Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетический анализ межрасовых гибридов SUNCUS MURINUS (INSECTIVORA, SORICIDAE)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетический анализ межрасовых гибридов SUNCUS MURINUS (INSECTIVORA, SORICIDAE)"

л.

I ч

На правах рукописи УДК 576.312.37:599.33

РОГАЧЕВА МАРГАРИТА БОРИСОВНА

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МЕЖРАСОВЫХ ГИБРИДОВ SUNCUS МиНШШ (1Ь!БЕСТ1УОЯА, БОШСЮАЕ).

Генетика - 03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1997

Работа выполнена в Институте экологической медицины Нагойского университета, г. Нагоя, Япония, и в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научные руководители: доктор биологических наук,

П.М. Бородин, доктор биологических наук, A.C. Графодатский Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

JI.B. Высоцкая

Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск кандидат биологических наук, Н.С. Жданова

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Нозосибирск

Ведущее учреждение: Институт проблем экологии и эволюции

им. А.Н. Северцова РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится _1997г. на утреннем

заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-02.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, просп. Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан_

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А.Д. Груздев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Изучение роли хромосомных перестроек в эволюции и видообразовании является одной из наиболее сложных и актуальных проблем эволюционной биологии. К настоящему времени накоплен огромный материал по сравнительной цитогенетике животных. Особенно значительный прогресс был достигнут в изучении хромосом млекопитающих (Орлов, Булатова, 1983; Графодатский, Раджабли, 1988). Было показано, что между близкими видами часто наблюдаются значительные кариотипические различия. Вопрос о том, является ли кариотипическая дивергенция причиной видообразования или лишь сопутствует ему, остается неясным.

Роль хромосомных перестроек в эволюции и видообразовании обычно изучается и обсуждается на материале сравнительного анализа близких видов и их гибридов. В тех случаях, когда виды кариотипически различаются, а межвидовые гибриды стерильны, делается вывод о том, что кариотипические различия родительских форм являются непосредственной причиной гибридной стерильности. Уайт (White, 1973, 1978) полагал, что хромосомные перестройки могут выступать в роли непосредственных факторов репродуктивной изоляции. Проверка корректности этого вывода на материале межвидовых гибридов часто затруднена, так как сама гибридная стерильность исключает возможность генетического анализа межвидовых различий и их роли в формировании репродуктивной изоляции. Анализ межрасовых гибридов, особенно в тех случаях, когда расы по степени кариотиопической и генетической дивергенции достигают уровня подвидов, представляется гораздо более продуктивным подходом для решения этих проблем. Классические исследования межрасовых гибридов у домовой мыши (Gropp,' Winking, 1981), черной крысы (Yosida, 1980), обыкновенной бурозубки (Searle, 1988) внесли существенный вклад в понимание механизмов видообразования у млекопитающих. Очевидно, однако, что для выявления общих закономерностей эволюции кариотипа требуется расширение круга модельных видов.

Чрезвычайно интересным и перспективным для изучения проблем хромосомной эволюции видом представляется домовая мускусная землеройка (Suncas murinus L., Insectívora, Soricidae). Этот вид широко распространен от восточного побережья Африки до Японских островов (Corbert, Hill, 1992). Он полиморфен по числу и морфологии хромосом. Число плеч постоянно во всех популяциях (NF=60), тогда как диплоидное число хромосом (2п) варьирует от 30 до 40. В изученных

популяциях был обнаружен также внутри- и межпопуляционный полиморфизм по размеру и морфологии половых хромосом (Raman, Nanda, 1986). Результаты анализа генетических маркеров (Ruedi et al., 1996; Yamagata et al., 1990, 1995) свидетельствуют о значительной генетической дивергенции между отдельными локальными популяциями. Таким образом мы вправе рассматривать географически изолированные, кариотипически и генетически дивершровавшие популяции S. murinus как отдельные расы.

Животные, отловленные из нескольких локальных популяций (Непала, Бангладеш, Шри Ланки, Японии и др.) послужили основой для создания лабораторных линий. Эти линии в настоящее время интенсивно используются для биомедицинских исследований (Oda et al., 1985).

