Циркулирующие колониеобразующие клетки и факторы, влияющие на их участие в атерогенезе человека

Сабурова, Ольга Стояновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Циркулирующие колониеобразующие клетки и факторы, влияющие на их участие в атерогенезе человека
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Циркулирующие колониеобразующие клетки и факторы, влияющие на их участие в атерогенезе человека"

На правахрукописи

САБУРОВА Ольга Стояновна

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ КОЛОНИЕОБРАЗУЮЩИЕ КЛЕТКИ И ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ИХ УЧАСТИЕ В АТЕРОГЕНЕЗЕ

ЧЕЛОВЕКА

03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в лаборатории Стволовых клеток Института экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗСР РФ.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук ЭЛ. Соболева Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Э.М.Тарарак

доктор биологических наук А.Г.Коноплянников Ведущая организация:

Российский Онкологический научный центр РАМН

Защита диссертации состоится "16" декабря 2004 года в 11.00 на заседании диссертационного совета Д 208.073.01 в ИЭК РКНПК МЗСР РФ по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, 15А

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗСР РФ.

Автореферат разослан «........»....................................2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.И. Венгерова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Атеросклеротические поражения магистральных сосудов человека являются причиной развития целого ряда сердечно-сосудистых заболеваний. Расшифровка клеточных механизмов формирования атеросклеротической бляшки остается актуальной нерешенной задачей современной медицинской и биологической науки.

Проводимые в Кардиологическом центре с 1985 года исследования клеток интимы атероматозной аорты человека [Chazov et al, 1986], а позднее клеток периферической крови пациентов с выраженным атеросклерозом на фоне тяжелой гиперлипидемии (ГЛП), позволили впервые получить данные, экспериментально доказывающие участие циркулирующих костномозговых стволовых клеток в атерогенезе человека [Соболева, 1989; Soboleva et al, 1994]. Сформулированная концепция роли циркулирующих полипотентных клеток-предшественников в развитии атеросклеротических поражений сосудов противоречила общепризнанной теории Р.Росса, в которой главная роль в формировании атеросклеротической бляшки отводится пролиферирующим макрофагам и гладкомышечным клеткам, мигрирующим из медии в интиму [Ross et al, 1973-1999]. Присутствие стволовых колониеобразующих единиц (КОЕ) в интиме атероматозной аорты и появление циркулирующих КОЕ для фибробластов (КОЕ-Ф) в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом [Soboleva et al, 1994-1995] позволили предположить, что ключевым моментом в развитии атеросклероза является проникновение костномозговых циркулирующих КОЕ в субэндотелий в места скопления липидов. Активно пролиферирующие в интиме КОЕ формируют клеточные скопления/клоны из гемопоэтических клеток, поглощающих избыточные липиды и секретирующих ростовые факторы, а также стромальных клеток, синтезирующих экстрацеллюлярный матрикс для изоляции очагов воспаления. Дифференцировка КОЕ-Ф в терминальные стромальные клетки происходит в зависимости от окружения, в которое они попадают. Вышесказанное объясняет возникновение различных типов склерозирования сосудистой стенки (фиброз, оссификация, хондрогенез, формирование адипозной ткани), а также известный факт формирования кости в стенке сосуда.

До 2003 года проблемой исследования роли циркулирующих стволовых клеток в развитии атеросклеротических поражений сосудов человека занимались только в Кардиологическом центре в группе Соболевой ЭЛ. Работы в этом направлении не проводились ни зарубежными ни отечественными учеными. Долгое время к циркуляции

стромальных стволовых клеток в периферической крови относились со скептицизмом. Первые обоснованные данные, свидетельствующие о такой возможности, начали появляться с 1997 года. Исследования не касались проблемы атеросклероза [Prockop, 1997, Chesney et al, 1997; Ferrari and Mavilio, 1998], однако косвенно подтверждали результаты Соболевой ЭЛ. с соавт. в фундаментальном плане. Только в 2003 г. появилась работа зарубежных авторов [Caplice, 2003], данные которой прямо указывали на участие циркулирующих костномозговых стромальных стволовых клеток в формировании атеросклеротических бляшек человека. В этом исследовании изучение пост-мортальных тканей больных, перенесших пересадку костного мозга, позволило установить, что поражение стенки артерий в результате атеросклероза происходит за счет клеток из костного мозга пациента. Таким образом, остается актуальным продолжение изучения роли стволовых клеток разных линий дифференцировки и факторов, влияющих на их коммитирование, в формировании атеросклеротических поражений.

Хорошо известно, что атеросклеротические поражения сосудов нередко осложняются кальцификацией [Virchow,1863; Buntmg,1906; Haust and More,1965; Agatson et al, 1990], однако механизм кальцификации в стенке сосуда при атеросклерозе до конца не ясен. Существует мнение, что развитие атеросклероза, наряду с остеопорозом (уменьшение минеральной плотности костной массы), может быть связано с нарушением кальциевого гомеостаза, поскольку отмечена позитивная корреляция между остеопорозом и интенсивной кальцификацией атероматозных сосудов. Так, у больных с остеопорозом кальцификация аорты развивается гораздо чаще, чем у лиц с нормальной минеральной плотностью костной ткани [Ouchi et al, 1993; Stefenelli et al, 1993, Banks et al, 1994]. Тот факт, что стромальные остеогенные клетки, присутствующие в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом, формируют in vitro остеоидную ткань [Soboleva, 1994], позволяет предполагать наличие оссификации в стенке сосуда при атеросклерозе с участием этих клеток. Остеокласты - многоядерные клетки, производные моноцитарно/макрофагального ростка дифференцировки, являются обязательными участниками остеогенеза. Путем резорбции костной ткани они участвуют в ремоделировании, а также обеспечивают потребность организма в дополнительном кальции, которая должна возникать из-за внекостной кальцификации в сосудах при атеросклерозе. В связи с этим представляет интерес изучение пула преостеокластов у пациентов с коронарным атеросклерозом и ГЛП, поскольку такие данные могли бы способствовать пониманию причин и механизмов кальцификации сосудистой стенки.

Большинство клеточных реакций в организме в норме и патологии опосредуется биохимическими ростовыми факторами/цитокинами. Изменение концентрации таких

факторов локально или в циркуляции обязательно вносит свой вклад в процессы пролиферации и дифференцировки соответствующих типов клеток. Известно, что в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний принимают участие ®P®(FGF), T<I>P(PDGF), 3®P(VEGF), TP<D-ß(TGF-beta), rM-KC<J>(GM-CSF) и другие факторы [Clinton, 1992; Ross R, 1993; O'Brien, 1994; Biwa, 2000]. Данные об участии костномозговых КОЕ гемопоэтической и стромальной линий дифференцировки в атерогенезе [Soboleva et al, 1994,1995] ставят вопрос об изменении концентрации в сыворотке у пациентов с гиперлипидемией и коронарным атеросклерозом гранулоцитарно-макрофагального КСФ (ГМ-КСФ) и фактора роста фибробластов (ФРФ-2). ГМ-КСФ действует на ранние гемопоэтические предшественники, а ФРФ-2 стимулирует и поддерживает пролиферацию и дифференцировку клеток стромальной природы.

Общеизвестно, что гиперлипидемия является одним из важнейших факторов риска, способствующих ускоренному развитию атеросклероза. По данным Seven Countries Study, увеличение уровня общего холестерина у мужчин в странах Северной Европы с 4,8 до 8,4 ммоль/л вызывает рост смертности от ИБС в 2,1 раза [Menotti et al, 1996; Keys, 1996]. Атерогенные модифицированные ЛПНП могут быть основным компонентом развития дисфункции эндотелия [Ross, 1993] и активатором экспрессии "скевенджер" -рецептора на макрофагальных клетках сосудистой стенки [Palinski et al, 1989]. Захват и накопление ЛПНП моноцитами/макрофагами приводит к их превращению в пенистые клетки, выделению различных факторов роста и хемоаттрактантов [Newby and Zaltsman, 1999]. Исследование в модельной системе in vitro реакции циркулирующих КОЕ на присутствие нативных и модифицированных (окисленных) ЛПНП может дополнить представления о роли ЛПНП в развитии атеросклероза через воздействие на клетки-предшественники.

Для лечения гиперхолестеринемии в клинике широкое применение нашли препараты группы статинов, снижающие избыточный уровень холестерина. Данные Health Protection Study, в которое было включено 20500 пациентов, подтверждают пользу применения статинов в различных подгруппах больных, в том числе у пациентов с сахарным диабетом, женщин в пост-менопаузе, пожилых людей. В этом исследовании длительная (более 5 лет) терапия симвастатином (40 мг) привела к снижению общей смертности на 12%, смертности от сердечно-сосудистых заболеваний на 17% и инсульта на 27% [Collins et al, 2002]. В связи с предположением о влиянии гиперлипидемии на костномозговые стволовые клетки и атерогенез представляет интерес реакция колониеобразующих единиц (КОЕ) на снижение уровня ЛПНП в крови под действием

статинов.

Цель исследования - анализ циркулирующих костномозговых гемопоэтических и стромальных стволовых клеток, а также факторов, влияющих на их коммитирование, у пациентов с ГЛП и верифицированным атеросклерозом коронарных артерий и у здоровых добровольцев (группа сравнения). Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Методами иммуноморфологии и поточной цитофлуорометрии фенотипировать циркулирующие костномозговые стромальные клетки-предшественники (КОЕ-Ф) в крови пациентов с первичной гиперлипидемией (ГЛП) и коронарным атеросклерозом.

2. В тест-системе in vitro методами гистохимии, иммуноморфологии и электронной микроскопии выявить гемопоэтические костномозговые предшественники остеокластов. Определить их количество в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом и здоровых добровольцев.

3. В сыворотке крови определить концентрацию колониестимулирующих факторов (ГМ-КСФ и ФРФ-2), влияющих на коммитирование гемопоэтических и стромальных колониеобразующих единиц. Сравнить содержание этих факторов у пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом и здоровых добровольцев.

4. Получить данные о влиянии терапии статинами на состав и пролиферативные способности КОЕ разных линий дифференцировки in vitro у пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом.

5. Оценить влияние терапии препаратами группы статинов на количество КОЕ-Ф с остеогенными потенциями в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом.

6. В модельной системе in vitro исследовать влияние модифицированных (окисленных) и нативных липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) на пролиферацию КОЕ пупочной крови.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые при использовании иммуноморфологического метода и метода поточной цитофлуорометрии в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом были выявлены костномозговые циркулирующие КОЕ-Ф, что подтвердило полученные ранее клональным методом данные об участии циркулирующих стволовых клеток в атерогенезе.

В лимфоцитарной фракции пациентов был определен пул клеток, в котором присутствуют стромальные остеобластные клетки-предшественники (ON+CD45lowCD34"). Среди лимфоцитоподобных клеток также выявлены стромальные клетки-предшественники, экспрессирующие коллаген I типа. Был выработан протокол

определения ON+ клеток методом поточной цитофлуорометрии. Показано, что число ON* в крови больных тесно связано с тяжестью атеросклеротических поражений, что в дальнейшем может быть использовано для разработки как прогностического теста, так и терапевтических подходов к лечению атеросклероза.

Впервые установлено, что в крови пациентов с пшерлипидемией и коронарным атеросклерозом увеличено содержание предшественников остеокластов - клеток гемопоэтической линии дифференцировки. Наряду с колониями/скоплениями остеокластов в тест-системах отмечено присутствие остеобластов. Эти данные позволяют приблизиться к объяснению процесса оссификации/кальцификации сосудистой стенки при атеросклерозе.

Впервые показано, что в сыворотке пациентов с гиперлипидемией и коронарным атеросклерозом одновременно увеличиваются уровни колониестимулирующего фактора для гранулоцитов-макрофагов (ГМ-КСФ) и фактора роста для фибробластов-2 (ФРФ-2). Эти данные могут свидетельствовать о стимулирующем влиянии повышенного содержания цитокинов в крови на активацию колониеобразующих клеток гемопоэтической и стромальной линий дифференцировки в костном мозге.

В работе представлены оригинальные результаты о снижении содержания в крови колониеобразующих единиц (КОЕ) различных линий дифференцировки, и в частности ON+ клеток-предшественников остеобластов под влиянием терапии статинами в течение трех месяцев у пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом. Эти данные удачно дополнены исследованиями реакции КОЕ пупочной крови на добавление липюпротеидов низкой плотности в модельной системе in vitro. Полученные результаты свидетельствуют о непосредственном влиянии ЛПНП на пролиферацию и коммитирование костномозговых КОЕ.

В настоящем исследовании получены данные, которые позволяют внести новые представления о клеточных механизмах атерогенеза, а также выработать новые подходы к диагностике и лечению атеросклероза, что имеет большую практическую значимость.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих научных конференциях: XII International Symposium on Drags Affecting Lipid Metabolism, Houston, 1995; 3rd Annual Scandinavian Atherosclerosis Conference, Copenhagen, 1996; 6th International Congress on Cell Biology, San Francisco, 1996; ISH-EHA Haematology congress, Amsterdam, 1998; Российский национальный конгресс кардиологов, Москва, 2000; Симпозиум по Экспериментальным и клиническим проблемам атеросклероза, Москва, 2000; 72rd Congress of the EAS, Salzburg, 2002; 74rd Congress of the EAS, Seville, 2004, a

также доложены на межлабораторном семинаре в ИЭК РКНПК МЗ РФ (Москва, 3 ноября 2004 года).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 11 тезисных сообщений, одна статья находится в печати.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, разделов: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на страницах и

включает_рисунков и_таблиц. Список процитированной литературы содержит_

источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом исследования служили стабилизированная ЭДТА или гепарином кровь или сыворотка крови пациентов с первичной ГЛП и верифицированным атеросклерозом. В качестве контроля использовали кровь здоровых добровольцев. Кровь для исследования брали из локтевой вены утром натощак после 14-часового голодания. Влияние ЛПНП на КОЕ исследовали в тест-системе in vitro с использованием стабилизированной ЭДТА пупочной крови здоровых рожениц.

Подбор пациентов с гиперлипидемией различных типов (общий холестерин>5,2 ммоль/л и/или триглицеридов>2,1 ммоль/л, холестерин ЛПНП 3,1-9,8 ммоль/л, холестерин ЛПВП 0,7-1,2 ммоль/л) и верифицированным атеросклерозом коронарных артерий проводился на основании клинико-генетической диагностики в отделах Гемодиализа и плазмафереза (зав. В.В.Кухарчук) и хирургии (зав. Р.САкчурин) ИКК РК НПК МЗСР РФ, а также на основании биохимической диагностики в отделе Клинической биохимии (зав. В.Н.Титов) ИКК РК НПК МЗСР РФ. Коронароангиография сердца у всех пациентов выявила критический стенозирующий атеросклероз как минимум двух коронарных артерий или их магистральных ветвей. Уровень холестерина и триглицеридов (в сыворотке крови) и холестерина ЛПВП (в супернатанте после преципитации других классов липопротеидов смесью фосфовольфрамовой кислоты и хлористого магния) определяли ферментативным способом на биохимическом автоанализаторе "EXPRESS PLUS" (фирма "CHIRON/Diagnostics", Великобритания). Содержание холестерина липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) определяли расчетным способом (по формуле Фридвальда). Тип ГЛП по классификации Фредриксона устанавливали с помощью электрофореза липопротеидов сыворотки крови в геле агарозы с использованием пластинок "Lipogel" на системе "Paragon" ("Beckman", США) с последующей денситометрией.

