Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетические изучение макрохромосом типа ламповых щеток кур Gallus domesticus

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетические изучение макрохромосом типа ламповых щеток кур Gallus domesticus"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЧЕЛЫШЕВА

Людмила Анатольевна

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ МАКРОХРОМОСОМ ТИПА ЛАМПОВЫХ ЩЕТОК КУР GALLUS DOMESTICUS

Специальность: 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1991

Работа выполнена в лаборатории молекулярной цитогенетики Всесоюзного научно-исследовательского института разведения и генетики сельскохозяйственных животных.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор А. Ф. Яковлев.

Научный консультант: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник А. В. Родионов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ю. Б. Бахтин; кандидат биологических наук А. Д. Харазова.

Ведущее учреждение: Институт экспериментальной медицины.

Защита диссертации состоится «¿^ » сия^лёл^,^ 1992 г. в

/¿ час. 00 мин. на заседании Специализированного совета Д.063.57.21 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.15 — «Генетика» при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская набережная, 7/9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета. Автореферат разослан/«2 » м'^со /?1992 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета Л. А. Мамон

1. ВВЕДЕНИЕ

Домашняя курица - наиболее изученный с молекулярно-биологи-ческой, эмбриологической, генетической точки зрения сельскохозяйственный объект. По количеству выделенных, клонированных' и детально охарактеризованных генов домашняя курица относится к ЧИСЛУ наиболее изученных ЖИВОТНЫХ (Stevens, 1986; Somes, 1987). . Эти характеристики домашней курицы в сочетании с быстрой скоростью размножения и большой изменчивостью Фенотипа позволяют рассматривать Gallus domestlcus КЭК ШрсГОКТИВИЫЙ обЬвКТ ДЛЯ генно-инженерных манипуляций."

Один из немногих недостатков пурины как объекта комплексных исследований - недостаточная цэтогенетическая изученность. В кариотипе кур . 78 хромосом, из них, как правило, удается идентифицировать только 5-6 пар наиболее крупных хромосом, называемых макрохромосомами. Термин "макрохромосомы" не долидан вводить в заблуждение: средняя длина наиболее крупных из них в метаФазе не превышает 5-6 мкм. размер некоторых из микрохромосом в метаФазе такой, что они находятся на грани разрешения светового микроскопа. Эти особенности кариотипа кур накладывают жесткие ограничения на перспективы использования цитогенетичес-кого анализа при изучении вопросов эволюции кариотипа (Булатова, 1977; Stock, Bunch, 1982), Мутагенеза (Bloom, 1981), являются основной причиной затруднений, с которыми сталкиваются исследователи, пытаясь картировать гены птиц методами гибридизации ДНК in situ (Tereba, 1963; ТараНТУЛ И др., 1989а), ГИбрОДИ-ЗЭЦИИ соматических клеток (Palmer,- Jone а, 19В6) Й бЛОТ-ГИЙрИДЙ-зации с фракционированными хромосомами (Hughes et al., 1979; Stubbiefield, .Oro, 1982).

Эти затруднения могут быть преодолены при использовании хромосом типа ламповых щеток (ЛШ), выделяемых из ооцитов половозрелых птиц (Кропотова, 1984; Кропотова, Гагинская, 1984). Выделенные из ооцитов, находящихся на стадии превителлогенеза, хромосомы'птиц имеют длину до 400 мкм (хромосома 1 голубя - см.: Хутинаева и др., 1989а,б) и представляют собой богатые деталями цитологические объекты. Однако проведенные в недавнее время исследования ЛЩ „курицы и предпринятые попытки; картировать на

• ■ . 'з

этих хромосомах клонированные последовательности, транскрибируемые В оогенезе (Кропотова, 1984;• Hutchison, 1987; Гагинская, 1989; Тарантул и др., 19896; Родионов и др., 1Э89) показали, что без проведения специальных исследований в превителлогенных ооцитах курицы удается идентифицировать 2-3 аутосомы и половой бивалент.

Пели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось детальное изучение морфологического строения макробивалентоа хромосом типа ЛЩ кур для последующего использования этих хромосом в цитогеяетических и молекулярно-биологических исследованиях.