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования был детальный цитогенетический анализ двух хромосомных рас S. murinus и их гибридов. Анализ кариотипических различий между географическими расами дает важную информацию о закономерностях эволюции хромосом у млекопитающих. Он позволяет установить распространенность отдельных хромосомных перестроек по ареалу обитания, и тем самым реконструировать особенности расселения вида. Изучение спаривания и сегрегации хромосом у межрасовых гибридов, одиночных и множественных гетерозигот по хромосомным перестройкам, позволяет выявить факторы, ответственные за поддержание внутривидового полиморфизма по структурным мутациям, оценить роль хромосомных и генетических механизмов в формировании репродуктивной изоляции.

Для достижения этой цели были посталены следующие задачи:

1 .Разработать надежную номенклатуру хромосом S. murinus, с использованием GTG-дифференциального окрашивания хромосом при разных уровнях конденсации.

2.Провести сравнительный анализ кариотипов двух географически изолированных рас S. murinus, населяющих Непал и Шри Ланку, выявить кариотипические различия между ними.

3.Оценить жизнеспособность и плодовитость межрасовых гибридов, гетерозиготных по одной или нескольким хромосомным перестройкам, различающим родительские расы.

-(.Проанализировать спаривание и сегрегацию полиморфных хромосом у межрасовых гибридов.

5.Провести детальный цитогенетический и генетический анализ случаев гибридной стерильности.

Научная новизна. Впервые описан стандартный хариотип 5. типпш. Сравнительный анализ кариотипов показал, что популяции 5. тигтш обитающие в Непале и в Шри Ланке существенно дивергировали карнотипически. Они отличаются по пяти робертсоновским транслокациям аутосом, по инсерциям гетерохроматина в хромосоме 7 и Х-хромосоме, множественными перестройкам в У-хромосоме. Показано, что популяции, населяющие Шри Ланку и Малайзию, имеют общие робертсоновские транслокации. Это подтверждает гипотезу о гибридном происхождении малайской популяции 5. типпш. Было установлено, что хромосомные варианты обеих родительских популяций нормально конъюгируют и сегрегируют в мейозе у гетерозигот. Гомо- и гетерозиготы по хромосомным перестройкам характеризуются нормальной плодовитостью и жизнеспособностью. Впервые описан и детально проанализирован феномен мужской гибридной стерильности у Б. типпш. Доказано, что обнаруженные в гибридной популяции случаи мужской стерильности не связаны с хромосомной гетерозиготностью. Наследование гибридной стерильности описано в рамках моногенной трехаллельной системы наследования. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что хромосомный полиморфизм у 5. типпш является селективно нейтральным. Становление репродуктивной изоляции между географическими расами происходит на основе генной, а не хромосомной дивергенции.

Практическая ценность. Полученные в работе результаты необходимы для развития частной генетики 5. типпш - они создают основу для проведения хромосомного и субхромосомного картирования. Обнаруженный в работе феномен гибридной мужской стерильности может быть использован для моделирования нарушений репродуктивной функции у человека. Результаты работы, важные для понимания генетических и хромосомных механизмов микроэволюции и видообразования у млекопитающих, используются при чтении курса по теории эволюции в Новосибирском государственном университете.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на 43 Всеяпонском Конгрессе по Изучению Экспериментальных Животных (Ниигата, Япония, июнь 1996 г.), на Четвертой Международной Конференции по Цитогенетике Боге:с агапеш (Упсала, Швеция, август 1996 г.) и на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН (февраль, 1997 г.).

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, изложение

собственных экспериментальных данных, обсуждение результатов исследования, выводы и список литературы (191 наименование). Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 24 рисунка.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В нашей работе были использованы S. murium аутбредных линий КАТ и SRI и гибридного стока SK, содержащиеся в виварии Института экологической медицины Нагойского университета. Родоначальниками линии КАТ были животные, отловленные в окрестностях столицы Непала Катманду. Как представитель базового 40-хромосомного кариотипа, эта линия была использована для построения стандартного кариотипа S. murinus. Линия SRI происходит от землероек западного берега острова Шри Ланка. Представители данной линии имели 2п=30-32. Гибриды первого и последующих поколений от скрещивания линий SRI и КАТ и бэккроссы составляли гибридный сток SIC и несли хромосомы линий КАТ и SRI в разных комбинациях.

Цитогенетический анализ митотических хромосом S. murinus был выполнен на клетках костного мозга и культивированных фибробластах. Прижизненное кариотипирование проводилось путем биопсии костного мозга или кончика хвоста.

