Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитофлуорометрия в потоке при изучении механизмов патогенетических процессов в биологических тканях и при получении новых линий клеток

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Цитофлуорометрия в потоке при изучении механизмов патогенетических процессов в биологических тканях и при получении новых линий клеток"

У 9 0

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ии. Л. В. ЛОМОНОСОВА

ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Рудченко Сергей Андреевич

УДК 576.8.097.29

ЦИТОФЛУОРОМЕТРИЯ В ПОТОКЕ ПРИ ИЗУЧЕНИИ МЕХАНИЗМОВ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ И ПРИ ПОЛУЧЕНИИ НОВЫХ ЛИНИЙ КЛЕТОК

03.00.02 — Биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

/ , Москва - 1990

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной кардиологии - Всесоюзного кардиологического научного центра Академии наук СССР

Научный руководитель: доктор физико-математических

наук, профессор Э. К. Рууге

Официальные оппоненты: доктор физико-математических

наук, В. А. Печатников

кандидат физико-математических наук, с.н.с. А. И. Полетаев

Ведущая организация: Ленинградский институт ядерной

физики АН СССР

Защита диссертации состоится и ЗУ « 1чопг

в_£е_часов на заседании специализированного совета №3

отделения физики твердого тела (К 053.05.77) в МГУ им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, ГСП, ские горы, МГУ, физический факультет, аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова

Автореферат разослан И.*:--Т 1990 года.

Ученый секретарь

специализированного совета, №3 ОФТТ, кандидат физико-матемауически^наук

Т. М. Козлова

■ •• _! ВВЕДЕНИЕ

т;В;,растоящее время известно, что ответы клеток на воздействие 'ртгш',;: ä

«юядгичвскя активных соединений, • как правило, гетерогенны по >им проявлениям. Выявление закономерностей такой гетерогенности ¡дставляется важным при решении ¡се" фундаментальных, так и 1кладных задач медицинской биофизики, а также при изучении механизмов течения различных патологических процессов в органкз-

Для успешного решения подобных задач на современном этапе пользуются метода автоматизированной цитологии [Goettlor and ihr, 1982], основанные на современных достижениях физики, хи-1, математики и электронно-вычислительной техники. Основными зимуществами данных методов исследования являются: во-первых, лучение количественных результатов анализа отдельных клеток, э собственно и позволяет проводить исследования на леоднородных эточных популяциях; во-вторых, возможность использования не-пьшого количества клеточного материала, необходимого для полу-аия достоверных результатов; в-третьих, высокая скорость провеши анализа. Развитие методов автоматизированной цитологии в яьшой степени было стимулировано успехами в синтезе сяецифиче-!'Х флуоресцентных зондов и изучением молекулярных механизмов эимодейстгия их с различными структурами клетки. Измеряя флуо-зценцию, исследователь не только имеет возможность выявить ни-чие и определить количество флуоресцирующего соединения, ко, з часто бывает еще важнее, оценить состояние данного вещества, впень его агрегации, свойства непосредственного окружения, лючая полярность и упорядоченность среды, наличие поблизости рядов и молекул-акцепторов энергии электронного возбуждения.

Одним из наиболее разлигых методов автоматизированной цитоло-

гии является катод цитометрии в потоке, с помощью которого ыоя не только проводить снализ, ко и физически разделять клетки, пр надлежащие к различным клеточным популяциям На сегодня цитоме рия в потоке является адекватным методом как при изучении механ зыов функционирования клеток, так и для проведения исследований медицине. ' Однако, для успешного решения методом цитометрии в п токе различных задач наряду с использованием традиционных прием проведения анализа подчас необходима разработка новых магодич ских подходов.

Целью диссертационной работы было развитие методов цитометр в потоке для решения конкретных задач биологии и медицины, име щих существенное фундаментальное и прикладное значение. Таки задачами стали:

1)определение распределения клеток периферической крови чел века по содержанию свободного внутриклеточного кальция в норме у больных бронхиальной астмой;

2) определение характеристик бета-адренорецепторного аппара клеток лкмфоидного происхождения; •

3) изучение сезонных изменений пролиферативной активное клеток зимоспящих млекопитающих;

4) селекция клеток, продуцентов бифункциональных монокл< нальных антител.

Баунназ аавиаш и пвакзизаАкэя анаыииамь $айяш- Применен] метода цитометрии в потоке позволило получить новые научные прикладные результаты при изучении целого ряда ыедико-биологкч« ских систем:

I. При изучении молекулярных и клеточных механизмов патоге» за бронхиальной астмы показано, что: (а) у больных бронхиальн'

астмой увгличена доля лейкоцитов периферической кропи с высокой концентрацией свободного внутриклеточного кальция по сравнению со здоровыми пациентами; использование экстракорпоральной терапии приводит к снижению количества клеток с повышенной концентрацией кальНия; (б) бронхиальная гиперрэяктивнооть при бронхиальной астме сопровождается уменьшением бега-адрэнергической чувствительности макрофагов бронхоальвэолярного смыва.

11. Изучена пролиферативная активность эпителия тонкой кишки суслика в течение года, что позволило сделать выводы о сезонных изменениях ряда метаболических процессов у эимоептцих животных.

tli. Разработан эффективный метод двойной сортировки гибридных клеток, получаемых слиянием клеток партнерских линий. Получе-1а линия клеток, продуцирующих бифункциональные мо но клона ль ныв антитела к липопротеид, и низкой плотности плазмы крови человека и иелочноР фосфзтазе.

