Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспозон hemarl: организация в геноме и роль в формировании генетического разнообразия партенит и перкарий трематод Himasthla elongata (Trematoda, Echinostomatidae)

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Транспозон hemarl: организация в геноме и роль в формировании генетического разнообразия партенит и перкарий трематод Himasthla elongata (Trematoda, Echinostomatidae)"

На правах рукописи

Галактионов Николай Кириллович

Транспозон ИетагП организация в геноме и роль в формировании генетического разнообразия партенит и перкарин трематод

Н'шнШЫа еШщШа (Тгста^а, ЕсЫпоэинпаМае).

03.01.03 — Молекулярная биология

2 3 СЕН 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2015

005562570

005562570

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук

Научный руководитель:

Подгорная Ольга Игоревпа

Доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник, зав. группой некодирующей ДНК ФГБУН Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург

Цымбаленко Надежда Васильевна

доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник отдела молекулярной генетики ФГБУН Институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург

Крамеров Дмитрий Александрович

доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией эволюции геномов эукариот ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, г. Москва

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

ФГБУН «Институт молекулярной и клеточной биологии» СО РАН, г. Новосибирск

Защита диссертации состоится «19» нюня 2015 г. в 14 часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, д.4.

e-mail: ceUbio@mail.cvtspb.rssi.ru

Сайт: http//www.cvtsr>b.rssi.ru

Факс: 8 (812) 2973541

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН и на сайте института httn:/Avww.cvtspb.rssi.ru/

Автореферат разослан « ^ta » ° ° 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совет; кандидат биологических наук

Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование организации генома стало одной из центральных задач современной Молекулярной биологин. Значительную часть генома составляют повторяющиеся последовательности ДНК, которые разделяют на диспергированные и таидемпые. Диспергированные повторы (или мобильные элементы

— МЭ) представлены двумя классами элементов, Класс I — ДНК-транспозоны и Класс 1Г

— ретроэлемепты. Ретроэлементы размножаются в геноме с помощью механизма обратной транскрипции посредством РНК-интермедиата; транспозоны же. размножаясь реплекативно, перемещаются в геноме с помощью механизма вырезания — встраивания (Ivics et al., 2004). Внутри обоих типов МЭ выделяют автономные элементы; их открытые рамки считывания (open reading frame, ORF) включают в себя последовательности фермента, осуществляющего транспозицию: транспозазу у ДНК-транспозонов и обратную транскриптазу у ретроэлементов. Последовательности неавтономных МЭ не несут каталитического мотива, способны к репликативному перемещению и рекрутируются автономным МЭ.

В геномах эукариот МЭ составляют от 1 до 50% (Feschotte, Pritham, 2007), однако долгое время их (вместе с тандемнымн повторами) относили к «мусорной» ДИК («junk» DNA). Предположение об участии МЭ в геномных перестройках впервые высказала Барбара МакКлинток, выявив неменделевское соотношение частот генотипов семян кукурузы. Лишь много позже описана система транспозонов Ac\Ds, чье перемещение и взаимодействие индуцирует полиморфизм окраски семян кукурузы (Jones, 2005).

Секвенирование геномов эукариот позволило установить последовательности многих новых МЭ и стало мощным толчком для понимания их организации в геноме. Так. ретропозоны LINE, чьи последовательности составляют ~ 20% генома Н. sapiens, играют решающую роль в инактивации 2-й X хромосомы (Lyon, 1995). Примеры активности ретроэлементов предсказаны и (или) экспериментально установлены у представителей различных групп эукариот (Huang et al., 2012).

ДНК транспозоны долгое время оставались вне поля зрения функциональной геномики. Связано это с пх меньшим, относительно ретроэлементов, количеством в геноме (-0,05—10%) и с тем, что большинство ДНК транспозонов не способны к перемещению. Обнаружено лишь нескольких активных копий ДНК транспозонов в геномах эукариот, но это не означает, что они никогда не были активны. Свидетельства перемещения ДНК транспозонов в ходе эволюции можно проследить по их «следам» (участкам фланкирующих транспозазу последовательностей) в геномах. Сайтами узнавания у большинства ДНК транспозонов служит динуклеотид ТА, что позволяет им распознавать матричную ДНК и перемещаться практически в любой участок хроматина. Встраивание МЭ может модифицировать экспрессию близлежащих генов, что служит фактором нестабильности генома. Перемещение МЭ имеет и эпигенетические последствия: так ITR (inverted terminal repeats) транспозонов служат сайтами узнавания

для малых РНК, участвующих в нанесении на хроматин меток эпигенетической модификации. Множество копий МЭ в геноме создает большее количество сайтов посадки для малых РНК. Можно предполагать, что следствием перемещения (автономного или рекомбинативного) МЭ в геноме станет модификация экспрессии близлежащих генов и перераспределение эпигенетических меток.

МЭ могут служить факторами, приводящими к возникновению геномного разнообразия, не сцепленного с половым процессом. При этом кажется, что роль именно ДНК транспозонов в этом процессе может быть определяющей. В пользу этого предположения говорит то, что геномы представителей подкласса Bdelloidea (Rotifera), размножающиеся партеногенетически, демонстрируют высокое разнообразие ДНК транспозонов при полном отсутствии ретроэлементов. Среди ДНК-транспозонов, только траиспозон mariner содержится в геномах всех изученных видов партеногенетических коловраток (Arkhipova, Meselson, 2000).

Траиспозон mariner, входящий в состав суперсемейства ДНК транспозонов Tcl/mariner/IS630, находят у представителей всех групп эукариот. Последовательности mariner разделяют на 11 подсемейств, представители которых названы MLE (mariner-like elements). Размеры MLE могут варьировать от 0.9 до 2.5 т.п.н. Траиспозон включает в себя открытую рамку считывания, кодирующую транспозазу и ограниченную 5'- и 3'-нетранслируемыми последовательностями (UTR — untranslated region), несущими по концам ITR, фланкированные прямыми повторами, представленные динуклеотидом ТА. Количество копий mariner в геномах варьирует от десятков до сотен тысяч, занимая 0,003—9% генома (Robertson, Lampe, 1995b). Благодаря гомологии многих копий mariner становится возможна как мейотическая, так и митотическая рекомбинация между копиями элемента.

Подавляющее большинство MLE утратили транспозиционную активность вследствие накопления мутаций. Однако выявлены и активные копии, которые могут выступать активными мутаторами (Medhora et at., 1991; Munoz-Lopez et al., 2008).

Последовательности MLE заселяют, за редкими исключениями, геномы всех эукариот. Некоторые MLE, принадлежащие к геномам филогенетически удаленных животных, имеют высокую (>97%) степень сходства. Это стало основанием для выдвижения гипотезы о горизонтальном переносе транспозонов mariner (Yoshiyama et al., 1995). Возможность для горизонтального переноса повышается, когда организмы донора и реципиента находятся в непосредственном контакте друг с другом, как в случае паразитизма (Yoshiyama et al., 2001).

Для того, чтобы изучить вклад транспозонов семейства mariner в формирование вариабельности генома, а также возможность его горизонтального переноса между геномами эукариот необходима модельная система паразит-хозяин, в которой паразит размножается бесполым или партеногенетическим путем и

несет в геноме траиспозон mariner.

