Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансмембранный протонной обмен в эритроцитах при первичной гипертонии. Исследование методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Трансмембранный протонной обмен в эритроцитах при первичной гипертонии. Исследование методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И БИОФИЗИКИ КНЦ РАН

На правах рукописи

Р Г К Пл

СОРОКИНА Наталья Юрьевна 1 ' и иИ

ТРАНСМЕМБРАННЫИ ПРОТОННЫЙ ОБМЕН В ЭРИТРОЦИТАХ ПРИ ПЕРВИЧНОЙ ГИПЕРТОНИИ. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОМ ЯМР С ИМПУЛЬСНЫМ ГРА ДИЕНТОМ МАГНИТНОГО ПОЛЯ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань 2000

Работа выполнена в лаборатории биофизики клетки Казанского института биохимии и биофизики Казанского Научного Центра РАН

Научные руководители: доктор физико-математических наук,

профессор A.B. Анисимов

доктор медицинских наук, профессор В.Н. Ослопов

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор В.И. Волков

кандидат биологических наук Ф.В. Миннибаева

Ведущая организация: Институт клинической кардиологии

им. A.JI. Мясникова Российского Кардиологического Научно-Производственного Комплекса МЗ РФ

(Москва)

Защита состоится

2000 г. в

час. на заседании

специализированного совета Ku02.16.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биохимии и биофизики КНЦ РАН (420305, г. Казань, а/я 30, ул. Лобачевского, 2/31).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского физико-технического института КНЦ РАН.

Автореферат разослан fiJZ&^Z-^fy 1999 ]

Ученый секретарь специализированного совета, ,, кандидат биологических наук

'А.Б. Иванова

РН'О. с ус - V'Jii"', £

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гипертоническая болезнь (ГБ) является самой распространенной формой сердечно-сосудистой патологии. Один из вариантов ГБ - первичная гипертония человека развивается на основе нарушения структуры и катион-транспортных функций мембран в клетках различного типа, в том числе и в эритроцитах. В данном случае хронически повышенное артериальное давление не связано ни с поражением почек, ни с артериосклерозом и является следствием нарушения одной транспортной системы регуляции водно-солевого гомеостаза -плазматической мембраны. При этом почки адаптируются к данным условиям и работают в режиме переключения, при котором величина регулируемого ими артериального давления сдвинута в сторону более высоких значений [Постнов Ю.В. и др.,1987]. Структурные изменения в плазматической мембране, природа которых до сих пор пе ясна, приводят к нарушению функционирования переносчиков ионов Са2+, К\ повышению пассивной проницаемости

мембраны для одновалентных катионов и уменьшению мембранного электрического потенциала. Таким образом, изучение особенностей мембранных нарушений в клетках пациентов является важной проблемой, а сопоставление этих данных с другими физиологическими характеристиками и клиническими особенностями может иметь решающее значение в определении конкретных вариантов ГБ.

Используемые в экспериментах по изучению На+/ГТ, №+/№+ и кальциевого обмена при первичной гипертонии биохимические методики и классический метод радиоактивных изотопов позволяют характеризовать катион-транспортные системы мембран, однако являются достаточно сложными и дорогими, что сводит к минимуму их использование в практике. С этой точки зрения неоспоримое преимущество имеет метод ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля (ЯМР ИГМП). В этом случае ядра, обладающие магнитным моментом, являются природной меткой, за трансляционным перемещением которой можно следить по изменению амплитуды сигнала спинового эхо. В итоге, возможность изучения процессов самодиффузии компонентов системы без вмешательства во внутреннюю структуру и широкий диапазон доступных измерению коэффициентов самодиффузии (КСД) позволяют использовать метод ЯМР ИГМП для исследования биологических систем наиболее эффективно. Однако исследований трансмембранного обмена воды и протонного обмена в клетках методом ЯМР ИГМП при наличии мембранных патологий до сих пор практически не проводилось.

Целью работы являлось:

1. Экспериментальное исследование обменных процессов в суспензиях эритроцитов на основе изучения в них особенностей самодиффузии.