¿про б вниз psSQlfe! и публикации,. Результаты работы доложены на v Всесоюзном совещании по проточной цитометрии (Ленинград, 1985 Пленуме Нэучнсго Совета по проблемам фтизиатрии и пуль»оно-югии "Диагностический бронхезльвеолярный 1аваж" (Москва, 1987 '.), Международной конференции "Интерферон и биотехнология" (Га->ана, Куба, 1989 Р.)» ежегодном Сьвзде научного гистохимического бшества США (Онтарио, СМ, 1989 f.),. заседаний кафедры внутренние болезней педиатрического факультета П~го МОЛГМИ им. Пирого-э, '««лабораторном семинаре Института экспериментальной гсардио-огии ВКНИ АМН СССР.

1Млякашт_ По материалам диссертации опубликовано 6 работ. Структура И ейьаи райат. Дгссертащюннад работа состоит из ведения, трех чаете!!, заключения, выводов и списка используемой

литературу, включающего ft"* наименований. Работа наложена на /л страницах машинописного текста, содержитUJтаблицы и to рнсунко; I. ФИЗИЧЕСКИЕ И МАТЕМАТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТОДА ШГГОЦЕТРИИ В П0Т01

Анализ параметров флуоресценции и сортировку клеток провод ли с помощью поточного цитофлуорныетра FACS—II (becton-pi ckiiisoi . США). Для возбуждения флуоресценции ФИТИа, ТРНТЦа и иодида проп: дня использовали линию 488 ни (мощность 400 мВт), ыитромццина 457 ни (мощность 100 мВт) аргонового ионного лазера модели I64-' (Spectra-Physics, США). Флуоресценцию Н342 и Quinвчэбуада ультрафиолетовыми линиями (35Г. I нм и 363.8 ни) с общей мсщнсст 200 иВт аргонового ионного лазера модели J7I-I9 (spectrd-Physjс США). Для регистрации флуоресценции использовали штерференцио ние фильтры (oj trie Optics, США): BP 520 - дал ФИТЦа, LP 58С для ТРИТЦа, бромида эти для и иодида пропидия, BP 460 - для Н342 BP 500 - для Qui п-2. Для сортировки клеток использовали сопло диаметром отверстия 70 икы, а анализа - 100 ыки Скорость анал11 и сортировки клеток составляла от 700 до 1000 клеток в секувд Математическую обработку получаемых результатов проводили на пр грамлруеыоы анализаторе сигналов 1 ы-1X0 (Intertschuiqu«, Франца состыкованной с поточным цитофлуориметрои.

Феноменологическое описание процесса взаимодействия издан флуорохроиа с клаткаыа. Понимание процессов, происходящих г формировании частотного распределения г.леток по интенсивное флуоресценции при измерении ыетодоы цитометрии в потоке, необз диш для корректного математического анализа. Для этого рассыс рим кинетику взаимодействнг шлакуя флуорохрош с клетками, им щимн n специфических мост связывания для нолгчул красителя. Пр» положим, что связывание молекул флуорс хрома происходит по и

ганд-рецепторного взаимодействия

з I - молекула лигакда (флуорохрома), - молекула рецептора эсто специфического связывания красителя на клетка), 1Я - ли-эд-рецептсрный комплекс, К+ и К. - гонстанты скоростей прямой и эатной реакции (отношение К_/К^=КД - константа диссоциации). •1более часто встречается на практике случай, когда количество яекул лиганда (или флуорохрома) з единице объема ([I]) много льшэ, чем количество их мест связывания на клетках. В этом слу-; скорость образования клеток, связавших к молекул лиганда 1И флуорохрома) в единице объема будет описываться системой эвнений

з С - концентрация клеток, уже несущих 1 молекул лиганда (О^Ю, ¡гчно, измерения проводят в момент, когда система находится в :тоякии динамического равновесия при котором скорость

зазования кошлекса будет равна скорости его распада лом случае анализ системы дифференциальных уравнений (2) пг>-;ляет вычислить помэкгы частотного распределения клтток по ко-теству молекул связанного лиганда.

Для исследование вида частотного распределен; т клеток по ко-кству молекул связанного л*танда представляю!' интерес центр определения (среднее количество молекул лиганда, связанного с :ТкоЗ, имеющей N мест связывания), дисперсия распределения и

коэффициенты вариации, лсшметрии и эксцесса, которые, соответсг венно, определяются выражениями

" Ш-л/

<к> ^к,сь * мт^ (з

* .....К

Ш)

к

(4

л «1<-<ыа> из-кд

А*с -----Е (6

6 УОД'ЛЛКд.

<(к-<Ь£> Е> --¿ч--з = о

(7:

Б проводимых измерениях величина Кд/1л] обычно изменяется I диапазоне от 0,1 до 10, а количество специфических мест связыва

о

ния для молекул флуорохрома на клетке N не менее 10' . В этом случае значение коэффициента асимметрии стремится к нулю. Равенстве нулю коэффициентовасииметрии и эксцесса говорит о том, что получаемые частотные распределения клеток являются нормальными (гауссовыми). Следует заметить, что выражение (3) аналогично классическому уравнению Михеэлиса-Менген.

При необратимом (например, ковалентном) связывании молекул флуорохрома с клеткой система уравнений (2) упрощается и приобретает вид

(8)

- и .1 i i. i i а! _ i/ л. 1 г . а •• i т

Решение системы (6) можно получить в аналитическом виде. В это! случае количество клеток в единице объема, несущих к молекул флуорохрома, определяется выражением

^етим, что выражение (9) представляет собой бшкминальное рас-эделение, которое в большинстве представляющих интерес зкспери-зталъных случаях ^ более 1(Я) переходит в нормальное распределив

((/\ |< А/. {< I С С к - А/р")2" 7

Таким образов анализ частотных распределений клеток, полу-змых методом цитофлуорометрии в потоке при взаимодействии мола-л флуорохрома с клетками в соответствии с рассматриваемымиыоде-т показывает: (I) получаемые частотные распределения являются /ссовыми; (2) коэффициент вариации распределения зависит от ко-■тества специфических мест связывания молекул флуорохрома на зтке (обратно пропорционален квадратному корню и). Приведенный элиз позволил нам создать пакет програш для математической об-5отки получаемых частотных распределений. Методы обработки одношрных гистограмм при анализе ктоточко-цихла. Для знали:а частотных распределений кл-ток по количе-зу ДНК наш были созданы пакеты програш на основе предложенной лели специфического взаимодействия флуорохроков с ДНК и алго-гыов, ог'лсанных ранее в литературе [Печатников, 1936;. Така->Ь1, 1981]. В основе реализованных алгоритмов заложены следуй 5 предположения:

Деление и рост клеток происходят асинхронно. Клетки с диплоидным и тетраплоидным наборам! ДНК (находящиеся 50+с1 л клеточного цикла, соответствен-:/ имеют рас-

селения ДНК, описывающиеся В -фу-.кгптвй Дкргг.э.