Это требовало решения следующих задач:

1. Изучить хромосомный набор кур на стадии ламповых щеток. Разработать систему цитологических маркеров, позволяющих идентифицировать возможно большее число хромосом набора, по крайней мере макрохромосомы. Определить координаты этих маркеров и построить на основании этих .данных цитологическую карггу для отдельных хромосом курицу.

2. Использовать хромосомы ЛЩ для картирования клонированной последовательности методом гибридизации нуклеиновых кислот in situ и оценить транскрипцию данной последовательности в ооцитах. •

3. Исследовать частоту возникновения хиазм на хромосомах ЛЩ кур. Определить частоту рекомбинации в макрохромосомах.

4. Оценить генетическое сцепление между морфологическими маркерами хромосомных районов и построить карты соответствующих групп сцеплений.

Научная новизна. В работе впервые идентифицированы все 5 макрааутосом и одна из крупных микроаутосом ■ ЛЩ кур, а также половой бивалент гw. Впервые разработана система цитологических маркеров и построены цитологические карты для этих хромосом.

С использованием метода шЗрвдизации нуклеиновых кислот, in eitu изучено распределение кластеров умеренных повторов семейства Р4В по длине хромосом. Впервые показано, что умеренные повторы геномов кур транскрибируются на стадии ламповых щеток.

Впервые показано, что блоки конститутивного гетерохроматина образуют- теломерные маркерные петли, обогащенные РНП-матриксом, что свидетельствует и транскрипции в оогенезе части ДНК гетерохроматиновых блоков.

Впервые оггре делена частота возникновения хиазм и их

Впервые определена частота возникновения хиазм и т распределение по длине макрохромосом курицы. Показано, что число хиазм линейно зависит от длины хромосом; в микрохрокосс!1зх, как правило, по одной хиазме. Показано, что распределение хиазм по длине хромосом достоверно отличается от равномерного: в субтерминальных районах хромосом обнаружена повышенная частота возникновения хиазм.

Впервые определено генетическое сцепление между маркерными структурами хромосом ЛЩ и построены генетические карты для .этих хромосом.

Практическая значимость работы. Разработанные цитологические и генетические карты макрохромосом ЛЩ кур могут быть использованы для цитологического картирования генов, изучения их транскрипции на стадии оогенеза, а также для выявления хромосомных изменении, происходящих в процессе селекции новых'пород кур.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 3 Болгарской национальной конференции по цитогенетике (Пловдив, 1984), на ii Всесоюзном Симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" (Черноголовка, 1987), на Вторых научных чтениях памяти академика Д.К.Беляева (Новосибирск, 1989), на iii Всесоюзной конференции по генетике и цитологии мейоза (Новосибирск, 1890), на 41 конференции Европейской ассоциации животноводов (Тулуза, 1990), на Международной конференции "Митоз и расхождение хромосом" (Ленинград, 1990).

Объем работы. Диссертация изложена на 128 страницах, состоит из введения, 5 глав, приложения и выводов, содержит 7 таблиц, 3 рисунка, 44 микрофотографии. Список литературы зключдет 226 наименований.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились на курах породы белый леггорн коллекции Экспериментального хозяйства ВНИИРП8 и из коллекции БиНИИ ЛГУ.

Хромосомы ЛЩ выделяли из ооцитов диаметром 0,75-2,75 мм, полученных из яичников половозрелых кур. Препараты получали' методом, исходно разработанным для ЛЦ амфибии (Gail .et. el.. 1983)' и адаптированным для ЛЩ птиц с учетом особенностей объекта (Кропотова, Гагинская, 1984; Hutchison,. 1Э87; Челышевз и др., 1990; Соловей и др., 1990).

красителем РомзновскогогГмлза и Кумасси А250. При выявлении РНП. препараты окрашивали Флуорохромом акридиновым оранжевым по модифицированному методу Риглера (Зеленин, 1977). Для выявления гетерохроматиновых сегментов препараты окрашивали растворами-дистамицина А и хромомицина А3 (Родионов и др., 1989).