G-окрашивание проводили по методу Сибрайт (Seabright, 1971) с некоторыми модификациями. Для окрашивания структурного гетерохроматина был использован метод, предложенный Самнером (Sumner, 1972). Ag-окрашивание ядрышко-образующих районов хромосом проводили согласно методу Хауелла и Блэка (Howell, Black, 1980). Метафазные пластинки фотографировали, затем препараты отмывали, высушивали и дифференциально окрашивали по G-методу. Препараты распластанных синаптонемных комплексов (CK) получали по методу Чендли (Chandley, 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Стандартный кариотнп Suncus murinus

Для того чтобы выделить ' характерные особенности каждой хромосомы, сделать сравнимыми раннее опубликованные данные и обеспечить материал для сравнительной цитогенетики и картирования, мы проанализировали и подробно описали 40-хромосомный кариотип с использованием G-дифференциального окрашивания. Мы предложили его

в качестве стандартного кариотипа 5. типти (1^а1сЬеуа е1 а1., 1996). Особи линии КАТ использовались как представители базового кариотипа.

, г

С5

а

15

16

10

17

11

1В

12

Б;

19

Рис. 1. Стандартный кариотип 5. тигтия

13

14

Каждая СТв-дифференциально окрашенная хромосома была представлена вариантами, отражающими наиболее характерную окраску этой хромосомы при разной степени конденсации. Идиограммы были построены на основе СТС-сегметированных хромосом наивысшей

степени разрешения. Результирующий кариотип состоит из 481 сегмента (рис. 1).

Мы проанализировали распределение блоков конститутивного гетерохроматина у представителей линий КАТ и SK. Прицентромерный гетерохроматин локализуется на хромосомах 1, 2 и 3, 15, 16 и 17. Теломерные блоки С-гетерохроматина выявляются на хромосоме 13 и на р-плече хромосомы 4. Хромосомы 18 и 19 имеют небольшие гетерохроматиновые плечи. Центромера и дистальные районы обоих плеч Х-хромосомы окрашиваются С-положителыю. Y-хромосома имеет ярко выраженный интерстициальный блок С-гетерохроматина в коротком плече. Дистальная половина длинного плеча и прицентромерная область Y хромосомы также окрашиваются характерно для С-гетерохроматина. Остальная часть Y-хромосомы, за исключением С-негативного терминального района короткого плеча, выглядит равномерно серой.

Проведенная нами окраска нитратом серебра митотических хромосом выявила от 1 до 6 ядрышковых организаторов (ЯО) (обычно 3) на трех парах хромосом. Последовательная переокраска этих хромосом, показала, что хромосомы 9 и 13 несут ЯО в теломерных районах, а хромосома 5 в теломерном районе короткого плеча. Результаты флуоресцентной in situ гибридизации клонированных последовательностей генов рРНК человека подтвердили данную локализацию.

Кариотипические различия между хромосомными расам

Сравнительный анализ хромосом линий SRI и КАТ был проведен на гибридах первого поколения. Перестроенные хромосомы и хромосомы стандартного набора анализировались и сравнивались в одних и тех же клетках при одинаковых условиях (рис. 2). Сравнительный анализ G-сегментации непарных хромосом гибридов показал, что все пять метацентриков линии SRI являются продуктами попарных центрических слияний 10 акроцентриков стандартного набора линии КАТ: 8 и 17, 9 и 13, 10 и 12, 11 и 16, 14 и 15. Для всех особей была установлена полная гомология по G-сегментации между плечами робертсоновских метацентриков линии SRI и соответствующими акроцентриками стандартного набора. Робертсоновские метацентрики были обозначены как Rb(8.17), Rb(9.13), Rb(10.12), Rb( 11.16) и Rb(14.15).

На рис. 2 видно, что пара хромосом 7 гетероморфна. Хромосома 7 линии SRI вдвое длиннее хромосомы 7 линии КАТ. Сравнение G-сегментации вариантов хромосомы 7 показало наличие дополнительного протяженного равномерно окрашенного темного сегмента, который

б

находится между прицентромерным темно серым сегментом ql.3 и следующим черным сегментом ql.5. С-окрашивание подтвердило гетерохроматиновую природу добавочного материала.

■Ii '(И/

Rh{8.17) Rb(9.13)' Rb(10.12) Rb(11.16) Rb(14.15) 7 X Y

Рис. 2. Полиморфные хромосомы в стоке SK. Слева вариант КАТ, справа - SRI. Стрелками отмечены добавочные сегменты.

