Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Цис- и транс-действующие факторы, контролирующие экспрессию гена SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae
ВАК РФ 03.00.15, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Цис- и транс-действующие факторы, контролирующие экспрессию гена SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae"
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
На правах рукописи
РЯБИНКОВА Наталья Анатольевна
Цис- и транс-действующие факторы, контролирующие экспрессию гена Я11Р35 дрожжей ЗассИаготусея сегс\ 'тае.
специальность: 03.00.15 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2006
Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета
Научный руководитель: Официальные оппоненты:
кандидат физико-математических наук Осипова Татьяна Николаевна
профессор, доктор биологических наук Квитко Константин Васильевич
доктор биологических наук Королев Владимир Геннадьевич
Ведущее учреждение: Институт экспериментальной кардиологии
федерального государственного учреждения Российский кардиологический научно-производственный
комплекс
Защита состоится "15" июня 2006 г. в /у часов на заседании Диссертационного совета Д.212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.
С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета
Автореферат разослан "/6 " 2006 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук
Л.А. Мамон
///ЗУ
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность проблемы. Хорошо известно, что регуляция эукариотических генов осуществляется на нескольких уровнях: транскрипционном, трансляционном и посттрансляционном. Первый из них - транскрипционный, часто является определяющим. На этом уровне в регуляцию вовлекаются многочисленные белковые факторы, взаимодействующие с регуляторными элементами ДНК. Характерным для эукариотического генома является наличие нуклеосомного и более высоких структурных уровней организации хроматина. Регуляторные изменения прежде всего выражаются в деконденсации генетического материала, которая сопровождается модификацией гистонов, удалением нуклеосом и формированием участков с повышенной чувствительностью к разным агентам.
В последние годы у эукариот обнаружены консервативные белковые комплексы, работа которых облегчает взаимодействие транскрипционных факторов с ДНК. Это комплексы, осуществляющие модификацию гистонов (ацетилирование и деацетилирование), и комплексы АТФ-зависимого изменения структуры хроматина. Механизмы регуляции экспрессии генов, осуществляемые транскрипционными активаторами, комплексами модификации гистонов и/или комплексами АТФ-зависимой перестройки структуры хоматина, являются предметом активного изучения. Показано непосредственное взаимодействие ДНК-связывающих транскрипционных активаторов с компонентами комплексов модифицикации гистонов и комплексов АТФ-зависимой перестройки хроматина. При изучении экспрессии ряда генов выявлено, в одних случаях, участие и комплексов модификации гистонов, и комплексов АТФ-зависимой перестройки хроматина; в других - участие только одного из эгах типов комплексов. В настоящее время механизмы действия этих комплексов и входящих в их состав коактиваторов изучены лишь для небольшого числа генов. Регуляция транскрипции генов, кодирующих компоненты аппарата трансляции, изучена недостаточно. Хорошо изучена транскрипция генов, кодирующих белки рибосомы. Данные о регуляции транскрипции генов, кодирующих факторы элонгации и терминации трансляции практически отсутствуют. Для исследования нами был выбран ген Б1/Р35 дрожжей 5. сегеумше, кодирующий эволюционно консервативный у эукариот фактор терминации трансляции сИРЗ. Помимо основной функции - терминации трансляции, Бир35 участвует в контроле клеточного цикла. Для белка Яир35 показана способность переходить в прионную форму.
Предметом наших исследований стал анализ структуры хроматина 5'-регуляторной области 1ена 5№35, идентификация регуляторных последовательностей для взаимодействия с транскрипционными акгиваторами, оценка уровня экспрессии $11Р35 в случае промоторных мутаций и влияние изменения экспрессии 81!Р35 на эффективность терминации трансляции и на другие функции продукта этого гена. В работе было оценено участие
П>ис. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.-Петербург ОЭ
транскрипционных коактиваторов, входящих в состав комплекса ацетилирования гистонов или комплекса АТФ-зависимой перестройки хроматина, в контроле экспрессии SUP35.
Работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов и лаборатории физиологической генетики Биологического НИИ СПбГУ. Отдельные эксперименты выполнены в лаборатории молекулярной биологии института имени Ханса-Кноля (Йена, ФРГ).
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы было выявление в промоторной области гена SUP35 цис-действующих регуляторных последовательностей, необходимых для взаимодействия с ДНК-связывающими транскрипционными активаторами, оценка влияния мутаций данных последовательностей на экспрессию гена SUP35 и его функцию, а также оценка влияния транскрипционных коактиваторов на экспрессию гена SUP35.
В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:
1. Картировать участки гиперчувствительности к нуклеазам и нуклеосомы в 5'-регуляторной области гена SUP35 in vitro.
2. Картировать места ДНК-белковых взаимодействий в промоторной области гена SUP35 in vivo с помощью метода геномного футпринтинга.
3. Получить мутации в цис-действующих регуляторных элементах гена SUP35. Оценить влияние данных мутаций на экспрессию гена SUP35, на жизнеспособность дрожжей, на выполнение функции терминации трансляции, а также другие возможные плейотропные проявления этих мутаций.
4. Исследовать влияние компонентов комплекса модификации гистонов и комплекса АТФ-зависимой перестройки хроматина на экспрессию гена SUP35.
5. Оценить влияние мутаций в стартовом кодоне трансляции SUP35 и мутаций в триплетах АТГш и АТГ254, находящихся в одной фазе считывания, на жизнеспособность дрожжей.
Научная новизна работы. Впервые оценено влияние промоторных мутаций на экспрессию и функцию гена SUP35. Получены доказательства участия транскрипционных активаторов Abfl, Rebl и Mbpl в регуляции экспрессии гена SUP35. Эти данные moiyr быть важны для выяснения механизмов регуляции экспрессии генов, кодирующих белковые компоненты аппарата трансляции в клетках эукариот. Впервые показано влияние транскрипционных коактиваторов, кодируемых генами GCN5, SPT20 и SNF2, на экспрессию гена SUP35.
Практическая ценность. Получены данные о структуре 5'-регуляторной области эволюционно консервативного гена SUP35 и оценено влияние мутаций в цис-действующих регуляторных элементах на экспресию и функцию гена, контролирующего один из важнейших процессов жизнедеятельности клетки -синтез белка. Эти данные могут быть использованы при чтении курсов лекций
«Молекулярная генетика», «Молекулярная биология», «Генетический контроль трансляции».
Апробация работы. Результаты работы были представлены на I (Саратов, 1994) и IIT (Москва, 2004) съездах ВОГиС,, на 2-й конференции МОГиС (Москва, 2003 г), на международных конференциях по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Висконсин, 1996; Гетеборг, 2003) и на семинарах лаборатории физиологической генетики Биологического НИИ СПбГУ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ
Объем диссертации. Диссертационная работа изложена на /¿о страницах и состоит из введения, обзора литературы глав "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение" и выводов. Работа содержит 4 таблицы, 15 рисунков, список литературы из //¿наименований.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Штаммы дрожжей S. cerevisiae, использованные в работе, приведены в таблице 1. Материал, выделенный из шгамма ЗЗГ-Д373, использовали для анализа структуры хроматина методами геномного футпринтинка и "непрямого мечения концов"; штаммы 19А-Д780 и GT403 для получения производных штаммов с промоторными мутацичми и для выделения тотальной РНК; штаммы YD-17390, YD-17285, YD-11586. YD-17400 и штамм 74-Д694 для измерения активности ß-галактозидазы.
Для поддержания и выделения челночных плазмид и в качестве реципиента для трансформации использовали штаммы бактерии Escherichia coli XL-Blue 1 и HB 101.
Таблица 1. Штаммы дрожжей S cerevisiae, использованные в работе
Название Генотип
ЭЗГ-Д373 MATa phel-A10 ade2-144,717 his7-l Iys9-A21 ura3-52 leu2-3,112 trp 1-289
74-Д694 MATa adel-14 his3-A200 ura3-52 Ieu2-3,112 trpl-289
1УА-Д780-ту1 MATa ade2-144,717 his7-l Iys9-A2l urai-52 ¡eu2-3,112 trp1-289 sup35 •:TRP1 fCEN URA3 SUP35]
YD-17400 MA Та leu2A lys2A игаЗЛ his 7Л
YD-17390 MATaleu2A lys2A игаЗА spt20A
YD-17285 MATaleu2A lys2A игаЗА %cn5A
YD-11586 MATa 1еи2А lys2A игаЗА snf2A
GT403 MATa adel-14 his3A lys2 ura3-52 leu2-3,112 trpl-289 sup35::HIS3 [CEN URA3 SUP35J
Плазмиды. В работе использовали челночные плазмиды, способные поддерживаться в S. cerevisiae и Е. coli. Все плазмиды, сконструированные нами, получены на основе дрожжевого вектора pRS315 (СEN LEU2). Плазмида pRS315SUP35 несет фрагмент хромосомной ДНК с геном SUP35 дикого типа. На основе данной плазмиды с помощью сайт-направленного олигонуклеотидного мутагенеза была получена серия плазмид pNR (pNRAREBl(A), pNRA REB1(B), pNRAREB 1 (С), pNRAREB 1 (А,В,С), pNRAABFl, pNRAGCN4,
pNRAREB 1 (A,B,C)AABF 1, pNRAREB 1 (А,В,), pNRAREB 1 (B,C),
pNRAREBl (А,С)), содержащих различные мутации в промоторе гена SUP35. Олш онуклеотиды, использованные для сайт-направленного мутагенеза, представлены в диссертационной работе. Исключение составляет плазмида pNRAMBPl, где деления регуляторной последовательности гена SUP35 получена в ходе гидролиза ДНК ферментом рестрикции Mlul с последующей обработкой S1 нуклеазой и лигированием.
Плазмиды pRZSUP35, pRZAMBPl, pRZAABFl, pRZAGCN4, pRZAREBl(A,B,C) были сконструированы в данной работе для измерения активности ß-галактозидазы E.coli у промоторных мутантов гена SUP35. Они содержат промотор гена SUP35 слитый с геном lacZ Е. coli. Плазмиды pNl, pNIA, pN2, pN3, pN4, pN2AABFl, pN3AABFl, pN4AABFl бьши сконструированы с помощью сайт направленного мутагенеза и несут мутации в одном из трех кодонов АТГ гена SUP35, находящихся в одной фазе считывания: плазмида pNl - мутацию в стартовом кодоне АТГ] (АТГ)—>АГТ), pNl Д - делецию всех трех нуклеотидов первого стартового кодона, pN2 и pN3 -мутации в триплете АТГ 124 (АТГ124->АГГ и АТГ|24—>ТГТ, соответственно), pN4 - мутацию в ATr2S4 (АТГ254—>ТГГ), pN2AABFl и pN3AABFl - мутации в триплете АТГШ и делецию сайта связывания белка Abfl; pN4AABFl - мутацию в триплете АТГ254 и делецию сайта связьшания белка Abfl)
Генетические методы. В работе использовали стандартные методы генетики дрожжей (Захаров и др. 1984; Rose et al, 1990).
