 Химиоустойчивая линия

Ramos 10 + 2,1 21+2,6 14 ±3,2 29 ± 2,7 Промежуточно -химиоустойчивая линия

Jurkat 8 ±3,2 29 ± 3,8 9 ±2,1 83 + 3,9 Химиочувствительная линия

В таблице приведены средние от измерений трех независимых экспериментов и их ошибки

Химиочувствительные линии при использовании обоих методов показывали достоверно сходное количество апоптотических клеток с линией Jurkat, химиоустойчивые - достоверно различное (р<0,01). Промежуточно-химиоустойчивые линии имели меньшее количество клеток в фазе SubGl, чем клеток с активированной каспазой -3, однако их количество было отличным от количества клеток с активной каспазой в контрольной линии Jurkat (р<0,01).

Устойчивость к апоптозу является одним из основных свойств раковых клеток и приводит к их химиоустойчивости (Kaufmann and Vaux, 2003). Так, около половины всех опухолей несут мутации гена р53 или другие повреждения, приводящие к их неспособности к апоптозу (Lowe et al, 2004). Например, меланомы отличает гиперметилирование промотора гена APAF-1 (Soengas et al, 2001), а в клеточной линии Raji белок Apaf-1 ассоциирован с плазматической мембраной, что мешает ему выполнять свою функцию активации каспаз (Sun et al, 2005). В ходе нашего исследования было показано, что большинство линий являются устойчивыми к воздействию этопозида, однако не все они несли мутации в гене р53, что говорит о наличии дополнительных факторов, влияющих на развитие химиоустойчивости. Такие факторы могут располагаться в определённых нами локусах частых аберраций, таких как 2pl6-pter, Зр14, 3q25-qter, 7ql 1.2-q22, 16ql2.1-q21,13ql4, 13q31 илокусе 17p. 3. Воздействие на клетки лимфом Бёркитта бетулиновой кислоты

Установив, что девять из одиннадцати использованных B-клеточных линий являются в разной степени устойчивыми к воздействию этопозида, нами было решено изучить чувствительность этих линий к экспериментальному соединению -бетулиновой кислоте (БК). Бетулиновая кислота является трициклическим тритерпеном растительного происхождения. Это соединение показало способность вызывать апоптоз в клетках нейроэктодермальных опухолей и лейкемий, однако, только в среде без добавления сыворотки из эмбрионов крупного рогатого скота. При установлении наличия и характера клеточной гибели в ответ на воздействие бетулиновой кислотой были использованы следующие методы:

а) анализ презентации на поверхности клеток фосфатидилсерина и б) анализ фронтального светорассеяния - для того чтобы определить соотношение некроза и апоптоза в популяции клеток после воздействия апоптотическими стимулами;

в) анализ энзиматической активности каспаз -3 и -7 и г) анализ морфологических изменений клеточных ядер - для того, чтобы определить является ли наблюдаемая клеточная гибель апоптозом. Линия Jurkat служила в проведённых экспериментах положительным контролем.

Одним из широко используемых и требующих небольшого количества клеток экспресс-методов определения апоптоза в клеточной популяции in vivo является метод анализа презентации фосфатидилсерина на поверхности клеток, так как этот метод позволяет различить апоптотическую и некротическую фракции среди умирающих клеток. Фосфатидилсерин - это фосфолипид, который клетка презентирует на своей поверхности в ходе гибели Этот липид является одним из нескольких "сигналов" к фагоцитозу презентирующих его клеток макрофагами, в том числе и в ходе апоптоза. Нами была выявлена неспособность всех использованных В-клеточньгх линий к презентации фосфатидилсерина в ответ на воздействие как БК, так и этопозидом Блокировка каспаз ингибитором zVAD на процесс презентации фосфатидилсерина влияния не оказывала, однако во всех линиях наблюдалось довольно большое количество умирающих клеток (данные приведены в тексте диссертации). Эти данные говорят о том, что бетулиновая кислота способна вызывать гибель клеток, однако этот процесс не является классическим апоптозом лимфоцитов с вовлечением каспаз и презентацией фосфатидилсерина.

Для того чтобы подтвердить наличие массовой клеточной гибели в ответ на воздействие БК мы обратились к анализу фронтального светорассеяния. При этом использовали те же образцы, что и при анализе презентации фосфатидилсерина. В ходе анализа фронтального светорассеяния было обнаружено, что бетулиновая кислота способна вызывать клеточную гибель как в химиочувствительных клеточных линиях (BL-28), так и в химиоустойчивых (BL-41, Daudi, DG-75, Mutu I, Raji) и промежуточно-химиоустойчивых (Rael и Ramos) линиях. Во всех этих клеточных линиях, кроме Mutu I, бетулиновая кислота приводила к появлению большего количества умирающих клеток, чем этопозид Особенного внимания заслуживает факт влияния ингибитора каспаз zVAD на количество умирающих клеток в популяции. В линиях Akata, BL-28, Rael и Raji пре-инкубация с zVAD усиливала эффект бетулиновой кислоты, в то время как в линиях Namalwa и Ramos - наоборот, снижала Чтобы установить природу наблюдаемой от воздействия бетулиновой кислотой клеточной гибели, был проведен анализ энзиматической активности каспаз -3 и -7. Каспазы -3 и -7 являются исполнительными каспазами апоптоза, и наличие их активации означало бы наличие

апоптоза в клетках. Для того чтобы провести анализ энзиматической активности каспаз -3 и -7 был выбран экспресс-метод, основанный на измерении флуоресценции высвобождаемого АМК при специфическом расщеплении каспазами -3 и -7 флуорогенного субстрата DEVD-AMK. Было показано, что бетулиновая кислота вызывает активацию каспаз в контрольной линии Jurkat, а также в В-клеточной линии Ramos. Во всех остальных клеточных линиях, включая те, где наблюдалась массовая клеточная гибель при анализе фронтального светорассеяния, не наблюдалось активации каспаз в ответ на воздействие бетулиновой кислотой. Однако, активация каспаз -3 и -7 присутствовала в клеточных лизатах после воздействия этопозидом, подтверждая данные, полученные при помощи проточной цитометрии (табл. 4).

Таблица 4. Анализ энзиматической активности каспаз -3 и -7 в клетках лимфом Бёркитта после воздействия этопозида и бетулиновой кислоты, в пикомолях __

Клеточная линия Контроль Бетулиновая кислота Этопозид Бетулиновая кислота + Этопозид

Akata 0,83 ±0,194 0,91 ±0,303 8,53 ± 1,929 0,07 ±0,010

BL-28 0,39 ± 0,097 0,40 ±0,081 2,16 ±0,185 1,60 ±0,101

BL-41 1,14 ±0,337 1,61 ±0,459 4,67 ± 1,462 3,82 ± 0,402

Daudi 0,51 ±0,212 0,11+0,082 3,91 ±0,765 2,39 ± 1,308

DG-7S 0,15 ±0,037 _ 0,14 ±0,064 0,37 ±0,108 0,37 ±0,122

Mutu I 2,04 ± 0,525 1,47 ±0,360 15,47 + 4,432 12,01 ± 0,599

Mutu III 11,46 ±0,538 8,87 ± 1,819 19,25 ±2,601 17,01 ±4,576

Namalwa 1,06 ±0,426 1,47 ±0,285 22,27 ±6,177 17,65 ±3,382

Rael 0,65 ± 0,099 0,44 ± 0,208 0,85 ± 0,306 0,50 ± 0,092

Raji 0,73 + 0,198 0,65 ±0,318 0,98 ±0,189 0,09 ± 0,030

Ramos 4,01 ± 1,020 5,65 ±1,983 18,48 + 4,891 21,18 ±6,479

Jurkat 3,95 ± 0,677 6,86+ 1,285 22,79+ 1,460 20,26 ± 0,767

Данные представляют собой средние от измерений трёх независимых экспериментов и их ошибки

Кроме активации каспаз, одним из маркеров апоптоза является конденсация и фрагментация клеточных ядер с образованием апоптотических телец, или кариорексис (пикноз). Чтобы вьиснить, имел ли этот процесс место в ответ на воздействие бетулиновой кислотой, был проведён анализ морфологических изменений ядер на цитологических препаратах, окрашенных DAPI. Анализ морфологических изменений клеточных ядер не выявил массового образования пикнотических ядер в ответ на воздействие бетулиновой кислотой во всех исследованных линиях (данные приведены в диссертации).

Представленные данные свидетельствуют о том, что клеточная гибель, наблюдаемая в исследованных линиях в ответ на воздействие бетулиновой кислотой, не является апоптозом. Этот процесс является каспазонезависимым (кроме линии Ramos) и не влечет за собой характерных морфологических изменений, таких как конденсация клеточных ядер в исследованных B-клеточных линиях. Однако, бетулиновая кислота имела определенный цитотоксический эффект в отношении исследованных клеточных линий, но вызываемая ею клеточная гибель скорее являлась некрозом. Полученные нами данные противоречат ранее опубликованным наблюдениям о способности бетулиновой кислоты вызывать апоптоз в клетках нейробластом, лейкемий и меланом (Schmidt et al, 1997; Fulda et al, 1999; Selzer et al, 2000; Zuco et al, 2002; Fernandes et al,

2003). Эти авторы предполагают, что бетулиновая кислота действует на сигнальный путь митохондриального апоптоза. Как мы уже отмечали выше, дефекты в сигнальных путях апоптоза далеко не редкость в раковых клетках и, возможно, такие нарушения в исследованных нами линях не позволили бетулиновой кислоте вызвать адекватную реакцию. Полученные данные представляют собой ценное для клинической практики наблюдение о возможном развитии очагов массивного некроза при действии бетулиновой кислоты, что представляет собой отрицательную характеристику для возможного химиотерапевтического агента.