2. Установление принципиальной возможности выявления мембранных нарушений, характерных для. первичной гипертонии, в эритроцитах человека методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля (ИГМП) на ядрах Н1.

Научная новизна.

1. Методом импульсного ЯМР исследовалась форма диффузионного затухания в суспензиях эритроцитов в диапазоне трех порядков величины амплитуды сигнала спинового эха. Установлено, что форма ДЗ описывается суммой трех компонент, относящихся к протонам внутри- и внеклеточной воды, а также к протонам структурообразующих молекул мембраны.

2. Установлено, что регистрируемый в эксперименте протонный обмен в целом обусловлен проницаемостью плазматической мембраны для молекул воды и протонным обменом вне- и внутриклеточной воды с компонентами мембраны.

3. На основании сравнительного анализа полученных данных по скоростям трансмембранного протонного обмена в эритроцитах крыс линии SHR (экспериментальная модель гипертонической болезни человека) и контрольных к ним крыс линии WKY показано, что различие в скоростях протонного обмена между больными и здоровыми выявляется при смещении внеклеточного рН или температуры. В естественных условиях разница между обменными характеристиками клеточных мембран в контрольных и опытных образцах не обнаруживается.

4. Установлен факт ослабления регулирующей роли внеклеточного рН на время трансмембранного протонного обмена в зависимости от степени заболевания у людей.

5. Установлена корреляция между скоростью Na+/Na+ противотранспорта, определенного в эритроцитах пациентов методом Na+/Li+ противотранспорта с временем протонного обмена, рассчитанным по данным ЯМР ИГМП.

Практическая значимость.

Продемонстрирована возможность использования метода ЯМР с ИГМП для обнаружения мембранных дефектов в эритроцитах, основанная на факте изменения зависимости времени протонного обмена от внешнего рН с развитием заболевания первичной гипертонией. Полученные результаты являются основой для разработки экспресс метода дифференциальной диагностики первичной гипертонии.

На защиту выносятся положения, сформулированные в выводах.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 3 статьи в центральной печати, 5 статей в сборниках статей отечественных и зарубежных конференций, 7 тезисов на всероссийских и зарубежных конференциях.

Апробация работы. Результаты работы представлялись на следующих конференциях: «8th International Symposium on SHR and Related Studies» (Osaka, Japan, 1994); 1-ом Съезде нефрологов России (Казань, 1994); II-IV,VI Всероссийских конференциях «Структура и динамика молекулярных систем» (Йошкар-Ола 1995-1997, 1999); Республиканской конференции «Новые методы диагностики и лечения» (Казань, 1995); «1st International Meeting on Interventional

Cardiology» (Jerusalem, Israel., 1995); «4th International Meeting "Recent Advances in MR Applications to Porous Media"» (Trondheim, Norway, 1997); «18th International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems» (Tokyo, Japan, 1998); «Joint 29,h AMPERE -13 ISMAR International Conference on Magnetic Rezonance and Related Phenomena» (Berlin, Germany, 1998); «5lh International Conference on Magnetic Resonance Microscopy» (Heidelberg, Germany, 1999).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 103 страницах, в том числе 2 схемы и 21 рисунок, состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы из 106 наименований, из них 35 - отечественных .

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В I главе дан обзор современных представлений о причинах и следствиях развития гипертонии.

И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом исследования были эритроциты крови человека и животных, поскольку в них отражаются практически все изменения мембранной функции, характерные для первичной гипертонии. В качестве экспериментальной модели для выработки методики выявления нарушений мембранного обмена при первичной гипертонии использовали крыс со спонтанной гипертензией Wistar-Kyoto линии SHR (spontaneously hypertensive rats Wistar-Kyoto )и контрольных нормотензивных крыс линии WKY (normotensive Wistar-Kyoto rats), составивших 2 группы по 14 крыс-самок массой 200 — 250 г в возрасте 8-10 недель. Кровь из аорты получали от крыс под эфирным наркозом.