МорФометрию проводили по Фотоотпечаткам (увеличение в 1 см - 10 мкм) с помощью курвиметра Ку-А. Определялись- длины осей бивалентов, расстояние от теломерных петель-"бантиков", принятых за начало координат, до маркерных структур и хиазм, при этом длины двойных мостов, представляющих собой растянутые в основании латеральные петли (Callan, 1986) из рассчетов исключались. На основании полученных измерений для каждой хромосомы ЛИ вычислялись ее средняя длина, средние координаты каждой маркерной структуры, координаты хиазм и расстояния между соседними хиазмами.

Для сравнения распределений ■ частот возникновения хиазм и распределении расстояний между хиазмами использовался критерий х2. Для статистической обработки данных использовался критерий х2 и коэффициент корреляции Пирсона (Глотов и др., 1982).

' Определение транскрипции последовательностей, гомологичных умеренному повтору Р48, на стадии ЛЩ проводили по методу Пукила ■ (Pukkila, 1975), используя зонд, содержащий ДНК, меченную 3Н-тимиданом. Зонд был любезно предоставлен сотрудником Института . Молекулярной биологии АН СССР В.3.Тарантулом.•

Были определены средние душны каждой хромосомы ЛЦ и.вычйс-' лены абсолютные координаты маркерных структур, по которым построены цитологические карты (рис.1).

Для построения генетической карты определялось среднее число хиайм между соседними цитологическими маркерами й генетическое расстояние между ними вычислялось по Формуле:

L . . = 50с

где L- генетическое расстояние между 1 и j маркерами в санти-морганвдах (сМ) '.•'..

с- среднее число хиазм между маркерами i и j.

3.'РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1.~ Цитологические карты макроо'ивалентов ЛЦ курицы

Хромосомы ЛИ представляют собой сильно удлиненные тонкий

хромосомы, имеющие многочисленные боковые, петли, которые отходят от составляющих ось хромосомы хромомеров, Помимо основной массы нормальных петель, можно выделить несколько типов маркерных структур, имеющих характерное местоположение и морфологию. Некоторые типы маркерных структур ЛИ кур аналогичны маркерам, описанным ранее на ЛЩ амфибий (см.сапап, 1986), поэтому для унификации обозначений была использована (там. где это возможно) терминология, разработанная для ЛЩ амфибий.

Маркерными структурами, использованными нами для описания хромосом, являлись:

Глыбчатыэ петли (lumpy loops - петли LL-типа по терминологии Кэллана) петли, находящиеся обычно в свернутом состоянии и имеющие вид глыбок неправильной Формы. Среди LL-петель выделяются гигантские ll-готли полового бивалента.

ют на хромосомах ЛЩ амфибии, и будут обозначаться нами как

telomeric bow-like loops - твь-готли. tbl-пвтли обнаруживаются

нба одном из теломеров хромосом и представляют собой крупные петли, обогащенные РНП-матрйксом.

Маркерные петли (marker loope - петли мь-типа по терминологии Кэллзна), - петли, расположенные в интерстициальных районах хромосом и отличающиеся от обычных ("нормальных") петель благодаря своей необычной длине (до 60 мкм). ml-штли особенно легко идентифицируются в ооцитах, где большинство петель га той или иной причине свернуты.

несущие выраженных петель и напоминающие центромерные "валики" (bara) хромосом ЭМФИбИЙ (Callan, 1968). ДЛИНЭ тэких КОНДеНСИрОванных тшей может достигать 10 мкм. Гяж обозначали по двум ограничивающим его петлям -. проксимальной pbl и дистальной dbl петле, • в зависимости от- расположения относительно центра хромосомы.

Перечень выявленных маркеров для каждой хромосомы представлен в таблице 1. На основании результатов морФометрических данных были вычислены нормированные средние координаты маркеров (длина хромосомы принята за 1) (табл.1).

