Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитофизиологические особенности ранних стадий развития возбудителя мучнистой росы пшеницы при моделировании окислительного стресса

ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Цитофизиологические особенности ранних стадий развития возбудителя мучнистой росы пшеницы при моделировании окислительного стресса"

На правах рукописи

.! ""Т"

АВЕТИСЯН ГАЯНЭ АКОПОВНА

ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАННИХ СТАДИЙ РАЗВИТИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ МУЧНИСТОЙ РОСЫ ПШЕНИЦЫ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА

03.02.01-ботаника

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2011

1 7 МАР 2011

4840671

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Бабоша Александр Валентинович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Аверьянов Андрей Александрович

доктор биологических наук Ткаченко Олег Борисович

Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова (Биологический факультет)

Защита состоится «31» марта 2011 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д. 002. 028. 01. ГБС РАН по адресу: 127276 Москва, ул. Ботаническая, д. 4.

Тел (495) 977 80 00; факс (495) 977 91 72

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБС РАН

Автореферат разослан «_»_2011 года

Ученый секретарь ('¿/^Ca-JQ Д.б.н. Ю.К. Виноградова,

Диссертационного совета

Актуальность темы. Мучнистая роса злаков распространена повсеместно, где выращивают зерновые культуры. Исследованиями последних лет на растениях ячменя и пшеницы показана важная роль активных форм кислорода (АФК) в патогенезе мучнистой росы, которые являются посредниками активации иммунного ответа растения, а также участвуют в контроле структурной организации клеточной стенки. Показано, что у проростков пшеницы Triticum aestimm L. уровень АФК повышался уже через 2 ч после заражения мучнистой росой (Hurkman, Tanaka, 1996). Отмечено, что предварительная- обработка растений пшеницы экзогенной перекисью водорода приводила к генерации АФК, которые индуцировали устойчивость к патогену (Feng et al., 2008).

Ввиду высокой вредоносности этой группы облигатных паразитов цитологические особенности взаимоотношений мучнисторосяных грибов и растений-хозяев достаточно хорошо изучены (Gorlenko, 1950; Aist, 1976; Kunoh et al., 1985). Вместе с тем данные о влиянии АФК на ранние этапы развития возбудителя мучнистой росы пшеницы практически отсутствуют. Преимущественное развитие мучнисторосяных грибов на поверхности эпидермальной ткани растений-хозяев дает возможность использовать для исследования данного патогена метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).

Цель работы. Определение роли окислительного стресса в регуляции ранних этапов взаимодействия возбудителя мучнистой росы пшеницы и растения-хозяина.

Задачи работы:

1.Определить характер действия перекиси водорода и 3-амино-1,2,4-триазола на морфологические" особенности инфекционных структур и развитие колоний возбудителя мучнистой росы в обработанных растениях в зависимости от концентрации и времени применения.

2.Выявить зависимость размеров и структуры гало в месте взаимодействия растения и патогена от концентрации исследуемых прооксидантов.

3.Выяснить возможность выявления гало методом сканирующей электронной микроскопии без использования окраски или фиксации.

4.0пределить характер регуляции направления роста аппрессориальной ростковой трубки при действии перекиси водорода.

Научная иовизна работы, i Впервые установлено изменение при окислительном стрессе размеров и морфологии гало в сайтах взаимодействия растения и патогена, показан многофазный характер концентрационной зависимости действия прооксидантов. Разработана методика, позволяющая наблюдать гало с использованием сканирующей электронной микроскопии

без окраски или химической фиксации. Показано, что мучнисторосяный патоген на разных стадиях развития имеет различную чувствительность к действию прооксидантов. Определен характер регуляции направления роста аппрессориальной ростковой трубки относительно эпидермальной клетки при окислительном стрессе. Впервые показано увеличение доли аппрессориев, растущих в поперечном направлении, под действием экзогенной перекиси водорода.

Практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о роли активных форм кислорода в патогенезе мучнистой росы. Показана патоген-ингибирующая активность соединений, индуцирующих окислительный стресс у растений. Размеры и особенности морфологии гало, а также направление роста аппрессориальной ростковой трубки могут быть использованы в качестве новых параметров диагностики состояния патосистемы в тестах на устойчивость.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на I Всероссийской молодежной научно-практической конференции ботаников в Новосибирске «Перспективы развития и проблемы современной ботаники» (Новосибирск, 2007); III Международной конференции молодых ученых "Биоразнобразие. Экология. Адаптация. Эволюция" (Одесса, 2007); Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века» (Петрозаводск, 2008); Международной конференции «Актуальные проблемы ботаники в Армении» (Ереван, 2008 г.); XXI Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твёрдых тел (Черноголовка Московской обл., 2009); 16th International Reinhardsbrunn Symposium on Modern Fungicides and Antifungal Compounds (Germany, 2010); Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них публикации в журналах, рекомендованных ВАК - 1, материалы международных конференций - 3, всероссийских съездов, конференций - 4.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 134 страницах, иллюстрирована 7 таблицами и 20 рисунками. Список литературы содержит 259 библиографических названий, из них 205 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. Рассмотрены современные представления о механизмах образования активных форм кислорода в растительной клетке. Особое внимание уделено биологическим и морфологическим особенностям возбудителя мучнистой росы злаков Erysiphe graminis DC и роли АФК в регуляции метаболизма у растений пшеницы.

Объекты и методы исследования. В работе использовали растения мягкой пшеницы Triticum aestivum L. сорта 'Заря', инфицированные возбудителем мучнистой росы пшеницы Erysiphe graminis DC. f. sp. Iritici Marchai.

Растения выращивали при температуре 20-22°С и 16-ти часовом фотопериоде. При заражении использовали популяцию возбудителя мучнистой росы Е. graminis, поддерживаемую на восприимчивой пшенице.

Инфицированные отделенные листья (первые или вторые настоящие листья) 10-12 суточных проростков пшеницы обрабатывали водными растворами перекиси водорода и 3-амино-1,2,4-триазола в чашках Петри на плаву адаксиальной стороной вверх или путем погружения в раствор нижней части листа. В контроле использовали дистиллированную воду. Исследуемые вещества вносили на период 24 ч в 1-е, 2-е, 3-й сут после инфицирования или на протяжении всего эксперимента.

На 5-6-е сутки после инфицирования число видимых колоний подсчитывали на абаксиальной и адаксиальной поверхностях листьев с помощью бинокулярной лупы.

Световая и микроскопия. Инфицированные участки эпидермиса снимали с абаксиальной стороны листа и окрашивали 1%-ным амидочерным в 7%-ной уксусной кислоте. Препараты просматривали под световым микроскопом Axioplan 2 (Carl Zeiss, Германия). Размеры гало и расстояния между большим и малым гало определяли по цифровым фотографиям при помощи программы Image J.

Электронная микроскопия. Препараты для электронной сканирующей микроскопии фиксировали в глутаровом альдегиде и четырехокиси осмия, обезвоживали в серии растворов спирта, высушивали при критической температуре, напыляли золотом и просматривали с помощью сканирующего электронного микроскопа LEO-1430 VP (Carl Zeiss, Германия) в режиме высокого вакуума. Образцы листовой ткани без химической фиксации исследовали в условиях низкого вакуума при комнатной температуре (VP режим) или в условиях высокого вакуума при температуре -30°С с применением замораживающей приставки Deben UK (Великобритания).

Через 24, 48 и 72 ч с момента инокуляции подсчитывали количество нормальных и аномальных (изросших) аппрессориев в 20-40 полях зрения микроскопа по 0.6 мм2 каждое. Определяли направления роста как аппрессориев прорастающих конидий, так и аппрессориев в составе колоний. Если угол между антиклинальной клеточной стенкой и направлением роста аппрессория находился в пределах от 0 до 30°, аппрессорий классифицировали как растущий вдоль эпидермальных клеток. Соответственно аппрессории, растущие под углом от 30° до 90°, относили к категории роста поперек эпидермальных клеток.