Молекулярно биологические методы. В работе использовали стандартные методы получения и анализа рекомбинантных ДНК, гибридизации ДНК-ДНК и ДНК-РНК, гель-электрофореза (Sambrook et. al.,1989). Выделение РНК проводили по методу Шмидта с соавторами (Schmidt et. al., 1990). Выделение ядер дрожжей проводили по методу, описанному Лором (Lohr, 1988). Для анализа структурно-функциональной организации хроматина 5'-регуляторной области гена SUP35 и обработки полученных данных использовали метод "непрямого мечения концов" (Nedospasov et al.,1980; Wu С, 1980), который включает в себя следующие этапы: 1) выделение ядер дрожжей и обработка агентами, специфичными для определения структуры хроматина - ДНКазой I или микрококковой нуклеазой; 2) выделение из ядер ДНК и ее депротеинизация; 3) обработка очищеной ДНК ферментом рестрикции, имеющим сайт узнавания в нукпеотидной
последовательности гена SUP35 (в нашем случая это рестриктаза Sali); 4) элетрофорез фрагментов тотальной ДНК в агарозном геле, перенос ДНК на мембрану и гибридизация по Саузерну с ДНК-пробой - фрагментом гена SUP35, один из концов которого должен быть получен при гидролизе тем же ферментом, что и тотальная ДНК (в нашем случае фрагмент HindIII-SalI гена SIJP35); 5) расчет положения разрывов ДНК, выявленных после Саузерн гибридизации, проводили при сопоставлении положений мест разрывов ДНК с положением фрагментов маркера молекулярного веса ДНК при построении графика, 1де по оси абсцисс - положение фрагмента ДНК в сантиметрах, а по оси ординат -натуральный логарифм размеров фрагментов маркера молекулярого веса ДНК. Геномный футпринтинг in vivo был проведен на основании методов описанных Хубрегстом (Huibrcgtse et al., 1991). Клетки дрожжей обрабатывали диметилсулъфатом (агент метилирует гуанины ДНК, не участвующие во взаимодействии с белками), после выделения ДНК проводили реакцию линейной амплификации с олигонуклеотидом специфичным для гена SUP35, (реакция амплификации прекращается в точке метилирования, т е происходи обрыв синтеза ДНК). Для сопоставления полученных результатов с нуклеотидной последовательностью гена SUP35 параллельно ставили реакцию секвенирования ДНК с тем же олигонуклеотидом. Измерение активности ß-галактозидазы проводили по стандартной методике (Ausubcl et al., 19Р9) Выделение белков проводили, по методу, описанному у Патино с соавторами и Ньюнама с соавторами (Patino et al.,1996; Newnam et.al., 1999). Детекцию гибридизации белков с антителами, специфичными для NM-Sup35, проводили с использованием набора фирмы "Amersham" (Австрия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Анализ структурной организации хроматина гена SUP35 методом "непрямого мечения концов" Для картирования структуры хроматина гена SUP35 использовали метод "непрямого мечения концов". В качестве агентов, позволяющих определить структуру хроматина, брали ДНКазу I или микрококковую нуклеазу. На рис.1 А представлен радиоавтограф фрагментов ДНК, полученных в результате обработки ядер микрококковой нуклеазой и последующей гибридизации ДНК с меченым ДНК-зондом. Расчет положений мест разрывов ДНК в последовательности гена SUP35 проводили на основании данных четырех экспериментов. Ошибка среднего не превышала +/- 20 п.н. При расчете положений мест расщепления ДНК и соо тнесении полученных позиций с положением на нуклеотидной последовательности гена SUP35 (расстояние дается от кодона АТГ|) были получены данные о структуре регуляторной области гена SUP35.
Переваривание хроматина микрококковой нуклеазой, выделенного из клеток дрожжей, находящихся на ранней и поздней логарифмической фазе роста культуры, выявило 8 мест расщепления ДНК для гена SUP35. Места разрывов 1,2
и 3,4 локализуются в промоторной области (положение - 461...-356 и -231...-79, соответственно). Протяженность зоны расщепления между границами разрывов 1,2 составляет 105 п.н., между разрывами 3,4 - 152 п.н. Расстояние между разрывами 2 и 3 - 125 п.н.
1 (-461)
2 ( 372;
3 (271)
4 (-91)
5 (+1)
' 6 (+158)
Рисунок 1. Картирование нуклеосом и сайтов гиперчувствителыюсти к ДНКа ¡еГ и микрококковой нуклеазе в 5'регуляторной области гена 811Р35
А - картина переваривания хроматина микрококковой нуклеазой, а-! - хроматин из клеток по ¡дней логарифмической фазы роста, л - депротеинизированная ДНК; е-и - хроматин из клеток ранней логарифмической фазы роста клеток.
Б - картина переваривания хроматина ДНКазоМ, а,б - хроматин клеток дрожжей поздней логарифмической фазы роста культуры, в - хроматин и! клеток ранней логарифмической фазы
Цифры слева - размер фра1менюв маркера молекулярного веса ДНК в парах оснований 1-8 -места расщепления ДНК иуклеазами Цифры справа в скобках - положение чес! разрывов ДНК (в п.о.) в нуклеотидной последовательности гена БиР35 от кодона АТГ
0 - нуклеосома;
1 - участок гипсрчувствительности к ДНКазе I или микрококковой нукпеазе
Протяженность зон расщепления и расстояния между ними позволяют сделать вывод, что зоны между разрывами 1,2 и 3,4 являются участками гиперчувствительности к микрококковой нуклеазе. Положение и интенсивность соответствующих зон на радиоавтохрафе не меняется в зависимости от фазы роста клеточной кулыуры.
Места разрывов 5,6,7,8 картируются в кодирующей части гена ££/Р55 (положение +22, +171, +180, +339, соответственно). Расчет расстояния между разрывами 5 и 6 (он составляет 149 п.н.) и между разрывами 7 и 8 (159 п.н.) позволяет говорить о соответствии этой величины размеру ДНК, организованной у дрожжей в нуклеосому. Таким образом, места разрывов 5,6,7,8 являются 1раницами нуклеосом. Сравнение структуры хроматина из материала, выделенного на разной логарифмической фазе роста, выявляет значительные различия в организации кодирующей области гена (места расщепления 5,6,7,8). На ранней логарифмической фазе места разрывов, соответствующие границам нуклеосом, полученных после обработки хроматина микрококковой нуклеазой,
нечеткие, их интенсивность изменяется в зависимости от степени переваривания вплоть до полного исчезновения (рис 1А, дорожки е-и). В то же время для хроматина, выделенного из клеток дрожжей поздней логарифмической фазы роста, выявлен ряд фазированных нуклеосом в кодирующей области, интенсивное гь мест расщепления ДНК, соответствующее границам нуклеосом, не зависит от степени переваривания хроматина микрококковой нуклеазой (рис 1 А, дорожки а-г) Переваривание контрольной денротеионизированной ДНК микрококковой нуклеазой выявило одно место расщепления ДНК в положении -177. ..-140 п.н (рис. 1А, дорожка д). В хроматине этот район гена недоступен для действия микрококковой нуклеазы.
При обработке хроматина ДНКазой I (из культур клеток дрожжей ранней и поздней логарифмической фазы роста) было выявлено б мест расщепления для гена SUP35 (рис.1Б) Места разрывов 1,2 и 3,4 (положение -461. .-372 и -271...-91, соответственно) локализованы в промоторной области и являются участками гиперчувствительности к ДНКазе1 (протяженность зоны между разрывами 1,2 - 89 п н , между разрывами 3,4 - 180 п н.) Места разрывов 5,6 соотвествуют границам нуклеосомы (положение +1, +158, соответственно) Сравнение картин переваривания хроматина гена SUP35 ДНКазой 1 и переваривания голой депротеиниризованной ДНК ДНКазой! показала специфичность картин переваривания для хроматина (рисунок не приводится).
Участки гиперчувствительности к ДНКазе 1 находятся практически в том же положении, что и участки гиперчувствительности к микрококковой нуклеазе. Единственным отличием является раздвоение зоны между разрывами 3,4 в случае микрококковой нуклеазы и отсутствие явного раздвоения этой зоны для ДНКазы I, что, по-видимому, связано с различием в действии нуклеаз. Исходя из наших данных 5 регуляторная область гена SUP35 организована следующим образом, два гиперчувствительных участка в промоторной области в положении -91. .-271 и -372. .-461, и район фазированных нуклеосом, начинающийся в положении t-22 от кодона АТГ, Локализация гиперчувствительных участков говорит о существовании сайтов связывания для транскрипционных факторов. TATA бокс входит в состав гиперчувствительного участка и остается не занятым нуклеосомой Изменения в фазировании нуклеосом в кодирующей части гена, обнаруженное нами на разных стадиях логарифмического роста клеток дрожжей, говорит о более активной транскрипции гена SUP35 на ранней логарифмической стадии роста клеток.
Ансти мест ДНК-бакового взаимодействия in vivo в промоторной об шети гена SUP35. Определив структуру регуляторной области гена SUP35 мы смогли перейти к более детальному анализу расположения сайтов связывания транскрипционных факторов На рис 2 представлена нуклеотидная последовательность гена SUP35 с расположением цис-дейс гвующих ретуляторных элементов, предсказанных при поиске консенсус-последовательностей для связывания регуляторных белков.
В ходе анализа нуклеотидной последовательности гена Б11Р35 нами были выявлены одиночные сайты связывания регулягорных белков Осп4, АЬП и МЬр1, и три сайта связывания 1?еЫ. Эти данные частично совпадают с данными, полученными другими авторами (Пацке55агпапчкауа е( а1., 1997). Ими обнаружены консенсус последовательное!и для связывания белков Осп4, КеЬI(сайг В) и АЬЛ.
-431 <,<М4 -426 -401..."8."..¡396
ТСОСЛТТАОСТОССК'ТЛТТ ГСЛСТСЛЛЛТТАТТЛПТТТТЛСТААОЛСС, лссссгсл
CAGTGTTCCjAGTCTGTGTCATTTCTTTTGTAATTCTCTTAAACCACTTCATAAAGTT
G1 GAAGTTCATAGCAAAATTCTTCCGCAAAAAGATGA ATCTTAGTTCTCA GCCCACCA
AAAGAGGTACATGCTAAGATCATACAGAAGTTATTGTCACTTCTTACCTTGCTCTTAAA
TGT ACATTACAAC CGGG TA 7TATATCTTACATCAT CGTA TA A TATGATCTT t CTTTATG
-104ТАГЛ-98
-56 1 -44
TTGGTAC ATCTTCTCTTGAAAG ACTCCATTGTACTGTAAC AA A AA GCGGTTTCTTCA TCG
-14 KEB1(C) -6 +1
ACTTGCTCGGAATAACATCTATATCT GCCCA СТА GCAACA/l TG
Рисунок 2 б'регучяторная область гена SUP35 дрожжей S cerevmae
- консенсус последоватепыюсти для связывания регуляторных белков;
— сашы связывания ре1уляторных белков, выявленные методом геномного футпришинга m
VIVO
I - сайт инициации транскрипции
Точное (+1 п.н.) картирование цис-действующих элементов в промоторной области гена SUP35 проводили методом геномного футпринтинга. В качестве агента, позволяющего картировать места ДНК-белковых взаимодействий, использовали димешлсульфат (ДМС). В ходе такого анализа в промоторной области гена SUP35 нами было картировано четыре района ДНК-белкового связывания. Первый район (рис. ЗА) протяженностью 18 п.о. находится в положении -391...-409 и.о. от старювого кодона трансляции в его состав входит сайт связывания белка Mbpl (МСВ-бокс), который является субъеденицей комплекса, работающего при переходе от поздней стадии G1 к стадии S клеточного цикла. Было показано, что данный комплекс регулирует гены, связанные с репликацией ДНК и синтезом нуклеотидов. Коровой последовательностью для узнавания белком Mbpl является четырехчленник CGCG, последовательность для узнавания - ACGCGT встречается дважды или трижды в генах, чья работа регулируется белком Mbpl. В гене SUP35 нами обнаружен только один МСВ-бокс. Дополнительно проведенный компьютерный анализ не обнаружил второю МСВ бокса в 5'-регуляюрной области. Однако в случае наличия в 8-ом положении консенсус последовательности пурина
(ACGCGNNPu) единичный МСВ-бокс работает как энхансер (Mcintosh et al., 1990). Локализованная нами иоследова1ельность МСВ бокса в гене SUP35 содержит пурин в 8-ом положении, что позволяет предполагать участие Mbpl в регуляции экспресии гена SUP35.