метаперклрпя марита

¿ЯГЧ /

Рис 1. Жтненнмй цикл трематоды Himasthïa elongata (по Werding, 1969 с изменениями).

яйцо

A: Lams argentatus; Б: Littorina lillorea; В: Mytilus ediilis

Таким объектом стал паразитический плоский червь Himasthla elongata (Trematoda, Echinostomatidae), в сложном жизненном цикле которого имеет место чередование гермафродитного (мариты в окончательном хозяине — серебристой чайке Larus argentatus) и партеногенетических (партениты — материнская спороциста и редии в первом промежуточном хозяине — моллюсках Littorina spp.) поколений. Производимые редиями расселительные личинки (церкарии) инфицируют второго промежуточного хозяина (мидий Mytilus ediilis), где превращаются в следующую личинку (метацеркарию), инвазионную для чаек. В кишечнике чайки метацеркария развивается в половозрелую мариту, откладывающую яйца, которые выводятся во внешнюю среду. При попадании в воду из яиц выходит личинка (мирацидий), внедряющаяся в литорин. В моллюске мирацидий претерпевает метаморфоз и превращается в материнскую спороцисту, которая производит редий. Редии первое время отрождают себе подобных, что ведет к увеличению численности их группировки в моллюске-хозяине. Затем редии приступают к продукции церкарий. И материнская спороциста, и все поколения редий размножаются исключительно путем апомиктического партеногенеза. Таким образом, при заражении моллюска одним мирацидием все редии и продуцируемые ими церкарии должны обладать одним генотипом (генотип мирацидия-материнской спороцисты) и представляют собой клон. Установлено, что церкарии разных клонов и. в меньшей степени, разные особи внутри одного клона различаются характером поведенческих реакций и инвазионной способностью (Прокофьев и др., 2011 ; Levakin et al., 2013). Генетический источник такого разнообразия неизвестен.

Для выявления внутривидового генетического разнообразия разработан ряд подходов, основанных на фрагментном анализе геномной ДНК. Одним из перспективных подходов стал метод AFLP (amplified fragment length jDolymorphism), успешно используемый для анализа генетического разнообразия гибридов высших растений (Vas et al.. 1995). Для анализа распределения транспозонов, применяют набор подходов, основанных на методе T1D (transposon insertion display). В настоящей работе применили сочетание AFLP и TID. Нам казалось, что это позволит не только выявить генетическое разнообразие животных размножающихся бесполо или партеногенетически, но и

проверить участие мобильных элементов ДНК в процессе формирования нестабильности генома.

Сочетание AFLP и TID позволит не только выявить генетическое разнообразие животных размножающихся бесполо или партеногенетически, но и проверить участие мобильных элементов ДНК в процессе формирования нестабильности генома.

Цели и задачи исследования. Цель настоящего исследования заключалась в определении последовательности транспозона mariner в геноме Himasthla elongata (Trematoda; Echinostomatidae) и определении его роли в формировании генетической вариабельности партеиогенстнческого потомства (редий и церкарий). Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Выявить и охарактеризовать транспозон mariner в геноме Н. elongata",

2. Установить наличие или отсутствие генетической природы вариабельности клонов партенит и церкарий Н. elongata методом AFLP;

3. Проверить возможность использования элемента mariner как маркера генетической изменчивости (в случае ее обнаружения) клонов редий и церкарий исследуемого вида трематод;

4. Оценить роль транспозона mariner в формировании нестабильности генома клонов редий и церкарий Н. elongata.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В геноме Н. elongata впервые выявлен и изучен транспозон hemarl, принадлежащий к классу ДНК транспозонов mariner, подклассу capitata. Hemarl насчитывает приблизительно сто копий, дисперсно распределенных в геноме. Последовательности двух копий hemarl — Hem2 и НетЗ, определены.

2. Геномы окончательного и промежуточных хозяев Н. elongata не содержат сходных с hemarl последовательностей mariner.

3. Метод AFLP позволил выявить генетическую природу клоналыюй изменчивости партенит и церкарий Н. elongata. Так среди церкарий, изолированных из одного клона, наблюдается полиморфизм зон разделения продуктов AFLP.

4. Использование праймера, специфического hemarl для постановки реакции TID, позволяет различать полиморфизм генотипов партенит и церкарий внутри одного клона. Повышенная гетерогенность зон амплификатов по сравнению с AFLP дает основание предположить, что транспозон hemarl вносит вклад в формирование генетической основы клоналыюй изменчивости партенит и церкарий Н. elongata.

Научная повизна работы.

1. Впервые клонирован полноразмерный транспозон mariner трематоды Н. elongata и выполнен его комплексный анализ, включающий характеристику распределения в геноме, определение сходных последовательностей в геномах хозяев, компьютерное сравнение со сходными последовательностями из баз данных.

2. Впервые определены концевые последовательности представителя подсемейства capitata семейства транспозонов mariner.

3. Впервые двумя методами (AFLP и T1D) установлена клональная генетическая изменчивость партенит Н. elongata

Теоретическое и практическое значение работы.

Многие виды трематод служат причиной тяжелых заболеваний человека и животных. Вызываемый представителями рода Schistosoma шистосоматоз классифицируется как одно из наиболее серьезных паразитарных заболеваний, от которого в мире страдает более 200 миллионов человек (Day, Botros, 2001). Использование ДНК-маркеров позволило установить существование индивидуальной изменчивости клонов партенит шистосом и ряда других видов трематод. Генетическая вариабельность паразитов увеличивает шанс на успешную инвазию хозяина и затрудняет разработку медикаментозных препаратов (William et al., 2006) против патогенных видов трематод, что делает определение механизма их генетической изменчивости весьма актуальным. В настоящей работе клонированный MLE послужил основой для выявления клоналыюй изменчивости. Дальнейшее определение конкретных последовательностей ДНК, служащих полиморфными маркерами, и определение роли МЭ в формировании клоналыюй изменчивости при партеногенезе может стать основой для разработки новых методов лечения паразитарных заболеваний.

Материалы диссертации используются в курсах лекций для бакалавров и магистров Биологического факультета Санкт-Петербургского государственного университета и могут быть использованы в общих и специальных курсах лекций биологических факультетов других университетов.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 5 статей в российских и международных рецензируемых журналах. Основные положения представлены и обсуждены на VII, VIII, IX, X, XI и XII Научных сессиях Морской биологической станции Санкт-Петербургского государственного университета (2006— 2011); IV Всероссийском съезде Паразитологического общества при РАН «Паразитология в XXI веке — проблемы, методы, решения» (2008); Международной конференции Морской биологической станции Зоологического института РАН (2007); па II Съезде Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию ИНЦ РАН (2007); Международном молодежном научном форуме "Ломоносов" (2008); XII и

XVI международных Путинских школах-конференциях молодых ученых «Биология — наука XXI века» (2008, 2012); Третьем Симпозиуме Скандинавского Балтийского Паразитологического общества (2009); X Европейском мультиколлоквиуме по паразитологии (2008); II конференции Американского общества микробиологов «Мобильная ДНК» (2010).

Вклад автора.

Результаты, включенные в работу, получены лично автором. Материалы, вошедшие в диссертацию, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 140 публикаций. Работа изложена на 104 страницах и иллюстрирована 20 рисунками и 5 таблицами.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты №05-04-49156-а, №05-04-49828-а, №11-04-01700-а), Президиума РАН (грант "Молекулярная и клеточная биология").

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор материала и выделение ДНК. Сбор и первичную обработку материала проводили на Беломорской биологической станции ЗИН РАН «Картсш» в июле—августе 2007—2011 гг. Литорины собраны на литорали и верхней сублиторали, мидии сняты с субстратов марикультуры, птенцы чайки пойманы на близлежащих островах. Источником церкарий и редий Н. elongata служили литорины Litíorina littorea (Gastropoda). Зараженных II. elongata моллюсков определяли по эмиссии церкарий. Для этого собранных литорин индивидуально помещали в 100 мл прозрачные сосуды с морской водой и экспонировали на свету при 15—20 °С в течении 1 ч. Неинфицированных моллюсков использовали как источник ДНК, инфицированных помещали в садки. Для выделения больших количеств ДНК И. elongata брали пул церкарий. Для выделения ДНК из отдельных особей церкарий — потомков одной редии, редий извлекали из Млюска и помещали в среду L15 (Leibovitz, Sigma). Церкарий извлекали непосредственно из редий, после чего выделяли ДНК. ДНК окончательного и промежуточных хозяев выделяли методом фенол-хлороформной экстракции (Sambrook et al., 1986). ДНК Н. elongata выделяли используя буфер, содержащий 2% СТАВ (Worden Lab Protocol).

Полнмеразнан Ценная Реакция (ПЦР). Для амплификации консервативной

последовательности транспозона mariner использовали вырожденные праймеры Mar-124F,

Mar-276R (см. таблицу).

Таблица. Мраймсры и адаптеры.

Амплификация копий hemarI в геноме Marl24F. Mai'276R;

инвертированная ПЦР и частично неспецифическая ПЦР — HmOuR и HmOuF. Селективные нуклеотиды последовательности сайтов узнавания Eco RI, Мус! и HindIii выделены жирным шрифтом.

20 мкл реакционной

смеси содержали IX буфер для Taq-полимеразы, 1.5 мМ MgC12, 1.6 мМ смеси dNTP, по 5 пМ/мкл каждого из праймеров, 200 нг геномной ДНК и 1 Ед Taq-полимеразы (Силекс. Москва). 30 циклов реакции включали: 95°С(Г) —> 55 °С (I ') —► 72 °С ( 1 '). Отрицательным контролем служила реакционная смесь без добавления матрицы. Фланкирующую Ileml 5'-последовательность выявляли частично неспецифической ПЦР (Karlyshev et al., 2000) используя обратный праймер HmOuR, сайт узнавания которого лежит на 30 п.н. ниже Marl24F. 25 циклов реакции включали: 95 °С (Г) —»■ 57 °С (20") —» 72 °С (40"). З'-последовательность, фланкирующая Heml с 3'-конца. выявлена методом обратной ПЦР. Для этого 0,5 мкг геномной ДНК обработали 5 Ед £coRI. Легированные «на себя» рестрикты стали матрицей для ПЦР с праймерами HmOuF/ HmOuR. 25 циклов реакции включали: 95 °С (30") -» 58 °С (20") ->• 72 °С (40"). Как обратная, так и частично неспецифическая ПЦР выявила несколько зон при разделении в 1%-ном агарозном геле. Зоны, Молекулярная масса которых соответствовала 1000 п.н. вырезаны из геля, клонированы и секвенированы.

AFLP и TID. Реакции AFLP и TID сходны и различаются тем, что при TID сайтом связывания селективного праймера служит последовательность транспозона. AFLP провели в соответствии с протоколом (Vos et al., 1995) (Рис. 2, панель А). Для проведения реакции TID (Рис. 2, панель А) 50 нг геномной ДНК И. elongata обрабатывали рестриктазой HincflU (5 Ед), образующей «липкие концы».

Название 1 Источник Последовательность 5* —• 3' Длина. назначение

Алаптерные последовательности

Ad£çoRl Vas et al 1995 S'-CTCGTAGACTGCGTACC CAT CTGACGCAT ЗОТТАА 5' AFLP

AdAfcçJ S'-GACGATGAGTCCTGAG 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 TACTCAGGACTCAT-5 '

Hmtilïï Собственная ратрапотка -AGCTCTCAGGACTCAT 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 GAGTCCTGAGTAGCAG-3' TiD

Праймеры

Nbrl2JF Robertson. 1003 TPfi^TN .-rNOAYGAPYT 1" Heml

Mar.'76R GGNGCNARRTCNGGNSWRTA

HmOuR Собсхвенная разработка OAATGGAAGC^fîOAAAT ~СТ'Г 2? 5". 3" ITR H ITR

HmOul- CTGTCAAGATGGCACTCCAAGAGCT -1

ргЕсоР.Нс Vas et al. 1995 ПАСТЛГПТАССААТТСс 1- AFLP

prEcoRI-^cag GAÇTG.-GTA "СААТТСеад 10

pi.Wjrl-c GATGAGTCCTGAGTAAo 1?

piAbel ' csg GATCACTCCTCACTAAcag 19

Hind-c Собственная разработка OACCATGAGTCCTCAGACCTTc 21 TID

Hind-cag CACCATGAÇTÇCTGAGAGCTTcag 21

^^^^ Р1М1/1И

оораооткл ДНК рестриктазой HmAtt

.Шш

Амплификация продуктов реакции лреамппификвции муклеотида. pc£coR1 помечем Y32PdATP

О

О

* -плификаци «райи I fine

lO

>дулов pti J ми Hiiidlli

ж

Рис. 2. Проведение реакций AFLP (А) н TID (Б)

Отожженные на себя адаптеры лигировали к рестриктам в течение ночи при + 16° С. Для обеспечения транспозон-снецифической реакции в первом раунде TID рестрикты амплифицировали нраймерами к адаптерной последовательности Ilind+c (5 пМ/мкл) и последовательности Лет] Mar276R (10 нМ/мкл) (см. таблицу). Ведение селективного цитозина обеспечило редукцию сигнала неспецифической амплификации. 24 цикла реакции включали: 95° С (30") -» 57° С (30") -> 72° С (30"). Селективная амплификация, матрицей для которой служил разведенный 1:10 в стерильной деионизованной воде продукт первой реакции, содержала: 5 пМ адаптер-специфичного праймера Hind+cag меченного у32Р dATP и 5 пМ праймера Mar276R. 35 циклов реакции в режиме «touch-down» включали: 95° С (30 ") —> 57° С (30 ") —» 72° С (30 "). Температура посадки праймеров (Та) в первом цикле составила 65 °С и снижена до 57 °С в течение 12 циклов с шагом 0,7 °С.

Клонирование и секвенирование. Последовательности клонированы в плазмидные векторы, pTZ57R и pTZ57R/T (Fermentas). В случае pTZ57R/T клонировали по «липким концам», в случае pTZ57R клонировали по «тупым концам». Лигирование в вектор и трансформацию проводили в соответствии с рекомендацией производителя (Fermentas). Плазмиды выделяли методом щелочного лизиса и дополнительно очищали в равновесном градиенте плотности CsCl (Sambrook et al; 1989). Вставки секвенированы в фирме Силекс (Москва). Плазмида, несущая консервативный участок транспозазы mariner названа pHem 1, а сама последовательность (вставка) — Heml.

Гибридизации но Саузерну, дот-блот гибридизация. Для гибридизации по Саузерну геномную ДНК Н. elongata обрабатывали одной из рестриктаз — HindlU, ЕсоК\. ВатУП, Msp\ (Сибэнзим) и фракционировали методом электрофореза в 1% агарозном геле. Перенос по Саузерну проводили но стандартному протоколу (Sambrook et al; 1989).

Гибридизацию проводили по стандартному протоколу (Wahl, 1979). Для блокирования мест иеспецифичного связывания мембрану инкубировали в предгибридизациопном буфере 2 ч при 65° С.

К раствору добавляли денатурированный в 50% формамиде меченый ДНК-зонд до конечной концентрации 100 нг/мкл и вели гибридизацию 12 ч при 64° С. Нсспецифичным конкурентом выступала разрушенная ультразвуком до средней длины 500 п.п. геномная ДНК Е. coli. Отмывку мембраны проводили в соответствии с рекомендациями Sambrook et al. (1989).

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Препараты ядер H. elongata получали из эмбрионов неркарий, препаративно выделенных из редин. Далее их фиксировали в модифицированном растворе Карнуа (метанол : ледяная уксусная в соотношении 3:1) и наносили на стекло. Препараты инкубировали 15 мин в буфере PBS, содержащем 0.05% Triton Х-100, и после серии отмывок обезвоживали и высушивали на воздухе. Для гибридизации in situ, вставка pHemCl, с помощью ПЦР, была помечена Су5-dUTP. Гибридизацию проводили по стандартному протоколу Rouche™ (Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual), ядра и хромосомы контрастировали DAPI и анализировали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа DMI3000B Leica Microsystems GmbH в ЦКП «Хромас». Для компьютерной обработки изображений использовали пакет программ Adobe Photoshop'" CS 5.

Эле1сгрофорсз. Амплификаты TID и AFLP разделяли в 5% секвеиирующем ПААГ (bis- АА - 19:1; 0,5х TBE; 6 M мочевина). Пробы денатурировали в буфере «SeqStop», содержащем 98% формамид, 10 мМ ЭДТА, бром-феноловый синий, ксиленцианол. Агарозный ЭФ проводили в геле с различным процентным содержанием агарозы (от 0.8— 1.5%) в зависимости от конкретной задачи. Высушенный гель экспонировали в радиоавтографической кассете при -80° С в течении 12-16 часов.

Компьютерные методы исследовании. Для поиска гомологов hemarl использовали ресурс NCBI (www.ncbi.nih.gov). Поиск осуществляли, применяя алгоритм wuBLAST (Washington University Basic Local Alignment Search Tool) по всем открытым базам данных первичных последовательностей нуклеиновых и аминокислот. Для выравнивания первичных последовательностей нуклеотидов использовали алгоритмы ClustalW2 и MUSCLE, аминокислот — COBALT. Филогенетическое расстояние между последовательностями MLE установлено по критерию p-distance, рассчитанному в программе MEGA 5.0. Для поиска ORF использовали ORF-finder. Для выявления консервативных мотивов в составе последовательностей использовали Motif Scan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan). Motif Finder и Helix-Turn-Helix Motif Prediction (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pr?page=/NPSA/npsa_hth.html).

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Транспозон hemarl в геноме трематоды Himasthla elongata

1.1. Определение полноразмерной последовательности hemar\

Для выявления транспозонов семейства mariner в геноме трематоды Н. elongala применяли успешно используемый подход: ПЦР-анализ с вырожденными праймерами к консервативным на аминокислотном уровне мотивам ORF транспозазы. Результатом такой ПЦР стал продукт длиной 500 п.н. (Рис. 3, А). Секвенирование продукта определило его как участок гена, кодирующего гранспозазу, сходную по последовательности (>80%) транспозазе mariner из генома турбеллярии Girardia tigrina. Амплифицированый участок назван Henil (Галактионов и др., 2009).

Для определения полноразмерной последовательности использовали методы частично неспецифической ПЦР (5'-конец) и обратной ПЦР (З'-конец) (Рис. 3, Б). Молекулярная структура полноразмерной копии hemarX характерна для транспозонов семейства mariner. Длина последовательности составляет 1237 п.н. и включает в себя одну ORF, потенциально кодирующую продукт длиной 339 а.к., а также 5'-UTR и З'-UTR 156 п.н. и 45 п.н. соответственно. 5'-UTR содержит предсказанный TATA box, в то время как З'-UTR несет предсказанный сигнал полиаденилирования. ORF hemarX несет множество замен знака, в связи с которыми элемент полностью утратил способность к перемещению.

Для того чтобы транслировать ORF in silico, в последовательности, ограниченные праймерами Marl24F и Mar276R, введен ряд сдвигов рамки считывания. Базы данных содержат только а.к. последовательности mariner между конвенционными праймерами, и сдвиги рамки считывания в hemañ введены в этом участке для адекватного сравнения. В транслированной последовательности выявлены: транспозазный мотив, характерный для транспозонов mariner; мотив helix-turn-helix (25% сходства с известными по базе данных мотивами этого класса); консервативный каталитический мотив D,D(34)D, служащий маркерным признаком транспозонов mariner (Рис. 4) (Galaktionov et al., 2013).

А Б

М I 2 .1 4

0ЯФ щккш

Рис. 3. Выявление полноразмерной последовательности hemarX в геноме Н. elongata.

А: Амплификация последовательности Heml с использованием вырожденных праймеров Mar124F и Mar276R: М - маркер; J - контроль без ДНК; 2 - ДНК Е. coir, 3 - ДНК человека; 4 - ДНК Н. elongata. В: амплификация 5' и З'-ITR hemarX: 5-ITR - частично неспецифическая ПЦР; З'-ITR - инвертированная ПЦР. Зоны, содержащие последовательности 5' и З'-UTR и ITR hemarl в рамке.