Распределение клеток., имеющих количество ДНК бо„т:ео диплоидною

и менее тетрапловдкого набора ДНК (находящихся в 5-фазе клаточно го цикла) монотонно и мозге т быть разбито на дискретные облает (диапазоны), в которых находятся клетки с одинаковым количество ДНК.

0. В каждой области величине количества ДНК на клетку приевчива ется значение (в относительных единицах), равное соответствующей номеру канала в анализируемой гистограмме.

Е. Значения интенсивности флуоресценции, измеренные от клеток одинаковым количеством ДНК, имеют нормальное распределение с средник значением, пропорциональным количеству ДНК в клетке (выра женив (3)).

Р. Коэффициент вариации частотного распределения значений инте* сивности флуоресценции клеток, с одинаковым количеством ДНК обрат ко пропорционален квадратному корню количества ДНК в клетках соответствии с выражением (5).

е. Часть клеток, которые находятся в 5-фазе клеточного цикла имеют количество ДНК, мало отличающееся от диплоидного набора при разбиении на дискретные области погздат в диапазон, соответ ствукщий клеткам, находящимся в бц+С2-фазе.

Предположение асинхрончости роста и деления клеток означает что количество клеток, ' имеющих диплоидный набор ДНК, т. е. нахс дявдхся в с^-фазе клеточного цикла или состоянии покоя (бд-фаза) значительно превышает количество клеток в любых других диапазс ках, соответствующих Б и йз+м-фазам. в реализованных программа не учитывается возможный биологический разброс количества ДМ соответствующего й2-фазе клеточного цикла.

Цельк машинного анализа является воссоздание частотного рас пределения клеток по количеству ДНК а(0 на основании частотно]

«определения клеток (гистограммы) по интенсивности флуоресценции (О, которое теоретически представляет собой сзертку распределе-шя с|(1) и фуь.сции нормального распределения с дгсперсией, обу-:ловленной условиями эксперимента и удовлетворявшей предположению ,?). На основании воссозданного ДНК-распределения производится юдсчвт доли клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла, что наиболее ч^сто необходимо для обработки результатов биологических и медицинских исследований.

В качестве первого юга для решгтия поставленной задачи производится первоначальная оценка коэффициента вариации нормального распределения клеток, имеющих диплоидный набор ДНК, по экспериментальной гистограмме по формуле, .;редлокенной Еинделовым [ VI п — ^ 19771 _

где ~ полная сирина пика, соответствующего диплоидному набору ДНК и определенная на уровне, равном половине максимального значения, а шд- — номер какала, соответствующего максимальному, значению пика. )\а основании первоначально оцененного значения коэффициента вариации (су^) и номеров каналов и ш2, соответствующих максимумам пиков диплоидного и тетраплоидного количества ДНК строится частотное распределение клеток по количеству ДНК которое

на первом этапе берется соответствует»! экспериментальному ча-стотиому распределению в области, ограниченной каналами П| и т2. Значения и <30(т<;>) принимаются равными суммам влево

от шд- и вправо т2, соответственно. На оснопния полученного распределения синтезируется "зстотное распределение клеток по интенсивности флуоресценции ^дО) с ранее оцененниьмпараметраки. Для количественной оценки отклонения синтезированного частотного

распре -'.едачия от экспериментально полученной гистограммы г (1) использовали параметр, определяемый выражением

* 1« Сл

1\де 1 £ и 12 - номера каналов, соответствующие нижней и верхней границе области, берущейся в рассмотрение. Далее производили изменение первоначально полученного распределения по ДНК и оцененных ранээ параметров с последующим построением частотного распределения я сравнения их с экспериментальной гистограммой по интенсивности флуоресценции с целью минимизации величины Д по процедурам, опксаным ниже.

Из соответствуещего распределения клеток по ДНК (¡О) (т^^и^ строится гистограмма 1^(0 суммированием вкладов нормально распределенных величин л)

Величина рС'> Л» СV^) является вероятностью того, что клетка с количеством ДНК равным ^ будет иметь интенсивность флуоресценции, определяемую в канале !. Поскольку ширина канала соизмерима с величинами можно записать

0 и о,С

* о '-0.Г

Существуют три группы параметров, которые определяют .вид рас-

сч^тьзаемого распределения по интенсивности флуоресценции и, соответственно, корректируются. Во-первых, производится ко.оэк-ция вида распределения клеток по количеству ДНК ¿„(О на п+1 шаге в соответствии с выражением <*п+хО)=<1Г10 )1')„О )3. дяя и1^2. Однако, следует заметить, что в диапазон, соответствующий клеткам с диплоидным набором ДНК, пог.адат к..етки, чаходящиа-