Принципиально отметить и то, что ни в ответ на воздействие бетулиновой кислотой, ни в ответ на воздействие этопозидом исследованные клеточные линии не были способны к презентации фосфатидилсерина. Фосфатидилсерин (ФС) впервые был описан как компонент мембраны эритроцитов и тромбоцитов, участвующий в разворачивании каскада свёртывания крови (Zwaal and Schroit, 1997). При апоптозе презентация ФС происходит на поверхности тимоцитов, лимфоцитов, нейтрофилов и многочисленных раковых клеточных линий (Fadok et al, 1998). Однако, этот феномен свойственен не всем раковым клеткам. Механизм презентации ФС до конца не изучен, но известно, что его присутствие на поверхности мембраны и последующее окисление являются необходимыми для распознавания и фагоцитоза умирающей клетки макрофагами (Martin et al, 1996; Naito et al, 1997; Fadeel et al, 1999; Fadok et al, 2001; Kagan et al, 2002). Поскольку исследованные клеточные линии не были способны к презентации ФС, то можно предположить, что даже при индукции апоптоза клетки этих линий не подверглись бы фагоцитозу со стороны макрофагов, что в условиях целого организма не привело бы к активации иммунной системы и не вызвало бы элиминации опухоли. Описание подобных примеров убедительно демонстрирует необходимость детального изучения механизмов апоптоза и различных нарушений в его реализации, что позволит управлять этим процессом в опухолевых тканях.

4. Уровень продукции белков-ингибиторов апоптоза c-IAPl. C-IAP2, Survivin и XI АР в клеточных линиях лимфом Бёркитта

Белки-ингибиторы апоптоза - это внутриклеточные регуляторы процесса клеточной гибели. Эти белки способны блокировать действие различных участников этого процесса и способствовать их ускоренной деградации. Повышенный уровень экспрессии этих белков является одним из механизмов развития устойчивости клеток к апоптозу. Чтобы выяснить базальные уровни продукции четырех белков-ингибиторов апоптоза - cIAP-1, cIAP-2, Survivin и XIАР был проведён иммуноблотгинг. Оказалось, что все клеточные линии имеют достоверно повышенный (р<0,01), относительно линии Jurkat, уровень экспрессии хотя бы одного из белков-ингибиторов апоптоза (данные приведены в тексте диссертации). При сравнении уровня продукции белков-ингибиторов апоптоза в клетках до и после воздействия этопозидом было отмечено, что в линии Jurkat наблюдается снижение уровня всех четырёх исследуемых белков в ответ на стимуляцию апоптоза. Сходная тенденция была обнаружена в химиочувствительных В-клеточных линиях (Akata,BL-28) для белков cIAP-1, с1АР-2 и XIAP. В большинстве химиоустойчивых и промежуточно-химиоустойчивых линий, в отличие от химиочувствительных, после воздействия этопозидом уровень белков-ингибиторов апоптоза cIAP-1, cIAP-2 и XIAP не снижался (кроме Namalwa и Mutu III). А в случае белка Survivin, напротив, наблюдалось повышение уровня его содержания в стимулированных этопозидом клетках линий Bl-41, DG-75, Mutu I, Mutu III, Ramos

(р<0,01). В линиях Rael и Raji отличия уровня содержания белка Survivin в контрольном и обработанном этопозидом образцах были недостоверными, и только в линии Namalwa наблюдалось его достоверное снижение (р<0,01 ) (рис. 2).

% 250

Survivin

*

i

£

F &

/А

% 250

clAP-1

Î

iïilïïlii

Jl

y ov <$■

Jt

XIAP

1

Mil

JÎ

» ^

% 250

«* <r

clAP-2

tdBffl

До*

<? <r #

Рис. 2. Уровень содержания белков-ингибиторов апоптоза в клетках лимфом Бёркитта, стимулированных этопозидом относительно интактных клеток тех же линий, в %

0- химиочувствительные линии, Д - промежуточно-химиоустойчивые, I - химиоустойчивые, и I I-контрольная линия Jurkat Полоса, выделяющая 100%-ный уровень экспрессии, обозначает уровень экспрессии

в интактных клетках, с которым проводилось сравнение содержания белков (р<0,01 )

- достоверные отличия от контрольного уровня

Таким образом, анализ уровня содержания белков-ингибиторов апоптоза с1АР-1, cIAP-2, Survivin и XIAP выявил наличие у химиоустойчивых линий механизма, обеспечивающего повышение уровня продукции белка Survivin в ответ на воздействие химиотерапевтическим агентом (этопозидом), что может лежать в основе химиоустойчивости этих клеточных линий. Таким механизмом может быть как инициация синтеза белка Survivin de novo, так и его накопление вследствие подавления деградации. Совсем недавно была описана способность белков с1АР-1 и с1АР-2 служить

убиквитин-лигазами и стимулировать как собственную убиквитинизацию, так и убиквитинизацию своих ингибиторов (Hu and Yang, 2003), подобная активность может существовать и у белка Survivin. 5. Заключение

В данной работе представлена детальная цитогенетическая характеристика 11 -ти широко используемых B-клеточных линий лимфом Бёркитта. Клеточные линии являются незаменимым исследовательским инструментом, и их появление позволило учёным заниматься биологией раковых новообразований на ранее недоступном уровне (Drexler and Minowada, 1998; Masters, 2000). Всесторонняя характеристика используемых лабораториями клеточных линий должна быть одной из приоритетных задач каждого исследования, связанного с их применением. Детальная информация об аберрациях хромосом в опухолях гематопоэтического ряда несомненно важна для диагностических и прогностических целей (Dohner et al, 1997; Grimwade et al, 1998). Более того, анализ хромосомных аберраций является первым шагом при идентификации генов, играющих роль в развитии раковых новообразований (Mitelman, 2000, Mitelman et al, 2005). В данном исследовании мы показали, что устойчивость клеточных линий лимфом Бёркитта к воздействию различных апоптотических стимулов (этопозид, бетулиновая кислота) является их общим свойством. Такое наблюдение предполагает продолжение поиска новых видов противораковой терапии, позволяющих блокировать опухолевый рост. Среди девяти линий, классифицированных как химиоустойчивые или промежуточно-химиоустойчивые, четыре раза встречались транслокации с участием короткого плеча хромосомы 17, умножение генетического материала большей части хромосомы 7 и трисомия хромосомы 20. Так же транслокации с вовлечением длинных плечей хромосом 4 и 18, хромосом 2, 3 и 16 были отмечены как минимум два раза. В четырех из девяти устойчивых линий были отмечены умножения генетического материала в локусе 3q25-qter, а в пяти из девяти - в локусе 7qll.2-q22. Можно предположить, что в этих районах находятся гены, участвующие в процессе клеточной гибели, например, через индукцию синтеза белка Survivin во время апоптоза, или замедление его деградации. Интересно отметить, что в двух промежуточно-устойчивых линиях, где уровень белка Survivin всё же снижался в ответ на воздействие этопозидом, присутствовала делеция 17р.

ВЫВОДЫ

1. Проведено кариотипирование 11-ти клеточных линий лимфом Бёркитта с использованием современных молекулярно-цитогенетических методов. Впервые описан ряд численных и структурных хромосомных аберраций.

2. Во всех исследованных клеточных линиях выявлена специфическая транслокация t(8;14)(q24;q32). Помимо этого, показано, что хромосома 3 достоверно чаще вовлекается в хромосомные аберрации (р<0,01), чем остальные хромосомы набора. Установлена тенденция к частому вовлечению в транслокации хромосом 4, 7, 13, 17 и 20.

3. В результате анализа апоптоза, вызванного стандартным апоптотическим стимулом - этопозидом, определена степень химиоустойчивости 11-ти исследованных клеточных линий. Две линии являлись химиочувствительными, шесть -химиоустойчивыми, и три - промежуточно-химиоустойчивыми.

4. Определено, что экспериментальный препарат - бетулиновая кислота - вызывает массовую неапоптотическую гибель клеток всех исследованных линий лимфом Бёркитта.

5. Показано, что ни одна из использованных 11-ти клеточных линий лимфом Бёркитта не обладала способностью к презентации фосфатидилсерина в ответ на воздействие этопозидом и бетулиновой кислотой.

6. Все исследованные клеточные линии обладали достоверно повышенным (р<0,01) уровнем хотя бы одного из четырёх белков-ингибиторов апоптоза (c-IAPl, C-IAP2, Survivin и XIAP) относительно контрольного образца линии Jurkat.

7. Установлено, что 5 из 9-ти химиоустойчивых линий способны к повышению уровня белка Survivin в ответ на воздействие этопозидом.

8. В 4 из 9-ти химиоустойчивых линий встречались хромосомные аберрации, с умножением генетического материала локуса 3q25-qter, и в 5 из 9-ти линий - локуса 7ql 1.2-q22, не обнаруженные в химиочувствительных линиях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Fadeel В. Phosphatidylserine externalization in cardiolipin-deficient cells / B.Fadeel, M.B.Karpova, M.Enoksson, S.Orrenius // Blood.-2004.-Vol.l04.-N.5.-P.1582-1583.

2. Karpova M.B. Raji revisited: cytogenetics of the original Burkitt's lymphoma cell line / M.B.Karpova, J.Schoumans, I.Ernberg, J.-I.Henter, M.Nordenskjold, B.Fadeel // Leukemia. -2005.-Vol. 19.-N. 1 .-P. 159-161.

3. Karpova M.B. Raji revisited: molecular cytogenetic profile of the original Burkitt's lymphoma-derived cell line / M.B.Karpova, J.Schoumans, I.Ernberg, J.-I.Henter, M.Nordenskjbld, B.Fadeel // 3rd Swiss Apoptosis Meeting / Institute of Pathology and Pharmacology University of Bern.-Bern, 2004.-P.21.

4. Karpova M.B. Response to the chemotherapeutic agent etoposide and cytogenetic profile of a panel of Burkitt's lymphoma-derived cell lines / M.B.Karpova, J.Schoumans, M.Nordenskjold, J.-I.Henter, B.Fadeel // 3rd Swiss Apoptosis Meeting / Institute of Pathology and Pharmacology University of Bern.-Bern, 2004.-P.21.

5. Карпова М.Б. Молекулярно-цитогенетический полиморфизм лимфом Бёркитта / М.Б.Карпова, А.Ф.Смирнов // Актуальные вопросы биологии и медицины: Материалы 2-ой межрегиональной и межвузовской научной конференции студентов и молодых учёных / Ижевская государственная медицинская академия.-Ижевск, 2005.-С.29-31.