На основании нормированных координат маркеров были

построены цитологические карты макробивалентов ЛЩ кур, учитывающие средние длины хромосом (рис.1). Анализ структуры хромосом ЛЩ

-эти маркерные петли отсутству-

- кластеры хромомеров, не

показал, что каждая макробивалент несет, по крайней мере, один

беспетлевой участок. по морфологии близкий пврицэнтрическим

Таблица i

Координаты маркеров макробивалантов курицы

Число Число бивалентов , ■ _Координаты

Бивалент исследов- Маркер у которых был Х+ SX

■ дав. Си- идентифицирован

. валентов маркер

А 25 TBL 11 .25 0

ML11 15 0,217+0,048

ML12 11 0,255+0,070

DBLU ' 15 0,370+0,063

PBL11 ; 24 0,439+0,0^1

МПЗ 16 0,485+0,020

ML14 20 ' 0,524+0,019

PBL12 ' 24 0,580+0,005

DBL12 '25 0,636+0,004

ML15 11 0,715+0,031

PBL13 19 ■ 0,893+0,029

DBL13 22 0,952+0,025

Т12 . .25 1

В 23 ■ TBL21 0

LL21 • 22 . '0,042+0,003

DBL21 ' ' . 16 0,110+0,014

PBL21 .16 ' 0,175+0,023

ML21 __ 0,291+0,041

ML22 ' 16 0,586+0,073

PBL22 22 0,602+0,016

DBL22 22 0,666+0,010

. ML23 . 3 ■ 0,706+0,105

, ML24 10 0,809+0,055

LL22 • 20 0,902+0,025

Г22 : 23 ■ ■ 1

С 15 TBL31 15 ' 0

ML31 10 ' 0,026+0,007

8.

МЬ32 • ' 9 0,168+0,046

1 мьзз 15 0,579+0,084

ЬЬ31 14 0,746+0,016

РВЬ31 Э 0,905+0,047

Т32 15 1

Ю 16 ТВЬ41 15 0

МЬ41 В • 0,297+0,107

МЬ42 13 • 0,439+0,042

РВЬ41 ■ 13 0,674+0,025

ЮВЬ41 13 0,816+0,030

Т42 15 1

Е 10 0X31,61 10 0

№,61 9 0,307+0,038

МЬ62 6 0,495+0,029

РВЬ61 9 0,900+0,046

Т62 10 1

К' 7 та1,81 7 0

рв[м1 "7 0,494+0,023

бвш 7 0,719+0,019

Т61 7 1

ги 19 твьг1 19 0

мьг1 . 13 0,153+0,031

РВЬ21 14 0,470+0,068

овьг1 14 0,567+0,083

МЬ22 15 • 0,945+0,094

19 1

осевым тяжам амФибий. На хромосоме А - три таких района, на хромосоме В -2, на с,р,Е,р-бивалентах по одному. Сопоставление координат этих районов с центромерными индексами (ЦП) миготических хромосом (Эрматов, 1983) и с ЦИ, определенными'для синаптонемных комплексов (НаИп, Бо1аг1, 1986). показало, что единственный беспетлевой тяж бивалентов с,о,е',р располагается там же, где судя по ЦИ должны располагаться соответственно центромеры хромосом 3,4,5,8 кариотипа кур. На хромосомах А и В с

40,2 17,2

70,0

81.0 90,0 97,4

407,,3

m.o

155,2 '176,1

/85,0

¿>hl11 <=>ml12

,dbl11

p&l11 ^o ml13 ml14

9 pbl12 dbl12

,p6¿13 fto oai 15

t12

a

32,0 47,0

72,0 87,0

щ0

tbl41

„о м-ч1 ti 14 2

z> pbl 41

d&l41 t4¿

6,5

16,6 24,4

0 ^ tbl21

&ll21

ш21 PBL 21

44,0

89,0 91,0 10Í0 1¿2,0

■136,0 ¡40,0 i 155,0

HLli

rfl¿2

pbl 22 obl22 > ml23

o HL2.4 LL¿2 T22.

22,1 35,3

62,9 750

В

& tgl51

|o hl51 io hl 52

pbl 51 » t5¿

3,0 22,0

у40

960

116,0

o _ 7шы

/1l31 \a> hl32

hl 33

ll 31

pbl31

/за d т 32.

