Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Цитобиологические и анатомо-морфологические признаки эндосперма риса в их связи с хозяйственно-ценными свойствами растений в целях создания новых и совершенствования существующих методов и приемов селекционно-семеноводческой работы

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Цитобиологические и анатомо-морфологические признаки эндосперма риса в их связи с хозяйственно-ценными свойствами растений в целях создания новых и совершенствования существующих методов и приемов селекционно-семеноводческой работы"

ВСЕСОЮЗНЫЙ МУЧНО-ИСОЩОМТЕЖКИЙ ИНСКОТТ ГЛСк

. Ш: /577Л+581.414631.52+631.53/: 633.18 '. ■

на правах рукописи ^

Лес эдев Евгений Владимирович )

Цитобиохкшческие и анатомо-морфрлогическяе прйзнаки эндосперма риса в их связи с хозяйственно-ценнши. свойствами растений в целях создания новых и совершенствования существующих методов и приемов селекционно-семеноводческой работа.

/05.01.СБ "Селекция и семеководствопполевых,включая яорцогне, плодовых и сводних культур/

Диссертация в форме научного доклада на сспсканне ученой степени кандидата биологических наук.

Краснодар 1952

Работа выполнена в лаборатории биохимии и молекулярной биологии Всесоюзного научно-исследовательского института риса в 1983-1992 г.г.

Научный рукоаадктвль-член-корреспондент Академии Технологичес ких Наук Российской Федерации Николай Евгеньевич Алешиа Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,профессор Щубич Моисей Григорьевич, кандидат сельскохозяйственных наук,с.н.с. Мазур Тамара Георгиевна-.

.Ведущее предприятие:опытная станция Кубанского Государствен-

• ного Аграрного Университета

Зав(ита состоится пХ9п ¿¿-¿оМ-Р 1992г. на заседании специализированного Совета К.020.66.01 Всесоюзного научно-исследовательского института риса 353204,Краснодар,п/о Белозерное.

С диссертацией макно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института риса.

. Диссертация разослана "" 1992г.

Ученый секретарь спецнагизированиого Совета, нандида-? селъснохозяйстведннх

наук • | ^ Кодцани ГЪлина Николаев!

-г-

Х.ОБРДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. в1с-ва;шойший хлебныЛ злак планета. Мировые площади под рисом составляют ~ 144 млн.га.Валовое производство риса достигло — 440 млн.т.,а урожайность--30,5 ц/га. 3 сачэи с постоянном ростом населения планеты,ФАО считает,что к 2000 году производство риса должно бнть увеличено в полтора раза.Б проплом Россия вынуздена была импортировать рис.В настоящее время потребность в нем в значительной степейи покрывается отечественным производством.^альнейпее развитие рисоводства необходимо для достижения полной независимости от импорта.Ребенке зтсй проблеш,кая в мировом,так и в отечественном масштабе возмсзло лизь пси- совершенствования существугацих методов и приемов салекниснно-семеноводческой работы с целью выведения новых шсокоуразайных сортов с хозяйственно-ценными свойствами.Такое г.олетенча дел связано с тем,что,по данным нескольких международных срганязацкй.дальнейиеэ экстенсифицирование производства гкса кевозмояно.гак как затруднено освоение ноеых плосздей. Кнтенсиккыа технологии,ко тем не данным,также не могут быть рас-©гр?км на ковке плсетда э свази с нехваткой ресурсов.единственна» гкхояои вядаетея создание принципиально новых форм" риса на основания новая- наукоемких метсдоз селекции /биотехнологочес-кмх, гистолпгиче::;^::,'. гесгоОкохммичесхих,цитологических/.

1.2.Паль к задача исследований.Целью настоящей работы явилось Еосполнениа пробела Российских исследования в этой области селекции и семеноводства,создание новых методоз оценки исходного материала риса для селекции»а таете получения улучшенного се-

!«'ЭННОГО ИГ1Т4'I

3 ходе решен-т этих аадая разработаны следующие положения, вынссикыб на эа^-гу.

1.Распределение белка в эндосперме риса является важнейшим се-■лекционным показателем.

2.Созданная нами классификация белковых структур,распределенных в эндосперма риса,превосходит По своим показателям существовавшие ранее зарубежные /М.С.Сваминатан и др./ и отечественные /Н.П.Красноок и др./iклассификации.

3.Характеристики алейроновых зерен являются важным селекционным показателем,позволяющим прогнозировать процесс заполнения эндосперма при созревании и процесс утилизации ендосперма при про-" растении семян. '

4.Предложенный наыи метод выделения алейроновых зерен

/A.C., 5?! 117013/ наиболее пригоден для целей оценки исходного материала. '

З.Оеникация риса позволяет растении более интенсивно заполнять ~ внутренние незаполненные лакуны эндосперма,тем самым,формируя, более полноценные и качественные семена. . -

5.Феномен превращении стекловидных зерновок риса' в мучнистые при длительном хранении или искуственном старении,открытый А.И.Апродои, имеет своей биологической сущностью деструкцию белковых таи.амилопластов и крахмальных зёрен.Таким образом,стекло- • видность зерна,как селекционный показатель,имеет, динамическую прирсду-иэмекяется во времени.