Вюрой и третий сайты находятся в положении -286...-278 и -209...-202, соответственно, от стартового кодона (рис.ЗБ и В). В этих участках картированы консенсус-последовательности для связывания регуляторного белка Rebl: последовательность А находится в обратной ориентации относительно направления транскрипции, последовательность В расположена в прямой ориентации. Последний, четвертый район ДНК-белкового взаимодействия (рис.ЗГ) находится на расстоянии -179...-185 п.о. oi кодона АТП и соответствует консенсус-последовательности для связывания белка Abfl. Геномный футпринтинг для локализации сайта REB1(C) не проводили. Регуляторные белки Rebl и Abfl являются многофункциональными транскрипционными факторами, которые могут осуществлять как репрессию, так и активацию транскрипции. Эти регуляторные белки участвуют в процессах организации структуры хроматина. а б в Г
Рисунок 3 Рстульташ геномного футпринтинга /и vivo Представлены места ДНК-белковых взаимодействий в промоторной области гена SUP35 дрожжей S. cerevinae Цифры слева соответствуют положению нуклеотидов в последовательности гена SUP35 относительно кодона АТГ[. С - хроматин, обработанный диметлсульфатом (дорожки 1-4) N - голая, контрольная ДНК, обработанная димегилсульфатом (дорожки5-7)
Гены, кодирующие белки рибосомы, содержат сайты связывания для белка Abfl Для его работы необходимо наличие Т-тракта с З'-конца регуляторной последовательности. Такой поли-Т район есть в гене SUP35 с 3'- конца от сайта для связывания белка Abfl (рис. 2). Белок Abfl влияет так же на репликацию ДНК.
Белок Rebl является терминатором транскрипции генов, транскрибируемых РНК полимеразой I, и активатором транскрипции генов, транскрибируемых РНК
полимеразой И Дополнительно проведенный нами компьютерный анализ выявил еще один, третий, сайт связывания для белка Rebl, расположенный за сайтом инициации транскрипции гена SUP35 (рис. 2) Наличие трех сайтов связывания для белка Rebl и их аналогичное расположение обнаружено в гене REB1 (Wang et al., 1998) Эти консенсус последовательности находятся в положении -110 (сайт А), -90 (сайт В), +30 (сайт С) от сайта инициации транскрипции гена REB1, кодирующего белок Rebl, причем два сайта в обратной (А и С) и один (В) в прямой ориентации. Все три консенсус последовательности связывают белок Rebl с разной афинностью, осуществляя тонкую авторегуляцию экспрессии гена REB1. Мутации сайтов А и В приводят к полному прекращению транскрипции гена REBI, мутации в сайте С снижают транскрипцию на 40 % В гене SUP35 обнаружено аналогичное расположение консенсус последовательностей для белка Rebl -234 (сайт А), -157 (сайт В), +38 (сайт С) от сайта инициации транскрипции гена SUP35. Так же как и в гене REB1, в гене SUP35 сайты Rebl (A), Rebl (С) расположены в обратной, a Rebl (В) - в прямой ориентации В гене SUP35 сайт Rebl (С) находится на таком же расстоянии от сайта инициации транскрипции, что и сайт Rebl(C) гена REB1. Это может говорить о похожей регуляции транскрипции гена SUP35 белком Reb 1.
Анализ (пияния промоторных мутаций на функции гена SUP35 Для изучения влияния инактивации сайтов связывания транскрипционных регуляторов на экспрессию и функцию гена SUP35 нами с помощью сайт-направленного олигонуклеотидного мутагенеза была получена серия плазмид с мутациями промоторной области гена SUP35 (см. материалы и методы) Кроме мутаций в консенсус-последовательностях для связывания регуляторных белков, чье наличие в гене SUP35 было подтверждено экспериментально геномным футггринтингом (МВР1, REB1(A), REB1(B), ABF1), нами были также получены мутации в потенциальных сайтах связывания белков Gcn4 и Rebl (сайт С), предсказанные нами при проведении компьютерного анализа (рис 2) Мы использовали штамм 19А-Д780, содержащий дизрупцию хромосомной копии гена SUP35, и ген SUP35 дикого типа на центромерной плазмиде. Штамм трансформировали серией плазмид с промоторными мутациями в гене SUP35 В дальнейшем проводили замещение плазмиды с геном SUP35 дикого типа на вариант плазмиды с мутацией в цис-действующем элементе. Типы полученных мутантов представлены в таблице 2 Полученные производные штамма 19А-Д780, отличающиеся различными вариантами мутаций в цис-действующих элементах промоторной области гена SUP35, тестировали на эффективность терминациии трансляции и на плейотропные проявления.
Влияние промоторных мутаций гена SUP35 на терминацию трансляции оценивали по способности супрессировать нонсенс-мутацию his7-l(\]\k) или Iys9-A21(UAA) при наличии либо в отсутствие в среде паромомицина -антибиотика, снижающего точность трансляции, при 20°С и 30°Г Только деления сайта связывания для белка Abfl в промоторной области гена SUP35 - мутация
уг//з.?5ДАВП - приводит к нонсенс-супрессии на среде С-Шв или С-Ьув без паромомицина (табл. 2). При анализе нонсенс-супрессии у промоторных мутантов на среде С-Шз или С-Ьуэ, содержащей паромомицин, было обнаружено следующее:
мутации лг/р55ДМВР1, «и/ШДОСМ, ,шр55ДЯЕВ 1 (В,С) или ,ум/;35Д ЯЕВ1 (А) не приводят к нонсенс супрессии;
- мутации ,?ир35ДЯЕВ1(В), ди/>.?5ДЯЕВ1(С), ,™/;_?5ДАВР I и сочетания различных вариантов мутаций яир35ДЯЕВ1(А,В,С); то/ШЛЯЕВ 1 (А,В); БирЗ 5ДЯЕВ1 (А,С); ,уир55ДКЕВ1(А,В,С),ДАВР1 приводят к фенотипической супрессии на среде с паромомицином. Таким образом, в отличие от одиночных мутаций ,ум/?55ДКЕВ1(В) или 5ДЯЕВ1 (С) двойная мутация то/ШДЯЕВ 1 (В,С) не приводит к нонсенс-супрессии. Мутации всех трех сайтов связывания белка ЯеЫ - аллель .то/гЗ^ДКЕВ! (А,В,С) приводят к восстановлению супрессии.
Таблица 2. Оценка влияния мутаций цис-действующих элементов гена 5иР35 на эффективность терминации трансляции Супрессию мутации /н?7-/(иАА) оценивали по способности к росту на среде без гистидина на 5 день инкубации при 20°С при наличии или в отсутствие
ГИСТИДИН - - - + +
паромомицин - 50мг/л 100мг/л - 100мг/л
яигзз - - - + +
хирЗ 5-ЛАВР ] + + + + +
.чир35-&КЕЪЦА) - - - + +
5И/Ш-ДЯЕВ1(В) - + + + +
.умр55-ДЯЕВ1 (С) - + + + +
5ирЛ-ДМВР1 - - - + +
.УМ/Ш-ДОСШ - - - + +
«мрЗ 5АЯЕВ1 (А,В) - + + + +
.™^5ДЯЕВ1(В,С) - - - + +
«/рЛДЯЕВ1(А,С) - + + + +
5,мр35Д11ЕВ 1 (А,В,С) - + + + +
.?«/?35-Л11ЕВ 1 (А,В,С), ДАВИ 1) + + + + +
При тестировании влияния промоторных мутаций гена 5С/Р35 на жизнеспособность, осмочувствительность, дыхательную компетентность, температурочувствительность, чуствительность к беномилу и к аминогликозидному антибиотику паромомицину никаких отличий у мутантов по сравнению с геном Б1/Р35 дикого типа ни по одному из выше перечисленных признаков обнаружено не было. Повидимому, спектр плейотропных проявлений характерен только для мутаций, локализованных в кодирующей части гена ЯОР35, которые вызывают нарушения в структуре белка. Изменения
регуляторных элементов промоторной области к плейотропии не приводят. Нами была проведена проверка доминантности промоторных мутаций. Штамм 19А-Д780, содержащий дизрупцию хромосомной копии гена SUP35 и ген SUP35 дикого типа на плазмиде, трансформировали серией плазмид с промоторными мутациями в гене SUP35 Добавление этих плазмид не приводило к какому либо фенотипическому проявлению в присутствии гена SUP35 дикого типа, то есть все промоторные мутации рецессивны.
Анализ влияния промоторных мутаций на экспрессию гена SUP35. Влияние промоторных мутаций на экспрессию гена SUP35 оценивали по уровню мРНК гена SUP35 и по активности ß-галактозидазьт E.coli в конструкциях, где промотор I
гена SUP35 или его мутантные варианты были слиты с геном JacZ E.coli. Результаты анализа количества мРНК гена SUP35 у промоторных мутантов представлены на рис 4. РНК выделяли из производных штамма 19А-Д780 и GT403 Уменьшение количества РНК гена SUP35 (в 10 раз) наблюдается в случае мутации .vh^'JAABFI , уменьшение количества мРНК вЗ-4 раза - у мутантов .sw/?35AREBl(B) Hswp55AREB1(C) Делеция уир35ДМВР1 приводит куменьшению количества мРНК гена SUP35 в 2 раза.
На рис. 5 представлены результаты измерений активности ß-галактозидазы у мутантов по промоторной области гена SUP35. Для каждого варианта измерения проводили у четырех независимых трансформантов штамма 74-Д694. Экспрессия гена SUP35 практически не меняется для аллелей <гм/?35ДМВР1 и s«p55AGCN4. Изменения (в 1,5 раза) обнаруженные у аллели гена SUP35 с делециями всех трех сайтов связывания регуляторного белка Rebl - s up 5 5 Д R F. В1 ( А ,В ,С), статистически недостоверны. Однако, поскольку в случае мутаций сайтов связывания для Rebl (аллель swp35AREBl(A,B,C)) наблюдается супрессия нонсенс мутаций на среде с паромомицином (табл. 2) статистическая недостоверность результатов измерения экспрессии гена SUP35, повидимому, связана с малым размером выборки. Данные, полученные при изучении влияния промоторных мутаций на функционирование гена коррелируют с полученными **
нами данными оценки уровня экспрессии гена SUP35. Снижение количества мРНК коррелирует с четким фенотипическим проявлением - супрессия нонсенс мутаций на среде содержащей паромомицин, а в случае аллели sup35AABFI, где снижение количества РНК наибольшее, супрессия нонсенс мутаций наблюдается на среде не содержащей паромомицина Чувствительности метода оценки экспресси гена по уровню активности ß-галактозидазы E.coli в случае аллели .yw/;35AABFl было недостаточно, поэтому этим методом уровень экспрессии у аллели sHpiJAABFl определить не удалось.
Полученные нами данные об изменении количества мРНК гена SUP35 с делецией сайта связывания Abfl (мутация лм/?55ААВР1) не противоречат результатам, полученным в работе Дагкессаманской с соавторами (Dagkessamanskaya et al., 1997). Однако в вышеуказанной работе количество
мРНК гена 5С1Р35 уменьшалось в 2,7 раза. Авторы использовали для работы делеционные варианты гена 5£/Р55 (делеции 5'-части гена 5£/Р35 или деления 5'-части и мутация сайта связывания АЬЛ, слитые с генов репортером вш и интегрированные в ген С/ЯАЗ). Возможно, отсутствие большого участка 5'-района 1ена 5С/Р35 и расположение в другом хромосомном окружении привело к меньшему снижению экспрессии гена 5£/Р35.