При исследовании влияния терапии статинами в течение 3 месяцев на циркулирующие КОЕ у пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом, применяли следующие препараты: зокор (20мг/сут.), лескол (40мг/сут.). У всех пациентов через три месяца приема статинов наблюдалось снижение уровня холестерина ЛПНП на 23-45% от исходного.

Для изучения влияния ЛПНП на пролиферацию КОЕ в модельной тест-системе клеток пупочной крови в культуру добавляли нативные или модифицированные (окисленные) ЛПНП в диапазоне концентраций от 8 до 250 мкг ЛПНП/мл культуральной среды.

ЛПНП из донорской плазмы выделяли методом последовательного ультрацентрифугирования в солевой плотности (р=1.006-1.063) [Lindgren et al, 1972]. Cu2+ индуцированное окисление ЛПНП (1мг/мл) в присутствии 50цМ Q1S04 осуществляли в течение 15 часов при 37°С.

Выделение мононуклеарной фракции клеток крови из свежей крови, взятой в ЭДТА или гепарин, проводили по стандартной методике на градиенте плотности ( р= 1,077, Lymphocyte Separation Medium, Flow Laboratories) [Лимфоциты. Методы, 1990]. Для удаления тромбоцитов кровь, разведенную в 2 раза сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS, Gibco), центрифугировали 6 мин при 200xg. Культуры клеток человека, использованные в работе:

Агаровая семисолидная тест-система. Для выявления КОЕ-Ф в клональных тест-системах, оценки влияния терапии статинами на КОЕ и исследования влияния ЛПНП на пролиферативные свойства КОЕ, клетки мононуклеарной фракции периферической крови (МФПК) пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом, здоровых добровольцев или пупочной крови культивировали в агаровых семисолидных тест-системах: культуральная среда Искова-Дюльбекко (Flow) содержала 0,3% агара (Bacto-Agar, Difco), 30% сыворотки человека AB(IV), 5хЮ'5М меркаптоэтанола (Sigma), 5% среды, кондиционированной лейкоцитами в присутствии фитогемаггаотинина (Sigma) (ФГА-ЛКС), пенициллин(100 ед/мл)/стрептомицин(100 мкг/мл) (HyClone). Клетки высаживали с плотностью 500.000 клетокЛмл среды/35 мм чашку Петри. Культивировали в течение 14 дней в атмосфере 5%СО2 при 37°С.

Семисолидная культура клеток в метилделлюлозе. Для фенотипирования стромальных колоний, формируемых циркулирующими в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом костномозговыми КОЕ-Ф, клетки МФПК культивировали в среде Искова-Дюльбекко, содержащей 0,9% метилцеллюлозы, 30% сыворотки человека

AB(IV), 5х1006М меркаптоэтанола, 5% среды, кондиционированной лейкоцитами в присутствии фитогемаглютинина (ФГА-ЛКС), пенициллин(100 ед/мл)/стрептомицин(100 мкг/мл). Клетки высаживали с плотностью 500.000 клеток/1мл среды/35 мм чашку Петри и культивировали в течение 14 дней в атмосфере 5%СС при 37°С.

Жидкая культура клеток. Для изучения остеокластогенеза клетки МФПК пациентов и здоровых доноров культивировали в 199 среде, содержащей 20% сыворотки новорожденного теленка (FCS, Gibco) и пенициллин(100ед/мл)/стрептомицин(100мкг/мл) (HyClone), в атмосфере 5% СО2 при 37°С. 1х10б ядросодержащих клеток МФПК/1мл среды высаживали на пластик (чашки 35мм) и/или на покровные стекла, помещенные в чашки (35мм). Плотность посадки клеток в силу объективных причин (отсутствие стимулированного с помощью КСФ выброса в циркуляцию гемопоэтических предшественников) не соответствовала оптимальной - 5х106 ядросодержащих клеток/35мм лунку, определенной авторами, изучавшими остеокластогенез [Purton et al, 1996]. Через 72 часа после посадки из культуры удаляли неприкрепившиеся клетки. Адгерентные агрегаты клеток оставляли для дальнейшего культивирования в течение 21 дня в культуральной среде того же состава. Два раза в неделю культуральную среду заменяли на свежую.

Идентификация гемопоэтических и стромальных колоний и клеток в культурах.

Анализировали колонии и клетки в агаровых, метилцеллюлозных или жидких первичных культурах по морфологическим признакам (характер роста, размер и форма колоний и клеток, ультраструктурные признаки), гистохимическому окрашиванию (гематоксилин-эозином (0,1%), красителем Май-грюнвальд-Гимза (5%), толуидиновым синим (0,1%), окрашивание клеток на неспецифическую эстеразу - маркер моноцитов-макрофагов, миелопероксидазу - маркер гранулоцитов, щелочную фосфатазу - маркер остеобластов, тартрат-резистентную кислую фосфатазу - маркер остеокластов), иммуноморфологическому окрашиванию антителами к: неколлагеновому белку кости остенектину (ON) - маркеру остеогенеза и остеобластных клеток; антигену коллагена I типа; CD68, CD45 и СБ14-антигенам гемопоэтических клеток. Методика окрашивания антителами включала инкубацию с соответствующими антителами в течение 40 мин при +4°С в присутствии БСА (1%) в фосфатном буфере (0,1М, рН=7.4). Для выявления цитоплазматической локализации белков препараты до инкубирования с антителами обрабатывали детергентом (0,02% раствор тритона Х-100, 1 минута) (Sigma). Ингибирование эндогенной пероксидазной активности осуществляли 0.03% Н2О2 (5 минут). В контроле использовали вместо первых антител иммуноглобулины

кролика или мыши соответствующего изотипа или пропуск первых антител для контроля вторых. В качестве вторых антител использовали антитела козы против иммуноглобулинов кролика или мыши, меченые пероксидазой хрена (Daco), препараты инкубировали со вторыми антителами в течение 30 минут при комнатной t°. Ферментативную активность пероксидазы визуализировали диаминобензидином (ДАБ) (О.6 мг/мл) (Sigma).

Изучение иммунофенотипических характеристик клеток исходной мононуклеарной

Иммуноморфологический анализ клеток с использованием световой микроскопии

Окрашивание антителами к остеонектину (ON) или коллагену I типа проводилось аналогично методике окрашивания клеток в культурах.

Иммунофенотипирование клеток с использованием метода поточной питофлуорометрии.

Использовали FITC-меченые моноклональные антитела к CD 14, CD3, CD 19 (Becton Dickinson), коллагену I типа (ИМТЕК), поликлональные антитела к остеонектину (ON) человека (любезно предоставлены д-ром Fisher, Bethesda,CUIA); моноклональные R-РЕ-меченые антитела к CD34 (Caltag) и РЕ-Су-5(TRI-COLOR)-меченые антитела к CD45 (Caltag). В контроле использовали соответствующие изотипические антитела (мышиные IgGl -R-PE, -TRI-COLOR или -FITC, Becton Dickinson или Caltag; кроличьи Ig(G+E+M)-FITC, ИМТЕК) или пропуск первыхдля контроля вторых антител.

Пробоподготовка включала инкубирование аликвоты цельной крови (100 мкл), взятой в ЭДТА, с соответствующими антителами. После инкубирования с антителами проводили лизис эритроцитов лизирующим буфером (10 минут) (FACS™ Lysing Solution, Becton Dickinson), отмыв ФБ (0,1 М, рН=7.4) и фиксацию клеток 1% параформальдегидом на ФБ (0,1М, рН=7.4). Анализировали на проточном цитофлуориметре FACS-Vantage или FACS-Calibur (Becton Dickinson,CUIA). Сбор и обработку информации производили с помощью программ CELLQuest (Becton Dickinson) и WinMDI(ver2.8). В каждом образце анализировали 100000 событий.

Определение содержания ГМ-КСФ и ФРФ-2 в сыворотке крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом и здоровых добровольцев.

Уровень ГМ-КСФ и ФРФ-2 в сыворотке крови определяли с помощью тест-наборов фирмы Amersham (Amersham's Biotrak™). Система базировалась на твердофазной ELISA, включающей сандвич-ферментативную иммунологическую количественную методику. В ячейки 9. -луночных полистирольных планшетов с иммобилизованными антителами наносили сыворотку крови. Весь определяемый,

присутствующий в сыворотке белок, связывался с антителами. Поликлональные антитела к выявляемому белку, меченые пероксидазой хрена, взаимодействовали со связавшимся белком из исследуемого образца. Пероксидазу проявляли с помощью тетраметилбензидина. После остановки реакции H2SO4 измеряли интенсивность окраски проявленной пероксидазы на спектрофотометре с вертикальным ходом луча "Multiscan" при 450нм. Количество белка в опытных образцах сыворотки определяли по калибровочной кривой, построенной по стандартам с известными концентрациями. Статистическая обработка данных.

Все данные были получены в нескольких независимых экспериментах на клетках/культурах клеток мононуклеарной фракции периферической или пупочной крови человека. Количественные данные обрабатывали с использованием стандартных пакетов программ прикладного статистического анализа (Sigma Plot v.8.0, SPSS v.7.5.2 и других). Применяли общеупотребительные методы параметрической и непараметрической статистики. Значение среднего выражали как М+m, где М - средняя величина параметров, m - стандартная ошибка среднего. Достоверность различия между средними при сравнении групп оценивали по t критерию Стьюдента. Для оценки взаимосвязи показателей использовали стандартные методы корреляционного анализа. Для всех видов анализа статистически значимым считали значение р<0,05. Список использованных сокращений

ГЛП-гиперлипидемия, КОЕ-колониеобразующая единица; КОЕ-Ф - КОЕ для фибробластов; ГМ-КСФ-гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; ФРФ-фактор роста фибробластов; МФПК-мононуклеарная фракция периферической крови, ON-остеонектин, ОК-остеокласт.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Иммуноморфологический анализ стромальных колоний, сформированных циркулирующими костномозговыми КОЕ-Ф в клональных тест-системах клеток крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом.

В клональных семисолидных тест-системах при культивировании клеток МФПК пациентов с гиперлипидемией и коронарным атеросклерозом было выявлено присутствие стромальных колоний, отличающихся от гемопоэтических характером роста (плотное расположение клеток в колониях, форма и размер колонии) и отсутствием реакции клеток на неспецифическую эстеразу и миелопероксидазу. При иммунофенотипировании стромальные колонии одного типа окрашивались антителами к коллагену I типа. Ультраструктурный анализ подобной колонии показал присутствие клеток,

синтезирующих экстрацеллюлярный коллагеновый матрикс (Рис 1 А, Б).

Рисунок 1.

Клетки стромальной колонии синтезируют Клетки стромальной колонии формируют

коллагеновый экстрацеллюлярный матрикс. остеовдный матрикс.

А - окраска колонии на коллаген I типа В - окраска колонии на остеонектин

Б - ТЭМ фрагмента колонии Г - ТЭМ фрагмента колонии

Стромальные колонии другого типа окрашивались на неколлагеновый белок кости остеонектин (Рис. 1В) При ультраструктурном анализе таких колоний был обнаружен сформированный остеобластными клетками (ОБ) остеоидный матрикс, рядом с которым находились остеокласты (ОК) (Рис. 1 Г) - спутники костеобразования. Полученные данные свидетельствовали о формировании в культуре стромальных колоний разного типа, что подтверждало присутствие в крови пациентов с ГЛП и атеросклерозом циркулирующих полипотентных КОЕ-Ф и предопределяло их костномозговую природу.

Эти данные поставили вопрос о необходимости фенотипирования стромальных клеток-предшественников в исходной мононуклеарной фракции пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом

2._Иммунофенотипирование_костномозговых стромальных клеток-

предшественников, циркулирующих в крови пациентов с первичной гиперлипидемией (ГЛП) и верифицированным атеросклерозом.

Анализ клеток мононуклеарной фракции крови пациентов с ГЛП и документированным атеросклерозом и здоровых добровольцев на присутствие циркулирующих ON клеток с использованием метода световой микроскопии.

При окрашивании суспензии клеток МФПК пациентов и здоровых добровольцев антителами к остеонектину (ОМ) у пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом выявляется большое число ОМ клеток (Рис. 2 В, стрелки), которых мало у здоровых добровольцев (Рис 2 А).

* ^ Г •> « *>

* ч , •«

а ©V *

Рисунок 2. Окрашивание клеток МФПК антителами к остеонектину

А - клетки здорового добровольца

Б - контроль на изотипичные антитела (Rb Щ

В - клетки пациента с ГЛП и коронарным атеросклерозом

Полученные результаты поставили вопрос о необходимости фенотипировать такие клетки с учетом друтих, как морфологических, так и иммунологических параметров, а также получить их количественные характеристики Для решения этих вопросов использовали современный метод анализа - цитофлуорометрию в потоке

Анализ клеток периферической крови пациентов с ГЛП и документированным атеросклерозом и здоровых добровольцев на присутствие циркулирующих стромальных клеток-предшественников с использованием метода поточной цитофлуорометрии.

1). Идентификация костномозговых циркулирующих клеток-предшественников остеобластов, имеющих ON* фенотип.

Отсутствие в литературе данных по стратегии определения клеток с ОМ фенотипом с помощью цитофлуорометрии в потоке обусловило длительный поисковый характер этой части работы В результате был разработан протокол верификации циркулирующих в крови ОМ клеток

Аликвоты цельной крови окрашивали антителами к трем антигенным маркерам -остеонектину (ЕГТС метка), СБ34 антигену ранних гемопоэтических предшественников (Я-РЕ-метка) и общему лейкоцитарному антигену СБ45 (ТЫ-СОЬОЯ-метка) Выбор данных маркеров определялся полученными нами в предшествовавших исследованиях данных, которые свидетельствовали, что интересующие нас клетки относятся к популяции лимфоцитоподобных клеток крови, причем не являются терминальными Т (СБ3+) или Б(СБ19) лимфоцитами Маркирование по СБ34 антигену является широко распространенным в современных исследованиях клеток класса стволовых Показано, что в популяции СБ34+ клеток костного мозга около 5% клеток связывается с антителами

STR0-1, выявляющими стромальные полипотентные КОЕ-Ф [Simmons and Torok-Storb, 1991] По протоколу, рекомендуемому международным обществом гематологов (ISHAGE), при верификации клеток по CD34 антигену необходимо учитывать

Рисунок 3. Верификация ON+ клеток. А - выделение гейта СВ45Ьс№ лимфоцитоподобных клеток на гистограмме 88С-СО45-ТК1-С0Ь0К. Б - выделение гейта CD45Low лимфоцитоподобных клеток на гистограмме 88С-Р8С. В -определение 0№ клеток на гистограмме CD34-R-PE от 0К-Р1ТС.