1.3. Научная новизна. Результаты,изложенные в' диссертации,характеризуется двум уровнями новизны-мировьм и отечественным.' "■ Впервые в мире создана полная классификапу.л распределения белок-содержыцих структур в эндосперме зерновок риса,превосходящая существовавшие до сих пор аналоги,которые характеризовались гораздо иеньией щ{формативностьзо;по!®зана селекционная значимость харак-

теристики алейроновых зерен;описана локализация ферментов,в тш числе арилациламидазы,з алейрокошх зернах;описан феномен почкования алейроновых зерен;создан приоритетный метод их выделения; вскрыты механизмы изменения качества семян при формировании, в том числе во время сеникации и хранении. Впервые в России исследовано распределение белоксодеряадкх структур в эндоспермах отечественных сортов риса,

1.4.Практическая ценность работы.На основании предложенных б диссертации методов проанализирована коллекция образцов риса" отечественной селекции из которых вкделекы и рекомендованы в качестве доноров наилучшего распределения белка в эндосперме три формы:мутант Алексеенко /включен ео многочисленные 'скрезмва-ш!й з селекцентре ЕКИЕрпсаЛсорт Кальпп,одна из линий,входящая в состав сорта Краснодарский 424,на основании которой группой авторов /£J. П. Алезии, А.Й.Апрсд, З.И.Еаллод, К.Е.Алешин и др./ создан сорт риса Краснодарский Е6, -»айонированный с 1990г.' Селекционера« реяомекцоБ&нс нести отбор ка определенный тип распределения селка,а таето ка повышение количества и крупности алейронозкх зёрен.Селекционерам рекомендовано учитывать,что сте-кловидность зерна является показателем динг^яческим.Обоснована необходимость применения сеникации для получения высококачественных семян.Для повышения массовости исследования образцов селекционного метериала с помощью электронного микроскопа разработан специальный метод нанесения пленок-подложек для образцов на опорные сетки /A.C. ¡Я599125,официально внедрено в народное хозяйство России через Госкомстат/.Способ позволяет на порядок повысить колическво анализируемых образцов.

1.5.Апробация работы.Результаты работы были доложены на: Всесошной конференции по субтропическим культурам /г.Махарад-эо,1965/;Всесоюзном симпозиуме по биологии семян /г.Душанбе, 1988/¡Всесоюзных конференциях ::о рису /во НМИриса, I9S4, Г9£5, 19еб/2доклада/,1937,Ю09/;на 15 региональных конференциях, заседаниях научных обществ и т.д. в 1982-1992г.г.

1.6. Публикация результатов исследования.По материалам исследовании опуо'лнковано 10 научных трудов /1-18/, в том числе два изобретения A.C. В? III70I3, A.C. № 159ЭГ25. , одно из них официально внедрено в народное хозяйство России.Креме этого разработано шесть рационализаторских предложений /19-24/.

1.7.0бьем работы. Диссертация изложена наХ5 машинописных страницах и содержит приложения,вкличаящие 2-2-.% микрофотография.

2. УСЛОВИЯ ПРОВЗДШИЯ ИССЭДОВАКИЛ, МАТЕРИАЛ И ШГОДЦ 2.1. Условия опыта,обьектн исследований. Сбьектом исследования служили зерновки риса 20 следухк(их сортоз и мутантов .-Краснодарский 424, Краснодарский 66, Кубань 3, Альтаир,Горизонт,Донской 63, Донской 402, Дунай, Зерноградский, Кубань 5, Кулон, .Чалки, Солнечный, Спальчик, Старт, ¡ССплейныи, Кемчукньгй,мутант Алексе-енко,альбиноски!5 мутант Спальчика, мутант Шиловского. Для исследования процессов формирования семян риса по общепринятой методике внрааизали вегетационным методом.Для определения возраста зерновок цветочные чешуи окрашивали различными красками во время цветения и по цвету отсчитывали количество дней после цветения. Зерновки отбирали начиная с 3-!5дне~ного возраста до 45днев-ного,через каждые 5 дней.

2.2. "етоди лабораторных исследований. Для исследования использовали собственные мйтодц: A.C. л- 11170I3 /5/-Способ выделения

алейрокоЕНх зерен,основанный на заливке кусочка кщссперма в -гелатин с последующим ультракпфотоыироваянец. A.C. (5 1599125 /18/- Способ нанесения полимерных пленок-подложек на спорные • сетки для электронной микроскопии,сокращающий на поредок скорость -одной из операций при препаративной подготовке тканей. Рационализаторские предложения приспособление для переноса полутени;« срезов с поверхности жидкости ванночки стеклянного нона ультрамикротома на предметное стекло с использование« волосяной петля /19/; приспособление к шкротону МС-2 для получения полутонких срезов.Приспособленке позволяет на обычном санном микротоме получать полутонкие срезы с больших поверхностей эндоспермов зерновок,залитых в спон-аралдитовые компаунды, с помощью стеклянного нога /3,20/; Устройство для точной дозировки компонентов эпоксидных смол при составлении заливочннх компаундов .Предложено для полного удаления компонентов из иер- . тах пипеток использовать компрессор неболвшой-мощности /3,21/; Зпособ получения микросподограш для выявления кремния в цвет-, <обых чешуях зерновок риса,основанный на помещении рх ыеяду дву-

ля предметными стеклами до легкого-их спекания в муфельной печи

t * ■ * . '22/; Устройство для хранения сеток-'подлоасек с ультратонкими

:резами для электронной микроскопии,предлагающее нанесение на

шпкую ленту укрепленной на тонкой стеклянной пластине кусочков

[еррорировзнного материала.Сетки торцом вклеивается в отверстия

[ерфорации. Полученный контейнер помечается в закрывающуюся

[робирку /23/; Приспособление для коррекции фотопластин /24/.