1 83

84 АИЗСАКЮШ miSJCiAlAil ALL П ЛЛи.-Пи1АА^АСССТА£ЗЛ ATG ATT GTC AAG TCG АСА AAA AAA 157

1 M I V К S T К к 8

158 та err TIA CGA TSC CTC СГТ err TTT GCT TTT AAT CGA GCT AAA AAA GCG AGT GAA GCC ACG 220

9 L L L R Y L L L F A F N R G К К A S E A T 29

221 Ata GAT ATT TCT GCC GTG TAT aa GAG SiC GCT ATA GCT GAG AGA ACT GkJ ОЗь GAT TGG TTT 283

30 R D I С A V Y G EDA I A E R T D R D W F 50

284 GCC A3G ТГС CAA TAC GAT AAT TTT GAC TTC AAC GAC GCT CCT TGT TCT AAA AGA CCA CTT GPG 346

51 A R F Q Y D К F D F N D A P С S К R P V E 71

347 АТС GAC GPG GAC CAA CTC AGT GET СГТ TTG AAG GAA AGT GGC CGC CAG АСА TGC AGA GAA TTG 409

72 M D E D Q L s D L L К E S G R О T С R E L 92

410 GGT SIA AAA ATG AAT TGT GAT TTT GIG АСА ACT TCA CGC CAC CTT CAG TCG ATG GGT АТС ACT 472

93 G E К M N С D F V T S S R H L Q S К G I T 113

HindiП >farl24F НггСШ

473 CGA ASG СТГ GGA GCT TGG GTT CDS CAT ®G CTC АТС CAA AAG CAG AAG GAT TTG CCG CT TCC 534

114 R К L G A VI V Р H E L I Q к Q К D L P t s 133

535 ATT GCT GCT TCA AAT CTC GCT CGA CAC CAA GGA ACC CAT Gffl CAC AGG CAA CGT TTC TIA TAC 597

134 I A A S N L A R H Q G T H G H R Q R F L У 154

598 AS АТС GTT ACT GGA par GAG AAA TGG TGT CTC TAT CTG AAT AT TAG GCA AAG GAA TGA CTG GG 661

155 R I V T G JL_ * К W С L Y V N tY * А К E * V» G 174

662 TXT OCT GGA GAG AAG ccr GAG OCT GGG АТС AAG AAA CAC CTG CAC TTG ACG AAG АСА ATG ATT 724

175 F p 3 E К p E p G I К К H L H L T К T M I 195

725 TGC СТА TGG TGG GAT TGG GlA OCT СТА АТС CAC TGG GAA ATG CTT GGA AAG AAC ATG АСА GTA 787

196 С V W W D w E G L I H W E M L G К N M T V 216

Mspl

788 GPG AAG АКТ CTC TAT AAA GCC CAA TTG CAT CAA GTC A ATT CAA CAA AAA AGA CCG GAT CGA CAA 851

117 E К N L У К A Q L H О V в I О Q К R D R Q 237

852 GGC CAG GTG АТС CTC CTC CAT CAC AAT GCT CGG CCC AC ACC TCA AAA ACT GTC AAG ATG GCA 913

238 G Q V I L L H JL_ N A R p* H T s К T V К M A 258

Ha£I InR Mspl Mar276R

914 CIC CAA GAG CIC CGG TGG 'Ж GTC CIT CAA CAT CCT CCC TAC AC С CCC GAC TCG CCC CAT ACT 976

259 L Q s L R И TGC E V L Q H p P Y г P D э P H T 279

977 psr TAT COG АТС TTG GCA ATA ACT AAT CAG ATG AGT GGT GTA ACG TTT GST GGC GAG GAG 1039

280 k * P I L С A I T н с M S G V T F D G E E 300

1040 Gffl TXA AJC AAC TGG СТА AAG AAC TTT TTC GAC ACG AGA CCC AGA AAT TTC TGG AGT ААУ GAY 1102

301 E L К N VJ V К N F F D T R P R N F W S N D 321

1103 ATT AAT AAA TTT СТА GAA GAG TAT ATG ATA GAG TSA"TAA2CAITCAGAATIACCTAA^ACTGGTGGTC2C 1173

322 I N К F V E E Y M I E 2 332

1174 TErTTGGTCTTGCCTAGCCS3TM?Jff^ 1237

Рис. 4. Полноразмерная последовательность транспозона hemarX

Инвертированные концевые повторы выделены жирным курсивом, ТАТА-бокс и сигнал полиаденилирования обозначены верхним подчеркиванием, мотив "helix-turn-helix" дважды подчеркнут, транспозазный домен выделен жирным подчеркиванием, аминокислотные остатки "D,D34D", составляющие каталитический мотив траиспозазы — обведены, сайты посадки праймеров — подчеркнуты. Сдвиги рамки считывания обозначены «#», терминальный стоп-кодон обозначен «Z», остальные стоп-кодоны обозначены «*». Сдвиги рамки считывания искусственно введены в последовательность таким образом, чтобы получать максимальное сходство при выравнивании с близкими последовательностями mariner. В базе данных NCBI последовательность под № JQ412055.

1.2. Копии hemar\ в геноме

Использование вырожденных праймеров к консервативному району траиспозазы mariner и дальнейшее клонирование и анализ полученных клонов позволили выявить две

последовательности гомологичные hemarl, названные Hem2 и НетЗ. Выравнивание последовательностей Heml, Hem2 и НетЗ показало, что последовательности Нет2 и НетЗ представляют собой копии hemarl. При этом НетЗ несет большее количество нуклеотидных замен (p-dist = 0.068) по сравнению с hemarl, чем Hem2 (p-dist = 0.007). Как и hemarl, последовательности транспозаз Нет2 и НетЗ несут замены, приводящие к инактивации этих элементов. Наличие негомологичных замен говорит о независимости мутационного процесса в геномных копиях hemarl (Galaktionov et al., 2013). He смотря на

1.3. Организации гранснозона hemarl в геноме.

Методом проточной цитофлуориметрии интерфазных ядер Н. elongata определили размер гаплоидного генома — 0.25 пг ДНК, что соответствует -1.22x10 п.н. Данные совпадают с размерами геномов других трематод (Galaktionov et al., 2013).

Метод дот-гибридизации (Рис. 5, I) и последующая денситометрия результатов позволила установить, что выявленная последовательность принадлежит геному трематоды Я. elongata и составляет около 0.01% от размера генома. Саузерн-блот геномной ДНК с зондом Hem 1 показал, что в геноме присутствуют как одиночные копии, так и кластеры, состоящие из нескольких элементов (Рис. 5, II, панель В). Геномная ДНК, обработанная рестриктазой Mspl, дает сигнал гибридизации, соответствующий зоне около 90 п.н. Компьютерный анализ последовательности hemarl выявил два сайта для рестриктазы Mspl (Рис. 2). Размер выявленного фрагмента соответствует расстоянию между ними (Рис. 5, II, панель В). Гибридизация ДНК. обработанной рестриктазами Mspl и Hpall (Рис. 5, II, панель В, дорожки 4. 5) показывает, что ДНК пе подвержена существенному метилированию, что согласуется с данными об отсутствии метилированного цитозина у плоских червей (Musto et al., 1994; Galaktionov et al., 2010).

положение сигнала 90 п.н. Линией отмечено положение одиночных копий и их кластеров.

Для локализации транспозонов mariner в интерфазных ядрах клеток трематод Я. elongata использовали метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с зондом

А

Рис. 5. Определение копийности гранснозона hemarl (1) и его распределение в геноме Н. elongata (II). I: Дот-блот гибридизация радиоктивно меченного Heml с плазмидой, несущей Heml (pHeml) и геномной ДНК Н. elongata. Концентрация нанесенной ДНК обозначена. II: (А) рестрикция геномной ДНК И. elongata: I -HinJIU; 2 - EcoRl; 3 - Ват HI, 4 - Ms/A; 5 -Нра II; (В) Гибридизации с фрагментом Heml: Номера рестриктаз наверху соответствуют номерам на панели А. Положение маркерных фрагментов отмечено между панелями А и В. Стрелкой отмечено

Heml. Диаметр ядер Я. elongata составляет около 8 мкм. FISH позволил выявить множественные сигналы гибридизации, распределенные по всему ядру (Рис. 6).