Группу исследования составили больные из числа пациентов Казанского кардиологического центра с диагнозом первичная гипертония различной степени тяжести (обследовано 200 пациентов) и здоровые люди (контрольная группа из 50 человек). Кровь забиралась из вены.

Кровь в количестве 3 мл, обработанную гепарином (50 ЕД гепарина на 1 мл крови), центрифугировали 5 мин. при 3000 об/мин. (2000 g), сыворотку удаляли. Полученный пакет эритроцитов промывали дважды физиологическим раствором в соотношении 1:1, затем снова добавляли этот раствор в том же соотношении, перемешивали и полученную взвесь эритроцитов подкисляли 0,05 н. раствором соляной кислоты, контролируя отсутствие гемолиза микроскопией образца. Снова центрифугировали при тех же параметрах, удаляли верхний прозрачный слой и 20 мкл эритроцитов помещали в цилиндрическую, запаянную с одного конца стеклянную ампулу с внутренним диаметром 5 мм. Образцы измерялись в течение первых 2 часов после забора крови, при температуре 0 °С.

■ЯМР исследования трансляционной диффузии в системе проводились на резонансной частоте Н1 64МГц с использованием последовательности стимулированного спинового эха [Скирда В.Д. и др., 1987]. Максимальная

величина импульсного градиента магнитного поля составляла 200 Тл/м. Первичную информацию о диффузионном процессе в методе ЯМР с градиентом магнитного поля получали из анализа диффузионного затухания (ДЗ) -зависимости амплитуды сигнала спинового эхо (A(g2)) от квадрата амплитуды импульсного градиента магнитного поля (g) в интервале времен диффузии td от 7 до 300 мс. Температура образца варьировалась от +5 до +40"С. Погрешность измерений не превышала 10%.

В качестве параллельного и независимого метода контроля мембранных нарушений в эритроцитах пациентов с ГБ использовали известный метод оценки скорости Na+/Li+ противотранспорта [Canessa М. et al., 1980]. Метод заключается в измерении обмена внутриклеточного лития в загруженных этим ионом клетках на внеклеточный натрий из среды инкубации. Для этого Na замещали в эритроцитах на Li путем прединкубации (в течение 3-х часов) в среде, содержащей изоосмотическую концентрацию LiCI при блокированию! уабаином Na-K-АТФазы. О скорости Na/Li обмена судили по разности выхода Li (через 60 минут инкубации) в среду, содержащую изоосмотическую концентрацию NaCI, и в среду, содержащую изоосмотическую смесь MgCI и сахарозы. Кинетику выхода из клеток лития регистрировали методом атомной абсорбционной спектрофотометрии в эмиссионном режиме (СА-455, ПО КОМЗ, г. Казань).

Параметры инкубации, подготовка образцов и центрифугирование при температуре 0°С, обеспечивались с использованием рефрижераторной центрифуги и лабораторного комплекса "Labsystems". Использовались реактивы фирм "Serva", "Sigma", "BDH".

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование процессов самодиффузии воды и протонного обмена в

эритроцитах

Форма диффузионных затуханий в суспензиях эритроцитов

Согласно представлениям о характере подвижности воды в плотной суспензии эритроцитов, форму диффузионного затухания в этой системе в основном определяют протоны внутриклеточной и внеклеточной воды. В регистрируемый сигнал стимулированного эхо могут вносить вклад протоны воды, являющейся непосредственно составной частью мембраны. Кроме того, вклад в сигнал могут давать также и протоны, входящие в структуру подвижных углеводородных цепей липидов и латеральных белков мембранного скелета.

Экспериментально полученная форма диффузионных затуханий A(g2) в суспензиях эритроцитов неэкспоненциальна и зависит от времени диффузии t,¡ во всем доступном диапазоне времен диффузии от 7 до -300 мс (Рис.1). В подобных ситуациях основной является проблема разложения A(g2) на компоненты с учетом зависимости населенностей и КСД этих компонент от времени диффузии и соотнесение этих компонент с конкретными фазами в изучаемой системе.