6. Карпова М.Б. Роль нарушений апоптотического аппарата в развитии лимфом Бёркитта: применение в разработке противораковой терапии / М.Б.Карпова, А.Ф.Смирнов // Всероссийский съезд лимфологов: материалы конференции / Санкт-Петербургский государственный университет.-СПб, 2005.-С.146.

И О 1 2 О

РНБ Русский фонд

2006-4 7007

Отпечатано в Санкт-Петербургской торгово-промышленной палате Подписано в печать 13.05.2005 Тираж 100 экз. Зак. №70-210-05

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карпова, Мария Борисовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Лимфомы Бёркитта.

1.1.1. История открытия лимфом Бёркитта.

1.1.2. Патоморфологическая характеристика лимфом Бёркитта.

1.1.3. Клеточные линии лимфом Бёркитта.

1.2. Апоптоз: процесс естественной гибели клеток.

1.2.1. История открытия клеточной гибели.

1.2.2. Морфология клеточной гибели.

1.2.3. Молекулярные механизмы апоптоза.

1.2.4. Удаление клеточных остатков.

1.2.5. Типы клеточной гибели.

1.2.6. Программируемая клеточная гибель в эволюционном аспекте.

1.3. Апоптоз и Рак.

1.3.1. Апоптотический парадокс раковых клеток.

1.3.2. Устойчивость к апоптозу.

ГЛАВА И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клеточные линии.

2.2. молекулярно-цитогенетические методы.

2.2.1. Мультиплексная Количественная Флуоресцентная Полимеразная Цепная Реакция.

2.2.2. Приготовление препаратов митотических хромосом из опухолевых клеток.

2.2.3. Спектральное Кариотипирование.

2.2.4. Сравнительная Геномная Гибридизация.

2.2.5. Флуоресцентная гибридизация in situ.

2.2.6. Анализ конденсации клеточных ядер.

- 2.3. условия индукции апоптоза опухолевых клеток.

2.4. Методы проточной цитометрии.

2.4.1. Анализ содержания ДНК.

2.4.2. Анализ активации каспазы -3.

2.4.3. Анализ презентации фосфатидилсерина на поверхности клеток.

2.4.4. Анализ фронтального светорассеяния клеток.

2.5. Методы работы с белками.

2.5.1. Анализ энзиматической активности каспаз -3 и -7.

2.5.2. Иммуноблоттинг (Вестерн-блот анализ).

2.6. Методы статистической обработки.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Анализ полиморфных маркеров с помощью метода мультиплексной количественной флуоресцентной полимеразной цепной реакции (QF

ПЦР).

3.2. Получение полных кариотипов одиннадцати В-клеточных линий

3.2.1. Спектральное кариотипирование.

3.2.2. Сравнительная геномная гибридизация.

• 3.2.3. Флуоресцентная гибридизация in situ.

3.3. Определение степени химиочувствительности одиннадцати В-клеточных линий.

3.4. Определение характера воздействия на клетки экспериментального противоракового соединения - Бетулиновой Кислоты (БК).

3.4.1. Анализ презентации фосфатидилсерина на поверхности клеток одиннадцати В-клеточных линий.

3.4.2. Анализ фронтального светорассеяния клеток одиннадцати В-клеточных линий.

3.4.3. Анализ энзиматической активности каспаз -3 и-7 в клеточных

4Ц лизатах одиннадцати В-клеточных линий.

3.4.4. Анализ морфологических изменений клеточных ядер в одиннадцати

В-клеточных линиях.

3.5. Определение уровня экспрессии белков-ингибиторов апоптоза в одиннадцати В-клеточных линий.

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. молекулярно-цитогенетические особенности одиннадцати В-клеточных линий.

4.2. Устойчивость к апоптозу в одиннадцати В-клеточных линий.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Цитогенетический и биохимический анализ одиннадцати клеточных линий лимфом Бёркитта"

Механизмы злокачественной трансформации и способы борьбы с раковыми клетками в течение длительного времени являются предметом активного изучения. В настоящий момент, когда известно, что широко используемые в лечении рака химиотерапевтические препараты действуют на опухолевые клетки через индукцию клеточной гибели (апоптоз), основные усилия исследователей сконцентрированы в области изучения молекулярных основ этого процесса (Herr and Debatin, 2001; Johnstone et al, 2002). Апоптоз является важным механизмом поддержания гомеостаза тканей в организме и нарушения в его реализации играют значительную роль в развитии раковых заболеваний и устойчивости опухолей к химиотерапии (Kroemer, 1997а).

Лимфома Бёркитта - это разновидность одного из распространённых раковых заболеваний, В-лимфомы, которая была описана в 50-е годы прошлого века (Burkitt, 1983). Заболевание очень быстро привлекло к себе интерес исследователей, и на его примере были решены многие проблемы в исследовании рака. Например, осуществлено лабораторное культивирование раковых клеток гематопоэтического ряда, изучено влияние на развитие раковых заболеваний инфекции вирусом Эпштейна-Барр (EBV), разработан метод Q-окрашивания хромосом, описана одна из первых реципрокных транслокаций, характерных для ракового заболевания, - "Бёркитт транслокация" t(8;14), а также, описаны механизмы раковой трансформации, задействованные при этой транслокации (Epstein et al, 1966; Zech, 1971; Manolova et al, 1979). Основным материалом в исследованиях механизмов апоптоза и химиоустойчивости являются клеточные линии опухолей человека, так как их использование позволяет применять в отношении раковых клеток экспериментальные виды терапии. Многие клеточные линии лимфом Бёркитта культивируются с 1960-х годов и о них накоплено много разносторонней информации. Однако очень часто эта информация является устаревшей. Так, например, цитогенетическая характеристика этих клеточных линий была проведена с помощью G-окрашивания, в то время как сейчас исследователям стали доступны несравнимо более точные методы.

Кроме того, за прошедшие годы были обнаружены десятки новых белков, участвующих в апоптозе, информация о продукции которых отсутствует для многих линий, и гораздо более детально описаны сигнальные пути этого процесса (Debatin et al, 2002). Подробное исследование нарушений апоптотического аппарата и молекулярных основ химиоустойчивости клеточных линий опухолей человека позволит создать новые поколения противораковых препаратов, что приведёт к прогрессу в лечении раковых заболеваний. В частности, это предоставит возможность добиваться регрессии опухолей без хирургического вмешательства.

Целью настоящей работы являлось выявление новых хромосомных перестроек в линиях лимфом Бёркитта и изучение молекулярных механизмов развития устойчивости этих клеточных линий к апоптозу.

В исследовании были поставлены следующие задачи:

1. Повести кариотипирование 11-ти клеточных линий лимфом Бёркитта с помощью современных молекулярно-цитогенетических методов: мультиплексной количественной флуоресцентной ПЦР (QF-ПЦР), спектрального кариотипирования (SKY), флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и сравнительной геномной гибридизации (CGH).

2. Определить степень химиоустойчивости используемых клеточных линий в ответ на стандартный апоптотический агент - этопозид.

3. Определить эффект от воздействия экспериментального химиотерапевтического агента - бетулиновой кислоты - на клетки лимфом Бёркитта.

4. Охарактеризовать уровень продукции белков-ингибиторов апоптоза (c-IAPl, C-IAP2, Survivin и XIAP) в используемых клеточных линиях.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Карпова, Мария Борисовна

выводы

1. Проведено карнотипирование 11 -тн клеточных линий лимфом Бёркитта с использованием современных молекулярно-цитогенетических методов. Впервые описан ряд численных и структурных хромосомных аберраций.

2. Во всех исследованных клеточных линиях выявлена специфическая транслокация 1(8;14)(ц24;я32). Помимо этого, показано, что хромосома 3 достоверно чаще вовлекается в хромосомные аберрации (р<0,01), чем остальные хромосомы набора. Установлена тенденция к частому вовлечению в транслокации хромосом 4, 7, 13, 17 и 20.

3. В результате анализа апоптоза, вызванного стандартным апоптотическим стимулом - этопозидом, определена степень химиоустойчивости 11-ти исследованных клеточных линий. Две линии являлись химиочувствительными, шесть - химиоустойчивыми, и три - промежуточно-химиоустойчивыми.

4. Определено, что экспериментальный препарат - бетулиновая кислота -вызывает массовую неапоптотическую гибель клеток всех исследованных линий лимфом Бёркитта.

5. Показано, что ни одна из использованных 11-ти клеточных линий лимфом Бёркитта не обладала способностью к презентации фосфатидилсерина в ответ на воздействие этопозидом и бетулиновой кислотой.

6. Все исследованные клеточные линии обладали достоверно повышенным (р<0,01) уровнем хотя бы одного из четырёх белков-ингибиторов апоптоза (с-1АР1, С-1АР2, Бигутп и Х1АР) относительно контрольного образца линии 1игка1.

7. Установлено, что 5 из 9-ти химиоустойчивых линий способны к повышению уровня белка БшлМут в ответ на воздействие этопозидом.

8. В 4-х из 9-ти химиоустойчивых линий встречались хромосомные аберрации, с умножением генетического материала локуса Зц25-ц1ег, и в 5-ти из 9-ти линий - локуса 7я11.2-я22, не обнаруженные в химиочувствительных линиях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карпова, Мария Борисовна, Санкт-Петербург

1. Кузнецова Т.В. Цитогенетические методы / Т.В.Кузнецова, Ю.А.Логинова, О.Г.Чиряева, А.А.Пендина, В.С.Баранов // В кн.: Медицинские лабораторные технологии (Справочник). Ред. А.И.Карпищенко. СПб: Интермедика.-1999.-Т.2.-с.550-578.

2. Лакин Г.Ф. Биометрия: учебное пособие 4-е издание, переработанное и дополненное // М.: Высш. шк., 1990.-352 е.: ил.

3. Лобко Г.Н. Иммуногенетические основы резистентности опухолей / Г.Н. Лобко, Г.М. Порубова // Мн.: Выш. Школа, 1980.-176 с.

4. Рубцов Н.Б. Современные методы молекулярно-цитогенетического анализа и диагностика хромосомной патологии / Н.Б.Рубцов, Т.В.Карамышева, Т.А.Гайнер // В кн. «Геномика-медицине» «Академкнига» М.-2005.-с.219-244.