Х-хромосома линии SRI имела в коротком плече дополнительный G-позитивный сегмент (рис. 2). С-окрашивание выявило в коротком плече X хромосомы линии SRI увеличенный блок гетерохроматина, соответствующий дополнительному темноокрашенному G-сегменту.

Y-хромосома линии SRI отличается существенно по рисунку G-сегментации от стандартной. На основе рисунка G-сегментации мы предположили, что SRI вариант Y-хромосомы отличается от КАТ варианта по делеции в коротком плече, парацентрической инверсии, инверсии длинного плеча и делеции в длинном плече. С-окрашивание показало, что Y-хромосомы различаются как по количеству С-позитивного, так и С-негативного материала.

Полиморфизм S. murinus по Rb был известен давно. Было показано, что большая часть ареала заселена 40-хромосмными животными, тогда как S. murinus юга Индии и Шри Ланки имели 30-32-хромосомый кариотип. В Малайзии был обнаружен полиморфизм по числу хромосом от 2п=35 до 2п=40. На основе этих данных Йосида (Yosida, 1982) предположил, что расселение S. murinus из центра Индии происходило в двух направлениях: на север и на юг. иерез северную Индию и Бангладеш S. murinus, вероятно, мигрировали в континентальные области Юго-восточной Азии, а затем по морю из Малайзии в Индонезию, Филиппины, Тайвань и Японию. В Южно-индийской ветви зафиксировались последовательные робертсоновские слияния. Полиморфизм в Малайзии, по мнению Йосиды (1982), является следствием гибридизации местной популяции с мигрантами из Южной Индии и/или Шри Ланки (рис. 3). Однако,для доказательства гипотезы о гибридной природе полиморфизма в Малайзии следовало показать, что малайская и шри-ланкийская популяции S. murinus имеют в кариофондах

одни и те же робертсоиовские слияния. Мы сравнили G-окрашенные хромосомы линии SRI с ранее опубликованными фотографиями кариотипов малайских S. murinus и обнаружили, что робертсоиовские метацентрики, встречающиеся в Малайзии, полностью соответствуют Rb(10.12) и Rb(14.15) из линии SRI. Обнаруженная нами идентичность робертсоновских транслокаций S. murinus в Малайзии и Шри Ланке доказывает справедливость гипотезы Йосиды о гибридной природе полиморфизма в природной популяции Малайзии.

Стерильность у межрасовых гибридов

Скрещенные в лаборатории представители линий КАТ и SRI дали жизнеспособных и плодовитых гибридов первого, и последующих поколений. Однако среди самцов гибридного стока SK мы обнаружили случаи стерильности. Мы проанализировали связь между стерильностью и кариотипом. В качестве показателя стерильности мы использовали редуцированный вес семенников.

Всего было проанализировано 59 взрослых самцов стока SK. Изученные самцы ясно подразделялись на две группы по признаку "вес семенников": i) менее чем 100 мг и И) более 200 мг. Средний вес (70.4+18.4) в первой группе отличатся достоверно от среднего веса второй группы (235.5+38.4). В семенниках весом менее 100 мг семенные канальцы были узкими и почти пустыми, сперматогонии и сперматоциты первого порядка присутствовали в них, но ни сперматид, ни спермы не было обнаружено. Сперматогенез был блокирован на стадии профазы мейоза или ранее. Электронно-микроскопический анализ распластанных сперматоцитов, проведенный у 4 стерильных самцов, подтвердил этот вывод. Большинство хромосом было неспарено или спарено

Рис. 3. Хромосомные числа в природных популяциях 5. murinus (по Yosida, 1982).

4L область - предполагаемый центр происхождения.

Стрелки указывают пути миграции, заштрихованная

неполностью. Важно, что не только готероморфные, но и гомоморфные хромосомы были не спарены. Количество аберрантных синаптонемных комплексов (СК) на клетку было выше, чем количество гетерозиготных комбинаций. В клетках наблюдалось большое количество электронно плотного материала. Описанная картина характерна для дегенерирующих клеток. Все это говорит о том, что мейоз у стерильных гибридов был серьезно нарушен и остановлен на стадии профазы. В семенниках весом более 200 мг семенные канальцы были нормальными. В них были представлены все стадии сперматогенеза, включая зрелые сперматозоиды. Самцы с весом семенников больше 200 мг обычно имели потомков, тогда как ни один из самцов из группы 0 потомков не оставил. Основываясь на вышеизложенных данных, мы относили всех самцов, имевших семенники весом меньше 100 мг, к стерильными, а самцов, имевших потомков и (или) вес семенников больше 200 мг, к фертильным.

