Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансплантация эмбрионов лошадей

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Трансплантация эмбрионов лошадей"

Р Г Б ОД

' ' " " " ' к

• I

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА (ВИЖ)

На правах рукописи УДК 612.646.02

ЛЕБЕДЕВ Станислав Гурьевич

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ ЛОШАДЕЙ

03.00.13 — Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

п. Дубровицы, Московской области 1994 г.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории физиологии размножения лошадей Всероссийского научно-исследовательского института коневодства

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки России,

доктор биологических наук, профессор А.А.Алиев

доктор биологических наук, профессор Н.И.Сергеев

доктор биологических наук, профессор А.А.Ласков

Ведущее учрехднение :

Всероссийский научно-исследовательский селекционно-генетический институт

Защита диссертации состоится 1994 г.

_часов на заседании специализированного совета Д.020.16.02 при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства

iCL

Адрес института: 142012, Московская обл.,Подольский район, пос. Дубровицы

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан , АНОД ■1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

П.АНауменко

1. ОЕП{АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы. В последние десятилетия, в связи с бурным развитием техники, народно - хозяйственные требования к количеству и качеству разводимых в нашей стране лошадей значительно изменились. Направления совершенствования поголовья отдельных конских пород по хозяйственно - полезным признакам, в настоящее время, требуют существенной корректировки.Однако, характерная для коневодства, замедленная по сравнению с другими видами животных сменяемость поколений, продолжительная беременность и резко выражнное одноплодие. кобыл, высокая стоимость выдающихся животных усложняет племенную работу, сдерживает темпы селекционного процесса в породах. Поэтому, наряду с применением обычных методов селекции,. все большее значение для совершенствования пород лошадей приобретают приемы ускоренного размножения особо ценных животных. В частности - трансплантация ранних эмбрионов.

Решаемые посредством технологии трансплантации эмбрионов вопросы в коневодстве аналогичны проблемам в других отраслях животноводства. Это - повышение интенсивности размно,тения генотипов выдающихся самок, совершенствование пород с ограниченным генофондом, сохранение оригинальных мутаций. Но, з. коневодстве есть и своя специфика. Хозяйственное использование лошадей часто не способствует интенсивному размноиению выдающихся по работоспособности животных. Например лошади, победители крупных всероссийских и международных соревнований по конному спорту, как правило совсем устраняются из племенной работы или возвращаются в конные заводы угй в преклонном возрасте с подорванным здоровьем, когда возможность получения от них потомства становится проблематичной. Применение методов трансплантации эмбрионов, в этой ситуации, освободит от необходимости изъятия из спорта на длительный срок выдающихся кобыл, связанного с беременностью .й позволит получать от них приплод без вреда для их дальнейшей спортивной карьеры.

Методы трансплантации эмбрионов от самок - доноров самкам - реципиентам хорошо разработаны в скотоводстве и уже широко

внедряются в производство. Однако, попытки механического перенесения приемов ускоренного размножения, разработанных на других видах животных, 9 коневодство часто оканчиваются неудачами. -Особенности анатомического строения и физиологии половьп функций вносят существенные коррективы в разработку приемо! случки и искусственного осеменения, пересадки эмбрионов, регулирования половой цикличности кобыл. Часть этих особенностей известна и хороню изучена, другая - вдет своего времени.

Практически, на всех этапах единого процесса воспроизведения (оогенеэ, овуляция, оплодотворение, ранний и поздний эмбриональный период) у лошадей выявлены существенное своеобразие и отличительные видовые особенности. И это, естественно, повлияло на стратегию исследований и технологических решена при выполнении научной работы по трансплантации эмбрионов I коневодстве. Наиболее существенными особенностями воспроизводительных функций кобьш, влияющих на разработку методоз трансплантации зародышей по сравнению с самками других видое являются:

1 Резко выраженное одноплодие.

2. Существенные отличия нейро-гуморальной регуллц® половой системы.

3. Сезонность размножения.

4. Повышенная интенсивность миграции плодов по маточной полости конематок в период ранней беременности.

5. Задержанная, по сравнению с другими видами, имплантация плодов.

6. Полноценное развитие фолликулов, овуляция и образование желтых тел второго порядка во время жеребости.

7. Отличия анатомического и гистологического строения половых органов, плаценты и плодов.

1.2 Цель и задачи работы

С целью разработки, совершенствования и внедрения в практику коннозаводства, приемлемого для производственных условий метода трансплантации эмбрионов лошадей были поставлены следующие задачи исследований:

1. Изучить сезонные и возрастные изменения половой цикличности кобыл разных пород в условиях континентального климата

Центральной России,

2. Разработать параметры отбора животных для работ по трансплантации в группы кобыл-доноров и кобыл-реципиентов.

3. Выяснить характер изменений концентрации лютеинизирую-щего гормона (ЛГ) в крови кобыл в фолликулярную фазу полового цикла.

4. Определить оптимальные сроки, дозировки, кратность применения хорионического гонадотропного гормона (ХГ) для синхронизации половых функций кобыл.

5. Предложить и апробировать несколько схем синхронизации сроков овуляции у кобыл-доноров и кобыл-реципиентов в зависимости от степени несовпадения их половых циклов.

6. Освоить и усовершенствовать нехирургический метод извлечения эмбрионов из матки кобыл-доноров, позволяющий многократно извлекать зародыш из одного и того же животного в течение ряда лет без вреда для его здоровья и последующего племенного использования.

7. Определить физиологические факторы, влияющие на результативность извлечения зародышей.

8. Предложить способы оценки качества зародышей.

9. Разработать способ продолжительного хранения эмбрионов in vitro при плюсовых температурах в жизнеспособном состоянии.

10. Освоить нехирургический трансцервикальный метод переноса эмбрионов в матку кобыл-реципиентов.

11. Апробировать в опытах по пересадкам зародышей изокссуприн лактат (Ханегиф) - препарат, временно подавляющий моторику матки.

12. Проанализировать ход беременности кобыл-реципиентов и качество полученных в опытах шребят-трансплантатов.

1.3 Научная новизна и теоретическая значимость исследова-ИИЙ- Впервые выяснено, что переход кобыл от случного сезона в состояние межсезонного анэструеа может наступить как в астральную, так и в лютеальную фазы полового цикла. И это, в последующем, влияет на их половое поведение и реакцию на введение экзогенных гормонов в начальный период следующего случного сезона. Определены возрастные особенности сезонных изменений половой цикличности у кобыл.. • Установлено постепенное снижение эффективности действия хорионического гонадотропного

гормона на сроки созревания лидирующего фолликула при его многократном и многолетнем применении на одном и том же животное.

Описаны изменения внешнего вида 7-9 суточных бластоцист лошадей при их хранении в неадекватных условиях внешней среды.

Считаем, что разработанная нами в соавторстве с Л Ф. Лебедевой (авторское свидетельство СССР N 1497215) среда для культивирования поздних (экспандированных) бластоцист лошадей, главной составной частью которой является тлток куриных яиц является серьезной теоретической базой,для серии новых исследований в области раннего эмбриогенеза млекопитающих. Выясненная в этих опытах необходимость включения в культуральные среды для 7-9 суточных эмбрионов лошадей 20 - 60 % желтка куриных яиц наводит на мысль об отсутствии существенных ви-доспецифичных факторов в секретах маточных желез кобыл на этой стадии ранней беременности.

Впервые, рекомендован при нехирургических пересадках эмбрионов лошадей миорелакеант - изокссуприн лактат. Установлено, что из-за высокой интенсивности миграции ранних эмбрионов по маточной полости кобыл эффективнее неглубокое введение трансплантата при пересадках.

_ 1. 4 Практическая значимость. Разработаны и предложены для внедрения в производство рекомендации по нехирургической трансплантации эмбрионов лошадей, которые позволяют существенно повысить интенсивность размножения выдающихся кобыл. Методика трансплантации эмбрионов является единственно возможным способом вовлечения в племенную работу выдающихся по спортивным достижениям в классических видах конного спорта (конкур, троеборье, выездка) кобыл. Считаем, что технология трансплантации эмбрионов должна быть включена в селекционные программы при работе со спортивными породами лошадей (тракененская, ганноверская, гольштинская, буденновская, УПГ и др.).

1.5 Основные положения диссертации, вынесенные на защиту.

- Возрастные и породные особенности сезонных изменений интенсивности воспроизводительных процессов у кобыл.

- Отличительные (по сравнению с другими видами животных) принципы синхронизации половых циклов у лошадей.

- Критерии оценки жизнеспособности поздних (экспедированных) бластоцист лошадей по размерам, внешнему виду и удельной массе.

- Способ продолжительного (до 2А часов) сохранения зо внешних условиях эмбрионов лошадей з лизиеспосоЗном состоянии.

- Особенности нехирургической трансплантации змбриокоз кобылам-реципиентам, позволяющие достигнуть наивысшей результативности пересадок.

1.6 Объем работы. Диссертация изложена ка 245 страницах машинописного текста, содержит 42 таблицы» 18 рисунков. Список использованной в работе литературы содержит 302 источника.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Намеченные цели и задачи научной работы по теме "Трансплантация эмбрионов лошадей" были решены путем постановки серии опытов на племенном и пользовательном поголовье ВНИИ коневодства, Опытного, -Старожиловского, Александровского, ЛЬ-котского, им. с. и. Буденного и им. Первой Конной Армии конных заводов России.