>но позволяет получать стеклянные фотопластикн лунного размера

ля электронного микроскопа,т.к.существует несколько стандартов

емок для кассеты микроскопа BS- 613 /ЧССР/.

Крсмэ з-того использовали разработки других ученых,а именно: для общих морфологических исследований "толстые" срезы окрашивал;! кислым гематоксилином по флиху.Полутонкие эпон-араддито-вые срезы окрашивали тотально ыетиленовым голубым с докрасксй фуксином основным,предварительно разрыхляя срезы ксилолом по У шелк. Такая окраска такие прекрасно выявляет белковые тела.

Еелок з "толстых" срезах выявляли с помощью реакции сулема-бромфеноловый синий по Еонхегу.Для электронной микроскопии: фиксация WEirapoLcM альдегидом и осмиевой кислотой с последующим контрастированием срезов на сетках уранилацетатом и цитра,-том свинца по Рейнольдсу. "

Аминокислоты в "толстых" срезах определяли с помощью гекса-зониевой реакции по Даниели в модификации Шубича .

ЛИпида определяли с помощьи жирорастворимых красителей-судана черного Б,смеси суданов III и 1У, нильского голубого, 3,4бенз- • пирена ,з растворе кофеина,осмиевой кислоты.Для контроля извлекали липиды пиридином при комнатной температуре.

Фосяюлипиды в тканях эндосперма окрашивали оранжевым К в смеси с неспецифическим красителем анилиновым синим по Дг-енсену. Специфичность окраски фосфолипидов и вдетификацию фракций их проводили с помощью тонкослойной хроматографии.

Крахмал, в полутонких срезах определяли с помощью реакции Инфф-иодная кислота /ШИК-реакция по Мак-»!анусу/.

Ферменты.Для выявления липазы пользовались методом Гомори; в качестве субстрата служил "твин 80",а также эабуференный раствор oL- нафтилацетата с диазосоединением-прочным синим Б.

Щелочная (Ьостотаза выявлялась методом Гомори с применением солей тяжелых металлов и глицерофосфата,находящихся в инкуба-

;ионной среде.

Аминопепткдазу М или арилациламинопептидазу определяли с- при-знением метода одновременного азосочетания по Нахласу и др. в унификации Лойда.В качестве субстрата использовали ¿-лейцил-гетокси-нафтиламид.

Микроскопические исслечоваяияпроводились на световых микроско-1хУУ-2Е/ГДР/,"Еиалар" с фазово-контрастной приставкой /Польша?, Й-У15.1. /СССР/,ультрафиолетовом микроскопе "№№'." /СССР/ и [ектронном микроскопе "Tejía" BS-6I3 /ЧССР/. 2.3.Математическая обработка 'данных,полученных в результате ¡следований проводилась методом стереометрического регрессион-' го микроанализа по Салтыкову С.А. /1976/.Данные для анализа лучали'с помощью микрометрического анализа по Наумову Н.Д. и. злову В.Е. /1954/,а также с помощью сканирования микрофотогра-й полутонких срезов. Обработку данных проводили на ЭВМ СМ-1800.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ■ Л.Распределение белка в эндосперме риса-важнейщий селекционный показатель.,

звестные советские селекционер« и.семеноводы риса /Красноок Н.П. ' 971, Сметанин А.П.,1975, Апрод А.Й., 1983, Дзюба ВД.,. 1987 белковость семян риса рассматривают как важнейший селекцион-1гЛ показатель. Так ке считает и международный институт риса

^М^Ов-ЧЗ^ 1975/. Однако,до сих пор селекция на этот признак носит очень проти-оречивкй характер и практически не дает результатов.Одинаковые о белковости сорта по разному передаит этот признак по наслед- . гзу.Причины этого неясны,что делает практически невозможным оправленную селекцию в этом направлении.

Еам удалось установить /4^6,12,14,17/,что причиной гтой ситуации является определение исследователями общего содержания белка в зерназкз или крупе без учета элементов распределения белка э ендосперках зерновок.Белок не в эндоспермах зерновок распределен нз гоаогенно.Он образует разнообразные структуры:тканевого, глоточного к субклеточного характера. Эти структуры иыездг особые генетические систелаг.Нами установлено,что основная часть белка гвдосперма содержится в латеральных сторонах паренхимы.Следо-ва?одьно,для направленной селекции на белковость селекционер долзеа кв только знать процент белка в зерновке риса,но я иметь ясное представление о том,в каких структурах этот белок сосредоточен,» как зти структуры наслвдуются.Напрж,!ер,каы удалось показать, что ядра клеток алейронового слоя сохраняются во время соарсванилхранения»вплоть до прорастания;ядра клеток субалейро-яового слоя и крахмалистой паренхимы обнаруживаются вплоть до окончания модочно-восковой спелости ¡; далее они редуцируются. Существенный доказательством нашего тезиса является открытая нами природа алейроновых зёрен.