о t8l 1й/

.9,8 о ml zm

22,0 о fllzwk

3 0,1 э pbll&x

39,0 » dblz.w1

50,3 а ml w3

60,5 о Щ zu''Ч gllxm

0 tblf1

'/9,1 26.2

40,0

pblf1 ípbl m

tP

ghlf1

Рис.1. Цитологические карты макробивалентов a-e. Расшифровку обозначений маркеров см.в тексте. Значения координат маркёров даны в миркронах

о

.предполагаемым расположением центромера совпадало положение наиболее отчетливого беспетлевого участка: для бивалента а - pbl 12-dbl12 и для бивалента в - pbl22-dbl22. Можно предположить, ччто Форму беспетлевого тяжа на стадии ЛЩ принимают блоки прицентромерного гетерохроматина.

■ Как видно из таблицы 1, погрешности определения координат маркеров достаточно велики и могут отличаться для разных маркеров. Так как в качестве маркеров были выбраны-характерные цитологические структуры, резко отличавшиеся от соседних своей морфологией и сохраняющие свое относительное местоположение на хромосоме, наиболее вероятной причиной, вызывающей большой разброс координат выбранных маркеров, является нарушение структуры хромосомы при приготовлении препаратов. Вероятно, на хромосомах ЛЩ существуют районы с разной степенью жесткости хромосомной оси, что влечет за собой неравномерное и случайное расстягивание или сжатие оси при центрифугировании хромосом. Поэтому, для уменьшения ошибки определения координат хиазм учитывалось их местоположение относительно средних координат двух ближайших маркеров.

•. 3.2. Закономерности распределения хиазм на хромосомах'ЛЩ кур

Хромосомы ЛЩ, являясь. мейотичеш<ими, представляют собой диплотенные биваленты, которые перекрещиваются в точках хиазм. На • окрашенных рутинным методом хромосомах ЛЩ за хиазму принимался такой перекрест гомологов, при котором в зонах,прилежащих к хиазме, сохранялась симметрия расположения хромомеров и петель на обоих гомологах относительно редукционной щели. Для макробивалентов А-f были определены максимальное, минимальное и среднее число встречающихся хиазм (табл.2)

Как видно из таблицы 2, количество хиазм на определенном биваленте варьирует от препарата к препарату,' однако среднее количество хиазм на биваленте пропорционально длине хромосомы (коэффициент корреляции. равный 0,983 статистически значим при ?0 = 0,001). Сравнение показывает, что число хиазм на макробивалентах в диплотене соответствует числу узелков рекомбинации в ■пахитене. (Rahn, Soiari, 1986)'. Сравнение среднего числа хиазм на ПЯТИ макробивалентах, В сперматогенезе (Pollock, Pechhaimer 1978) и оогенезе курицы (наши данные) не выявило значительных . различий этих величин, т.е. частота рекомбинации в оогенезе и .'

сперматогенезе Gall.ua с!отевЪ1сив, вероятно, одинакова.

Таблица 2

Частота хиазм на макробивалентах - ламповых щэтках курицы

гпяпняя плиня Количество хиазм Среднее коли Макробивалент ьредняя длина, --чество хиазм

. min шах на хромосому

А 185 . 5 9 7,3 ± 0,20

В 151 4 8 5,5 ± 0,23

С 128 4' 6 4,7 ± 0,18

• ' D ■ 107,2 . 3 6 4,7 ± 0,18

Е 71,9. 2 4 2,4 + 0,28

F 36,5 2 , 2 2,0 ±

Одновременно определяли' распределение хиазм по длине макро, бивалентов (рис.2). Анализ этах распределений показал, что полученные распределения достоверно отличаются от равномерного .случайного распределения ( х2цд)= 96,75). Из данных, представленных на рисунке 2, видно, что хиазмы наиболее часто возни. кают около теломеров хромосом. Аналогичные распределения были получены для, рекомбинационных нодул на синапгонемных комплексах в оогенезе кур (Rahn, Soiari, 1986). Совпадение распределений рекомбинационных нодул и хиазм в оогенезе курицы подтверждает преемственность этих явлений в. мейозе, что позволяет связывать положение хиазм на хромосомах ЛЩ с местами осуществления крос-синговера на более ранних стадиях мейозз.