5. Acehan D. Three-dimentional structure of the apoptosome: implications for assembly, procaspase-9 binding, and activation / D. Acehan, X. Jiang, D.G. Morgan, J.E. Heuser, X. Wang, C.W. Akey // Molecular Cell.-2002.-Vol.9.-P.423-432.

6. Adams J.M. Apoptosomes: engines for caspase activation / J.M. Adams, S. Cory // Current Opinion in Cell Biology.-2002.-Vol.l4.-P.715-720.

7. Adams J.M. Ways of dying: multiple pathways to apoptosis / J.M. Adams // Genes and Development.-2003.-Vol.17.-P.2481-2485.

8. Adida C. Anti-apaoptosis gene, survivin, and prognosis of neuroblastoma / C. Adida, D. Berrebi, M. Peuchmaur, M. Reyes-Mudica, D.C. Altieri // Lancet.-1998.-Vol.351.-P.882-883.

9. Adinolfi M. Rapid detection of aneuploidies by microsatellite and the quantitative fluorescent polymerase chain reaction / M. Adinolfi, B. Pertl, J. Sherlock // Prenatal Diagnosis.-1997.-Vol. 17.-N. 13.-P. 1299-1311.

10. Ambrosini G. A novel anti-apoptotic gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma / G. Ambrosini, C. Adida, D.C. Alteri // Nature Med.-1997.-Vol.3.-P.917-921.

11. Anderson P. Kinase cascades regulating entry into apoptosis / P. Anderson // Microbiol. Mol. Biol. Rev.-1997.-Vol.61 .-P.33-46.

12. Arur S. Annexin I ia an endogenous ligand that mediates apoptotic cell engulfment / S. Arur, U.E. Uche, K. Rezaul, M. Fong, V. Scanton, A.E. Cowan, W. Mohler, D.K. Han // Developmental Cell.-2003.-Vol.4.-P.587-598.

13. Ashkenazi A. Death receptors: signaling and modulation / A. Ashkenazi, V.M. Dixit//Science.-1998.-V.281.-P.1305-1308.

14. Bagg A. Molecular pathology of leukemia and lymphoma / A. Bagg, B.V.S. Kallakury //Am. J. Clin. Pathol.-1999.-Vol.l 12.-Suppl.l.-P.S76-S92.

15. Beltinger C. CD95 (APO-l/Fas) mutations in childhood T-lineage acute lymphoblastic leukaemia / C. Beltinger, E. Kurz, T. Bohler, M. Schrappe, W.-D. Ludwig, K.-M. Debatin // Blood.-1998.-Vol.282.-P.290-293.

16. Berger R. Cytogenetics of Burkitt's lymphoma-leukemia: a review / R. Berger, A. Bernheim // IARC Sci. Publ.-1985.-N.60.-P.65-83.

17. Bernheim A. Cytogenetic studies on Burkitt's lymphoma cell lines / A. Bernheim, R. Berger, G. Lenoir // Cancer Genet. Cytogenet.-1983.-Vol.8.-N.3.-P.223-229.

18. Bernheim A. Cytogenetic studies on African Burkitt's lymphoma cell lines: t(8;14), t(2;8) and t(8;22) translocations / A. Bernheim, R. Berger, G. Lenoir // Cancer Genet Cytogenet.-1981.-Vol.3.-N.4.-P.307-315

19. Birch C.A. Burkitt's lymphoma. Denis Parsons Burkitt (born 1911)/ C.A. Birch // Practitioner.-1974.-Vol.213 .-N. 1273 .-P. 106-108.

20. Bishop P.C. Burkitt's lymphoma: molecular pathogenesis and treatment / P.C. Bishop, K. Rao, W.H. Wilson // Cancer Investigation.-2000.-Vol.l8.-N.6.-P.574-583.

21. Blum K.A. Adult Burkitt leukemia and lymphoma / K.A. Blum, G. Lozanski, J.C. Byrd // Blood.-2004.-Vol.l04.-P.3009-3020.

22. Bryndorf T. Comparative genomic hybridization in clinical cytogenetics / T. Bryndorf, M. Kirchhoff, H. Rose, J. Maahr, T. Gerdes, R. Karhu, A. Kallioniemi, B. Christensen, C. Lundsteen, J. Philip // Am. J. Hum. Genet.-1995.-Vol.57.-N.5.-P.1211-1220.

23. Budihardjo I, Oliver H, Lutter M et al. Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis // Annual Reviews of Cell and Developmental Biology.-1999.-V. 15 .-P.269-90.

24. Burkitt D.P. Etiology of Burkitt's lymphoma -an alternative hypothesis to a vectored virus / D.P. Burkitt// J. Natl. Cancer Inst.-1969.-Vol.42.-N.l.-P. 19-28.

25. Burkitt D.P. Host defence mechanisms in Burkitt's lymphoma and Kaposis sarcoma: the clinical evidence / D.P. Burkitt // Br. Med. J.-1970.-Vol.4.-N.732.-P.424-426.

26. Burkitt D.P. The beginnings of the Burkitt's lymphoma story / D.P. Burkitt // IARC Sci. Publ.-1985.-N.60.-P. 11-15.m

27. Burkitt D.P. The discovery of Burkitt's lymphoma / D.P. Burkitt // Cancer.-1983.-Vol.51 .-N. 10.-P. 1777-1786.

28. Bylund L. Analysis of the cytogenetic stability of the human embryonal kidney cell line 293 by cytogenetic and STR profiling approaches / L. Bylund, S. Kytola, W.O. Lui, C. Larsson, G. Weber // Cytogenet. Genome Res.-2004.-Vol.l06.-P.28-32.

29. Cai W.-W. Genome-wide detection of chromosomal imbalances in tumors using BAC microarrays / W.-W. Cai, J.-H. Mao, C.-W. Chow, S. Damani, A. Balmain, A. Bradley //Nature Biotech.-2002.-Vol.20.-P.393-396.

30. Cain K. The Apaf-1 apoptosome: a large caspase-activating complex / K. Cain, S.B. Bratton, G.M. Cohen //Biochimie.-2002.-Vol.84.-P.203-214.

31. Capello D. Point mutations of the BCL-6 gene in Burkitt's lymphoma / D. Capello, A. Carbone, C. Pastore, A. Gloghini, G. Saglio, G. Gaidano // Br. J. Haematol.-1997.-Vol.99.-P. 168-170.

32. Caspersson T. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents / T. Caspersson, L. Zech, C. Johansson // Exp. Cell Res.-1970a.-Vol.62.-N.2.-P.490-492.

33. Caspersson T. Identification of human chromosomes by DNA-binding fluorescent agents / T. Caspersson, L. Zech, C. Johansson, E.J. Modest // Chromosoma.-19706.-Vol.30.-N.2.-P.215-217.

34. Caspersson T. Rapid techniques for counting and analysis of chromosome aberrations / T. Caspersson, G. Lomakka, L. Zech, P. Issler, J. Kudynowski, K. Kvarnstrom //Exp. Cell Res.-1974.-Vol.88.-N.2.-P.427-428.

35. Caspersson T. The 24 fluorescence patterns of the human metaphase chromosomes distinguishing characters and variability / T. Caspersson, G.Lomakka, L. Zech //Hereditas.-1972.-Vol.67.-N.l.-P.89-102.

36. Chen P. Dredd, a novel effector of the apoptosis activators reaper, grim, and hid in Drosophila / P. Chen, A. Rodrigues, R. Erskine, T. Thach, J.M. Abrams // Develop. Biol.-1998.-Vol.201 .-P.202-216.

37. Chen P. Grim, a novel cell death gene in Drosophila / P. Chen, W. Nordstrom, B. Gish, J.M. Abrams // Genes Dev.-1996.-Vol.l0.-P.1773-1782.

38. Clarke P.G.H. Nineteenth centuiy research on naturally occuring cell death and realted phenomena / P.G.H. Clarke, S. Clarke // ANature Embryol.-1996.-Vol.l93.-P.81-99.

39. Coakley D. 1994 de Villers Lecture-tribute to Denis Burkitt / D. Coakley // Leukemia.-1995.-Vol.9.-Suppl.l.-P.l-6.

40. Cook P.J. Cancer in Africa / P.J. Cook , D.P. Burkitt // Br. Med. Bull.-1971.-Vol.27.-N.l.-P.14-20.

41. Croce C.M. Chromosome translocations and human cancer / C.M. Croce, G. Klein // Sci. Am.-1985.-Vol.252.-N.3.-P.54-60.

42. Danial N.N. Cell death: critical control points / N.N. Danial, S.J. Korsmeyer // Cell.-2004.-Vol.116.-P.205-219.

43. Debatin K.-M. Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway / K.-M. Debatin, D. Poncet, G. Kroemer // ()ncogene.-2002.-Vol.21.-P.8786-8803.

44. Debernardi S. Understanding cancer at the chromosome level: 40 years of progress / S. Debernardi, D. Lillington, B.D. Young // Eur. J. Cancer.-2004.-Vol.40.-P. 1960-1967.

45. Dive C. Analysis and discrimination of necrosis and apoptosis (programmed cell death) by multiparameter flow cytometry / C. Dive, C.D. Gregory, D.J. Phipps, D.L. Evans, A.E. Milner, A.H. Wyllie // Biochim. Biophys. Acta.-1992.-Vol.-l 133.-P.275-285.

46. Douglas R.S. A simplified method for the coordinate examination of apoptosis and surface phenotype of murine lymphocytes / R.S. Douglas, A.D. Tarshis, C.H. Pletcher, P.C. Nowell, J.S. Moore // J. Immunol. Methods.-1995.-Vol.l88.-P.219-228.

47. Douglass E.C. Cytogenetic studies in non-African Burkitt lymphoma / E.C. Douglass, I.T. Magrath, E.C. Lee, J. Whang-Peng // Blood.- 1980.-Vol.55.-P.148-155.

48. Drexler H.G. Catalogue of Human and Animal Cell Lines / H.G. Drexler, W. Dirks, R.A.F. MacLeod, H. Quentmeier, K.G. Steube, C.C. Uphoff (editors) // DSMZ: Braunschweig, Germany.-2001.-21 O.P.