Рисунок 4 Оценка количества РНК 1ена ЯиР35 у промоторных мутантов В работе использовали штамм 19А-Д780 и его прошводные Общую РНК гибридизовали со специфическими пробами генов З'С/РЗЗ или АСТ1. мРНК гена АСТ1 была использована в качестве конгроля
SUP3S
АСТ1
g 450
z з 400
5 § 350
£ 5 зоо о
i z 250
3 я 200
Рисунок 5. Оценка экспрессии 1ена SUP35 у аллелей с промоторными мутациями. Измерение активности ß-галактозидазы Е. coli проводили в конструкциях, 1де промоторная область гена SUP35 и его мутантных аллелей была слита с геном LacZE coli
SUP3S
sup35-4МВР1
sup35- sup35-AGCN4 2IREB1 (A,B,C)
Оценка количества белка гена 8ЦР35 у промоторных мутантов. На рис. 6. представлены результаты иммуногибридизации с антителами к белку 8ир35 тотального белка, выделенного из производных штамма 19А-Д780, несущего ген Я11Р35 с промоторными мутациями. Статистически достоверно количество белка изменяется (уменьшается в 13 раз) у аллели я(р35ДАВР1.
С1 О # ##
I Ii
*
I £
2?
//
* £ г
Рисунок 6 Иммуногибридизация тотального белка, выделенного из штаммов с различными промоторными мутациями в гене ЗС1Р35 с антителами к гену 5СР35
Оценка вчияиия мутаций в кодоиах АТГ гена SUP35 дикого типа и алчет sup35AABFl на жизнеспособность дрожжей.
Показано, что ген SUP35 кодирует два транскрипта- один 2,3 т.п о., соответствует полноразмерному гену, второй (минорный) - 1,4 т.п.о., соответствует 3' части гена. Ген SUP35 является жизненно важным, его деления приводит к летальности у дрожжей. Триплеты АТГ находятся в одной фазе считывания в позициях 1, 124, 254 гена SUP35. С помощью сайт направленного олигонуклеотидного мутагенеза были получены мутации в каждом из триплетов АТГ. При изучении влияния мутаций триплетов АТГ мы попытались оценить возможную роль минорного транскрипта, соответствующего 3' части гена, в поддержании жизнеспособности дрожжей. Предполагалось, что мутация АТГ! позволит получать белковый продукт только с триплетов АТГ)24 или АТГ2я, а получение мутаций в триплетах АТГ124 или АТГ254 - будет приводить к отсутствию белкового продукта, получаемого с минорного транскрипта.
Мы показали, что инактивация первого стартового кодона в гене SUP35 дикого типа АТГ,—>АГГ или ДАТП приводит к нежизнеспособности клеток дрожжей. Мутации АТГ^—>АГТ, АТГ124—>ТГТ и АТГ254—>ТГТ не приводят к летальности Нами так же были получены мутации АТГ]24—>АГГ и АТГ|24—>ТГГ и АТГ2<м—>ТГТ у алллели гена SUP35 с делецией сайта для связывания белка Abfl -аллели íí/jp5JAABF,AGGi24, ím/?35AABF,TGGi24, .sM/>35AABF,TGG2<j4 . Сочетание этих мутаций так же не приводили к летальности. Полученные результаты свидетельствуют о том, что минорного транскрипта гена SUP35 либо не существует, либо количеста белка, получаемого с минорного транскрипта, недостаточно для обеспечения жизнеспособности клеток.
Изучение влияния компонентов комплексов SWI/SNF и SAGA на экспрессию гена SUP35. Мы проанализировали влияние основных субъединиц комплексов, функцией которых является контроль транскрипции и изменение структуры хроматина. Белковый комплекс SAGA отвечает за модификацию гистонов -ацетилирование, которое, как правило, коррелирует с транскрипционной активностью генов. Основная функциональная субъеденица SAGA - белок коактиватор Gcn5, гистонацетилтрансфераза Второй тестируемый комплекс - это SWI/SNF. Комплекс использует энергию гидролиза АТФ для изменения структуры хроматина (сбрасывания, сдвига или переноса нуклеосом). Ген SNF2, кодирующий ДНК зависимую АТФазу, является основным компонентом комплекса. Оба комплекса эволюционно консервативны. В регуляции транскрипции индивидуальных генов могут участвовать либо оба комплекса одновременно, либо регуляция транскрипции может осуществляться независимо тем или другим комплексом. Для генов HIS3, TRP3, IL VI, НО, SUC2, PII05 и гена РН08 показано участие в регуляции экспрессии комплекса SAGA; SWI/SNF комплекс влияет на транскрипцию генов SUC2, ¡NO], ПО, ADH2 РН08 и не влияет на транскрипцию PHOS, LEU2. Комплекс SW1/SNF принимает активное участие в регуляции экспрессии генов, связанных с клеточным циклом.
Изучение влияния комплексов SWI/SNF и SAGA на экспрессию гена SUP35 проводилось на изогенных штаммах, несущих делеции генов GCN5, SNF2 или SPT20 (белок Spt20 отвечает за сборку комплекса SAGA). Экспрессию гена SUP35 оценивали по уровню активности ß-галактозидазы E.coli у трансформантов, несущих плазмиду pRZSUP35. Результаты измерений представлены на рис. 7.
В ходе анализа было установлено, что при делеции генов GCN5 и SPT20 -экспрессия гена SUP35 уменьшается в 2 раза, а при делеции гена SNF2 - в 3-4 раза. Таким образом, можно говорить, что оба комплекса участвуют в регуляции экспресиии гена SUP35.
Заключение В регуляторной области гена SUP35 картированы два участка гиперчувствительности к ДНКазе! и микрококковой нуклеазе, и район, занятый нуклеосомами. При геномном футпринтинге in vivo были выявлены сайты связывания регуляторных белков Mbpl, Abfl и Rebl. Наличие трех сайтов связывания белка Rebl и сайта связывания Abfl могут свидетельствовать о сложном механизме регуляции транскрипции гена SUP35. Изменение количества РНК гена SUP35 при делеции сайта связывания Abfl приводит к уменьшению количества белка гена SUP35 и нарушению терминации трансляции, что выражается в супрессии нонсенс мутаций. Плейотропных проявлений промоторных мутаций обнаружено не было. Делеции сайтов связывания белков Mbpl, Gcn4, Rebl (А) не имели какого либо фенотипического проявления. Нами показано, что мутации в триплетах АТГ124 и АТГ254 гена SUP35 и двойные мутации sm/?55-AABF,AGGi24, swp35-AABF,TGGi24, si/p5J-AABF,TGG254 к летальности не приводят. Мутация кодона АТГ1 - стартового кодона для трансляции - приводит к летальности клеток дрожжей. Обнаружено уменьшение уровня экспрессии гена SUP35 на фоне делеций генов, кодирующих основные субъединицы транскрипционных комплексов SAGA и SWI/SNF, что указывает на участие этих комплексов в регуляции транскрипции гена SUP35.
ВЫВОДЫ.
1. Картированы два сайта гиперчувствительности к ДНКазеГ и микрококковой нуклеазе в промоторной области гена SUP35, и район, занятый нуклеосомами, в кодирующей части гена SUP35.
Рисунок 7. Оценка экспрессии гена SUP35 в штаммах дрожжей с делениями генов, кодирующих субьеденицы комплексов SAGA (GCN5.SPT20) и SWSNPY57VF2J. И ¡чсрснис активности ß-галактозидазы Е coli проводили при использовании плазмиды, где промоторная область гена SUP35 была слита с геном LacZ Е coli
д. т. gen 5А
sn/2b. spt20&
2. Анализ нуклеотидной последовательности гена SUP35 подтвердил наличие консенсус-последовательностей для связывания регуляторных белков Gcn4, Rebl (сайт В) и Abfl в промоторе гена SUP35. Дополительно нами обнаружены консенсус-последовательности для связывания белка Mbpl и два сайта для связывания белка Rebl (сайты А и С).
3. Экспериментально подтверждено наличие сайтов связывания для белков Mbpl, Rebl (сайты А и В) и Abfl в промоторной области гена SUP35.
4. Показано влияние мутаций сайтов связывания регуляторных белков Abfl и Rebl на экспрессию гена SUP35 и на эффективность терминации трансляции.
5. Показано влияние компонентов транскрипционных комплексов SAGA (белки Gcn5, Spt20) и SWI/SNF (белок Snf2) на экспрессию гена SUP35.
6. Инактивация триплета АТГ| гена SUP35 летальна Мутации триплетов АТГш и АТГ254 к летальности не приводят.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Л.Г. Водопьянова, Н.А. Рябинкова, Т.Н. Осипова. (1996) Влияние источников углерода на экспрессию гена SUP35 дрожжей Sacchoromyces cerevisiae. Тезисы XII Всероссийского симпозиума «Структура и функция клеточного ядра», Санкт-Петербург, 22-24 октября 1996 г. Цитология. 3:118.
2. Н А.Рябинкова. Л.Г.Водопьянова, М.Г. Самсонова , Е.М. Мясникова, Т.Н. Осипова. (1997) Структурно-функциональная организация хроматина гена SUP35 дрожжей Sacchoromyces cerevisiae. Генетика. 33 (2): 202-208.
3. Ryabinkova N.A.. Vodopyanova L.G., Osipova T.N. (1996) The relationship between chromatin structure and expression of SUP35 gene in yeast Sacchoromyces cerevisiae. Abstracts of 1996 Yeast Genetics and molecular biology meeting. University of Wisconsin, August 6-11. Program and abstracts volume, p. 185.
4. Рябинкова H.A.. Полозков Г.В Инге-Вечтомов С.Г. (2003) Изучение роли минорного транскрипта гена SUP35 дрожжей Sacchoromyces cerevisiae. Тезисы 2-й конференции МОГиС, 20-21 февраля 2003 г. "Актуальные проблемы генетики" 20:115.
5. Ryabinkova, N.A.. Borchsenius, A.S., Ingc-Vechtomov, S.G. (2003) Localization of cis-acting regulatory elements in promoter region of SUP35 gene of Sacchoromyces cerevisiae and phenotypic analysis of mutants with their disruptions. Abstracts of the XXIst International Conference on Yeast Genetics and Molecular biology Yeast, 20 (SI): 117.
6. Рябинкова H.A., Борхсениус A.C., Инге-Вечтомов (2004). Влияние делеции сайта связывания транскрипционного фактора Abfl на экспрессию и функцию гена SUP35. Тезисы III съезда ВОГиС, Москва, 6-12 июня, 2004. Генетика в XXI веке-. 40 (S2): 342.
Подписано в печать /£.04.2006. Формат бумаги 60 х 84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 3763.
Отпечатано в отделе оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ. 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр.26
//S7f I
»S1 1 5 8 t
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рябинкова, Наталья Анатольевна
Введение
Глава 1. (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1 .Белковые комплексы, контролирующие структуру хроматина и транскрипцию генов 1.1. Типы структурной организации хроматина промоторных областей 7 генов дрожжей.
1.2. АТФ-зависимые комплексы реорганизации структуры хроматина 10 (ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Complex).
1.2.1 Структура комплексов и характеристика субъедениц.
1.2.2. Характеристика активностей и механимы действия белковых 15 комплексов, осуществляющих перестройку структуры хроматина.
1.2.3. Взаимодействие с промоторами.
1.2.4. Комплексы реорганизации структуры хроматина и клеточный 21 цикл.
1.3 Белковые комплексы, модифицирующие структуру хроматина.
1.3.1 Гистонацетилтрансферазные комплексы дрожжей.
1.3.2. Гистонацетилтрансферазные комплексы человека.
1.3.3 Гистонацетилтрансферазный комплекс МБЬ БгозоркИа.
1.4 Взаимодействие комплексов модификации гистонов и комплексов АТФ-зависимой перестройки хроматина при регуляции экспрессии генов.
1.5 Транскрипционные коактиваторы не влияющие непосредственно 32 на изменение структуры хроматина при активации экспрессии генов. 1.5.1. Факторы, взаимодействующие с ТВР (ТВР associated factors').