Результаты исследования и их обсуждение

Влияние экзогенной обработки перекисью водорода и З-амино-1,2,4 триазолом на развитие колоний мучнисторосяного патогена. Обработка отделенных листьев пшеницы, как перекисью водорода, так и 3-АТА ингибироваяа развитие колоний Е. ^атМя. При увеличении концентрации данных веществ ингибирующая активность возрастала.

При внесении исследуемых соединений все варианты показали достоверное снижение числа колоний (р<0,001). Среди вариантов с применением прооксидантов в течение ограниченного срока наиболее сильное ингибирование наблюдали в 1-е сут, что соответствовало стадиям прорастания конидии, образования аппрессория и проникновения в клетку растения, а также на 3-й сут. Стадии развития патогена, протекающие на 2-е сут (развитие питающей структуры и рост гиф), относительно более устойчивы к ингибированию.

Формирование гало при инфицировании возбудителем мучнистой росы. Одним из ранних проявлений взаимодействия растения и патогена в изучаемой патосистеме является образование гало - специфических концентрических структур в месте контакта, выявляемых при цитохимической окраске (рис 1). Гало можно наблюдать как в восприимчивых, так и в устойчивых растениях. В месте контакта с эпидермисом первичной ростковой трубки образуется малое гало, в месте контакта лопасти аппрессория образуется большое гало. Одиночные вторичные гало образуются в местах контакта с эпидермисом гифальных лопастей. В наших опытах размеры большого гало варьировали в пределах 60 - 250 мкм, малого гало в пределах 20 - 40 мкм.

Изменение структуры и окраски гало под действием перекиси водорода и 3-амино-1,2,4-триазола. Наиболее типичны одноцветные синие или двухцветные гало с пурпурной серединой и синим внешним кольцом. Размеры и интенсивность окраски пурпурной части варьировали. В центре гало часто наблюдали пятно или кольцо диаметром 1,5-24 мкм с более

Рис. 1. А - Образование гало под действием первичных инфекционных структур возбудителя мучнистой росы пшеницы; Б - образование гаусторий возбудителя мучнистой росы пшеницы; В - гало в контроле; Г - образование вторичных гало. А, В - 2 сут после инфицирования; Б, Г - 5 сут после инфицирования. Окраска на общие белки с использованием амидочерного: а — аппрессорий, бг - большое гало, г - гало, гст - гаустория, гф - гифы мицелия, мг - малое гало, к - конидия.

интенсивной синей или пурпурной окраской, соответствующее зоне папиллы.

В контрольном варианте часть гало имела выраженную слоистость, которая возникала в результате появления дополнительных темно-синих и светло-синих колец в пределах сине-окрашенной внешней зоны гало (рис 2). При добавлении низких концентраций 3-АТА (0,5 и 1 мМ) встречались слоистые гало с менее четкими размытыми кольцами. Во всех вариантах с обработкой 3-АТА наблюдали гало с размытым и частично обесцвеченным краем, в отличие от гало в контроле, которые имели более четкие границы. В некоторых случаях обесцвеченная область имела вид слабо заметного серого или бледно-коричневого внешнего кольца. Практически бесцветные гало появлялись при высоких концентрациях 3-АТА (10 и 20 мМ).

Рис. 2. Вариабельность окраски и структуры гало: под действием перекиси водорода (А - контроль, Б - 1 мМ Н202); под действием 3-амино-1,2,4-триазола (Г - 4 мМ 3-АТА, Д - 10 мМ 3-АТА, Е - 20 мМ 3-АТА). 2448 ч после инфицирования, окраска на общие белки с использованием амидочерного. Стрелками указана обесцвеченная область гало.

Особенно значительные изменения структуры и окраски гало имели место при обработке перекисью водорода. При этом наряду с гало, сходными с теми, которые встречаются в контроле, наблюдали очень

крупные гало разнообразной окраски. Среди них встречались крупные слабоокрашенные однотонные фиолетово-серые гало, а также крупные практически неокрашенные гало с узкими четкими кольцами темно-серого, пурпурного или синего цвета. Следует отметить, что при обработке 3-АТА также встречались гало, которые имели внешнее кольцо серого или бледно-коричневого цвета, однако при этом внутренняя часть гало не обесцвечивалась.

Таким образом, при моделировании окислительного стресса обработкой перекисью водорода и 3-АТА отмечено появление новых типов гало. Поскольку обработка прооксидантами существенно уменьшала восприимчивость проростков пшекицы и число колоний мучнисторосяного патогена, такие изменения структуры гало, вероятно, могут быть связаны с изменением восприимчивости растения при действии перекиси водорода.

Размер гало коррелировал с концентрацией исследуемых веществ. Добавление 3-АТА в достаточно широком диапазоне концентраций приводило к увеличению средних размеров большого и малого гало (рис 3). Концентрационная кривая для большого гало, полученная в этом опыте, имела выраженный максимум при 10 мМ ингибитора. Увеличение диаметра гало при концентрациях 6 и 10 мМ было достоверно (р<0,05) по сравнению с контролем. При дальнейшем увеличении концентрации 3-АТА происходило уменьшение диаметра гало (достоверно по сравнению с точкой максимума -р<0.001). В повторном опыте также было отмечено достоверное увеличение диаметра большого гало под действием высоких концентраций 3-АТА, однако оно проявилось при более высокой концентрации.

130 120 * 110 3. 100 I 90

С 80

а 70

6 60

I 50

и- 40

4 30 20

10 15 3-АТА,мМ

Рис. 3. Зависимость от концентрации 3-АТА: А - диаметра большого гало; Б - диаметра малого гало (1) и расстояния между большим и малым гало (2) на 2-е сут после инфицирования.

Увеличение диаметра под действием 3-АТА было свойственно также малому гало. При концентрации 1 мМ отмечен хорошо выраженный достоверный максимум. При более высоких концентрациях (4-20 мМ) наблюдали вторую область достоверного, по сравнению с контролем,

9

увеличения диаметра малого гало. Таким образом, форма концентрационной кривой для малого гало в целом имела сходство с формой кривой для большого гало. В обоих случаях концентрационная зависимость имела 2 зоны увеличения размеров гало при низких и высоких концентрациях ингибитора.

Расстояние между большим и малым гало отражает расстояние между точками контакта патогена с эпидермисом растения первичной ростковой трубки и аппрессория. Обработка 3-АТА оказывала влияние на этот параметр, однако в обоих опытах это влияние проявлялось только при самой высокой из использованных концентраций ингибитора (20 мМ) и заключалось в достоверном его увеличении примерно в 1,5 раза.

Появление первичных гало в виде пары рядом расположенных большого и малого гало можно наблюдать и на более поздних этапах патогенеза. Поскольку, согласно литературным данным, время жизни гало ограничено примерно 2 сут, первичные гало, наблюдаемые на столь поздних этапах, с большой вероятностью могут быть результатом вторичного инфицирования. В этом случае действие 3-АТА также сопровождалось существенным увеличением размеров гало. Так, на 8 сут после инфицирования диаметр большого гало в варианте с обработкой 20 мМ 3-АТА составлял 321,7 ± 43,4, что достоверно превышало значения, полученные в контроле (183,9 ± 11,4). Диаметр малого гало и расстояние между большим и малым гало при действии этой концентрации также имели тенденцию к увеличению.

160 160 I 140

о" 120

= 100 &

| 80 я

а 60

40 20

Рис. 4. Влияние перекиси водорода на размеры большого (1) и малого (2) гало на отделенных первых (А) и большого гало на вторых (Б) листьях проростков пшеницы.

Концентрационные кривые действия перекиси водорода на размеры гало на листьях первого и второго яруса представлены на рис. 4. Обработка 1 мМ перекиси водорода вызывала достоверное увеличение среднего диаметра большого гало в эпидермисе первых листьев. Во многом сходные изменения формы концентрационной кривой наблюдали в случае малого гало, а также расстояния между большим и малым гало (рис. 4). Достоверное увеличение

10

диаметра большого гало под действием перекиси водорода получено также при обработке вторых листьев (рис. 4 Б). Максимум кривой соответствовал концентрации 5 мМ. При увеличении концентрации эффект незначительно снижался.