типирование по CD45 С учетом вышеизложенного стратегия верификации 0К+ клеток с помощью цитофлуорометрии включала первоначально выделение на

Рисунок 4 Костномозговые CD45 ™ CD34" 0К клетки в крови пацентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом

гистограмме зависимости SSC-CD45-TRI-C0L0R-флyopecценции гейта клеток с

низкой экспрессией CD45 (Рис ЗА), применение этого гейта на гистограмме зависимости

свечения CD34-R-PE от 0^Р1ТС (Рис 3 В) или SSC от 0^Р1ТС (Рис 4) Подобная логика

позволила добиться четкого выделения популяции 0К-позитивных клеток, которые были

отрицательными по СD34-антигену (Рис 3 В)

Результаты анализа показали, что клетки с фенотипом 01Ч+С0451о*'С034" обнаруживаются у пациентов с коронарным атеросклерозом. Их число в изученной нами группе больных варьировалось от 90 до 1850 на 100000 лейкоцитов крови. Количество таких клеток в контроле при окрашивании изотипическими антителами было менее 10 на 100000 лейкоцитов, также как и в контрольной группе здоровых добровольцев. Важно, что количество ОМ клеток связано с тяжестью атеросклероза, - больший процент определялся у пациентов с критическим стенозирующим атеросклерозом шунтов и коронарных артерий.

2). Идентификация циркулирующих стромальных клеток-предшественников, экспрессирующих поверхностный антиген коллагена I типа.

В лимфоцитарной фракции клеток МФПК, выделенной по свойствам

светорассеяния (гейт Ю), при окрашивании антителами к коллагену I типа выявлены

положительно окрашивающиеся клетки, процент которых у пациентов с ГЛП и

коронарным атеросклерозом составлял 0,17+0,04%, а у здоровых добровольцев-

Количество коллаген I+ клеток на 100000

мононуклеарных клеток крови

контроль(п=4) пациенты (п=5)

40+10 170+40

Рисунок 5. Верификация коллаген Г клеток. Выделение гейта лимфоцитоподобных клеток на гистограмме зависимости SSC-FSC (гейт R3). Определение коллаген 1+клеток на гистограмме SSC- коллаген I - FITC.

0,04+ 0,01% от клеток МФПК. Целесообразно продолжить этот анализ с учетом других

клеточных маркеров, поскольку литературные данные свидетельствуют, что

циркулирующие фибробластоподобные клетки, которые способны в условиях in vitro к

пролиферации, синтезу коллагена и фибронектина, имеют фенотип коллаген I+CD34+

(Bucala et al, 1994, Chesney et al, 1997,1998).

3_Циркулирующие костномозговые предшественники остеокластов и

остеокластогенез у пациентов с первичной ГЛП

Стромальные остеогенные клетки предшественники присутствуют в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом и формируют in vitro остеоидную ткань, около которой отмечается присутствие остеокластов (Рис 1 Г) В связи с процессом оссификации в стенке атероматозных сосудов, основными участниками которого являются остеобласты и остеокласты, а также из за дополнительной потребности в кальции для внекостной кальцификации, которую обеспечивают остеокласты путем резорбции костного матрикса, у больных с коронарным атеросклерозом может увеличиваться количество циркулирующих в крови преостеокластов В связи с вышеизложенным, была поставлена задача идентифицировать преостеокласты в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом

Анализировали жидкие культуры клеток мононуклеарной фракции крови пациентов с ГЛП и атеросклерозом и здоровых добровольцев

Через 72 часа культивирования клетки МФПК пациентов и здоровых добровольцев

Рисунок 6 Остеокластогенез в адгезивном слое жидких культур клеток МФПК

А - 7-10 дней культивирования, агрегаты прикрепившихся веретеноподобных и округлых клеток, Б - 2-3 недели культивирования, скопления гигантских многоядерных клеток (стрелки), В - формирование поликарионов путем слияния моноцитоподобных СБ14+ клеток (стрелки), Г - ТЭМ, слияние преостеокластов

формировали хорошо прикрепившиеся к подложке агрегаты Все неприкрепившиеся

клетки были удалены из культуры В течение недели агрегаты превращались в скопления

клеток, отличающихся по форме, адгерентности и размеру К 7-10 дню культивирования

основу сформированных агрегатов/скоплений составляли прикрепившиеся

веретеноподобные и округлые клетки в кооперации с неприкрепившимися мелкими

лимфоцитоподобными клетками (Рис. 6 А). На второй-третьей неделе культивирования в этих скоплениях появлялись большие многоядерные, а нередко гигантские распластанные клетки (Рис. 6 Б), которые формировались в результате слияния моноцитоподобных клеток-преостеокластов, активно вырабатывающих неспецифическую эстеразу и окрашивающихся на СБ14-антиген (Рис 6 В,Г). С увеличением числа ядер в формирующихся клетках-поликарионах наблюдалось уменьшение интенсивности секреции неспецифической эстеразы и экспрессии СБ68-антигена. Многоядерные клетки с содержанием ядер £5 контрастно отличались от моноцитов/макрофагов своим слабым окрашиванием на эти маркеры (Рис.7 АБ). Поликарионы положительно окрашивались на специфический маркер остеокластов (ОК) - тартрат-резистентную кислую фосфатазу (Рис. 7 В), что хорошо согласуется с данными других авторов [Ibbotson et al, 1984, Roodman et al, 1985, Purton et al, 1996]. В культурах пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом при окрашивании на маркер остеобластов

е V А s * w "» » * />y „, , Jf- ¿^fbi: ¡X W лШ — щр в

г у\ <.'

Рисунок 7. Остеокластогенез в адгезивном слое жидких культур клеток МФПК

А - слабая экспрессия СD68-антигеяа в многоядерной клетке (стрелка), Б - слабое окрашивание многоядерной клетки на неспецифическую эстеразу (стрелка), В - положительное окрашивание поликарнона на ТРКФ (стрелка), Г-гранулы щелочной фосфатазы в клетке, присутствующей в культуре остеокластов (стрелка), Д - положительное окрашивание клеток, присутствующих в культуре остеокластов, на остеонектин (стрелки).

щелочную фосфатазу в ряде клеток обнаруживались характерные гранулы (Рис.7 Г) а при

иммуноморфологическом окрашивании на маркер остеобластных клеток остеонектин

выявлялись места солокализации поликарионов и клеток, положительно

окрашивающихся на остеонектин (Рис.7 Д).

Ультраструктурный анализ многоядерных клеток выявил характерные признаки

остеокластов единообразные ядра с четкими ядрышками и минимумом гетерохроматина, множество митохондрий и лизосом в богатой органеллами цитоплазме, характерные выросты цитоплазмы (Рис 8А,БЗ,Г)

Рисунок 8. Ультра структур а многоядерных клеток с характерными признаками остеокластов: единообразные ядра (А) с четкими ядрышками и минимумом гетерохроматина (В), множество митохондрий и лизосом в богатой органеллами цитоплазме (Б), характерные выросты цитоплазмы (Г).

В группе пациентов с ГЛП (п=21) количество образовавшихся колоний/скоплений клеток, содержащих хорошо различимые после второй недели

культивирования многоядерные ОК, составляло 16,4+1,9 на 1х106 ядро содержащих

Таблица 1. Остеокластогенез (21 день) в жидких культурах клеток МФПК здоровых добровольцев (контроль) и пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом.

Число колоний/скоплений, содержащих остеокласты, на 10' ядросодержащих клеток МФПК Число остеокластов в культуре на 10е ядросодержащих клеток МФПК

Контроль (п=5) 2,0+0,8 / 11,6+2 2

Пациенты (п=21) 16,4+1,9* 119,4+23,5*

* <%»

•р<0,001

0r*i

клеток МФПК Общее число ОК в культуре (ОК в скоплениях, а также отдельно лежащие поликарионы) колебалось от 23 до 511 (среднее 119,4+23,5) на 1x106 ядросодержащих клеток МФПК (Таблица 1) Число ядер в некоторых ОК у пациентов к 21 дню культивирования достигало 50-70 (Таблица 1, рис Б) Иная картина наблюдалась в

культурах МФПК нормолипимических доноров. Здесь клеточные скопления, содержащие многоядерные клетки, были единичными - 2,0+0,8. Общее количество поликарионов составляло 11,6+2,2 на 1хЮ6 ядерных клеток мононуклеарной фракции крови, а число ядер в клетках-поликарионах не превышало 6 (Табл. 1, рисА).

Логично предполагать, что стимуляция остеокластогенеза у больных обусловлена гиперлипидемий, поскольку в применяемой нами тест-системе, в отличие от других авторов [Muguruma et al, 1998], не использовались факторы, усиливающие остеокластогенез. Обнаружение в этих культурах клеток с характеристиками остеобластов позволяет предположить их роль в развитии остеокластов. Эти данные могут быть важны для объяснения оссификации/кальцификации в сосудистой стенке при атеросклерозе, поскольку основными участниками этого процесса являются остеобласты и остеокласты. Возможно, высокое содержание преостеокластов связано с усилением потребности в кальции не только для костной, но и внекосгаой кальцификации, что в свою очередь может объяснять существующую связь между остеопорозом (уменьшение минеральной плотности костей) и усиленной кальцификацией атеросклеротических поражений [Ouchi et al,1993; Stefenelli et al, 1993; Banks et al, 1994]. 4. Определение уровня ГМ-КСФ и ФРФ-2 в сыворотке крови здоровых нормолипимических добровольцев и пациентов с первичной ГЛП и документированным атеросклерозом.

Вышеизложенные данные свидетельствуют о появлении в крови пациентов с коронарным атеросклерозом и гиперлипидемией нехарактерных для нормы циркулирующих стромальных КОЕ-Ф и увеличении числа преостеокластов, относящихся к клеткам гемопоэтической линии дифференцировки. Было важно оценить содержание в крови биохимических факторов, стимулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток гемопоэтический и стромальной линий дифференцировки.

С помощью метода твердофазной ELISA были определены уровни гранулоцитарно-макрофагального колонистимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и фактора роста фибробластов (ФРФ-2) в сыворотке здоровых добровольцев (n=7) и пациентов с тяжелой гиперлипидемией и коронарным атеросклерозом (n=31).

Полученные результаты показали, что уровень ГМ-КСФ в сыворотке здоровых нормолипимических доноров (n=7) составил 2,95+0,42 пг/мл, в то время как в группе пациентов с ГЛП (n=31) среднее значение уровня ГМ-КСФ было достоверно выше и составило 4,20+0,57ш7мл (р<0,05), что превышало контроль на 42,4% (Рис. 9).

Рисунок 9. Концентрация ГМ-КСФ и ФРФ-2 в сыворотке здоровых добровольцев и пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом.

Концентрация ФРФ-2 в контрольной группе (п=7) составила 19,67+5,04пг/мл, а в группе пациентов с ГЛП (п=31) - 29,40+4,50пг/мл (р<0,05), что превышало контроль на 49,47% (Рис. 9). Существует корреляция между значениями уровня ГМ-КСФ и ФРФ-2, коэффициент корреляции (г) составляет 0,66 (п=38, р<0,01) (Рис.9)

5. Исследование влияния липид-снижающей терапии препаратами ГРУППЫ статинов на КОЕ у пациентов с первичной ГЛП и документированным атеросклерозом.

Изучали циркулирующие костномозговые КОЕ у пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом до и после 3-месяцев терапии статинами, а именно зокором (20мг/сут) и лесколом (40 мг/сут)

Колониеобразование в стандартных семисолидных культурах клеток моноуклеарной фракции периферической крови (МФПК) пациентов с первичной ГЛП и документированным атеросклерозом до и после терапии статинами (п=7).

Исследование колониеобразования в клональных агаровых тест-системах обнаружило факт уменьшения суммарного количества циркулирующих в крови пациентов КОЕ в 1,6 раза (Рис. 10) на фоне снижения уровня общего холестерина на 2345% от исходного в результате терапии статинами

Рисунок 10. Колониеобразование в агаровых культурах клеток пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом до и после терапии статииами в течение 3-х месяцев.

Наблюдалось уменьшение числа КОЕ, дающих в культуре рост как гемопоэтическим (в 1,6 раза), так и негемопоэтическим (в 1,4 раза) колониям (Рис 10)

Влияние терапии статинами на присутствие циркулирующих ON клеток-предшественников остеобластов в мононуклеарной фракции пациентов с ГЛП и документированным атеросклерозом (п=8).

Анализ крови пациентов, принимавших статины, на присутствие циркулирующих

клеток-предшественников остеобластов, положительно окрашивающихся антителами к

Рисунок 11. Процент О^клеток в МФПК пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом до и после терапии статннами. Световая микроскопия.

остеонектину, проводили с использованием метода световой микроскопии Количество

ON+клеток уменьшалось в 1,7 раза по сравнению с исходным, наблюдавшимся у этих

пациентов до лечения. При сравнении этих данных с контролем оказалось, что до терапии статинами число ON+ клеток у пациентов превышало контроль в 3 раза, а после терапии статинами - в 1,7 раза.

Эти результаты показывают, что существует реакция костномозговых КОЕ на снижение уровня холестерина ЛПНП в крови пациентов с ГЛП на фоне статиновой терапии, то есть можно говорить о взимосвязи между количеством циркулирующих КОЕ и концентрацией ЛПНП в крови. Уменьшение числа гемопоэтических КОЕ в циркуляции, возможно, свидетельствует об уменьшении воспалительного процесса в организме. Также

логично ожидать уменьшения числа преостеокластов, о которых упоминалось выше, вследствие уменьшения количества остеобластных ON+ клеток в циркуляции.

6. Изучение влияния нативных и модифицированных (окисленных) ЛПНП на пролиферативный потенциал КОЕ в модельной системе культуры клеток мононуклеарной фракции пуповинной крови ЗДОРОВЫХ рожениц (n=5).

Поскольку было обнаружено, что изменение уровня холестерина ЛПНП влияет на популяцию циркулирующих в крови костномозговых КОЕ, исследовали реакцию КОЕ пупочной крови на повышение содержания ЛПНП в модельной клеточной тест-системе. Известно, что в процессе проникновения из циркуляции в стенку сосуда, ЛПНП окисляются [Steinberg D. 1987] и становятся атерогенными [Palinski et al, 1989]. В этой связи колониеобразование в клональных тест-системах изучали при добавлении в культуру нативных или окисленных ЛПНП.

Анализ культур показал, что при концентрациях о-ЛПНП в культуральной среде до 25мкг о-ЛПНП/мл наблюдается увеличение пролиферативного потенциала

мкг о-ЛПНП/мл мкг н-ЛПНП/мл

Рисунок 12. Колониеобразование в клональной тест-системе в присутствии н-ЛПНП и о-ЛПНП на модели КОЕ пупочной крови.

присутствующих в пупочной крови КОЕ по сравнению с контролем (0 мкг о-ЛПНП/мл культуральной среды). Так, при концентрации 10 мкг о-ЛПНП/мл количество колоний/кластеров в культуре достигало максимума и превышало контроль (100+20%) в среднем на 64% (164+9%) (Рис.12). Дальнейшее увеличение концентрации о-ЛПНП в культуральной среде ведет к плавному снижению количества формирующихся колоний, что скорее всего определяется токсическим эффектом о-ЛПНП. При концентрации ЮОмкг о-ЛПНП /мл колониеобразование практически полностью подавлялось и составляло 5% от исходного (Рис. 12). Влияние нативных ЛПНП (н-ЛПНП) на колониеобразование изучали при концентрациях в культуре от 50 мкг н-ЛПНП/мл, когда уже начинало сказываться токсическое воздействие. Было установлено, что при равных с о-ЛПНП концентрациях н-ЛПНП менее токсичны для КОЕ. В присутствии 50 мкг/мл н-ЛПНП в культуре суммарный пролиферативный потенциал составлял 93+12% от исходной культуры, при концентрации 100 мкг/мл н-ЛПНП еще также сохранялся высокий пролиферативный потенциал (82+13%), а при 250 мкг н-ЛПНП /мл культуральной среды составлял 33+7% от исходного (Рис. 12).