я в s-фазе клеточного цикла и мякшие количество ДНК, мало отли-:ающееся от диплоидного наборе, и количество которых теоретически «предсказуемо. Тем не менее, исходя из монотонности распределяя клеток по ДНК, эту величину можно рассчитать на основании начений величин соседних диапазонов (d(mj+I) и d(mj+2)). Остаток .леток в этом случае будет соответсвовать количеству клеток,находящихся в 5q- и gj-фазах клеточного цикла Gj=d(mj)-[2' d(т^т!)-•dUj+2)]. Доля клеток с тетраплоидным набором ДНК определяется ta основании аналогичных условий: d(l)$G2+M (r^-Vs'( i^-n-jOck^). ¡глэживание распределения клеток, находящихся в s-фазе, по коли-кству ДНК производится по формуле: d( 1) {d( 1) +V2* [d(i-I)+ i +1)])- Эти процедуры повторяются до тех пор, пока при первона-гально оцененной величине cvfflj и при заданных значениях m-j- и mg зе личина Л не достигнет предельно минимального з качения. Ео-зто-эых, корректируются значения величин nj и соответствующие ди-1Лоидному и тетраплоидному количеству ДНК, й теоретически езязан-1Ъ® соотношением ^2=2'ш^. Однако, в процессе дискретизации изке-5Яемьь. сигналов, это соотношение может быть нарушено. А так же зри их определении по экспериментальному частотному распределению то интенсивности флуоресценции моает быть допущена ошибка. Для уменьшения влияния подобных ошибок на, получаемые результаты была реализована процедура подбора величин mj и nig. При этом учитывалось, чте ошибка дискретизации гожет лииь принимать значения ±1. И наконец, в третьих, проводилась коррекция величины коэффициента вариаций (cvmj) нормального распределения клеток с диплоидным набором ДНК Поправка оц-ненного значения cvbj на величину, равную 0,на каадом уровне приближен:*я. Вели такое изменение я*1 яичниц cv ^ приводит к уменьшению ошибки синтезированной гисто-

rpaiu.ii в сравнении с экспериментальной, то новое значение берат за основу при дальнейших процедурах нахождения распределения кл г эк пс количеству ДНК. Елли коррекция СУИ^ не изменяет величину то величина шага уменьшается на треть по сравнению со значением предыдущем уровне приближения.

II, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ШТОМЕГГРШ В ПОТОКЕ ДНЯ ИЗУЧЕНИЯ

МЕХАНИЗМОВ ПАТОГЕНЕЗА БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ Клетки крови принимают участие во всех защитных функциях о; ганизма, а также в анафилактических, аллергических, инфекционн! и других патологических реакциях. Практически все нейрогуморад ныэ медиаторы, принимающие участие в выше перечисленных реакци. организма, стимулируют фосфоинозитидный обмен. Это приводит к п< вышнию концентрации внутриклеточного ([Са^4],) и к десенс: тизации рецепторов на поверхности клетки, в частности ¿ата-адр| нергических рецепторов. Поэтому разработка метода быстрого тест рования [Са2+]1Г а также количества и свойств рецепторов в хле' ках крови представлялась нам актуальной задачей с точки зрен диагностики и мониторинга эффектов лечения.

Содержание свободного внутриклеточного кальция в клетках кр ви при бронхиальной астш (БА). В данной работе проведено изуч ние возможности измерения [Са2^ в лейкоцитах периферическ крови человека с помощью кальций-чувствительного флуоресцентно зонда (¡ц1п~2 методом цитофлуорометрии в потоке. Клетки нагружа п-2 по методу, предложенному ранее [т$1еп е1 «1, 1984]. В исследование включались больные, недавно поступившие в ст ционар (от 6 до 48 часов), получившие терапию по "скорой помощ и в стационаре. Обследован 41 пациент с диагнозом БА различи форм (21 жен., 20 муж.) в возрасте от 15 до 74 лет. Контролен

.Ряс. I. Частотные распределения лей-■: ¡коиитов человека по содешанню сво-

. бодного внутриклеточного* Са . . Ко 'осям абсцисса - инт^нсивнасть флуоресценции комплекса Са -<з<пп-2 (отн. ед.)- ордината - число клеток на канал. — - здоровый донор, — ^ больной бронхиальной астмой.

Ьм .•.*=-„.. ' ¡группу составили 21 ЗДОрОЕЬЙ донов

I возрасте от 25 до 50 лет.

Во всех проанализированных про-ах было выявлено две популяции лейкоцитов, сильно и слабо флуо-есцирующих, различащихся по интенсивности флуоресценции компле-са Са^+-ди1п-2 в среднем в 2,3 (рис. I). Для определения оличества молекул (}и1п-2 на клетку в обоих популяциях, был ис-ользован [%]-0и1 п-2. Средний уровен' радиоактивности на клетку, бусловленный содержанием в них п-2, не различался в

летках высортированных из обоих популяций. Поскольку, ззаимодей-твие Чи 1 п-2 с Са^ происходит в соответствгп с реакцией (Г), а оличество молекул (1и1п-2 во всех клетках приблизительна одикако-о, для определения ,;оли клеток в популяциях мсаьо воспользовать-я модель», описанной в части I.

При сравнении больных и здоровых людей было выявлено, что ко-ичество „ильно флуоресцирующих лейкоцитов значительно вьлпэ у олькых бронхиальной астмой различными фермами, чем у здоровых оноров (рис. I). Доля сильно флуоресцирующих клеток у больньк: олеблется от 39,1% до 80,1% (ерэднее - 55,6% у больных атопиче-кой формой БА и 55,8% - у больных инфекциокно-завискиой формой А и у здоровых - от 23,3% до 53,2% (среднее - 40,0%).

Предполагается, что выявлениогузеличекие доли лс:":::оц;;тоа <.; овьшенкой у больных ЕА по сравнению со здоровьш дзчора-

ми связано с тем; что в фазе обострения заболевания отмечается повышение связывания кальция частью мононуклеарных лейкоцитов, т. е. у большего числа клеток активирован мембранный транспорт Са^+ в цитоплазму. Это мокат бьггь обусловлено аллергической реакцией антиген-1д£-антитело на поверхности клетки, приводами к увеличению метилирования фосфолипидов клеточной мембраны. Этс делает ее проницаемой для ионов Са^т [Чучалик, 1985], что является самым ранним эффектом антигенного стимулирования. Е свяэ! с этим, изучение изменения [Са2+] представляет интерес не толькс при развитии БА, ко и при использовании экстракорпоральных методов ее лечения, позволяющих удалять 1дЕ то кровотока.