.3»2.Кпасск$икац11я белковых структур эвдосперма риса В гвдосперыз риса наш опнеаш /4,6,12,14,17,16/ следующие бе-локсодеркацие структура:алейроновые зёрна/пввду их особой природа, рассиотрение в п.3.3./;днффузкая белковая сеть /тканевая мно-гоЮ1С-!;стлал' структура синцитиального типа/; белковые "карманы" /клеточные структуры компактного типа,состоящие кз клеток, обо,-шцежшх белковали телами/; отдельные богатые белком клетки в глубине крахмалистой паренхимы;отдельные белковые тела. Всзго в субалейроноЕО« слоо и в крахмалистси паренхиме обнаружено два типа белковых тол.Первый тип-кристаллические.Второй тип

подразделяется на два класса ,а именно,первый класс:большие сферические белковые тела/синогаш:болытз саровидккз белковые тела/; второй класс:малые сферические белковые тела/синоним:малые Еаро-видные белковые тела/.На основании описанных структур ками создана классификация распределения белка з эндосперме зерновок риса. Она учитывает наличие упомянутых структуру нагое следующие их характеристики:обогащенность белковой сети белком,глубина её проникновения_в эндосперм,наличие п количество белковых "карманов",их величина и слойность,наличие отдельных клеток,богатых белком в глубине крахмалистой паренхима,равномерность распределения белка в эндосперме.В результате систему распределения белка в эндосперме мозно представить следующим образом: А-наличие диффузной белковой сети и а глубине крахмалистой па-ренхк£н ,

А^богатая белком

А2~беднай белкой , • '

А^-отсутствие белковой'сети - . . ".

В-глубина проникновения диффузной белковой сети в эндоспррм В^-глубокая • :

3^-средняя „ :•

В^-слаба!

С-на,-"-парчаноз" с беляонд® телами

Сх-мнсго :

С^-мало

и -единичной

'-^-с-гсутсггле

Д-величяна "карыаное" ,

Д^-большид *

2

Д-средкш

Д^-гкаше

•д^-отсутстЕяа

Б-слойноетьпкармаяоз"

Е^-многослойные;

Е^-деуслойные

^-шогослойные

ЕР-отсутствио ' - .

Г-калич^е отдельных клеток,богатых белком в глубине крахмалис-- . той-паренхиш эндосперма. • . • Р^-ШрГО ; .. Л 1 .

'• Й-моло • ; г^ ' '

^-отсутствие " . • -

.СЗ^-равномерность распределения' белка в эндосперме

т ' " * ' -

О-равномерное /хорошее/ ■

(^-равномерное /среднее/ С^-нераЕноиерноо /плохое/ .

В соответствии о приведенной схемой каздсму сорту,мутанту или другой форме ри.оа может быть-приписана определенная формула'распределения белка.Оптшальной формулой,при этом,является следующая: А1В1С1Д1ЕГР1^

Из 20 проанализированных сортов и мутантов наиболее близки, к оптимальной формуле следуедке лят .'и:-. ;з«еака,Краснодарский 86,Малыш* -'..'■';•■'. ■. -

Сзодная таблица эмпирических формул описывает« распределение . белка в зндсспериах изученных сортов и мутантов раса

КЗ п/п Сорт Мутант Формула распределения белка

- I Путях ■ Алекс есшсо А^дадад......

2 ■ * ■ йалыш ' : •А^С1Д2г3Е?¥с1- ......

3 Краснодарский 65 А^С^Е0!*7^-' .

' -4 Краснодарский 424* Палиморфичен,представлен,по неньп'ей • мере»семыэ вариантами .' '

5 ■ Горизонт ' А2В2С7Д1"3Е2~%2&г .....

6 Старт А2ВЗСРД°Е0р°а2-3:

? } Кулон

1 8 Зерноградский ' - -- -

о %-нгЯ Л1В1"2С3Д3£3Р1С-г

10 Цуг ант Енл-гзского

II Донской 402

1 ^ ■ » " Сорт 1 _

5 | { Формула распределения белка

| п/п | -■ Цутант (

4--|----1-%-г-

! 12 |Кубань 3. . Г / А^С^Е1"1^ 4-1-_4—.--:—

| 13 | Спальник ; | А^С^Е3^

!----:—-4-:-

| 14 | Жемчужный | " А2В3С2Д2~3Ег~3Р1С?

-й ¡Альтаир ■ "г

'в |длвбшгосный мутает 1Спальчика '. ! А2ВэС1Д2~3ЕэР°С? . .

Г7 • • ГДокской 63 • ! . . ^ А^С^Е^СЗ-3 ' ' ; * .