Сложные диффузионные процессы в многофазных, с точки зрения ЯМР,

в®

. Р (15мс)

-Ч4&ЙКч

» * у щ т ттг »

Т=36.5С • -7 мс

2000

ц2 [Тл7м2]

системах принято

характеризовать средним по всему спектру коэффициентом . самодиффузии О, определяемым из тангенса угла наклона касательной к начальному —И))

участку кривой А(§2) [.Маклаков А. и др., 1987]. Тогда, одним из критериев правильного разделения на компоненты будет служить выполнение условия:

Б = У />,./)„. (1.)

Рис. 1. Зависимость формы диффузионного затухания ,

в образцах эритроцитов от времени диффузии

Исследование поведения среднего коэффициента во времени с применением современных [Скирда В.Д. и др., 1996] приемов обработки экспериментальных зависимостей О при сопоставлении с результатами разложения ДЗ на компоненты позволяет достаточно точно интерпретировать полученную информацию о характере подвижности компонент системы.

Известно [р]екЬег О. е{ а!., 1990], что для случая замкнутых пор характерна зависимость ОО^осЧ' - так называемый режим полностью ограниченной диффузии. В экспериментах с эритроцитами наблюдается довольно слабая зависимость 2) стремящаяся при мс выйти на плато (Рис.2). Причина такого поведения в том, что во временном интервале от 7 до - 30 мс эволюция зависимости 2) определяется суперпозицией двух динамических режимов. Один из них - промежуточный режим диффузии молекул воды вне- и внутри клетки эритроцита, испытывающих ограничение со стороны стенки мембраны. Второй - режим проницаемости, определяемый общим процессом трансмембранного молекулярного обмена воды, характеризующегося коэффициентом поровой проницаемости Х> = ИтБ().

Для разделения вкладов эффектов ограничений и проницаемости в В использовалось аналитическое выражение [Скирда В.Д. и др., 1996], позволяющее определять размеры ограничений в проницаемых системах, где зависимость

В (/,1) искажена вкладом проницаемости пор:

(о <ч, >-/>„)

Вл

1>о-Ор

(2.)

где В0 - в данном случае КСД внеклеточной воды. Из полученной таким

образом зависимости (Рис.2.) по соотношению Эйнштейна был оценен

среднеквадратичный радиус ограничений г.

[г2)=601,

(3.)

5" 10

0,1

ю

100

/-"с/

Рис.2. А — Зависимость среднего коэффициента самодиффузии от времени диффузии; В — Зависимость Б'" полученная из В посредством

исключения эффекта проницаемости.

который оказался равным 3 мкм, и, в принципе, согласуется со средним размером эритроцитов (средний диаметр 6-7 мкм).

С ростом времени диффузии, начиная примерно с 30 мс, наблюдается выход В (7,/) на плато, который обусловлен изменением условий наблюдения за молекулами воды. Очевидно с этого момента большинство молекул внутри эритроцита достигают стенки мембраны.

При временах более 30 мс, за пределами промежуточного режима диффузии, определяемого наибольшим размером ограничений -размером клетки эритроцита

среднеквадратичные смещения диффузанта превышают размеры эритроцита и сигнал от протонов воды, взаимодействующих со стенкой мембраны, усредняется. С этого момента времени и вплоть до максимально допустимого времени наблюдения для молекул, взаимодействующих с мембранами, начинает реализовываться так называемый длинноволновой режим. В этом случае временная зависимость формы диффузионного затухания определяется процессом трансмембранного обмена, осуществляемым между молекулами внутри и внеклеточной воды, а также между внутри- и внеклеточной водой и водой, находящейся в мембране. Также в данный процесс может вносить вклад протонный обмен между группами Н+ и ОН- плазмы и протоносодержащими группами компонентов каркаса мембраны. Таким образом в общем случае механизм проницаемости включает в себя и молекулярный и протонный трансмембранный обмены.