1.5.2 Медиатор БЫВ.
1.6. Транскрипционные факторы Яар1, АЬП, 11еЬ1.
1.7 Ген ££/Р35 дрожжей & сегеушяе - его роль в контроле трансляции 41 и других клеточных процессах.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 46 2.1. Штаммы и плазмиды, использованные в работе.
2.2 Среды и условия культивирования.
2.3. Генетические методы.
2.4. Молекулярно-биологические методы.
2.4.1. Сайт-направленный мутагенез.
2.4.2. Определение активности р-галактозидазы.
2.4.3. Непрямое концевое мечение.
2.4.4 Геномный футпринтинг in vivo.
2.5. Статистическая обработка результатов.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Анализ структурной организации хроматина гена SUP35 методом "непрямого мечения концов".
3.2. Анализ мест ДНК-белкового взаимодействия in vivo в 66 промоторной области гена SUP35.
3.3. Анализ влияния промоторных мутаций на функции гена SUP
3.4 Анализ влияния промоторных мутаций на экспрессию гена SUP
3.5 Оценка количества белка гена SUP35 у промоторных мутантов.
3.6. Оценка влияния мутаций в кодонах АТГ гена SUP35 дикого типа 83 и аллели .sm/?35-ДАВИ на жизнеспособность дрожжей.
3.7. Изучение влияния компонентов комплексов SWI/SNF и SAGA на экспрессию гена SUP35.
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Цис- и транс-действующие факторы, контролирующие экспрессию гена SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae"
Обзор литературы. ВВЕДЕНИЕ. Хорошо известно, что регуляция эукариотических геиов осуществляется на нескольких уровнях: транскринционном, трансляционном и носттрансляционном. Первый из них транскрииционный, часто является онределяющим. На этом уровне в регуляцию вовлекаются многочисленные белковые факторы, взаимодействующие с регуляторными элементами ДНК. Характерным для эукариотического генома является наличие нуклеосомного и более высоких структурных уровней организации хроматина. Регуляторные изменения нрежде всего выражаются в деконденсации генетического материала, которая сонровождается модификацией гистонов, удалением нуклеосом и формированием участков с новышенной чувствительностью к разным агентам. В последние годы у эукариот обнаружены консервативные белковые комплексы, работа которых облегчает взаимодействие транскринционных факторов с ДНК. Это комплексы, осуществляющие модификацию гистонов (ацетилирование и деацетилирование), и комплексы АТФ-зависимого изменения структуры хроматина. Механизмы регуляции экснрессии генов, осуществляемые транскрипциопными активаторами, комплексами модификации гистонов и/или комплексами АТФ-зависимой перестройки структуры хоматина, являются нредметом активного изучения. Показано неносредственное взаимодействие ДНК-связывающих транскрипционных активаторов комнлексов с комнонентами комнлексов модифицикации гистонов и АТФ-зависимой нерестройки хроматина. При изучении экспрессии ряда гепов выявлепо, в одних случаях, участие и комплексов модификации гистонов, и комнлексов АТФ-зависимой перестройки хроматина; в других участие только одного из этих типов комплексов. В настоящее время механизмы действия этих комнлексов и входящих в их состав коактиваторов изучены лищь для небольшого числа генов. Регуляция транскринции генов, кодирующих компоненты аппарата трансляции, изучена недостаточно. Хорошо изучена транскрипция генов, кодирующих белки рибосомы. Данные о регуляции транскринции генов, кодирующих факторы элонгации и терминации нами был трансляции выбран ген практически SUP35 отсутствуют. S. Для исследования дрожжей cerevisiae, кодирующий эволюционно консервативный у эукариот фактор терминации трансляции eRF3. Помимо основной функции терминации трансляции, Sup35 участвует в контроле клеточного цикла. Для белка Sup35 показана способность переходить в прионпую форму. Предметом наших исследований стал анализ структуры хроматина 5регуляторной области гена для SUP35, идентификация с регуляторных последовательностей взаимодействия транскрипциоппыми в случае промоторных на эффектив1юсть активаторами, оцепка уровня экспрессии SUP35 мутаций и влияние изменения экснрессии SUP35 терминации трансляции и на другие функции продукта этого гена. В работе было оценено участие трапскринционных коактиваторов, входящих в состав комплекса ацетилирования гистонов или комнлекса АТФ-зависимой перестройки хроматина, в контроле экспрессии SUP35.Белковые комплексы, контролирующие структуру хроматина и транскрипцию генов. 1.1. Тины структурной организации хроматина нромоторных областей генов дрожжей. Принципы организации структуры хроматина привлекают внимание ученых с давних пор. К настоящему времени охарактеризована структура 5регуляторных областей для большого числа генов дрожжей, контролирующих в клетке различные процессы. Несмотря на различия в нрограммах активации транскрипции различпых генов, на сегодняшний день можно выделить общие этапы инициации транскрипции. затем Сначала сборка происходит связывание транскрипционного активатора, транскринционных коактиваторов и комплекса преипициации транскрипции. В случае если ТАТА бокс или другие регуляторные элементы находятся в составе нуклеосомы, создаются препятствия для взаимодействия транскрипционных факторов со своими сайтами узнавания. Структуру хроматина промоторных областей изученных генов можно
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Рябинкова, Наталья Анатольевна
выводы.
1. Картированы два сайта гиперчувствителыюсти к ДНКазе I и микрококковой нуклеазе в промоторной области гена SUP35, и район, занятый нуклеосомами, в кодирующей части гена SUP35.
2. Анализ нуклеотидной последовательности гена SUP35 подтвердил наличие консенсус-последовательностей для связывания регуляторных белков Gcn4, Rebl (В сайт) и Abfl в промоторе гена SUP35. Дополнительно нами обнаружены консенсус-последовательности для связывания белка Mbpl и два сайта для связывания белка Rebl (сайты А и С).
3. Экспериментально подтверждено наличие сайтов связывания для белков Mbpl, Rebl (сайты А и В) и Abfl в промоторной области гена SUP35.
4. Показано влияние мутаций сайтов связывания регуляторных белков Abfl и Rebl на экспрессию гена SUP35 и на эффективность терминации трансляции.
5. Показано влияние компонентов транскрипционных комплексов SAGA (белки Gcn5, Spt20) и SWI/SNF (белок Snf2) на экспрессию гена SUP35.
6. Инактивация триплета АТП гена SUP35 летальна. Мутации триплетов АТГ]24 и АТГ254 к летальности не приводят.
БЛАГОДАРНОСТИ.
В заключение хочется поблагодарить моих коллег за внимание, помощь и поддержку при выполнении работы. Я благодарю профессора, руководителя лаборатории физиологической генетики Санкт-Петербургского государственного университета Сергея Георгиевича Инге-Вечтомова за внимание к моим научным интересам. Степченкову Елену Игоревну, Борхсениуса Андрея Сергеевича, Шумегу Андрея Романовича и Рубеля Александра Анатольевича за помощь при оформлении работы и участии в проведении отдельных экспериментов.
Заключение.
В регуляторной области гена SUP35 картированы два участка гиперчувствительности к ДНКазе I и микрококковой нуклеазе и район, занятый нуклеосомами. При геномном футпринтинге in vivo были выявлены сайты для связывания регуляторных белков Mbpl, Abfl и Rebl. Наличие трех сайтов связывания для белка Rebl и сайта связывания Abfl могут свидетельствовать о сложном механизме регуляции транскрипции гена SUP35. Изменение количества РНК гена SUP35 при делеции сайта для связывания Abfl приводит к уменьшению количества белка Sup35 и нарушению терминации трансляции, что выражается в супрессии нонсенс мутаций. Плейотропиых проявлений промоторных мутаций обнаружено не было. Делеции сайтов связывания белков Mbpl, Gcn4, Rebl(A) не имела какого либо фенотипического проявления. Нами показано, что мутаций в триплетах АТГ124 и АТГ254 гена SUP35 и совместные мутации АТГ124 и sup35-AKBV\ или АТГ254 и sup35-AP&F\ к летальности не приводят. Мутация кодона АТГ1 - стартового кодона для трансляции - приводит к летальности клеток дрожжей. Обнаружено уменьшение уровня экспрессии гена SUP35 на фоне делеций генов, кодирующих основные субъединицы комплексов SAGA и SWI/SNF, что указывает на участие этих комплексов в регуляции транскрипции гена SUP35.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рябинкова, Наталья Анатольевна, Санкт-Петербург
1. Глотов Н.В., Животовский H.A., Хованов Н.В., Хромов-Борисов H.H. (1982). Биометрия. JL: Изд-во ЛГУ. 264 с. ® 2. Инге-Вечтомов С.Г. (1964). Реверсии к прототрофности у дрожжей,нуждающихся в аденине. Вест. ЛГУ: Сер. Биол. 2: 112-116.
2. Волков К.В., Куришко К., Инге-Вечтомов С.Г., Миронова Л.Н. (2000).
3. Полиморфизм гена SUP35 и его продукта у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Генетика. 35: 1-4.
4. Инге-Вечтомов С.Г., Л.Н. Миронова, М.Д. Тер-Аванесян. Неоднозначность трансляции: версия эукариот? (1994) Генетика, Т.30,1. С.1022-1035.
5. Инге-Вечтомов С. Г. (1971). Идентификация некоторых групп сцепления у Петергофских генетических линий дрожжей. Генетика. 7: 113-124.
6. Инге-Вечтомов С.Г. и Андрианова В.М. (1988) Каталог (указатель) Петергофской генетической коллекции дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Л., Изд-во ЛГУ. 53 с.
7. Захаров И.А., Кожина Т.Н., Кожин С.А., Федорова И.В. (1984). Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука. 144 с.
8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. ® Методы генетической инженерии. Пер. с англ. Мир. -1984.
9. Миронова Л.Н. Генетический и эпигенетический контроль считывания стоп-кодонов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Автореферат докт. дисс., Санкт-Петербург, 2002.
10. Ю.Телков М.В., Сургучев А.П., Дагкесаманская А.Р., Тер-Аванесян М.Д. (1986). Выделение фрагмента ДНК, содержащего ген SUP35. Генетика. 22: 17-25.
11. П.Чернов Ю.О., Деркач И.Л., Дагкесаманская А.Р., Тихомирова В.Л., Тер-Аванееян М.Д., Инге-Вечтомов С.Г. (1988). Нонсенс-супрессия при амплификации гена, кодирующего белковый фактор трансляции // Докл. АН СССР. 301: 1227-1229.
12. Тиходеев О.Н., Гетманова Е.В., Тихомирова В.Л., Инге-Вечтомов С.Г. (1990). Неоднозначность трансляции у дрожжей: генетический контроль и модификации (В сб.: Молекулярные механизмы генетических процессов). М.: Наука. 218-228.
13. Apone LM, Virbasius CM, Reese JC, Green MR.Yeast TAF(II)90 is required for cell-cycle progression through G2/M but not for general transcription activation. Genes Dev. 1996 Sep 15;10(18):2368-80.
14. Ausubel F, R. Brent, R. Kingstone, D. Moore, J. Seidman J. Smith, K. Struhl Current protocol in molecular biology, 1989, Publisched by Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience 13.6.1-13.6.4).
15. Bean J., Siggia E and Cross F1 High Functional Overlap Between Mlul Cell-Cycle Box Binding Factor and Swi4/6 Cell-Cycle Box Binding Factor in the Gl/S Transcriptional Program in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 2005 171:49-61
16. Belotserkovskaya R, Berger SLInterplay between chromatin modifying and remodeling complexes in transcriptional regulation. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 1999;9(3-4):221-30.
17. Belotserkovskaya R, Sterner DE, Deng M, Sayre MH, Lieberman PM, Berger SL.Inhibition of TATA-binding protein function by SAGA subunits Spt3 and Spt8 at Gcn4-activated promoters. Mol Cell Biol. 2000 Jan;20(2):634-47.