Злизшзе акгвамрпашьнай ¡терапии на седарвашш авойашог! ЕЕУЕЕкклагазааге а лайкшжхаа;». Было исследовано влияниэ экс тракорпоральной сорбции на соотношение выявленных популяций лей коцитов у больных с высокой гиперчувствителькостью к различны аллергенам. Шестеро больных атонической БА (средняя тяжесть тече кия, фаза ремиссии) были подвергнуты экстракорпоральной терапии Обследование проводили до и через 7-10 дней после проведения про цедуры.

Через 7-10 дней после проведени

процедуры замечено снижение количеств

сильнофлуоресцирующих лейкоцитов (рис

2). Видимо, это обусловлено тем, ■ чт

проведение экстракорпоральной сорбция

включающей геыссорбцию и кммуносорбцик

Рис, 2. Влияние экстракорпоральной терг пии наколичество лейкоцитов с повыше* ным содержанием свободного внутрикле точного Са^ у больных БА. I - до, 2 после процедуры.

приводит, во-первых, к уменьшению количества специфических igE-антител и, во-вторых, к стабилизации мембраны лейкоцитов, что приводит к снижению реакции кожи на введение "виновного" аллергена [Казанбиев, 1986]. Это, по всей видимост;., нормализует процессы транспорта кальция через клеточную мембрану и ведет к постепенному сн:::«ешю доли клеток с высокой концентрацией внутрц-р.

клеточного Ca .

Изучение состояния бета-а;¿.¡энергической рецепции иакрофагов бронхоальвеолягного сыывь и лшфоцитоъ крогч у больше бронхиальной астмой. Для определения состояния бета-адренороцепции макрофагов методом цитофлуоромэтрии в потоке был использован флуорес-центномеченый антагонист бета-рецзпторов - 3-амино-ак.ридил- про— .¡ранолол (9-ААП) (Pol ysci ence, США), который ранее использовался лишь для визуализации бета-рецептороз в различных тканях и клет-<ах методом флуоресцентной микроскопии.

ИатльзаЕшца ЗгШ для колаь'есхвевтй йра^ешкзжп й^т-рэиетараВх- Чтобы убедиться в том, что S-AАП действительно специфически связывается с бета-рецепторами на поверхности клеток, мы посмотрели в какой концентрации им Г'лесняется высокоспецифичныл ii широко используемый радиоактивный антагонист бета-рецепторов '1251]-цианоп1Шдолол ([ I25t ] -ЦИП). На рисунке 3 представлена зависимость специфического связывания [ 1251 ]-ЦИП от концентрации 9-/ АЛ. Видно, что 9-ААП является лигандом к бета-адренер-

Рис. 3. Вытеснение ГГ251 ]-циано-" „ пиндолола 9-ААП. По осям^З6?-' цисса - доля связанного L !]------------__ _ ПИП (Я), ордината - концентра-» -7 ЦИЯ 9-ААП (lg М).

100 (Э—о

гическгч рецьлтораи с кинетической ¡.онстантой связывания, близкой к нативному пропраяололу. Значение константы связывания 9-ААП, определенно» по вытеснению радиоактивномеченого лиганд., также совпадает с константой диссоциации (Кд=(3±1) • Ю-8 М), определенной ранее по ингибиоованию адреналин стиму тированной активности аде нилатцик. лазы [ Me lamed et »1, 1976]. Проведение такого эксперимента мы сочли необходимым, поскольку в литературе высказывали сомнения о специфичности связывния 9-ААП [Cornett and Melzel, I960]. Однако, 'это может быть объяснено высокой' концентрацией (5 мкМ) 9-ААП, используемой авторами. С нашей точки зрения 9-амино-акридин пропранолол может бьггь использован в качестве флуоресцентного зонда для выявления бета-адренорецепторов методами флуоресцентной микроскопии и цигофлуорсмегрии в потоке.

*надаа Ssia=peusniQC2s макрафасав вргишасьв&здарцгга смьша._ Для получения клеток Сронхоальвеолярного смыва использовали метод ФБС, когда средыдолевой :1роьх справа промыв п лея 30-50 мл подогретого физиологического раствора. Дгч определения бета-рецепторов методом цитофлуороыетрии в потоке клетки инкубировали с 9-ААП в I мл среды Игла, модифицированной дулбекко (GIBCO, США)» з течение I часа при 37°С с периодическим встряхиванием. Концентрация 9-ААП варьировала в диапазоне от 2,5 кМ до 100 нМ. Для определения неспецифического связывания 9-ААП клетки инкубировали с 1-?л-пренололом в концентрации 10 мкМ. После окончания инкубации клетки центрифугировали при 400хд в течение 10 минут. Супернатант удаляли, клетки ресуспендирозали в 50 мхл среды инкубации и держали на льду до момента проведения анализа. Перед проведением анализа методом цитофлуорометрии в потоке клетки ресуспендиронали в 2 мл среды без добавок. Субпопуляцяю макрофагов выделяли по

Таблица Ь

Показатели б в та-адре нз ргичэ с к о й рецепции исследуемых груш больных

Больные хроническим бронхитом Больные бронхиальной астмой

Боль- Макрофаги Лимфоциты Боли- М?крофаги Лимфоциты-ные бр. -альв. периф. ные бр. -альч. пе; иф. смыва крови смыва крови

Ко. 1,6 9,8 9,0 35,0 Да. 56,0 73,5 ЩЗ 37,0

Ла. 2,0 42,0 - - Бе. 49,3 128,0

Ко. 8,2 56,5 9,8 40, 0 Бу. 30,8 82,0

Ро. 9,4 79,0 - - Бы. 75,5 155,0

М±м 5, 3±3,5 52, 9+16, О

68, 8*21, 4 109, 6+34, О

* Терапия: беротек 5-8 инг. /день, полькортолон 5 т. /день анализу светорассеяния [Oethloff and Lehnert, 1988]. Параметры связывания (количество бета-рецепторов и константа диссоциации) определяли по анаморфозе Скэтчарда, определяемой выражением (3).