Руководствуясь известным принципом выделения экспоненциальной составляющей с минимальным значением КСД, в ДЗ была определена компонента, КСД которой (£л= 1,55-10'"м2/сек) в интервале от 7 до 200мс оказался независящим от времени диффузии. Однако, населенность этой

1

компоненты, составляющая максимум несколько процентов от общего сигнала, зависит от времени диффузии сложным образом (Рис. 1): начиная приблизительно с 20 мс, с ростом времени диффузии населенность (ра) компоненты с DSa монотонно уменьшается вплоть до t¡, ~ 200 мс. Данная картина характерна для поведения A(g2) в условиях промежуточного обмена, когда время диффузии сравнимо с временами жизни молекул в обменивающихся фазах [Маклаков А. и др., 1987] (отсутствие эффектов неэкспоненциальности спин-решеточной релаксации на форму ДЗ было установлено предварительно).

Полученные данные указывают на то, что весьма небольшое количество протононесущих молекул, находящихся в системе, совершает очень медленное движение, по сравнению с КОД объемной воды, причем зависимости Dsa(t,i), свидетельствующей о наличии ограничений для этой фазы не наблюдается. В то же время основная часть молекул, диффундирующих практически на два порядка быстрее, испытывает влияние ограничений.

Известно [Сорокина З.А., 1978], что трансляционная подвижность гидратной воды и латеральная диффузия самих липидов в мембране характеризуется близкими по порядку величины коэффициентами диффузии -порядка Ю'"-10"12 м2/сек. Оценка вклада этих компонент в сигнал спинового эха соответствует экспериментально полученной величине ра ~ 1.5% . В этой связи можно считать, что компонента с Dsa является суммой вкладов от протонов воды, содержащейся в каналах и порах мембран, а также протонов латеральных липидов и воды, взаимодействующей с латеральными белками и электролитами:

^воды в мембране^^латеральпыхлипидгя^^иоиов 11 ,ОИ • (4.)

В интервале от 7< td < 200 мс эти слагаемые друг от друга не различаются. При td < 200 мс в ДЗ отчетливо проявляется компонента, с КСД порядка 8* 10'|2м2/сек, населенность которой не зависит от времени диффузии. Этот факт может быть связан с завершением процесса обмена между быстродиффундирующими компонентами ДЗ и компонентами из спектра Dsa, способными обмениваться, оставшаяся же компонента с КСД ~ 10'12м2/сек, очевидно, не участвует в обмене.

В интервале времен диффузии от 7 до ~ 100 мс результат вычитания из диффузионного затухания описанной выше экспоненты, характеризующейся коэффициентом самодиффузии Dm и населенностью ра, представляет собой двухкомпонентный спад, форма которого зависит от времени диффузии.

Таким образом в диапазоне td от 7 до 100 мс форма ДЗ для исследованных систем удовлетворительно описывается суммой трех экспоненциальных составляющих:

A(g2)=pá(td)exp(-y252g2tdDsa)+p'b(td)exp(-y282g2tdDsb(td))+

+Pc(td)exp('r252g2tdDc(tsd)) (5)

При td> 100 мс, форма спада, оставшегося после вычитания компоненты с DSa становится однокомпонентной. Подобное изменение формы ДЗ может быть вызвано целым рядом процессов, но наиболее вероятно оно связано с наличием обмена между двумя компонентами, составляющими часть ДЗ, оставшуюся после вычитания компоненты с DSa.

При разложении экспериментальных ДЗ (см. результаты в Таблице 1), руководствуясь выполнением условия (1.), представленным в виде:

D(td) = pat(tll)Dm+pb(td)D\b(td) + pc'(tll)D'sc(tSIl) (6.)

важно помнить, что из экспериментальных ДЗ могут быть получены лишь кажущиеся значения Dsc и Dsb и их населенностей. Истинные значения Dsc и DSb будут искажены влиянием ограничений, а истинные значения населенностей будут искажены обменом, о наличии которого свидетельствуют зависимости

p\(Q иP*c(t<i).