18 . 3 • • 1 Солнечный . ? . А^сЗ^Е3?2^3 - -

- ,!,Кубааь 9 ' Ц----- А2В2СгД1_3Е1"2Р°С? -. • —;-:-

•[20 {Юбилейный - ] А^^С^Е3^3'

* Предложенная классификация превосходит классификацию,создан-' . нув выдающимся селекционером современности М.С.Сваминатаном /1939/,т.к. он не знал о существовании элемента Г-наличии отдельных клеток богатых,белком в глубине крахмалистой паренхимы,а такие не учитывал полиыорфность элементов А,В,С,Д,Е, считая их моно-корфньш.Отечественное.система классификации распределения белок-содэрааврос структур вообще ке идут ля а как-!" сражение с предзд-• денной "нами .системой. •-

Ограничшся двумя примерами: Л.П.С&етанкк /1975/ звделкл 3 .типа зерновок : обогащенные беля ом с плохими технологическими качествами,оптимально обогащенные белком и бедные белком.Но ; какова природа оптимума ему было неизвестно.Н.П.Красноок /1;.;?3/ и её последователи строили свою систему исключительно на якобы, совершённом ими открытии особого типа белковых тел-вакуоляр-ных.Нам удалось показать,что это открытие является артефактом /14/.За белковые тела был принят неудаленный ор среза осадок цитрата свинца. ' '

Итак,зарубежные и отечественные классификации белоксодерна-щих структур существенно уступают разработанной нами классификации. С помощью последней была идентифицирована одна из линий сорта Краснодарский 424,легшая з основу нового районированного сорта Краснодарский 86 /1986/.Кроме того был идентифицирован мутант Алексеенко,который вклхчен во многочисленные скрещивания во ВШШриса. . ' ;

3.3.Характеристика алейроновых зёрен риса валснейший селекционный показатель.■ Нами впервые установлено/8,П/:на поверхности алейроновых зёрен локализована арилациламидаза /ашнопептидаза М,аминопеп-тидаза вдкросомная,аминопептвдаза связанная с част газами,мембранная аминоПептидаза I,классификационный намер-3,4, П.2/.Амино-пептидаза-ферчент обуславливающий устойчивость риса к арилацил-амидным гербицидам,препятствующий проникновению остатков гербицидов в крахмалистую паренхиму.Здесь же локализован фермент липаза.На поверхности алейроновых зёрен отсутствует щелочная фосфотаза /локализована только в эндоплазматическом ретикулуые/; химотрипсиноподобный фермент А5-Д эстераза.

Арилациламидаза разрушгл арилациламиды контролирует биосин- * тез клеточных стенок в форшрукцихся эндоспермах /образутацие-ся арилы-материал для клеточных стенок,а ацилы-топливо для дыхания/.Зтаза алейроновых зёрен регулирует липидный метаболизм при формировании зерновок.Обращенное действие названных ферментов^ такяе внутренних ферментов алейроновых зёрен-один из основных механизмов регуляции распада запаса эндосперма при прорастании семян.Поэтему,характеристики алейроновых зёрен являются важнейшим селекционным показателем,т.к. они определяют процессы созревания и прорастания,а кроме того,сами по себе .являются белок-и фитинзапасаящими структурами,имеющими пищевую ценность.Особое значение для селекционеров тлеет тот факт, что да разрешали дш'дийсн с 1868 года спор /Верминский ,1883/ о природе алейроновых зёрен.Одно научное направление считает их высохшими вакуолями,а другое-особш классом пластид.Мы показали /16/,что алейроновые зёрна риса способны к поверхностному, почкованию,следовательно,имеют автономный генетический материал и являются пластидами. Этот результат признан Мездуна- ■ родным Институтом риса /16/.Для селекционеров ке он означает, что алейроновые зерна является одним >;з носителей материнской наследственности/как и другие пластиды они несут таазмагены передаваемые только с цитоплазмой яйцеклетки/.Итак,мы устако-вили.что одна из важнейших белокзапасамцих структур рисовой зерновки наследуется по материнскому типу.

3.4.Новые методы оценки исходного материала для селекции '•

Оценка исходного материала риса для селекции тесно сопряжена со сложной проблемой размножения селекционных образцов. Это трудоемкий и долговременный процесс .Поэтому > естественным

является стремление селекционеров,особенно специалистов в облас-.тк научных коллекций семян иметь такие метода,которые позволяли бьг проводить оценку образца буквально по одной зерновке. Нами разработаны методы,которые в значительной-мере удовлетво-, ряот згу. направленность /3,5,17,18,19-24/. Заработан метод . ютфссподографии.позволяшгий более четко,чем его. аналоги выявлять динамику окремнения клеток покровов зерновки /22/. Нами впервые разработана система подбора компонентов эпоксидных смол . для получения коша^дца,пропитывающего зерновку ь процессе получения полутонких срезов /3/.Пропитка зерновки по нашей системе впервые позволяет получить полутоккие срезы,площадь которых равна любой из проекций зерновки.При этом эти среза можно.получать на простейшем сгпщом микротоме,избегая разрыва тканей, что позволяет избегать разнообразны:!'артефактов /см. п.3.5./. Для использования названной, сис-от разработано специальное устройстзо,дсзируэщее смолы /217,приспособление для переноса • полутонких срезов от микротома на предметное стекло /19/,приспособленке я микротому для получения полутонких срезов /20/. С целью,значительно увеличить; количество анализируемых электронно-микроскопических образцов,разработан способ нанесения полимерных пленок-подложек на опорные сетки /17,18/,а также приспособление для хранения сеток с нанесенными на них образцами /23/. Последнее позволяет заранее формировать своеобразные коллекции электронно-микроскопических образцов.Одна зерновка позволяет создать коллекцию срезов от 10 тысяч до 100 тысяч образцов.Для оптимизации процесса получения электронно-микроскопических фотографий создано устройство коррекции размеров фотопластин /24/. • Особое значение имеет способ получения изолированных алейроно-