Таблица 1. Распределение хромосомных вариантов у самцов 8К.

Стерильные самцы

Фертильные самцы

8.17 9.13 10.12 11.16 14.15 7 ГУ 8.17 9.13 10.12 11.16 14.15 7 ХТ

А М А м М я« ' -К ;... в.)'; А

М :Г7я "Т,Я7. 1.. А "и" 1 .. .н, I от м А А А 3 ¡.лея:

А А А -i.il. к/к А Г Ю А ! ЭТ. от

В" ""ц ... , у .. "Г А А к к/к м м А А А ¡. 388?'

И ■ н н •И. : "и: '1 к от -•А-« А А А А 1 к/к

Н . № ; а А А •7 к 1 от н А А * 1 А к к/к

Н М чГ И' ' и Л 8Я7 в 1 м А А А от

Н " Н ' ! Н - И . „ н» к от н ! А А А я от

н . :.■ н. ,: А г. „К 1 а ¡1' (•• м: .л .... А М Ь Н" ! г Ч I Б от

м м II* 5 А А : н I* от А А А А К кж

• "•' а 1 А А ."Я" И -1 от "а"" А А Г Я : 5 к«'

А А А А А . И ~ Н ? А А А . В. " "Я"" • »5.

А •. Й ' К Л А "'•'•Я' 5 ; к/э ..Г II" а *н к/к

Й " н А А . н ; 5 К/3 А А н а; ; а 1 .¿И "" от

Н • н А Г „ н н~ 5/К "к ' А А А А к "т •

м н А А м Н . та . н ' А А А . А к кя .

н и А А А н • от -Н : А А А А к ' К/к

. н н н А А - Н .: к/к м Г Н ' " А А А Ю5

А II А " Н '< А к к/к А А А А Н~ К - К/8

"н ' н А Н ! А к *' Эис* А А А А 1 . ' й " хя

А А А А А к ак А А А А А н .т

А А А ; а к $пс А А А !" н. : к к/к

А н А А . и. ' к 5/К 'н. А А А А к '""«се

А н А А А К ; зли н А А "я • А " И ~ кя

А н А А А .....и" к/к н А А А и:' И ' ?в

А н А А А в 1 к/к . н А А А А II '

А А А А Н ..н К/8 " А н - А А : и'- к к/к

А А А А Н н к» 7 н. А Г. н -'. А н н м н А А А А А " "а, А н н • 1 А ' н Я к н: II 5 к/к Г юз К/5 от

** М - метацентические акроцентрические гомозиготы, Б

гомозиготы, Н - БЯ! вариант, К

- гетерозиготы, А -- КАТ вариант.

В таблице 1 показано распределение кариотипов в группе стерильных и фертильных самцов. Видно, что ни одна из перестроек качественно не отличала стерильных и фертильных самцов. Гетерозиготы по каждой из перестроек присутствовали в обеих группах.

Стерильные самцы имели все возможные комбинации половых хромосом: XK-YK, Xs-Ys, XK-YS, Xs - YK. Это указывает на то, что происхождение Х- и Y-хромосом не играет роли в определении стерильности животного. Что касается статуса хромосомы 7, то как среди фертильных, так и среди стерильных самцов были обнаружены все возможные комбинации (S/S, S/K, К/К), что исключает роль данной хромосомы в стерильности.

Все это свидетельствует о том, что структурная гетерозиготность сама по себе не вызывает стерильности. Можно предположить' что гибридная стерильность в стоке SK обусловлена генетическими, а не хромосомными факторами. Для проверки этой гипотеза мы проанализировали происхождение стерильных и фертильных гибридов.

В целом, анализ родословной показывает, что случаи стерильности у гибридов SK стока распределены не случайно. Стерильные самцы часто имеют стерильных братьев, дядей и т.д. Из родословной видно, что стерильные самцы имели как цитоплазму линии SRI, так и КАТ. Следовательно, можно исключить передачу стерильности через цитоплазму матери. Так же мы можем исключить сцепленную с полом наследственность, поскольку нормальные самцы были получены как в скрещиваниях SRI х КАТ, так и в реципрокных. Кроме того, кариологический анализ показал наличие всех возможных комбинаций X-Y, как у стерильных, так и у фертильных самцов.