49. Drexler H.G. False leukemialymphoma cell lines: an update on over 500 cell lines / H.G. Drexler, W.G. Dirks, Y. Matsuo, R.A. MacLeod // Leukemia.-2003 .-Vol. 17.-P.416-426.

50. Drexler H.G. History and classification of human leukemia-lymphoma cell lines / H.G. Drexler, J. Minowada // Leuk. Lymphoma.-1998.-Vol.31 .-P.305-316.

51. Duvall E. Macrophage recognition of cell undergoing programmed cell death (apoptosis) / E. Duvall, A.H. Wyllie, R.G. Morris // Immunology.-1985.-Vol.56.-P.351-358.

52. Dyall S.D. Ancient invasions: from endosymbionts to organelles / S.D. Dyall, M.T. Brown, P.J. Johnson // Science.-2004.-Vol.304.-P.253-257.

53. Ehlin-Henriksson B. Expression of B-cell-specific markers in different Burkitt lymphoma subgroups / B. Ehlin-Henriksson, A. Manneborg-Sandlund, G. Klein //Int. J. Cancer.-1987.-Vol.39.-N.2.-P.211-218.

54. Ehrhardt H. Betulinic acid-induced apoptosis in leukemia cells / H. Ehrhardt, S. Fulda, M. Fuhrer, K.M. Debatin, I. Jeremias // Leukemia.-2004.-Vol.18.-P-1406-1412.

55. El-Diery W.S. WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression / W.S. El-^ Diery, T. Tokino, V.E. Velculescu, D.B. Levy, R. Parsons, J.M. Trent, D. Lin,

56. W.E. Mecer, K.W. Kinzler, B. Vogelstein // Cell.-1993.-Vol.75.-P.817-825.

57. Ellis H. Eponyms in oncology: Denis Burkitt (contemporary) / H. Ellis // Eur. J. Surg. Oncol.-1987.-Vol. 13.-N.2.-P. 167.

58. Ellis H.M. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans / H.M. Ellis, H.R. Horvitz // Cell.-1986.-Vol.44.-P.817-829.

59. Ellis R.E. Genes required for the engulfment of veil corpes during programmed cell death in Caenorhabditis elegans / R.E. Ellis, D.M. Jacobson, H.R. Horvitz // Genetics.-19916.-V0I.129.-P.79-94.

60. Ellis R.E. Mechanisms and functions of cell death / R.E. Ellis, J. Yuan, H.R. Horvitz//Ann. Rev. Cell. Biol.-1991a.-Vo.7.-P.663-698.

61. Ellis R.E. Two C. elegans genes control the pregrammed deaths of specific cells in the pharynx / R.E. Ellis, H.R. Horvitz // Development.-1991.-Vol. 112.-P.591-603.

62. Epstein M.A. Cultivation in vitro of human lymphoblasts from Burkitt's malignant lymphoma / M.A .Epstein, Y.M. Barr // Lancet.-1964.-Vol.41.-P.252-253.

63. Epstein M.A. Historical background; Burkitt's lymphoma and Epstein-Barr virus / M.A. Epstein // IARC Sci. Publ.-1985.-N.60.-P.17-27.

64. Epstein M.A. Morphological and virological investigations on cultured Burkitt tumor lymphoblasts (strain Raji) / M.A. Epstein, B.G. Achong, Y.M. Barr, B. Zajac, G. Henle, W.Henle //J. Natl. Cancer Inst.-1966.-Vol.37.-N.4.-P.547-559.

65. Epstein M.A. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma / M.A. Epstein, B.G. Achong, Y.M. Barr // Lancet.-1964.-Vol.I.-P.702-703.

66. Fadok V.A. Exposure of phosphatidylserine onthe surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages / V.A.

67. Fadok, D.R. Voelker, P.A. Campbell, J.J. Cohen, D.L. Bratton, P.M. Henson // J. Immunol.-1992a.-Vol. 148.-2207-2216.

68. Fadok V.A. The role of phosphatidylserine in recognition of apoptotic cells by phagocytes / V.A. Fadok, D.L. Bratton, S.C. Frasch, M.L. Warner, P.M. Henson //Cell Death Diff.-1998.-Vol.5.-P.551-562.

69. Farrell P.J. p53 is frequently mutated in Burkitt's lymphoma cell lines / P.J. Farrell, G.J. Allan, F. Shanahan, K.H. Vousden, T. Crook // EMBO J.-1991.-Vol. 10.-P.2879-2887.

70. Favort M. Cell death and cancer: replacement of apoptotic genes and inactivation of death suppressor genes in therapy / M. Favort, J.-L. Coll, N. Louis, A. Nigoescu // Gene Ther.-1998.-Vol.5.-P.728-739.

71. Fisher D.E. Apoptosis in cancer therapy: crossing the threshold / D.E. Fisher // Cell.-1994.-VoI.78.-P.539-542.

72. Fong W.G. Expression and genetic analysis of XIAP-associated factor 1 (XAF1) in cancer cell lines / W.G. Fong, P. Liston, E. Rajcan-Separovic, M. St.Jean, C. Craig, R.G. Korneluk // Genomics.-2000.-V.70.-P.l 13-122.

73. Forozan F. Genome screening by comparative genomic hybridization / F. Forozan, R. Karhu, J. Kononen, A. Kallioniemi, O.P. Kallioniemi // Trends in Genetics.-1997.-Vol. 13 .-N. 10.-P.405-409.

74. Frade J.M. Origon of eukaryotic programmed cell death: a consequence of aerobic metabolisz? / J.M. Frade, T.M. Michaelidis // BioEssays.-1997.-Vol.l9.-P.827-832.

75. Frank S. Scission, spores, and apoptosis: a proposal for the evolutionary origin of mitochondria in cell death induction / S. Frank, E.G. Robert, R.J. Youle // Biochemical and Biophysical Research Communications.-2003.-Vol.304.-P.481-486.

76. Fraser A. Fermenting debate: do yeast undergo apoptosis? / A. Fräser, C. James //Trends Cell Biol.-1998.-Vol.8.-P.219-221.

77. Fraser A.G. Identification of a Drosophila melanogaster ICE/CED-3-related protease, drICE / A.G. Fraser, G.I. Evan // EMBO J.-1997.-Vol.l6.-P.2805-2813.

78. Friesen C. Involvement of the CD95 (APO-l/Fas) receptor/1 igand system in drug-induced apoptosis in leukemia cells / C. Friesen, I. Herr, P.H. Krammer, K.M. Debatin//Nature Med.-1996.-Vol.2.-P.574-577.

79. Fulda S. Betulinic acid: a new cytotoxic agent against malignant brain-tumor cells / S. Fulda, I. Jeremias, H.H. Steiner, T. Pietsch, K.M. Debatin // Int. J. Cancer.-1999.-Vol.82.-P.435-441.

80. Fulda S. Smac agonists sensitize for Apo2L/TRAIL-or anticancer drug-induced apoptosis and induce regression of malignant glioma in vivo / S. Fulda, W. Wick, M. Weller, K.M. Debatin//Nature Med.-2001.-V.8.-P.808-815.

81. Gordon J. Signals for survival and apoptosis in normal and neoplastic B lymphocytes / J. Gordon, C.D. Gregory, G. Grafton, J.D. Pound // Adv. Exp. Med. Biol.-1996.-Vol.406.-P. 139-144.

82. Gray M.W. Mitochondrial evolution / M.W. Gray, G. Burger, B.F. Lang // Science.-1999.-Vol.283.-P. 1476-1481.

83. Green D.R. Mitochondria and apoptosis / D.R. Green, J.C. Reed // Science.-1998.-V.281.-P. 1309-1312.

84. Gregory C.D. Different Epstein-Barr virus-B cell interactions in phenotypically distinct clones of a Burkitt's lymphoma cell line / C.D. Gregory, M. Rowe, A.B. Rickinson // J. Gen. Virol.-1990.-Vol.71.-P.1481-1495.

85. Gurtsevitch V.E. Burkitt's lymphoma cell lines reveal different degrees of tumorigenicity in nude mice / V.E. Gurtsevitch, G.T. 0'Conor,G.M. Lenoir // Int. J. Cancer.-1988.-Vol.41.-P.87-95.

86. Hacker G. A chronology of cell death / G. Hacker, D.L. Voux // Apoptosis.-1997.-Vol.2.-P.247-256.

87. Hacker G. The morphology of apoptosis / G. Hacker // Cell Tissue Res.-2000.-Vol.301.-P.5-17.

88. Hart S.P. Recognition of apoptotic cells by phagocytes / S.P. Hart, C. Haslett, I. Dransfield // Experientia.-1996.-Vol.52.-P.950-956.

89. Haupt Y. Mdm2 promotes the repid degradation of p53 / Y. Haupt, R. Maya, A. Kazar, M. Oren//Nature.-1997.-Vol.387.-P.296-299.

90. Hay B.A. Drosophila homologs of baculovirus inhibitior of apoptosis proteins function to block cell death / B.A. Hay, D.A. Wassarman, G.M. Rubin // Cell.-1995.-Vol.83.-P. 1253-1262.

91. Hecht J.L. Molecular biology of Burkitt's lymphoma / J.L. Hecht, J.C. Aster // Journal of Clinical Oncology.-2000.-Vol.l8.-N.21.-P.3707-3721.

92. Hell K. Substrate cleavage by caspases generates protein fragments with Smac/DIABLO-like activities / K. Hell, M. Saleh, G.D. Crescenzo, M.D. O'Connor-McCourt, D.W. Nicholson // Cell, Death and Differentiation.-2003.-V.10.-N.11.-P.1234-1239.

93. Henriksson M. Inactivation of Myc-induced p53-dependent apoptosis in human tumors / M Henriksson, Selivanova G, Lindstrom M, Wiman KG // Apoptosis.-2001.-Vol.6.-P. 133-137.

94. Herr I. Cellular stress response and apoptosis in cancer therapy / I. Herr, K.M. Debatin // Blood.-2001.-V.98.-N.9.-P.2603-2614.