В состав обследуемых групп были включены 9 человек. Первую группу составили 4 человека с минимально выраженными клиническими и эндоскопическими признакам! эндобронхита, без признаков бронхиальной обструкции. Во вторую группу были ¿ключены пятеро больных смешанной формой БА. Астматический анамнез этих пациентов составлял 2-3 года, четверо из них не принимали бега-агонисты, глюкокортнкоиды, т. е. препараты, которые способны оказать влияние на состояние бета-адренорецепции. Прием метилксантинов у этих больных был прекращен за сутки до проведения обследования.

Результаты анализа показали, что количество бета-адренорецеп-торов на поверхности лейкоцитов периферической крови, а также сродство флуоресцентномеченого пропранолола к бета-рецепторам не отличается у больных ЕЛ хроническим бронхитом (табл. I). Кон-

станта диссоциации пропранолода с бета-рецепторами на макрофага у больных БА на порядок выгч, чем на макрофагах у больных хрони ческиы бронхитом. В то же время, количество бета адренорецепторо на поверхности макрофагов бронхоальвеолярного смьша у больных Е несколько выше, чем у больных хроническим бронхитом. У больног БА, принимавшего бета-атонисты (берогек,6-8 вдохов в день) и гор мокальные препараты (полькартолон, 5 т. в день), оказалось снижен ным количество бета-адренорецепторсв как на поверхности лейкоци тов периферической крови, так и на поверхности макрофагов и бронхоальвеолярного смыва. Этот феномен десенситизации к бета агонистам хорошо известен в литературе [sibley and lefkowitz 1985].

Увеличение константы диссоциации пропранолола с бета-рецепте

о

рами на поверхности макрофагов бронхоальвеолярного смыва у боль ных БА указывает на снижение функциональной активности бета-адре норсцепторного аппарата в легких больных. Некоторое же увеличена количества бата-адренорецепгоров может расцениваться как компеь заторная реакция на снижение функциональной активности.

III. ПРИМЕНЕНИЕ ШТОДА ШТОМЕТРИП В ПОТОКЕ ДЛЯ ОШЯЩЕЛЕНИЯ

а

КОЛИЧЕСТВА ДНК В КЛЕШАХ.

Сеаонная динамика про лифа ративной активности у гиюспящга Исследование проводилось на сусликах Ciiellus undulatus, которь относятся к истшньмзиыоспящим. В качестве объекта исследовани были выбраны клетки эпителия тонкой кишки, одной из наиболее бь стро обновляющихся тканей. ДНК-синтезнрующую активность изучали активных животных в июле, сентябре-ноябре и в апреле, а также гибернирукщих в ноябре и в январе-марте. Животных забивали в о®-

,и то же.время - в 21 час. Клетки из крипт тонкой кишки суслик

✓

18

Таблица 2.

выделяли по ранее описан-

Ъдовая динамика извинения доля кла- ной меТ0дике [Kruman et al, ток в s-йазе из крип* тонкой кишки '

с:-слрт<а citelluj undUtu».

1есяц Состояние Число Доля к л.

аивотных животных S-<ta3e,£

1юль Активные ГО 9, Э±0,5

!ентябрь \ктивныэ j 6, 4±0, 9

)ктябрь Активные 6 5, 4±0, 8

1оябрь Активнее 5 4, 4±1, 0

{оябрь Спящие 5 4, 0+0, 7

1нварь Спящие ÏO 3, 4iO, 5

Авраль Спящие 10 7±0, 6

iapT Спяпиа 7 6,1±0, С

трель Активные 7 ?, 6±Г, ?

1986]. Клетки в суспензии

этиловым спиртом окрашива-

тофлуороиэтрии в потоке.

Уровень ДЧК-синтезируюшей активности в сентябре был ниже, чем июле (табл. 2). В дальнейшем, в сентябре и октябре, когда ос-овная часть животных находилась в активном состоянии, ДНК-синте-ирукхцая активность продолжала сниа лъся и в ноябре почти дости-ала минимального уровня, характерного для периода глубокой спяч-и (январь). В феврале лролнферативная активность начинает возра-тать после периода глубокой спячки. В марте происходило дчльнай-ее возрастание доли клеток ъ s-фазе клеточного цикла, и в апре-з, когда животные пробудились от гтмней спячки, длля клеток в сазе достигла уровня близкого к июльскому.

Полученные нами результаты показывает, что пролиферативныо роцессы, как н другие процессы в организма истинных зимоспящих, апримар, ряд эндокринных (Wang, 1932), подвержены перестройке -епреаированию в период подготовки к гибернации и реактивации в ериод подготовки к пробуждению, что может происходить независимо т состояния .жвотного (оцепененлз или бодрствование) и его тем-ературы. В целом, если взять среднее значение периода реактква-îi средноо осеннее значение, то полученные нам! результаты

Таблица :

Изшнашю дси кл'ток в S-фззе кз гошгг тонкой rkjkh суслика Cite! lus undHtus в течанио периода оцепенения.