18. Biggar SR, Crabtree GR.Continuous and widespread roles for the Swi-Snf complex in transcription. EMBO J. 1999 Apr 15;18(8):2254-64.
19. Bjorklund S, Kim YJ.Mediator of transcriptional regulation. Trends Biochem Sci. 1996 Sep;21(9):335-7.
20. Borchsenius A. S., A. A. Tchourikova and S. G. Inge-Vechtomov. Recessive mutations in SUP35 and SUP45 genes coding for translation release factors affect chromosome stability in Saccharomyces cerevisicie (2000) Curr Genet, V.37, P.285-91.
21. Bradley M. E., S. Bagriantsev, N. Vishveshwara and S. W. Liebman. Guanidine reduces stop codon read-through caused by missense mutations in SUP35 or SUP45 (2003) Yeast, V.20, P.625-32.
22. Breeden L, Nasmyth K. Cell cycle control of the yeast HO gene: cis- and transacting regulators. Cell. 1987 Feb 13;48(3):389-97.
23. Brownell JE, Allis CD.Special HATs for special occasions: linking histone acetylation to chromatin assembly and gene activation. Curr Opin Genet Dev. 1996 Apr;6(2): 176-84. Review.
24. Burns, L. and C.L. Peterson. 1997. Protein complexes for remodeling chromatin. Biochem. Biophys. Acta 1350: 159-168.
25. Cairns BR, Kim YJ, Sayre MH, Laurent BC, Kornberg RD. A multisubunit complex containing the SWI1/ADR6, SWI2/SNF2, SWI3, SNF5, and SNF6 gene products isolated from yeast. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Mar 1 ;91(5):1950-1954.
26. Cairns BR, Lorch Y, Li Y, Zhang M, Lacomis L, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Du J, Laurent B, Kornberg RD. RSC, an essential, abundant chromatin-remodeling complex. Cell. 1996 Dec 27;87(7): 1249-60.
27. Cao Y, Cairns BR, Kornberg RD, Laurent BC. Sfhlp, a component of a novel chromatin-remodeling complex, is required for cell cycle progression. Mol Cell Biol. 1997 Jun;17(6):3323-34.
28. Chernoff Y.O., Derkach I.L., Inge-Vechtomov S.G. (1993) Multi-copy SUP35 gene induses de-novo appearance of psi-like factors in yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 34: 268-270.
29. Clarke AS, Lowell JE, Jacobson SJ, Pillus L.Esalp is an essential histone acetyltransferase required for cell cycle progression. Mol Cell Biol. 1999 Apr; 19(4):2515-26.
30. Cosma, M.P., T. Tanaka, and K. Nasmyth. 1999. Ordered recruitment of transcription and chromatin re-modeling factors to a cell cycle and developmentally regulated promoter. Cell 978: 299-311.
31. Cosson B., A. Couturier, R. Le Guellec, J. Moreau, S. Chabelskaya, G. Zhouravleva and M. Philippe. Characterization of the poly(A) binding proteins expressed during oogenesis and early development of Xenopus laevis (2002c) Biol Cell, V.94, P.217-31.
32. Cote J, Peterson CL, Workman JL.Perturbation of nucleosome core structure by the SWI/SNF complex persists after its detachment, enhancing subsequent transcription factor binding. Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Apr 28;95(9):4947-52.
33. Cote J, Quinn J, Workman JL, Peterson CL.Stimulation of GAL4 derivative binding to nucleosomal DNA by the yeast SWI/SNF complex. Science. 1994 Jul l;265(5168):53-60.
34. Cox B.S. (1965). y, cytoplasmic suppressor of super-suppressor in yeast. Heredity. 20: 505-521.
35. Czaplinski K., N. Majlesi, T. Baneijee and S. W. Peltz. Mttl is a Upfl-likehelicase that interacts with the translation termination factors and whose overexpression can modulate termination efficiency. 2000. RNA, V.6, P.730-43.
36. Dagkessamanskaya A. R., Ter-Avanesian, M. D., Mager W.H. Transcriptional regulation of SUP35 and SUP45 in Saccharomyces cerevisiae.\991. Yeast, V.13, P.1265-12745.
37. O 41.Davis DR, Stillman DJ. Altered structure of the DNA duplex recognized byyeast transcription factor Reblp. Nucleic Acids Res. 1997 Feb l;25(3):668-74.
38. Derkatch I.L., Chernov Y.O., Kushnirov V.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. (1996). Genesis and variability of PSI. prion factors in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 144: 1375-1383.
39. Dhasarathy A. and M. P. Kladde. Promoter Occupancy Is a Major Determinant of Chromatin Remodeling Enzyme Requirements. MCB, 2005, p. 2698-2707 Vol. 25, No. 7/
40. Dimova D, Nackerdien Z, Furgeson S, Eguchi S, Osley MA. A role for transcriptional repressors in targeting the yeast Swi/Snf complex. Mol Cell.1999 Jul;4(l):75-83.
41. Dudley AM, Rougeulle C, Winston F. The Spt components of SAGA facilitate TBP binding to a promoter at a post-activator-binding step in vivo. Genes Dev. 1999 Nov 15;13(22):2940-5.
42. Dunaief JL, Strober BE, Guha S, Khavari PA, Alin K, Luban J, Begemann M, Crabtree GR, Goff SP. The retinoblastoma protein and BRG1 form a complex and cooperate to induce cell cycle arrest. Cell. 1994 Oct 7;79(1):119-30.
43. Eberharter A, Sterner DE, Schieltz D, Hassan A, Yates JR 3rd, Berger SL, Workman JL. The ADA complex is a distinct histone acetyltransferase complex in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 1999 0ct;19(10):6621-31.
44. Elfring LK, Deuring R, McCallum CM, Peterson CL, Tamkun JW.1.entification and characterization of Drosophila relatives of the yeasttranscriptional activator SNF2/SWI2. Mol Cell Biol. 1994 Apr;14(4):2225-34.
45. Fascher K.D., Schmitz J., Horz W. Role of transactivating proteins in the generation of active chromatin at the PH05 promoter in S.cervisiae 1990.1. EMBO J. v.9. P.2523-2528.
46. Fedor MJ, Lue NF, Kornberg RDStatistical positioning of nucleosomes by specific protein-binding to an upstream activating sequence in yeast. J Mol Biol. 1988 Nov 5;204(1): 109-27.
47. Flanagan PM, Kelleher RJ 3rd, Sayre MH, Tschochner H, Kornberg RD.mediator required for activation of RNA polymerase II transcription in vitro. Nature. 1991 Apr 4;350(6317):436-8.
48. Gailus-Durner V, Xie J, Chintamaneni C, Vershon AK.Participation of the yeast activator Abfl in meiosis-specific expression of the HOP1 gene. Mol Cell
49. Biol. 1996 Jun;16(6):2777-86.
50. Gaudreau L, Schmid A, Blaschke D, Ptashne M, Horz WRNA polymerase II holoenzyme recruitment is sufficient to remodel chromatin at the yeast PH05 promoter. Cell. 1997 Apr 4;89(l):55-62.
51. Georgakopoulos T. Thireos G Two distinct yeast transcriptional activators require the function of the GCN5 protein to promote normal levels of transcription. EMBO J. 1992 Nov;ll(ll):4145-52.
52. Georgel PT, Tsukiyama T, Wu C. Role of histone tails in nucleosome remodeling by Drosophila NURF. EMBO J. 1997 Aug l;16(15):4717-26.
53. Grant PA, Schieltz D, Pray-Grant MG, Steger DJ, Reese JC, Yates JR 3rd, Workman JL. A subset of TAF(II)s are integral components of the SAGA complex required for nucleosome acetylation and transcriptional stimulation. Cell. 1998 Jul 10;94(l):45-53 (a).
54. Grant PA, Schieltz D, Pray-Grant MG, Yates JR 3rd, Workman JL.The ATM-related cofactor Tral is a component of the purified SAGA complex. Mol Cell. 1998 Dec;2(6):863-7 (6).
55. Grant PA, Sterner DE, Duggan LJ, Workman JL, Berger SL. The SAGA unfolds: convergence of transcription regulators in chromatin-modifying complexes. Trends Cell Biol. 1998 May;8(5): 193-7. Review (b).
56. Gregory PD, Schmid A, Zavari M, Lui L, Berger SL, Horz W.Absence of Gcn5 HAT activity defines a novel state in the opening of chromatin at the PH05 promoter in yeast. Mol Cell. 1998 Mar;l(4):495-505.
57. Guyon, J.R., G.J. Narlikar, S. Sif, and R.E. Kingston. 1999. Stable remodeling of tailless nucleosomes by the human SWI-SNF complex. Mol. Cell. Biol. 19: 2088-2097.
58. Hampsey M. Molecular genetics of the RNA polymerase II general ® transcriptional machinery. Microbiol Mol Biol Rev. 1998 Jun;62(2):465-503
59. Hardy CF, Sussel L, Shore D.A RAP 1-interacting protein involved in transcriptional silencing and telomere length regulation. Genes Dev. 1992 May;6(5):801-14.
60. Henry, N. L., A. M. Campbell, W. J. Feaver, D. Poon, P. A. Weil, and R. D. Kornberg. 1994. TFIIF-TAF-RNA polymerase II connection. Genes Dev. 8:2868-2878.
61. Holstege, F.C., E.G. Jennings, J.J. Wyrick, T.I. Lee, C.J. Hengartner, M.R. Green, T.R. Golub, E.S. Lander, and R.A. Young. 1998. Dissecting the regulatory circuitry of a eukaryotic genome. Cell 95: 717-728.
62. Hoshino S., Imai M., Kobayashi T., Uchida N., Katada T. The eukaryotic polypeptide chain Releasing factor (eRF3/GSPT) carrying the translation signal to the 3'-poly(A) tail of mRNA (1999) The Journal of Biological Chemistry, V.274, P.16677-16680.
63. Hu YF, Hao ZL, Li R. Chromatin remodeling and activation of chromosomal DNA replication by an acidic transcriptional activation domain from BRCA1. Genes Dev. 1999 Mar 15;13(6):637-42.
64. Huibregtse JM, Engelke DR.Direct sequence and footprint analysis of yeast
65. DNA by primer extension. Methods Enzymol. 1991;194:550-62.
66. Inoue H, Nojima H, Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 1990 Nov 30;96(l):23-8.
67. Iyer V, Struhl K. Mechanism of differential utilization of the his3 TR and TC TATA elements. Mol Cell Biol. 1995 Dec;15(12):7059-66.
68. Jimenez JL, Nettleton EJ, Bouchard M, Robinson CV, Dobson CM, Saibil HR.
69. The protofilament structure of insulin amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Jul 9;99(14):9196-201. Epub 2002 Jul 1.
70. Kelleher RJ, Flanagan PM, Kornberg RD A novel mediator between activator proteins and the RNA polymerase II transcription apparatus. Cell. 1990 Jun 29;61(7): 1209-15.
71. Khavari PA, Peterson CL, Tamkun JW, Mendel DB, Crabtree GR. BRG1 contains a conserved domain of the SWI2/SNF2 family necessary for normalmitotic growth and transcription. Nature. 1993 Nov 11;366(6451): 170-4.
72. Kikuchi Y., Shimatake H., Kikuchi A. (1988). A yeast gene recuired for Gl-to-S transition encodes a protein containing an A-kinase target site and GTP-ase domain. EMBO J. 7: 1175-1182.
73. Kim YJ, Bjorklund S, Li Y, Sayre MH, Kornberg RD. .A multiprotein mediator of transcriptional activation and its interaction with the C-terminal repeat domain of RNA polymerase II. Cell. 1994 May 20;77(4):599-608.