Таким образом, обработка перекисью водорода и 3-АТА способствовала увеличению размеров гало. Максимальное увеличение диаметра достигалось при использовании оптимальных концентраций данных соединений, при их превышении средний эффект снижался. Изменение размеров и структуры гало в растительных тканях при действии АФК установлено нами впервые.

Особенности эктофитного развития возбудителя мучнистой росы пшеницы при действии перекиси водорода и 3-АТА. На рис. 5 показаны начальные этапы развития возбудителя мучнистой росы пшеницы и образования инфекционных структур. В случае нормального развития образуется аппрессорий с одной или двумя лопастями (примерно 20-25мкм). Длина аппрессориальной ростковой трубки аномальной морфологии достигала (50-120 мкм) (Рис. 6 В и 7 Д).

Рис. 5. Развитие Е. graminis на листьях пшеницы (СЭМ, нативный материал при -30 °С). А -непроросшие конидии; Б - образование ростковых трубок; В и Г - начало роста гиф мицелия

(микроколония); Д -молодые колонии.

..........

Рис. 6. Влияние концентрации экзогенной перекиси водорода на характер прорастания конидий возбудителя мучнистой росы через 48 ч после инфицирования: а-аппрессорий; иа — изросший аппрессорий; к -конидия; рт -ростковая трубка. А, Б, Д, Е и Ж - СЭМ, нативный материал при -30 °С; В и Г -СЭМ, фиксация и напыление.

В наших исследованиях наблюдали несколько типов дифференциации первичных инфекционных структур патогена. Прорастание конидии сопровождалось появлением одной первичной ростковой трубки, контактирующей с поверхностью растительной клетки (рис. 6 Б). Однако некоторые конидии прорастали с образованием 2-5 ростковых трубок, не взаимодействующих с эпидермисом растения (рис. 6 А, В, Е, Ж). В ряде случаев происходило разветвление первичных ростковых трубок (рис. 6 Д, Ж) или образование пучка из нескольких коротких трубок (рис. 6 А, Г). Впоследствии у части проросших конидий наблюдали появление вторичной ростковой трубки с аппрессорием нормальной морфологии (рис. 6Д) или аномальный рост с изросшим аппрессорием (рис. 6 В).

Все указанные морфологические типы наблюдали как в опытных вариантах, так и в контроле. Однако их доля в различных вариантах опыта

была разной. Обработка 0,5 мМ и 1 мМ перекиси водорода приводила к достоверному увеличению доли аномальных аппрессориальных структур.

Обработка 3-АТА также увеличивала количество конидий с аномальными инфекционными структурами (рис. 7). К моменту образования в контроле развитых колоний с многочисленными конидиеносцами в вариантах с сильным ингибированием развития мучнистой росы в единичных случаях наблюдали начальные стадии развития колонии. При этом, в отличие от колоний в контроле, колонии в опытных вариантах имели сильно утолщенные гифы (рис. 7 Б, В). При высоких концентрациях 3-АТА так же, как и при действии перекиси водорода, происходило образование множества зачатков гиф, в дальнейшем не развивающихся (рис. 7 Г).

Рис. 7. Влияние концентрации 3-АТА на характер прорастания конидий возбудителя мучнистой росы на отделенных листьях пшеницы сорта 'Заря' на 8-9 сут после инфицирования (СЭМ, низкий вакуум). А -контроль; Б и Б — 10 мМ 3-АТА; В и Д-1 мМ 3-АТА; Г - 20 мМ 3-АТА.

Таким образом, обработка перекисью водорода и 3-АТА приводила к ингибированию развития патогена. Исследуемые вещества проявляли сходную активность и в отношении характера изменения размеров гало. В обоих случаях наблюдали появление конидий с большим количеством ростковых трубок. Вместе с тем при использовании низких концентраций 3-АТА происходило образование утолщенных коротких гиф.

Необходимо отметить, что изменения размеров и структуры гало, а также аномальная дифференциация инфекционных структур возбудителя

100 ^т

мучнистой росы происходили при концентрациях перекиси водорода и 3-АТА, близких к тем, которые ингибировали развитие колоний. Таким образом, данные, полученные нами при обработке веществами, моделирующими окислительный стресс, позволяют предположить, что причиной наблюдаемого ранее аномального развития патогена на устойчивых растениях (Мишина и др., 2001), может быть воздействие активных форм кислорода, возникающих в устойчивом растении при прохождении защитных реакций.

Влияние окислительного стресса на регуляцию направления роста инфекционных структур возбудителя мучнистой росы пшеницы вдоль и поперек эпидермальных клеток. Направление роста инфекционных структур имеет адаптивный характер и зависит от характера взаимодействия первичной ростковой трубки с клеткой (Рябченко и др., 2009). В таблице приведены результаты подсчета аппрессориев различных групп. Рост нормальных аппрессориев направлен преимущественно вдоль эпидермальных клеток, а большинства аномальных аппрессориев - поперек. Направление роста аппрессориев в составе колоний соответствовало закономерностям, характерным для нормальных аппрессориев: применение критерия х2 показало достоверное преобладание продольного роста, как в контроле, так и в вариантах с обработкой перекисью водорода.

Однако в вариантах с обработкой перекисью водорода доля аппрессориев вне колонии, растущих в поперечном направлении, увеличивалась по сравнению с контролем. Все использованные концентрации перекиси приводили к достоверным (в соответствии с критерием %2, р<0,001) изменениям соотношений различных групп аппрессориев. В последующие двое суток во всех вариантах также наблюдали тенденцию преобладания нормальных инфекционных структур, направленных вдоль эпидермальных клеток, а действие перекиси приводило к относительному увеличению доли аппрессориев, растущих в поперечном направлении. При низких концентрациях перекиси водорода это увеличение было менее заметным, что может быть связано с постепенным разложением перекиси водорода при длительной инкубации и уменьшением ее реальной концентрации в тканях растения.

Сходное относительное увеличение доли аппрессориев, растущих в поперечном направлении, при действии перекиси водорода наблюдали также для аппрессориев в составе колоний. В соответствии с результатами применения критерия соотношение численности различно направленных аппрессориев в составе микроколоний в варианте применения 0,5 мМ достоверно отличалось от соответствующего соотношения в контроле (/>=0,016). При использовании более высоких концентраций перекиси водорода число микроколоний, которые образовались через 24 ч после инфицирования, было недостаточно для статистического анализа, а в более поздние сроки наблюдали достаточно развитые колонии с многочисленными

гифами мицелия, для которых было невозможно с уверенностью определить направление роста аппрессория. Среди изросших аппрессориев на всех стадиях эксперимента, в большинстве вариантов и в контроле преобладала тенденция поперечного роста. Однако относительно небольшое число аппрессориев с аномальным ростом не позволило провести статистический анализ характера влияния перекиси водорода на аномальные аппрессории.

Таблица. Влияние экзогенной перекиси водорода на направление роста аппрессориев через 24 ч после инфицирования

Перекись Характер роста аппрессориев Количество Р

водорода, Вдоль Поперек аппрессориев с

конц. эпидермальнои эпидермальнои поперечным

клетки клетки ростом, % от общего числа

Нормальные аппрессории

Контроль 295 64 17,8 0,000*

0,5 мМ 108 72 40,0 0,000

1 мМ 71 41 36,6 0,000

5 мМ 111 80 41,9 0,000

10 мМ 36 20 35,7 0,000

Аномальные аппрессории

Контроль 4 4 50 -

0,5 мМ 8 13 61,9 -

1 мМ 5 6 54,5 -

5 мМ 5 10 66,7 -

10 мМ 2 0 - -

Аппрессории в составе колоний

Контроль 18 5 21,7 -

0,5 мМ 8 13 61,9 -

1 мМ 1 0 - -

5 мМ 2 6 75 -

10 мМ 0 0 - -

Примечание В таблице значения р указаны только в случае, если суммарное число сравниваемых инфекционных структур превышало 30 *- р< 0,001

Полученные нами данные показали, что обработка перекисью водорода вызывает снижение числа колоний возбудителя мучнистой росы (таблица). Это свидетельствует о снижении доли клеток, восприимчивых к патогену и повышению вероятности неблагоприятного для патогена первого контакта с клеткой растения-хозяина, а, следовательно, к увеличению вероятности

15

поперечного роста аппрессориев. Таким образом, обнаруженное нами воздействие перекиси водорода на направление роста первичных инфекционных структур возбудителя мучнистой росы, по-видимому, является следствием ее участия в защитных процессах.