95. Hoglund M. Statistical behavior of complex cancer karyotypes / M. Hoglund, A. Frigyesi, T. Sail, D. Gisselsson, F. Mitelman // Genes, Chromosomes, and Cancer.-2005.-Vol.42.-N.4.-P.327-341.

96. Horiike T. Origin of eukaryotic cell niclei by symbiosis of Archaea in Bacteria supported be newly clarified origin of functional genes / T. Horiike, K. Hamada, T. Shinozawa // Genes Genet. Syst.-2002.-Vol.77.-P.369-376.

97. Houldsworth J. Comparative genomic hybridization: an overview / J. Houldsworth, R.S. Chaganti // Am J Pathol.-1994.-Vol.l45.-N.6.-P.1253-1260.

98. Huettenbrenner S. The evolution of cell death programs as prerequisities of multicellularity / S. Huettenbrenner, S. Maier, C. Leisser, D. Polgar, S. Strasser, M. Grusch, G. Krupitza//Mutation Res.-2003.-Vol.543.-P.235-249.

99. Hulten M.A. Rapid and simple prenatal diagnosis of common chromosome disorders: advantages and disadvantages of the molecular methods FISH and QF-PCR / M.A. Hulten, S. Dhanjal, B. Pertl // Reproduction.-2003.-Vol. 126.-P.279-297.

100. Inohara N. CIDE, a novel family of cell death activators with homology to the ^ 45 kDa subunit of the DNA fragmentation factor / N. Inohara, T. Koseki, S.

101. Chen, X. Wu, G. Nunez// EMBO J.-1998.-Vol.l7.-P.2526-2533.

102. Jarvis P. Intracellular signalling: the language of the chloroplast / P. Jarvis // Current Biology.-2003 .-Vol. 13.-P.R314-R316.

103. Johnstone R.W. Apoptosis: a link between cancer genetics and chemotherapy / R.W. Johnstone, A.A. Ruefli, S.W. Lowe // Cell.-2002.-Vol.l08.-P.153-164.

104. Kafuko G.W. Burkitt's lymphoma and malaria / G.W. Kafuko, D.P. Burkitt // Int. J. Cancer.-1970.-V0I.6.-N.I.-P. 1-9.

105. Kallioniemi A. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors / A. Kallioniemi, O.P. Kallioniemi, D. Sudar, D. Rutovitz, J.W. Gray, F. Waldman, D. Pinkel // Science.-1992.-Vol.25 8,-N.5083.-P.818-821.

106. Kamesaki H. Mechanisms involved in chemotherapy-induced apoptosis and their implications in cancer chemotherapy / H. Kamesaki // Int. J. Hematol.-1998.-Vol.68.-P.29-43.

107. Kaufmann S.H. Alterations in the apoptotic machinery and their potential role in anticancer drug resistance / S.H. Kaufmann, D.L. Vaux // 0ncogene.-2003.-Vol.22.-P.7414-7430.

108. Kerr J.F.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging ^ implications in tissue kinetics / J.F.R. Kerr, A.H. Wyllie, A.R. Currie // Br. J.

109. Cancer.-1972.-Vol.26.-P.239-257.

110. Kiss C. T cell leukemia I oncogene expression depends on the presence of Epstein-Barr virus in the virus-carrying Burkitt lymphoma lines / C. Kiss, J. Nishikawa, K. Takada, P. Trivedi, G. Klein, L. Szekely // Proc. Natl. Acad. Sci.

111. U.S.A.-2003.-Vol. 100.-P.4813-4818.

112. Klein E. Surface IgM-kappa specificity on a Burkitt lymphoma cell in vivo and in derived culture lines / E. Klein, G. Klein, J.S. Nadkarni, J.J. Nadkarni, H. Wigzell, P. Clifford//CancerRes.-1968.-Vol.28.-N.7.-P. 1300-1310.

113. Klein G. Role of EBV and Igmyc translocation in Burkitt lymphoma / G. Klein

114. Antibiot. Chemother.-1994.- Vol.46.-P. 110-116.

115. Klein G. Sensitivity of Epstein-Barr virus (EBV) producer and non-producer human lymphoblastoid cell lines to superinfection with EB-virus / G. Klein, L. Dombos, B. Gothoskar// Int. J. Cancer.-1972.-Vol.l0.-N.l.-P.44-57.

116. Koonin E.V. Origin and evolution of eukaryotyc apoptosis: the bacterial

117. V connection / E.V. Koonin, L. Aravind // Cell death and Differentiation.-2002.1. Vol.9.-P.394-404.

118. Kornblau S.M. Chromosomal abnormalities in adult non-endemic Burkitt's lymphoma and leukemia: 22 new reports and a review of 148 cases from the literature / S.M. Kornblau, A. Goodacre, F. Cabanillas // Hematol. Oncol.-1991.-Vol.9.-N.2.-P.63-78.

119. Kroemer G. Mitochondrial implication in apoptosis. Towards an endosymbiont hypothesis of apoptosis evolution / G. Kroemer // Cell Death and Diff.-1997a.-Vol.4.-P.443-446.

120. Kroemer G. The proto-oncogene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis / G. Kroemer // Nature Med.-19976.-Vol.3.-P.614-620.

121. Kubbutat M.H.G. Ragulation of p53 stability by Mdm2 / M.H.G. Kubbutat, S.N. Jones, K.H. Vousden //Nature.-1997.-Vol.387.-P.299-303.

122. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli //-Nature.- 1970.-V.5259.-N.227. -P.680-685.

123. Lake J.A. Was the nucleus the first endosymbiont? / J.A. Lake, M.C. Rivera // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.-Vol.91.-P.2880-2881.

124. Lamy T. Dysregulation of CD95/CD95-ligand apoptotic pathway in CD3+ largegranular lymphocyte leukemia / T. Lamy, J.H. Liu, T.H. Landowski, W.S. Dalton, T.P. Loughran // Blood.-1998.-Vol.92.-P.4771-4777.

125. Landowski T.H. Selection for drug resistance results in resistance to Fasmediated apoptosis / T.H. Landowski, M.C. Gleason-Guzman, W.S. Dalton // Blood.-1997.-Vol.89.-P. 1854-1861.

126. Lawen A. Apoptosis an introduction / A. Lawen // BioEssays.-2003.-Vol.25.-P.888-896.

127. Lecoeur H. Strategies for phenotyping apoptotic peripheral human lymphocytes comaring ISNT, annexin-V and 7-AAD cytofluotometric staining methods / H.1.coeur, E. Ledru, M.-C. Prevost, M.-L. Gougeon // J. Immunol. Methods.* 1997.-Vol.209.-P.l 11-123.

128. Lee Y. Oxidative stress inhibits apoptosis in human lymphoma cells / Y. Lee, E. Shacter//J. Biol. Chem.-1999.-Vol.274.-N.28.-P.19792-19798.

129. Lenoir G.M. Correlation between immunoglobulin light chain expression and variant translocation in Burkitt's lymphoma / G.M. Lenoir, J.L. Preudhomme, A. Bernheim, R. Berger//Nature.-1982.-Vol.298.-N.5873.-P.474-476.

130. Lenoir G.M. The use of lymphomatous and lymphoblastoid cell lines in the study of Burkitt's lymphoma / G.M. Lenoir, M. Vuillaume, C. Bonnardel // IARC Sci. Publ.-1985.-Vol.60.-P.309-318.

131. Levine A.J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division / A.J. Levine // Cell.-1997.-Vol.88.-P.323-331.

132. Li P. Mitochondrial activation of apoptosis / P. Li, D. Nijhawan, X. Wang // Cell.-2004.-Vol.Sl 16.-P.S57-S59.

133. Liest M. Four deaths and a funeral: from caspases to alternative mechanisms / M. Liest, M. Jaattela // Nature Rev. Mol. Cell Biol.-2001.-Vol.2.-P.l-10.

134. Lindstrom M.S. Role of genetic changes in Burkitt lymphoma / M.S. Lindstrom, K.G. Wiman // Seminars in Cancer Biology.-2002.-Vol.12.-P.381-387.

135. Lockshin R.A. The early modern period in cell death / R.A. Lockshin // Cell

136. Death Diff.-1997.-Vol.4.-P.347-3 51.

137. Lowe S.W. Intrinsic tumour suppression / S.W. Lowe, E. Cepero, G. Evan // Nature.-2004.-Vol.432.-P.307-315.

138. Lundsteen C. Image analysis in comparative genomic hybridization / C. Lundsteen, J. Maahr, B. Christensen, T. Bryndorf, M. Bentz, P. Lichter, T. Gerdes // Cytometry.- 1995.-Vol.l9.-P.42-50.

139. Manolov G. Marker band in one chromosome 14 from Burkitt lymphomas / G. Manolov, Y. Manolova // Nature.-1972.-Vol.237.-N.5349.-P.33-34.

140. Manolova Y. Genesis of the 14q+ marker in Burkitt's lymphoma / Y. Manolova, G. Manolov, J. Kieler, A. Levan, G. Klein // Hereditas.-1979.-Vol.90.-N.l.-P.5-10.

141. Margulis L. The chimeric eukaryote: origin of the necleus from the karyomastigont / L. Margulis, M.F. Dolan, R. Guerrero // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.-2000.-Vol.97.-P.6954-6959.

142. Martin S.J. Phosphatidylserine externalization during CD95-induced apoptosis requires ICE/CED-3 protease activity / S.J. Martin, D.M. Finucane, G.P. Amarante-Mendes, G.A. O'Brien, D.R. Green // J. Biol. Chem.-1996.-Vol.271.-P.28753-28756.

143. Marx J. New methods for expanding the chromosomal paint kit /J. Marx // Science.-1996.-Vol.273.-N.5274.-P.430.

144. Masters J.R.W. Human cancer cell lines: fact and fantasy / J.R.W. Masters // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.-2000.-Vol.l.-P.233-236.

145. Mayer B. Mitochondrial regulation of apoptosis / B. Mayer, R. Oberbauer // News Physiol. Sci.-2003.-Vol.l8.-P.89-94.

146. McNeil N. Novel molecular cytogenetic techniques for identifying complex chromoosmal rearrangements: technology and applications in molecular nedicine / N. McNeil, T. Ried // Expert Reviews in Molecular Medicine.-2000.-P.l-14.