Схема опытов

Н I Перечень изучаемых вопросов! Объем работы!Задачи экспери-ояыта! I ! мента

1 ! 2 ! 3 1 4

1. Вменение сезонных и возрастных изменений половой цикличности кобыл разных пород и разного физиологического состояния в условия х континентального климата Центральной России

Регулярный Разработать па-

контроль за раметры отбора

половой цик- кобыл-доноров и

личностью ко- кобыл-реципиек-

был опытной тов группы в течение 16 лет

2. Изучение характера измене- Опыт проведен Выяснение меха-ний концентрации ЛГ в кро- на 3-х кобы- низма регуляции

ви кобыл в фолликулярную фазу полового цикла

лах

процессов овуляции у кобыл

3. Определение действия ХГ на Две группы Изучение пара-

время овуляции при введении препарата на разных стадиях созревания фэлли-кула

кобыл (опытная и контрольная) по 34 головы в группе

метров эффективного применения препарата

Выяснить влияние разных доз ХГ на воспроизводительные процессы кобыл

2 серии опы- Изучение паратов: I серия метров зффектив-поставлена на ного применения 40 кобылах, препарата П-на 44 коб.

б. Анализ эффективности действия разных способов введения ХГ кобылам

39 кобыл разделили на 4 группы (1 контроль-

Изучение параметров эффективного применения препарата

ная, 3-опытные)

8. Изучение последствий мно- 2 группы ко-

гократного применения ХГ был (опытная,

на одном и том из «квот- контрольная)

ном в течение нескольких по 10 годов

лег в группе

Изучение. параметров эффективного применения препарата

7. Комиссионное испытание эффективности применения хорионического гонадотро-пина для синхронизации сроков овуляции у кобыл

2 группы ко- Апробация ХГ в был (опытная, производственных контрольная) условиях по 16 голов в группе

1 I 2

8. Применение синтетического аналога простаглан-дина для синхронизации эструса у кобыл

9. Проверить несколько схем синхронизации сроков зет-руса и овуляции у кобыл посредством инъекций про-стагландина и ХГ

10. Освоить нехирургический метод извлечения эмбрионов из матки

кобыл-доноров .

11. Апробировать многократное извлечение зародышей из одной и той же кобылы-донора в течение ряда лет

3 ! 4

Проведено 3 Сравнить "Экви-серми опытов майт", "Эстро-на 58 кобылах фан",

"Энзапрост-®''

Проверено 4 схема обрабо ток на 64 парах кобыл

Цюведеко 7 Сравнить 2 кз-вымываний по вестных спосо-Аллену-Роусону ба извлечения и 7 по Огури- зародышей из Тсутсуми матки кобыл

В обработку Выяснить возмож-взяты резуль- кость получения таты 273 большого кол-ва вымываний кз эмбрионов из 21 кобылы одной кобылы-донора

Разработка оптимальных схем синхронизации половых функций

12. Изучить изменения морфологических признаков и размеров ранних доимпланта-ционных эмбрионов разного возраста

Оценили 7 Разработать шка-

эмбрионов лу оценки качес-

б-ти дяев. тва змбркокоз

возраста, 69 разного возраста

эмбрионов 7-и

днев. ,311

эмбр. 8-и дн.

83 эмбриона

9-м дн. и 9

эмбрионов 10-и

днев. возраста

1 1

.2

А

13.'ВЬКСШТЬ возюжости про-долгнтелького хранения эмбрионов m vitro в сре-' sas ¡разжчкого состава •

Зьу.о постав- Шкопить необхо-леко 40 дикыэ знания для

опытов разработки спо-

собов хранения &мбриноз

14.Разработать способ кухъти-вированкя змбркокоь. хоеадей

Совестно с

аспиранткой Л, О. ХеОадэзой зып0дк8к0 4 серий опытов на 21 варианте сред

Преяломйть способ хранений змбриокоз лошадей

15.Освоить нехирургический метод перекоса лошадиных эмбрионов в матку кобыл-реципиентов

Всего вылоя- Получить кибых

нено 154 >ï.->-1ofir--'-.-пересадкк эмбрионов

гхэ ребят-трансплантатов

16. Выяснить влияние различ- 106 пере-ных факторов на прижив- садок ляекость трансплантатов

Повысить уровень прияиа-ляешсти трансплантатов

17. Апробировать разработак-ныэ рекомендации по трансплантации эмбрионов гошадей

Довести исследования по трансплантации эмбрионов до этапа внедрения метода в практику коннозаводства

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Синхронизация кодовых функций кобыл

3.1.1 Изучение половой цикличности. Проведение регулярного круглогодичного контроля воспроизводительных функций кекаребьос кобыл в условиях опытов по трансплантации эмбрионов позволяло обратить вникшие на ряд известных и неизвестных ранее особенностей их половой цикличности.

Количество регулярно проявляющих зструе {находящихся " состоянии половой активности) холостых кобыл а зимние месяцы существенно меньше (40-50%), чем в летние (75,6-89%). Имеатся заметные колебания показателей половой активности лошадей по годам. В отдельные годы сезонность размножения у холостых кобыл в наших опытах была вырзиэна резче (1978,-1382, 1989, 1902 годы), з другие годы этот признак был более сглажен (19фЗ, 1984, 1985 годы). Анализ полозой активности конкретных опытных кобыл-доноров этой ие группы иивотных за ряд лет, проведенный под нашим руководством аспирантом И. -Л Чернышевым показал, чгс у кобыл имеются возрастные особенности овариальной активности связанные с сезонностью. Было установлено, что у старых кобыл (14-20 летнего возраста) продолжительность кегжезонкого аиэигрального периода существенно длиннее, чем у иивотных более молодого возраста (190,8±30,4 суток -у старых ответных; 107,1+31,2 суток - у двухлеток; 97,3^25,3 суток - у кобыл 3-8 летнего возраста и 91,3±24,1 суток у 7-13 летних яивоткых.

Существенные ментоловые различия половой активности холостых кобыл, з наших опытах, коша объяснить возрастным составом группы животных только частично. Частично, зероят::оь повлияли погодные условия и кормовые факторы, а частично - породные отличия. Сведения об овариальной активности кобыл разных пород приведены в таблице 3.1.

. Таблица 3.1

Количество проявленных полноценных половых циклов в течение года кобылами-донорами разных пород.

! Количество! Количество! Среднее количество Порода I голов 1 плодовых I половых циклов в

I ! лет (течение года

Русская рысистая 10 28 9,3 ± 1,7

Русская тяжеловозная 6 17 11,7 ± 1.9

Советская тяжеловозная 12 26 12,4 ± 1.1

Вуденновская и донская 6 18 8,4 ± 2,6

Больше количество проявленных в течение года половых циклов советскими тяжеловозными кобылами (таблица 3.1) объясняется коротким, а часто даже полным отсутствием межсезонного анэстрального периода у животных этой породы. У буден-новских и донских кобыл сезонность размножения выражена резче. Лошади русской рысистой породы занимают по этому показателю промежуточное положение.

Изучающие сезонность размножения лошадей исследователи обычно обращают внимание на период перехода кобыл из состояния межсезонного анэструса к 'половой цикличности. Период же перехода кобыл от сезона размножения в межсезонное анэстральное состояние в специальной литературе почти не освещен. Проанализировав этот переход у кобыл опытной группы мы заметили, что сезонное затухание половой цикличности может происходить по ■двум сценариям. В одном случае происходит пролонгирование лк>-теальной фазы полового цикла В другом - переход в межсезонное анэстральное состояние может наступить в период эструса. Е этом случае размеры лидирующего фолликула не достигают максимальных размеров и овуляция не.происходит. Обычно через 3-7 дней после качала эструса наблюдается постепенное уменьшение размеров начавшего созревать -фолликула и охота постепенно затухает. У кобылы наступает продолжительный межсезонный анзст-ральный период. По нашим наблюдениям примерно у 3/4 кобыл опытной группы сезонное затухание половых функций отмечали е люггеальную фазу полового цикла (68 случаев из 93 наблюдений) V

• - и -

7 1/4 кобыл - з зстральиую фазу (25 случаев).

Затем, весной, переход кобыл от состояния полового покоя з активное состояние, такие происходил по двум сценариям. Зивот-*ые, перешедшие в межсезонный анэструс в лютеаланую фазу пого-аого цикла, приходили весной в первую охоту с одновременно дозревающим в яичнике лидирующим фолликулом. У уяюдтх дэ з ^«сезонный анэструс кобыл в эстральну» фазу полового цикла» весной наблюдается признаки первой охоты без одновременного развития лидирующих фолликулов в яичнике. Такое состояние ¡проявление охоты без созревающих фолликулов) у них шизт проползаться довольно длительное время (от 2-3 недель до 1,5-2*-месяцев). Но и у кобыл, ушедших в меизезонный анэструс в легальную фазу полового цикла, первая весенняя охота не всегда завершается овуляцией. Отмечено много случаев (около 70%)„ когда начавший развиваться фолликул не- достигает максимума звоих размеров, а через 5-7 дней после качала охоты регрессирует и вместо него начинает созревать другой, а иногда и третий фолликул.