Изучение гало методом сканирующей электронной микроскопии. Использование препаратов при -30°С позволило впервые наблюдать гало без использования цитохимической окраски (рис 9). В наших экспериментах диаметр гало, видимых при использовании СЭМ, варьировал в пределах 7-30 мкм, что, в целом, соответствовало размерам гало, получаемых при окраске красителем амидочерным. В ряде случаев гало имели внутреннюю структуру в виде более светлых или более темных колец, что, вероятно, соответствует «слоистым» гало, видимым в световой микроскоп.

Рис. 9. Образование гало на листьях пшеницы (СЭМ, нативный материал при -30 °С). А, Б - контроль, 72 ч после инфицирования; В - 5 мМ перекиси водорода, 24 ч после инфицирования; Г - 10 мМ перекиси водорода, 24ч после инфицирования; Д - 10 мМ перекиси водорода, 72 ч после инфицирования; Е-И- 5 мМ перекиси водорода, 48 ч после инфицирования.

Заключение

О характере взаимодействия растения и патогена можно судить уже на начальных этапах развития патосистемы, наблюдая процессы прорастания конидий и дифференциации инфекционных структур. Окислительный стресс моделировали экзогенным применением перекиси водорода и З-амино-1,2,4-триазола. Показано, что прооксиданты способны изменять характер эктофитного развития возбудителя мучнистой росы пшеницы. Обработка перекисью водорода приводила к увеличению доли аномальных аппрессориальных структур. Особенностью действия 3-АТА было образование утолщенных коротких гиф, а часто большого числа укороченных зачатков гиф. Преимущественно продольное направление роста аппрессориальной ростковой трубки характерно для необработанных листьев пшеницы. На листьях, обработанных перекисью водорода, происходило достоверное увеличение доли аппрессориев, растущих поперек эпидермальных клеток. Под действием прооксидантов изменялись структура и размеры гало. Показано, что зависимость диаметра гало от концентрации обоих исследованных соединений имела многофазный характер и включала один или два максимума, что указывает на сложное и часто неоднозначное влияние активных форм кислорода на процессы, происходящие в патосистеме. Направление роста инфекционных структур возбудителя мучнистой росы пшеницы, а также вариабельность размеров и формы гало, вероятно, обусловлены локальным изменением восприимчивости клеток растения-хозяина, включая локальные изменения метаболизма АФК. Многие явления, которые мы наблюдали при моделировании окислительного стресса, характерны для устойчивых растений. Полученные данные позволяют предположить, что причиной увеличения частоты аномального развития патогена на устойчивых растениях может быть воздействие активных форм кислорода, возникающих в устойчивом растении при прохождении защитных реакций.

Выводы

1. Обработка перекисью водорода и 3-АТА ингибирует развитие возбудителя мучнистой росы пшеницы и существенно сокращает число колоний патогена.

2. Размеры гало в местах контакта растения и патогена являются параметром, зависимым от действия прооксидантов. Обработка перекисью водорода приводит к появлению очень крупных гало с аномальной структурой. Концентрационная зависимость действия

перекиси водорода и 3-АТА на диаметр большого и малого гало описывается многофазной кривой.

3. Благодаря изменению химического состава поверхности клетки и ее способности отражать электронный пучок в зоне контакта с патогеном возможно наблюдать гало с применением сканирующей электронной микроскопии без использования химической окраски и фиксации.

4. При использовании перекиси водорода и 3-АТА увеличивается доля аномальных инфекционных структур возбудителя мучнистой росы пшеницы.

5. Аппрессориальные ростковые трубки нормальной морфологии растут преимущественно в направлении вдоль эпидермальных клеток. Под действием перекиси водорода происходит изменение направления роста и увеличение доли поперечно направленных аппрессориев.

6. Выдвинута гипотеза о том, что одним из механизмов, приводящих к корреляции доли аномальных инфекционных структур и устойчивости растения, является протекание в клетке защитных реакций в форме окислительного взрыва.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Рябченко А.С., Аветисян Г.А., Аветисян Т.В., Бабоша А.В. Применение современных методов исследований для оценки морфологической изменчивости возбудителя мучнистой росы пшеницы при использовании 3-амино-1,2,4-триазола и экзогенных цитокининов / Перспективы развития и проблемы современной ботаники: Материалы первой Всероссийской молодежной научно-практической конференции ботаников (Новосибирск, 17-21 октября 2007 г.). С.187-189.

2. Ryabchenko A.S., Avetisyan G.A. Evaluation of influence of a 3-amino-1,2,4-triazole on development of the causal organism of wheat powdery mildew with scanning electron microscopy / Proceedings of the III International Young scientists conference «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution.», dedicated to 100 anniversary from birth of famous Ukrainian lichenologist Maria Makarevych (Odesa, 15-18 May, 2007). Odesa: Pechatniy dom, 2007. P. 98.

3. Аветисян Г.А., Аветисян T.B. Влияние перекиси водорода и 3-амино-1,2,3-триазола в патосистеме пшеница - возбудитель мучнистой росы // Актуальные проблемы ботаники в Армении. Материалы Международной конференции (6-9 октября 2008г., Ереван). Ереван: Институт ботаники НАН РА, 2008. С. 203-207.

4. Аветисян Г.А., Бабоша А.В. Влияние перекиси водорода на развитие мучнистой росы пшеницы II Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века: Материалы всероссийской конференции

(Петрозаводск, 22-27 сентября 2008 г.). Ч. 2. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2008. С. 103-105.

5. Рябченко A.C., Аветисян Т.В., Аветисян Г.А., Бабоша A.B. Влияние экзогенного зеатина на ранние этапы развития возбудителя мучнистой росы пшеницы // Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века: Материалы всероссийской конференции (Петрозаводск, 22-27 сентября 2008 г.). Ч. 2. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2008. С. 153-156.

6. Аветисян Г.А., Бабоша A.B. Влияние перекиси водорода и З-амино-1, 2, 4-триазола на развитие мучнистой росы пшеницы // Современная микология в России. Том 2. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2008. С. 157.

7. Рябченко A.C., Аветисян Т.В., Аветисян Г.А., Бабоша A.B. Влияние экзогеного зеатина на морфологические показатели развития колоний возбудителя мучнистой росы пшеницы // Современная микология в России. Том 2. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии. 2008. С.202-203.

8. Аветисян Г.А., Бабоша A.B. Особенности развития возбудителя мучнистой росы пшеницы при действии окислительного стресса / Тезисы докладов XXI Российского симпозиума по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твёрдых тел (РЭМ-2009) (31 мая - 3 июня 2009 г., г. Черноголовка Московской обл.). С. 215.

9. Аветисян Г.А., Бабоша A.B. Роль окислительного стресса в патогенезе мучнистой росы пшеницы // Бюллетень ГБС. 2009. Т. 196. С. 158-165.

10. Аветисян Г.А. Развитие возбудителя мучнистой росы пшеницы при моделировании окислительного стресса обработкой перекисью водорода и З-амино-1,2,4-триазолом // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2010. № 1.С.13.

11. Аветисян Г.А. Особенности роста возбудителя мучнистой росы пшеницы под действием окислительного стресса смоделированного обработкой перекисью водорода / Биоантиоксидант: Тезисы докладов VIII Международной конференции. М.: РУДН. 2010. С. 7-9.

12. Аветисян Г.А. Влияние окислительного стресса на особенности развития инфекционных структур возбудителя мучнистой росы пшеницы / Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Растение и стресс». 2010 г., Москва / Отв. ред. Вл.В. Кузнецов. С. 26-27.

13. Babosha A.V., Avetisyan G.A., Ryabchenko A.S., Avetisyan T.V. The action of 3-amino-l,2,4-triazoIe on early developmental stages of the wheat powdery mildew pathogen / In Modern Fungicides and Antifungal Compounds. Abstracts of the 16th International Reinhardsbrunn Symposium (April 25 - April 29,2010, Friedrichroda, Germany), Vol. VI.