74. Kingston R. and Geeta J. Narlikar ATP-dependent remodeling and acetylation as regulatorsof chromatin fluidity 1999. Genes & Development 13:2339—9 2352.1999
75. Krebs J.E., M.H. Kuo, C.D. Allis, and C.L. Peterson. 1999. Cell cycle-regulated histone acetylation required for expression of the yeast HO gene. Genes & Dev. 13: 1412-1421.
76. Krebs, J. E., C. J. Fry, M. L. Samuels, and C. L. Peterson. 2000. Global role for chromatin remodeling enzymes in mitotic gene expression. Cell 102:587-598.
77. Kruger W, Peterson CL, Sil A, Coburn C, Arents G, Moudrianakis EN, Herskowitz I. Amino acid substitutions in the structured domains of histones
78. H3 and H4 partially relieve the requirement of the yeast SWI/SNF complex for transcription. Genes Dev. 1995 Nov 15;9(22):2770-9.
79. Kundu TK, Wang Z, Roeder RG.Human TFIIIC relieves chromatin-mediated repression of RNA polymerase III transcription and contains an intrinsic histone• acetyltransferase activity. Mol Cell Biol. 1999 Feb;19(2):1605-15.
80. Kuo MH, Zhou J, Jambeck P, Churchill ME, Allis CD.Histone acetyltransferase activity of yeast Gcn5p is required for the activation of target genes in vivo. Genes Dev. 1998 Mar l;12(5):627-39.
81. Kushnirov V. V., M. D. Ter-Avanesyan, M. V. Telckov, A. P. Surguchov, V. N. Smirnov and S. G. Inge-Vechtomov. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae (1988) Gene, V.66, P.45-54.
82. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Surguchov A.P., Smirnov V.N., Inge
83. Vechtomov S.G. (1987). Localization of possible functional domains in SUP2 gene product of yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 215: 257-260.
84. Lascaris RF, Groot E, Hoen PB, Mager WH, Planta RJ. Different roles for abflp and a T-rich promoter element in nucleosome organization of the yeast RPS28A gene. Nucleic Acids Res. 2000 Mar 15;28(6): 1390-6.
85. Laurenson P, Rine J.Silencers, silencing, and heritable transcriptional states. Microbiol Rev. 1992 Dec;56(4):543-60.
86. Lee, M., and K. Struhl. 1997. A severly defective TATA-binding protein-TFIIB interaction does not preclude transcriptional activation in vivo. Mol. Cell. Biol.• 17:1336-1345.
87. Liebman S.W. and Sherman F. (1979). Extrachromosomal PSI+. determinant suppresses nonsense mutations in yeast. J.Bacteriol. 139: 1068-1071.
88. Lohr D. Isolation of yest nuclei and chromatin for studies of transcription related processes. Yeast apractical approch. Acad. Press. 1988. 4.P. 125-143.
89. Lorch, Y., M. Zhang, and R.D. Kornberg. 1999. Histone octamer transfer by a chromatin-remodeling complex. Cell 96: 389-392.
90. Lucchesi JC. Dosage compensation in flies and worms: the ups and downs of X-chromosome regulation. Curr Opin Genet Dev. 1998 Apr;8(2): 179-84. Review.
91. Marcus GA, Horiuchi J, Silverman N, Guarente L.ADA5/SPT20 links the ADA and SPT genes, which are involved in yeast transcription. Mol Cell Biol. 1996 Jun;16(6):3197-205.
92. Martinez E, Kundu TK, Fu J, Roeder RG.A human SPT3-TAFII31-GCN5-L acetylase complex distinct from transcription factor IID. J Biol Chem. 1998 Sep 11;273(37):23781-5. Erratum in: J Biol Chem 1998 Oct 16;273(42):27755.
93. Martinez-Garsia J.F., Estruch F., J.E. Perz-Ortin Chromatin structure of the 5'flanking region of the yeast LEU2 genes. 1989. MGG. 217:464-470.
94. McIntosh EM, Ord RW, Storms RK. Transcriptional regulation of the cell cycle-dependent thymidylate synthase gene of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 1988 Nov;8(ll):4616-24.
95. McLean M, Hubberstey AV, Bouman DJ, Pece N, Mastrangelo P, Wildeman AG. Organization of the Saccharomyces cerevisiae actin gene UAS: functional significance of reiterated REB1 binding sites and AT-rich elements. Mol Microbiol. 1995 Nov;18(4):605-14.
96. McMahon SB, Van Buskirk HA, Dugan KA, Copeland TD, Cole MD.The novel ATM-related protein TRRAP is an essential cofactor for the c-Myc and E2F oncoproteins. Cell. 1998 Aug 7;94(3):363-74.
97. Meller VH.Dosage compensation: making IX equal 2X. Trends Cell Biol. 2000 Feb;10(2):54-9. Review.
98. Miyake, T., C. M. Loch, and R. Li. 2002. Identification of a multifunctional domain in autonomously replicating sequence-binding factor 1 required for transcriptional activation, DNA replication, and gene silencing. Mol. Cell. Biol. 22:505-516.
99. Mizzen CA, Yang XJ, Kokubo T, Brownell JE, Bannister AJ, Owen-Hughes T, Workman J, Wang L, Berger SL, Kouzarides T, Nakatani Y, Allis
100. CD.The TAF(II)250 subunit of TFIID has histone acetyltransferase activity. Cell. 1996 Dec 27;87(7): 1261-70.
101. Moqtaderi, Z., Y. Bai, D. Poon, P. A. Weil, and K. Struhl. 1996. TBP associated factors are not generally required for transcriptional activation in• yeast. Nature 383:188-191.
102. Moreira JM, Holmberg S.Transcriptional repression of the yeast CHA1 gene requires the chromatin-remodeling complex RSC. EMBO J. 1999 May 17;18(10):2836-44.
103. Moreira JM, Holmberg S.Transcriptional repression of the yeast CHA1 gene requires the chromatin-remodeling complex RSC. EMBO J. 1999 May 17;18(10):2836-44.
104. Morrow BE, Ju Q, Warner JR.A bipartite DNA-binding domain in yeast
105. Reblp. Mol Cell Biol. 1993 Feb; 13(2): 1173-82.
106. Morse RH.RAP, RAP, open up! New wrinkles for RAP1 in yeast.Trends Genet. 2000 Feb;16(2):51-3. Review.
107. Moskalenko S. E., S. V. Chabelskaya, S. G. Inge-Vechtomov, M. Philippe and G. A. Zhouravleva. Viable nonsense mutants for the essential gene SUP45 of Saccharomyces cerevisiae (2003) BMC Mol Biol, V.4, P.2.
108. Murphy DJ, Hardy S, Engel DA.Human SWI-SNF component BRG1 represses transcription of the c-fos gene.Mol Cell Biol. 1999 Apr;19(4):2724-33.
109. Myers, L.C., C.M. Gustafsson, D.A. Bushnell, M. Lui, H. Erdjument
110. Bromage, P. Tempst, and R.D. Kornberg. 1998. The Med proteins of yeast and their function through the RNA polymerase II carboxy-terminal domain. Genes & Devi 2: 45-54.
111. Natarajan K, Jackson BM, Zhou H, Winston F, Hinnebusch AG. Transcriptional activation by Gcn4p involves independent interactions with the SWI/SNF complex and the SRB/mediator. Mol Cell. 1999 Oct;4(4):657-64.
112. Natarajan K., Meyer M., Jeckson B., Slade D., Roberts C., Hinnebusch A., Marton J. Transcription profiling Shows that Gcn4p is a master Regulator of gene expression during amino acid starvation in Yeast. 2001. MCB, July, p. 4347-4368.
113. Nedospasov SA, Georgiev GP. Non-random cleavage of SV40 DNA in the compact minichromosome and free in solution by micrococcal nuclease.Biochem Biophys Res Commun. 1980 Jan 29;92(2):532-9.
114. Neef, D. W., and M. P. Kladde. 2003. Polyphosphate loss promotes SNF/ SWI- and Gcn5-dependent mitotic induction of PH05. Mol. Cell. Biol. 23:3788-3797.
115. Neely KE, Hassan AH, Wallberg AE, Steger DJ, Cairns BR, Wright AP, Workman JL. Activation domain-mediated targeting of the SWI/SNF complex to promoters stimulates transcription from nucleosome arrays. Mol Cell. 1999 Oct;4(4):649-55.
116. Neigebom L, Carlson M. Genes affecting the regulation of SUC2 gene expression by glucose repression in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 1984 Dec;108(4):845-58.
117. Newnam G. P., Wegrzyn R. D., Lindquist S. L., Chernoff, Y. O. (1999). Antagonistic interactions between yeast chaperones Hspl04 and Hsp70 in prion curing. Mol. Cell. Biol. 19: 1325-1333.
118. Nonet ML, Young RA. Intragenic and extragenic suppressors of mutations in the heptapeptide repeat domain of Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II. Genetics. 1989 Dec; 123(4):715-24.
119. Nouranil A, Utley R, Allard S and Co"te J. Recruitment of the NuA4 complex poises the PH05 promoter for chromatin remodeling and activation.The EMBO Journal (2004) 23, 2597-2607.
120. Ogryzko VV, Kotani T, Zhang X, Schiltz RL, Howard T, Yang XJ, Howard BH, Qin J, Nakatani Y.Histone-like TAFs within the PCAF histone acetylase complex. Cell. 1998 Jul 10;94(l):35-44.
121. Ozsarac N, Straffon MJ, Dal ton HE, Dawes IW Regulation of gene expression during meiosis in Saccharomyces cerevisiae: SPR3 is controlled by both ABFI and a new sporulation control element. Mol Cell Biol. 1997 Mar; 17(3): 1152-9.
122. Packham EA, Graham IR, Chambers A The multifunctional transcription factors Abflp, Raplp and Reblp are required for full transcriptional activation of the chromosomal PGK gene in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 1996 Feb 25;250(3):348-56
123. Paranjape SM, Kamakaka RT, Kadonaga JT. Role of chromatin structure in the regulation of transcription by RNA polymerase II. Annu Rev Biochem. 1994;63:265-97. Review.
124. Patino M.M., J.J. Liu, J.R. Glover, S. Lindquist. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. 1996 Science, V.273. P.622-626.
125. Paushkin S. V.,. Kushnirov, V. N. Smirnov and M. D. Ter-Avanesyan. Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion-dependent regulation (1997) Mol Cell Biol, V.17, P.2798-805.
126. Peterson C.L.Multiple Switches to turn on chromatin? Curr Opin Genet Dev. 1996 Apr;6(2): 171-5. Review.
127. Peterson CL, Herskowitz I. Characterization of the yeast SWI1, SWI2, and SWI3 genes, which encode a global activator of transcription. Cell. 1992 Feb 7;68(3):573-83. PetersonC.L/, and I. Herskowitz 1992. Cell 68:573-583.
128. Planta RJ, Goncalves PM, Mager WH. Global regulators of ribosome biosynthesis in yeast. Biochem Cell Biol. 1995 Nov-Dec;73(l l-12):825-34. Review
129. Planta RJ. Regulation of ribosome synthesis in yeast. Yeast. 1997 Dec;13(16): 1505-18. Review.
130. Pollard KJ, Peterson CL.Role for ADA/GCN5 products in antagonizing chromatin-mediated transcriptional repression. Mol Cell Biol. 1997 Nov; 17 (11):6212-22.
131. Raithatha S and Stuart D.Meiosis-Specific Regulation of the Saccharomyces cerevisiae S-Phase Cyclin CLB5 Is Dependent on Mlul Cell Cycle Box (MCB) Elements in Its Promoter but Is Independent of MCB-Binding Factor Activity Genetics 2005 169: 1329-1342.
132. Recht J. and Oasley M.A. Mutations in both the structured domain and N-terminus of histone H2B bypass the requirement for Swi-Snf in yeast.EMBO J. 1999 Jan 4;18(l):229-40.