Результаты оценки колониеобразования в культуре в присутствии нативных и окисленных ЛПНП свидетельствовали о существовании непосредственного влияния ЛПНП на стимулирование или подавление пролиферации КОЕ всех линий дифференцировки в зависимости от концентрации ЛПНП.

Полученные данные позволяют предположить наличие связи межяу ГЛП, костным мозгом и развитием склеротического процесса в сосудистой стенке. Качественные и количественные изменения в составе костномозговых клеток-предшественников, циркулирующих в периферической крови, обусловлены реакцией костного мозга на поступающие из циркуляции биохимические сигналы. Фиброз интимы, приводящий к сосудистому стенозу, видимо, является побочным результатом природной "клеточной терапии" воспалительного процесса в сосудистой стенке.

выводы

1. Показано, что в культурах клеток крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом формируются колонии, положительно окрашивающиеся на неколлагеновый белок кости - остеонектин (маркер остеогенеза) и коллаген I типа, что подтверждает присутствие в крови циркулирующих колониеобразующих единиц для фибробластов (КОЕ-Ф).

2. В периферической крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом иммунофенотипированы стромальные костномозговые циркулирующие ОМ+ клетки-предшественники. Методом поточной цитофлуорометрии определено, что они относятся к популяции лимфоцитоподобных клеток с умеренной экспрессией СМ5 и имеют фенотип ОМ+СЭ451сГЮ34\ Количество этих клеток тесно связано с тяжестью атеросклеротических поражений коронарных артерий. Такие клетки отсутствуют у здоровых добровольцев.

3. Методом поточной цитофлуорометрии в популяции лимфоцитоподобных клеток мононуклеарной фракции крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом выявлено повышенное по сравнению с контролем содержание клеток, маркируемых антителами к коллагену I типа.

4. В периферической крови пациентов с ГЛП и документированным атеросклерозом (в отличие от здоровых добровольцев) показано высокое содержание циркулирующих преостеокластов. Этот феномен, по-видимому, связан с процессом оссификации и кальцификации в стенке сосуда, непосредственными участниками которого являются остеобласты и остеокласты.

5. Установлено, что в сыворотке пациентов с ГЛП и документированным атеросклерозом увеличиваются концентрации колониестимулирующих факторов, влияющих на коммутирование гемопоэтических и стромальных стволовых колониеобразующих единиц, а именно ГМ-КСФ и ФРФ-2, что не наблюдается у здоровых добровольцев. Эти результаты могут свидетельствовать о стимулирующем влиянии повышенного содержания ростовых факторов в крови на активацию костномозговых колониеобразующих клеток.

уменьшается. Снижение числа гемопоэтических КОЕ в циркуляции может свидетельствовать об уменьшении воспалительного процесса в организме. Также логично ожидать уменьшения числа преостеокластов вследствие снижения количества остеобластных ON+ клеток в циркуляции.

7. Показано, что модифицированные (окисленные) ЛПНП в модельной системе in vitro вызывают усиление пролиферативного потенциала КОЕ пупочной крови при концентрациях 8-25мкг/мл в культуре и уменьшение - при концентрациях более 25 мкг/мл (когда начинает сказываться токсический эффект о-ЛПНП). При равных концентрациях нативные ЛПНП по сравнению с о-ЛПНП имеют меньшее токсическое влияние на пролиферативные способности КОЕ.

По материалам диссертация опубликованы следующие работы:

1. Soboleva ELa Shindler EM, Saburova OS, Tvorogova MG, Smirnov VN. Colony forming units for fibroblasts (CFU-1) in the peripheral blood of patients with primary hypercholesterolemia. In: W.H.Hauss, RVWissler, HJ.Banch, eds., New pathogenic aspects of atherosclerosis. Nordrhein-Westfalische Academic der Wissenschaffen, Westdeutscher Verlag, 1994,93: 79-93.

2. Soboleva EL, Saburova OS, Rozhkova ТА, Tvorogova MG. Stem cells of hemopoietic and stromal differentiation lineages and human atherosclerosis. Angiology and vascular surgery, 1999; N5: 190-203.

3. Соболева Э.Л., Сабурова O.C., Рожкова ТА. Циркулирующие костномозговые предшественники остеокластов и остеокластогенез у пациентов с гиперлипидемией Па и lib типов. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2001; 9: 324-329 (Soboleva EL, Saburova OS and Rozhkova ТА. Circulating bone marrow osteoclast precursors and osteoclstogenesis in patients with Type HA and Type IIB hyperlipidemias. Bull Exp Biol Med, 2001; 132 (3): 890894.

4. Сабурова О.С., Творогова М.Г., Соболева Э.Л.. Колониестимулнрующий фактор гранулоцитов-макрофагов (ГМ-КСФ) и фактор роста фибробластов (ФРФ-2) в крови пациентов с гиперлипидемией (ГЛП). Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2003; 135(2): 170-172 (Saburova OS, Tvorogova MG, Soboleva EL. Macrophage-granulocyte colony-stimulating factor and fibroblast growth factor in the blood of patients with hyperlipoproteinemia. Bull Exp Biol Med. 2003;135(2):147-149).

5. Soboleva EL, Saburova OS, Prokofieva LA, Popkova VM, Rozhkova ТА, Smirnov VN. Identification of the colony forming units-fibroblasts in peripheral blood of coronary patients with hypercholesterolemia. XII Intern. Sympos. on Drugs Affecting Lipid Metabolism, Houston, 1995:121.

6. Soboleva EL, Saburova OS, Prokofieva LA, Alidganova KhG, Smirnov VN Stem osteogenic cells and pathogenesis of human atherosclerosis. 3rd Annual Scandinavian Atherosclerosis Conference, Copenhagen, 1996: 61.

7. Soboleva EL, Saburova OS, Prokofieva LV, Martynova EA, Smirnov VN Extracellular matrix production in peripheral blood leukocyte cultures of hyperlipidemic patients. 6th International Congress on Cell Biology, San Francisco, 1996: C-157.

8. Soboleva EL, Saburova OS, Smirnov VN, Akchurin RS/ Circulating colony-forming units for fibroblasts (CFU-F) and hyperlipidemia. British J of Hematology (Amsterdam), 1998; 102(1): 358.

9. Соболева Э.Л., Сабурова О.С., Смирнов В.Н.. Костномозговые стволовые клетки, стенка сосудов и костный мозг при атеросклерозе. Материалы Российского национального конгресса кардиологов, Москва, 2000, с. 18.

Ю.Соболева Э.Л., Сабурова О.С., Акчурин Р.С., Смирнов В.Н.. Гиперлипидемия, костномозговые стволовые клетки и атерогенез. Экспериментальные и клинические проблемы атеросклероза, Москва, 2000. Материалы симпозиума, с 11.

11. Soboleva EL, Saburova O.S, Smirnov VN, Chazov El: Characterization of circulating stem/progenitor cells in coronary patients with hyperlipidemia (HLP). Atherosclerosis suppl (Glasgo), 2001,2(2): 102.

12. Soboleva EL, Saburova OS, Akchurin RS, Chazov El, Smirnov VN. Stem cells and pathogenesis ofhuman atherosclerosis. Atherosclerosis Suppl., 2002; 3(2): 209.

13. Saburova OS, Rozhkova ТА, Soboleva EL. Circulating colony-forming units for osteoclasts in coronary patients with hyperlipidemia. Atherosclerosis Suppl (Salzburg), 2002,3(2): 199.

14. Soboleva EL, Saburova OS, Smimov VN, Chazov El. Bone marrow stem/progenitor cells and human atherosclerosis. Atherosclerosis Suppl, 2003; 4(2): 198.

15. Soboleva EL, Gabbasov ZA, Agapov AA, Saburova OS, Smirnov VN. Circulating stromal stem cells and diagnostics of atherosclerosis. Atherosclerosis Suppl. 2004, 5(1): 1.

»25174

Подписано в печать 12 ноября 2004 г. Заказ 451. Формат 60 х90/16. Тираж 100 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ. Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ. Тел. 778-87-47

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сабурова, Ольга Стояновна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

I. ВВЕДЕНИЕ

H.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Липопротеидная теория атеросклероза. Клеточные концепции патогенеза атеросклероза.

1.1. Липопротеидная теория атеросклероза.

1.2. Клеточные концепции теории атеросклероза.

1.2.1. Концепция Р .Росса

1.2.2. Концепция участия полипотентных стволовых клеток 16 1.2.2.1 .Стволовые клетки а). Гемопоэтические стволовые колониеобразующие единицы (КОЕ). б). Стромальные стволовые клетки, колониеобразующие единицы для фибробластов ^ в). Циркулирующие КОЕ-Ф.

1.2.2.2. Концепция участия костномозговых стволовых клеток в атерогенезе.

2. Кальцификация и остеогенез при атеросклерозе. Остеокласты и остеобласты. Атеросклероз и остеопороз. Остеонектин - маркер остеогенеза.

2.1. Кальцификация и остеогенез в стенке сосудов при атеросклерозе.

2.1.1. Кальцификация сосудов при атеросклерозе.

2.1.2. Остеобласты и остеокласты - клетки, осуществляющие остеогенез.

2.1.3. Связь между развитием кальцификации сосудов при атеросклерозе и нарушениями костного метаболизма. Влияние гиперлипидемии на мышечно-скелетные нарушения у человека.

2.2. Остеокластогенез и атерогенез.

2.2.1. Остеокласты - участники остеогенеза, производные гемопоэтического ростка дифференцировки клеток.

2.2.2. Остеокластогенез и атерогенез.

2.3. Остеонектин - маркер костеобразования. Остеонектин и атерогенез.

2.3.1. Остеонектин - маркер костеобразования и остеобластной дифференцировки стромальных клеток.

2.3.2. Остеонектин и атерогенез.

3. Цитокины. Ростовые факторы, влияющие на гемопоэз и стромопоэз. Гранулоцитарно-макрофагальный фактор (ГМ-КСФ) и фактор роста фибробластов (ФРФ). Участие факторов роста в воспалительных/патологических процессах.

3.1. Семейство цитокинов.

3.1.1. Ростовые факторы, влияющие на гемопоэз. Колониестимулирующие факторы (КСФ). Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ).

3.1.2. Ростовые факторы, влияющие на стромопоэз. Семейство факторов роста фибробластов (ФРФ). Основной фактор роста фибробластов (ФРФ-2).

3.2. Участие факторов роста гемопоэтических и стромальных клеток в воспалительных/патологических процессах.

3.2.1. Роль гемопоэтических КСФ (в том чилсе ГМ-КСФ в воспалительных/патологических процессах.

3.2.2. Участие факторов роста стромальных клеток (в том числе ФРФ-2 в воспалительных/патологических процессах.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Циркулирующие колониеобразующие клетки и факторы, влияющие на их участие в атерогенезе человека"

Атеросклеротические поражения магистральных сосудов человека являются причиной развития целого ряда сердечно-сосудистых заболеваний. Разгадка причин возникновения и клеточных механизмов формирования атеросклеротических бляшек является одним из главных направлений современной медицинской науки.

Наибольшее распространение среди клеточных концепций теорий атерогенеза получила гипотеза Р.Росса, согласно которой формирование атеросклертических поражений стенки сосудов является результатом повреждения эндотелия, сопровождающегося адгезией тромбоцитов, их активацией и локальным выбросом тромбоцитарного фактора роста (ТФР), под влиянием которого происходит проникновение гладкомышечных клеток (ГМК) из медии в интиму и их пролиферация [Ross and Glomset, 1973-1976; Ross and Harker, 1976]. Полагали, что именно ГМК, поглощая накапливающиеся в интиме сосудов человека липиды, становятся пенистыми клетками, но после появления данных о моноцитарном происхождении пенистых клеток [Aquel et al, 1984], Р.Росс откорректировал свою гипотезу: моноциты из кровотока проникают через эндотелий в интиму, где, поглощая и накапливая липиды, превращаются в пенистые клетки. Развивающийся в стенке сосуда воспалительный процесс запускает защитный механизм "ремонта" в виде фибропролиферативного ответа, в котором главная роль принадлежит пролиферирующим макрофагам и ГМК медии [Ross, 1986,1987,1993].

Относительно идеи о формировании бляшки за счет пролиферирующих и мигрирующих из медии в интиму ГМК высказывались сомнения только немногими авторами [Krushinsky and Nestaiko, 1987; Gordon et al, 1990; Schwartz and O'Brien, 1995]. В связи с этим оставались открытыми вопросы о природе клеток, способных к гиперпродукции экстрацеллюлярного матрикса, а также о происхождении мультиклеточных популяций (моноцитов/макрофагов, лимфоцитов, ГМК, фибробластов, тучных клеток и др.), присутствующих в районах атеросклеротических поражений.

В оригинальных исследованиях группы Э.Л.Соболевой, проводимых в Кардиологическом Научном Центре с 1985 г., впервые удалось обнаружить в субэндотелиальном слое интимы человека в зонах липидной инфильтрации низкодифференцированные клетки-предшественники. Стволовые колониеобразующие клетки, так называемые колониеобразующие единицы (КОЕ) гемопоэтической и стромальной линий дифференцировки, были выявлены с помощью классических колониеобразующих тестов [Chazov et al, 1986, Соболева и Попкова, 1989]. Стромальные стволовые КОЕ (КОЕ-Ф) были выявлены позже в крови пациентов с первичной гиперлипидемией (ГЛП) и выраженным коронарным атеросклерозом [Soboleva et al, 1994, Soboleva and Smirnov, 1995]. Эти данные позволили предположить, что пролиферирующие в интиме человека клетки, названные "неизвестными" [Gordon et al, 1990], имеют костномозговую природу, а ключевым моментом в развитии атеросклероза является проникновение циркулирующих КОЕ в интиму в места скопления липидов - очаги воспаления. Активно пролиферирующие в интиме КОЕ формируют клеточные скопления/клоны из гемопоэтических и стромальных клеток, которые поглощают избыточные липиды и синтезируют экстрацеллюлярный матрикс для изоляции очагов воспаления, что и обусловливает развитие атеросклеротических бляшек.

Однако этим данным о роли костномозговых стволовых клеток в формировании атеросклеротических поражений сосудов на фоне общепринятой теории Росса не уделялось должного внимания. Наконец в 2003г. было подтверждено присутствие костномозговых клеток в интиме атероматозных сосудов человека [Caplice et al, 2003].

Данная работа является продолжением и расширением вышеуказанных исследований о роли циркулирующих стволовых клеток в атерогенезе человека.

Представлялось необходимым конкретизировать фенотип обнаруженных клональным методом колониеобразующих единиц для фибробластов (КОЕ-Ф) иммуноморфологическими методами как с использованием световой микроскопии, так и с помощью современного метода анализа - цитофлуорометрии в потоке.

Данные о присутствии КОЕ-Ф с остеогенными потенциями в интиме атероматозных сосудов человека и в периферической крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом, формирующих in vitro костный матрикс, около которого было отмечено присутствие остеокластов [Soboleva et al, 1994], определили интерес к остео - и остеокластогенезу у указанных пациентов.