С целью более детального исследования закономерностей возникновения хиазм на хромосомах ЛЦ были определены расстояния между соседними хиазмами на каждой макрохромосоме. Соответствующие данные представлены в таблице 3. Как следует из таблицы, для каждой хромосомы существуют минимальное, соответствующее области полной интерференции (не менее 5 мкм) и максимальное (не более 65% длины хромосомы) расстояния, на которые могут быть удалены соседние хиазмы. Независимо от длины хромосомы, расстояния, соответствующие модальному классу, примерно одинаковы в разных хромосомах и составляют 25-30 мкм.

Распределение расстояний для первых трех хромосом (до?" которых выборка достаточно представительна) были также сравнены

Таблица 3

Минимальное, максимальное и модальное расстояния между соседними хиазмами на бивалентах а-и

Расстояние

Минимальное Максимальное соответст-

' Хромосома расстояние. расстояние, вующее мо-

мкм мкм дальному

классу, мкм

А 5 80 25-30

в 5 95 20-25

с 5 65 30-35

в 5 65 20-25

Е 15 55 .15-20,30-35

Р 10 30 20-25

между собой при помощи критерия однородности. Сравнение показало, что достоверных различий между распределениями расстояний на первых трех хромосомах не существует. Рассчитанный *"=16,112, табличный х2=21,00. Это позволяет предположить, что существуют общие для всех хромосом закономерности распределения хиазм гю .длине хромосом, не зависящие от конфигурации хромосом, на.стадга ЛЩ. •

3.3. Построение генетических карт

Существование связи между местами осуществления кроссинго-.вера и положением хиазм на хромосомах позволяет составить генетические карты цитологических маркеров и сравнить генетические и цитологические расстояния между отдельными маркерами (Нидлеп, 1974; Горлов и др., 1987). Генетические карты представлены на' рисунке 3.

На' хромосомах ЛЩ курицы существуют районы с повышенной частотой возникновения хиазм <рис.2). Поскольку расстояния на генетической карте зависят от плотности рекомбинационных обменов, . цитологические и . генетические карты для этих районов значительно отличаются. Особенно с.юдует отметить теломерныя хромдмер 112 на хромосоме А. На Физической карте он представляет собой точку - конец хромосомы (рис.1). Но частота обменов в этом районе такова, что на генетической карт« он занимает 11Ж ее-длины. В то время как районы предполагаемого расположении центромеры на генетической карте короче (рис.3).

макробивалент А

__ ив ■■ ■ ■

»■па нп ■ с

•■■<■ кип и ■

■■■■ ■■■■■■■■

макробивалент в

в в в

п я в

■а в в в в

■ЯК «ВИИ ВЕЭ явяяяшпнн

пп нпгтнпппм

ИРЯЯМНГШППИВ

I I I I I

I I

макробивалент с

в ■

■■■

■ ■в

URB

мппв вяввв

вв пв ■ в

макробивалент D

в ■

■

и япя

впи

ИНН

RH« МВИЯРНПа

н к и w и w и ■иыпм^и

ЙЦВЯИПЙ ИДНМИИМ ННРКИЧК

ваввввв

в в

в я

I I

макробивалент Е

в

■

■

а

■в и

вв п

вв И

пп □

аа □

сю П

■ в я

вя MB S3

ня RH

ив ин

ня ИИ

ПН ПИ

пв ИЯ

вв са

ПН пп ■

пи ИВ .

ия пп

вя Na

■в ■в

макробивалент F

Рис.2. Распределение 480.хиазм по 6 макробивалентам ■ По оси абсцисс - частота хиазм; по оси ординат - расстояние в микронах

Построенные генетические карты могут служить для локализации на цитологических картах хромосом генов из определенных методом генетического анализа групп сцеплений.