147. Mehra S. Molecular cytogenetic characterization of non-Hodgkin lymphoma cell lines / S. Mehra, H. Messner, M. Minden, R.S.K. Chaganti // Genes, Chromosomes, and Cancer.-2002.-Vol.33.-P.225-234.

148. Mesner P.W. Chemotherapy-induced apoptosis / P.W. Mesner // Apoptosis: Pharmacological implications and therapeutic opportunities, editor S.H. Kaufmann / Advances in Pharmacology.-1997.-Vol.41.-P.461-499.

149. Metzstein M.M. Transcriptional regulator of programmed cell death encoded by Caenorhabditis elegans gene ces-2 / M.M. Metzstein, M.O. Hengartner, N. Tsung, R.E. Ellis, H.R. Horvitz // Nature.-1996.-Vol.382.-P.545-547.

150. Metzstein M.M. Genetics of programmed cell death in C. elegans: past, present and future / M.M. Metzstein, G.M. Stanfield, H.R. Horvitz // Trends Genet.-1998.-Vol. 14.-P.410-416.

151. Mignotte B. Mitochondria and apoptosis / B. Mignotte, J.-L. Vayssiere // Eur. J. Biochem.-1998.-Vol.252.-P. 1-15.

152. Miller G. Human lymphoblastoid cell lines and Epstein-Barr virus: a review of their interrelationships and their relevance to the etiology of leukoproliferative states in men/G. Miller//Yale J. Biol. Med.-1971.-Vol.43.-N.6.-P.358-384.

153. Milner A.E. Apoptosis in Burkitt lymphoma cells is driven by c-myc / A.E. Milner, R.J. Grand, C.M. Waters, C.D. Gregoiy // Oncogene.-1993.-Vol.8.-N.12.-P.3385-3391.

154. Mitelman F. ISCN. An international system for human cytogenetic nomenclature / F. Mitelman (editor) // Karger.-1995.-Basel, Switzerland.-114.P.

155. Mitelman F. Recurrent chromosome aberrations in cancer / F. Mittelman // Mutat. Res.-2000.-VoI.462.-P.247-253.

156. Mitelman F. Prevalence estimates of recurrent balanced cytogenetic aberrations and gene fusions in unselected patients with neoplastic disorders / F. Mitelman, F. Masters, B. Johansson /Genes, Chromosomes, and Cancer.-2005.-Epub ahead of print.

157. Nadkarni J.S. Characteristics of new cell lines derived from Burkitt lymphomas / J.S. Nadkarni, J.J. Nadkarni, P. Clifford, G. Manolov, E.M. Fenyo, E. Klein // Cancer.-1969.-Vol.23.-N. 1 .-P.64-79.

158. Nagata S. Apoptosis by death factor / S. Nagata // Cell.-1997.-Vol.88.-P.355-365.

159. Naito M. Phosphatidylserine externalization is a downstream event of interleukin-ip-converting enzyme family protease activation during apoptosis / M. Naito, K. Nagashima, T. Mashima, T. Tsuruo // Blood.-1997.-Vol.89.-P.2060-2066.

160. Nicholson D.W. Life and death decisions / D.W. Nicholson, N.A. Thornberry // Science.-2003.-Vol.299.-P.214-215.

161. Nicoletti I. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry / I. Nicoletti, G. Migliorati, M.C. Pagliacci, F. Grignani, C. Riccardi // J. Immunol. Methods.-1991.-Vol. 139.-P.271-279.

162. Nielsen L.L. p53 tumor supressor gene therapy for cancer / L.L. Nielsen, D.C. Maneval // Cancer Gene Ther.-1998.-Vol.5.-P.52-63.

163. Nilsson K. Classification and biological nature of established human hematopoietic cell lines / K. Nilsson, J. Ponten // Int. J. Cancer.-1975.-Vol.15.-N.2.-P.321-341.

164. O'Connor P.M. Role of the p53 tumor suppressor gene in cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkitt's lymphoma cell lines / P.M. O'Connor, J. Jackman, D. Jondle, K. Bhatia, I. Magrath, K.W. Kohn // Cancer Res.-1993.-Vol.53.-N.20.-P.4776-4780.

165. Pai S.I. Rare loss-of-function mutation of a death receptor gene in head and neck cancer / S.I. Pai, G.S. Wu, N. Ozoren, L. Wu, J. Jen, D. Sidransky, W.S. El-Diery // Cancer Res.-1998.-Vol.58.-P.3515-3518.

166. Pan G. An antagonist decoy receptor and a death domain-containing receptor fro TRAIL / G. Pan, J. Ni, Y.F. Wei, G. Yu, R. Gentz, V.M. Dixit // Science.-1997.-Vol.277.-P.815-818.

167. Parkin D.M. Geographic distribution of Burkitt's lymphoma / D.M. Parkin, R. Sohier, G.T. O'Conor//IARC Sci. Publ.-1985.-N.60.-P.155-164.

168. Pearson M. The relation of oncogenesis and cytogenecs in leukemia and lymphoma / M. Pearson, J.D. Rowley // Ann. Rev. Med.-1985.-Vol.36.-P. 471483.

169. Pertl B. Rapid detection of trisomies 21 and 18 and sexing be quantitative ^ fluorescent multiplex PCR / B. Pertl, U. Weitgasser, S. Kopp, P.M. Kroisel, J.

170. Sherlock, M. Adinolfi // Human Genetics.-1996.-Vol.96.-P.55-59.

171. Piper J. Computer image analysis of comparative genomic hybridization / J. Piper, D. Rutovitz, D. Sudar, A. Kallioniemi, O.P. Kallioniemi, F.M. Waldman, J.W. Gray, D. Pinkel //Cytometry.-l995.-Vol.19.-N.1.-P. 10-26.

172. Pitti R.M. Introdiction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family / R. Pitti, S.A. Masters, S. Ruppert, C.J. Donahue, A. Moore, A. Ashkenazi // J. Biol. Chem.-1996.-Vol.271.-P. 1268712690.

173. Pulvertaft J.V. A study of malignant tumours in Nigeria by short-term tissue culture/J.V. Pulvertaft//J. Clin. Pathol.-1965.-Vol.l8.-P.261-273.

174. Pulvertaft J.V. Cytology of Burkitt's Tumour (African lymphoma) / J.V. Pulvertaft // Lancet.-1964.-Vol.39.-P.238-240.

175. Raff M.C. Social controls on cell survival and cell death / M.C. Raff // Nature.-1992.-Vol.356.-P.397-400.

176. Ramqvist T. Wild-type p53 induces apoptosis in a Burkitt lymphoma (BL) line that carries mutant p53 / T. Ramqvist, K.P. Magnusson, Y. Wang, L. Szekely, G. Klein, K.G. Wiman // C>ncogene.-1993.-Vol.8.-P.1495-1500.

177. Reed J.C. Apoptosis-targeted therapies for cancer / J.C. Reed // Cancer cell 2003 Vol 3: 17-22.

178. Reed J.C. The domains of apoptosis: a genomics perspective / J.C. Reed, K.S. Doctor, A. Godzik // Science.-2004.-STKE.-P.l-9.

179. Ried T. Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping / T. Ried, M. Liyanage, S. du Manoir, K. Heselmeyer, G. Auer, M. Macville, E. Schrock//J. Mol. Med.-1997.-Vol.75.-P.801-814.

180. Roninson I.B. If not apoptosis, then what? Treatment-induced senescence and mitotic catastrophe i ntumor cells / I.B. Roninson, E.V. Broude, B.-D. Chang // Drug Resistance Updates.-2001.-Vol.4.-P.303-313.

181. Roschke A.V. Karyotypic complexity of the NCI-60 drug-screening panel / % A.V. Roschke, G. Tonon, K.S. Gehlhaus, N. McTyre, K.J. Bussey, S. Lababidi,

182. D.A. Scudiero, J.N. Weinstein, I.R. Kirsch // Cancer Res.-2003.-Vol.63.-P.8634-8647.

183. Rowley J.D. Chromosome abnormalities in leukemia and lymphoma / J.D. Rawley //Ann. Clin. Lab. Sci.-1983.-Vol.l3.-N.2.-P.87-94.

184. Salvesen G.S. IAP proteins: blocking the road to death's door / G.S. Salvesen, C.S. Duckett// Nature Rev. Mol. Cell Biol.-2002.-V.3.-N.6.-P.401-410.

185. Sanchez-Beato M. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas / M. Sanchez-Beato, A. Sanchez-Aguilera, M.A. Piris // Blood.-2003.-Vol.101.-N.4.-P. 12201235.

186. Sanderson C.J. The mechanism of T cell mediated cytotoxicity. II. Morphological studies of cell death by tame-lapse microcinematography / C.J.

187. Sanderson//Proc. R. Soc. London.-1976.-Vol.l92.-241-255.

188. Savill J. Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cell undergoing apoptosis / J. Savill, I. Dransfield, N. Hogg, C. Haslett // Nature.-1990.-Vol.343.-P. 170-173.

189. Savill J.S. Thrombospondin cooperates with CD36 and the vitronectin receptor in macrophage recognition of neutrophils undergoing apoptosis / J.S. Savill, N. Hogg, Y. Ren, C. Haslett//J. Clin. Invest.-1992.-Vol.90.-P.1513-1522.

190. Schmidt M.L. Betulinic acid induces apoptosis in human neuroblastoma cell lines / M.L. Schmidt, K.L. Kuzmanoff, L. Ling-Indeck, J.M. Pezzuto // Eur. J. Cancer.-1997.-Vol.33 .-P.2007-2010.

191. Schneider U. Characterization of EBV-genome negative null and T cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed / U. Schneider, H.U. Schwenk, G. Bornkamm // Int. J. Cancer.-1977.-Vol.l9.-N.5.-P.621-626.

192. Schoumans J. The performance of CGH array for the detection of cryptic constitutional chromosome imbalances / J. Schoumans, B.-M. Anderlid, E. Blennow, B.T. Teh, M. Nordenskjöld // J. Med. Genet.-2004a.-Vol.41.-P.198-202.