Атеросклеротические поражения сосудов часто осложняются кальцификацией [Вихерт с соавт., 1970; Agatson et al, 1990], однако механизм патогенеза кальцификации в стенке сосуда при атеросклерозе до конца не ясен. Заслуживают внимания данные литературы о наличии связи между развитием атеросклероза и нарушениями костного метаболизма: усиленная калыдафикация атероматозных сосудов сопровождается снижением минеральной плотности костей [Ouchi et al, 1993; Banks et al, 1994]. Процесс реконструкции кости постоянно протекает в организме, а уменьшение костной массы происходит при сдвиге равновесия в направлении преобладания резорбции кости остеокластами, когда увеличивается потребность организма в кальции. В норме количество циркулирующих преостеокластов чрезвычайно мало (менее 1 на 105 ядросодержащих клеток крови) [Scheven et al, 1986]. Представлялось необходимым проанализировать состояние пула преостеокластов у пациентов с верифицированным атеросклерозом и ГЛП, поскольку такие данные отсутствуют в литературе и могли бы способствовать пониманию причин и механизмов кальцификации сосудистой стенки.

Обнаруженны особенности состава КОЕ у пациентов с первичной ГЛП и атеросклерозом [Soboleva et al, 1994, Soboleva and Smirnov, 1995], также установлены факты присутствия разнообразных цитокинов, и в том числе ростовых факторов, в зонах атеросклеротического поражения сосудов [Ross, 1993; Clinton and Libby, 1992]. В связи с этим целесообразно оценить, имеет ли место изменение уровня факторов, способствующих коммитированию гемопоэтических и стромальных КОЕ, в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом, относительно нормы. Важнейшими факторами, способствующими коммитированию клеток-предшественников, являются факторы роста или колониестимулирующие факторы [Metealf, 1984; Rougier et al, 1996]. На дифференцировку гемопоэтических КОЕ влияет колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (ГМ-КСФ) [Metealf, 1986], а стромальных КОЕ - фактор роста фибробластов-2 (ФРФ-2) [Burgess, 1989]. До настоящего времени сравнительного анализа уровня ГМ-КСФ и ФРФ-2 в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом не проводилось. Определение роли ГМ-КСФ и ФРФ-2 в патогенезе атеросклероза прояснит перспективы терапевтического использования этих факторов.

Общеизвестно, что гиперлипидемия, и в частности гиперхолестеринемия, является одним из важнейших факторов риска, способствующих ускоренному развитию атеросклероза. По данным Seven Countries Study, увеличение уровня общего холестерина у мужчин в странах Северной Европы с 4,8 до 8,4 ммоль/л вызывает возрастание смертности от ИБС в 2,1 раза (с 1,4 до 2,9%) [Menotti et al, 1996]

Атерогенные (модифицированные) J111HU могут быть основным компонентом развития дисфункции эндотелия, выступая в качестве антигена, провоцирующего иммунную реакцию [Ross, 1993]. Модифицированные ЛПНП активируют экспрессию "скевенджер" - рецептора на макрофагальных клетках сосудистой стенки [Palinski et al, 1989], а образующиеся из моноцитов в результате захвата ЛПНП пенистые клетки выделяют различные факторы роста и хемоаттрактанты [Newby and Zaltsman, 1999]. Принимая во внимание эти данные, представляется важным исследовать в экспериментах in vitro реакцию циркулирующих КОЕ на присутствие нативных и модифицированных ЛПНП.

Для лечения гиперхолестеринемии в клинике широкое применение нашли препараты группы статинов, снижающие избыточный уровень холестерина. Данные Health Protection Study, в которое было включено 20500 пациентов, подтверждают пользу применения статинов в различных подгруппах больных, в том числе у пациентов с сахарным диабетом, женщин в пост-менопаузе, пожилых людей. В этом исследовании длительная (более 5 лет) терапия симвастатином (40 мг) привела к снижению общей смертности на 12%, смертности от сердечно-сосудистых заболеваний на 17%, частоты коронарных осложнений на 24% и инсульта на 27% [Collins et al, 2002].

В целях проверки предположения об опосредованном влиянии гиперлипидемии на атерогенез сосудистой стенки через костномозговые стволовые клетки, представлялось интересным проанализировать влияние терапии липид-снижающими препаратами группы статинов на состояние пула изучаемых нами колониеобразующих единиц (КОЕ) в крови пациентов с ГЛП и документированным коронарным атеросклерозом.

Целью диссертации является анализ циркулирующих костномозговых гемопоэтических и стромальных стволовых клеток, а также факторов, влияющих на их коммитирование, у пациентов с ГЛП и атеросклерозом коронарных артерий и у здоровых добровольцев (группа сравнения).

Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

5. Оценить влияние терапии препаратами группы статинов на количество циркулирующих стромальных ON+клеток-предшественников остеобластов в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом.

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Липопротеидная теория атеросклероза. Клеточные концепции патогенеза атеросклероза.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Сабурова, Ольга Стояновна

VI. выводы

1. Показано, что в культурах клеток крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом формируются колонии, положительно окрашивающиеся на неколлагеновый белок кости - остеонектин (маркер остеогенеза) и коллаген I типа, что подтверждает присутствие в крови костномозговых колониеобразующих единиц для фибробластов (КОЕ-Ф).

2. В периферической крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом иммунофенотипированы стромальные костномозговые циркулирующие (Ж+ клетки-предшественники. Методом поточной цитофлуорометрии определено, что (Ж+клетки-предшественники относятся к популяции лимфоцитоподобных клеток с умеренной экспрессией СБ45 и имеют фенотип

Количество этих клеток тесно связано с тяжестью атеросклеротических поражений коронарных артерий. Такие клетки отсутствуют у здоровых добровольцев.

3. Методом поточной цитофлуорометрии в популяции лимфоцитоподобных клеток мононуклеарной фракции крови у пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом выявлено повышенное по сравнению со здоровыми добровольцами содержание клеток, положительно окрашиваемых на коллаген I типа.

5. Установлено, что в сыворотке пациентов с ГЛП и документированным атеросклерозом по сравнению со здоровыми добровольцами увеличиваются концентрации колониестимулирующих факторов, влияющих на коммитирование гемопоэтических и стромальных стволовых колониеобразующих единиц, а именно ГМ-КСФ и ФРФ-2. Эти результаты могут свидетельствовать о стимулирующем влиянии повышенного содержания ростовых факторов в крови на активацию костномозговых колониеобразующих клеток.

6. Терапия статинами в течение 3-х месяцев приводит к уменьшению количества циркулирующих КОЕ стромальной и гемопоэтической природы в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом. Число циркулирующих ONf клеток также уменьшается. Снижение числа гемопоэтических КОЕ в циркуляции может свидетельствовать об уменьшении воспалительного процесса в организме. Также логично ожидать уменьшения числа преостеокластов вследствие снижения количества остеобластных ONf клеток в циркуляции.

Показано, что модифицированные (окисленные) ЛПНП в модельной системе in vitro вызывают усиление пролиферативного потенциала КОЕ пупочной крови при концентрациях 8-25мкг/мл в культуре и уменьшение - при концентрациях более 25 мкг/мл (когда начинает сказываться токсический эффект о-ЛПНП). При равных концентрациях нативные ЛПНП по сравнению с о-ЛПНП имеют меньшее токсическое влияние на пролиферативные способности КОЕ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сабурова, Ольга Стояновна, Москва

1. Анестиади В, Нагорнев В. Морфогенез атеросклероза // Кишинев, «Штиинца», 1982: С. 238-240, С. 159-160

2. Аничков H.H. Новые данные по вопросу о патологии и этиологии атеросклероза (артериосклероза) // Русский врач. -1915.-№8. С.184-186. - №9 - С.207-211.

3. Аничков H.H. Об отложении жиров в промежуточном веществе // Харьковский Мед. Журнал. 1916. - Т. 22. - С.30-39.

4. Аничков H.H., Волкова К.Г. Основные положения современного учения об атеросклерозе артерий и перспективы его дальнейшего развития // Труды ин-та / Институт клинической и экспериментальной кардиологии АН Груз. ССР. 1958, Т.5. С. 591-598

5. Владимирская Е.Б., Замараева Н.В., Волынец М.В. и др. Пуповинная кровь -альтернативный источник стволовых кроветворных клеток для трансплантации // Педиатрия. 1997. - №4. - С. 9-12.

6. Вихерт AM, Седов KP, Соколова РИ. Кальциноз артерий (аорты и коронарных сосудов). М., 1970

7. Вихерт А.М. К вопросу об этиологии, патогенезе и гистогенезе атеросклероза // Кардиология. 1974. - №12. - С.61-66.

8. Внутренние болезни. В 7 т. М.: Медицина, 1996. Т.7. - 650 с.

9. Грачева J1.A. Цитокины в онкогематологии // М., 1996. - С.4-9.

10. Давыдовский И.В. Атеросклероз как проблема возраста // Геронтология. М., 1966. С. 204-219.

11. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача // С.- П, 1998. С.28-33, 119-121.

12. Климов А.Н., Синицына Т.А., Нагорнев В.А. Развитие идей Н.Н.Аничкова на современном этапе учения об атеросклерозе //Арх. пат. 1975. - №11. - С. 3-16.

13. Климов А.Н. Некоторые вопросы патогенеза атеросклероза // Кардиология. 1976. -№2. - С. 12-17.

14. Климов А.Н. Причины и условия развития атеросклероза // Превентивная кардиология / Под ред.Г.И.Косицкого. М., 1977. С. 260-321

15. Панкин В.З., Гуревич С.М. Системы, ответственные за перекисное окисление полиеновых жирных кислот при экспериментальном злокачественном росте //

16. Липиды в организме животных и человека / Под ред. С.Е.Северина. М., 1974. С. 7277.

17. Лимфоциты. Методы: Пер. с англ. / Под ред.Дж.Клауса. М., Мир. 1990. - С. 29-30.

18. Максимов А. Основы гистологии. II. Учение о тканях. М., Прогресс, 1918. - 624с.

19. Нагорнев В А. Морфологические основы ишемической болезни сердца / Под ред. ИЕ Ганелиной. М., 1977. - С. 14-25.

20. Насонов, Е.Л. Роль кальция, витамина D и тиазидных диуретиков в профилактике и лечении остеопороза / Русский мед.журнал. 1997. - №5. - С. 978-982.

21. Пальцев М.А., Иванов A.A. Межклеточные взаимодействия. М., Медицина, 1995. -С.39-59

22. Соболева Э.Л., Попкова В.М. Гемопоэтические клетки-предшественники в интиме атероматозной аорты человека// Бюлл. Эксп. Биол. Мед.- 1986. №5.- С.600-604

23. Соболева Э.Л., Сабурова О.С., Рожкова Т.А., Творогова М.Г. Стволовые клетки гемопоэтической и стромальной линий дифференцировки и атеросклероз человека // Ангиология и сосудистая хирургия. 1999.- т5.- С.190-203.

24. Фриденштейн А .Я., Лурия Е.А. Клеточные основы кроветворного микроокружения // М, Медицина, 1980. 213 с.

25. Цинзерлинг В.Д. Морфология атеросклероза человека // Клин.Мед. 1937. - Т. 15. -С. 521-527.

26. Чертков И.Л., Фриденштейн А.Я. Клеточные основы кроветворения, кроветворные клетки-предшественники // М, Медицина, 1977. 270 с.

27. Шиффман Ф.Д. Патофизиология крови. С.-П., Бином, 2000.- 448с.

28. Agatson A.S., Janowitz W.R., Hildner F.J. Et al. Quantification of coronary artery calcium using ultrafast computed tomography // J. Am. Coll. Cardiol. 1990. - V. 15. - P. 827-832.

29. Ananyeva N.M., Tjurmin A.V., Berliner J.A. et al. // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. -1997. V. 17. - P. 445-453.

30. Anitschkov N. Uber die Veränderungen der kaninchenaorta bei experimenteller cholesterin-steatose // Beitr pathol Anat allgem Pathol. 1913. - V. 56. - P. 379-405.

31. Aquel N.M, Ball R.Y, Waldmann H., Mitchinson M.J. Monocytic origin of foam cells in human atherosclerotic plaques // Atherosclerosis. 1984. - V. 53. - P. 265-271.

32. Assmus В., Schächinger V., Teupe С. Et al. Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE-AMI) // Circulation. 2002. - V. 106. - P. 3009-3017.

33. Ash P., Loutit J.F., Townsend K.M.S. Osteoclasts derived from hematopoietic stem cells // Nature. 1980. - V. 283. - P. 669.

34. Ash S., Detrick R.A., Lanjani E.D. Studies of human pluripotential hemopoietic stem cells (CFU-GEMM) in vitro // Blood. 1981. - V. 58. - P. 309-316.

35. Ash P, Loutit J.F., Townsend K.M.S. Osteoclasts derive from hematopoietic stem cells according to marker, giant lysosomes of beige mice // Clin. Orthop. Rel. Res. 1985. - V. 155.-P. 249.

36. Baird A., Bohlen P. "Fibroblast Growth Factors" in Peptide Growth Factors and their receptors // Sporn M.B. and Roberts A.B. eds. Springer-Verlag, New York, 1990, P.369.

37. Barengolts E.I., Berman M., Kukreja S.C. et al. Osteoporosis and coronary atherosclerosis in asymptomatic postmenopausal women // Calcif. Tssue Int. 1998. - V. 62. - P. 209-213.

38. Barnes D.W., Loutit J.F. Haemopoietic stem cells in the peripheral blood // The Lancet. -• 1967.-V. 2.-P. 1138-1141.

39. Baron R., Neff L., Tran Van P. et al. Kinetic and Cytochemical identification of osteoclast precursors and their differentiation into multinucleated osteoclasts // Am. J. Pathol. 1986. -V. 122.-P. 363-367.

40. Bauters C., Six I., Meurice T., Van Belle E. Growth factors and endothelial dysfunction // Drugs.- 1999,-V. 58. -№l.-p. 11-15.

41. Benditt E.P., Benditt J.M. Evidence for a monoclonal origin of human atherosclerotic plaque // Proc. Natl. Acad. Sei. 1973. - V. 70. - P. 1753-1756.

42. Benditt E.P. Implication of monoclonal character of human atherosclerotic plaque // Ann. N.Y. Acad. Sei. 1976. - V. 275. - P. 96-100.

43. Bini A., Mann K.G., Kudryk B.J., Schoen F.J. Noncollagenous bone matrix proteins, calcification, and thrombosis in carotid artery atherosclerosis // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.-1999.-V. 19.-P. 1852-1861.

44. Biwa T., Sakai M., Horiuchi S. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plays essential role in oxidized low density lipoprotein-induced macrophage proliferation // J. Atheroscler. Thromb.-2000.-V.l.-P. 14-20.

45. Blankenborn D.H., Nessim S.A., Johnson R.L. et al. Beneficial effects of combined colestipolniacin therapy on coronary atherosclerosis and coronary venous bypass grafts // JAMA. 1987. -V. 257. - P. 3233-3240.

46. Bostrom K., Watson K.E., Horn S. et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions // J. Clin. Invest. 1993. - V. 91. - P. 1800-1809.

47. Brandt J., Baird N., Lu L. et al. Characterization of a human hematopoietic progenitor cell capable of forming blast cell containing colonies in vitro // J. Clin. Invest. 1988.- V. 82. P. 1017-1027.

48. Browner W.S., Sooley D.G., Vogt T.M. Non-trauma mortality in eldery women with low bone mineral density // Lancet. 1991. - V. 338. - P. 335-338.

49. Browner W.S., Pressman A.R., Nevitt M.C. et al. Association between low bone density and stroke in elderly women. The study of osteoporotic fractures // Stroke. 1993. - V.24.- P. 940-946.