133. Reid JL, Iyer VR, Brown PO, Struhl K. Coordinate regulation of yeast ribosomal protein genes is associated with targeted recruitment of Esal histone acetylase. Mol Cell. 2000 Dec;6(6): 1297-307.
134. Remacle JE, Holmberg S.A REB1-binding site is required for GCN4-independent ILV1 basal level transcription and can be functionally replaced by an ABF1-binding site. Mol Cell Biol. 1992 Dec;12(12):5516-26.
135. Roberts SM, Winston F. Essential functional interactions of SAGA, a Saccharomyces cerevisiae complex of Spt, Ada, and Gcn5 proteins, with the Snf/Swi and Srb/mediator complexes. Genetics. 1997 Oct; 147(2):451-65
136. Roberts SM, Winston F. SPT20/ADA5 encodes a novel protein functionally related to the TATA-binding protein and important for transcription in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 1996 Jun; 16(6):3206-13.
137. Rose M.D., Winston F., Hieter P. (1990). Methods in yeast genetics. NY: CSHL Press. 198p.
138. Sakurai H, Ohishi T, Fukasawa T. Core promoter elements are essential as selective determinants for function of the yeast transcription factor GAL11. FEBS Lett. 1996 Nov 25; 398(1): 113-9.
139. Saleh A, Schieltz D, Ting N, McMahon SB, Litchfield DW, Yates JR 3rd, Lees-Miller SP, Cole MD, Brandl CJ. Tralp is a component of the yeast Ada.Spt transcriptional regulatory complexes. J Biol Chem. 1998 Oct 9;273(41):26559-65.
140. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989). Molecular cloning. NY: Cold Spring Harbor Laboratory press. 3 V.
141. Samsonova M.G. and Inge-Vechtomov S.G. (1994). Sup2 proteins: the relation to elongation factors EF-Tu (EF-la) and the role of N-terminal extention. J. Gen. Res. 1: 279-295.
142. Schmidt M.E., Brown T.A., Trumpower B.L. (1990). A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 18: 3091-3092.
143. Scott EW, Baker HV.Concerted action of the transcriptional activators REB1, RAP1, and GCR1 in the high-level expression of the glycolytic gene TPI. Mol Cell Biol. 1993 Jan;13(l):543-50.
144. Shanahan F, Seghezzi W, Parry D, Mahony D, Lees E. Cyclin E associates with BAF155 and BRG1, components of the mammalian SWI-SNF complex, and alters the ability of BRG1 to induce growth arrest.Mol Cell Biol. 1999 Feb; 19(2): 1460-9.
145. Shen, W.C. and M.R. Green. 1997. Yeast TAF(II)145 functions as a core promoter selectivity factor, not a general coactivator. Cell 90: 615-624.
146. Shore D RAP1: a protean regulator in yeast. Trends Genet. 1994 Nov; 10(11):408-12. Review.
147. Sif S, Stukenberg PT, Kirschner MW, Kingston RE. Mitotic inactivation of a human SWI/SNF chromatin remodeling complex. Genes Dev. 1998 Sep 15; 12(18):2842-51.
148. Silve S, Rhode PR, Coll B, Campbell J, Poyton RO.ABF1 is a phosphoprotein and plays a role in carbon source control of COX6 transcription in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 1992 Sep; 12(9):4197-208.
149. Stansfield I., L. Eurwilaichitr, Akhmaloka and M. F. Tuite. Depletion in the levels of the release factor eRFl causes a reduction in the efficiency of translation termination in yeast (1996) Mol Microbiol, V.20, P.l 135-43.
150. Steger D. J., Workman J. L. Remodeling chromatin structures for transcription: what happens to the histons? 1996. BioEssays 18:875-884.
151. Stern M, Jensen R, Herskowitz I. Five SWI genes are required for expression of the HO gene in yeast. J Mol Biol. 1984 Oct 5; .178(4):853-68.
152. Sterner DE, Berger SL. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiol Mol Biol Rev. 2000 Jun; 64(2):435-59. Review.
153. Surguchov A.P., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D., Inge-Vechtomov S.G. (1984). Ribosomal suppression in eukaryotes. Phis. Chem. Biol. 4: 147-205.
154. Surguchov A.P., Telkov M.V., Smirnov V.N. (1986). Absence of strutural homology between SUP1 and SUP2 genes of Saccharomyces cerevisiae and identification of their transcripts. FEBS Lett. 206: 147-150.
155. Ter-Avanesyan M. D., V. V. Kushnirov, A. R. Dagkesamanskaya, S. A. Didichenko, Y. O. Chernoff, S. G. Inge-Vechtomov and V. N. Smirnov.
156. Deletion analysis of the SUP35 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae reveals two non-overlapping functional regions in the encoded protein (1993) Mol Microbiol, V.7, P.683-92.
157. Ter-Avanesyan M.D., Dagkesamanskaya A.R., Kushnirov V.V., Smirnov V.N. (1994) The SUP35 omnipotent suppressor gene is involved in the maintenance of the non-Mendelian determinant psi+. in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics 137: 671-676.
158. Thompson CM, Young RA General requirement for RNA polymerase II holoenzymes in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 1995 May 9; 92(10):4587-90.
159. Tikhomirova V.L., Inge-Vechtomov S.G. (1996). Sensitivity of sup35 and sup45 mutants in Saccharomyces cerevisiae to antimicrotubule drug benomyl.1. Curr. Genet. 30: 44-49.
160. Trouche D, Le Chalony C, Muchardt C, Yaniv M, Kouzarides T. RB and hbrm cooperate to repress the activation functions of E2F1. Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Oct 14; 94(21): 11268-73.
161. Tsukiyama T, Palmer J, Landel CC, Shiloach J, Wu C. Characterization of the imitation switch subfamily of ATP-dependent chromatin-remodeling factors in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 1999 Mar 15; 13(6):686-97.
162. Tuite M.F., Mundy C.R., Cox B.R. (1981). Agents that cause a high frequency of genetic change from psi+. to [psi"] in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 98: 691-711.
163. Uchida N., S. Hoshino, H. Imataka, N. Sonenberg and T. Katada. A novelrole of the mammalian GSPT/eRF3 associating with poly(A)-binding protein in Cap/Poly(A)-dependent translation (2002) J Biol Chem, V.277, P.50286-92.
164. Urakov V. N., I. A. Valouev, E. I. Lewitin, S. V. Paushkin, V. S. Kosorukov, V. V. Kushnirov, V. N. Smirnov and M. D. Ter-Avanesyan. Ittlp, a novel protein inhibiting translation termination in Saccharomyces cerevisiae (2001) BMC Mol Biol, V.2, P.9
165. Utley RT, Ikeda K, Grant PA, Cote J, Steger DJ, Eberharter A, John S, Workman JL.Transcriptional activators direct histone acetyltransferase complexes to nucleosomes. Nature. 1998 Jul 30;394(6692):498-502.
166. Valouev 1. A., V. V. Kushnirov and M. D. Ter-Avanesyan. Yeast polypeptide chain release factors eRFl and eRF3 are involved in cytoskeleton organization and cell cycle regulation (2002) Cell Motil Cytoskeleton, V.52, P. 161-73.
167. Vassilev A, Yamauchi J, Kotani T, Prives C, Avantaggiati ML, Qin J, Nakatani Y.The 400 kDa subunit of the PCAF histone acetylase complex belongs to the ATM superfamily. Mol Cell. 1998 Dec;2(6):869-75.
168. Vershon AK, Pierce M. Transcriptional regulation of meiosis in yeast. Curr Opin Cell Biol. 2000 Jun; 12(3):334-9. Review.
169. Vignali M, Hassan AH, Neely KE, Workman JL. ATP-dependent chromatin-remodeling complexes. Mol Cell Biol. 2000 Mar; 20(6): 1899-910. Review.
170. Walker SS, Shen WC, Reese JC, Apone LM, Green MR.Yeast TAF(II)145 required for transcription of Gl/S cyclin genes and regulated by the cellular growth state. Cell. 1997 Aug 22; 90(4):607-14.
171. Wang KL, Warner JR. Positive and negative autoregulation of REB1 transcription in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 1998 Jul; 18(7):4368-76.
172. Wang L, Liu L, Berger SL.Critical residues for histone acetylation by Gcn5, functioning in Ada and SAGA complexes, are also required for transcriptional function in vivo. Genes Dev. 1998 Mar 1; 12(5):640-53.
173. Wang W, Cote J, Xue Y, Zhou S, Khavari PA, Biggar SR, Muchardt C, Kalpana GV, Goff SP, Yaniv M, Workman JL, Crabtree GR. Purification and biochemical heterogeneity of the mammalian SWI-SNF complex. EMBO J. 1996 Oct 1; 15(19):5370-82.
174. Wang W, Xue Y, Zhou S, Kuo A, Cairns BR, Crabtree GR. Diversity and specialization of mammalian SWI/SNF complexes. Genes Dev. 1996 Sep 1; 10(17):2117-30 (a).
175. Wang W., K. Czaplinski, Y. Rao and S. W. Peltz. The role of Upf proteins in modulating the translation read-through of nonsense-containing transcripts (2001) EMBO J, V.20, P.880-90 (6).
176. Welch MD, Vinh DB, Okamura HH, Drubin DG.Screens for extragenic mutations that fail to complement actl alleles identify genes that are important for actin function in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 1993 Oct; 135(2):265-74.
177. Wickner R.B., Masison D.C., Edskes H.K. (1995). PSI. and [URE3] as yeast prions. Yeast. 11: 1671-1685.
178. Winstone F and Carlsonl M Yeast SWI/SNF transcriptional activators and the SPT/SIN chromatin connection. 1992 Trends Genet 8:387-391
179. Winzeler E. A. et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis Science. 1999. V. 258. P. 901-906.
180. Wu C. The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature. 1980 Aug 28; 286(5776):854-60.
181. Xie X, Kokubo T, Cohen SL, Mirza UA, Hoffmann A, Chait BT, Roeder RG, Nakatani Y, Burley SK.Structural similarity between TAFs and theheterotetrameric core of the histone octamer. Nature. 1996 Mar 28; 380(6572):316-22.
182. Yarragudi A, Miyake T, Li R, and R.H. Morse. Comparison of ABF1 and RAP1 in Chromatin Opening and Transactivator Potentiation in the Budding Yeast Saccharomyces cerevisiaeMCB, Oct. 2004, p. 9152-9164.
183. Yu J, Madison JM, Mundlos S, Winston F, Olsen BR.Characterization of a human homologue of the Saccharomyces cerevisiae transcription factor spt3 (SUPT3H). Genomics. 1998 Oct 1; 53(l):90-6.
184. Yu L, Morse RH. Chromatin opening and transactivator potentiation by RAP1 in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 1999 Aug; 19(8):5279-88.
185. Yu Y, Eriksson P, Stillman DJ.Architectural transcription factors and the SAGA complex function in parallel pathways to activate transcription. Mol Cell Biol. 2000 Apr;20(7):2350-7.
186. Yudkovsky,N, Colin Logie,Steven Hahn, and Craig L. Peterson Recruitment of the WI/SNF chromatin remodeling complex by transcriptional activators. Genes & Development 13:2369-237
-
Рябинкова, Наталья Анатольевна
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2006
-
ВАК 03.00.15
- Взаимодействие омнипотентных супрессоров SUP35 и SUP45 с цитоплазматическими детерминантами у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
- Гиперэкспрессия гена SUP35 дрожжей Saccharomyses cerevisiae индуцирует возникновение экстрахромосомного фактора (psi+)
- Гиперэкспрессия гена SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisae индуцирует возникновение экстрахромосомного фактора [psi+]
- Фенотипическое проявление гена SUP35 Pichia methanolica и прионизация его продукта в дрожжах Saccharomyces cerevisiae
- Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