3.1.2 Применение хорионического гонадотропина человека (ХГ) для синхронизации сроков овуляции у кобыл. Выделяемый гипофизом кобыл комплекс гонадотропных горшков существенно отличается от комплекса гонадотропных гормонов выделяемого.гипофизами самок других видов повышенным содержанием ®СГ и дефицитом ЛГ. Поэтому, у кобыл резко изменено соотношение продолжительности разных фаз полового цикла Обычно диэструс у кобыл составляет 16 - 17 суток, эструс - 5 - 6 суток. То-есть, по продолжительности диэструс у кобыл составляет 75 % полового цикла, эструс 25 %. У коров не, дизсрус составляет 92-95 % времени полового цикла, эструс - 5-7 %. В связи с этими особенностями' проявления феноменов полового цикла сроки эффективного действия различных гормональных препаратов на кобылах и коровах различны. Рекомендованные для применения на коровах схемы синхронизации половых функций на лошадях не эффективны к не приемлемы. Добиться синхронного наступления овуляции у кобыл без иньекций хорионического гонадотропина (ХГ) не удается.

Влияние хорионического гонадотропина (ХГ) на сроки овуля- -ции у кобыл, находящихся на разных стадиях созревания лидирующего фолликула в момент введения препарата, изучали на племен-

ном поголовье Александровского и Локотского конных заводов. Результаты этих исследований приведены в таблице 3. 2.

Таблица 3. 2

Влияние ХР на сроки овуляции при введении препарата на разных стадиях созреваний фолликула (доза 2500 ЫЕ)

Стадия созревания 1 Ii Время от инъекции препарата

фолликула в.момент! Группы i п 'до овуляции (часы)

инъекции препарата! ! !--------------------------

1 i ' М + m I lim l' t

2-я стадия Контрольная 18 95,3+6 59 48-156 7,9

Опытная 18 42,0±1 32 36-54

3-я стадия Контрольная 12 48,8±б 96 24-108 2,0

Опытная 12 32,8±3 36 18-48

4-я стадия Контрольная 4 19,5±7 68 6-35 0,6

Опытная 4 13,б±6 56 6-35

При введении хорконического гонадотропкна кобылам со 2-oí и 3-ей стадией созревания фолликула овуляция у 27 голов (90%) произошла в интервале от 24 до 48 часов после инъекции.

Многократкое применение хорконического гонадотропина в течение пяти лет ее одних и тех да кобылах кумысной фермы Опытного .конного завода показало, что эффективность действия прет парата постепенно понизилась. В первые четыре года опытов ову-ляцкя у ЗС8Е етзоткых опытной группы наступала черев? 35-4£ часов посла введения гормона. Ка пятом году опытов были отмечены мучай замедленного созревания фолликулов у части подвергнутых инъекциям ХГ кобыл. Достоверных отклонений от нормь во зааэрзбляеюстк, етзиеспособности жеребят, вынашивавшем беременности у кобыл опытной группы при сравнении аналогичны) показателей у их контрольных аналогов не установлено. 3 связ! с супзественной разницей продолжительности созревания фолликулов у кобыл опытной и контрольной групп было произведено: i опытной группе по 1,2 осеменений одной кобылы в цикле, в конт-. ¡рольной - по 2,7. Разница по заиеребляемости опытных и контрольных швотных недостоверна (t «=1,2).

¡Доведенное комиссионное испытание гонадотропкна хориони-

ческого с участием специалистов Ветфармсовета СССР подтвердило высокую эффективность действия препарата на процесс созревания фолликула и овуляции у кобыл (таблица 3. 4)

Таблица 3. 4

Результаты комиссионного испытания гонадотропина хоркокического

Группы ¡Среднее время | Среднее количество { Зажереб-

(по 16 голов)¡от инъекции |-,- -1 ляемость

|до овуляции |ректальных ¡осеменений! а %

¡(в сутках) |исследований| [

Опытная 1,8 2,8 1.0 68,7

Контрольная 4,4' .5,4- 2,1 50,0

Разница меяду достоверна достоверна достоверна не досто-

группами верна

На основании полученных результатов испытания ХГ комиссия пришла к выводу о его сильном синхронизирующем действии на созревающий в яичниках кобыл фолликул, что и было отмечено в заключении комиссии. Препарат был рекомендован к применению на лосадях.

3.1.3 Разработка- схем синхронизации половых функций кобыд.

Применение хорионического гонадотропина позволяет синхронизировать сроки овуляции у кобыл, находящихся в естественном зструсе. Однако подобрать для работ по трансплантации необходимых кивотных одновременно находящихся в состоянии эструса не всегда удается. Поэтому, нами была апробирована методика применения простагландика з комплексе с хорионическим гонадотро-пиком. Были испытаны - английский препарат "Эквимайт", чешский "Зстрофан", венгерский "Зкзапрост-©". Разницы между препаратами по эффективности действия (индуцирования лютеолизиса) нами ке установлено. Такдэ не установлено различий медцу группами по продолжительности индуцированного зсгруса.

В зависимости от сроков несовпадения половых циклов у кобыл, в предшествуюгций опытам период, нами было апробировано четыре схемы их гормональных обработок, с целью синхронизации,

в период подготовки к пересадкам эмбрионов. Используя различ ные комбинации введения аналогов простагландина Р^ и ХГ уда лось добиться необходимой степени синхронности времени овуля ции у кобыл-доноров и кобыл-реципиентов независимо от стади полового цикла на момент начала опытов.

3.2 Нехирургическое извлечение эмбрионов из матки кобыл-доноров

3.2.1 Освоение и совершенствование методики вымывания за родышей. Первые попытки извлечь эмбрионы из кобыл-доноров не хирургическим методом провели японские исследователи Н. Огури Кв. Тсутсуми (1972). Применив, разработанную для крупного рога того скота нехирургическую методику извлечения эмбрионов н кобылах им удалось извлечь 40Х зародышей. Идентичную методик нехирургического извлечения эмбрионов на лошадях применили своих опытах английские исследователи Аллен и Роусон в 197 году. В 1974 году Огури и Тсутсуми опубликовали новое сообще ние о результатах своих исследований по трансплантации эмбрио нов лошадей. Путем модернизации нехирургического вымывания эм брионов из матки кобыл-доноров авторам удалось существенно по высить результативность и достичь 90% извлекаемости зародышей Принципиальное различие нехирургического метода извлечения за родышей, приведенного в работах Н. Огури и Кв. Тсутсуми в 197 году и Аллена и Роусона в 197Б году с методом, опубликовании Е Огури и Кв. Тсутсуми в 1974 году, заключается в том, что первом случае инструмент для извлечения эмбрионов вводят в по лость ипсилатерального последней овуляции рога матки, во вто ром случае катетер помещают в тело матки и фиксируют его бал лончиком сразу за цервикальным каналом. По первому способ промывается только один рог матки, по второму - вся маточна полость. Увеличение объема промываемой полости матки позволил японским исследователям существенно улучшить результаты иэвле чения эмбрионов из кобыл-доноров.

В первых опытах по -вымыванию зародышей методом Огу ри-Тсутсуми (1974) мы пользовались инструментом, иэготовленнь по схеме авторов, приведенной в опубликованной ими статье. 1 июля 1977 года в этих опытах был извлечен нами первый эмбрион Однако в трех из девяти вымываниях, выполненных этим катете

ром," нам не удалось полностью извлечь залитую в матку кобылы промывную жидкость. Попытки удалить остатки раствора путем массажа матки через прямую кишку привели к травмированию слизистой и появлению примеси крови в извлеченной жидкости. В дальнейшем, опытным путем, на убойном материале было установлено, что при небольшом количестве и малом диаметре входных отверстий инструмента слизистая оболочка матки током жидкости присасывается к катетеру и препятствует полной эвакуации промывной жидкости. Было установлено, что при извлечении эмбрионов по принципу Огури-Тсутсуми жесткость инструмента не является обязательным требованием. Поэтому конструкция катетера для вымывания эмбрионов была нами изменена. Трехканальный инструмент был заменен двухканальным. Наконечник катетера, вводимый в матку кобылы, удлинили на 10-15 см и на нем сделали 10-12 отверстий диаметром 5 мм. В результате этих изменений сумма площади входных отверстий в 2,5 раза превысила площадь, поперечного сечения внутреннего магистрального канала катетера. Предложенный инструмент измененной конструкции был изготовлен в НИИ резины и применяется нами без существенных изменений до настоящего времени. При применении катетера этой конструкции промывная жидкость самотеком эвакуируется из матки кобыл-доноров почти Полностью (в полости матки остается максимум 30-35 мл жидкости). Ни одного случая травмирования слизистой и появления крови в промывной жидкости отмечено не лило. Извлечение зародышей из кобыл-доноров проводили в станках обычной конструкции, применяемых для зооветеринарных обработок лошадей. Обычно, при извлечении эмбрионов кобылы ведут себя зпокойно. Это позволяет сделать вывод о том, что вымывание зародышей применяемым методом не вызывает у опытных животных болевых ощущений. Опытами установлено, что в связи с анатомическими особенностями строения родополовых путей кобыл, катетер для извлечения эмбрионов удобнее вводить маноцервикальным методом. В целях защиты руки исследователя и вводимого инстру-лента от случайного загрязнения при прохождении преддверья ¡лагалища, надеваем сверху полиэтиленовый чехол одноразового фименения. После введения кисти руки во .внутренний участок ¡лагалища кобылы передняя часть чехла разъединяется и катетер [роталкивается в цервикальный канал. Для выяснения вопроса о ■ом, в каких порциях промывной жидкости чаще извлекается эмб-

рион, В период освоения методики вымывания (1977-1978 года) был поставлен специальный, эксперимент. В этих опытах удалось установить, что в первом приеме вымывания извлекаются 70% эмбрионов, повторном - ¿5Х, третьем - 57,. Поэтому в методику извлечения зародышей было введено правило обязательной трехкратной перфузии матки кобыл-доноров.

3.2.2 Многократкое извлечение эмбрионов и воздействие процедуры вымывания на последующую плодовитость кобыл-доноров.

Многократное проведение опытов по извлечению зародышей освоенным иехирургическим методом на одних и тех жэ животных показало возможность извлечения большого числа, эмбрионов от кобыл-доноров в течение длительного времени без вреда для их последующей плодовой деятельности. В отдельные годы некоторые опытные, кобылы были подвергнуты процедуре вымывания зародышей в большинстве проявленных половых циклов. В качестве примера интенсивного использования доноров з таблице 3.5 приведены .данные по вымывании зародышей из кобыл Хлопуши, Богини и Богам.

Шсле такого интенсивного к многократного использования вышеперечисленных тобыл в опытах по извлечению зародышей все они сохранили нормальную плодовитость. Многократкой процедуре вымывания зй5рионоз были подвергнуты и другие кобылы опытной группы. Так, кобылу Черепицу в течение нескольких лет опытов промывали 46 раз, извлекли 24 зародыша; кобылу Дикцию - 30 раз, извлекли 20 зародышей; Мапу - 23 раза, 17 зародышей; Пиф-ку - 2В раз» 22 зародыша. В 1985 году из кобылы-донора Пифки в течение одного года было извлечено 14 зародышей. Есе опытные кобылы в период проведения исследований нормально теребились. Причем, , кобылы Дикция и Пифка вынашивали трансплантированных гхерэбят. Эти факты свидетельствуют о том, что освоенная нехирургическая методика вымывания зародышей позволяет извлекать эмбрионы многократно без вреда для последующего племенного использования кобыл-доноров.

В опытах 1977-1980 гг. были получены интересные результаты по продолжительности кеюстралького периода у кобыл, подвергнутых процедуре промывания матки с целью извлечения эмбри-

Таблица 3. 5 Результаты извлечения эмбрионов из кобыл Хлопуши, Богини и Богии

N | Кличка кобылы

поло-1--;-:-

вого | Хпопуша | Богиня | Богия

цикла |-1-;-1-

|дата извле-¡резуль-|дата извле-|резуль-|дата извле-\ревуль |чения |тат ¡чения |тат | чення |тат

1 10. 02. 78 + 7. 01.83 + 31.03. 84 +

2 1.03. 78 + 25. 02. 83 - 21.04. 84 +

3 13. 04. 78 + 20. 03. 83 - 11.05. 84 +

4 29. 04. 78 + 8. 04. 83 - 13. 07. 84 +

5 3. 06. 78 . 26.04.83 - 9. 08. 84

6 Б. 07. 78 + 20. 05. 83 + 9. 09. 84

7 20. 0 78 ++ 4. Об. 83 4.11.84 ++

8 12. 10. 78 - 27. Об. 83 + 19.11.84 слу-

9 7.12. 78 + 12. 07. 83 - чена и оставлена

10 27.12. 78 + 9. 09. 83 + жеребой

И 28. 09. 83

12 6.11.83 ++

13 26.11.83 +

14 18. 12. 83 -

Итого 10 вымываний 10 эмбрионов 14 вымываний 9 эмбрионов 7 вымываний 8 эмбрионов

Примечание: + - извлечен один эмбрион.

++ - извлечено два эмбриона. - - эмбриона нет. онов. Результаты этих экспериментов,приведены в таблице 3.6.

Таблица 3.6

Продолжительность межэстрального периода при вымывании эмбрионов в разные- сроки после овуляции (опыты 1977-1980 гг.)

Сроки извлечения | Эмбрион найден | Эмбрион не найден

1 1 п 1 1 м + т ! 1 П | М + т

Через 6 суток после

овуляции 2 16,5 4 16,3

Через 7 суток 22 16 ± 1,02 16 17 ± 1,0

Через 8 суток 17 16 + 0,74 12 16 + 1,1

Через 9 суток 31 17 ± 0,4 12 ' ' 16 + 0,9

Через 10 суток 3 16,7 ■ 1 15

Через 11 суток 2 32 2 18

В этой таблице приведены продолжительность межэстрального периода у кобыл-доноров в половых циклах, в которых были извлечены эмбрионы (т.е. доказан факт их результативного оплодотворения), и в циклах, в которых зародышей не оказалось (скорее всего, кобылы оказались не оплодотворенными). Установлено, что при выполнении процедуры вымывания, спустя 6-10 дней после овуляции, продолжительность межэстрального периода существенно не различается и находится в обычных пределах.

3.2.3 Влияние различных факторов на уровень извлекаемости зародышей из матки кобыл-доноров.Исследования по выяснению ■влияния возраста извлекаемого эмбриона на результативность вымывания выполнены в период с 1977 по 1980 год. Зародыши в этих экспериментах извлекали через 6-11 суток после овуляции. Результаты опытов приведены в таблице 3.7.

Анализ данных этой таблицы показывает, что эффективность освоенной нехирургической методики зависит от возраста- извлекаемого эмбриона. Так, в 6 вымываниях, выполненных через 6 дней после овуляции у донора, найдено всего 2 эмбриона (33,3%), а через 7 дней после овуляции уке в 38 опытах найдено 22 зародыша (67,9%). Возрастание результативности освоенной методики извлечения эмбрионов на 7 день после овуляции у доно-

ра, видимо-, объясняется переходом развивающихся зародышей из

Таблица 3. 7

Результаты извлечения эмбрионов в опытах 1977-1980 годов

:-1-1-г--

Возраст эмбриона (время от| Кол-во|Найдено | Процент овуляции до извлечения) | опытов|эмбрионов| извлечения

6 суток б 2 33,3

7 суток 38 22 57,9

8 суток 29 17 58,7

9 суток 43 31 72,1

10 суток 4 3 75,0

11 суток 4 2 50,0

Итого 124 77 62,1

яйцеводов в полость матки. Некоторое увеличение числа найденных эмбрионов от 7-го к 9-му дню связано с их размерами. На восыюй-девятый день развития зародыши достигают 1-2 миллиметров в диаметре и становятся хорошо видимыми в промывной жидкости невооруженным глазом. Это, в свою очередь, уменьшает вероятность потерь эмбрионов в процессе их поиска Одиннадцатидневные бластоцисты достигают больших размеров и при их извлечении, видимо, с трудом проходят через входные отверстия катетера. В последующих опытах мы полностью отказались от извлечения зародышей в крайние сроки (6 и 11 дни после овуляции) и в опытах. 1981-1985 годов полностью перешли на вымывание 8-9 дневных эмбрионов.

Анализ результатов извлечения эмбрионов после осеменения кобыл-доноров тремя различными способами - естественной случкой, искусственным осеменением свекей спермой и искусственным осеменением криоконсервированной спермой (данные этого анализа приведены в таблице 4.19) показал, что наивысшая их оплодотворяемость достигается при искусственном осеменении кобыл свежей спермой (74,3%). Достаточно высокий процент извлечения зародышей получен и после естественной случки (66,7%).

При искусственном осеменении криоконсервированной спермой результативность извлечения зародышей достоверно снижалась.

- го -

Более высокая оплодотворяемость кобыл при их искусственном осеменении свежей спермой, по нашему мнению объясняется боль-

Таблица 3. 8

Зависимость результативности извлечения эмбрионов из матки кобш-доноров от технологии их осеменения (1978-1992 годы)

-—1-:-1-1-

Технология осеменения | Количество |Извлечено|Извлекае-

I опытов |эмбрионов|мость в %

J_I.

Естественная случка 336 224 66,7

Искусственное осеменение

свежей спермой 309 230 74,3

Искусственное осеменение

криоконсервированной спермой 59 27 46,1

Итого 704 481 68,3

шей точностью места введения семени под контролем руки исполнителя. С целью уточнения параметров воздействия физиологических факторов на результативность осеменения кобыл-доноров нами, совместно с аспирантом И. Л. Чернышовым был проведен опыт по осеменению кобыл разными разовыми дозами спермы. Проверяли три объема разовой дозы спермы - 20, 10 и 5 мл. Результаты этого эксперимента приведены в таблице 3.9.

Таблица 3. 9

Взаимосвязь объема доаы спермы при осеменении кобыл-доноров и результативность извлечения зародышей

Объем дозы « — 1 | Число | Число ! 1 (Извлечено(Результативность

сперий! |активных |опытов |эмбрионов|извлечения эмбрионов

(ил) |спермйев | 1 1 в %

| (млн/дозе | в 1 1 1 1 1

20 300 8 6 75,0 + 17,67

10 300 8 5 62,5 ± 21,65

5 300 8 3 37,5 ± 27,95

Проведенные опыты показали, что при уменьшении объема разовой дозы спермы на осеменение кобыл происходит снижение его

- С .1 -

реоультетог-. Эти данньге полное г ью согласуется с данными другж хесгедователей. Одновременно этот- эксперимент показал, что применение нехирургкческой хетодики изалеченка зародышей яоз-Ео.г.кет существенно упростить проведение исследования по искусственному осеменения попадей к повысить репреэеататиа-;-:сс?5 поставленных опытов.

3 теченяз 1678-1985 годоз нг>5и было проанализирована извлекаемое?:? згтодкгэй яз мгткм шбыл-^о.-:ороз а зазисижгстй от зремени года, йвкяке зтяз: исс^здозакяй приведены з ?Ебяице 3. 10.

?г.;5/:-:;'ь. ЗЛО

Покзгртазькыэ изменения йэвлгкаеьгетя зародыше?! .из .габыл-доноров (1973 - 1685 году)

;д0кгзател". ] Кварталь: года , 1

!-!-1-1-1 КТО ГО

: п ! ш ) 1У з

Зсегс выполнено процедур

зыхьзаккя эмбрионов 84 138 55 85 404

Извлечено зародькэй 51 82 53 41 230

% кзвлечения 60,7 59,4 58,3 47,6 56,9

У.ъ данных таблицы 3.10 следует, что извдекгемость эмбрионов КБ кобыл-доноров достаточно стабильна з течение года и только з танце года (4-ом квартале) несколько снижается.

3. 3 Поиск, оценка и хранение эмбрионов во внесших условиях

3. 3.1 Отработка приемов поиска зародысей в промывкой жидкости. 3>:5ш:окы млекопитающих, в том числе м лошадей, отличается тем, что з процессе своего роста и развития они с возрастом из разряда микрообъектов. поиск которых воаыояэн только с помощь» специальных оптических приборов, постепенно, вырастают в макросбъекты, хорош зидикьге невооруженным глазом. В таблице 3.11 приведены сведения о размерах извлеченных зародышей разного возраста.

Таблица 3. И Размеры извлеченных эмбрионов лошадей

Возраст эмбрионов 1 1 П | 1 1 Диаметр в мм

1 1 1 1 1 1 М 1 m

6 суток 7 0,147 ± 0,007

7 суток 69 0,436 ± 0,096

8 суток 311 0,973 ± 0,112

9 суток 83 2,182 + 0,133

10 суток 9 4,4 ± 0,571

Большой неозкиданностыо для нас явилось то, что зародыши лосадей рано освобождаются от блестящей оболочки (Zona pslluoida) и начинают быстро (существенно интенсивнее, чем зародыши других видоз млекопитающих) увеличиваться в размерах, продолкая сохранять иаровидную форму. Сведения о стадийном развитии извлеченных нами зародышей лошадей приведены в таблице 3.12.

Таблица 3.12

Стадии развития извлеченных эмбрионов

I I

Возраст ¡Всего извле-| В том числа

эмбрионов | чено эыбрио-|-i-1-1-

| нов |ЬЬрула|Ранняя бла- |Расширяю- (Поздняя

| | |стоциста |щаяся блас-|бласто-

| | | |тоциста | штата

_i_!_I_I_1_

6 суток 7 12-2 2

7 суток 59-2 1 66

8 суток -311 - - - 311

С 1977 ~ по 1990 год шести- и семи-суточные эмбрионь отыскивали в осадке промывной жидкости, после 20-30 минутногс отстаивания. Семисуточные зародыши иногда удавалось обнаружит! в промывной жидкости невооруженным глазом (около 10 7.), Но чаще 7-и суточные гмбрионы находили с помощью стереоскопической

микроскопа }.{БС - 9. С 1990 года яри поиске 8-7 - суточных эмбрионов применяли метод фильтрации. Способ и время поиска эмбрионов разного возраста приведены з таблице 3.13.

Таблица 3.13

Способы и время поиска эмбрионов резного возраста

Возраст змбриона| Способ поиска

j Среднее время поиска | эмбриона

6 суточные Осадцение и микроско-дирование 41 минута

6 суточные Фильтрация и микроско-

пирование 27 минут

7 суточные В основном осалдение и

микроскопирование 34 минуты

7 суточные В основном фильтрация и

микроскопирование 22 минуты

8 суточные Часто (80%) невооружен-

ным глазом 3 минуты

9 суточные Невооруженным глазом менее -1 минуты

10 суточные Невооруженным глазом Все зародыши, кроме первого обнаружены в процессе вымывания

Из приведенных в этой таблице сведений видно, что время поиска эмбрионов лошадей в промывной жидкости зависит ■ г их возраста А это,естественно, связано с их размерами.

Анализируя полученные в процессе освоения нехирургического метода извлечения и отработки технологических приемов поиска эмбрионов лошадей мы сделали вывод о необходимости разработки оригинальных (отличных от рекомендованных для зародьпгэй других видов) способов краткосрочного хранения зародышей in vitro. Требовалось разработать быстрый способ оценки шъ-неспособности поздних бластоцист (экспандированных) и на основе зтого прогнозировать результаты последующих пересадок.

3.3. 2 Оценка жизнеспособности экспандированных бластоцист. В целях стандартизации показателей при разработке метода оценки качества зародышей по морфологическим признакам и упрощения технологии трансплантации мы обработали полученные све-

дения о размерах и описанию внешних признаков по 394 зародышам лошадей, в ток числе 311 - 8-сугочного и 83 - 9-суточного жоз-раста. Средни;- размеры 8-и дневных зародышей составили 0,973 ± 0,112 мм) 9-:» дневных - 2,182 + 0,133 мм. Подавляющее большинство зародышей при их оценке под микроскопом МБС-9 были полупрозрачными, имели правильную шаровидную форму, четко выраженную клеточную структуру. Некоторые извлеченные 8-9 дневные зародыши по своему внешнему виду существенно отличались. Они были непрозрачны, матового цвета, внешняя оболочка сильно отделялась от клеточной массы, клетки выглядели сморщенными и скатыми. Их мы отнесли к категории погибших. Встретились и несколько зародышей, занимавших промежуточное положение мекду этими двумя крайними вариантами, которые были оценены наш как сомнительные. Поводом для отнесения помутневгшх 'зародышей с сильно отделенной оболочкой (бластолеммой) и сморщенными клетками к разряду погибших послукшю то, что после 5-7 часового хранения полупрозрачных, шаровидных, с четко выраженной клеточкой структурой эмбрионов с плотно прилегающей (и поэтому практически незаметной) внешней оболочкой в фосфатно-солевом буферном растворе Дюльбекко (ФБС) у них начинались постепенные изменения внесшего вида. Сначала у таких зародышей становилась все более заметна внешняя оболочка, что вероятно связано с ее отслоением от сообщества клеток. Но клеточная масса продолжала сохранять некоторое время правильную шаровидную форму. Затем, изменялся тургор клеток и они сморщивались. Сообщество клеток эмбриона превращалось в комочек неправильной формы. Цвет бластоцисты постепенно из полупрозрачного становился мутньш (матовым). На основании опытов, по продолжительному хранению Эмбрионов в ФБС-среде, мы сделали вывод о том, что изменения внешнего вида эмбрионов связано с их гибелью в неадекватных условиях существования. Наиболее валшыми морфологическими показателями качества зародышей являются: степень прозрачности бластоцкет, целостность и состояние оболочек и хорошая выра-дэнность клеточной кассы. Поэтому в настоящее время мы разделяем 8-9 дневные зародыши на 3 категории: 1) жизнеспособные; 2) погибшие; и 3) сомнительные. После получения результатов культивирования зародышей в келточно-солевой среде и пересадок хобылам-рецйпиентги, ¡.гы пришли к выводу о том, что размеры эмбрионов при их оценке не оказывают существенного влияния на их

жизнеспособность.

Жизнеспособные зародыши полупрозрачны, имеют четкую шаровидную или слегка эллипсоидную форму, хорош зураганную массу клеток, четко различающиеся эмбриоблает "и трофобласт. Оболочка (бластолемма) плотно прилегает к клеткам по всей поверхности и при осмотре под микроскопом практически ке видна.

Погибше эмбрионы не прозрачны, клетки сморщены и сгруппированы в один матовый комок, оболочка (бластолемма) сильно отделена от клеток. '

Сомнительные зародыши полупрозрачны, клетки имеют правильную Еаровидную форму, оболочка (бластолемма) местами, а иногда и по всей поверхности заметно отслоена от клеток.

Никз { з таблице 3.14) приводим данные оценки свелеиззле-чэнных 8-е дневных зародышей за весь период проведения опытов.

Таблица 3.14 Оценка 8-9 дневных зародышей (1879-1092 гг)

Показатели | * 1 .....1 п | 1 t ! в Ж

Всего извлечено 8-9 дневных зародышей | Е 394 | ! loo .

В том- числе отнесено| дивых '345 37,1

к категории '| сомнительных 15 3,8

| погибших Зч/ 9,1

Ка основании данных таблицы 3.14 напрашивается вызод о том, что около 10% зародьгаей гибнет в организме осемененных кобыл до 8-9 дня своего эмбрионального развития. По-зкдимоиу, это обычный уровень эмбриональной смертности дхи конских зародышей на этой стадии развития.

3.3.3 Хранение эмбрионов лошадей во внешних условиях.

Проведенные опыты по изучению изменений внешнего вида 8-9 суточных бластоцист при их непродолжительном хранении з различных кидкостях дали толчок к разработке способа культивирования эмбрионов лошадей in vitro. Щшн, совместно с JL ©..Лебедевой был предложен и защипан' авторским .свидетельством СССР N14977215, выданным 1 апреля 1989 года, "Способ получения ииз-' неспособных поздних бластоцист лошадей". Главным элементом за-

щиты авторским свидетельством явилась среда, включающая в свой состав 20-60% желтка куриных яиц, 0-60% кипяченого молока кобыл и/или 0-60% фосфатно-солевого буферного раствора (ФБС). Поменянные в эту среду поздние бластоцисты лошадей продолжают интенсивно расти при температуре +37®С.

Для определения оптимальных соотношений вводимых в среду компонентов использовали принцип треугольной трехкомпонентной диаграммы Гиббса-Розебома. В одной серии опытов готовили 21 вариант среды с 20%-ным интервалом концентрации базового раствора (ФБС), желтка и молока. Всего провели две серии опытов. В первой серии опытов зародыши культивировали в течение 12 часов, а во второй - в течение 24 часов. Флакону со средой помешали в термостат для подогрева до оптимальной температуры. Извлеченные 8-дневные эмбрионы лошадей пипеткой переносили в испытуемую культуральную среду и инкубировали при температуре 37®с. До к после культивирования проводили оценку к измерение зуйрконов под микроскопом МБС-9. Интенсивность роста бласто-цист в проверяемых средах приведена в таблице 3.15. Наилучший результат получен при культивировании в среде 6 (60% желтка и 40% ФБС). Стабильный рост бластоцнст наблюдали в среде 7 (60% молока к 40% зяэлтка) и в среде 8 (40% молока, 40% мелтка и 20% ФБС). Менее стабильный результат культивирования эмбрионов лошадей был отмечен в средах 4, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.

Анализ результатов культивирования (таблица 3.15) показывает, что бластоцисты развивается как при 12 часовом, так и при 24 часовом культивировании, причем рост в средах оптимального состава (среды-6, 7 к 8) стабилен. При просмотре под микроскопом у всех прокультивированных в этих средах зародышей, Каких либо отклонений от нормы ке отмечали. Клетки трофобласта и эмбриобласта четко выраиены, зародыши полупрозрачны, правильной шаровидной формы. Помешенные в чистый желток или ФБС-раствор эмбрионы не растут. При осмотре под микроскопом у них обнарудагааот признаки деге.нерации.

Во время проведения опытов по разработке оптимального состава культуральной среды неожиданно было обнаружено, что эмбрионы с нормальной клеточной структурой, помещенные в среды, содержащие желток и молоко кобыл всплывают к поверхности жидкости и приближаются к стенкам стекляного сосуда, где могут

Таблица 3.15

Интенсивность роста бластоцист в средах разного рода

-1-:-;-

номер(Соотношение ингридиентов, в Интенсивность роста Оласто-

среды|-1-1-1 цист

| молоко | желток | ФБС |-1-

| II |при 12 часовом |при 24 часо-

I | | |культивировании|вом культи-

| • | II |вировании

_I_I_I_I_!_

1 - 100 - 0 0

2 20 80 - 390,9 132,3

3 - 80 20 329,6 0

4 40 60 - 244,8 270,3

5 20 60 20 66,7 667,9

6 - 60 40 325,9 905,5

7 60 40 - 204,9 643,9

8 40 40 . 20 313,9 744,7

9 ' 20 40 40 33,2 764,9

10 - 40 60 205,6 . 244,0

11 80 20 - 240,4 268,1

12 60 ' 20 20 298,9 342,2

13 40 20 40 173,0 609,7

14 20 20 60 23,8 526, е

16 - 20 80 266,7 518,4

16 100 - 76,1 0

17 80 20 60,0 163,3

18 60 40 126,0 114,3

19 40 - 60 139,6 00,1

20 20 - 60 0 • о

21 - - 100 0 0

бить легко обнаружены визуально. Эмбрионы с нарушенной клеточной структурой постепенно, погружаются в толщу жидкости. Кроме того, ■ плавающие у поверхности Оластоцисты за период культивирования существенно увеличиваются в размерах. Опустившиеся в толщу иидкости зародыши не растут.

В настоящее время, под нашим руководством готовит к эащ-

те кандидатскую диссертацию соискатель Н. В. Сидорова. Тема ее работы,- "Хранение и транспортировка бластоцист лошади". Е проведенных экспериментах установлено, что жизнеспособность эмбрионов лошадей в мелточко-солевой среде (50 % желтка + 50 % ФЕС) сохраняется в довольно широком диапазоне плюсовых температур (от +10 до +40®С) (таблица 3,15).

Таблица 3.16

Влияние хранения при различных температурах в течение 24 часов на 8 - 8,5 суточные эмбрионы

Темпе-| 3 серия (повторность)

ратура |-1-(-

экспо-|Началъ- ¡Конеч- ¡Оценка за-зиции ¡ный раз-|ный |родыша (С®) ¡мер за- ¡размер ¡после |родыша ¡зароды-¡опыта |(в мм) |ша (мм)|

| II серия (повторность)

1_-,--—.-

|Началь-.¡Конеч- ¡Оценка зар |ный раз-¡ный ¡дыша после ¡мер за- ¡размер ¡опыта |родыша |зароды-| ¡(в мм) |ша (мм)|

+42 +40

+38

+36

+34

+32

+30 +28

+26

+24

1,0 0,95 Погиб 1,25

1,0 2,0 Жизнеспо- 0,75 собен

1,0 2,075 Жизнеспо- 0,6 собен

1,05 2,25 Жизнеспо- 0,7 собен

0,75 1,45 Жизнеспо- 1,8 собен

Жизнеспо- О,925 собен

Погиб 1,2

Жизнеспо- 1,45 собен

Жизнеспо- О,55

собен

0,9 1,22 Еизнеспо- 0,9 собен

0,85 1,075 Жизнеспо- 1,325 собен

1.4 2,0

1.05 1,1 1,35 1,75

1,6

,7

1,0 Погиб

1,75 Жизнеспособен

0,85 Жизнеспособен

1,15 Жизнеспособен

2.0 Жизнеспособен

1,225 Жизнеспособен

1.1 Погиб

1,62 Жизнеспособен

0,7 Сомнителе

0,75 Погиб

1,375 Жизнеспособен

1 1 1 2 | 1 1 з 1 1 1 1 4 | 1 1 5 1 1 1 6 | | 1 7

+20 1,0 1.2 Жизнеспособен 1,0 1.0 Погиб

+10 1,0 1,75 Пизнеспо-собен 0,6 0,65 Еизиеспо-собен

+8 0,925 - Погиб 0,875 0,6 Погиб

+6 0,6 Погиб 0,575 0,575 неспособен

+4 1,15 - Погиб

В тер- 0,825 0,825 Сомнителен '

мосе с

тазощш

льдом

Сба эмбриона, хранившиеся в течение 24 часов при температуре +42®С погибли, 10 зародыпзй, хранившихся при температуре от +32 до +40°С сохранили иизнеспособность, из 12 эмбрионов, подвергнутых воздействию температур от +20 до +30"С„ 4 погибли, 1 оценен как сомнительный и 7 - лизнеспособных. К сожалению из-за технических ограничений нам не удалось провести опыты по хранению зародмзей в зоне температур от +12 до +18®С. Кз 8 эмбрионов, находившихся 24 часа в термостате при температуре от 0 до +105С, 4 погибли, 1 оценен как сомнительный и 3 - хаз-неспособные.

3. 4 Пересадка эмбрионов кобылам-рэципиентам.

Проведенную нами научно-исследовательскую работу по освоению и совершенствованию нехирургического грансцервикального метода пересадки эмбрионов в матку кобыл-реципиентов условно моино разделить на 4 этапа.

Первый этап. (С 1978 по 1981 год). В этот период было выполнено 48 попыток пересадок зародышей от кобыл-доноров кобылам-реципиентам. Все 48 пересадок оказались безрезультатны}®. Б первых опытах по трансплантации зародышей мы пользовались рекомендованным для крупного рогатого скота прибором Кассу, вводимого коровам ректо-цервикальным методом в ипсилатеральный

к 'функционирующему желтому телу рог матки. Вероятно, из-за анатомических и гистологических особенностей строения пох >ых органов кобыл этот способ введения инструмента оказался т, ш-моопасным для лошадей й поэтому не эффективным.

Второй этап. (1981-1985 годы). В этот период времени было выполнено 54 пересадки - зажеребело 11 кобыл-реципиентов. Получено 10 жеребят-трансплантатов. У одной кобылы-реципиента иеребость оборвалась выкидышем неустановленной этиологии. Результативность пересадок в этот период составила 20,4%. Этот этап исследований был посвящзн освоению методики пересадок ■ и получению первичных данных об оптимальных биологических параметрах технологии трансплантации зародышей у лошадей.

Третий этап. (1985-1987 годы). . В течение этого времени, основное внимание уделяли совершенствованию метода и его адаптации к производственным условиям. Было произведено 28 пересадок - закеребело 9 кобыл-реципиентов (32,1%). Установили, что замена дефицитной фетапьной сыворотки крови крупного рогатого скота на доступный желток куриных яиц в пересадочной среде не снияает результативность пересадок. Внутримышечное введение потенциальным реципиентам раствора изокссуприн лактата с целью блокирования спазматических сокращений миометрия в период введения эмбриона достоверно и существенно повысило результативность опытов.

Четвертый этап. (1988-1992 годы). В эти годы в 24 пересадках у 17 кобыл-реципиентов наступила беременность (70,8%). Этот период научной работы по трансплантации эмбрионов лошадей характеризуется устойчивым высоким уровнем прижив-дяемости трансплантатов. Часть пересадок зародышей в 1992 году выполняли по заказам производственников за плату. Практически |&чалея этап внедрения технологии трансплантации эмбрионов в фактику коннозаводства.

3. 4.1 Влияние различных факторов на результативность пересадок. После освоения нехирургического метода трансплантации эмбрионов в матку кобыл-реципиентов (с 23 марта 1981 года)наш было выполнено 105 пересадок. Для выяснения оптимального места аппликации зародыша, глубину введения пересадочного инструмента в матку кобыл варьировали. Данные этого эксперимента приведены в таблице 3.17.

Таблица 3.17

Результативность пересадок при различной глубине введения инструмента в матку кобыл-реципиентов

-1-!-1

Глубина введения инструмента!Выполнено|Залеребело |Реэультати-

|пересадок)реципиентов|вкость в %

Глубокая'(10-12 см за церви- 44 .2 4,5

кальный канал)

Средняя (5-9 см за цервикаль- 38 18 47,4

ный канал)

Неглубокая (2-4 см за церви- 24 17 70,8

кальный канал)

Итого • 106 37 34,9

Полученные результаты опыта по месту введения эмбриона а матку реципиента свидетельствуют о том, что при пересадках зародышей кобылам трансплантат должен быть помещен в прилегающий к цервикальному каналу участок тела матки. Разница медду группами достоверна.

В бпытах были выполнены пересадки семи-, восьми- и девя-тисуточных бластоцист". Сведения о результатах трансплантации эмбрионов в зависимости от их возраста даны а таблице 3.18. Практически, уровень прижйвляемости во всех возрастных группах был близок к среднему показателю.

Таблица 3.18 Приживляемость бластоцист разного возраста

Возраст пересаживаемого зародыша ) 1 1 |Выполнено|Зажеребело|Результатив- |пересадок¡реципиент. |ность в % 1 1 1

7-и суточные бластоцисты 12 4 33,3

8-и суточные 70 27 38,6

9-и суточные 24 6 25,0

Итого 105 37 34,9

Разница медду группами недостоверна. В последние годы мы

перешли к пересадкам в основном 8-8,5 суточных бластоцист. этом возрасте эмбрионы лошадей достигают уже достаточно бол1 ших размеров - 0,973 + 0,112 мм в диаметре (см. табл. 3.11] Это позволяет проводить пересадки эмбрионов без использован! стереомикроскопа. Достаточно большие размеры 8-и суточш бластоцист позволяют ускорить их поиск и перенос в пересадо* ную среду. Они хорошо видны в заправленной для пересадки пайе те, даже в непрозрачной желточно-солевой пересадочной сред« Ш месту положения бластоцист в столбе пересадочной среды пайете мокло судить об их жизнеспособности (жизнеспособнь всплывают, погибшие опускаются вниз). Размеры 8-8,5 суточнь эмбрионов позволяют использовать серийно выпускаемые инстрз менты для трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, суточные бластоцисты еще очень малы (0,436+0,096 мм в диамеа ре). Их трудно обнаружить в жидкости невооруженным глазом. Or становятся практически неконтролируемыми в непрозрачной mi точно-солеЕой пересадочной среде. Затрачиваемое на пересади время сильно затягивается, а это в свою очередь, может снизит результативность работы. 9-и суточные эмбрионы, наоборот достигают уиз чрезмерно крупных размеров (2,182+0,133 мм в ди аметре). При пересадке 9-и суточных бластоцист применение дл пересадок на лошадях серийно выпускаемых инструментов станс вится невозможным. Повышается риск травмирования бластоцист процессе манипулирования с ними in vitro.

.Применение гормональных препаратов с целью синхронизацн половых функций доноров и.реципиентов не всегда позволяет до биться наступления одновременной овуляции у обеих кобыл. Эт может быть связано с функциональным состоянием обрабатываема швотньи, многократностью применения препаратов и другими фак торами. Анализ результатов трансплантации эмбрионов за все го ды работы (таблица 3.19) показал, что у лошадей допустим большая степень асинхронности половых циклов при пересадках чем у крупного рогатого скота и овец. Достаточно большая амп яитуда допустимой асинхронности половых функций кобыл-доноро и кобыл-реципиентов при пересадках позволяет значительно уп ростить технологию подготовки животных к трансплантации. 1992 году ш практически отказались от воздействия гормонам на половые проиессы кобыл-доноров и ограничились однократны внутривенным введением хорионического гонадотропного гормон

(ХГ) любой находящейся в охоте потенциальной кобыле-реципиенту в день овуляции у намечаемого для пересадки донора. Овуляция у-подвергнутой такой обработке кобылы-реципиента обычно происходит через 36-48 часов.

Таблица 3.18

Результаты пересадок эмбрионов в зависимости от степени синхронности половых циклов кобыл-донороэ и кобыл-реципиентов

-г"-1-з-

Степень синхронности ову-¡Количество¡Количество¡Резуяьтатив-ляции у доноров и рецици-¡пересадок ¡кэрэбостей!шсть а % ентов (в сутках) ¡1 I

Л_1_1.

-3 5 3 60,0

-2,5 2 - 0

-2 18 ' 7 38,9

-1,5 13 4 30,8

* 31 ' 13 41,9

-0,5 б 3 50,0

0 25 6 24,0

+6,5 4 1 25,0

+1 - 0

+1,5 1 - 0

Итого 106 37 34,9

Знаком (-) помечена такая асинхронность полозьк функций, когда овуляция у кобылы-донора наступила раньше, чем у кобылы-реципиента. Если овуляция у реципиента наступила раньше донора, то поставлен знак плюс (+).

Одной из вероятных причин, снижающих прилив ляешстъ трансплантатов в матке кобыл-реципиентов могут быть сназттм-ческие сокращения миометрия, спровоцированные неадекватным раздражением рецепторов влагалища и цервккальюго какала а момент введения инструмента с пересаживаемым эмбрионом. С целью блокирования нежелательной реакции .»квотного в 1986-1687 годах был проведен опыт по введении кобыяам-реципкектам перед пересадкой эмбриона миорелаксанта "Ханегиф". В оийгеьпс пересадках меребость наступила у 5 из 8 обработанных Закегкфох кобыл-реципиентов. в контрольной группе ааиеребела одна Разница

между группами достоверна.

3.5 Беременность, роды и последующая плодовитость кобыл-реципиентов.

Беременность кобыл-реципиентов устанавливали ректальным методом в общепринятые в коневодстве сроки. Первую проверку на жеребость проводили на 25 день развития плода (через 17 дней после пересадки). Вторую - на 45 день (через 37 дней после пересадки). Третью (заключительную) - на 5-6 месяце беременности. Однако первым признаком наступления или наоборот отсутствия беременности было нарушение или сохранение половой цикличности у кобылы-реципиента после пересадки, выявляемое по ее поведению на "пробе", при общении с жеребцом-пробником.

Из 37 керебостей кобыл-реципиентов 33 беременности завершились нормальными родами и 4-аборта. Три аборта произошли осенью (в том числе 2 - на 6-ом месяце и один - на 7-ом месяце) Один аборт произошел в феврале месяце (на 9-ом месяце). В эти же сроки наблюдались аборты у интактных кобыл Опытного конного завода, на территории которого размещена экспериментальная конюшня ВШШКа.

За 25-30 дней до ожидаемых родов у всех 33 кобыл было отмечено начало налива вымени. К моменту выжеребки степень налива вымени достигала максимума. У 17 кобыл-реципиентов за сутки до родов на кончиках сосков были обнаружены сгустки высохшего молозива (молозивные пробки). Расслабление связок таза, припу-хание наружных половых органов в предродовой период были хорошо выражены у всех ожеребившихся кобыл-реципиентов. У 11 кобыл роды прошли в отсутствии обслуживающего персонала, поэтому ход родового процесса у них оказался не проконтролированным. 22 кобылы-реципиента жеребились в присутствии людей. В 21 родах зафиксировано переднее предлежание жеребят-трансплантатов, в 1 - заднее. Ни одного случая неправильного, мешающего родам, членорасполокэния плодов не зификсировано. 27 выжеребок кобыл- реципиентов произошли в темное (ночное) время суток и 6 -в дневное. Роды протекали быстро. Необходимости в оказании акушерской помощи кобылам не было ни в одном случае. У 31 кобылы послед отделился самопроизвольно. У 2 кобыл, для удаления задержавшегося последа потребовалось вмешательство ветеринар-

ного специалиста.

Продолжительность беременности кобыл-реципиентов с учетом сроков эмбрионального развития трансплантатов в организме кобылы-донора (+ 8 суток) была в пределах нормы - 335,9 £ 4,9 суток.

Все кобылы-реципиенты, кооме одной в течении первых двух недель после выжеребки проявили нормальный эструс. Кобыла Дикция проявила первую охоту через два месяца после родов, плодовитость кобыл-реципиентов после ■ родов жеребят-трансплантатов сохранилась в норме. Часть бывших кобыл-реципиентоз после вы-жеребки была передана в производящий состав кумысной фермы Опытного конного завода. Часть - использовали в опытах в качестве доноров эмбрионов. Части кобыл повторно пересадили эмбрионы. По два трансплантата было получено от кобылы-рецгашеита Лозы, кобылы N 006, кобылы N 002. Опытная кобыла Проекция, бу-денновской породы была использована в экспериментах и в качестве донора, затем - реципиента и, после выиэребта трансплантатом - скова донором. Опыты по извлечению ш пересадкам эмбрионов проводили и на виргинных кобылках, и на кедавно ожеребившихся кобылах, и на длительно холостеющих по разным причинам животных. Уровень пршшвляемости трансплантатов в катке гинекологически здоровых кобыл, по нашим наблюдениям, одинаков для всех групп животных (виргинных, ожеребившихся в текущем году, холостых).