50. Broxmeyer H., Douglas G.W., Hangoc G. et al.: Human umbilical cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 1989. V. 86.-P. 3828-3832.

51. Bucala R., Spiegel L.A., Chesney J. et al. Circulating fibrocytes define a new leukocyte subpopulation that mediates tissue repair // Mol. Med. 1994. - V.1.-P.71-81.

52. Bücher H.C., Cook R.J., Guyatt G.H. et al. Effects of dietary calcium supplementation on blood pressure. A meta-analysis of randomized controlled trials // JAMA/ -1996. V. 275. -P. 1016-1022.

53. Bukhardt R. Morphologische hinweise auf eine vasculare Pathogenese der rheumatische Osteoporose. In Abendroth K. (Ed.) // Primum colloquim osteologicum. Jenese.-1980.-Schiller Univ., Jena.- 1982,- P.44-49.

54. Bunting C.H. The formation of true bone with cellular (red) marrow in a sclerotic aort // J. Exp. Med. 1906. - V. 8. - P. 365-376.

55. Burgess W.H., Maciag T. The heparin-binding (fibroblast) growth factor family of proteins // Annu. Rev. Biochem. 1989. - V. 58. - P. 575-606.

56. Burgess A.W., Metealf D. The nature and action of granulocyte-macrophage colony stimulating factors // Blood. 1980. - V. 56. - P. 947-958.

57. Burgess A., Nicola N. Growth factors and stem cells // Academic press, 1983

58. Bussolino F., Wang J.M., Defilippi P. et al. Granulocyte- and granulocyte-macrophage-colony stimulating factors induce human endothelial cells to migrate and proliferate // Nature. 1989. - V. 337. - P. 471-473.

59. Campuzano R., Barrios V., Cuevas B. et al. Serum basic fibroblast growth factor levels in exercise-induced myocardial ischemia more likely a marker of endothelial dysfunction than a marker of ischemia // Eur. J. Med. Res. 2002. - V. 7. - P. 93-97.

60. Caplice N.M., Bunch T.J., Stalboerger P.G. et al. Smooth muscle cells in human coronary atherosclerosis can originate from cells administrated at marrow transplantation // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 2003. - V. 100. - P. 4754-4759.

61. Castro-Malaspina H., Gay R.E., Resnic G. et al. Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny // Blood. 1980. - v. 56. - P. 289-301.

62. Chang M.Y., Sasahara M., Chait A. et al. Inhibition of hypercholesterolemia-induced atherosclerosis in the nonhuman primate by probucol, II: cellular composition and proliferation // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1995. - V. 15. - P. 1631-1640.

63. Chazov E.I., Repin V.S., Orekhov A.N. et al. Atherosclerosis: What has been learned studying human arteries // Atherosclerosis Reviews, edited by A.M.Gotto and R.Paoletti. Raven press, New York. 1986. - V. 14 - P. 7-60.

64. Cheng-S.L.; Yang-J.W., Rifas-L. et al. Differentiation of human bone marrow osteogenic stromal cells in vitro: induction of the osteoblast phenotype by dexamethasone // Endocrinology. 1994. - V. 134. - P. 277-286.

65. Chesney J., Bacher M., Bender A., Bucala R. The peripheral blood fibrocyte is a potent antigen-presenting cell capable of priming naive T cells in situ // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1997. - V. 94. - P. 6307-6312.

66. Chesney J., Metz C., Stavitsky A.B. et al. Regulated production of typel collagen and inflammatory cytokines by peripheral blood fibrocytes // J. Immunol. 1998. - V. 160. - P. 419-425.

67. Choi K., Kennedy M., Kazarov A. et al. A common precursor for hematopoietic and endothelial cells // Development. 1998. - V. 125. - P. 725-732.

68. Clinton S.K., Libby P. Cytokines and growth factors in atherogenesis // Arch. Pathol. Lab. Med. 1992. - V. 116. - P. 1292-1300.

69. Collins R., Peto R., Armitage J. The MRC/BHF Heart Protection Study: preliminary results // Int. J. Clin .Pract. 2002. -V. 56. - P. 53-56.

70. Constantinides P., Wiggers K.D. Electron microscopic autoradiographic study of cholesteral passage across arterial and capillary endothelium // Virchows Arch. Pathol. Anat. Histol. 1974. -V. 362. - P. 291-310.

71. Crawford T., Levene C. The incorporation of fibrin within the aortic intima // J. Pathol. Bacterid. 1952. - V. 64. - P. 523-528.

72. Dedhar S., Gaboury L., Galloway P., Eaves C. Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor is a growth factor active on a variety of cell types of nonhemopoietic origin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 9253-9257.

73. Demer L.L., Watson K.E. Mechanism of calcification in atherosclerosis // Trends Cardiovasc. Med. 1994. - V. 4. - P. 45-49.

74. Demer L.L. A skeleton in the atherosclerosis closet // Circulation. 1995. - V. 92. - P. 2029-2032.

75. Dhore C.R., Cleutjens J.P., Lutgens E. et al. Differential expression of bone matrix regulatory proteins in human atherosclerotic plaques // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. -2001.-V. 21.-P. 1998-2003.

76. Diguid J. Trombosis as a factor in the pathogenesis of coronary atherosclerosis // J. Pathol. Bacterid. 1946. -V. 58. - P. 207-212.

77. Diguid J. Pathogenesis of atherosclerosis // Lancet. 1949. - V. 2. - P. 925-927.

78. Doherty T.M., Detrano R.C. Coronary arterial calcification as an active process: a new perspective on an old problem // Calcif. Tissue Int. 1994. - V. 54. - P. 224-230.

79. Dominici M., Pritchard C., Garlits J.E. et al. Hematopoietic cells and osteoblasts are derived from a common marrow progenitor after bone marrow transplantation // Proc. Nat. Acad. Sci.USA.-2004.-V. 101.-P. 11761-11766.

80. DufF G. Experimental cholesterol arteriosclerosis and its relationship to human arteriosclerosis // Arch.Pathol. 1935. - V. 20. - P .90-96,259-296

81. Fauser A.A., Messner H.A. Granuloerythropoietic Colonies in Human Bone Marrow // Peripheral. Blood and Cord. Blood. 1978. - V. 52. - P. 1243-1248.

82. Faust J., Lacey D.L., Hunt P. et al. Osteoclast markers accumulate on cells developing from human peripheral blood mononuclear precursors // J. Cell Biochem. 1999. - V. 72. - P. 167-180.

83. Feldman D.L., Hoff H.F., Gerrity R.G. Immunohistochemical localization of apoprotein B in aortas from hyperlipemic swine. Preferential accumulation in lesion-prone areas // Arch. Pathol. Lab. Med. 1984. - V. 108. - P. 817-822.

84. Fernandez-Real J.M., Vayreda M., Casamitjana R. et al. Circulating GM-CSF and serum fatty acid composition in men and women // Metabolism. 2001. - V. 50. - P. 1479-1483.

85. Ferrari G., Cusella-De Angelis G., Coletta M. et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors // Science. 1998. - V. 279. - P. 1528-30.

86. Fleet J.C., Clinton S.K., Salomon R.N., Loppnow H., Libby P. Atherogenic diets enhance endotoxin-stimulated interleukin-1 and tumor necrosis factor gene expression in rabbit // J.

87. Nutr. 1992. - V. 122. - P. 294-305.

88. Fleish M., Billinger M., Ebelri FR. Et al. Physiologically assessed coronary collateral flow and intracoronary growth factor concentrations in patients with 1- to 3-vessel coronary artery disease // Circulation. 1999. - V. 100. - P. 1945-1950.

89. Ford R., Wang G., Jannati P. et al. Modulation of SPARC expression during butyrate-induced terminal differentiation of cultured human keratinocytes: regulation via a TGF-beta-dependent pathway // Exp. Cell Res. 1993. - V. 206. - P. 261-275.

90. Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K., Lalykina K.S. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells // Cell Tissue Kinet. -1970.-V. 3.-P. 393-403.

91. Friedenstein A.J., Deriglasova U.F., Kulagina N.N. et al.Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method // Exp. Hematol. 1974. -V. 2. - P. 83-92.

92. Friedenstein A.J. Stromal mechanocytes of bone marrow: Cloning in vitro and retransplantation in vivo // Thiernfelder S. (ed.): Immunology of bone marrow transplantation. Berlin, Germany, Springer-Verlag Berlin, 1980. P.19

93. Friedenstein A.J. Osteogenic stem cells in the bone marrow // Bone and Mineral Research. -1990.-V. 7.-P. 243-272.

94. Friedewald W.T., Levy R.I., Fredrickson D.S. Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifiige // Clin. Chem. 1972. -V. 18. - P. 499-502.

95. Frye M.A., Melton L.J., Bryant S.C. et al. Osteoporosis and calcification of aorta // Bone miner. 1992. - V. 19. - P. 185-194.

96. Fukuda J., Kaneko T., Egashira M., Oshimi K. Direct measurement of CD34+ blood stem cell absolute counts by flow cytometry // Stem Cells. -1998. V. -16. - P. 294-300.

97. Fuller K., Chambers T.J. Generation of osteoclasts in cultures of rabbit bone marrow and spleen cells // J. Cell Physiol. 1987. - V. 132. - P. 441.

98. Gadeau A.P., Chaulet H., Daret D. et al. Time course of osteopontin, osteocalcin, and osteonectin accumulation and calcification after acute vessel wall injury // J. Histochem. Cytochem. 2001. - V. 49. - P. 79-86.

99. Galzie Z., Kinsella A.R., Smith J.A. Fibroblast growth factors and their receptors // Biochem. Cell Biol. 1997. - V. 75. -P. 669-685.

100. Gauthier T., Maftouh M., Picard C. Rapid enzymatic degradation of ,25I.(tyrlO)FGF (1-10) by serum in vitro and involvement in determination of circulating FGF by RIA. // BBRC.• 1987.-V. 145.-P. 775-781.

101. Gerrity R.G., Naito H.K., Richardson M., Schwartz C.J. Dietary induced atherogenesis in swine. Morphology of the intima in prelesion stages // Am. J. Pathol. 1979. - V. 95. - P. 775-792.

102. Giachelli C.M., Bae N., Almeida M. et al. Osteopontin is elevated during neointima formation in rat arteries and is a novel component of human atherosclerotic plaque // J. Clin. Invest. 1993. -V. 92. - P. 1686-1696.

103. Goldblum S.E., Ding X., Funk S.E., Sage E.H. SPARC (secreted protein acidic and rich in cysteine) regulates endothelial cell shape and barrier function // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994. -V. 91. - P. 3448-3452.

104. Goldstein J.L., Brown M.S. Lipoproteins receptors, cholesterol metabolism and atherosclerosis // Arch. Pathol. 1975. - V. 99. - P. 181-184.

105. Goldstein J.L., Brown M.S., Anderson R.G.W. et al. Receptor-mediated endocytosis: concepts emerging from the LDL receptor system // Annu. Rev. Cell Biol. 1985. - V. 1. -P. 1-39.

106. Goodman J.W., Hodson G.S. Evidence for stem cells in the peripheral blood of mice // Blood. 1962. - V. 19. - P. 702-714.

107. Gordon D., Reidy M.A., Benditt E.P., Schwartz S.M. Cell proliferation in coronary arteries // Proc Nat. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 4600-4604.

108. Gospodarowicz D., Localisation of a fibroblast growth factor and its effect alone and with hydrocortisone on 3T3 cell growth // Nature. 1974. - V. 249. - P. 123-127.

109. Gospodarowicz D., Weseman J., Moran J.S. Presence in brain of mitogenic agent promoting proliferation of myoblast in low density culture // Nature. 1975. — V. 256. - P. 216-219.

110. Gospodarowicz D., Mescher A.L. A comparison of the responsee of cultured myoblasts and chondrocytes to fibroblast and epidermal growth factors // J. Cell Physiol. 1977. - V. 93. -P. 117-128.

111. Groessner-Schreiber B., Krukowski M., Hertweck D., Osdoby P. Osteoclast formation is related to bone matrix age // Calcif. Tissue Int. 1991. - V. 48. - P. 335-340.

112. Gronthos S., Graves S.E., Ohta S., Simmons P.J. The STRO-1+ fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors // Blood. 1994. — V. 84. - P. 4164-4173.

113. Guba S.C., Sartor C.I., Gottschalk L.R. et al. Bone marrow stromal fibroblasts secrete IL-6 and GM-CSF in the absence of inflammatory stimulation // Blood. 1992. -V. 80. - P. 1190-1198.

114. Guerriero A., Worford L., Holland H.K. et al. Thrombopoietin is synthesized by bone marrow stromal cells // Blood. 1997. - V. 90. - P. 3444-55.

115. Hall F.L., Han B., Kundu R.K. et al. Phenotypic differentiation of TGF-betal-responsive pluripotent premesenchymal prehematopoietic progenitor (P4 stem) cells from murine bone marrow // J. Hematother Stem Cell Res. 2001. - V. 10. - P. 261 -271.

116. Hansson G.K., Holm J., Jonasson L. Detection of activated T lymphocytes in the human atherosclerotic plaque // Am. J. Pathol. 1989. - V. 135. - P. 169-175.

117. Hasdai D., Barak V., Leibovitz E. et al. Serum basic fibroblast growth factor levels in patients with ischemic heart disease // Int. J. Cardiol. 1997. - V. 59. - P. 133-138 .

118. Haust M.D. Early permeability changes in human atherosclerotic lesions // Prog. Biochem. Pharmacol. 1977. -V. 13. - P. 203-207.

119. Haust D., More R. Significace of the smooth muscle cell in atherogenesis // Evolution of the atherosclerotic Plaque. Chicago-London, 1963. P. 51-63.

120. Heimfeld S., Hudak S., Weissman I., Rennick D. The in vitro response of phenotypically defined mouse stem cells and myeloerythroid progenitors to single or multiple growth factors // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 9902-9906 .

121. Hentunen T.A., Cunningham N.S., Vuolteenaho O. et al. Osteoclast recruiting activity in bone matrix // Bone Miner. 1994. - V. 25. - P. 183-198.

122. Hinek A., Rosnowsky A. Comparison of morphology of isolated cells obtained from aortas * of normal and cholesterol fed rabbits // Arterial Wall. 1975. - V. 3. - P. 17-29.

123. Hirota S., Imakita M., Kohri K. et al. Expression of osteopontin messenger RNA by macrophages in atherosclerotic plaques. A possible association with calcification // Am. J. Pathol. 1993. - V. 143. - P. 1003-1008.

124. Honye J., Mahon D.J., White C.J. et al. Morphological effects of coronary balloon angioplasty in vivo assessed by intravascular ultrasound imaging // Circulation. 1992. -V. 85.-P. 1012-1025.

125. Huss R., Hong D.S., McSweeney P.A. et al. Differentiation of canine bone marrow cells with hemopoietic characteristics from an adherent stromal cell precursor // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92. - P. 748-752.

126. Ibbotson K.J., Roodman G.D., McManus L.M., Mundy G.R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenotors in cultures of feline marrow mononuclear cell // J. Cell Biol. 1984. - V. 99. - P. 471-480.

127. Ingber D.E., Folkman J. J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix // J. Cell Biol. 1989. - V. 109. - P. 317-330.