14. Аветисян Г.А., Бабоша А. В. Развитие возбудителя мучнистой росы

пшеницы под действием окислительного стресса, индуцированного перекисью водорода и 3-амино-1,2,4-триазолом // Известия РАН. Серия биологическая. 2010 (В печати).

Подписано в печать:

15.02.2011

Заказ № 4979 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Аветисян, Гаянэ Акоповна

Введение.

Глава I. Обзор литературы

1.1. Роль окислительного стресса в регуляции защитных реакций растения

1.1.1. Биохимические свойства активных форм кислорода.

1.1.2. Источники активных форм кислорода в растениях.

1.1.3. Антиоксидантная система.

1.1.4. Образование активных форм кислорода под действием стрессов различной природы.

1.1.5. Эндогенная и экзогенная перекись водорода в регуляции защитных процессов у растений.

1. 2. Особенности патогенеза мучнистой росы злаков

1.2.1. Биологические и морфологические особенности возбудителя мучнистой росы злаков ЕгуБгрке %гститз БС.

1.2.2. Цитологические и цитофизиологические особенности взаимоотношений между растением-хозяином и мучнисторосяным патогеном Егуз1рЬе graminis £ ер. 1гШ&.

1.2.3. Формирование гало при инфицировании эпидермальных клеток растения возбудителем мучнистой росы.

1.2.4^Окислительный стресс в патогенезе мучнисторосяных грибов

Глава II. Материалы и методы исследований

2.1. Объекты исследований.

2.2. Выращивание растений и заражение.

2.3. Световая микроскопия.

2.4. Электронная микроскопия.

2.5. Подсчет колоний мучнистой росы.

2.6. Статистическая обработка данных.

2.7. Реактивы, использованные в исследованиях.

Глава III. Влияние экзогенной обработки перекисью водорода и 3-АТА на развитие колоний мучнисторосяного патогена.

Глава IV. Влияние окислительного стресса на цитофизиологические реакции растений пшеницы при инфицировании возбудителем мучнистой росы

4.1. Особенности ранних этапов развития возбудителя мучнистой росы и ответные реакции эпидермальных клеток пшеницы.

4.2. Изменение структуры и окраски гало под действием перекиси водорода и 3-АТА.

4.3. Изменение размеров гало под действием окислительного стресса.

Глава V. Морфологическая изменчивость инфекционных структур возбудителя мучнистой росы пшеницы при моделировании окислительного стресса перекисью водорода и 3-амино-1,2,4-триазолом

5.1. Особенности эктофитного развития возбудителя мучнистой росы пшеницы.

5.2. Морфологические особенности первичных инфекционных структур возбудителя мучнистой росы пшеницы при действии перекиси водорода и 3-АТА.

5.3'. Влияние окислительного стресса на регуляцию направления роста инфекционных структур возбудителя мучнистой росы пшеницы вдоль и поперек длинной оси листа.

5.4. Изучение гало методом сканирующей электронной микроскопии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Цитофизиологические особенности ранних стадий развития возбудителя мучнистой росы пшеницы при моделировании окислительного стресса"

Рост и развитие растения существенно зависят от его способности адаптироваться к изменениям окружающей среды. Растения, как и другие аэробные организмы, нуждаются в кислороде для получения энергии и хорошо приспособлены к жизни в кислородной среде (Угапоуа е1 а1., 2002). Однако существование растений в атмосфере, содержащей кислород, неразрывно связано с образованием в их тканях активных форм кислорода (АФК) (ЬаЫ е! а1., 2006). АФК играют важную роль в регуляции метаболизма растений. В естественных условиях растительные организмы содержат АФК, но их количество возрастает под влиянием биотических и абиотических стрессов. АФК - одно из основных звеньев сигнальной системы, благодаря которой растения узнают об атаке патогена и активируют иммунный ответ (Тарчевский, 2002). Однако они обладают токсическим действием в отношении клеток растения и патогена, поэтому могут выполнять также функции непосредственного антиинфекционного агента (Аверьянов и др., 1978). В частности, одним из наиболее важных защитных механизмов растения против атаки патогенов является реакция сверхчувствительности, при которой происходит окислительный взрыв и образование АФК в токсических концентрациях (Уапаскег Qt а1., 2000; ТпуШо е! а1., 2006).

Особый интерес представляет исследование роли АФК в регуляции развития биотрофных патогенов. Биотрофный тип питания основан на взаимодействии с клетками живого растения-хозяина. Биотрофные паразиты выделяют в зараженные ткани растений биологически активные вещества, регулирующие метаболизм и имеют специальный трофический орган гаусторий (Дьяков и др., 2001). Возбудители мучнистой росы злаков Егутрке ^гатЪт являются типичными биотрофными паразитами. Они имеют несколько специализированных форм, паразитирующих на некоторых видах семейства Злаков {Роасеаг ВагиЬ.).

Исследования последних лет показали, что характер патогенеза мучнистой росы злаков также в значительной степени зависит от окислительного метаболизма. При инфицировании листьев злаков возбудителем мучнистой росы накопление АФК наблюдали как в клетках устойчивого растения (Zhou et al., 2000), так и при совместимом взаимодействии с патогеном (Huckelhoven et al., 2003). Накопление АФК происходило, как правило, в эпидермальных клетках растения в местах непосредственного взаимодействия растения и патогена.

Цель работы. Определение роли окислительного стресса в регуляции ранних этапов взаимодействия возбудителя мучнистой росы пшеницы и растения-хозяина. Для выполнения данной цели были поставлены следующие задачи:

1.Определить характер действия перекиси водорода и 3-амино-1,2,4-триазола на морфологические особенности инфекционных структур и развитие колоний возбудителя мучнистой росы в обработанных растениях в зависимости от концентрации и времени применения.

2.Выявить зависимость размеров и структуры гало в месте взаимодействия растения и патогена от концентрации исследуемых прооксидантов.

3.Выяснить возможность выявления гало методом сканирующей электронной микроскопии без использования окраски или фиксации.

4.0пределить характер регуляции направления роста аппрессориальной ростковой трубки при действии перекиси водорода.

Научная новизна работы. Впервые установлено изменение при окислительном стрессе размеров и морфологии гало в сайтах взаимодействия растения и патогена, показан многофазный характер концентрационной зависимости действия прооксидантов. Разработана методика, позволяющая наблюдать гало с использованием сканирующей электронной микроскопии без окраски или химической фиксации. Показано, что мучнисторосяный патоген на разных, стадиях развития имеет различную чувствительность к действию прооксидантов. Определен характер регуляции направленшг роста аппрессориальной ростковой трубки относительно эпидермальной клетки при окислительном стрессе. Впервые показано увеличение доли аппрессориев, растущих в поперечном направлении, под действием экзогенной перекиси водорода.

Практическое значение работы; Полученные данные расширяют представления о роли активных форм кислорода в патогенезе мучнистой росы. Показана патоген-ингибирующая активность соединений, индуцирующих окислительный стресс у растений. Размеры и особенности морфологии гало, а также направление роста аппрессориальной ростковой трубки могут быть использованы в качестве новых параметров диагностики состояния патосистемы в тестах на устойчивость.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на I Всероссийской молодежной научно-практической конференции ботаников в Новосибирске «Перспективы развития и проблемы современной ботаники» (Новосибирск, 2007); III Международной конференции молодых ученых "Биоразнобразие. Экология. Адаптация. Эволюция" (Одесса, 2007); Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века» (Петрозаводск, 2008); Международной конференции «Актуальные проблемы ботаники в Армении» (Ереван, 2008 г.); XXI Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твёрдых тел (Черноголовка Московской обл., 2009); 16th International Reinhardsbrunn Symposium on Modern Fungicides and Antifungal Compounds (Germany, 2010); Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них публикации в журналах,, рекомендованных ВАК — 1, материалы международных конференций - 3, всероссийских съездов, конференций - 4.