вьк зёрен растений риса /5,17/.Этот способ оснозан на ультра-микротомироЕании и позволяет получить гораздо больше алейроновых зёрен,чем традиционными способах*.Кроме того,этот способ позволяет получить алейроновые зерна,характеристики которых есть важнейший селекционный показатель,в нативном состоянии.Это делает над: метод наиболее пригодным для оценки селекционного материала риса.

3.5. Новые факты и артефакты из области формирования зерновок риса

Чтобы направленно регулировать формирование полноценных семян риса необходило знать закономерности этого процесса.В этой_области нами впервые установлены следующие факты.Функция проводящего пучка з ешовки во времени обращается:первоначально он поставляет воду и растворенные вещества в дерновку,а по мере со-.-зрегания его флоача оо.титерируется.а окремневаая ксилема начинает выполнять функцию осушающего сосуда,удаляющего воду из зерновки /13/. Проводящий пучок зерновки риса имеет липвдную выстилку,а открытые О.Улиано /1975/ так называемые "жировые утолщения перисперма" является ни чем иным,как цистернами липидной выстилки сосудов ксилемы /13/. Б игдоспьрме запасные липиды и липаза локализованы только в алейронозз?! слое /Х/.Предлокешшв иатгда их локализации оказались пригодны ке только ;ггя однодольных ,но и для двудольных /подсолнёчник//2/. Теорзш Н.П.Красноок я её последователей о превращении липидных капель е крахмал на последних этапах процесса созревания семян риса является артефактом электронной микроскопии /9/.Точно также артефактом яБляется якобы установленный С.М.Соном/1973/, факт утраты-клеточной структуры эндоспермом на последних этапах созревания.

"Огкрытие" Сона С.М. есть следствие использования "толстых" .срезов,что приводит к судесгзенныу чеканениям /17/.По той же причзше неверны утверждения Н.В.Еелицер /1965/ о том,что при созревании семян риса стараются белковые тела /17/.Й1 показали, что игл нэ только не сливается, но особым образом кемпартмента-лизутстся .и упаковываются в мембранную оболочку з стрсмз эндо-плазыатического ретикулума /сПР/ /17/.Последний в-клетках суб-алейроновогс слоя содержит ¡целочну» фосфатазу /10,II/.В алейроновом слое не только клетки или белоксодерчацио структуры,но и ядра сохраняются на протяжении всего созревания и хранения залога до прорастания.Аминокислоты по М.Г.Еубичу заявляются ' только з субаяейрсновом слое /12/.Теория,так называемого "зародышевого крахмала" Н.П.Красноок,которая наела з зародыше риса . свызз 50:4- крахмала от сухого вещества,является артефактом,выз-зеннна разрывом тканей зерновки вследствие неизотропного распределения упругости на границе различных тканей.3 результате на отделяемых срезах зародыпей у Н.П.Красноок сохранились обломки крахмальных гранул /Б/.Зтого артефакта мобно избеясать,используя ноли компаунды смол /см. п. 3.4../.

Наиболее вазнш для семеноводов фактом,установленным в наак: работах,является наличие в центре эндосперма риса незаполненных г - •".■>стеЛ~закун.Чем больше заполнена полость,тем более 'няаяода зерное&икг пергыз по::г-лал*.1 .что механизм зякнеЛсего агротехнического приема в семеновод гтнг-г&никацкя заключается з том,что поздняя здекориеззя подкотдаа минеральными удобрения-во ззаинодзйствии с рагулятертмч роста приводит я усиленному ззполнгпиа внутренних лакун сндосперма.Зх-о нозвсйдет .с одной сторскы ускорить сопреватоге семян,а о другой-улучпм-ть их ка-

чсство /7/.

3.6. Некоторые селекционные показатели в процессе хранения семян риса Ведущие отечественные селекционеры и семеноводы считают од-ит из важнейших селекционных показателей риса стекловидность его семян.Однако,Л.И.Апрод более трвдцати лет назад открыл интересный научный феномен:стекловидные зерновки при длительном хранении становятся мучнистыми.Причины этого вплоть до наша исследований были неизвестны.Нам ке удалось показать /17/,что в процессе утраты стекловидности происходит деструкция белковых тел,амилопластов и крахмальных зерен.Причем,этот процесс, в зависимости от разных условий и сорта идет с различной скоростью.Следовательно,селекционеры должны учитывать,что стекло^,, водность есть показатель динамический и в характеристике сорта кроме степени -стекловидности должны показывать и динамику утраты этого показателя.Иначе,через определенное время хранения, ' семена,характеризовавшиеся в прошлом определенны,! уровнем стекловидности-и утратившие его,нельзя будет причислить к тому сорту, к которому они действительно принадлежат.