Поскольку КСД медленной компоненты Dsa не зависит от времени диффузии, логично предположить, что зависимость D (t(l) обусловлена эффектами ограничений, которые испытывают протоны воды, дающие вклад в компоненты с Dsc и Dsb. Кажущийся КСД для компоненты Ь в интервале от 7 до 20 мс уменьшается с ростом времени и, начиная с 30 мс, зависимость DSb (tj ослабевает и выходит на плато (см. рис З.А). При этом ее населенность на начальном этапе возрастает, а затем монотонно уменьшается вплоть до полного исчезновения при td -130 мс. Здесь просматривается аналогия в поведении зависимости D (td) и зависимости Ds¿(Q на этапе 7-30 мс. В этом же интервале времен кажущийся КСД компоненты с очень слабо убывает, затем к 130 мс перестает зависеть от времени диффузии. Нельзя исключить, что зависимость Dsc (t,i) является следствием погрешности процедуры разложения ДЗ, однако очевидно что зависимость Dsb (tj намного сильнее. Следовательно, характер D (tj в интервале 7-30 мс в основном определен влиянием ограничений на подвижность молекул компоненты Ь. Полного ограничения не наблюдается даже при малых td, что свидетельствует о проницаемости существующих барьеров.

Таким образом согласованность характеристических размеров ограничений, полученных из ЯМР данных с известными размерами эритроцитов, а также достаточно высокая подвижность протонов двух выделенных фаз — b и с (их КСД порядка 10"9 -10' 10м2/сек. - Табл. 3.1), близкая к подвижности объемной воды, позволяют нам считать, что эти фазы соответствуют протонам внутриклеточной (компонента Ь) и внеклеточной (компонента с) воды. Аргументами в пользу данного утверждения служат: 1) - эффекты ограничения для компонент Ъ и с; 2) -экспериментально регистрируемый обмен между фазами b и с; 3) - процентное отношение долей этих фаз, согласующееся с концентрацией эритроцитов в исследуемых образцах. Можно отметить, что кажущиеся значения коэффициентов самодиффузии этих компонент близки, но все же выполняется неравенство: Db* >DC*. Ранее авторами [Latour L.L. et al., 1994] отмечалось, что

подобное неравенство является следствием присутствия внутри эритроцита молекулы гемоглобина, занимающего примерно 33% объема клетки. Однако, регистрируемая нами зависимость йь и от времени диффузии

свидетельствует о преимущественном влиянии ограничений со стороны мембраны на подвижность молекул внутри эритроцита.

Таблица 1 Результаты разложения* экспериментальных ДЗ, полученных в образцах эритроцитов человека при различных временах диффузии.

и мс Р:, ¡%] ±0.05 [м?/сек! ±0.05 Рь 1°/о1 ¿0.05 Л,' х10-'° [м'/сек] ±0.05 г: ¡%/ ±0.05 Л/ XI0 [,42/сск1 ±0.05 О хЮ '10 [м2/сек] ±0.05

1 5.0 1.5 44,8 3.52 50.2 1.12 7.2

10 3.7 1.5 52.3 2.47 44.0 1.09 6.1

20 2.8 1.5 33.6 2.20 63.4 0.80 5.8

30 1.4 1.5 28.0 2.00 70.6 0.75 5.6

50 0.8 1.5 19.0 1.92 80.2 0.65 5.6

80 1.5 4.6 1.90 94.9 0.58 5.6

130 0.3 1.5 - - 99.7 0.56 15.5

(усредненный результат разложения 50 диффузионных затуханий)

Итак из эксперимента следует: 1) во всем исследуемом временном диапазоне не наблюдается полного ограничения ни для одной из компонент а, Ъ и с, и этот факт однозначно связан с проницаемостью эритроцитарной мембраны; 2) - в диапазоне времен 7-130 мс существуют зависимости р и Р

Протонный обмен в суспензиях эритроцитов

В диссертации подробно рассматривается процесс промежуточного обмена в двухфазных системах и, в частности, в суспензии эритроцитов. Из

экспериментального изучения зависимостей р а() и р'ь^л) может быть получена информация как о виде функций распределения времен жизни, так и о

со

временах (?■),

о

характеризующих среднее время нахождения молекул в обменивающихся фазах а и Ь.

Вероятность пребывания молекул в течение всего времени ¡л в состоянии а,(Ь) имеет вид: ¡Га,^^ ) = ра}>(I - ) (таЬ )с!га Ь = ра Ь ) (8.)

О

Из функции полученной по (8)

г (Т.*) = -

-ехр

1*. А

(9.)

Ра,ь(0) л раЬА

и из экспериментальных зависимостей р*а((,/) можно получить т а из (7.):

в РаЛ

Т" ехр(-~)йти А

г р //1 _Гв/

__р /А

(10.)

и аналогично т ь из р (см. Рис. 3).

Полученное из зависимости р'ь(1а) характеристическое время ть оказалось

несколько больше значения т „ (см Рис 3. А, Б). Однако нельзя утверждать, что обмен между фазами бис (между внутри- и внеклеточной водой) происходит с меньшей скоростью. Дело в том, что суспензия эритроцитов представляет собой трехфазную систему с обменом, который осуществляется транзитным способом,. когда разрешены только указанные пути обмена:

В а О с

Поэтому для данной системы должно выполняться условие

5» „Л (П),

Ра

так как полученные времена жизни диффузанта в фазах а и Ь связаны с населенностями этих фаз соотношениями:

г„ гА

Ра= , _ , Ръ=-

Т„+Т1+ г.

т„ + тк + г„

Полученное из эксперимента соотношение представляет собой неравенство

^ 3

Ра

из которого следует, что регистрируются по крайней мере два типа трансмембранного протонного обмена, обусловленные различными механизмами. В обоих случаях в процессе обмена участвует мембрана клетки (фаза а), однако, в первом случае с вне- и внутриклеточной водой обмениваются протоны, входящие в структуру мембраны как таковой, а во втором случае мембрана служит системой препятствий на пути молекул воды, осуществляющих очень

быстрый молекулярный обмен (между фазами b и с). Время г ь трансмембранного обмена вне- и внутриклеточной воды, естественно, должно зависеть от концентрации внеклеточной воды, т.е. от условий приготовления

образцов пакетов эритроцитов [Latour L.L. et al., 1994], а параметр f а непосредственно характеризует

структурное состояние мембраны. Поэтому в дальнейших исследованиях мы сконцентрировали свое внимание на исследовании протонного обмена, характеризующегося величиной т а, т.к. он представляет больший практический интерес в связи с поставленной в данной работе целью обнаружить мембранные нарушения в плазматической мембране при заболевании первичной гипертонией. Полученные значения х а для образцов эритроцитов всей обследованной (контрольной и опытной) группы пациентов (Рис. З.Б) оказались приблизительно одинаковы ~ 23 ±1 мс; различий во временах обмена между здоровыми и больными обнаружено не было.

Полученные аналогичным

образом значения т я для ооразцов

эритроцитов крыс линии WKY и SHR

также приблизительно одинаковы, Рис. 3. Извлечение среднего времени одшко ß данном случае време„а

жизни молекул в обменивающихся обмена оказались меньше и составляли

фазах из зависимости p'b(td) - (А) и _ lOdrl мс. Подобная разница не

-p4U) (Б) в образцах эритроцитов противоречит литературным данным

[ПостновЮ.В. и др.,1987] о том, что

обменные процессы у крыс происходят с более высокой скоростью, нежели у людей, вследствие сравнительно пониженной вязкости мембран.

Зависимость времени трансмембранного обмена от pH и температуры. Выявление мембранных нарушений в экспериментах на модельных объектах

Форма диффузионного затухания у больных и здоровых не отличалась, разницы в коэффициентах самодиффузии и временах обмена не отмечалось

U

tflMC1

-а

0,01

Т= 36° с

О - К1Ж р! 1=7,46

\ • - рИ= 7.46 0,1-

\ д - БНК рН =6.55

V А - ЖУ рН =6.55 в>ч 0,01-

4 1Е-3-

0 200 400 600 800 1000 1200

0,1

I,, [секунды]

1Е-3

Рис.4. Изменение формы диффузионного затухания при подкислении плазмы. Эритроциты крыс линий ЗИП и

Рис.5. Зависимость р*а( ¡а )при

различных значениях рН, характерная

для эритроцитов крыс линии П'КУ (здоровые).