Заключение Диссертация по теме "Ботаника", Аветисян, Гаянэ Акоповна

Выводы

1. Обработка перекисью водорода и 3-АТА ингибирует развитие возбудителя мучнистой росы пшеницы и существенно сокращает число колоний патогена.

2. Размеры гало в местах контакта растения и патогена являются параметром, зависимым от действия прооксидантов. Обработка перекисью водорода приводит к появлению очень крупных гало с аномальной структурой. Концентрационная зависимость действия перекиси водорода и 3-АТА на диаметр большого и малого гало описывается многофазной кривой.

3. Благодаря изменению химического состава поверхности клетки и ее способности отражать электронный пучок в зоне контакта с патогеном возможно наблюдать гало с применением сканирующей электронной микроскопии без использования химической окраски и фиксации.

4. При использовании перекиси водорода и 3-АТА увеличивается доля аномальных инфекционных структур возбудителя мучнистой росы пшеницы.

5. Аппрессориальные ростковые трубки нормальной морфологии растут преимущественно в направлении вдоль эпидермальных клеток. Под действием перекиси водорода происходит изменение направления роста и увеличение доли поперечно направленных аппрессориев.

6. Выдвинута гипотеза о том, что одним из механизмов, приводящих к корреляции доли аномальных инфекционных структур и устойчивости растения, является протекание в клетке защитных реакций в форме окислительного взрыва.

Список использованных сокращений

АФК - активные формы кислорода;

СОД - супероксиддисмутаза;

02~- супероксидный анион-радикал;

СК - салициловая кислота;

НО2' - гидропероксидный радикал;

НО' - гидроксильный радикал;

Ог - синглетно возбужденный кислород;

Н202 - перекись водорода;

3-АТА - 3-Амино-1,2,4-триазол.

101

Заключение

О характере взаимодействия растения и патогена часто можно • судить уже на начальных этапах развития патосистемы, наблюдая процессы, прорастания* конидий и дифференциации- инфекционных структур. Рост мучнисторосяных грибов происходит преимущественно на поверхности эпидермальнон ткани растений-хозяев. Это позволило использовать для изучения роли окислительного стресса в регуляции ранних этапов взаимодействия данного патогена и растения-хозяина методы световой и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).

Окислительный стресс моделировали экзогенным применением перекиси водорода и 3-амино-1,2,4-триазола. Многие исследователи, изучавшие механизм действия перекиси водорода, отмечали, что предварительная обработка растений экзогенной перекисью водорода индуцирует устойчивость к патогену. 3-Амино-1,2,4-триазол, являясь действующим веществом препарата с гербицидной активностью, способствует повышению эндогенной перекиси водорода посредством ингибирования пероксидазы и каталазы. Проведенные исследования показали, что обработка прооксидантами оказывает действие на характер эктофитного развития возбудителя мучнистой росы пшеницы. При увеличении концентрации исследуемых веществ их ингибирующая активность возрастала, а высокие концентрации (5 мМ и более для перекиси водорода и 10 мМ и более для 3-АТА) полностью предотвращали развитие колоний патогена, что, возможно, явилось результатом повышения устойчивости пшеницы к возбудителю мучнистой росы.

Обработка перекисью водорода и 3-АТА приводила к ингибированию развития патогена. Перекись водорода способствовала увеличению доли аномальных аппрессориальных структур (длинных ростковых трубок). Особенностью действия 3-АТА было образование утолщенных коротких гиф; а часто большого числа укороченных зачатков гиф. В обоих случаях наблюдали появление конидий и с другими аномалиями, которые относительно редко встречались у необработанных контрольных растений. Полученные данные позволяют предположить, что одной из причин наблюдаемого ранее некоторыми исследователями аномального развития патогена на устойчивых растениях может быть воздействие активных форм кислорода; возникающих в устойчивом растении при прохождении защитных реакций.

Взаимодействие конидии с поверхностью растения-хозяина уже на ранних этапах патогенеза может иметь достаточно сложный характер. Регуляция преимущественного направления роста эктофитного патогена гормональной системой растения свидетельствует о возможном адаптивном характере этих процессов. Нами впервые было' показано, что перекись водорода способна регулировать направление роста аппрессориальной ростковой трубки. Все использованные концентрации приводили к достоверным изменениям соотношения различно направленных аппрессориев по сравнению с контролем. Продольное направление роста аппрессориальной ростковой трубки, характерное для необработанных листьев пшеницы, сменялось ростом поперек длинной оси листа на листьях, обработанных перекисью водорода. Направление роста аппрессориев в составе колоний соответствовало закономерностям, характерным для нормальных аппрессориев. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что обработка перекисью водорода вызывает снижение числа колоний возбудителя мучнистой росы. Это может свидетельствовать об уменьшении доли клеток, восприимчивых к патогену. Можно предположить, что уменьшение числа "таких клеток будет приводить к увеличению вероятности неблагоприятного для патогена первого контакта растения с клеткой растения-хозяина, и, следовательно, к увеличению вероятности поперечного роста.

Под действием прооксидантов изменялись структура и размеры гало. Показано, что зависимость диаметра гало от концентрации обоих исследованных соединений имела многофазный характер и включала один или два максимума, что указывает на сложное и часто неоднозначное влияние активных форм кислорода на процессы, происходящие в патосистеме. При обработке перекисью водорода наблюдали появление очень крупных гало, резко отличающихся по своей морфологии от гало в контроле. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования размеров и особенностей морфологии гало, а также направление роста аппрессориальной ростковой трубки в качестве новых параметров диагностики состояния патосистемы в тестах на устойчивость в селекционной работе и при поиске соединений с иммуномодулирующей активностью.

Явления, которые мы наблюдали при моделировании окислительного стресса обработкой прооксидантами, сходны с теми, которые ранее были известны для устойчивых растений. Это позволяет предположить, что причиной аномального развития патогена на устойчивых растениях может быть воздействие активных форм кислорода, возникающих в устойчивом растении при прохождении защитных реакций.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аветисян, Гаянэ Акоповна, Москва

1. Аверьянов A.A., Мерзляк М.Н, Рубин Б.А. Хемилюминесценция при окислении госсипола пероксидазой// Биохимия. 1978. Т. 43. С. 1594-1601.

2. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. Фунгитоксичность выделений листьев риса, обусловленная активными формами кислорода // Физиология растений. 1988. Т. 35. С. 1142-1151.

3. Аверьянов A.A. Активные формы кислорода и иммунитет растений // Успехи совр. биологии. 199i. Т. 111. С. 722-737.

4. Аверьянов A.A. Индуцированная болезнеустойчивость растений и активные формы кислорода / Материалы Всероссийской научно-практической конференции. 2006. С. 17-18.

5. Андреева В.А. Фермент пероксидаза: участие в защитном механизме растений. М.: Мир. 1988. 128 с.

6. Аронова Е.Е, Шевякова Н. И, Стеценко JT.A, Кузнецов В.В. Индукция кадаверином экспрессии гена супероксиддисмутазы у растений Mesembryanthemum crystallinum L // Общая биология. 2005. Т. 403. С. 131134.

7. Бабоша A.B., Рябченко А.С, Аветисян Т.В. Влияние экзогенных цитокининов на динамику развития и дифференциацию инфекционных структур возбудителя мучнистой росы пшеницы // Цитология. 2009. Т. 51. № 7. С. 602-611.

8. Бармин М.И, Мельников В.В. Новые амино-1,2,4-триазолил и тетразолил алканы / Монография. СПб: СПГУТД. 2002. 240 с.

9. Вавилов Н.И. Материалы к вопросу об устойчивости хлебных злаков против паразитических грибов // Тр. Селекц. станции при М. с/х институте. М. 1913. Вып. 1.С. 1-118.

10. Вандерпланк Я. Генетические и молекулярные основы онтогенеза у растений. М.: Мир. 1981. 236 с.

11. Горленко M.B. Болезни пшеницы. M.: Сельхозиздат. 1951. 350 с.

12. Граскова И.А., Антипина И.В., Потапенко О.Ю., Войников В.К. Динамика активности внеклеточных, пероксидаз суспензионных клеток картофеля при патогенезе кольцевойгнили // Общая*биология. 2004. Т. 399. G. 567-570.