4. ВЫВОДИ

4.I Распределение белка в эндосперме риса является важнейшим селекционным показателем.

■1.2 Показатель распределения белка необходимо использовать при селекции на белковость,а такие на физико-механические параметры зерновки.

4.3. Классификации распределения белка,предложенные Н.П.Красноок, А.П.С?.!етакиким,;.!.С.СЕа_минатаном и др. являются неполными и не соответствуют современней требованиям селекционного процесса.

4.4.Созданная нами классификация распределения белоксодер-

, лсащюс структур учитывают всё многообразие этого явления,известное в науке на сегодняшний день и наиболее полно удовлетворяет требования!f селекционного процесса.

4.5.Характеристики алейроновых зёрен является ватным селекционным показателем,позволяющим прогнозировать процесс заполнения эндосперма при созревании и процесс утилизации эндосперма при прорастании семян.

4.6.Алейроновые зёрна являюгся особым классом пластид,они способны к внешне?.«у почкования и являются носителями материнской наследственности;

4.7.Предложенный нами метод выделения алейроновых зёрен /A.C. !i5 1117013/ наиболее пригоден для целей оценки исходного селекционного материала .

4.8.Разработанные методы подбора смол для препаративной подготовки образцов,принадлежащие нам новые метода электронной микроскопии, э том числе /А.С.М599125/ позволяют на порядок увеличить количесгэо анализируемпх образцоз и избежать разнообразных артефактов.

4.9. Распространенные представления о превращении липидннх капель з крахмал на последних этапах созревания'риса,о зароди-•.тегом крахмале,ctf утрате эндоспермом клеточной организация л слиянии белковых тел являйся артефактами,

1.10.Важнейшую роль в процессе формирования семян риса играют впервые описанные нами явления обра^ния функции проводящего пучка,а такка существования липидной оокладки а ксилеме последнего.

.Г?1.-

4.П.Сеникация риса позволяет растению более интенсивно заполнять внутренние лакуны эндосперма,тем самым формируя полноценные и качественные семена.

4. П.Феномен превращения стекловидных зерновок риса з мучнистые при длительном хранении или искуствекном старении,открытый А.И.Апродом,имеег своей биологической сущность» деструкцию белковых тел,амклопластов и крахмальных зерен.Стекловвдность зерна,как селекционный показатель,имеет динамическую природу-изменяется во времени.

5.РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ 5.1.Генетикам и селекционерам рекомендуем проводить селекцию, на вмсокобелковость и равномерность распределения белка в эндосперме риса на основе предложенной нами классификации его распределения. Рекомендуем также дополнить ГОСТ на качество крупы этим параметром.

Г).5.В цитогенетических лабораториях оцениваниях семенной материм широко использовать разработанные нами методы: выделения алейроновых зёрен,переноса полутонких срезов на предметное стекло, получения микросподограмм.р. такхе приспособлений:« санному микротому для -получения полутонких срезов,для точной дозировки компонентов эпоксидных смол при составлении заливочных компаундов, для хранения опорных сеток-подложек с ультратонкими срезами и т.д. .

5.3.В изменчивых климатических условиях не только Краснодарского края,но и всего северного ре га о л варьирования риса ввести

в обязательном порядке сеникаци»,как непременный агротехнический

*ч *

прием сопочных посевов,т.к. без этого приема не заполняется внутренние лакуны эндосперма.

5.4.В паспорта сортов риса ввести характеристики изменения динамики стекловидности при хранении.

6. Каботы,в которых опубликованы материалы диссертации

6.1.Лебедев Е.В.,Красноок Н.П..Вишнякова И.А.,Шведов И.В.

К вопросу об активности липазы и локализации запасных и структурных липидов в эндосперме зерновки риса.Ред.ж."Изв.вузов пищ. технол." Краснодар. ICSI.' 16 с. ил. Еиблиогр. 10 назв. /Рукопись деп. в ЦНИМТШзаготовок'28.02.8Гг., Р 495зг-,Ц81/.

6.2.Минакова А.Д..Лобанов В.Г..Лебедев Е.В. Локализация липазы в тканях семян высокомасличного подсолнечника. "Изв.вузов "пищ. технол." Краснодар. 1981. га/142/, С. 113-114.

6.3.Лебедев Е.В..Вишнякова И.А. Некоторые методические особенности получения полутонких срезов эндосперма зерновок риса Для оптико-микроскопических исследований. Ред.я. "Изв.вузов пищ,-технол." Краснодар. 1983. ?с.,ил. Библиогр. 10 назв. /Рукопись деп. в 1даТ31заготовок 22.0S.63r., 5? 364зг-,Ц83/.

6.4.Л££1ед£а_Е*В»,Красноок Н.П. .Вишнякова й.А..Орлова 3.3. Сравнительное исследование распределения и накопления белка в эндосперме различных сортов риса в последний период созревания. Ред.я. "Изв.вузов пищ.технол." Краснодар.£983. 14 с. ил. Библиогр. 31 назз. /Рукопись деп. в 15ШГсИзаготовок 30.09.83г.

к; 373зг-Д83/.

6.5.Лебедев Е.В..Красноок Н.П..Вишнякова И.А.,Шведов И.В.