Мы рассмотрели две модели моногенного аутосомного контроля стерильности.

Двухаллельная модель. Если предположить, что линия КАТ была гомозиготна по аллелю А], а линия SRI по аллелю Аг.и гетерозиготы А|Аг - стерильны, тоща все гибридные самцы Fi должны быть стерильными. Среди самцов гибридов Fi по крайней мере 5 самцов было фертильных. Наблюдаемая картина может указывать на неполную пенентрантность генотипа А1А2. Тоща неполная пенетрантность должна была проявляться равномерно среди А1А2 самцов. Однако у одного из самцов Fi при скрещивании с 6 самками линии КАТ все 13 сыновей были нормальными. В потомстве остальных самцов были отмечены случаи стерильности.

Гетерогенность среди Fi самцов в проявлении и передаче стерильности потомству может быть описана в рамках трехаллелыюй модели. Мы предположили, что линия КАТ была гомогенной по аллелю А|. Линия SRI содержала аллели Аг и A3. Сочетания аллелей А2А1 „ А2А3 давали фертильных самцов. Только комбинация А1А3 вызывала стерильность. Тогда в потомстве основателей стока SK при скрещивании с линией КАТ (AjAi) должно быть расщепление на нормальных самок (А1А2 и А1А3), нормальных самцов(А|А2) и стерильных самцов (А1А3). Часть самок (А1А2) при скрещивании с самцами КАТ линии (А1А1) или самцами стока SK (А1А2) всегда имела только нормальных сыновей и дочерей (AjAj и А1А2). Другие самки (А[Аз) при скрещивании с самцами КАТ линии (А)Ai) или самцами стока SK (А1А2) давали расщепление на нормальных потомков (А|А| и А|Аг) и стерильных сыновей (А|Аз) и дочерей-носителей (А]Аз).

Сегрегационный анализ родословных, проведенный Т.И. Аксенович, подтвердил валидность предложенной трехаллельной модели и показал, что она достоверно лучше диаллельной с неполной пенентрантностью.

Спаривание хромосом у межрасовых гибридов.

Мы показали, что у стерильных самцов мейоз останавливается на зиготене - пахитене. Нас интересовало, как происходит спаривание гетероморфных хромосом в профазе мейоза у фертильных самцов SK гетерозиготных по вариантам хромосом, различающих родительские линии SRI и КАТ. Все фертильные самцы SK демонстрировали

в пахитене мейоза (рис. 4). Рис. 4. Синаптонемные комплексы самца SK. Rb8.17)/+, Rb(9.13)/+, Rb(10.12)/+, Rb(14.15)/+, Is(7)/+, XK/YS

Стрелками показаны гетероморфные конфигурации.

У гетерозигот по робертсоновским транслокациям наблюдались триваленты между метацентриками и двумя гомологичными акроцентрикамн. Обычно синапсис между метацентриком и

нормальное спаривание хромосом

Rb ..

' h

. •. У v - . .-Rb

-у Г-

i

Ь Rb t -'

\

гомологичными акроцентриками был полным. В большинстве клеток прицентромерные районы акроцентриков были негомологично спарены друг с другом, образуя боковые плечи разных размеров.

Хромосома 7 линии SRI была вдвое длиннее стандартной за счет большой вставки гетерохроматина в прицентромерном районе. Однако только в небольшой фракции клеток гетерозиготных самцов (5.3%) были зафиксированы гетероморфные биваленты с небольшой шпилькой, обычно расположенной ближе к одному из концов бивалента (рис. 4). Большинство клеток содержало нормально спаренный бивалент без шпилек и утолщений.

Несмотря на значительную дивергенцию половых хромосом у изучаемых линий, они, по-видимому, сохранили неизменным район спаривания. Частота X-Y диссоциаций была довольно низкой во всех комбинациях (от 0.04 до 0.06) и не отличалась от таковой в родительских линиях. Так как во всех случаях диссоциации X и Y элементы находились в непосредственной близости друг к другу, то их следует рассматривать как продукты преждевременной диссоциации, а не истинные униваленты. Мы не обнаружили примеров негомологичного спаривания неспаренных участков X и Y элементов с участками робертсоновскмх тривалентов. В целом, аберрантные конфигурации в пахитенных клетках фертильных самцов были довольно редки (5%).