128. Inoue I., Inaba T., Motoyoshi K. et al. Macrophage colony stimulating factor prevents the progression of atherosclerosis in Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits // Atherosclerosis. 1992. - V. 93. - P. 245-254.

129. Jundt G., Berghauzer K-H., Termine J.D. et al. Osteonectin a differentiation marker of bone cells // Cell Tissue Res. - 1987. - V. 248. - P. 409-415.

130. Kamada M., Irahara M., Maegawa M. et al. Postmenopausal changes in serum cytokine levels and hormone replacement therapy // Am. J. Obstet. Gynecol. 2001. - V. 184. - P. 309-314.

131. Katinioti A.A., Tousoulis D., Economou E. et al. Basic fibroblast growth factor changes in response to coronary angioplasty in patients with stable angina // Int. J. Cardiol. 2002. -V. 84.-P. 195-199.

132. Katsuda S., Okada Y., Minamoto T. et al. Collagens in human atherosclerosis // Arterioscler. Thromb. 1992 - V. 12. - P. 494-502.

133. Keating A., Singer J.W., Killen P.D. et al. Donor origin of the in vitro haematopoietic microinvironment after marrow transplantation in man // Nature. 1982. - V. 298. - P. 280283.

134. Kim H.T., Kim I.S., Lim S.E. et al. Gene and cell replacement via neural stem cells // Yonsei Med. J. 2004. - V. 45. - P. 32-40.

135. Ko J.S., Bernard G.E. Osteoclast formation in vitro from bone marrow mononuclear cells in osteoclast-free bone // Am. J. Anat. 1981. - V. 161. - P. 415.

136. Kresina T.F., He Q., Degli Esposti S., Zern M.A. Gene expression of transforming growth factor beta 1 and extracellular matrix proteins in murine Schistosoma mansoni infection // Gastroenterology. 1994. - V. 107. - P. 773-780.

137. Krause D. et al. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell // Cell. 2001. - V. 105. - P. 369-377.

138. Krushinsky A.V., Nestaiko G.V. Morphology of smooth muscle cells from normal and atherosclerotic human aorta // Soc. Med .Rev. A Cardiol. -1987. V. 1. - P. 35-73.

139. Kurihara N., Suda T., Miura Y. et al. Generation of osteoclasts from isolated hematopoietic progenitor cells // Blood. -1989. V. 74. - P. 1295-1299.

140. Kuznetsov S.A., Mankani M.H., Gronthos S. et al. Circulating skeletal stem cells // J. Cell Biol.-2001.-V. 153.-P. 1133-1140.

141. Lane T.F., Sage E.H. The biology of SPARC, a protein that modulates cell-matrix interactions // FASEB J. 1994. - V. 8. - P. 163-73.

142. Laroche M., Moulinier L., Bon E., Cantagrel A., Mazieres B. Renal tubular disorders and arteriopathy of the lower limbs: risk factors for osteoporosis in men? // Osteoporos Int. -1994.-V. 4.-P. 309-313.

143. Leary T. Experimental atherosclerosis in the rabbit compared with human (coronary) atherosclerosis // Arch.Pathol. 1934. - V. 17. - P. 453-492.

144. Lee F., Yokota T., Otsuka T. et al. Isolation of cDNA for a human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by functional expression in mammalian cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. -V. 82. - P. 4360-4364.

145. Lee M.Y., Eyre D.R., Osborne W.R.A. Isolation of a murine osteoclast colony-stimulating factor // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 8500-8509.

146. Lee M.Y., Lottsfeldt J.L., Fevold K.L. Identification and characterization of osteoclast progenitors by clonal analysis of hematopoietic cells // Blood. 1992. - V. 80. - P. 17101712.

147. Lee O.K., Kuo T.K., Chen W.M. et al Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood // Blood. 2004. - V. 103. - P. 1669-1675.

148. Lercher P., Fahrleitner A., Dobnig H et al. Osteoprotegerin in patients with coronary artery diseas // Atherosclerosis suppl. 2001. - V. 2. - P. 223.

149. Li M., Yoshida H., Aramaki Y. et al. Improved enzyme immunoassay for human basic fibroblast growth factor using a new enhanced chemiluminescence system // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. - V. 193. - P. 540-545.

150. Libby P., Hansson G.K. Involvement of the immune system in human atherogenesis: current knowledge and unanswered questions // Lab. Invest. 1991. - V. 64. - P. 5-15.

151. Libby P., Egan D., Skarlatos S. Roles of infectious agents in atherosclerosis and restenosis: an assessment of the evidence and need for future research // Circulation. 1997. - V. 96. -P. 4095-4103.

152. Lin Y., Weisdorf D.J., Solovey A., Hebbel R.P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood // J. Clin. Invest. 2000. - V. 105. - P. 71-77.

153. Lindgren F.T., Jensen L.C., Wills R.D., Stevens G.R. Subfractionation of S f 4-10 5 , S f 420 and high density lipoproteins // Lipids. 1972. V. 7. - P. 194-201.

154. Lum H., Malik A.B. Regulation of vascular endothelial barrier function // Am. J. Physiol. 1994. - V. 267. - P. 223-241.

155. Luria E.A., Panasyuk A.F., Friedenstein A.Y. Fibroblast colony formation from monolayer cultures ofblood cells//Transfusion.-1971.-V. 11.-P. 345-349.

156. Makino S., Fukuda K., Miyoshi S. et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro // J. Clin. Invest. 1999. - V. 103. - P. 697-705.

157. Malaval-L., Modrowski-D., Gupta-A.K., Aubin-J.E. Cellular expression of bone-related proteins during in vitro osteogenesis in rat bone marrow stromal cell cultures // J. Cell Physiol. 1994. - V. 158. - P. 555-572.

158. Malinow M.R. Regression of atherosclerosis in humans: facts or myth // Circulation. -1981.-V. 64.-P. 1-3.

159. Marshall M.J., Nisbet N.W., Evans S. Donor origin of the in vitro hematopoietic microenvironment after marrow transplantation in mice // Experientia. 1984. - V. 40. - P. 589-595.

160. Martin G.M., Sprague C.A. Life histories of hyperplastoid cell lines from aorta and skin // Exp. Molec. Pathol. 1973. - V. 18. - P. 125-141.

161. Matayoshi A., Brown C., DiPersio J.F. et al. Human blood-mobilized hematopoietic precursors differentiate into osteoclasts in the absence of stromal cells // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1996. - V. 93. - P. 10785-10790.

162. Maxsimov A.A. Der lymphozyte als gemeinsame Stammzelle der verschiedenen Blutelemente in der embryonalen Entwicklung und in postfotalen Leben der Zeugertiere // Folia Haematol. 1909. - V. 8. - P. 125-134.

163. Maxsimov A.A. Relation of blood cells to connective tissues and endothelium // Physiol. Rev. 1924. - V. 4. - P. 533-539.

164. Maxsimov A.A. Cultures of blood leukocytes. From lymphocyte and monocyte to connective tissue // Arch. Exp. Zellforsch. 1928. - V. 5. - P. 169-178.

165. Melnick J.L., Hu C., Burek J. et al. Cytomegalovirus DNA in arterial walls of patients with atherosclerosis // J. Med. Virol. 1994. - V. 42. - P. 170-174.

166. Metcalf D., Moore M.A.S. Haemopoietic Cells. Frontiers of biology // Amsterdam-London: North Holland Publishing Co., 1971.

167. Metcalf D. Hemopoietic colonies // Springer-Verlag. Berlin., 1977.

168. Metcalf D. The hemopoietic growth factors // Elsevier, Amsterdam., 1984.

169. Metcalf D. The molecular biology and functions of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factors // Blood. 1986. - V. 67. - P. 257-67.

170. Miranville A., Heeschen C., Sengenes C. et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells // Circulation. 2004. - V. 110.-P. 349-355.

171. Miyamoto T., Sasaguri Y., Sasaguri T. et al. // Atherosclerosis. 1996. - V. 129. - P. 207-213.

172. Morstyn G., Burgess A.W. Hemopoietic growth factors: a review // Cancer Res. 1988. - V. 48. - P. 5624-5637.

173. Muguruma Y., Lee M.Y. Isolation and characterization of murine clonogenic osteoclast progenitors by cell surface phenotype analysis // Blood. 1998. - V. 91. - P. 1272-1279.

174. Nash R., Storb R., Torok-Storb B., Neiman P. Clonal hematopoiesis after bone marrow transplantation // N. Engl. J. Med. 1989. - V. 321. - P. 1758-1759.

175. Nathan C.F. Secretory products of macrophages // J. Clin. Invest. 1987. - V. 79. - P. 319326.

176. Newby A.C., Zaltsman A.B. Fibrous cap formation or destruction~the critical importance of vascular smooth muscle cell proliferation, migration and matrix formation // Cardiovasc. Res. 1999. - V. 41. - P. 345-360.

177. Nimer S.D., Champlin R.E., Golde D.W. Serum cholesterol-lowering activity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor // JAMA. 1988. - V. 260. - P. 32973300.

178. O'Brien E.R., Garvin M.R., Dev R. Angiogenesis in human coronary atherosclerotic plaques // Am. J. Pathol. 1994. - V. 145. - P. 883-894.

179. Orekhov A.N., Tertov V.V., Mukhin D.N. Desialylated low density lipoprotein—naturally occurring modified lipoprotein with atherogenic potency // Atherosclerosis. 1991. - V. 86.-P. 153-161.

180. Orekhov A.N., Tertov V.V., Sobenin I.A. et al. Sialic acid content of human low density • lipoproteins affects their interaction with cell receptors and intracellular lipid accumulation

181. J. Lipid Res. 1992. - V. 33. - P. 805-817.

182. Orlic D., Hill J.M., Arai A.E. Stem cells for myocardial regeneration // Circ. Res. 2002. -V. 91. - P. 1092-1102.

183. Orlic D. Adult bone marrow stem cells regenerate myocardium in ischemic heart disease // Ann. NY Acad. Sci. 2003. - V. 996. - P. 152-157.

184. Ouchi Y., Akishita M., de Souza A.C. et al. Age-related loss of bone mass and aortic/aortic valve calcification-réévaluation of recommended dietary allowance of calcium in the elderly // Ann. NY Acad. Sci. 1993. - V. 676. - P. 297-307.

185. Owen M. Lineage of osteogenic cells and their relationship to the stromal system // Peck W.A. (ed): Bone and Mineral Research (ed 3). Amsterdam, The Netherlands, Elsevier, 1985.-P. 1

186. Owen M., Friedenstein A.J. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors // Ciba Found Symp. 1988. - V. 136. - P. 42-60.

187. Palinski W., Rosenfeld M.E., Yla-Herttuala S. et al. Low density lipoprotein undergoes oxidative modification in vivo // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 13721376.

188. Pampou S.Yu., Gnedoy S.N., Bystrevskaya V.B. et al. Cytomegalovirus genome and the immediate-early antigen in cells of different layers of human aorta // Virchows Arch. -2000.-V. 436.-P. 539-552.

189. Parhami F., Jackson S.M., Tintut Y. et al. Atherogenic diet and minimally oxidized low density lipoprotein inhibit osteogenic and promote adipogenic differentiation of marrow stromal cells // J. Bone Miner. Res. 1999. - V. 14. - P. 2067-2078.

190. Parker F. An electron microscopic study of experimental atherosclerosis // Amer. J. Pathol. 1960. V. 36. - P. 19-53.

191. Patterson J., Moffatt T., Mills J. Hemosiderin deposition in early atherosclerotic plaques // Arch. Pathol. 1956. - V. 61. - P. 496-502.

192. Piersma A.H., Ploemacher R.E., Brockbank K.G.M. et al. Migration of fibroblastoid stromal cells in murine blood // Cell Tissue Kinet.- 1985. Vol. 18. - P. 589-595.

193. Pearson T.A., Dillman J.M., Heptinstall R.H. 1987. Clonal mapping of the human aorta. Relationship of monoclonal characteristics, lesion thickness, and age in normal intima and atherosclerotic lesions // Am. J. Pathol. 1987. - V. 126. - P. 33-39.

194. Planat-Benard V., Silvestre J.S., Cousin B. et al. Plasticity of human adipose lineage cells • toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives // Circulation. 2004.1. V. 109.-P. 656-663.

195. Presta M., Maier J.A., Rusnati M., Ragnotti G. Basic fibroblast growth factor is released from endothelial extracellular matrix in a biologically active form // J. Cell Physiol. 1989. - V. 140. - P. 68-74.

196. Prindull G., Ben-Ishay Z., Ebell W. et al. CFU-F circulating in cord blood // Blut. 1987. -V. 54.-P. 351-359.

197. Purton L.E., Lee M.Y., B. Torok-Storb. 1996. Normal human peripheral blood mononuclear cells mobilized with granulocyte colony-stimulating factor have increased

198. Rajavishisth T.B., Andalibi A., Territo M.C. et al. Induction of endothelial cell expression of granulocyte and macrophage colony-stimulating factors by modified low-density lipoproteins. //Nature. 1990. - V. 344. - P. 254-257.

199. Roach-H.I. Why does bone matrix contain non-collagenous proteins? The possible roles of osteocalcin, osteonectin, osteopontin and bone sialoprotein in bone mineralisation and resorption // Cell Biol. Int. 1994. - V. 18. - P. 617-628.

200. Robertson J. The influence of mechanical factors on the structure of the peripheral arteries and the localization of atherosclerosis // J. Clin. Pathol. 1960. - V. 13. - P. 199-204.

201. Rokitansky K. The organs of circulation //A manual of pathological anatomy.- Philadelphia, Blanchard & Lea. 1855. P. 201-208

202. Romberg R.W., Werness P.G., Lollar P. et al. Isolation and characterization of native adultosteonectin // J. Biol. Chem. 1985. - V. 260. - P. 2728-2736 .

203. Romanov Y.A., Balyasnikova I.V., Bystrevskaya V.B. et al. Endothelial heterogeneity and intimal blood-borne cells. Relation to human atherosclerosis // Ann. NY Acad. Sci. 1995. -V. 748.-P. 12-37.

204. Roodman G.D., Ibbotson K.J., MacDonald BR. Et al. 1.25-Dihidroxyvitamin D3 causes formation of multinucleated cells with several osteoclast characteristic in cultures of primate marrow // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. - V. 82. - P. 8213.

205. Rosenkranz S., Bohm M., Kazlauskas A. Pathophysiologic significance of growth factors and new therapeutic concepts in cardiovascular disease // Med. Klin. 1999. - V. 94. - P. 496-504.

206. Ross R., Glomset J.A. Atherosclerosis and the arterial smooth muscle cell: Proliferation of smooth muscle is a key event in the genesis of the lesions of atherosclerosis // Science.1973.-V. 180.-P. 1332-1339.

207. Ross R., Glomset J., Kariya B., Harker L. A platelet-dependent serum factor that stimulates the proliferation of arterial smooth muscle cells in vitro // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.1974.-V. 71.-P. 1207-1210.

208. Ross R., Glomset J. Studies of primate arterial smooth muscle cells in relation to atherosclerosis // Adv. Exp Med. Biol. 1974. - V. 43. - P. 265-79.

209. Ross R., Glomset J. A. The pathogenesis of atherosclerosis // N. Engl. J. Med. 1976. - V.- PP. 369-377; 420-425.

210. Ross R., Harker L. Hyperlipidemia and atherosclerosis // Science. 1976. - V. 193. - P. 1094-1100.

211. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis an apdate // N. Engl. J. Med. - 1986. - V. 314. P. 489-500.