Рис. 6. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) ядер клеток редин с плазмидой pHeml. Зонд pHeml помечен Су5 dUTP (черный), ядра окрашены DAPI (серый).

Выявлено два типа сигналов: яркие сигналы (~ 15 на ядро) и меньшие по размеру сигналы (~ 30 на ядро). Меньшие по размеру сигналы соответствуют одиночным копиям ИетаП, в то время как яркие говорят о кластеризации последовательностей Иетаг! в геноме Я. elongata (Са1акПопоу е( а1„ 2013). Эти

результаты согласуются с результатами гибридизации по Саузерну. Таким образом, hemarl — действительно диспергированный элемент генома.

1.4. Сравнение hemarl с секвенированными представителями семейства Tcl\mariner из геномов зу кар нот

Для того чтобы выявить последовательности mariner, сходные с консервативным участком ORF hemarl, выполнен поиск сходных с Heml MLE среди всех известных геномных последовательностей в базах данных WGS (whole genome sequences) и nr (non redundant). Видно, что в одном геноме могут соседствовать MLE, относящиеся к разным подсемействам mariner (Рис.7). Так, геном Girardia tigrina (Turbellaria, Dugesiidae) содержит множество копий MLE, принадлежащих к разным подсемействам mariner (Robertson, 1997). Наибольшую степень сходства с Heml демонстрирует MLE из клона G. tigrina_DTU51176 (p-distance = 0.177). Следующие по степени гоМогии MLE принадлежит геномам Forfícula auricularia (Arthropoda, Insecta) (p-distance = 0.37) и Hydra vutgaris (Cnidaría, Hydrozoa) (p-distance = 0.395) (Рис. 7).

Hemarl н MLE разных видов. По оси абсцисс — p-distance, по оси ординат — клоны mariner из различных животных.

Platyhelminthes Hydra

Insecta

Рис. 7. Степень сходства между

Остальные MLE G. tigrina формируют линию в интервале p-distance 0.5 — 0.7, так же как и MLE насекомых. Элементы mariner гидры формируют группу с p-distance ~ 0.4 и имеют большую степень сходства с hemarТ, чем с большинством MLE насекомых. Эволюционно Cnidaria, к которым относится гидра, равноудалены от плоских червей и насекомых. Общая картина распределения MLE, родственных hemarl, соответствует принятым эволюционным отношениям. Скорее всего, mariner наследовался в эволюции вертикально и подвергался обычной дивергенции.

1.5. Hemarl в геномах хозяев трематоды

Я. elongala паразитирует в широком круге филогенетически удаленных хозяев. Для того, чтобы установить содержат ли геномы хозяев последовательности, подобные hemarl, его консервативный район Henil гибридизован с геномной ДНК промежуточных (L. littorea, L. saxatilis, М. edulis) и окончательного (L. argéntalas) хозяев Я. elongala (Рис.

6).

А В

$ ^ Í f Í I ^ i i Í Ü 8. Выявление »wriner в

-с ; ; ' i - ' геномах хозяев И. elongata и

ззпе ф определение степени их сходства

^ с heinl. А - ПЦР с геномной ДНК

í—* Ш jp U"B Щ с ираймерами Marl24F and

Кпе щ Ma276R (см. таблицу). В - Дот-

гнбри'зизация радиоактивно

меченного зонда Henil с плазмидой pHemt и геномной ДНК Н. elongala и ее хозяев. Виды животных обозначены сверху. Указано количество нанесенной ДНК.

2. Метод AFLP выявляет клональную вариабельность партенит и перкарин

Н. elongata

Наличие генетических основ клональной вариабельности церкарий Н. elongata проверяли методом AFLP, для постановки которого использовали ДНК отдельных особей церкарий, препарированных из одной редии. Амплификация после обработки ДНК fcoRI дала набор зон молекулярной массы от 1500 до 100 п.н., среди которых присутствуют как консервативные, так и полиморфные.

«. т

Рис.9. Авторадиограмма продуктов электрофоретического разделения АII-Р фрагментов.

I —большие цифры - номер моллюска; малые цифры - единичные церкарии из каждого моллюска; 1—3 — совместная рестрикция £гаК1/Мхе1; 4 - рестрикция только /'.£т;кI;

[I — рестрикция только ЯсоШ; все церкарии принадлежат к одной инфрапопуляции (группировка редий в одном моллюске). Области, представленные консервативными (<) и вариабельными (*) 'зонами, маркированы справа. Размеры маркерных фрагментов в п.н. показаны слева от каждой панели.

Анализ зон разделения позволил выявить вариабельность геномов церкарии внутри одного клона, при этом церкарии принадлежащие разным клонам, демонстрируют существенно больший полиморфизм зон разделения амплификатов АИЬР (Рис.9, панель I, клоны 4/1 —4/2, панель II).

Совместная рестрикция ЕсоКММ$е9\ и последующая амплификация рестриктов (АРЬР) позволила выявить набор фрагментов, включающих как консервативные, так и полиморфные зоны разделения реакции, размер большинства фрагментов составляет менее 500 п.н. (Рис. 9, I, клоны 1—3). Использование двух рестриктаз существенно повышает гетерогенность распределения зон амплификации АРЬР. Обработка £с(Ж1/М$е91 позволяет выделять большее, по сравнению с обработкой число

вариабельных зон, что позволяет точнее дифференцировать особи церкарий внутри клона, однако между клонами вариабельность становится менее очевидна (Оаккйопоу И а1., 2014).

3. Нешаг1-специфичсский ТГО выявил полиморфизм распределения Ьетаг1 в геномах клонов нартенит и церкарий трематоды Н. ектцШа

Для того чтобы определить, полиморфно ли распределение транспозона Иетаг\ внутри клонов церкарий и между ними (Рис. 10, I), использован метод ТГО (Рис. 2, Б). Геномная

ДНК редий и церкарий обработана рестриктазой Н'ииЛИ. Н/'псЛП имеет единственный сайт узнавания в последовательности 5'-1Л"Я ЪетаЛ (Рис.4) (Соловьева и др., 2013). Для амплификации рестриктов использовали как праймер, специфичный к адаптерной последовательности, легированной на 5'-липкие концы ШтЛ\\ рестриктов — Hind+cag (Рис. 10, II, дорожки под номером 1), так и Hind+cag совместно с вырожденным обратным праймером к последовательности Иетаг\ — Маг2761? (Рис. 10, 1Г, дорожки под номером 2). Для авторадиографической визуализации продуктов разделения ТГО, праймер Hind+cag

Рис. 10. Номенклатура клоков, нспользованных для ТП) (I), и авторадиограмма продуктов III) из одиночных церкарий (II).

I — Буквами (А, В и т.д.) обозначены особи Млюсков — хозяев. Цифры до разделительной черты — редин; цифры после разделительной черты — церкарии из соответствующей редии. I! — ДНК каждой церкарии использованы для постановки двух реакций ТЮ с праймерами: Hind+cag* (первая дорожка) и праймеры Hind+cag*\Mar276R (вторая дорожка).