Размер помета у межрасовых гибридов

Мы показали, что гетерозиготность по хромосомным вариантам, различающим родительские линии КАТ и SRI, не приводит к остановке мейоза и стерильности. Однако она может приводить к формированию несбалансированных гамет, повышению эмбриональной смертности и, следовательно, к снижению размера помета. Чтобы проверить это, мы проанализировали размер помета у животных родительских линий и у животных линии SK, гетерозиготных по одной или нескольким перестройкам.

Рис. 5 показывает, что размер помета во всех группах был промежуточным между значениями родительских линий. Не было обнаружено достоверных различий в размере помета в зависимости от отдельных транслокаций и от пола гетерозиготного родителя. Гетерозиготность как по одной, так и по нескольким Rb не снижала плодовитость носителей до уровня наименее плодовитой линии SRI. Анализ частных коэффициентов корреляции показал, что вариация в размере помета скорее была обусловлена вариацией генетического вклада

линии SRI р<0.509).

(b=-0.29,

р<0.035), чем

гетерозиготностью родителей (Ь=-0.09,

i

Рис. 5. Размер помета при рождении у гетерозигот по Rb

' ■ ' самки Rb самцы НЬ

а g ; з г s s з s

х - х »* * 2 ~ 2

Е 5 ä g g g

Таким образом, результаты данного эксперимента показывают, что гетерозиготность по одной или нескольким Rb не приводит к значимому снижению плодовитости у межрасовых гибридов. Наблюдаемая вариация в размере помета как у самцов, так и у самок была обусловлена генетическим вкладом линии SRI, имеющей низкую плодовитость.

Сегрегация хромосом у межрасовых гибридов

Используя полученных в лабораторных условиях межрасовых гибридов двух кариотипически дивергировавших рас, представленных лабораторными линиями SRI и КАТ, мы провели анализ сегрегации пяти робертсоновских транслокаций в потомстве гетерозиготных самцов и самок. Всего было проанализировано 290 потомков из 136 пометов.

0.7 -0.6 : 05 -0.4 • 0.3 -

02 ; 0.1 • о -

к

Рис. 6. Частота передачи Rb и Is потомству от гетерозиготных родителей

I I самки гетерозиготы самцы гетерозиготы

а s s

На рис. 6 представлены результаты анализа сегрегации пяти робертсоновских транслокаций во всех информативных скрещиваниях. Ни для одной из полиморфных хромосом во всех типах скрещиваний не обнаружилось отклонений в сегрегации от ожидаемого (1:1 или 1:2:1). Как гетерозиготные самцы, так и самки передавали перестроенную и нормальную хромосомы потомкам в соответствии с законами Менделя.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, мы показали, что существенная кариотипическая дивергенция, возникшая между географически и исторически изолированными расами S. murinus, не привела к нарушению мейоза и гаметогенеза у межрасовых гибридов. Это хорошо согласуется с данными полученными из анализа других видов: естественно возникшие перестройки, редко нарушают мейоз и приводят к стерильности гетерозигот ( Reed et al„ 1992а,b; Coyne et al., 1993).

Мейотический механизм "укрощения хромосомных перестроек" удивительно сходен у разных видов и для разных перестроек. Обычно он вовлекает негомологичное спаривание гетероморфных сегментов. В случае робертсоновских или тандемных слияний прицентромерные районы близнецовых акроцентриков обычно формируют боковое плечо. В случае инсерций, делеций, инверсий или амплификаций, петли и выпячивания боковых элементов или устраняются синаптической подгонкой или не возникают вовсе. Во всех случаях, роль негомологичного спаривания заключается в превращении сложной или частично асинаптической конфигурации в прямолинейную и полностью спаренную. Это обеспечивает перестройкам беспрепятственное прохождение через профазу мейоза и нормальное развитие гамет. Вторая, не менее важная функция негомологичного спаривания в профазе мейоза - создание условий для нормальной сегрегации хромосом. Благодаря этому снижается риск образования анеуплоидных зигот и гибели эмбрионов.

В проведенном нами анализе межрасовых гибридов S. murinus мы не обнаружили ни нарушений в сегрегации робертсоновских транслокаций, ни эффекта гетерозиготности на размер помета. Даже если робертсоновская гетерозиготность оказывала отрицательное влияние на плодовитость, эффект этот был несущественным по сравнению с эффектом генетического фона родительских линий. Генные факторы оказались более важными, чем хромосомные и в контроле гибридной стерильности.

Таким образом мы можем заключить, что хромосомные перестройки, различающие родительские линии, не вызывали заметного отрицательного гетерозиса. Следовательно, они не могут выступать в роли механизмов репродуктивной изоляции, по крайней мере, в проанализированной нами ситуации. Наши данные по "популяционной генетике" линии Б К показывают, что они могут вести себя в популяциях типпиз как нейтральные варианты: фиксироваться в одних популяциях и оставаться полиморфными в других.

На основе анализа одного вида нельзя сделать однозначного вывода о роли хромосомных перестроек в млкроэволюцни и видообразовании. Наши данные показывают с какой осторожностью следует судить о природе репродуктивной изоляции. Если две расы или два вида отличаются по ряду хромосомных перестроек, и при этом их гибриды демонстрируют нарушения в мейозе, то причиной этих нарушений совсем не обязательно должна быть кариотипическая дивергенция. Нарушения могут быть обусловлены и несовместимостью родительских геномов, вызванной генетической дивергенцией.

ВЫВОДЫ

1. С помощью методов дифференциальной окраски проведен подробный цитологический анализ хромосомного набора Бипсиз типпиз Ь. Описаны ОТв-окрашенные хромосомы высокого уровня разрешения (481 сегмент). Охарактеризовано распределение гетерохроматина по хромосомам 5. типпиз. Определена локализация ядрышко-образуюхцих' районов на хромосомах 5, 9 и 13. Впервые предложена номенклатура хромосом данного вида.

2. Сравнительный анализ показал, что кариотип животных из популяции 5. типпиз, обитающих в Шри Ланке, отличается от стандартного по пяти робертсоновским транслокациям аутосом, инсерциям гетерохроматина в хромосоме 7 и Х-хромосоме, множественными перестройками в У-хромосоме.

3. Показано, что кариотипы животных из популяций Шри Ланки и Малайзии, имеют ■ общие робертсоновские транслокации. Это подтверждает гипотезу о гибридном происхождении малайской популяции 5. типпиз.

4. Установлено, что в гибридной лабораторной популяции, происходящей от скрещивания представителей популяций Б. типпиз Непала и Шри Ланки, хромосомы, различающие родительские популяции нормально

конъюгируют и сегрегируют в мейозе, а их гетерозиготные носители характеризуются нормальной плодовитостью.

5. Показано, что обнаруженные в гибридной популяции S. murinus случаи мужской стерильности не связаны с гетерозиготностью по хромосомным перестройкам, а наследование гибридной стерильности мЬжет быть описано в рамках моногенной трехаллельной системы.

6. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что хромосомный полиморфизм у S. murinus является селективно нейтральным. Становление репродуктивной изоляции между географическими расами Suncus murinus происходит на основе генной, а не хромосомной дивергенции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Rogatcheva M.В., Borodin P.M., Matsuda Y., Oda S. Standard karyotype of the house musk shrew, Suncus murinus (Insectivora, Soricidae). // Cytologia. 1996. V. 61. P. 197-208.

2. Rogatcheva M.B. Standard karyotype and high resolution analysis of the house musk shrew, Suncus murinus. II Abstracts of the 43rd Annual Meeting of Japanese Society of Laboratory Animal Science. Niigata. 1996. P.348.

3. Rogatcheva M.B. Chromosome variation in the house musk shrew, Suncus murinus. И In: Evolution in the Sorex araneus group: Cytogenetic and molecular aspects. Edited by Fredga K. 1996. Uppsala P. 22.

4. Rogatcheva M.B., Borodin P.M., Oda S.-I., Searle J.B. Robertsonian chromosomal variation in the house musk shrew (Suncus murinus, Insectivora, Soricidae) and the colonisation history of the species. // Genome. 1997. V. 40. P. 18-24.

5. Поляков, A.B., Рогачева, М.Б.,. Бородин П.М. Хромосомная география природных популяций землероек Soreх araneus и Suncus murinus. // Генетика. 1997. Т. 33: 832-838.

• 6. Бородин П.М., Ладыгина Т.Ю., Поляков А.В., Рогачева М.Б. Спаривание хромосом у Робертсоновских гетерозигот у обыкновенной (Sorex araneus) и мускусной (Suncus murinus) землероек. // Доклады Академии Наук. 1997. Т. 352.