3.4. Транскрипция повторяющихся последовательностей ДНК на стадии ЛЩ в оогенезе курицы

На одном из теломеров макробивалентов A-F и на обоих тело-' мерах zw Формируются специфические петли-"бантики" (маркер TBL на рис.1). ■ После окрашивания ■Гц-специфическим. красителем хромомициюм А3 хромомеры, лежащие в ■ основании этих петель, светятся ярче, чем после окрашивания АТ-специФичным Хехстом. 33258. Это позволяет предположить, что они сформированы блоками

о töl 11

96 104

146 160 16в 172

i9г. 200. 228

гэг

3 20 362.

ml 11 ml-12

p3l11 dbl11 ml /3 ml 14

d8l12 pbl12 mlj5

pbl-is

ы2. dbl15

67 87

120 133

180 190

ti2

ti2* tbl 41

. ml 41 ml 42

. pbl 41 oat 41

'. t42 •t42'

о tbl21 о tbl 31

41. ll21 47 ml 31

56. dbl21 64 . ml 32

76 pbl21

106. . ml21

127. ml 33

165 . pbl22 167 . ll31

172 obl 22 . 187. pbl31

18ъ hl23 .

sos. ml 24

226. ll22 2 30 t52

236 г 32'

276 т22

278 Т22*

о tbl 51 о , tbl h

50 ml 51. , 50 pölf1

65. ml 52 71. üb lh

• 100. :qt1lf1

120 pbl51

125. t52

Рис.3. Генетические карты макробивалентов a-f Координаты маркеров даны в-морганидах

теломерпого С-гетерохроматша, что соответствует данным о локализации С-гетерохроматина на митотических хромосомах (Pollock, Fochheimer, 1981). Окрашивание акридиновым оранжевым показывает, что теломерные петли покрыты большим количеством РНП. На препаратах эти петли Флуоресцируют в красной области спектра, в то время как хромомеры - в зеленом. Это свидетельствует о транскрипции части ДНК гетерохроматиновых блоков • на данной стадии оогенеза у кур.

Была проведена гибридизация in situ хромосом Щ с кластером умеренных консервативных повторов птиц,Р48. Условия гибридизации были подобраны таким образом, чтобы ДНК зонда гибрвдизовалась с ' РНК трнанскриптами хромосом Щ'. Показано, что кластер умеренных повторов Р48 локализуется по длине хромосом на латеральных петлях, являющихся зонами активной транскрипции на ЛЩ, а также в хромомерах. В последнем случае гибридизация происходит вероятно, С микропетлями, описанными Анжелье С соавт. (Angelier et al., 1986). В контрольном эксперименте с хромосомами, обработанными РНК-азоа, реакция гибридизации не происходит.

■ВЫВОДЫ

1. Выявлены и описаны цитологические маркеры, позволяющие идентифицировать пять макробивалентов а-е, один микробивалент•f и половой бивалент zw типа ламповых щеток кур. В качестве маркеров использовались глыбчатые петли, длинные нормальные петли и тяжи конденсированных .хромомеров, резко отличающиеся от

.соседних структур своей морфологией и сохраняющие свое относительное местоположение на хромосоме. Для этих маркеров определены координаты, на основании которых для хромосом a-f и zw построены цитологические карты высокого разрешения.

2. С помощью метода дифференциального окрашивания хромосом показано, что теломерные петли-"бантики" образованы блоками конститутивного гетерохроматина. Обнаружено обогащение этих датель РНП-матриксом, что свидетельствует о транскрипции в оогопезо кур по. крайней мере части ДНК гетерохроматиновых блоков. . ■

3. С помощью метода гибридизации нуклеиновых кислот in. situ измучено распределение кластеров умеренных повторов семейства Р48 по длине хромосом ЛЩ курицы. Показано, что умеренные повторы-равномерно распределены по всей длине хромосомы и обнаружены Há всех изученных бивалентах. Обнаружена транскрипция этих повторов

: на стадии ламповых щеток.

а 4. Определены частоты встречаемости и распределения хиазм по даже макробивалентов. Показано, что среднее количество хиазм 4 на каждом из пяти макробивалентов прямо пропорционально длине бивалента (г=0,983>. Показано, что распределение хиазм по длине макробивалентов является неравномерным: в теломерных районах обнаружена повышенная частота встречаемости хиазм.

5. Определены расстояния между соседними хиазмами для бивалентов a-f. Показано, что независимо от длины хромосомы среднее расстояние, между хиазмами • составляет 25-30 мкм, минимальное расстояние между хиазмами (область полной интерференции) - 5 мкм.

6. Оценено генетическое сцепление между цитологическими маркерами хромосомных районов, построены карты соответствующих групп сцепления. Показано, что теломерные районы хромосом представлены значительными'расстояниями на генетических картах.