212. Ross R. Platelet-derived growth factor // Ann. Rev Med. 1987. - V. 38. - P. 71-79.

213. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. 1993. -V. 362.-P. 801-808.

214. Ross R. Atherosclerosis- an inflammatory disease // N. Engl. J. Med. 1999. - V. 340. - P. 115-126.

215. Rougier F., Dupuis F., Denizot Y. Human bone marrow fibroblasts--an overview of their characterization, proliferation and inflammatory mediator production // Hematol. Cell Ther.- 1996.- V. 38.-P. 241-246.

216. Russel D.S. Taichman N., Marcelle J. et al. Human Osteoblasts Support Human

217. Hematopoietic Progenitor Cells in In Vitro Bone Marrow Cultures // Blood. 1996. - V. 87.-P. 518-524.

218. Safford K.M., Safford S.D., Gimble J.M. et al. Characterization of neuronal/glial differentiation of murine adipose-derived adult stromal cells // Exp. Neurol. 2004. - V. 187. - P. 319-328.

219. Sage H., Vernon R.B., Funk S.E. et al. SPARC, a secreted protein associated with cellular proliferation, inhibits cell spreading in vitro and exhibits Ca+2 -dependent binding to the extracellular matrix // J. Cell Biol. 1989. - V. 109. - P. 341-356.

220. Saotome K., Hoshino T., Harada T. Bone resorption under the influence of paratiroid in vitro // J. Jap. Orthop. Assoc. 1982. - V. 56. - P. 777-789.

221. Sasaki T., Maita E. Increased basic Fibroblast growth factor in the serum of patients with phenytoin-induced gingival overgrowth // J. Clin. Periodontal. 1998. - V. 25. - P. 42-47.

222. Sata M., Saiura A., Kunisato A. et al. Hematopoietic stem cells differentiate into vascular cells thet participate in the pathogenesis of atherogenesis // Nature medicine. 2002. - V. 8. - P. 403-409 .

223. Sato H., Oh Kudo M., Nagaoka T. Levels of serum colony-stimulating factors (CSFs) in patients on long-term haemodialysis // Cytikine. 1994. - V. 6. - P. 187-94.

224. Satoh T., Sasatomi E., Yamasaki F. et al. Multinucleated variant endothelial cells (MVECs) of human aorta: expression of tumor suppressor gene p53 and relation to atherosclerosis and aging // Endothelium. 1998. - V. 6. - P. 123-132.

225. Scheven B.A.A., Visser J.W.M., Nijweide P.J. In vitro osteoclast generation from different bone marrow fractions, including a high enriched haematopoietic stem cell population // Nature. 1996. - V. 321. - P. 79.

226. Schwartz S.M., O'Brien E.R.M. Absence of replication of vascular smooth muscle // Atherosclerosis X. Elsevier Science, 1995. - P. 704-720.

227. Sieff C.A. Hemopoietic growth factors // J. Clin. Invest. 1987. - V. 79. - P. 1549-1557.

228. Shanahan C.M., Cary N.R., Metcalfe J.C. et al. High ezpression of genes for calcification-regulating proteins in human atherosclerotic plaque // J. Clin. Invest. 1994. - V. 93. - P. 2393-2402.

229. Shi Q., Hong-De Wu M., Hayashida N. et al. Proof of fallout endothelization of impervious Dacron grafts in the aorta and inferior vena cava of the dog // J. Vase. Surg. 1994. - V. 20. -P. 546-557.

230. Shi Q., Rafii S., Hong-De Wu M. et al. Evidence for Circulating bone marrow-derived endothelial cells // Blood. 1998. - V. 92. - P. 362-367.

231. Shimamoto T., Moriya K., Kobayashi D.V. et al. Hyperreactive arterial endothelial cells in atherogenesis. Effect of smooth muscle relaxants // Adv. Exp. Med. Biol. 1977. - V. 82. -P. 234-236.

232. Shimano H., Yamada N., Motoyoshi K. et al. Plasma cholesterol-lowering activity of monocyte colony-stimulating factor (M-CSF) // Ann. NY Acad. Sci. 1990. - V. 587. - P. 362-370.

233. Sieff C.A., Niemeyer C.M., Faller D.V. Human colony-stimulating factors and stromal cell function // Soc. Gen. Physiol. Ser. 1988. - V. 43. - P. 47-55.

234. Simons M., Annex BH., Laham RJ. Et al. Pharmacological treatment of coronary artery disease with recombinant fibroblast growth factor-2: double-blind, randomized, controlled clinical trial // Circulation. 2002. - V. 105. - P. 788-793.

235. Simmons P.J., Torok-Storb B. Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody, STRO-1 // Blood. 1991a. - V. 78. - P. 55-62.

236. Simmons P.J, Torok-Storb B. CD34 expression by stromal precursors in human adult bone marrow // Blood. 1991b. - V. 78. - P. 2848 .

237. Sinapius D. Zur genese atherosclerotischer fruhveranderungen der aorta // Virchow's Arch. -1950.-V. 318.-P. 316-351.

238. Soboleva E.L., Saburova O.S., Rozhkova T.A. et al. // Angiology and vascular surgery. -1999.-V. 5.-P. 190-203.

239. Soboleva E.L., Popkova V.M., Saburova O.S. et al. Colony-forming units and atherosclerosis // Atherosclerosis X., Elsevier Science, 1994. P. 919-925.

240. Soboleva E.L., Smirnov V.N. Local hemo- and stromopoiesis in human vascular wall // Lectures XHIth meeting of the international society of hematology, 1995. P. 134-139.

241. Spaet T.H., Stemerman M.B., Veith F.J., Lejnieks I. Intimal injury and regrowth in the rabbit aorta; medial smooth muscle cells as a source of neointima // Circ. Res. 1975. - V. 36.-P. 58-70.

242. Srour E.F., Brandt J.E., Leemhuis T. et al. Relationship between cytokine-dependent cell cycle progression and MHC class II antigen expression by human CD34+ HLA-DR- bone marrow cells // J. Immunol. 1992. - V. 148. - P. 815-820.

243. Stary H.C., McMillan G.C. Kinetics of cellular proliferation in experimental atherosclerosis. Radioautography with drain counts in cholesterol-fed rabbits // Arch. Pathol. 1970. -V. 89. - P. 173-183.

244. Stary H.C. Proliferation of arterial cells in atherosclerosis // Adv. Exp. Med. Biol. 1974. -V. 43.-P. 59-81.

245. Stary H.C. The sequence of cell and matrix changes in atherosclerotic lesions of coronary arteries in the first forty years of life // European Heart Journal. 1990. - V. 11(E). - P. 319.

246. Stefenelli T., Mayer H., Bergler-Klein J. et al. Primary hyperparathyroidism: incidence of cardiac abnormalities and partial reversibility after succsessful parathyroidectomy // Am. J. Med. 1993. - V. 95. - P. 197-202

247. Steinberg D. Lipoproteins and pathogenesis of atherosclerosis // Circulation. 1987. - V. 76.-P. 508-514.

248. Steinberg D., Witztum J.L. Lipoproteins and atherogenesis. Current concepts // JAMA. -1990. V. 264. - P. 3047-3052.

249. Stenner D.D., Tracy R.P., Riggs B.L., Mann K.G. Human platelets contain and secrete osteonectin, a major protein of mineralized bone // Proc. Nat. Acad. Sci USA. 1986. - V. 83.-P. 6892-6896.

250. Strauer B.E., Brehm M., Zeus Tobias et al. Repair of Infarcted Myocardium by Autologous Intracoronary Mononuclear Bone Marrow Cell Transplantation in Humans // Circulation. -2002.-V. 106.-P. 1913-1918.

251. Struzyna J., Pojda Z., Braun B. et al. Serum Cytokine levels (IL-4, IL-6, IL-8, G-CSF, GM

252. CSF) in burned patients // Burns. 1995. - V. 21. - P. 437-440.

253. Suda T., Takahashi N., Martin T.J. Modulation of osteoclast differentiation // Endocr. Rev. 1992. -V. 13.-P. 66.

254. Suda T., Takahashi N., Abe E. Role of vitamin D in bone resorption // J. Cell Biochem. -1992.-V. 49.-P. 53.

255. Sugiyama S., Okada Y., Sukhova G,K. et al. Macrophhage myeloperoxidase regulation by granulocyte macrophage colony-stimulating factor in human atherosclerosis and implications in acute coronary syndromes // Am. J. Pathol. 2001. - V. 158. - P. 879-891.

256. Takahashi N., Akatsu T., Udagawa N. et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation // Endocrinology. 1998. - V. 123. - P. 2600.

257. Takahashi M., Nagaretani H., Funahashi T. et al. The expression of SPARC in adipose tissue and its increased plasma concentration in patients with coronary artery disease // Obes. Res. 2001. - V. 9. - P. 388-393.

258. Tertov V.V., Sobenin I.A., Gabbasov Z.A. ey al. Multiple-modified desialylated low density lipoproteins that cause intracellular lipid accumulation. Isolation, fractionation and characterization // Lab. Invest. 1992. - V. 67. - P. 665-675.

259. Testa N.G., Lord B.J., Shore N.A. The in vivo seeding of hemopoietic CFU's in irradiated mice // Blood. 1972. - V. 40. - P. 654-661.

260. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. - V. 282. - P. 1145-1147.

261. Tian W.D., Jiang H.B., Liu L. et al. In vitro culture and biological characteristics of cranial neural crest stem cell // Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 2004. - V. 22. - P. 229-231.

262. Till J.E, McCulloch E.A. A direct measurement of the radiation sensitivity of mouse bone marrow cells // Radiat. Res. 1961. - V. 14. - P. 213-222.

263. Tintut Y., Parhami F., Bostrom et al. cAMP stimulates osteoblast-like differentiation ofcalcifying vascular cells // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 7547-7553.

264. Tintut Y., Alfonso Z., Saini T. et al. Multilineage potential of cells from the artery wall // Circulation. 2003. - V. 108. - P. 2505-2510.

265. Thoma R. Uber die genese und die lokalisation der arteriosclerose // Virchow's Arch. Pathol. Anat. und Phys. 1923. - V. 245. - P. 78-122.

266. Thomas W.A., Janakidevi K., Florentin R.A., Reiner J.M. The reversibility of human atherosclerotic plaque // International Symposium: State of prevention and therapy in human arteriosclerosis and in animal models. Munster, Westfalen, 1977. - P. 73-80.

267. Thomas W.A., Reiner J.M., Janakidevi K., Florentin R.A. Possible causes other than monoclonism for G-6-PD monotypism in atherosclerotic lesions of black women // Circulation. 1979. - V. 59 ( Suppl.II). - P. 11-166.

268. Thyberg J., Nilsson J., Palmberg L., Sjolund M. Adult human arterial smooth muscle cells in primary culture. Modulation from contractile to synthetic phenotype // Cell Tissue Res. -1985.-V. 239.-P. 69-74.

269. To L.B., Haylock D.N., Simmons P.J., Juttner C.A.The biology and clinical uses of blood stem cells // Blood. 1997. - V. 89. - P. 2233-2258.

270. Tokunaga O., Fan J.L., Watanabe T. Atherosclerosis and age-related multinucleated variant endothelial cells in primary culture from human aorta // Am. J. Pathol. - 1989. - V. 135.-P. 967-976.

271. Tomita M., Yamada H., Adachi Y., Cui Y., Yamada E., Higuchi A., Minamino K., Suzuki Y., Matsumura M., Ikehara S. Choroidal neovascularization is provided by bone marrow cells // Stem Cells. 2004. - V. 22. - P. 21-26.

272. Tseug S.C.G., Savion N., Stern R., Gospodarowicz D. Fibroblast growth factor modulates synthesis of collagen in cultured vascular endothelial cells // Europ. J. Biochem. 1982. -V. 122.-P. 355-360.

273. Vasa M., Fichtlscherer S., Adler K. et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease // Circulation. 2001. - V. 103.-P. 2885-2890.

274. Verhoef G.E., De Schouwer P., Ceuppens J.L. et al. Measurement of serum cytokine levels in patients with myelodysplastic syndromes // Leukemia. 1992. -V. 6. - P. 1268-1272.

275. Virchow R. Cellular pathology // John Churchill, London, 1858.

276. Virchow R. Cellular pathology: as based upon physiological and pathological histology // New York, Dover Publications, 1863. P. 404-408.

277. Wahl S.M., Wong H., McCartney-Francis N. Role of growth factors in inflammation and repair // J. Cell Biochem. 1989. - V. 40. - P. 193-199.

278. Walder S., Ferretti P. Distinct neural precursors in the developing human spinal cord // Int. J. Dev. Biol. 2004. - V. 48. - P. 671-674.

279. Walker D.G. Osteopetrosis cured by temporary parabioses // Science. 1973. - V. 180. -P. 875.

280. Walker D.G. Control of bone resorption by hematopoietic tissue: The induction and reversal of congenital osteopetrosis in mice through use of bone marrow and splenic transplants // J. Exp. Med. 1975. - V. 142. - P. 651.

281. Wang J., Wang S., Lu Y., Gown A.M. GM-CSF and M-CSF expression is associated with macrophage proliferation in progressing and regressing rabbit atheromatous lesions // Exp. Mol. Pathol. 1994. - V. 61. - P. 109-118.

282. Watson K.E., Bostrom K., Ravindranath R. et al. TGF-pi and 25-hydroxycholesterol stimulate osteoblast-like vascular cells to calcify // J. Clin. Invest. 1994. - V. 93. - P. 2106-2113.

283. Weihrauch D., Zimmermann R., Arras M., Schaper J. Expression of extracellular matrix proteins and the role of fibroblasts and macrophages in repair processes in ischemic porcine myocardium // Cell Mol. Biol. Res. 1994. - V. 40. - P. 105-116.

284. Weiss H.J. Platelet physiology and abnormalities of platelet function // N. Engl. J. Med. -1975. V. 293. - P. 531-541, 580-588.

285. Weiss L. The hematopoietic microenvironment of the bone marrow: An ultrastructure of the stroma in rats // Anat. Rec. 1976. - V. 186. - P. 161.

286. Wick G., Schett G., Amberger A. et al. Is atherosclerosis an immunologically mediated disease? // Immunology Today. 1995. - V. 16. - P. 27-33.

287. Wissler R.W., Moskowitz M., Hunghes R., Petrie L. A study of the gistogenesis of atherosclerosis in man // Circulation. 1958. - V. 18. - P. 497-503.

288. Wissler R.W. The arterial medial cell, smooth muscle or multifunctional mesenchyme // J. Atheroscler. Res. 1968. - V. 8. - P. 201-213.

289. Wong G.G., Witek J.S., Temple P.A. et al. Human GM-CSF: molecular cloning of the complementary DNA and purification of the natural and recombinant proteins // Science. -1985.-V. 228.-P. 810-815.

290. Wright H.P. Mitosis patterns in aortic endothelium // Atherosclerosis. 1972. - V. 15. - P. 93-100.

291. Zimering M.B., Brandi M.L., deGrande D.A. et al. Circulating fibroblast growth factor-like substance in familial multiple endocrine neoplasia type I // J. Clin. Endocrinol. Metab. -1990.-V. 70.-P. 149-154.

Информация о работе

Сабурова, Ольга Стояновна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.25

Диссертация

Циркулирующие колониеобразующие клетки и факторы, влияющие на их участие в атерогенезе человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы