Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ ЛОШАДЕЙ
ВАК РФ 03.00.13, Физиология
Автореферат диссертации по теме "ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ ЛОШАДЕЙ"
А
ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА <ВИЖ)
На правах рукописи УДК 612.646.02
ЛВШДЕВ . Станислав Гуриаич
ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ ЛОШАДЕЙ
43.00.13 — Физиологи« человека и животных
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
п. Дубромщи, Московской области 1994г.
—
Диссертационная работа .V " -на в лаборатории
физиологии размножения лошадей Йс V >чаучно-исследо-»ателъекого института кояеяодствг
■ ■. ■. ■ > ^ . .. * \, ■ ,
Официальные оппоненты:
Заслуженный деятель науки России,
доктор биологических наук, профессор А.А.Алие»
доктор биологических паук, профессор Н.И.Сергеев
доктор биологических наук, профессор А.АЛасков
Ведущее учреяднение *
Всероссийский научно-исследовательский селекционно-г нетический институт ^
I л Защита диссертации состоится МЛШУ^ 1994 г. 1
я [О часов на заседании специализированного совета Д.020.16.02 при Всероссийском научно-исследовательском институте животис водства
Адрес института: 142012, Московская обл.,Подольский район, пос. Дубровицы
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан '1994 г»
Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук
П. А. Ноумен ко і
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА.РАБОТЫ
■ 1.1 Актуальность темы. В последние десятилетия, в связи с бурным развитием техники, народно -'хозяйственные требования к количеству-и качеству разводимых в нашей странелотадей значительно, изменились. Направления совершенствования поголовья отдельных конских пород по-хозяйственно - полезным признакам, в настоящее время, требуют существенной.корректировки. Однако, характерная для коневодства, замедленная по сравнения с другими видами животных сменяемость поколений, продолжительная беременность и резко выраженное одноплодие:кобыл/ высокая стой* мость выдающихся животных:усложняет плеиенну» работу,.сдержи-, вает темпы селекционного процесса в.породах. Поэтому, наряду с применением обычных методов селекции,. все большее значение для совершенствования пород лошадей приобретают приемы ускоренного размножения особо ценных животных. В частности■- трансплантация ранних эмбрионов.
Решаемые посредством технологии трансплантации эмбрионов вопросы в коневодствеаналогичны проблемам в других отраслях животноводства. Это - повышение интенсивности размножения генотипов выдающихся самок, совершенствование пород с ограниченным генофондом, сохранение оригинальных мутаций. МЬ, в коневодстве есть и своя специфика. Хозяйственное использование лошадей часто не способствует интенсивному размножению выдающихся по работоспособности ливотных.'1 Например лоиади, победители.крупных всероссийских, и. международных соревнований по конному спорту, как'; .правило совсем устраняется из племенной работы или возвращаются в конные заводы уже в преклонном возрасте с подорванным здоровьем,;. когда' возможность получения от них потомства становится. проблематичной. Применение методов трансплантации эмбрионов,: в этой ситуации, освободит от.необходимости изъятия из спорта на длительный срок выдающихся кобыл,.1 связанного с ■ беременностью\й позволит получать от них приплод без вреда для их дальнейшей спортивной карьеры.
Методы трансплантации-амйрщновотсамок доноров самкам
__._____л__[17А¡т~и'^ипг^гггт .. ___■ _______
реципиентам хорошо разрабо^аны7ЙЛйаЖШодствЗ и уже широко
КЛУЧмЛ^ .БИБЛИОТЕКА'
, ' - 2 -
внедряются в производство. Однако, попытка механического перенесения приемов ускоренного размножения, разработанных на других видах животных, е коневодство часто оканчиваются неудачами. Особенности анатомического строения и физиологии половых функций вносят существенные ' коррективы в разработку приёмов случки и искусственного осеменения, пересадки эмбрионов, регулирования половой цикличности кобыл.' Часть этих особенностей известна и хорош изучена, другая - вдет своего времени. •
фактически, на всех этапах единого процесса воспроизведения (оогеиеэ, овуляция, оплодотворение, ранний и поздний эмбриональный период) у лоиадэй выявлены существенное своеобразие и отличительные видовые особенности. И это, естественно, повлияло »а стратегию исследований и технологинеских, решений при выполнении- научной работы по трансплантации эмбрионов а коневодстве. Наиболее существенными особенностями.воспроизводительных : функций кобыл, влияющих на разработку методов трансплантации зародышей по сравнению с самкамч других видов являются: " ■ ;< .. ~ ..'
1 Резко выраженное одноплодие.
2. Существенные отличия нейро-гуморальной ре гуляща* половой системы. _
3. Сезонность размножения. -
4. Повышенная интенсивность миграции плодов по маточной полости конематок в период ранней беременности. . ■, ■
5. Задерганная, по сравнению с-другими, видами, имплантация плодов. ' - ■.'■;.■ ■
6. Полноценное развитие фолликулов, овуляция и образование иелтых тел-второго' порядка во время жеребости. :
7. Отличия анатомического и гистологического строения половых органов, плаценты и плодов.
- 1.2 Сель и задачи работы
у < - • ■
С целью разработки, совершенствования и внедрения в практику коннозаводства, приемлемого для производственных условий метода трансплантации эмбрионов лошадей были поставлены следующие задачи исследований: * -
1. Изучить сезонные и возрастные изменения половой цикличности кобыл разных пород в условиях континентального климата
Центральной России. ; - ■. ". .
. 2. Разработать параметры отбора животных для работ по трансплантации в группы кобыл-доноров и кобыл-реципиентов,"
3. Выяснить характер изменений концентрации люгеинизируо-щэго гормона (ЛГ) в крови кобыл в фолликулярную фазу, полового цикла. '■. ■ '.'■'■."
4. Определить оптимальные сроки, дозировки, кратность применения хорионического.гонадотропного гормона (ХГ) для синхронизации половых функций кобыл.'
'■' Б. Предложить и апробировать несколько схем синхронизации .сроков овуляции у кобыл-доноров и кобыл'реципиентов в эависи-мости от степени несовпадения их половых' циклов.
. 6. Освоить . и усовершенствовать нехирургический метод извлечения эмбрионов из матки кобыл-доноров, позволяющий многократно извлекать зародыши из одного и того же животного в течение ряда лет без вреда для его здоровья и последующего племенного использования. . ^ ■ ■
■ 7. Определить физиологические факторы, влияювде на результативность извлечения зародышей. ^
8. Предложить способы оценки качества зародышей.
9. Разработать способ продолжительного хранения эмбрионов in vitro при плюсовых температурах в жизнеспособном состоянии.
10. Освоить.. нехирургический траисцервикальный метод перекоса эмбрионов в' матку кобыл-реципиентов.
_ 11. Апробировать в- опытах по пересадкам зародышей изокссуприн лактат (Ханегиф) - препарат, временно подавляющий 'моторику матки. • '...'."■. ■ % . .
.v 12. Проанализировать ход беременности кобыл- реципиентов и качество полученных в опытах жеребят-трансплантатов.
, 1.3 Научная новизна и теоретическая значимость исследований. Впервые выяснено, что переход кобыл от случного сезона в состояние межсезонного акэструса может наступить как в эст-радьную, так и в лютеальную фазы' полового цикла. И это, в последующем, влияет на их половое поведение и реакцию на введение экзогенных гормонов в начальный период следуицэго случ-'ного сезона. Определены возрастные особенности сезонных изменений половой цикличности . у . коОши. Установлено постепенное снижение1 эффективности действия хорионического гонадотролного
...... ...... 4:-.
.гормона на сроки созревания лидирующзго фолликула при его. мно-" гократном и многолетнем применении на одном и томде'животном. '.' '. '■■■ ,.У , .■ У-.■ ■■'■*
Описаны изменения внешнего вида 7 - .9 суточных, бластоцист .лошадей при их хранении в.неадекватных условиях внешней среды.
Считаем, что разработанная нами в соавторстве, с А Ф. Леб?-; девой 1авторское свидетельство' СССР;Н 1497£15)"среда для.-культивирования поздних (экспандированных) . бластоцист • лошадей, главной составной частью -которой является.желток куриных яиц является серьезной теоретической базой для серии,новых, исследований в области раннего эмбриогенеза млекопитамких.. Выясненная в этих опытах необходимость включения в-'культуралъные среды для 7-9 суточных эмбрионов.лошадей 20 - 60 X желтка куриных яиц наводит на. мысль об отсутствии ; существенных ви-доспециничных факторов в;секретах'маточных желез кобыл на этой стадии ранней беременности. •
Впервые» рекомендован при нехирургических пересадках эмбрионов лошадей-миорелги«зант иэокссуприн лактат. Установлено, что из-за высокой интенсивности миграции ранних эмбрионов по маточной полости, кобыл ' эффективнее неглубокое введение' трансплантата при пересадках. . - *• • " -' 1"
,1.4 Практическая значимость. Разработаны-и предложены'для внедрения - в производство рекомендации' по.,;. не хирургической трансплантации эмбрионов лопадей, которые позволяют существен-' но повысить интенсивность размножения выдающихся кобыл. Методика, трансплантации эмбрионов является'.единственно возможным способом вовлечения в племенную работу выдающихся по спортивным достижениям ' в классических видах-конного спорта (конкур» троеборье,, выездка).кобыл, Считаем; что.технология трансплан-' тации эмбрионов должна быть включена в селекционные программы при работе'со спортивными породами лошадей (тракененская, ганноверская, гольпгтинская, буденновская» УТ1Г и дрГ).
1.5 Основные положения диссертации,; вынесенные на защиту.
- Возрастные и породные особенности 'сезонных :изменений интенсивности воспроизводительных, процессов у кобыл.
- Отличительные (по сравнению с другими видами животных) ". принципы синхронизации половш: циклбв у лошадей.1
' : - ' - 5 -
.-Критерии оценки жизнеспособности поздних (экспандиро-ванных) бластоцист лошадей по размерам, внешнему виду и удельной массе.■ . •
- Способ продолжительного (до 24 часов) сохранения во внешних условиях эмбрионов лошадей з жизнеспособном состояний.
- Особенности нехирургической трансплантации вибрионов кобылам-реципиента», позволяющие достигнуть наивысшей результативности пересадок. .
1.6 Объем работ Диссертация изложена ка 245 страницах машинописного текста, содержит 42.таблицы. 18 рисунков. Список использованной 3 работе литературы содержит 302 источника.
/ ' 2. МАТЕРИАЛ И. МЕТОДИКА
. Намеченные цели и задачи научной работы по ■ теме. "Трансплантация эмбрионов лошадей" были решены путем постанов1Г ки серии опытов яа племенном и пользователем поголовье ВНИИ коневодства« Опытного,-Старожиловского, Александровского, Ло-; котского, им.С. 11 Буденного и им. Первой.Коиной Армии конных • заводов России. '
Схема опытов
_________;______________;___;___________;_________
N 1 Перечень изучаеыыхвопросов! Обгем работы! Задачи экспери-опьгга! ' i ' I мента
11
1
I
1. • Вменение сезонных и воэ-г растных изменений половой ': цикличности кобыл разных пород и разного физиологического состояния в условиях континентального климата Центральной России :
Регулярный . Разработать па-
контроль за рамотры отбора
половой цик- кобыл-доноров и
личностью ко- кобыл-реципиен-
6ыл опытной тов ;
группы в те- .
чение 16 лет
2
!'- ; 3 ' і '. L_ 4
2. Изучение'характера изменений концентрации ЛГ в кро-. ви коСил в фолликулярнуп ; фазу полового цикла :
Опыт проведен Выяснение меха-на З-х кобы- низка регуляции лах процессов овуля-
ции у кобыл
Определение действия ХГ на Две группы . Изучение пара-
время овуляции при введо-. юш препарата на разных ' стадиях созревания фолликула '.' *
кобыл ( опыт-; пая и контрольная) по 34 головы в группе
метров эффективного применения препарата : Г
4. Выяснить влияние ; разных. доз ХГ на воспроизводи-* тельные процессы кобыл
6. Анализ эффективности действия разных способов введения ХГ кобылам
2 серии опы- Изучение пара- . тов:1 серия : метров эффектив-поставлена на ного применения 40 кобылах,-. .: препарата■ .. , П-на 44 коб.
'ЗЭкобыл раз- Изучение параде лили на 4 метров эффзктив-группы ного применения
(1 контроль- препарата ная,. 3-опытные) ■'■.-'■■>
G. Изучение последствий многократкого применения ХГ ■ »а одной и том та кивот- :
ном в течение нескольких ■ £вт
2 группа ко- Изучение пара-Оыл (опытная, метров эффектив-контрольная) ного применения; по 10 голов препарата в группе '. ...
7. йоииссконноэ испытание эффективности применения хорионического гонадотро-. пина для синхронизации ; сроков овуляции у кобыл
2 труппы кобыл (опытная/ контрольная) ПО 16 голов в группе
Апробация хг в.
производственных
условиях
8. Применение еинтетичес- ; кого аналога простатлан-■ дина для синхрониза-/ ции эструса у кобыл
Проведено 3 Сравнить "Экви-серии отлов майт", "Эстро-на 58 кобылах фан",
' "Энзапрост-<Р' •
9. Проверить несколько схем синхронизации сроков эст-. руса и овуляции у кобыл _ посредством инъекций простат дандинаи хг
-Проверено 4 Разработка оп-схеш обрабо- тимальных схем ток на 64 синхронизации парах кобыл полових функций
10. Освоить нехирургический метод извлечения эмбрионов из матки - ' кобыл-доноров . '
Проведено 7 -Сравнить 2 из-вымываний по " вестных спосо-Аллену-Роусону ба извлечения и 7 по Огури- вародшей из Тсутоуми матки кобыл
11. Апробировать многократное извлечение еародЬапей нз одной и той же' кобылы-донора в течение ряда дат
В обработку Выяснить возмож-взяты резулъ- ность получения таты 273 большого кол-ва вьмывакий из вибрионов из 21 кобыла одной кобылы-донора
12. Изучить изменения морфологических признаков и.размеров ранних доимпланта-ционных эмбрионов разного . возраста /
Оценили 7 эмбрионов 6-ти даев. возраста, 69
Разработать шкалу оценки качества змбрионоз равного возраста
эмбрионов 7-й дне»., 311 эмэр. а-и дн. 83 эмбриона 9-й дн. и А . эмбрионов 10-и днев. возраста
1 t
I
I
13. Вькскить зоамотаюстк про- - Было постав-
должителъкого хранения леко iO
эмбрионов in vitro в ере- опытов дах различного состава-
Накопить необхо-дикыэ знания для разработки способов хранения ■ Эмбрнноэ
14. Разработать спосоО культивирования эмбрионов, лошадей
Совместно а предложить спо-аспиранткой сов хранения .10. Лебедевой эмОркокоа лова-ашолнеко і дей > серия опытов на 21 варианте сред-.-
15. Освоить нехирургический штод переноса лошадиных вибрионов в матку кобыл-реципиентов
Всего выпод- Излучить живых
нено 164 жерёвят-транс-
пересадки плантатов эмбрионов
16. Вьксяить влияние раэлич- 106 перё-нык факторов на прижив- садок ляемость трансплантатов
: ПОВЫСИТЬ уро--вень прижив-ляешетй трансплантатов
17. Апробировать разработан' ; виз рекомендации по , -трансплантации эмбрионов . лошадей
Довести исследования по трансплантации \ эмбрионов до этапа внедрения метода в практику коннозаводства
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
, 3.1 Синхронизация половых функций кобьи
3.1.1 Лучение половой цикличности. Проведение регулярного круглогодичного контроля воспроизводительных функций кежгребых кобыл в условиях опытов по трансплантации эмбрионов позволяло обратить внимание на ряд известных и неизвестных ранее особенностей их половой цикличности.
Количество регулярно проявлявших зструс (находящихся -s состоянии половой активности) холостых кобьи в екшше . ЫесйЦЫ существенно «еньюе (40-БСЖ), ~ че'м в летние (75,6-89Х). Ишятся заметные колебания показателей половой активности лошадей по годам. В отдельные годы сезонность размножения у холостых кобыл в"наших опытах была выракэна резче (1978,. 1S82, 1689, 19S2 годы), в другие годы -этот признак был более сглажен (1S?3, 1984, 1985 годы). Анализ половой активности конкретных опытк&х кобыл-доноров этой же группы животных за ряд лет, проведенный под нашим руководством аспирантом И. & Черншовыи показал, что у кобыл имеются возрастные особенности овариальной активное;^ связанные с сезонностью. "Было установлено, что у старых кобыл (14-20 летнего возраста) продолжительность межсезонного аяэ^т-рального периода сущэственко длиннее, чем у животных более молодого возраста (190,8±30,4 суток - - у старых животных; 107,1±31,2 суток - у двухлеток; 97,3425,3 суток - у кобыл 3-S *" летнего возраста и 91,3±24,1 суток у 7-13 летних животных.
Существенные ментоловые различия половой активности.холостых кобыл, в . наших опытах, можно объяснить возрастным составом группы животных только частично. Частично, вероятно, повлияли погодные условия и кормовые факторы, а частично - по-~ родные отличия! Сведения об овариалъкоя активности кобыл разных пород приведены в таблице a i.
• - 10 - ;.*■ .. .
. * : . Таблица 3.1
Количество проявленных полноценных половых циклов в течение года кобылами-донорами разных пород.„
Порода . I Количество! Количество!Среднее количество 1 ГОЛОВ 1 плодовых (половых циклов в ; 1 ) дат "1 течение года
Русская рысистая ' 10 28 9,3 ±1.7
Русская тяжеловозная 6 1? 11,7 4 1,9'
Советская тяжеловозная 12 26 12,4 ±1,1
Буденновская и донская б % 1 ' 1в 8,4 ± 2,6
Больше количество проявленных в точение года половых циклов советскимиЧямэловозными кобылами (таблица 3.1) объясняется коротким* а Часто дама полным отсутствием межсезонного анэстраньного периода у' животных этой породы. У буден-нозскнх и донских кобыл севонность размножения выражена резче. Лэшади русской рысистой породы эанимаш по этому' показателю проме^точное положение. ;
Изучахжцие сезонность размножения лошадей исследователи обычно обращают внимание на период перехода кобыл из состояния межсезонного анэструса к половой цикличности. Период же перехода кобыл от сезона размножения.в шжсезонное анэстральное" состояние в специальной литературе почти не освешэн. Проанада-аировав этот переход у кобыл опытной группы мы заметили, что сезонное затухание половой цикличности мотет происходить .по •двум сценариям. В одном случае происходит пролонгирование лю-теалыюй фазы полового цикла. В другом - переход в межсезонное аязстральное' состояние может наступить в период, эструса.. В этом случае размеры ледирушзго фолликула не достигают . максимальных размеров и овуляция не происходит. Обычно через 3-7 дней после начала эструса наблюдается постепенное уменьшение размеров начавшего созревать -фолликула и охота постепенно затухает. У кобылы наступает продолжительный межсезонный анэет-радьный период. Ш нашим наблюдениям примерно у 3/4 кобыл опытной группы сезонное затухание половых функций отмечали в люгеальную фазу подового цикла (68 случаев из 93 наблюдений) и
.r'V " " ■ • - 11 т ■. ---'у. ' .
у 1/4 кобыа - в эстральную фазу (25 случаев).
Затем, весной, переход кобыл от состояния полового покоя в активное состояние, также происходил по двум сценариям. Властные, перешедшие в межсезонный анэструс в лотеахънута фазу полового цикла, приходили весной в первую охоту с одновременно созревающим в яичнике лидирующим фолликулом. У удадшкх ВЭ 3 межсезонный анэструс кобыл в астральную Фазу подового цикла, весной наблвдаотся признаки первой охоты без одновременного развития лвдирушда фолликулов в яичнике. Такое состояние (проявление охоты без созревающих фолликулов) у них может продолжаться довольно длительное время (от 2-3 недель до 1,Б-2 месяцев), № и у кобыл, ушедших в межсезонный анэструс в:лютеальную фазу полового цикла; первая весенняя охота не всегда завершается овуляцией.' Отмечено .много случаев (опало 70S), когда начавший развиваться фолликул не- достигает максииума своих размеров, ачереэ В-7 дней после качала охоты регрессирует н вместо него начинает,созревать другой, а иногда и третий фолликул- .. ' ■'
3.1; 2 применение ' хорионического гоиадотропкна человека (ХГ) скнхронияят^ии проков овуляции у иобыя. Выделяемый гипофизом' кобыл: комплекс гонадотрошшх гормонов существенно отличается'от комплекса гонадотропных гормонов выделяемого.гипофизами самок других видов повышенным содержанием 5СГ и дефицитом ЛР. Поэтому» У кобыл ревко изменено соотношение' продолжительности разных- фаз полового цикла. Обычно диэструс у кобыл составляет-16> 17 суток, эструс- Б - 6 суток. То-есть, по продоллитель ности диэструс у кобыл составляет 76 X полового цикла, эструс 25 X. У коров же, диэсрус составляет 92-95 X времени полового цикла, эструс - 6-7 X. В связи с этими особенностями проявления феноменов полового цикла сроки эффективного действия различных гормональных препаратов на кобылах и коровах различны. РекЬмендованные для применения на коровах схемы синхронизации половых функций на лошадях не эффективны и не приемлемы. Добиться синхронного наступления овуляции у кобыл беэ инъекций хорионического 1ч)на^отропина (ХГ) ие удается.
Влияние хорионического гонадотропина (ХГ) на Сроки овуляции у кобыл, находящихся.на разных стадиях созревания лидирующего фолликула в момент введения препарата, изучали яа племен-
- 12 - - • ном поголовье Александровского и Локотского конных,заводов. .Результаты этих исследований приведены в таблице 3.2.
Таблица 3.2
Влияние ХГ на сроки овуляции при введении препарата на разных стадиях созревания фолликула (доза 2500 МЕ)
Стадия созревания 1V . I I Время от инъекции препарата фолликула в.момент) Группы I п (до овуляции (часы) инъекции препарата! . I I----;-----:—------I I I Мл ш, I Ни \ . Ь
2-Я стадия .Контрольная 18 95,3±6,Б9 48-156 7,9
Опытная ■ 18 42.Otl.32 36-64 -
3-я стадия Контрольная 12 43,816,96 24-108 '' 2.0
. Опытная 12 32,813,30 , 18-48 . 4-*я стадия Контрольная 4 19,5±7,68 6-36 0,6 , Опытная 4 13,5±6,Б6 6-36
При введении хорконического гонадотропина кобылам со 2-ой и 3-ей стадией созревания фолликула овуляция у 27 голов (90%) прокзосла в интервале от 24 до 48 часов после инъекции.
Многократное применение хорионического гонадотропина в теленке пяти лет на одних й тех же кобылах кумысной фермы Опытного тонкого завода показало, что эффективность действия пре? парата постепенно понизилась. В первые .четыре года опытов овуляция у всех животных опытной группы - наступала через* 36-48 часов после введения гормона. , На пятом году опытов были отмечены случаи замедленного созревания фолликулов у части подвергнутых инъекциям ХГ кобыл. Достоверных отклонений от нормы по эаиереблкемости, жизнеспособности шребят, вынашиваемости беременности у кобыл опытной группы при сравнении аналогичных показателей у кх контрольных аналогов ке" установлено. В связи с. существенной разницей продоляителыюсти согревания фолликулов у кобыл опытной и контрольной групп ! было произведено: в опытной группе по 1,2 осеменений одной кобылы в цикле, в конт-ро-^коЯ - по 2,7. Разница по эамеребляемости опытных и контрольных даизотных недостоверна (1. - 1,2).
Проведенное комиссионное испытание гонадотропина хориони-
' ' - із - ' •--■.■ - у."' ■'
ческого с участием специалистов Ветфармсовета СССР подтвердило -высокую эффективность действия препарата на процесс созревания фолликула и овуляции у кобыл (таблица 3,4)
■Таблица 3» 4
Результаты комиссионного испытания гонадотропииа хорионического
Группы (Среднее время! - Среднее количество | Зажереб-",
(по, 16 голов) (от инъекции |—---——-—(ляемость
|до овуляции (ректальных (осеменений) в X |(в сутках) (исследований! 1
Опытная 1.8 2*8 ■ 1.0 68.7
Контрольная 4,4' ; .6.4- 2,1 50,0
Разница между достоверна достоверна достоверна не досто-
группами верна
На основании полученных-результатов испытания ХГ комиссия пришла к выводу о его,'сильном синхронизирующем действии на> созревающий в яичниках кобыл фолликул, что и было отмечено в ваключении комиссии. Препарат был рекомендован к применению нр ■ лошадях. . '-■■..-
а 1.3 Разработка схем синхронизации половых Функций кобыл. Применение хорионического гонадотропина позволяет синхронизировать сроки овуляции у кобыл» находящихся в естественном эструсе. . Однако подобрать для работ по трансплантации необходимых животных одновременно находящихся в. состоянии эструса не всегда удается. Поэтому, нами была апробирована методика применения простатландкна в комплексе с хорионическим гонадотро-пином. Еши испытаны - английский препарат "Зквимайт", чешский "Эстрофан", венгерский "Знзалрбст-О". >. Разницы между препаратами по эффективности действия (индуцирования лшеолизиса) нами не.установлено, Такле ке установлено различий меиду группами по продолжительности индуцировакног о эструса. >
В зависимости от сроков несовпадения половых циклов у ко-.Сыл, в првдшествущий опытам период; нами было апробировано четыре схемы их гормональных обработок, с цель» синхронизации*
в'период подготовки к пересадкам'эмбрионов,' Используя.различные комбинации введения аналогов простагландине 'и ХГ удалось добиться необходимой степени синхронности времени овуляции у кобыл-доноров и кобыл-реципиентов независимо от стадии полового цикла на момент начала опытов. -
3.2 Нехирургическое извлечение эмбрионов из матки кобыл-доноров
3.2.1 Осврение и совершенствование методики вымывания зародышей. Первые попытки извлечь эмбрионы из кобыл-доноров нехирургическим методом провели японские исследователи Н Огури и Кв,Тсутсуми (1972). Применив^ разработанную для крупного рога-. ' того скота нехирургическую методику извлечения.эмбрионов на кобылах им удалось извлечь 40Х 4 аародыгаей. Идентичную методику нехирургического извлечения эмбрионов на лошадях применили в своих опытах английские исследователи Аллен и Роусон в 1975 году, в 1974 году Огури и Тсутсумиопубликовали новое сообщение о результатах своих исследований по трансплантации эмбрионов лошадей. Путем модернизации нехирургического вымывания эмбрионов из матки кобыл-доноров авторам;удалось существенно повысить результативность и достичь ВОХ извлекаемости зародышей. -. Принципиальное различие нехирургического метода извлечения зародышей, приведенного в работах Е Огури и Кв.Тсутсуми в 1972 году и Аллена и Роусона в 1976 году с методом, опубликованным Н.Огури и Кв.Тсутсуми в 1974-году, заключается в том, .что.в первом случае инструмент для извлечения эмбрионов вводят в полость ипсилатерального последней овуляции рога матки, во вто-„ ром случае катетер помещают в тело матки ификсируот его • баллончиком сразу за цервикальиым каналом. По первому способу промывается только один рог матки, по второму - вся маточная полость. Увеличение объема промываемой полости матки позволило японским исследователям существенно улучшить результаты извлечения эмбрионов из кобыл-доноров.
В первых опытах . по .вымыванию зародышей методом Огури- Тсутсу ми (1974) мы пользовались инструментом, изготовленным по схеме авторов, приведенной в опубликованной ими статье, 11 июля 1977 года в этих опытах был извлечен нами первый эмбрион. Однако в трех иэ девяти вымываниях, выполненных этим катете-
ром,' нам не удалюсь полностью извлечь залитую в - матку кобылы промывную жидкость. Попытки удалить остатки раствора путем массажа матки через прямую кишку, привели в травмированию слизистой и появлению примеси крови; в: извлеченной жидкости. В дальнейшем/ , опытным путем, на убойном материале было установлено, . что при небольшом количестве и малом .диаметре входных отверстий инструмента слизистая.оболочка матки током жидкости присасывается к катетеру и препятствует полной эвакуации промывной жидкости.; £шю установлено, что при извлечении зкйрио- ' 'нов по принципу Огури-Тсутсуми жесткость инструмента не является обязательным требованием. Поэтому конструкция катетера для вымывания " эмбрионов была; нами изменена.. Трехканальный инструмент был заменен - двухканальным. Наконечник катетера, вводимый в матку кобылы, удлинили на 10-16 см и на нем сделали 10-12 ■ отверстий диаметром 5 мм. В результате этих изменений сумма площади входных отверстий в 2,6 раза превысила площадь.' поперечного. сечения внутреннего магистрального канала катетера. Предложенный инструмент измененной конструкции был изго- / товлен в НИИ резины и применяется нами беэ существенных иэмене нийдо настоящего времени.' При применении катетера этой конструкции промывная жидкость самотеком эвакуируется из матки кобыл-доноров почти полностью (в полости матки остается макс»-" Мум ЭО-35 мл жидкости).. Ни одного случая травмирования слизистой н появления крови в промывной жидкости отмечено не Оы-ло. Извлечение зародышей из кобыл-доноров проводили'в станках обычной конструкции,; применяемых для зооветеринарных обработок лошадей, обычно, при извлечении эмбрионов кобылы ведут себя спокойно. Это позволяет сделать вывод о том, что вымывание зародышей применяемым методом не вызывает у опытных животных бо~ левых ощущений. Опытами установлено, что в связи с анатомическими особенностями строения родополовых путей кобыл, . катетер для извлечения эмбрионов удобнее вводить маноцервикальным.. методом. В целях защиты руки исследователя и вводимого инструмента" от'случайного загрязнения при прохождении преддверья влагалища». надеваем сверху полиэтиленовый чехол одноразового применения. Пэсле введения кисти руки во .внутренний участок влагалища кобылы передняя часть чехла разъединяется и катетер проталкивается в цервикальный канал. Для выяснения вопроса о том/ в каких порциях промывной жидкости чаще извлекается эмб-
• - 16 - . рион. и'период освоения методики вымывания '(1977-1978 годы) был поставлен специальньйГзксперимент. Вэтих опытах удалось установить, что в первом приеме вымывания извлекаются 70Х эмбрионов, повторном - Й5Х, третьем - бХ. Яэзтому в методику извлечения зародышей было введено правило обязательной трехкратной перфузии матки кобыл-доноров.
3.2. £ Многократное извлечение эмбрионов и воздействие процедуры выпадания на последующую плодовитость кобыл-доноров.
Многократное проведение' опытов по извлечению зародышей освоенным ' нехирургическим методом на одних и тех же животных показало возможность извлечения большого числа, эмбрионов от кобыл-доноров в течение длительного времени без вреда'для их последувдэй плодовой деятельности. В отдельные годы некоторые опытные, кобылы были подвергнуты процедуре вымывания зародышей' а-большинстве проявленных половых циклов. В качестве примера интенсивного использования доноров в таблице 3.6 приведены .данные по вымыванию зародышей из кобыл Хлопуши, Богини и Бо" гии.
ГОсле такого интенсивного и многократного использования . вышеперечисленных . кобыл в опытах по извлечению зародышей все они сохранили нормальную плодовитость. Многократной процедуре вымывания эмбрионов были подвергнуты и другие кобылы опытной группы. ?ах, кобылу Черепицу в течение нескольких лет опытов промывали 46 раз, извлекли £4 зародыша; кобылу Дикцию - 30 раз, извлекли 20 "зародышей; Капу - 23 раза, 17 зародьссей( Пиф-ку - 25 раз, 22 зародит В 1Э85 году, из кобылы-донора Пи£ки в течение одного года было извлечено : 14 .зародышей. Все опытные кобылы в период проведения исследований нормально теребились. Причем, кобылы Дикция и Пифка выкашивали трансплантированных хюребят. Эти Секты свидетельствуют о том, что освоенная нехирургическая методика вымывания зародышей позволяет извлекать Бмбриокы многократко без вреда для последующего племенного использования кобыл-доноров,
В опытах 1677-1989 гг- вьШ1 получены интересные результаты по прододлительности меяэстрального периода у кобыл, подвергнутых процедуре промывания матки с целью извлечения эмбри-
Таблица а 5 Результаты извлечения эмбрионов из кобыл Хюпуши, Богини и Богии
N |
поло-|-
вого i цикла |-
Кличка кобылы
Хлопуша
I
Богиня
Богия
Ідата игвлё-|регуль-|дата иэвле-|резуль-|дата извле-[резуль |чения |тат |чения |тат | чения |тат
1 10;02.78 + 7.01.83 + 31.0а84 + .
г 1.0а78 + 26. 02. 83 ■ - 21.04.84 +
з 1а 04.78 + го.оаез ■ 11.05.84 '+
4 ' £9.04.78 ; 4 8.04.83 . - . ' 1а 07.84 +'
6' а 06. 78 + * 26.04.83 - 9.06.84 +
6 Б.07.78 + 20.05.83 + . 8.09.84 +.
7 20.0 (. 78 ++ 4. Об! 83 + ,4.11.84 ++ ■
8 1а 10.78 - 27. Об. 83 + 19.11.84 слу-
9. 7.12.78 . + 12. 07.83 - ■ чена и оставлена
10 27.12.78 9.09. 83 + ' ■ ' меребой
11 28. 09. 83
12 6.11,83 . ++
13 * 26.11.83 +
14 , 18.12.83 ■ - .
Итого 10 вымываний 10 эмбрионов 14 вымываний . 9 эмбрионов 7 вымываний 8 эмбрионов
Примечание: + - извлечен один эмбрион. ■ \ ++ - извлечено два эмбриона
- - эмбриона нет.: ■' .
онов. Результаты этих экспериментов,приведены в таблице а 6.
• Таблица 3. б Продолжительность межэстрального периода при вымывании эмбрионов в разные сроки после овуляции (опыты 1077-1880 гг.)
Сроки извлечения | Эмбрион найден | Эмбрион не найден I-—-—- ..'■-'
- | п | М + ш | п | М ± ш
Через в суток после \
овуляции г 16,Ь ,. 4 16,3
Через 7 суток 22 . 16 і 1,02 16 17 ±1,0
Через 8 суток • ; 17 16 ± 0,74 12 ■ .16+1,1
Через 9 суток 31 ■■■ • . 17 ± 0,4 12 ' 16 ± 0,9
Через 10 суток 3 • 16,7 • 1 16 ,
Через 11 суток 2 32 '2 18
В этой таблице приведены продолжительность межэстрального периода у нобыл-доноров в половых циклах, в которых были изв-> лечены эмбрионы (т. е.. доказан факт их результативного оплодот-: ворения),. и в циклах, в которых зародышей не оказалось (скорее всего, кобылы оказались не оплодотворенными). Установлено, что при выполнении процедуры вымывания, спустя 6-ю : дней после овуляции, продолжительность межэстрального периода существенно, не различается и находится в обычных пределах.
3.2,3 Влияние различных Факторов на уровень извлекаемости зародышей из матки кобыл-доноров. Исследования по выяснению 'Влияния возраста извлекаемого эмбриона на результативность вы- . мывания выполнены в период с 1977 по 1980 год. Зародыше этих экспериментах извлекали .через 6-11 суток после 'овуляции. Ре-, эультаты опытов приведены в таблице 3.7. " '
Анализ данных этой таблицы показывает,. что эффективность освоенной нехирургичесной методики зависит от возраста- извлекаемого эмбриона. Так, в 6 вымываниях, выполненных через 6 дней' после овуляции у донора, найдено всего 2 эмбриона (33,ЗХ), а через 7 дней после овуляции уже в 38 опытах'найдено 22 зародыша (67,9Х). ' Возрастание результативности освоенной методики извлечения эмбрионов на 7 день после овуляции у доно-
ра. ■ видимо-, объясняется переходом развивающихся зародышей из л ; Таблица 3.7 Результаты извлеадния эмбрионов в опытах 1977-1980 годов .. . --.— :--—;-;—г—у—--:—I----Г"---:- ■
Возраст эмбриона (время от 1 Кол-во|Найдено | Процент овуляции до извлечения) ; | опытов)эмбрионов) извлечения
6 суток .6 ... '3 ■ 33,3
7 суток зв 22' '.-' 67.9
8 суток 29 17 ' Б8.7 -
9 суток 43 V 31 .:*,'. 72.1 ..
' 10 суток. -4 . -3 V 76,0
. 11 суток ■V... • 4 50.0
Итого :. 124 * 77 62,1
яйцеводов в полость матки. -Некоторое увеличение числа найденных эмбрионов от 7-го к-9т!<у дню связано с их размерами.- На' - восьмой-девятый день развития зародыши достигают 1-2 миллимет7 ров в диаметре и становятся хорошо видишми в промывной дид- -кости невооруженным глазом.. Это; в свою очередь, уменьшает ве-.
• роятность'потерь эмбрионов в процессе их поиска. Одиннадцатидневные - бластоцнсты достигают больших размеров и при их извлечении, видимо, с трудом проходят через входные отверстия катетера. В последующих опытах мы полностью отказались от извлечения зародышей в крайние сроки (б и 11 дни после овуляции) и в . .опытах 1961-1985 годов'/полностью перепит на вымывание 8-0 дневных эмбрионов. . ' . - ; .
Анализ результатов извлечения эмбрионов после, осеменения кобыл-доноров тремя различными способами - естественной случкой,' искусственным осеменением свежей спермой и искусственным осеменением криоконсервированной спермой (данные этого анализа приведены в таблице 4.19) показал, что наивысшая их оплодотворяемость ' достигается при искусственном осеменении кобыл свеней спермой (74.3Х). Достаточно высокий процент извлечения зародышей получен и после естественной случки (66,71). '
:: При искусственном осеменении криоконсервированной спермой . результативность извлечения вародытей достоверно снижалась. У
Более высокая оплодотворяемость кобыл при их искусственном осеменении свежей спермой, по нашему мнению объясняется боль-• Таблица 3.8
Зависимость результативности извлечения эмбрионов из матки кобыд-доноров от технологии их осеменения'(1978-1692 годы)
-----і-:-г--1-;—
Технология осеменения | Количество IИзвлечено|Извлекав-
I опытов |эмбрионов|мость в X
J_;_і______ і_
Естественная случка 336 224 66,7
Искусственное осеменение
свежей спермой 309 230 74,3 .
Искусственное осеменение
криоконсервированной спермой 59 , . 27 46,1.
Итого - 704 481 68,3
шей точностью места введения семени под контролем руки исполнителя. С целью уточнения параметров воздействия физиологических факторов на результативность• осеменения кобыл-доноров нами, совместно, с аспирантом И. Л. Чернышевым был проведен опыт по осеменению кобыл разными разовыми дозами спермы. Проверяли три ' объема разовой дозы спермы - 20, 10 и б мл. Результаты этого эксперимента приведены в таблице 3.9.
' Таблица 3.9
Взаимосвязь объема дозы спермы при осеменении кобыд-доноров и результативность извлечения зародышей
----1—т——|—--л—:———I-;---.
Объем довы( Число | Число (Извлечено(Результативность спермы (активных (опытов |эмбрионов(извлечения эмбрионов : (мл) (спермиев 1 I - I в X .
((млн/дозе( (
.,*,•* . ■ .' _I________
20 300 8 6 75,0> 17,67
10 300 8 5 62.6 ± 21;65
'6 300 8 3 37,5 ± 27,95
Проведанные опыты показали, что при уменьшении объема ра-вовой дозы спермы на осеменение кобыл происходит снижение его
результатов. Эти данные полностью согласуются с данными других исследователей. Одновременно этот эксперимент показал, что применение нехирургической методики извлечения зародышей позволяет существенно .упростить проведение исследований по искусственному осеменению.лошадей и . повысить репрезентативность поставленных опытов. .
В течение 1978-1685 годов нами было проанализирована изв- . лекаедасть эародыавй из матки кобыл-доноров в зависимости от времени года. Данные этих исследований' приведены в таблице
■ з.ю. . . /' - . -' ■ . . *... .■ ■
Таблица, 3.10
Поквартальные изменения извлзкавмостн зародышей ив кобыл-доноров С1978 - 1665 годы)
^ I ~Т I
Показатели Г Кварталы года | -
Т.. ' - -1-1-:-1-1 Итого
II I II I III I- IV |
-:-:_I-_I-1-1_;_-
Всего выполнено процедур
вымывания эмбрионов 84 138 ее 86 404 ."'
- Извлечено зародышей 61 82 56 41 230
X извлечения ' 60,7 59,4 58,3 47,6. " 50,0
Из данных таблицы 3.10 следует, что извлекавмость эмбрионов из. кобыл-доноров достаточно стабильна в течение' года и только в конце года (4-ом квартале) несколько снижается.
3. з Поиск, оценка и хранение эмбрионов во внешних условиях
ч
3.-3.1 Отработка приемов поиска зародышей в промывкой жидкости. Эмбрионы млекопитающих, в-том числе и лошадей, - отличаются тем, что в процессе своего роста- и развития они с возрастом из разряда микрообъектов, поиск которых возможен только /С. помощью специальных.оптических приборов, постепенно, вырастают в макрообгекты, хорошо видимые невооруженным глазом. В таблице 3.11 приведены сведения о размерах извлеченных зародышей разного возраста.
■ Таблица 3.11 Размеры извлеченных эмбрионов лошадей
-:-:-—---1—-1-:-•—:-—
Возраст эмбрионов { п |" Диаметр в им
1 ■■ н———•—' '
. I I . М ± т . ..
б суток 7 0,147 + 0,007
7 суток .' . 69 0,436 ± 0,096 .
8 суток 311 0,973 ± 0,112,
9 суток 83 2,182 ± 0,133
10 суток 9 , 4,4 ± 0,571
Большой неожиданностью для Нас явилось то, . что эародыши лошадей рано освобождаются от блестящей оболочки (Zona pelluotda) и начинают быстро (существенно интенсивнее, чем зародыши других, видоз млекопитающих) увеличиваться в размерах, продолжая сохранять шаровидную форму. Сведения о стадийном развитии извлеченных нами зародышей лошадей,приведены в таблице 3.12. . , • -
Таблица 3.12 *'
Стадии развития извлеченных эмбрионов .
*-;—г—-7-;-г-—-. ' -
Возраст (Всего иэвле-| В том числа —
эмбрионов(чено эмбрш-1-1——-—;---' [ " —
"( нов (Шрула) Ранняя бла-. |Расширяю- |Шэдняя
| | [стоциста |щаяся блас-(бласто-
• | II (тоциста : [циста
*_;____1__:_I_;___|_:___I... . ._.„•. '
6 суток 7 '1 2 2 2
7 суток 69 - 2 1 66
8 суток . 311 - ■ : . 311
. л С 1977 по 1990 год шести- и семи-суточные эмбрионы отыскивали в осадке промывной жидкости, после 20-30 минутного отстаивания. Семисуточные зародыш иногда удавалось обнаружить в промывной жидкости невооруженным глазом (около 10 X), на чада 7-и суточные эмбрионы находили с помощью стереоскопического
• - 23 -
микроскопа ИБС-0. с 1990 года при поиске 6-7 - суточных эмбрионов применяли, метод фильтрации. Способ и время поиска эмбрионов разного возраста приведены в таблице 3.13.
. Таблица 3.13 ■
Способы и время поиска эмбрионов разного возраста
—--—:— I --1—(-:—;---~-
Возраст эмбриона| ' Способ поиска ) Среднее время поиска
I - .... I эмбриона ■ _ ■_~ _| __
6 суточные - Осаждение и микроско- •■ 41 минута 1 пирование - ■ - ■ .
6 суточные ■ Фильтрация и микроско- ..■.".
пирование' 27 минут
7 суточные 'в основном осаждение й '
" микроскопирование 34 минуты
7 суточные : в основном фильтрация и
микроскопирование ." 22 минуты
8 суточные ' Часто (801) невооружен-
ным глазом ' . 3 минуты
• О суточные Невооруженным глазом менее -1 минуты 10 суточные Невооруженным глазом Все зародыши, кроме
первого обнаружены в
■ ' - ^ ' процессе вымывания
- Из приведенных в'этой таблице сведений видно, что время поиска эмбрионов лошадей \в промывной жидкости зависит (г их возраста, А это,естественно, связано с их размерами.
Анализируя полученные в процессе освоения нехирургическо-
• го метода извлечения и отработки технологических приемов по-, иска эмбрионов лошадей мы сделали вывод о необходимости разработки.оригинальных (отличных от рекомендованных для зародышей других видов) способов краткосрочного хранения зародышей 1п у1Ьго.:Требовалось разработать быстрый способ оценки жизнеспособности поздних бластоцист (экспандированных) и на основе этого прогнозировать результаты последующих пересадок.
3.3.2 Оценка жизнеспособности экспандированных бластоцист. "... В целях стандартизации показателей при' разработке; метода оценки качества зародышей по морфологическим признакам и упрощения технологий' трансплантации мы обработали полученные све-
дення о размерах и описанию внешних признаков по 394 зародышам лошадей, в том числе 311 - 8-суточного и 83 - 9-суточного возраста. Средние размеры 8-и дневных зародышей составили 0,973 л 0,112 мм', 9-к дневных - 2,182 ± 0,133 мм. Подавляющее большинство зародышей при их оценке под микроскопом ЫБ09 были полупрозрачными, имели правильную шаровидную форму, четко выраг пенную клеточную структуру. Некоторые извлеченные 6-9 дневные зародыши по своему внешнему виду существенно отличались. Они были непрозрачны, матового цвета; внешняя оболочка сильно отделялась от клеточной массы, клетки выглядели сморщенны»» и сжатыми. Их мы.1 отнесли к категории погибших. ; Встретились и несколько зародышей, занимавших промежуточное положение между этими двумя крайними вариантами, которые били оценены нами как сомнительные. Поводом для отнесения помутневяих 'зародышей с . сильно отделенной оболочкой (бластолеммой) и сморщенным» клетками к разряду погибших послужило то, что после' Б-7, часового хранения полупрозрачныхI шаровидных, с четко выраженной кле-'точной структурой эчбрионов с плотно прилегая*!« (и поэтом/ практически • незаметной) внешней оболочкойв фосфатно- солевом буферном растворе Дюльбекко (ИЭС) у пих начинались постепенные изменения внешнего вида. Сначала у таких зародышей становилась все более заметна внешняя оболочка, что вероятно связано с ее отслоением от сообщества клеток. Но клеточная масса продолжала сохранять некоторое время правильную шаровидную форму. ; Затем, изменялся тургор клеток и они сморщивались. .Сообщество клеток эмбриона превращалось в комочек неправильной Форш. Цвет бластоцисты постепенно из полупрозрачного становился мутят (матовым). На основании опытов, по продолжительному хранению эмбрионов в ФБС-среде, мы сделали вывод о том, :. что изменения внешнего вида эмбрионов связано с их гибелью в неадекватных условиях существования. Наиболее важными морфологическими показателями качества зародышей являются: степень прозрачности бластоцист, целостность и состояние оболочек и хорошая выра-хйнкость клеточной массы. Поэтому в настоящее время ш разделяем 8-9 дневные зародыши на 3 категории: 1) жизнеспособные; 2) погибшие; и 3) сомнительные. После получения результатов культивирования зародышей в дедточно-солевой среде и пересадок кобылам-реципиентам. ш пришли к выводу о том, что размеры эмбрионов при их оценке не оказывают существенного влияния на их.
V, ч.;-,-,;:-.--,25 - ,
жизнеспособность.
Жизнеспособные зародыши полупрозрачны, имеют четкую шаровидную или слегка эллипсоидную форму, хорошо выраженную массу клеток, четко различающиеся эмбриобласт и трофобласт. Оболочка (бластолемма) плотно прилегает'к клеткам по всей поверхности и при осмотре под микроскопом практически ие видна.
Пэтибвиеэмбрноны ве прозрачны, клетки сморцзны и сгруппированы в одив штовый комок, оболочка (бластолекма) сильноот-делена от клеток.
Сомнительные зародыши полупрозрачны, клетки имепт правильную шаровидную форму, оболочка (бластолемма) местами, а иногда и по всей поверхности заметно отслоена от клеток. * .V Ниже ( в таблице а 14) приводим данные оценки свежвизвле-ченнъй 8-9 дневных зародышей за весь период проведения опытов.
Таблица 3.14 Оценка_8-9 дневных зародышей (1979-1992 гг)
Показатели -г-1 п 1 BZ
Всего извлечено 8-9 дневных зародышей 1 1 1 394 \ 1 1 100 .
В том- числе отнесено 1 живых к категории '( сомнительных- | погибших . -34S 16 - 36 87.1 3,8 \ Q.1
На основании данных таблицы а 14 напрашивается вывод о том,- что около 10Х зародьгаей гибнет в организме осемененных кобыл до 8-9 дня своего эмбрионального развития. По-видимому, это обычный уровень эмбриональной смертности для конских зародышей на этой стадии развития.
3.3.3 Хранение эмбрионов лошадей во внешних условиях.
. Проведенные опыты по изучению изменений внешнего вида 8-9 суточных бластоцист при их непродолжительном хранении в' различных жидкостях дали толчок к разработке способа культивирования эмбрионов лошадей in vitro. 1&ми, совместно с ЛФ. Лебедевой был предложен и защищен * авторским . свидетельством СССР N14977216, веданным Г апреля'1989 года,' "Способ получения хиа-неспособных поздних бластоцист лошадей". Главным элементом-8а-
■ - 26. - -о/'
питы авторским сыисетельством явилась среда, включающая а свой состав 20-605 желтка куриных-яиц, 0-60Х кипяченого молока;кобыл и/или 0-60Х фосфатно-солевого буферного раствора (ФБС). Помещенные в эту среду поздние бластоцисты лошадей продолжают интенсивно-расти при температуре +37*С.
Для определения оптимальных соотношений вводимых в среду компонентов использовали принцип треугольной трехкомпонентной . диаграммы ГНОбса-РоэеОома. В одной серии опытов готовили 21 вариант" среды с 201-ным интервалом концентрации базового раствора (ФВС), лэлтка и молока.. Всего провели две серии опытов. В первой серии опытов зародыши культивировали в течение 12 ,часов, а эо второй -в течение 24 часов. Фхаконр со средой по--мещага в термостат для подогрева до оптимальной температуры. Извлеченные 8-дневные'эмбрионы лошадей пипеткой переносили в испытуемую культуральну» среду иинкубировали при температуре 37®С. До и после культивирования проводили оценку и измерение эмбрионов под микроскопом ИБО9. Интенсивность роста бласто-цист в проверяемых средах приведена в таблице 3.16.; Наилучший^ результат получен при культивировании в среде 6 (601 желтка и 401 С£С).- Стабильный рост бластоцист наблюдали в среде 7 (601 молока и 401 дэлтка) и в среде 8 (40% молока, 40Х яэлтка и 201 ФВС). Шнее стабильный результат культивирования эмбрионов ло-,шадей был отмечен в средах 4, 5, 0, 10, 11, 12, '13, 14,16.
Анализ результатов культивирования (таблица 3.16) показывает, что бластоцисты развиваются как при 12 часовом, так и при 24 часовом культивировании, причем рост в средах оптимального состава (среды-б, 7 и в) стабилен. При просмотре под микроскопом у всех прокультивированных в этих средах зародышей, каких либо отклонений от нормы ке отмечали. Клетки трофобласта и дмбриобЛаста четко выражены» зародыши полупрозрачны,-правильной шаровидной формы. Помещение в чистый желток или &ВС-раствор эмбрионы не растут. При осмотре под микроскопом у них обнаруживают признаки дегенерации.
Во время проведения опытов по' разработке . оптимального состава культуральной среды неожиданно бшю обнаружено, что эмбрионы о нормальной клеточной структурой, поменянные а.среды, содержащие желток и молоко кобыл всплывают к поверхности жидкости и приближаются к стенкам стекляного сосуда, где могут
Таблица 3.15 .
■■ ' Интенсивность роста бластоцнст в средах разного рола
-г'"".—-:—■-———--—-5-;-:-
номер(Соотношение »шгрндиентов, в X(Интенсивность роста бласто-
среды|——:—-г—'——--1-:-1 цист 4
I молоко | желток | ФЕС |—-;—•—|-:-
| | | |лри 12 часовом Гпри 24 часо-
| | | - . | культивировании (вом культи-
I ■ I | | (вкровании
:_I_—_..I—'.,_—I---1---1__
1 : -1оо ;о , 0
г 20 80 " .. - ■ : 380,0 ,132,3
3 80 20 -и 329,6 0
4 40 60 244,8 270,3
В . 20 60 20 66,7 667,9
в 60 40 326,9 906,5
7 . ■ 60 40 ■" - * 204,9 643,9
8 ' 40 ■ - 40- • ° 20 313,9 744,7
9 ' 20 40 40 33,2 764,9
10 ' , * - - ■ 40 60 205,6 244,0
11 во 20 ■'-- 240,4 , 268,1
12 60 ". / Г 20 20 298,9 342,2
13; ; 40 20 , 40 173,0 609.7
14 20 20 60 23,8 526,6
16 20 80 266,7 618,4
16 100 - ■' :. 76,1 0,
17 80 ' 20 60,0 163,3
16 60 40 125,0 114,3
10 40 . - 60 139,6 90,1
20 . -20 - 80 . 0 . • 0
21 Л' 100 0 ' 0
быть легко обнаружены визуально. Эмбрионы с нарушенной клеточ- ' • ной структурой постепенно, погружаются в толщу жидкости. Кроме . - того, -плавающие у поверхности бласгоцксты аа период культивирования сум&ственно увеличиваются в размерах, опустившиеся в толщу жидкости зародыш не растут.
В настоящее время, под нашим руководством готовит к ввщл-
- 2Ь - . ,
те кандидатскую диссертацию соискатель Н. В. Сидорова. Тема ее работы,- "ранение и транспортировка бластоцист лошади". В проведенных экспериментах установлено, что жизнеспособность эмбрионов лошадей в пёлточно-солевой среде (50 х желтка + 50 2 ФБС) сохраняется в довольно широком диапазоне плюсовых температур (от +10 до +40*С) (таблица 3.16).
; . ■ ■ Таблица 3.16 ■ Влияние хранения при различных температурах в течение 24 часов на 8 - 8,5 суточные эмбрионы
Темпе-) I серия (повторкость) | II серия (повторность)
рагура!---—I—--~Н — ■■■■■ -I-* - -г——-
экспо-(Началь- (Конеч- (Оценка за-(Началь-,¡Конеч- |Оценка заро-зиции |ныЯ раэ-|ный }родьдо . |ный раз-|ныЯ (дыша после (С) ; (мер за- (размер (после 1 мер за- [размер |опыга (родыша (зароди (опьгга (родьша (зароды-1 |( в мм) (оа(мм)| ((в мм)' (ва(им)Г
+42 1.0 0,95 Погиб 1,25 1,0 ПОГИО
+40 1.0 2,0 Жизнеспособен 0,75 1,75 Жизнеспособен
+38 1,0 2,075 Жизнеспособен 0,6 0,85 Жизнеспособен
+3б' 1,05 2,25 Жизнеспособен 0.7 1,16 Жизнеспособен
+34 0,75 1,45 Жизнеспособен 1,8 2,0. Жизнеспособен
+32 1И 2,0 Лизнеспособен 0,925 1.225 Жизнеспособен
+30 1,05 1.1 Погиб " 1.2 1.1 • ГЬгиб
+28 . 1,35 1,75 Жизнеспособен 1,45 1.62 Жизнеспособен
+26 1.7 Жизнеспособен 0,55 0.7 Сомнителен
+24 0,9 1,22 жнзнеспо-' собен 0,9 0,75 Погиб
+22 0,85 1,075 . Жизнеспособен 1,325 1,375 Жнзнеспо-. собен
-т-:-1——---І'--—:-:-1—--—І---Л-
1 12 І З І 4 І 5 16 | 7 _■ ■ "" ' ' " ' '-1_-■ і--1—-1_,_
+20 ■ 1,0 1,2 . Жиэнеспо- .. 1,0:
' собен
+10 1,6 1,76 . Яйзнеспо- 0,6
_ собен
+8 0,926 - . Погиб 0,676
+6 • 0,6 - : Пзгиб 0,676
+4 ,1,16 - ■: ІЬгиб Втер- 0,825 0,826 Сомнителен* мое© с • . ■ -тащим'",
льдом ; " . •" • ,
1,0 .ІЬгиб
0,66 ' Жизнеспособен ^0,6 Погиб . 0,676 Жизнеспособен .
Оба эмбриона, хранившиеся а течение 24 часов при температуре +42*С погибли, 10 зародышей, хранившихся при температуре от +32 до +40*0-сохранили жизнеспособность, из 12 амЗрионов, подвергнутых воздействию температур от +20 до +30»С, 4 погибли,- 1 оценен как сомнительный и 7 - жизнеспособных. К сожалению из-за технических, ограничений нам не удалось провести опыты по хранению эароДшей в зоне температур от +12 до +18®С. № 8 эмбрионов, находившихся 24 часа в термостате при температуре от О до +10®С,'4 погибли, 1 оценен как сомнительный и 3 ж: га-неспособные. " •
3,4 Пересадка эмбрионов кобылам-реципиентам.
Проведенную нами научно-исследовательскую работу по освоению и совершенствованию нехирургического тргнецерв«пального метода- пересадки эмбрионов в матку кобыл-реципиентов условно, можно разделить на 4 этапа.
Первый этап. (О 1978 по 1981 год). В этот период было выполнено 48 попыток пересадок зародышей от кобыл-доноров кобы-дам-реципиентам. -Все 48 пересадок оказались безрезультатными. , В первых опыта» по трансплантации зародышей мы пользовались рекомендованным..для кратного ' рогатого скота прибором Кассу, вводимого коровам ректо-цервикальным методом в шеидатерадьный
к ' функционирующему. желтому тел? рог матки. Вероятно, из-за анатомических и гистологических особенностей строения ПОЛ шх органов кобыл этот способ введения инструмента оказался т; :ш-моопасным для лошадей й поэтому не эффективным.
Второй этап. (1981-1986 годы), в этот период времени было выполнено 54 пересадки - зажеребело 11 кобыл-реципиентов. \ Получено 10 жеребят-трансплантатов. У одной кобылы-реципиента жеребость оборвалась выкидышем неустановленной этиологии. Результативность пересадок в этот период составила 20,42. Этот этап исследований был посвящэн освоению методики* пересадок * и получению первичных данных об оптимальных биологических пара-' метрах технологии трансплантации зародышей у лошадей.
Третий этап. (1986-1987 годы). ; В течение этого времени, основное внимание уделяли совершенствованию метода и его-адаптации к производственным условиям. Шло произведено 28 пересадок - зажеребело В кобыл-реципиентов (32,12). Установили, что замена дефицитной Детальной сыворотки крови крупного рогатого скота на Доступный явлток куриных яиц в пересадочной среде не скидает результативность пересадок. Внутримышечное введение потенциальным реципиентам раствора изокссуприн лактата с целью блокирования спазматических сокращений миометрия в период введения эмбриона достоверно и существенно повысило результативность опытов.
Чэтвертый этап. (1988-1992 годы). В эти годы в 24 . пересадках . у 17 кобыл-реципиентов наступила беременность (70,ВХ), Этот период научной работы по трансплантации эмбрионов лошадей характеризуется устойчивым высоким уровнем прижив-ляемости трансплантатов. Часть пересадок зародышей в 1992 году Выполняли по заказам производственников ва плату. Практически |ьчался этап внедрения технологии трансплантации эмбрионов в фактику коннозаводства. : ■
|. 3.4.1 Влияние различных Факторов на результативность пе-¿ЁЁЗНЦЦ. После освоения нехирургического метода трансплантации вмбрионов в матку кобыл-реципиентов (с 23 марта 1981 года)нами было выполнено 106 пересадок. "Для выяснения оптимального места аппликаций зародыша, глубину введения пересадочного инструмента в матку кобыл варьировали. Данные этого эксперимента приведена в таблице 3.17. * *
- зі - ■■ .г"- / *
■■У' Таблица 3.17
■Результативность пересадок при различной глубине введения инструмента в матку кобыл-реципиентов
.---—-.--—-..-—■■•■, ■--■—"——г—-~"Г~—■—;-
■; Глубина введения инст румент а і Выполнено|Заявребело |Результати-■■■..'.' : - |пересадок|реципиентов(вность в X :_-і___;________і__;_л__;_і_;_і_;—
V Глубокая (10-12 см за церви- 44 . ,2 4,6
кадьный канал) ' " ■ ■ ■ ■ ■
Средняя (Б-9 см за цервикадь- 38 У 18у 47,4
ный канал) У ^
Неглубокая (2-4 см за церви- 24 17 ч 70,8 ,
кальный канал) ' '—.
> • . -.ні ' - • „
Итого V : ; 106 37 . 34,9
Излученные результаты опьгга по месту введения эмбриона в матку реципиента свидетельствуют о том, что при пересадках ва-родышей кобылам трансплантат должен быть помещен в прилегапгий к цервикально'му каналу участоктела матки. Разница между группами достоверна
V В опытах были выполнены пересадки"семи-, восьми- и девя-- тисуточных бластоцист". Сведения о результатах трансплантации эмбрионов в зависимости: от их возраста даны в таблице'а 18. ' фактически, уровень приживляемости во всех возрастных группах / был близок к среднему показателю^
Таблица 3.18 • Цриживляемость бластоцист разного возраста ' . ~
Возраст пересаживаемого .заро-. дыша I-Г--—г—--:—I- |Выполнено|Заяеребело|результатиз-|пересадок(реципиент, (ность в X
7-й суточные бластоцисти 12 - .4 33,3
8-й суточные 70 27 38.6
9-й суточные ... 24 6 25,0
■■" итого . 106 37 34,9.
Разница между группами недостоверна. В последние годы мы
'' ■ / - 32 -
перешли к пересадкам в основном 8-8,5 суточных бластоцист. В этом возрасте эмбрионы лошадей достигши: уде достаточно больших размеров - 0,973 + 0,112 мм в диаметре (см. табл. 3,11). Это позволяет проводить пересадки эмбрионов бег использования стереомикроскола. Достаточно большие размеры 8-и суточных бластоцист позволяют ускорить их поиск и перенос в пересадочную среду. Они хорошо видны в заправленной для пересадки пайе-те, даже в непрозрачной желточно-солевой пересадочной среде. По месту, положения бластоцист в столбе пересадочной среды в пайете можно судить -об ■ их ' жизнеспособности (жизнеспособные всплывают, погибшие опускаются вниз), размеры 8-8,5 суточных эмбрионов позволяют использовать серийно выпускаемые инструменты для трансплантации эмбрионов крупного рогатого; скота. 7 суточные бластоцнсты ет$ очень малы (0,43в£0,096 мм в диамет-—ре). Их трудно обнаружить в жидкости невооруженным глазом. Они становятся практически неконтролируемыми в непрозрачной желточно-солевой пересадочной среде, затрачиваемое на пересадку время сильно затягивается, а это в свою очередь, может снизить 1 результативность работы. 9-и суточные эмбрионы, наоборот, достигают ут чрезмерно крупных размеров (2,182±0,133 мм в диаметре) . Jlpii пересадке 9-и суточных бластоцист применение для. пересадок, йа лошадях'серийно выпускаемых инструментов становится невозможным. ' Повышается риск травмирования бластоцист в процессе манипулирования Ь ними in vitro.
.Применение гормональных препаратов.с целью синхронизации половых .функций доноров и реципиентов не всегда позволяет добиться наступления одновременной овуляции у обеих кобыл. Это может бить связано с функциональным состоянием обрабатываемых: животных, многократностью применения препаратов и другими факторами. Анализ результатов трансплантации эмбрионов"за все, годы работы (таблица 3.10) показал, что у лошадей допустима большая степень асилхронности половых циклов при пересадках, чем у крупного рогатого скота и овец. Достаточно большая амплитуда допустимой асинхронности половых функций кобьщ-доноров и кобыя-реципиентов при пересадках позволяет значительно упростить технологию подготовки животных к трансплантации. В 1G82 году мы практически отказались от воздействий гормонами на половые процессы кобыл-доноров и ограничились однократным внутривенным введением хорионического гонадотропного гормона
(ХГ) любой находящейся в охоте потенциальной кобыле-реципиенту в день овуляции у намечаемого для пересадки донора. Овуляция у подвергнутой такой обработке кобылы-реципиента обычно происходит через 36-48 часов. , '
Таблица аіе
Результаты пересадок эмбрионов в зависимости от степени синхронности половых циклов кобыл-донороэ "л кобыл-рецияиектоз
■-—---——-г--—-1--—:--г—---
Степень синхронности ову-|Количество ІКоличество(Результатив-ляции у доноров и реципи-1 пересадок | керебостей | ность зХ -ентов (в сутках) \ | (
_і;_I___1_;_■ ' _-
-3 - 6 ; . 3 60,0
-2.6 2 0
-2 18 , 7 38,9
-1.6 13 4 30,8
-1 * зі ' 13 41,9
-0.6 6 3 60,0
0 25 6 24,0
+0,6 ■ 4 1 25,0
+1 .. ■ ./:•' і. ' - 0
+1,6 і 0
Итого 106 37 34,9 '
Знаком (-) помечена такая асинхронность половых' функций, когда овуляция у кобыш-донора наступила раньше, чем у kj6u-лы-реципиента. Если! овуляция у реципиента наступила раяьш 'донора ,то поставлен энакплюс (+).
Одной из . вероятных причин; снижающих пригшвляеыость трансплантатов в матке кобыл-реципиентов могут быть спазматические сокращения миометрия.: спровоцированные неадекватный раздражением рецепторов влагалища и цервикального канала в ш-мент введения инструмента с пересаживаемым эмбрионом. С целью блокирования нежелательной реакции яивотного в 1886-1687 годах был проведен опыт по введению кобыгам-реципиентам перед пересадкой эмбриона киорелаксаята "Ханегиф'Ч В опытных пересадках перебость наступила у 6 из 8 обработанных Ханегифом косил- реципиентов. . в контрольной группе зажеребела одна. Разница
между группами достоверна.
3.6 Беременность, роды и последующая плодовитость ко-. ■ \ ' і, / был-реципиентов.
Беременность кобыл-реципиентов устанавливали ректальным методом в общепринятые в коневодстве сроки. Первую проверку на жеребость проводили на 25 день развития плода (через 17 дней после пересадки). Вторую - на 45 день (через 37 дней после пересадки). Третью (заключительную) - на 5-6 месяце беременности. Однако первым признаком наступления или наоборот отсутствия беременности было нарушение или сохранение половой цикличности у кобылы-реципиента после пересадки/выявляемое по ее поведению на "пробе", при общении о жеребцом-пробником.
Из 37 жеребостей кобыл-реципиентов 33 беременности завершились нормальными родами ~и 4-аборта. Три аборта произошли осенью (в .том числе 2 - на 6-ом месяце и один - на 7-ом месяце) Один аборт произошел в феврале месяце (на 9-ом месяце). В _ эти яе сроки наблюдались аборты у интактных кобыл Опытного конного завода, на территории которого размещена экспериментальная коншня ВНИИКа.
За 25-ЭО дней до ожидаемых родов у всех 33 кобыл было отмечено "начало налива вымени. К моменту выжеребки степень налива вымени достигала максимума. У 17 кобш1 реципиентов за сутки до родов на кончиках сосков*были обнаружены сгустки высохшего молозива (молозивные пробки), послабление связок таза, припу-хание наружных половых органов в предродовой период были хоро-. то выражены у всех ожеребившихся кобыл-реципиентов. У 11 кобыл рода прошли в отсутствии обслуживающего персонала, поэтому ход родового процесса у них оказался не проконтролированным. - 22 кобылы-реципиента «єробились в присутствии людей. В 21 родах зафиксировано переднее предлежание л^ребят-трансплантатов, в1; - заднее. Ни одного случая неправильного, мешающего родам, ■ члекорасполояения плодов не зификсйровано. 27 выжеребок кобыл- реципиентов произошли в темное (ночное) время суток'и б- -в дневное. Роды протекали быстро. Необходимости в оказании акушерской помощи кобылам не было ни в одном случае. . У 31 'кобылы послед отделился самопроизвольно. У 2 кобыл, для удаления вадержавюегося последа потребовалось вмешательство ветеринар-
; > ■ - ^Vv; г зз -■ ;:■. ного специалиста. •
Продолжительность беременности кобыл-реципиентов с учетом сроков эмбрионального! развития трансплантатов в организме ко-Оылы-донора (+ 8 ¿уток) была в пределах нормы - 335,9 ± 4,9 суток. '.у ■; V : '-■:'"-'■' ■ ■,
Все кобылы-реципиенты, кроме одной,в течении первых двух недель после выжеребки проявили' нормальный"эструс. Кобыла Дикция проявила первую охоту через два месяца после родов. Плодовитость кобьи-реципиентов после •родов жеребят-трансплантатов сохранилась в норме. Часть бывших кобыл-рецнпиентов посла выжеребкибыла передана в производяаяй состав, кумысной фермы Опытного конного завода. Часть - использовали в опытах в качестве доноров эмбрионов. Части кобыл повторно пересадили эмбрионы. Ш два трансплантата было получено от кобылы-реципхекта Лозы, кобылы Н 006, кобылы N OOS, Опытная кобыла Проекция,; бу-денновской породы была использовала в экспериментах и в качестве донора, затем" -реципиента1 и, после выягребхи трансплантатом - , снова донорол ; Опыты по извлечению ипересад; кам эмбрионов проводили и-ра виргйнных кобылках, й на недавно ожеребившихся кобылах, и . .на длительно.холостекхЕИх по разным причинам животных. Уровень приживляємости трансплантатов в катке: гинекологически здоровых кобыл,, по нашим наблюдениям, одинаков ДЛЯ'всех групп ЖИВОТНЫХ (виргинных, ОЖЭребИВЕИХСЯ в текущем году, холостых).