193. Schulze-Osthoff K. Apoptosis: the biochemistry and molecular biology of programmed cell death / K. Schulze-Osthoff, D. Ferreri, M. Loss, S. Wesselborg, M.E. Peter//Eur. J. Biochem.-1998.-Vol.254.-P.439-459.

194. Selzer E. Effects of betulinic acid alone and in combination with irradiation in human melanoma cells / E. Selzer, E. Pimentel, V. Wacheck, W. Schlegel, H. Pehamberger, B. Jansen, R. Kodym // J. Invest. Dermatol.-2000.-Vol. 114.-P.935-940.

195. Shade M. Chromosome aberrations acquired in vitro by human B-cell lines. II. Distribution of break points / M. Shade, M.A. Woodward, C.M. Steel // J. Natl. Cancer Inst.-1980.-Vol.65.-N.l.-P.101-109.

196. Shaham S. Identification of multiple Caenorhabditis elegans caspases and their potential roles in proteoplytic cascades / S. Shaham // J. Biol. Chem.-1998.-Vol.273.-P.35109-35117.

197. Shaw P. Induction of apoptosis by wild-type p53 in a human colon tumor-derived cell line / P. Shaw, R. Bovey, S. Tardy, R. Sahli, B. Sorbat, J. Costa // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1992.-Vol.89.-P.4485-4499.

198. Shi L. Premature p34cdc2 activation required for apoptosis / L. Shi, W.K. Nishioka, J. Th'ng, E.M. Bradburiy, D.W. Litchfield, A.H. Greenberg // Science.-1994.-Vol.277.-P. 1143-1145.

199. Siebert R. Molecular features of B-cell lymphoma / R. Siebert, A. Rosenwald, L.M. Staudt, S.W. Morris // Current Opinion in Nocology.-2001.-Vol.13.-P.316-324.

200. Song Z. DCP-1, a Drosophila cell death protease essential for development / Z.

201. Song, K. McCall, H. Steller // Science.-1997.-Vol.275.-P.536-540.

202. Steel C.M. The cytogenetics of human B lymphoid malignancy: studies in Burkitt's lymphoma and Epstein-Barr virus-transformed lymphablastoid cell lines / C.M. Steel, J.E.N. Morten, E. Foster // IARC Sci. Publ.-1985.-N.60.-P.265-292.

203. Story J.A. Denis Parsons Burkitt (1911-1993) / J.A. Story, D. Kritchevsky // J. Nutr.-1994.-Vol. 124.-N.9.-P. 1551 -1554.

204. Strasser A. Apoptosis signaling / A. Strasser, L. O'Connor, V.M. Dixit // Ann. Rev. Biochemistry.-2000.-V.69.-P.217-245.

205. Sun Y. Plasma membrane sequestration of apoptotic protease-activating factor-1 in human B lymphoma cells: a novel mechanism of chemoresistance / Y. Sun, S. Orrenius, S. Pervaiz, B. Fadeel // Blood.-2005.-Vol.l05.-N.10.-P.4070-4077.

206. Takada K. An Epstein-Barr virus-producer line Akata: establishment of the cell line and analysis of viral DNA / K. Takada, K. Horinouchi, Y. Ono, T. Aya, T. Osato, M. Takahashi, S. Hayasaka // Virus Genes.-1991.-Vol.5.-N.2.-P. 147156.

207. Takada K. The role of Epstein-Barr virus in Burkitt's lymphoma / K. Takada // Curr. Top. Microbiol. Immunol.-2001.-Vol.258.-P.141-151.

208. Tamiya S. Mutation of CD95 (Fas/Apo-1) gene in adult T-cell leukemia cells / S. Tamiya, K.-I. Etoh, H. Suzushima, K. Takatzuki, M. Matsuoka // Blood.-1998.-Vol.91.-P.3935-3942.

209. Thornberry N.A. Caspases: enemies within / N.A. Thornberry, Y. Lazebnik // Science.-1998.-Vol.281.-P. 1312-1316.

210. Towbin H. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications / H. Towbin, T. Staehelin, J. Gordon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1979.-Vol.79.-N.9.-P.4350-4354.

211. Uren A.G. Conservetion of baculovirus inhibitor of apoptosis repeat proteins (BIRPs) in viruses, nematodes, vertebrates and yeasts / A.G. Uren, E.J. Coulson, D.L. Vaux // Trends Biochem. Sci.-1998.-Vol.23.-P.159-162.

212. Uthaisang W. Phosphatidylserine exposure in Fas type I cells is mitochondria-dependent / W. Uthaisang, L.K. Nutt, S. Orrenius, B. Fadeel // FEBS Letters.-2003.-Vol.545.-P.l 10-114.

213. Vaux D.L. Apoptosis timeline / D.L. Voux // Cell Death and Differentiation.-2002.-Vol.9.-P.349-354.

214. Veldman T. Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping / T. Veldman, C. Vignon, E. Schrock, J.D. Rowley, T. Ried // Nature Genet.-1997.-Vol.l5.-N.4.-P.406-410.

215. Wang K. Bid: a novel BH3 domain-only death agonist / K. Wang, X.-M. Yin, D.T. Chao, C.L. Milliman, S.J. Korsmeyer // Genes Dev.-1996.-Vol.10.-P.2859-2869.

216. Wang X. The expanding role of mitochondria in apoptosis / X. Wang // Genes and Dev.-2001 .-V. 15.-N.22.-P.2922-2933.

217. Waterhouse N.J. And all of a sudden it's over: mitochondrial outer-membrane permeabilization in apoptosis / N.J. Waterhouse, J.-E. Ricci, D.R. Green // Biochimie.-2002.-Vol.84.-P. 113-121.

218. White K. Cell killing by the Drosophila gene reaper / K. White, E. Tahaoglu, H.

219. SJetter // Science.-1996.-Vol.271 .-P.446-455.

220. White K. Genetic control of programmed cell death in Drosophila / K. White, M.E. Grether, J.M. Abrams, L. Young, K. Farrel, H. Sletter // Science.-1994.-Vol.264.-P.677-683.

221. Wiman K.G. Mutant p53 detected in a majority of Burkitt lymphoma cell lines by monoclonal antibody PAb240 / K.G. Wiman, K.P. Magnusson, T. Ramqvist,

222. G. Klein// Oncogene.-199l.-Vol.6.-N.9.-P. 1633-1639.

223. Wiman K.G. p53: emergency brake and target for cancer therapy / K.G. Wiman // Exp. Cell Res.-1997.-Vol.237.-P.14-18.

224. Wright D.H. What is Burkitt's lymphoma and when is it endemic? / D.H. Wright // Blood.-1999.-Vol.93 .-N.2.-P.75 8.

225. Wyllie A.H. Cell death: the significance of apoptosis / A.H. Wylie, J.F.R. Kerr, A.R. Currie // Int. Rev. Cytol.-1980a.-Vol.68.-P.251-306.

226. Wyllie A.H. Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation / A.H. Wyllie // Nature.-19806.-Vol.284,-P.555-556.

227. Yang E. Bad, a heterodimeric partner for Bcl-XL and Bcl-2 displaces Bax and promotes cell death / E. Yang, J. Zha, J. Jockel, L.H. Boise, C.B. Thompson,m S.J. Korsmeyer // Cell.-l 995.-Vol.80.-P.285-291.

228. Yonish-Rouach E. Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukemic cells that is inhibited by interleukin-6 / E. Yonish-Rouach, D. Resnitzky, J. Lotem, L. Sacha, A. Kimchi, M. Oren // Nature.-199l.-Vol.352.-P.345-347.

229. Yoshida H. The role of Apaf-1 in programmed cell death: from worm to tumor /

230. H. Yoshida// Cell Structure and Function.-2003.-Vol.28.-P.3-9.

231. Yuan J. A first insight into the molecular mechanisms of apoptosis / J. Yuan, H.B. Horvitz // Cell.-2004.-Vol.S 116.-P.S53-S56.

232. Yuan J. The C. elegans cell death gene ced-3 encodesa protein similar to mammalian inerleukin-1 P-converting enzyme / J. Yuan, S. Shaham, S. Ledoux,

233. H.M. Ellis, H.R. Horvitz // Cell.-1993.-Vol.75.-P.641-652.

234. Yuan J. The Caenorhabditis elegans cell death gene ced-4 encodes a novel ^ protein and is expressed during the period of extensive programmed cell death /

235. J. Yuan, H.R. Horvitz // Development.-1992.-Vol. 116.-P.309-320.

236. Zech L. Characteristic chromosomal abnormalities in biopsies and Iymphoid-cell lines from patients with Burkitt and non-Burkitt lymphomas / L. Zech, U. Haglund, K. Nilsson, G. Klein // Int. J. Cancer.-1976.-Vol.l7.-P.47-56.

237. Zech L. The identification of human chromosomes by fluorescence technics / L. Zech // Biochem. J.-l971 .-Vol. 124.-N.5.-P.38-39.

238. Zeuthen J. Epstein-Barr virus (EBV), lymphocytes and transformation / J. Zeuthen // J. Cancer Res. Clin. Oncol.-1983 .-Vol. 106.-N. 1 .-P. 1 -11.m

239. Zhang S. High-resolution analysis of chromosome markers in Burkitt lymphoma cell lines / S. Zhang, L. Zech, G. Klein // Int. J. Cancer.-1982.-Vol.29.-N.2.-P. 153-157.

240. Zimonjic D.B. Novel genomic imbalances and chromosome translocations involving c-myc gene in Burkitt's lymphoma / D.B. Zimonjic, C. Keck-Waggoner, N.C. Popescu//Leukemia.-2001.-Vol.15.-P. 1582-1588.

241. Zou H. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspases-3 / H. Zou, W.J. Henzel, X. Liu, A. Lutschg, X. Wang // Cell.-1997.-Vol.90.-P.405-413.

242. Zuco V. Selective cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell lines, but not on normal cells / V. Zuco, R. Supino, S.C. Righetti, L. Cleris, E. Marchesi, C. Gambacorti-Passerini, F. Formelli // Cancer Lett.-2002.-Vol.175.-P. 17-25.

243. Zwaal R.F.A. Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cells / R.F.A. Zwaal, A.J. Schroit // Blood.-1997.-Vol.89.-P.l 121-1132.