СПИСОК РДБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ НО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ '

1. Rodionov A.V., Dukelskeya A.V., Chelysheva L.A.. et al. Molecular heterogenety of the domestic fowl (Gallus Dornest icua) heterochromatin // 3 Natl Conf on Cytogenetics. - Plovdiv, 1934. - p.138-141. .

2. Дукельская A.B., Челышева Л.А., Родионов A.B., Смирнов А.Ф. Характеристика интерфазного гетерохроматина у кур, его онтогенетическая и межлинейная изменчивость // Еюл.ВНИИРГЖ. -

.1886, -Вып.89. - С.34-38.

3. Родионов A.B., Козикова Л.В., .Челышева Л.А., Раудесапп Т., Нуммик Т., ¡Эрматов Ю.А. Изменчивость карнотитов сельскохо-

1 зяйствейных птиц. - В кн.: Цитогенетика и молекулярная генетика с.-х. животных. - Л., ВАСХНИЛ, 3987. - С.63-73. '

4. Кропотова Е.В., Челышева Л.А., Родионов A.B., Гапшская , Е.Р. .Моррофункциональная организация хромосом ламповых щеток

курицы // XI Всес.сшп. "Структура и функция клеточного ядра". -Черноголовка: Наука, i9ö7. - С.22.

5. Родионов A.B., Челышева Л.А., Кропотова Е.В., Гагинская .. Е.Р. Гетерохроматиновые районы хромосом курицы и ' японскогд-' перепела'в митозе и на стадии ламповых щеток // Цитология. 1989. -Т.31. N8. - С.867-873.

6. Тарантул В.З., Гольцов В.А.. Родионов A.B., Челышева Л.А., Хутинаева M.Â., Гагинская Е.Р., Газэрян К.Г. Молекулярный и цитологический анализ кластеров умеренных повторов геномов ПТИЦ //Молвк.биол. - 1089. - Т.23, N2. - C.48J.-490.

7. Тарантул В.З.,. Родионов A.B., Макарова И.В., Гольцов

B.А., Челышева Л.А., Хутинаева М.А., Гагинская Е.Р., Газарян К. Г. Молекулярный и цитологический анализ транскрипции эволюционно консервативных умеренно повторяющихся последовательностей геномов позвоночных // Цитология. - 1989. - Т.31, N6. -

C.619-625. ' .

. 8. Челышева Л.А., Соловей И.В., Родионов A.B., Яковлев " А.Ф., Гагинская Е.Р. Цитологические карты хромосом ламповых щеток кур сверхвысокого разрешения. - В кн.: Вторые . научные чтения памяти академика . Д.К.Беляева. '- Новосибирск. 1989. -С.119. i

9. Гагинская Е.Р., Хутийаева М.Аб, Челышева Л.А., Родионов , A.B. Изучение транскрипционной активности хромосом ламповых.

шрток птиц методом гибридизации in situ// vu Всес.симп. "Молекулярные механизмы, генетических процэссов. - М. , 1990. -С.13. . '•

10. Родионов A.B., Челышева Л.А., Соловей И.В. Цитологический анализ процессов мейотической рекомбинации у кур. Карты генетического сцепления маркерных петель // vu Всес. симп. "Молекулярные механизмы генетических процэссов". - М., 1990. - С.50-51.

11. Челышева Л.А., Родионов A.B., Соловей И.В.', Гагинская Е.Р., Яковлев А.ф. Хромосомы - ламповые. щетки курицы. Цитологические карты макробивалентов // Цитология. - 1990. - Т.31, N4. -С.303-316.

12. Челышева' Л. А., .Соловей И.В.Родионов A.B. Закономерности возникновения соседних хиазм на хромосомах -ламповых щетках кур // Известия СО АН СССР, - Сер.Биологические. науки. - 1990. -Вып.2. - С.14.

13. Chelysheva L.A. , Solovey I.V., Rodionov A. V. Yakovlev A.F., Gaginskaya E.R. The lampbrush chromosomes of Gallus doinesticuB // The 41th Annual Meeting of Animal Production. -Toulouse, 1990. - P.348.