Положение "Температура Число Долг клеток (%) в

в цикло гель, С животных s-фазе g2+M

Начало ÏÎ-Ï6 ~ 6 4,~5±5/Г~ 13,9±î, 7 Конец t. -6 12 5,0±0,3 17,3±0,9

шкно представить в виде годового цикла: падение ДНК-сингезирук

щей активности в обновляющихся тканях истинного зимоспящего с

максимального летнего через промежуточной осеннее до минимально1

уровня в период глубокой спячки и снова повышение через промеж^

точное значение, соответствующее периоду реактивации до летнего.

Мы предполагаем, что сезонное изменение пролиферативной af тивности у зимоспяших регулируется эндогенно и происходит путг снижения или повышения количест: э клеток, вступающих в митотич« ский цикл, с другой - пониженной из-за низкой температуры скорс стью митотического цикла с блоком в фазе g2. из которого клет* "выходят" во время спонтанных пробуждений. Действительно, до.; эпителиальных клеток с тетраплоидныы набором дНК возрастала в те чение периода оцепенения (табл. 3), в тоже вре'1Я количество митс зов в обновляющихся тканях зимос 1ящих остается неиз'-енным [Adel stein et ab, 1967]. Это говорит о том, что в период оцепеней прохождение митотического цикла клетками обновляющихся тканей и: тиннвдаимоспящих не прекращается, хотя сильно растянуто во врем< ни. При этом происходит блокирование клеток в G2-$f>3e и накошк кие таких клеток в течение периода оцепенения.

Получение гибридных гибридок, производят бкспэцифичэск: антителг, штодом двойной сортировки. В работе использовали кле' ки, производящие антитела к антигенной детерминанте апобел; BIOO, экспонированной на поверхности лкпопротеидов низкой плот»

:ти (Jllllin) плчзмы крови человека (линия анти-лПНП), и клерки, [роизводящиа антитела к щелочной фосфатазе кишечника теленка (ли-[ия анти-ШФ).

йпшдемниа коланасгва ШК в ШВЫ Oält^X.. Для окраски ДНК в ¡.ивых клетках использовали крас; гель Hoechst 333-»2 (н342) (ше-el-de Haen AG, ФРГ). К кпткам, в культурзльной среде, добавляли ¡азличные количества маточного раствора Н342 (I м_-/мл в 70% EtOH) ; инкубировали при 2?°С. Затем клетки отмывали от Н342 однократ-:ым центрифугированием (4п0хд, 10 мин. 1, ресуспендирочали в куль-уральной среде и хранили до анализа и сортировки методом цито-втрии в потоке при ,°С не более 60 минут.

Удовлетворительное окрашивание ДНК в клетках линии анти-ЛПНП, сходящихся в различны, фазах цикла деления, достигается после ин-убации их в течение 90 минут с Н342 в концентрации 10 мкг/мл. да определения влияния воздействия Н342 на способность клеток к ■?о лифе рации и секреции антител, ш наблюдали рост клеток, инкуби-■ованных 90 минут с Н342 в концентрация:- 10 мт/ил и 20 мкг/мл. летки, которые инкубировали с Н342 в концентрации 20 ж г/мл, те-яли способность к делению и через несколько дней погибали. В то ;е время, значительная часть клеток, подвергнутых воздействию [342 в концентрации 10 мкг/мл, продолжала сохранять способность длиться и производить антитела. Жизнеспособность клеток после оздействия Н342 снижалась и по сравнению с контролем составила 3% клеток линии анти-ЛПНП и 75% клеток линии анти-ЩФ. В тоже .ремя 83% клеток линии анти-ЛПНП и 100% • лишл анти-ЯЙ продолжа-:н сохранять способность производить антитела.

Отбор шйршюа шгоюы 1Ш0ШХР1Ш в пате.- Перед гибридизацией клетки линии анти-ЛПНП ок(чшивали ФИТПам, а клетки линии ан-

ти-ШФ - ТРИТЦгч по "хеме, описанной р-нее [кага*»еЛ* ег а 1, 1938]. После гибригдазации были отсортированы клетки с двойной флуоресценцией, которые выявляли с помощью метода цитоф,»уоромет;ин в потоке и доля которых составляла 2, 5% от общего количества клеток. Отсортированные клетки были разделены на д^е части: 10^ клеток были равномерно высеяны в лунки 96-луночного планшета со сплино-цитарным фидерным слоем, а 35хЮ3 клеток - высеяны в чашку Петри диаметром 35 мм. Клетки, высеянные в планшзт, дали 78 клонов, в среде которых биспецифических антител обнаружить не удалось.

Клетки, высеянные после сортировки в чашку Петри, культивировали (с периодическим обновлением культуральной среды) в течение 10 дней,®«! затем были окрашены при ранее подосранньг/ условиях, Н324. При дальне^ем анализе методом цитофлурометрии в потоке было

о

получено частотное распределение клеток по количеству ДНК, показывающее, что 0,2% от 'бщего числа проанализированных клеток имеют Количество ДНК заведомо большее, чем тетраплоидный набор ДНК в клетках партнерских линий, находящихся в момент анализа в Й2-фазе :: митозе. Было отсортировано около 600 таких клеток, которые были равномерно высеяны в ячейки 96-лу..очного планшета со сплиноци-тарныы фидерным слоем. Из клеток, полученных после повторной сортировки, выросло 74 клона. Методом иммукоферментного анализа в ..ультуральной среде одного из них были обнаружены биспецифич^-ские антитела. Этот клок был подвергнут реклонированию, необходимому для дальнейшей работы.

Для определения и сравнения количества ДКК в клетках партнерских линий и полученной гибридной гибридомы методом цитометрии в потоке использовали иодвд пропиция. Ядра клеток, полученной линии в а--фазе цикла деления содержат 77, 5% ДКК от суммарного количе-

Рис. 4. Частотные распраде :ения клеток, родительских линий и полученной гибридной хибридош по количеству ДНК. По осям абсцисса - количество клеток ордината - количество ДНК на клетку.