Вертикальными линиями справа обозначены: два вариабельных района — толстая линия (200—400 п.н.) и тонкая линия (500 п.н. — I т.п.н.). Размеры маркерных фрагментов в п.н. показаны слева от панели. 6%-ный секвенирующий гель.

В случае Hind+cag* выявлен полиморфный набор высокомолекулярных (от 500 п.н. и выше) зон. Добавление в реакцию Маг276Я существенно меняет картину, сильно увеличивая как количество зон, так и их гетерогенность. Наиболее полиморфные паттерны смещаются в область 200—400 п.н., при этом повышается полиморфизм зон как внутри клона, так и между клонами (ваЫкПопоу е1 а1„ 2013).

Использование праймеров, основанных на последовательности НетаЛ, выявляет полиморфизм у церкарий и партенит внутри клона. До определения последовательности фрагментов нельзя утверждать, что ИетшЛ является основным источником полиморфизма. Однако, по условиям постановки ТГО, участие ИетагХ в геномных перестройках вполне возможно.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Комплекс методов молекулярной, клеточной и компьютерной биологии, использованный в настоящей работе, позволил выявить и охарактеризовать элемент

помечен у32Р dATP (обозначен НМНч^*)

I

V 5Г 7 V

1\1 2\1 3\1 1\1 2\1 2\2 1\1 2\1 1М 2\1 3\1

2 1 2 1 2 1 2 12—1

hemar\ из генома трематоды Himasthla elongata. Элементы mariner в геномах плоских червей изучены мало. Известно, что геном Schistosoma mansoni (Trematoda; Schistosomatoidea) несет доместицированный участок транспозазы mariner, входящий в состав гена SETklAR. ITR исходного MLE, необходимые для самостоятельного перемещения, при этом утрачены. В геноме S. mansoni до сих пор не найдено ни одной копии полноразмерной последовательности mariner, что подтверждает данные об эволюционной древности гена SETMAR (Shaheen et al., 2010).

Как и большинство сиквенированных на сегодня MLH, элементы hemar\ несут множественные замены, приводящие к сдвигам ORF, и соответственно к инактивации выявленных элементов.

Изучение организации транспозона hemarl методами саузерн блотинга (Рис. 5) и in situ гибридизации (Рис. 6) показывает, что элемент представлен приблизительно 100 копиями, диспергированными в геноме. Копии hemarl могут кластеризоваться, что объясняется рекомбинацией между гомологичными копиями транспозонов. Выявление же высоко гомологичных копий hemarl — hem2 и hem3 подтвердило множественность копий транспозона hemarl (Galaktionov et al., 2013).

Выравнивание консервативных участков аминокислотных последовательностей характерных представителей известных подсемейств mariner и элемента hemarl (Рис. 11) позволило установить, что hemarl принадлежит к подсемейству capitala, как и гомологичный ему на 88% транспозон пресноводной турбеллярии Dugesia tigrina (клон G.tigrina DTU5117).

Рис. 11. Филограмма родства элементов mariner, основанная на выравнивании аминокислотных последовательностей MLE и hemarl. Указано название подсемейств, к которым принадлежат использованные элементы mariner.

Capitata — одно из наименее изученных подсемейств mariner. Его представители найдены только у беспозвоночных. Среди насекомых, демонстрирующих все разнообразие MLE, последовательность, отнесенная к подсемейству capitata, выявлена лишь в геноме Forficula auricularia (Insecta, Forficulina).

Изучение hemarl позволило впервые установить последовательности ITR элемента, принадлежащего к подсемейству capitata. Выявленные 1TR имеют низкий уровень сходства с ITR элементов mariner, найденных в базах данных. Интересно и то, что уровень сходства между инвертированными повторами элемента не коррелирует с таковым между транспозазами (Рис. 7, Galaktionov et al., 2013)

Вопрос о горизонтальном переносе (ГП) транспозонов семейства mariner широко дискутируется. В геномах филогенетически удаленных организмов выявлены такие MLE, степень сходства первичных последовательностей которых превосходит 90%. Высоко гомологичные копий MLE найдены в геномах паразитов (паразитоидов) и их хозяев (Yoshiyama et al., 2001). Кажется логичным, что в случае паразитизма вероятность ГП возрастает. Однако вывод о возможном ГП основан на сходстве MLE в системах паразит-хозяин, оба компонента которых представлены насекомыми. Нельзя исключить, что такой элемент mariner нес их гипотетический общий предок.

В настоящей работе, используя в качестве модельного объекта паразита с широким кругом хозяев, проверили, присутствуют ли гомологи hemarl в геномах хозяев трематоды (Рис. 8). Выявлен слабый сигнал гибридизации Heml к геномной ДНК L. sa.xatilis и L. littorea, однако амплификация консервативного участка транспозазы, не показала характерную для Heml зону (500 п.н.) ни в одном из геномов литорин. Наличие же высокомолекулярных мажорных зон (Рис. 8, А) говорит о том, что если эти геномы и несут копии mariner, то их последовательности отличны от Heml. Таким образом, hemarl не служит основным (мажорным) MLE в геномах литорин (брюхоногих Млюсков) и тем более в геномах других хозяев (двустворчатых Моллюсков и птиц). Сравнение же последовательностей mariner беспозвоночных с Heml методами биоинформатики выявляет группы, которые скорее свидетельствуют о вертикальном наследовании фрагмента с последующим исчезновением у одних видов и размножением отдельных копий у других (Рис. 7).

Источник генетической вариабельности эукариот, обладающих бесполым или партеногенетическим размножением, и выявление последовательностей, определяющих такое разнообразие, стало актуальной, но не решенной задачей биологии генома. Но уже появились методы которые дают высокую воспроизводимость результата и позволяют работать с малыми количествами ДНК.

Использование AFLP, TID и подобных подходов дает высокую воспроизводимость результата и позволяет работать с малыми количествами ДНК и в настоящей работе именно методом AFLP подтвержден факт генетической вариабельности клонов партенит и церкарий Я. elongala. Установлено, что уровень вариабельности между клонами превосходит таковой внутри клона, однако в клоне церкарий выявлена вариабельность зон разделения продуктов AFLP. Таким образом, в ходе развития партенит Я. elongala происходит реорганизация генома, служащая источником клоналыюй вариабельности и, по-видимому, той генетической основой, которая определяет широкий полиморфизм в поведении, биологии и инвазионной способности церкарий.

Использование праймера к консервативной последовательности hemarl при постановке TID позволяет предполагать участие последовательности hemarl в индукции генетической вариабельности Я. elongala. Распределение последовательностей, амплифицированных праймером к консервативному участку транспозазы hemarl, вариабельно, как внутри клона, так и между. Выявлены и высоко консервативные полосы,

сохраняющие свое положение в череде экспериментов на разных особях церкарий. Использование последовательности транспозона как сайта посадки праймера при TID существенно повысило гетерогенность зон разделения амплификатов по сравнению с AFLP. Таким образом, есть основания полагать, что последовательность транспозона hemarl вносит вклад в формирование генетической вариабельности партенит. В транскриптоме церкарий с помощью //(.'»««/-специфичных праймеров выявили транскрипцию mariner, по клонирование и секвенирование активной копии mariner является предметом дальнейшей работы.