13. Дьяков Ю.Т., Семенкова И.Г., Успенская Г.Д. Общая фитопатология с основами иммунитета. М.: Колос. 1976. 256 с.

14. Дьяков Ю.Т., Озерецковская O.JL, Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. Общая и молекулярная фитопатология. М.: Общество фитопатологов. 2001. 301с.

15. Дьякова Г.А. Фитопатологический словарь справочник. М.: Наука. 1969. 432с.

16. Зайцев Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной ботанике. М.: Наука. 1984.424с.

17. Каримова Ф.Г., Петрова Н.В. Влияние Н202 на фосфорилирование по тирозину белков гороха// Физиология растений. 2007. Т.54. С. 365-372.

18. Купер P.M. Изменения в ультраструктуре растений-хозяев, индуцированные патогенами // Борьба с болезнями растений: устойчивость и восприимчивость. М.: Колос. 1984. С. 105.

19. Лапикова В.П., Гайворонская JIM., Аверьянов A.A. возможное участие активных форм кислорода в двойной индукции противоинфекционных реакций растения// Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 160-162.

20. Ли С., Лю В., Ли Г., Гонг Я.-Д., Жао Н.-М., Жанг Р.-К., Жоу Х.-М. взаимодействие перекиси водорода с рибулозо-1,5дифосфаткарбоксилазой\оксигеназой из риса // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 13961403.

21. Лукаткин A.C. Вклад окислительного стресса в развитие холодового повреждения в листьях теплолюбивых растений. Образование активных форм кислорода при охлаждении растений // Физиология растений. 2002.Т. 49. С. 697-702.

22. Мишина Г.Н., Сережкина Г.В., Рашаль И.Д., Андреев Л.Н. Особенности развития Erysiphe graminis DC f. sp. 'hordei Marchai на листьях различных поустойчивости генотипов ячменя // Микология и фитопатология. 1988. Т. 22. С. 292-294.

23. Мишина Г.Н., Талиева М.Н., Бабоша A.B., Сережкина Г.В., Андреев JI.H. Влияние фитогормонов на развитие конидиального иноку'люма возбудителей мучнистой росы флокса и ячменя // Известия АН. Серия биол. 2002. № i.e. 74-81.

24. Неклеса Н.П. Мучнистая роса зерновых культур. // Защита и карантин растений. 2002. №5. С. 46-47.

25. Овчинникова З.Г., Демин В.И., Лебедев В.Б. Моделирование пораженности посевов пшеницы мучнистой росой в Нижнем Поволжье // Сб. н. работ. Саратовский с/х институт. 1993. С. 87-94.

26. Островская Л.К. супероксидный радикал при дефиците металлов и симптомах хлороза// Физиология и биохимия культ, растений. 1993. Т. 25. С. 107-113.

27. Пасечник Т.Д., Аверьянов A.A., Лапикова В.П., Коваленко Е.Д., Коломиец Т.М. возможное участие активных форм кислорода в проявлениях вертикальной и горизонтальной устойчивости риса к пирикуляриозу // Физиология растений. 1998. Т.45. С. 433-441.

28. Рябченко A.C., Аветисян Т.В., Бабоша A.B. Особенности роста возбудителя мучнистой росы пшеницы вдоль и поперек длинной оси листа под действием экзогенного зеатина // Известия АН. Сер. Биол. 2009. № 5. С. 1-13.

29. Сахабутдинова А.Р., Фатхутдинова Д.Р., Шакирова Ф.М. 2004. Влияние салициловой кислоты на активность антиоксидантных ферментов у пшеницыв условиях засоления // Прикладная биохимия и микробиология. Т. 40. С. 579-583.

30. Сережкина Г.В., Андреев Л.Н;, Мишина Г.Н. Значение адгезии во взаимоотношениях паразита, и растения- хозяина при облигатном паразитизме//Известия АН. Серия биол. 1990. №1. С. 149-Г53.

31. Сережкина Г.В., Андреев Л.Н. Роль мембранных структур в межклеточных взаимоотношениях при ржавчиной и мучнисторосяной инфекции // J. Russ. Phytopathol. Soc. 2000. V. 1. P. 21 29.

32. Синицина Ю.В. Фотохимическая активность и перекисный гомеостаз в хлоропластах растений при гипертермическом воздействии. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Нижний Новгород. 2002. 23 с.

33. Талиева М.Н., Филимонова М.В., Андреев Л.Н. Вещества с цитокининовой активностью возбудителя мучнистой росы флокса Erysiphe cichoracearum DC. f. phlogis Jaez. // Известия АН. Серия биол. 1991. № 2. С. 194-200.

34. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. М.: Наука. 2002. 294 с.1

35. Турпаев К.Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов // Биохимия. 2002. Т. 67. С. 339-352.

36. Урбах В.Ю. Биометрические методы. М: Наука. 1964.

37. Хайруллин P.M., Яруллина Л.Г., Трошина Н.Б., Ахметова И.Э. Активация хитоолигосахаридами окисления орто-фенилен диамина проростками пшеницы в присутствии щавелевой кислоты // Биохимия. 2001'. Т. 66. С. 354-358.

38. Часов A.B., Гордон Л.Х., Колесников О.П., Минибаева Ф.В. Пероксидаза клеточной поверхности генератор супероксид-аниона в корневых клетках пшеницы при раневом стрессе // Цитология. 2002. Т. 44. С. 691-696.

39. Чижова С.И., Павлова В.В., Прусакова Л.Д. Содержание абсцизовой кислоты и рост растений ярового ячменя под действием триазолов // Физиология растений. 2005.Т. 52. С. 108-114.

40. Шервуд Р.Т., Вэнс К.П. Первичные изменения в клетках эпидермиса при проникании паразита // Инфекционные болезни растений. М.: Агропромиздат. 1985. С. 34-53.

41. Юрина Т.П., Умнов В.А., Караваев В.А., Солнцев М.К. Влияние мучнистой росы на физиологические процессы в листьях пшеницы // Физиология растений. 1992. Т.39. С. 270-275.

42. Юрина Т.П., Юрина Е.В., Караваев В.А., Солнцев М.К. Влияние условий минерального питания на устойчивость пшеницы к мучнистой росе // Физиология растений. 1993. Т. 44. С. 64-67.

43. Ячевский A.A. Ежегодник сведений о болезнях и повреждениях растений. Спб. 1909. 163 с.

44. Able A.J., Guest D.I., Mark W. Sutherland M.W. Hydrogen Peroxide Yields during the Incompatible Interaction of Tobacco Suspension Cells Inoculated with Phytophthora nicotianae I I Plant Physiology. 2000. V. 124. P. 899-910.

45. Ahn I-P. Glufosinate Ammonium-Induced Pathogen Inhibition and Defense Responses Culminate in Disease Protection in bar-Transgenic Rice // Plant Physiology. 2008. V. 146. P. 213 227.

46. Aist J.R. Papillae and Related Wound Plugs of Plant Cells // Annual Review of Phytopathology. 1976. V. 14. P. 145-163.

47. Al-Taweel K., Iwaki Т., Yabuta Y., Shigeoka S., Murata N., Wadano A. A Bacterial Transgene for Catalase Protects Translation of D1 Protein during Exposure of Salt-Stressed Tobacco Leaves to Strong Light // Plant Physiology. 2007. V. 145. P. 258 265.

48. Albury M.S., Affourtit C., Crichton P.G., Moore A.L. Structure of the Plant Alternative Oxidase. Site-directed Mutagenesis Provides New Information on the Active Site and Membrane Topology // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 1190-1194.

49. Allan A. C., Fluhr R.Two Distinct Sources of Elicited Reactive Oxygen Species in Tobacco Epidermal Cells // Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1559-1572.

50. Allen P.J., Goddard D.R. A respiratory study of powdery mildew of wheat // Am. J, Bot. 1938. V. 25. P. 613-621.

51. Alscher R.G., Erturk N., Heath L.S. Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants // J. Exp. Bot. 2002. V. 53. P. 1331 1341.