6.1 выводы ;
■ 1. Разработана нехирургическая технология трансплантации эмбрионов лошадей. ■ Суп$ственными особенностями которой являются: ' '
многократное извлечение эмбрионов из кобыл-доноров а как-, дом следующем друг, за другом .половых циклах, '
пересадка 8-й суточных поздних (экспандированных) бласто-
■ ЦИСТ, . " .
использование пересадочной.среды, содержащей 40-60Ї шгт-ка куриных яиц, -
синхронизация половых циклов кобыД посредством хоркоки-ческого гонадотропного гормона. *
2. Многократное извлечение эмбрионов из матки кобыд-доно-
pos позволяет получить несколько (до 14) зародышей в течение года от одного животного без вреда для его здоровья й последующей плодовой деятельности иотказаться от разработки методов вндуцкрозаняя полиовуляции. . ...
3. Екэкеспособкыз 7-9 -и суточные бластоцисты лошадей су-цэствешгостлячавтсЕ по внешнему виду, прозрачности и удельной кассе от погибших* Жизнеспособные эмбрионы имеют правильную сзрозидауо или слегка эллипсоидную форму, плотно прилегающую к клеткам трофобласта внешхю оболочку (бластолемму), полупрозрачна. При погруяэнии в иелточно-солевую среду (имеющую в своем составе 20 и более процентов желтка) жизнеспособные бластоцисты всплывают к поверхности. Погибшие эмбрионы по внешнему зиду напоминают спуиэнный мяч, внешняя обблочка (бяастолемма) сильно отслоена от клеточной массы, комок клеток бластоцисты мутный (матового цвета). При переносе в же лточно-солевую среду* когибске зародыши погружайтея в толшу жидкости.
4; 8-и и 9-и дневные'бластоцисты лошадей быстро увеличиваются в размерах и в этом возрасте из разряда микрообьектов переходят в! разряд макрообьекгов; становятся хорош видимы в промырной шдкости невооруженным глазом, что позволяет исключить кинроскопирование при пересадках. '
-6, Добавление к фосфатно-солевому раствору (ФБС), либо к кобыльему молоку 20-60Z юелтка куриных яиц позволяет успешно культивировать 7-9 суточные эмбрионы лошадей in vitro в,течение нескольких (от 1 до 3) суток.
б. Хранение- 8 -я суточных лошадиных зародышей в желточ-'ко-солевой среде (50Х яелтка и 50Z ФЕС) в интервале температур' од +32 до +40*С обеспечивает высокую сохранность и способствует интенсивному увеличению их размеров. Снижение ■ температуры ниш +32*С приводит к подавлению роста бластоцист. Сохранность зародышей при понмдошшх температурах ухудшается.
7. Введение хорионического гонадотропного гормона (ХГ) подготавливаемым к пересадкам кобылам в фолликулярную фазу Еструса обязательно. Без шгьекции хорионического гонадотропина овуляция у обрабатываемых кобыл наступает в неконтролируемые сроки, разновременно и необходимой степени синхронности их половых циклов добиться не удается.
'8. Сезонные изменения интенсивности овариашгой функции яичников кобьи связаны с возрастными и наследственными особен- .
ностяии и условиями обитания конкретного ккаотно'го. нобшы советской и русской тяиеловоэаыг пород проявляет В Т6Ч9КИ9 rosa болы» половыж циклов, чемизтккдокскоЯ и будеяновской пород. Русские рысветые кобылы вакииэпр пр этому показателю. ■ про«эсуточное тюлои?ю1е. ■'■;■* \ :.' .
.' 9. Прииехярургмческих пересадках эмбрионов кобыхаа-рэци-пиентаи пересадочный иястру»энт необходимо вводить каяо-цэрзи-калыши методом"неглубоко' (на' 2-4 см) в тело матки. \ .■' ; 10. превентивное введение (га 16-20 минут до пересадка) шокссуприпз лзктата кобылам- реципиантам# повыгаэт проиаляз-мость.эмбрвонов-трансилантатов.
11. Беременность,' роды и-лактация кобал-рвцжпсэятоэ протекает /'.■■■ нормально. : Рост и развитие /полученных - пэра-бят-трансплантатов ве отдичвотся от сверстников. ' ,'* .
првдошия производству
. Разработай, рассмотрен, одобрен Ученым Советом ВНИИ коневодства и ; предлояеа для внедрения проект рекомзкд^ий по трансплантация эмбрионов лошадей в производственных усгсйшяг.
Список основных опубликованных по теш1 диссертации
;■;'..:": ;*.'' .Г-' . научвцт работ: '
1. Shilova А. V., Platov E.U -and Lebedev S.G. ' The usa of Human Chorionic Gonadotropin ror Ovulation Date Regulation in ttares//Proc. 8 int.Cong.'Anlia Reprod. and Art if. Insen Krakov, 12-16 July 1970.- P. 331 ; '
2. СМлова A.R , Лебедев С.Г. Роль гормональных факторов в регудяции процесса созревания фолдякулов у кобыл к , применение хориояического гонадотролива для ускорения овуляции// Кв-вестия ТСХА.- 1978.- N5.- С. 176-184. '.-.V', .
. 3. Лебедев CMY, >Ьлахоэа Т.е. Результаты освоения ке-хирургнческого метода- извлечения ранних вибрионов из матки ко^ бш/ Научные тр. БНИИК "Воспроизводство и улучшение плэиен-ных качеств конского поголовья". - 1979. - С.69-73
.'4. Лэбедев С.Г, Влияние хорданического гонадотропина на воспроизводительные функции кобыл/ Научные тр. ВНИИК "Резервы . развития и повышения эффективности 'коневодства". - , Рязань. -.. .1070. - С. 27-33 , . . ; I , Г
'6.. Лебедев С.Г., Григорьев М.Ю. О механизме оЬуляции у кобыл/ Научные тр. ВНИИК "Селекция и технология выращивания v лошадей в конных заводах". - 1981. - С. 92-98
. б. Lebedew S.O. Unblutige Elgewinnung beim Pferd/ Pro«. ; 30 Internat. Fachtag, fur " Fortpfl. .und ■ Besamminp. - Wals;: '(Osterreich) 24-26 Septeirber 1981.
7. Лебедев С.Г. Нехирургическая пересадка эмбрионов в , коневодстве/ Материалы 33 ежегодной конференции ЕАД. 16-19 августа 1982.- Ленинград. ' . ' ; '* ■
8. Лебедев С. Г. , Малахова Т. С. , Синхронизация времени овуляции у кобыл/ Научные тр. ВНИИК "Биологические 'основы технологии коневодства". - 1982. - С. 48-56 , i ;
9. Лебедев С. Г. Васин А. Д., Силаева ИД.,.; Результаты комиссионного испытания хорионического гонадотропина// Ветеринария, - «3.- 1983.- С. 64 ■■' ; '
10. Лебедев O. P. ; Способ определения оплодотворяющей , способности спермы жеребца.. Авт. свид. СССР N1090384, J9B4.
II/ Лебедев С. Г. Многократное использование кобыл-доноров для трансплантации эмбрионов/ Научные тр. ВНИИК "Достижения . физиологии и их применение в коневодстве".- 1984. - С. 107-116
12. Лебедев а Г., Малахова Т.е.» Сидорова Н. В. ■ Нехирургический метод перекоса ранних эмбрионов в матку кобыл-реципиентов/ Научные тр. ВНИИК "Интенсификация коневодства". - 'l985. -С.?0-79 ' ■ ■ ; ." ■ ■ ; / ■■''..
13. Лебедев С, Г,, Малахова Т. С., Сидорова Н. В, Физиологические основы метода трансплантации зародышей.у лошадей (Од-ношюдие кобыл)/ Научные тр. ВНИИК "Дгти ускорения научно-технического прогресса в коневодстве". - 1986. - С. 133-141 ;
14. Лебедев С. Г. , Лебедева Л.Ф. Способ получения жизнеспособных поздних бластоцист лошадей. Авт. свид. СССР N1497216, 1969. \ ■.:" * / :
15. Лебедев С. Г., Лебедева Л. & Культивирование экспонди-рованных бластоцист лошадей/Научные тр. ВНИИК "Интенсификация селекции и технология выращивания^лошадей".- 1988.- С.202-209'
■■.■■' 16, Чернышов И. Л., Лебедев С.Г. Условия отбора кобыл-доноров эмбрионов/ Об. научн, тр. НИИ племенного дела "Биотехнология воспроизведения и биотехнологические методы разведения с.-х. животных".- 1989,- С. 1Б2-1Б4
17. Лебедев С. Г., Храброва Л. А.. Малахова Т. С., Сидорова Н.Е Совершенствование технологии пересадок эмбрионов нехирургическим методом/ Научные труды ВНИИК "Новое в технологии
; коневодства и коннозаводства". - 1990.- С. 34-51
18. Лэбедев С. Г. О сезонности размножения лошадей/ Научные тр. ВНИИК "ПУтя повышения1племенных, .спортивных, рабочих и продуктивных качеств лошадей". - 1992. - С. 140-152
19. Лебедев С. Г.» Сидорова-Н.ЕГ. Влияние температурного фактора на жизнеспособность бластоцист лошадей/ Научные труды ВНИИК "Цуги повышения племенных, спортивных, рабочих и продукт тивных качесть лошадей". - 1992, - й162-160
Подписано к печати 4.05.94 Тирад 100 .
Закав .^36 Объем 20 л.
- Лебедев, Станислав Гурьевич
- доктора биологических наук
- Дубровицы, 1994
- ВАК 03.00.13
- Трансплантация эмбрионов лошадей
- Морфогистологическая характеристика развития эмбриона лошади в зародышевый период
- Культивирование бластоцист лошади in vitro
- Биотехнологические методы повышения продуктивных качеств овец бурятского типа забайкальской тонкорунной породы
- Современное состояние и перспективы совершенствования русской верховой породы лошадей