ВЫВОДЫ

1. В геноме трематоды H. elongata выявлен полноразмерный транспозон hemarl. Элемент hemarl относится к ДНК транспозонам семейства Тс\! mariner и принадлежит подсемейству capitata.

2. Элемент hemarl распределен в геноме дисперсно с отдельными кластерами. Его копии составляют приблизительно 0.01% от генома трематоды.

3. Данные ПЦР анализа и саузерн гибридизации свидетельствуют об отсутствии недавнего горизонтального переноса в системах хозяин-паразит, формируемых при участии Н. elongata.

4. Доказан факт генетической вариабельности партенит Н. elongata. Метод AFLP (amplified fragment length polymorphism) позволил установить клональную вариабельность церкарий и патенит трематоды.

5. Метод TID (transposon insertion display), основанный на hemarl специфичном праймере, увеличивает гетерогенность зон амплификатов по сравнению с AFLP. Вероятно, последовательность транспозона hemarl вносит вклад в формирование генетической вариабельности партенит.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Galaktionov N.K., Solovyeva A.I., Fedorov A.V., Podgornaya O.I. Trematode llimasthla elongata mariner element (Hemar): structure and applications. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution, 2014, 322: 142155.

2. А.И. Соловьева, H.K. Галактионов, О.И. Подгорная. 2013. Ретротранспозон класса LINE является компонентом паттерна полиморфных фрагментов партенит трематоды Himastla elongata. Цитология. 55(7): 492—500

3. H.K. Галактионов, О.И. Подгорная, A.B. Федоров, 2009. Характеристика транспозона mariner из генома плоского паразитического червя Himasthla elongata. Цитология: 51 (11): 924—928

4. О. И. Подгорная, Н. К. Галактионов, 2009. Мобильные элементы как потенциальные векторы горизонтального переноса генетической информации в системах паразит-хозяин. Труды зоологического института РАН: 313 (3): 283—296

5. Галактионов Н.К., Галактионов К.В., Скирниссон К., Регель К.В., Атрашкевич Г.И., Орловская О.М. 2009. Использование молекулярных маркеров для уточнения видовых статусов и видовой принадлежности спороцист и церкарий некоторых рениколид (Trematoda, Renicolidae). В кн.: Паразитологические исследования в Сибири и на Дальнем Востоке, изд. Ин-та систематики и экологии животных СО РАН, Новосибирск, 62—65.

Тезисы

1. Соловьева А.И., Подгорная О.И, Галактионов Н.К. 2011. Метод Транспозон Дисплея как инструмент выявления генетического полиморфизма. Морской биологический симпозиум СПб. Сборник тезисов докладов, стр. 81

2. N. К. Galaktionov, А. V. Fedorov, О. 1. Podgornaya. 2010. Hemarl a novel transposable element of mariner family from the genome of Himasthla elongata fluke. Conference of American Society for Microbiology (Mobile DNA). Montreal, Canada. April 24—28, Abstract book, p. 148

3. Подгорная О.И., Галактионов Н.К. 2008. О возможности переноса генетической информации в системе паразит-хозяин. В кн.: Материалы IV Всероссийского Съезда Паразитологического общества при РАН «Паразитология в XXI веке — проблемы, методы, решения». Т. 3. СПб., изд-во «ЛЕМА», 36—41.

4. Н.К. Галактионов, А.В. Федоров, О.И. Подгорная, 2008. Транспозон mariner из генома паразитического плоского червя Himasthla elogata. Современные методы микроскопии в исследовании живых систем. СПб, Россия. 17—21 наября, стр. 4

5. Galaktionov N.K., Galaktionov K.V., Skirnisson К. 2009. An attempt to analysis of life cycles of renicolid trematodes (Digenea, Renicolidae) usinr ITS1 region of the rDNA sequences. The 3rd Symposium of the Scandianavian-Baltic Society for Parasitology. Riga, Latvia, 16—18 April. Abstract book, p. 16.

6. Galaktionov N.K., Fedorov A.V., Podgornaya O.I. 2008. Identification and characterization of a novel Hemarl and Hemarll elements belonrinr to mariner family of transposons, in the genome of flatworm Himasthla elongata (Platyhelminthes; Tremetoda; Echinodermata). Xth European Multicolloquium of Parasitology. 2008. Paris, France. August 24—29, Abstract book, p. 148

7. Галактионов H.K., Федоров A.B., Подгорная О.И. 2007. Клонирование и анализ транспозона mariner из генома паразитического плоского червя Himasthla elongata. СПб, Россия. Цитология, 49 (10) р. 735

8. Галактионов Н.К., Зайцева М.А., Сухачев А.Н., Дьячков И.С., Кудрявцев И.В., Полевщиков А.В., Харазова А.Д., Галактионов К.В., Подгорная О.И. 2006. Роль поверхностных антигенов церкарий трематод Himasthla elongata (Trematoda, Echinostomatidae) в иммунном ответе мидий (Mytilus eduHs). Фауна, биология, морфология и систематика паразитов. Материалы международной научной конференции. Москва, с.78—79.

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА В.В. Прокофьев II К.В. Галактиоиов. 2010. Труды ЗИН РАН. 313.(3): 308—318. Arkhipova I, Meselson М. 2000. PNAS. 97(26): 14473—14477. Нианг CR, Burns KH, Boeke JD. 2012. Annu. Rev. Genet.46: 651—675. Ivies Z, Kaufman CD, Zayed H, Miskey C, Walisko O, Izsvak Z. Curr. 2004. Issues Mol. Biol. 6(1):43—55. Fesehotte C. and Pritham E. J. 2007. DNA Annual Review of Genetics, 41:331—368. Jones UN.2005. Cytogenet. Genome Res. 109(1—3):90—103. Karlyshev AV, Fallen MJ, Wren B\V. 2000. BioTechniques 28: 1078—1082. Levakin 1Л, Losev EA, Nikolaev KE, Galaktionov KV. 2012. J Helminthol. 30: 1—9. Lyon MF. 1995. Turk. J. Pediatr. 37(2): 125—140. Medhora M, Maruyama K, Hartl DL. 1991. Genetics. 128(2):311—318. Munoz-Lopez M, Siddique A, Bischerour J, Lorite P, Chalmers R, Palomeque T. 2008. J Mol Biol. 382(3):567—72. Musto H, Rodriguez-Maseda H, Alvarez F, Tort J. 1994. J Mol Evol. 38(l):36-^0. Robertson HM and Lampe DJ. 1995b. Ann. Rev. Entomol. 40: 333—357. Robertson HM. 1997. J Hered. 88(3): 195— 201. Sambrook J., Fritsch EF„ Maniatis T. 1989. Cold Sprinr Harbor: Cold Sprinr Harbor Press. Shaheen M., Williamson E., Nickoloff J., Lee S-H., Hromas R. 2010. Genetica. 138(5): 559—566. Worden Lab Protocol: http://vvww.mbari.org. Yoshiyama M, Tu Z, Kainoh Y, Honda H, Shono T, Kimura K. 2001. Mol. Biol. Evol. 18(10):1952—1958.

Подписано в печать 30.04.2015. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 13068Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Типографии Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812) 552-77-17; 550-40-14