A.C. 13 III70I3. Способ получения изолированных алейроновых зёрен растений риса " Открытия .изобретения". 198-4. Е37.С.9.

6.6.Лебедев Е.В..Краскоок Н.П..Вишнякова И.А.,Алешин R.E. Изучение сравнительного распределения белка в зерновках риса различных сортов.Ред.к."Изв.вузов пищ.технол."Краснодар.1984.

ХЗс.ил.Библиогр. 10 назв. /^копись деп. в ЦНИИТсИзаготовок -. 04.10.54г., >!'- 494зг-Д84/.

6.7.Лебедев Е.В. .Новикова И.Е. Гкстобиохимическос свидетельство необходимости сеникации риса.Материалы конференции молодых • ученых. Краснодар. ШГЛриса. 1984. С. 10-11.

6.8.Лебедев Б.В. Пгстобиохимическое доказательство неаозксе-нссти накопления остатков 3,4Д в крупе риса.Материалы конференции молодых ученых и специалистов ВКИИриса. Краснодар. 1985.

С. 12-13.

6.9.Лебедев Е.В. О невозможности превращения липидов в углеводы на последних этапах созревания в эндоспермах зерновок риса. Бюллетень научно-технической информации ВНИИ риса.Краснодар.« 1986.вып. 35.С.10-13.

6.10.Лебедев К.В. О механизме действия некоторых ферментов в оццосперме зерновок риса.Тезисы конференции молодых ученых и специалистов ВНйИриса.Краснодар.1986. С.9-П.

6.11.Лебедев Е.3. Локализация некоторых ферментов в эндосперме зерновок риса.Тезис.ч конференции молодых ученых и специалистов ВНШриса'; Краснодар. 1955. С. 15-17.

6.12'.Лебедев Е.В. .Лебедев В.Е. Локализация некоторых амико-ацялоз в эндосперме зерновок риса.Материалы конференции молодых ученых и специалистов ШШриса.Краснодар. 1967.0.4-5.

5.13.Лебедев Е.В..Лебедев В.Е.,Алешин Н.Е. Структурная организация проводящего пучка в процессе созревания зерновок риса. Бюллетень научно-технической информации ВНИИриса.Краснодар. 19Ш. вш. 37. С.8-11.

6.14.Лебедев Е.З. К вопросу о классификации белковых тел риса. Бюллетень научно-технической информации БНЙИриса.Краснодар.1989.

вкл.38.С.25-28.

6.15.Лебедев E.B.K вопросу о зародышевом крахмале у риса. Бюллетень научно-технический информации ЕНИИриса.Краснодар. 1989.зып38.С. 29-31.

6.16. L&SicLtM E.V., Jfyesti* У.£у LU«t«f if^cj^ t f.

^./ie^Ko-i -¿uoCci!*-* in. w'ea й4«гвАг OTiitÄj',

6.17.Лебедев E.B..Алешин Й.Е. ,Авайян''Э;Р;,Лебедев B.E., .Алехин Е.П. Гистобиохимия формирования зерновок риса.'Зизио-'. логия семян:формирование,прорастание,прикладные аспекты /Но материалам Всесоюзного симпозиума "Физиология семян" 10-14 октября 1988. г.Душанбе/ Изд-во "Дониш"1990.С.59-51. р.18.Лебедев Е.В..Алешин Н.Е.,Лебедев В.В.,Алешин В.П. •• Способ нанесения полимерных пленок-подложек A.C.K599I25 "Открытия,изобретения" 1990. № 38.С.46.

Приложение I.

Рационализаторские предложения и документы о внедрении 6.Ю.Лебедев Е.В. Приспособление для переноса полутонких срезов. /Удостоверение К? 368 ВНИИриса ВАСХНИЛ от 30.11.£4/.

6.20.Лебедев Е.В. Приспособление к микротому МС-2 для получения по'лутонких срезов. /Удостоверение 370 ВНИИриса ВАСХНИЛ от 30.11.34/.

6.21.Лебедев Е.В. Устройство для точной дозировки компонентов эпоксидных смол при составлении заливочных компаундов /Удостоверение S-3 471 ВН-ГИриса ВАСХ1МЛ от 22.I2.r6/.

6.22.Лебедев S.3. »Алегсин К.Е. Способ получения микроспадов грамм для выявления кремния в цветковых чешуях зерноаок риса. /Удостоверение К 37S КШриса ЙА.СХШЛ от 22.04.S5/'.

6.23.Лебедев Е.В..Лебедев В.Е. Устройство для хранения сегок-подложек с ультратонкими срезами для электронной микроскопии, /Удостоверение £472 ВНИПриса Е1СХНИЛ от 22.12.Ш.

6.24.Лебедев Е.В..Лебедев В.Е. Приспособление для коррекции размеров фотопластин /Удостоверение ¡Р 473 ВНШриса ВАСХШЛ от 22.12.65/.

6.25.0гчет ВНЙИриса по форме 4-нт за 1990г. о внедрении изобретения Лебедева Е.В.'.Алешина Н.Е.,Лебедева В.Е.,Алешина Е.П. "Способ ианес.ения полимерных пленок-подложек".А.С.М599125.

Подпись автора: ■

I/