52. Altman S.A., Solomos T. 3-Amino-l,2,4-triazole, a Catalase Inhibitor, Prolongs Carnation Vase Life // HortScience. 1990. V. 25. P. 1127.

53. Altman S.A., Solomos T. 3-Amino-l,2,4-triazole Prolongs Carnation Vase Life // HortScience. 1993. V. 28. P. 201-203.

54. An Z, Jing W, Liu Y, Zhang W. Hydrogen.peroxide generated by copperamine oxidase is involved in abscisic acid-induced stomatal closure in Vicia faba // J. Exp. Bot. 2008. V. 59. P. 815 825.

55. Andersen J.B, Torp J. Quantitative analysis of early powdery mildew infection stages on resistant barley genotypes // J. Phytopathol. 1986. V. 115. P. 173-186.

56. Angelini R, Tisi A, Rea G, Chen M.M, Botta M, Federico R, Cona A. Involvement of Polyamine Oxidase in Wound Healing // Plant Physiology. 2008. V.146. P. 162-177.

57. Apostol I., Heinstein P.F, Low P.S. Rapid Stimulation of an Oxidative Burst during Elicitation of Cultured Plant Cells: Role in Defense and Signal Transduction // Plant Physiology. 1989. V. 90. P. 109-116.

58. Asada K. Ascorbate peroxidase a hydrogen peroxide-scavenging enzymes in plants Physiol. Plant 1992. V. 85. P. 235-241.

59. Asada K. The water-water cycle as alternative photon and electron sinks // Phil Trans R Soc B. 2000. V. 355. P. 1419 1431.

60. Asada K. Production and Scavenging of Reactive Oxygen Species in Chloroplasts and Their Functions // Plant Physiology. 2006. V. 141. P. 391 396.

61. Ashby A.M. Biotrophy and the cytokinin conundrum // Physiological and Molecular Plant Pathology. 2000. V. 57. N 4. P. 147-158.

62. Auh C. K., Murphy T. M. Plasma Membrane Redox Enzyme Is Involved, in the Synthesis of 02- and H202 by Phytophthora Elicitor-Stimulated Rose Cells 7/ Plant Physiology. 1995. V.107. P.' 1241-1247.

63. Avon*A.J. The genera of fungi sporulation in pure culture // Jena. 1979. 288 p.

64. Baek K-H., Rajashekar C.B. Hydrogen Peroxide Reduces Hypoxia in Germinating Bean Seeds // HortScience. 2000. V. 35. P. 427 428.

65. Baker C.J., Orlandi E.W., Mock N.M. Harpin, An Elicitor of the Hypersensitive Response in Tobacco Caused by Envinia amylovora, Elicits Active Oxygen Prodùction in Suspension Cells // Plant Physiology. 1993: V. 102. P. 1341-1344.

66. Bartoli C.G., Gômez F., Martinez D.E., Juan José Guiamet J.J. Mitochondria are the main target for oxidative damage in leaves of wheat (Triticum aestivum L.) //J. Exp. Bot. 2004.V. 55. P. 1663 1669.

67. Bayles C.J., Ghemawat M.S., Aist J.R. Inhibition by 2-deoxy-D-glucose of callose formation, papilla deposition, and resistance to powdery mildew in an ml-o barley mutant // Physiol. Mol. Plant: Pathol. 1990. V. 36. P. 63-72.

68. Belanger R.R., Bushnell W.R. The Powdery Mildews: A Comprehensive Treatise. 2002. St. Paul, MN: APS Press.

69. Bernard D.G., Gabilly S.T., Dujardin G., Merchant S., Hamel P.P. Overlapping Specificities of the Mitochondrial Cytochrome c and cl Heme Lyases //J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 49732-49742.

70. Bestwick C.S., Brown I.R., Bennet M., Mansfield J.W. Localization of Hydrogen Peroxide Accumulation during the Hypersensitive Reaction of Lettuce Cells to Pseudomonas syringae pv phaseolicola // Plant Cell. 1997. V.9. P. 209221.

71. Bestwick C.S., Brown I.R., Mansfield J.W. Localized Changes in Peroxidase Activity Accompany Hydrogen Peroxide Generation during the Development of a Nonhost Hypersensitive Reaction in Lettuce // Plant Physiology. 1998. V. 118; P. 1067-1078.

72. Biehler K., Fock H. Evidence for the Contribution of the Mehler-Peroxidase Reaction in Dissipating Excess Electrons in- Drought-Stressed Wheat // Plant Physiology. 1996. V. 112. P. 265-272.

73. Biemelt S. Re-Aeration following Hypoxia or Anoxia Leads to Activation of the Antioxidative Defense System in Roots of Wheat Seedlings // Plant Physiology. 1998. V. 116. P. 651-658.

74. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K.V. Antioxidants, Oxidative Damage and Oxygen Deprivation Stress //Ann. Bot. 2003. V. 91. P. 179-194.

75. Borghouts C., Werner A., Elthon Т., Osiewacz H.D. Copper-Modulated Gene Expression and Senescence in the Filamentous Fungus Podospora anserine //Mol. Cell. Biol. 2001. V. 21. P. 390-399.

76. Bouvier-Nave P., Berna A., Noiriel A., Compagnon V., Carlsson A.S., Banas A., Stymne S., Schaller H. Involvement of the Phospholipid Sterol Acyltransferase 1 in plant sterol homeostasis and leaf senescence // Plant Physiology. 2010. V. 152. P. 107-119.

77. Bowler C., Alliotte Т., Van Den Bulcke M., Bauw G., Vandekerckhove J., Van Montagu M., Inze D. A Plant Manganese Superoxide Dismutase is Efficiently Imported and Correctly Processed by Yeast Mitochondria // PNAS. 1989. V. 86. P. 3237-3241.

78. Brown W., Harvey C.E. Studies in the physiology of parasitism. On the entrance of parasitic fungi into the host plant // Ann. Bot. 1927. № CLXIV. P. 643662.

79. Burritt D. J., Mackenzie S. Antioxidant Metabolism during Acclimation' of Begoniaxerythrophylla to High Light Levels // Ann. Bot. 2003. V. 91. P. 783-794.

80. Bushnell W.R., Bergquist S.E. Aggregation of host cytoplasm and the formation of papilla and haustoria in powdery mildew of barley // Phytopath. 1975. Y. 65. P. 310-318'.

81. Bushnell W.R., Bergquist S.E. Aggregation of host cytoplasm and the formation of papilla and haustoria in powdery mildew of barley // Phytopath. 1975. V. 65. P. 310-318.

82. Cakmak I., van de Wetering Dj A. M., Marschner H., Bienfait H.F. Involvement of Superoxide Radical in Extracellular Ferric Reduction by Iron-Deficient Bean Roots // Plant Physiology. 1987. V. 85. P. 310-314.

83. Cakmak I., Marschner H. Enhanced Superoxide Radical Production in Roots of Zinc-Deficient Plants // J. Exp. Bot. 1988. V. 39. P. 1449-1460.

84. Cakmak I., Marschner H., Bangerth F. Effect of Zinc Nutritional Status on Growth, Protein Metabolism and Levels of Indole-3-acetic Acid and other Phytohormones in Bean (Phaseolus vulgaris L.) // J. Exp. Bot. 1989. V. 40. P.405-412.

85. Casano L.M., Martin M., Sabater B. Hydrogen Peroxide Mediates the Induction of Chloroplastic Ndh Complex under Photooxidative Stress in Barley // Plant Physiology. 2001. V. 125. P. 1450-1458.

86. Casati P., Walbot V. Gene Expression Profiling in Response to Ultraviolet Radiation in Maize Genotypes with Varying Flavonoid Content // Plant Physiology. 2003. V. 132. P. 1739-1754.

87. Chamnongpol S., Willekens H., Moeder W., Langebartels C., Sandermann H;, Van Montagu M., Inze D., Van Camp W. Defense activation and enhanced pathogen tolerance induced by H202 in transgenic tobacco // PNAS. 1998. V. 95. P. 5818-5823.i

88. Cheeseman J.M. Hydrogen peroxide concentrations in leaves under natural conditions // J. Exp. Bot. 2006. V. 57. P. 2435 2444.i