6.1 ВЫВОДЫ

1. Разработана нехирургическая технология трансплантации эмбрионов лошадей. Существенными особенностями которой являются:

многократное извлечение эмбрионов из кобыл-доноров в как-дом следующем друг за другом половых циклах,

пересадка 8-и суточных поздних (экспандированных) блаето-

цист,

использование пересадочной среды, содержащей 40-601 гзлт-ка куриных яиц,

синхронизация половых циклов кобыл посредством хориони-ческого гонадотропного гормона.

2. Многократное извлечение эмбрионов из матки кобыл-доно-

ров позволяет получить несколько (до 14) зародышей в течение года от одного животного без вреда для его здоровья и последу-ащэй плодовой деятельности и отказаться от разработки методов индуцирования полиовуляции.

3. Ейзкеспособкыэ 7-9 -и суточные бластоцисты лошадей су-щэственно отличаются по внешнему виду, прозрачности и удельной массе от погибших. Жизнеспособные эмбрионы имеют правильную шаровидную или Слегка эллипсоидную форму, плотно прилегающую к клеткам трофобласта внешнюю оболочку (бластолемму), полупрозрачна Прк погружении в иелточно-солевую среду (имеющую в своем составе 20 и более процентов желтка) жизнеспособные бластоцисты всплывают к поверхности. Погибшие эмбрионы по внешнему заду напоминай^ спущенный мяч, внешняя оболочка (бластолемма) сильно отслоена от клеточной массы, комок клеток бластоцисты мутный (матового цвета). При переносе в гаэлточно-солевую среду погибше зародыш погружаются, в толщу жидкости.

4. 8-к м 9-и дневные бластоцисты лошадей быстро увеличиваются в размерах и в этом возрасте из разряда микрообьектов переходят в разряд макрообьектов, становятся хороио видимы в промывкой жидкости невооруженным глазом, что позволяет исключить микросконнроваше при пересадках.

5. Добавление к фосфатко-солевому раствору (ФЕС), либо к-кобыльему шлоку 20-60% желтка куриных яиц.позволяет успешно культивировать 7-2 суточные эмбрионы лошадей in vitro в.течение нескольких (от i до 3) суток.

5. Хранение- 8 -и суточных лошадиных зародышей в желточ-'но-солевой среде (60Z желтка и 50% ®БС) в интервале температур от +32 до +40^0 обеспечивает высокую сохранность и способствует интенсивному'увеличению их размеров. Снижение температуры шиэ +32®С привода? к подавлению роста бластоцист. Сохранность зародышей при нонзшеннш тешературах ухудшается.

7. Введение яорионического гонадотропного гормона (ХГ) подготавливаемым к пересадкам кобылам в фолликулярную фазу зструса обязательно. Без инъекции хорионического гонадотропина овуляция у обрабатываемых кобыл наступает в неконтролируемые сроки, разновременно и необходимой степени синхронности их половых циклов добиться не удается.

'8. Сезонные изменения интенсивности овариальной функции яичников кобыл связаны с возрастными и наследственными особен-

поста и условиями обитания конкретного газетного, Кобшн советской и русской тягблэвоэнюг пород проявляют в течение года больпе полгаых циклов, чем гатя донской и буденкозско® порол. Русс1а:э р^гкеть-з кобылы занимав? по зтоадг показатели - пронэз^-точное пологэя::з.

9. 15311 сззкрургичесгеих пересадках знбрхезоз кобнгзм-рзцк-ппентач пгрссддочппй инструмент необходимо вводить шзко-цзрви-кальным ?.:зтодом неглубоко (на 2-4 он) в тело матга.

10. ПроЕзпт-'гвпоэ введение (за 15-20 минут до перзсадга) кзокссупргяга ггкетата гсобшжм-реципиентам повышает нригавляе-î.:ocTb з.^р^опоз-трзнешинтагов.

11. Еэрэ:„'2йеос5Ь, роды и -.гактацггя ксбыя-рэцЕпкэктов протекав? пор^ззхю. Рост и раззиткэ подучэнных • гзэрз-бят-трз.1гсп.г2пгатоз па отличается от сверстников.

ПРЕДЛОИШИШ ПРаЭВОДСТИГ '

Разработал, рзссяатрен, одобрен Учении Советом ВШШ коневодства п предлоглн для внедрения проект рэкокэндахрй по трансплантации эмбрионов лопадей в производственных условиях.

Список основнш опубликованных по те^з* диссертации научных- работ:

1. Shi lova L V., Platon Е. M, and Lsfcsdsv S. G. ' The uss of Питал Chorionic Gonadotropin for Ovulation Date Regulation in f.&res//Proc. в. int. Cons. An in. Raprod. am! Artif.Insaa , Krakov, 12-16 July 1976.- P. 331

2. Кялова L В., Лзбедэв О. Г. Роль гормональных факторов в регуляций процесса созревания фолликулов j кобыл и применение хориоиического гонадотропина для ускорения овуляции// Известия ТОМ.- 1973." Мб.- С. 170-184

3. Лзбедев С. Г., Малахова Т. С. Результаты освоения нэ-хирургического петода извлечения ранних энбрионов из катет отбил/ Научные тр. ВНШК "Воспроизводство н улучпэние елзелзе-ных качеств конского поголовья". - 1979. - С. 69-73

- 38 -

4. Лебедев С. Г. Влияние хорионического гонадотропина на воспроизводительные функции кобыл/ Научные тр. ВНИИК "Резервы развития и повышения эффективности -коневодства". -, Рязань. -1979.- С. 27-33

'5. Лебедев С. Г. , Григорьев M.1Û О механизме овуляции у кобыл/ Научные тр. ВНИИК "Селекция и технология выращивания лошадей в конных заводах'*. - 1981.- С. 92-98

6. Lebedew S. G. Unblutige Eigewinnung beim Pferd/ Prog. 30 Internat. Fachtag. fur Fortpfl. und Besammung. - Wels (Österreich) 24-26 September 1981.

7. Лебедев С. Г. Нехирургическая пересадка эмбрионов в коневодстве/ Материалы 33 ежегодной конференции ЕАЖ, 16-19 августа 1982. - Ленинград.

8. Лебедев С. Г. , Малахова Т. С. Синхронизация времени овуляции у кобыл/ Научные тр. ВНИИК "Биологические основы технологии коневодства". - 1982.- С. 48-56

9. Лебедев С. Г. Васин А. Д., Силаева М. Д. , Результаты комиссионного испытания хорионического гонадотропина// Ветеринария. - N3.- 1983.- С. 54

10. Лебедев С. Г. Способ определения оплодотворяющей способности спермы жеребца. Авт. свид. СССР N1090384, 1984.

11: Лебедев С. Г. Многократное использование кобыл-доноров для трансплантации эмбрионов/ Научные тр. ВНИИК "Достижения физиологии и их применение в коневодстве". - 1984.- С. 107-116

12. Лебедев С. Г., Малахова Т. С., Сидорова H. Е Нехирургический метод переноса ранних эмбрионов в матку кобыл-реципиентов/ Научные тр. ВНИИК "Интенсификация коневодства". - 1985. -С. 70-79

13. Лебедев С. Г., Малахова Т. С. , Сидорова H. Е Физиологические основы метода трансплантации зародышей у лошадей (Од-ноплодие кобыл)/ Научные тр. ВНИИК "Пути ускорения научно-технического прогресса в коневодстве". - 1986.- С. 133-141

14. Лебедев С.Г., Лебедева Л.Ф. Способ получения жизнеспособных поздних бластоцист лошадей. Авт. свид. CCCI N1497215, 1989. •

15. Лебедев С. Г., Лебедева Л. Ф. Культивирование зкспонди-рованных бластоцист лошадей/Научные тр. ВНИИК "Интенсификации селекции и технология выращивания лошадей". - 1988. - С. 202-209

16. Чернышов И. Л. , Лебедев С. Г. Условия отбора кобыл-доноров эмбрионов/ Сб. научн. тр. НИИ племенного дела "Биотехнология воспроизведения и биотехнологические методы разведения с. -X. животных". - 1989. - С. 152-164

17. Лебедев С. Г. , Храброва Л. А., Малахова Т. С. , Сидорова Н. В. Совершенствование технологии пересадок эмбрионов нехирургическим методом/ Научные труды ВНИИК "Новое в технологии коневодства и коннозаводства".- 1990.- С.34-51

18. Лебедев С. Г. О сезонности размножения лошадей/ Научные тр. ВНИИК "Пути повышения племенных,.спортивных, рабочих и продуктивных качеств лошадей".- 1992.- С.140-152

19. Лебедев С. Г., Сидорова-К К. Влияние температурного фактора на жизнеспособность бластоцист лошадей/ Научные труды ВНИИК "Пути повышения племенных, спортивных, рабочих и продукт тивных качесть лошадей". - 1992.- С. 152-160