ства диплоидного набора ВДК в ..летках партнерских линий (рис. 4).

Метод отбора ибридов, основанный на сортировке гетерофлуоресцектных клеток, имеет ряд преимуществ по сравнению с методами, основанными на отборе клеток на селективных средах. Так, отпадает необходимость предварительного получения мутантов, чувствительных к этим средам, что требует длительного подбора условий мутагенеза. Однако, метпц, основанный на однократной сортировке не всегда позволяет получить бридные гибридога, производящие биспецифические антитела, что казано в нашей работе. Эго можно объяснить как низкой вероят-стью получения гибридов, содержащих одновременно гены иимуногло-линов, при утствувдие в клетках родительских линий, так и тех-ческими ошибками, приводящими к ложному отбору негибридизуемых еток. Для увеличения эффективности отбора гибридных клеток мы пользовали повторную сортировку клеток, полагая, что клетки бридной гибридомы буд/т иметь количество ДНК большее, чем клет-родительских линий.

Для количественной окраски ДНК.в живых клетках был использо-н Hoechst 33342. Ранее Н342 использовали для отбора гибридов • бробластоподобных клеток. Однако, было показано, что обработка 42 оказывает не одинаковое злилчне на жизнеспособность клеток

мот-ЛШШ

различного происхождения. Этс обстоятельств! определило необходимость подбора условий окраски К342 ДНК в клетках, синтезирующих антитела. Б результате проведенной экспериментов были подобрань оптимальные условия прижизненного окрашивания ДНК в клегках гибридных линий, I.) лученных на основе миеломы от мышей в а1в/с. Это позволило прозести говторную сортировку клеток, в результате которой была получена линия клеток производящая моноклокальные антитела двойной специфичности.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и теоретически обоа ,<ваны новые экспериментальные подходы использования метода цитофлуорометрии в потоке для определения характеристик лиганд-рецепторного взаимодействия моде^ флуорохрома с клетками. Показ г чо, что получаемые частотные распределения клеток описываются нормальным законом с дисперсией, пропорциональной количеству мест связывания флуорохрома на клетк«

2. Показано, что метод двойной сортировки клеток значительно повышает вероятность получения ноеых гибридных линий клеток. Получена линия клеток, производящих бисьецифические моноклональньк антитела к антигенным детершне-'ам, экспэнированнь'м на липопро-теидах низкой плотности периферической крови человека и щелочно{ фосфатззе.

3. Обнаружено, что уменьшение Сета-адренорецепторной чувствительности сопровождает бронхи, "шную гиперреэк.тивность при бронхиальной астме. Снижение значений количества бета-адренорецепторов кг поверхности клеток. Оронхоальвеолярного смыва и уменьшение константы .диссоциации пропраколола с бета-рецепторами у гормонозавя-сшшх больных бронхиальной астной объясняется эффектом приема, соответственно, бета-агониетов и кортикостероидов.

1. Показано, что при атопической бронхиальной астма увеличивается соличество лейкоцитов с высокой концентрацией внутриклеточного Проведение процедуры экстракорпоральной сороции, уменьшаете й количество igE-антнтел и ослабляющей кожную гиперчувстви-гельность к данному аллергену, приводит к снижению количества лейкоцитов с высокой концентрацией кальция.

5. Установлено, что пролиферативная активность в эпителии тонкой

сишкн суслика носит сезонный характер; постепенно падает в тече-

1ие осеннего периода - при подготовка к гнйернации и возрастает в

сечение февраля-марта - периода подготовки к пробуждению, причем

лштез ДНК не прекращается в период оцепенения, однако клетки

¡локируются и накапливаются в премитотичзской фазе цикла деления.

)сновные результаты диссертации отражены в следующих публикациях;

[. Круман И. ¡1, Колаева С. Г. , Иваницкий Г. Р., Рудченко С. А., Хур-хулу 3. С. Сезонная динамика пролифаратпвной активности у зимо-спящих. Доклады Академии наук СССР, 1986, том 291, « Ч, с. 922924.

i. Kruman 1.1., Kolaeva S. G. , Rudchenko S. A. , KhurKhulu Z. S. Seasonal variations of DMA-synthesis in intestinal epithelial cells of hibernating animals - 2. DNA-synthesi s in intestinal epithelial cells df ground squirrel (Citellus Undulitus) during aututiB and late hibernation season. Camp Biochem Physiol, vol. 89B, Ho. 2, pp. 271-273, I9S8. 1. Зфендиева И. С., Рудченко С. А., Кормощ Т., Хурхулу 3. С., Григорян Г. Е , Ткачук В. А. Исследование влияния экстракорпоральной сорбции на содержание свободного внутриклеточного кальций в лейкоцитах при атопической бронхиальной астме. Терапевтический архив, т. сX, Но. 12, стр. 58-60, 1988.

Kruman I.I., llyasova E.N., Rudchenko S. А. , Khurkhulu I.S. The Intestinal EpltiiejSal tells of Ground Squirrel (Citellus Undti-latus) Accumulate at Go PhaSe of tha Call Cycle Throughout A Bout of Hibernation. CdSp Biochem Physial M,

:. Rudchenko s. a. tiarjchnfeva !.l., Chuchjlfn a.g. Analysis if beta-adren6captori in cells usi и, 9-ami noaeri dyne propranolol (9-AAP) by Псч cytometry. 40th Annual Meeting of the Hlsio-chemical Society, J. Hi s tochen. Cytochen. , 37, 6, p. 940, 198-9. i. Rudchenko S. A., lilasik Т.Н., Kapawajew L. , Kakitslcaya V.V., T>-akht I.H. fiuplicata cell sorting procedure for the leiecHon hybrid hvbridoihis. 40th Annual Meeting of the Hi stocheWrcal Society, 3. Histoche®. Cytrchero. , 37, 6, p. 941, 1989.