Известно, что рН оказывает сильное влияние на работу любых ферментов, в том числе и транспортных [Агопбоп Р.8. е1 а1., 1982], поэтому было выдвинуто предположение, что дефект плазматической мембраны может проявиться при воздействии на механизм транспорта изменением внеклеточной рН. Исследования, проведенные на образцах эритроцитов крыс линии БНИ и \ViiY, показали, что при изменении рН от естественного значения 7,4 до 6,5 форма диффузионного затухания изменяется, и проявляется существенное различие для 2) больных и здоровых животных (Рис.4.). Из зависимости р*а(1а) при различных рН в образцах гипертензивных

вНЯ и здоровых \УКУ были получены значения времен жизни т а. Оказалось (Рис. 5), что среднее время нахождения протонов в обменивающихся фазах в образцах здоровых животных сильно зависит от рН - с уменьшением рН от 7,4 до 6,55 время обмена увеличивается от 10 мс до 23 мс. Следовательно, обмен между внутриклеточной и внеклеточной компонентами ДЗ замедляется.

Итак, регуляторная роль рН выражается в изменении кинетических характеристик трансмембранного обмена таким образом, что при повышении рН протонный обмен усиливается, а при понижении - замедляется.

Для образцов линии БИЛ наблюдалась совершенно противоположная картина: форма ДЗ слабо реагирует на изменение внешней рН и, как следствие, время обмена практически не изменяется при подкислении плазмы. По-видимому, структурные либо функциональные нарушения мембраны в случае с БИЯ не позволяют реализовать обменному механизму адекватную ответную реакцию на изменение рН среды. Подобное отличие для образцов крыс контрольной группы

наблюдалось абсолютно для всех обследованных на данный предмет особей линии БЬШ.. Этот экспериментально установленный факт позволяет сделать вывод о чувствительности метода ЯМР ИГМП, в частности извлекаемого параметра та, к нарушению протонного обмена, вызванному дефектом мембран эритроцитов при первичной гипертонии.

В связи с полученными результатами по зависимости времени протонного обмена от внешних условий (внеклеточного рН), были проведены температурные исследования формы диффузионного затухания в образцах эритроцитов \VbCY и 8НЯ. Наиболее интересным оказался факт ускорения регистрируемого протонного обмена с ростом температуры в образцах эритроцитов \¥КУ, и отсутствие зависимости т„ (Т) в группе БИЛ.

Исследование протонного обмена в эритроцитах человека при первичной гипертонии

Поскольку цель исследований состояла в разработке методики выявления нарушений мембранного транспорта и в изучении особенностей такого рода нарушений для выяснения конкретных причин заболевания гипертонией у людей, естественным продолжением исследований была попытка получить информацию о наличии мембранных дефектов в образцах крови пациентов с диагнозом «первичная гипертония».

По аналогии с экспериментами на модельных объектах были проведены исследования формы ДЗ и времени протонного обмена у людей,

страдающих гипертонической болезнью разной степени, и здоровых людей. В контрольной группе при варьировании рН от 7.4 до 6.7 время обмена га изменялось преимущественно от 23 до 36 мс.

В группе пациентов с ГБ характер зависимости зависел от степени заболевания. Различие в степени заболевания у пациентов контролировалось уровнем артериального давления и скоростью противотранспорта V

(единицы измерений - мкмоль/(литр-час). Была обнаружена четкая корреляция между характером зависимости та от рН и параметром V.

Для пациентов, у которых У>200, как правило, характерны тяжелые формы гипертонии, а люди с У<150, как правило, не страдают первичной формой гипертонии. На рисунке 6 прослеживается четкая корреляция т„ с величиной V: в области У>250 (соответствующей больным людям) наблюдается слабая зависимость га от рН, причем подобным же образом идут зависимости для образцов крыс линии 81111; а в области У<150 (здоровые люди) - выраженная зависимость та от рН (аналогично ведут себя кривые для крыс линии \УКУ). Таким образом, очевидна связь между №+ЛЧа+ и протонным обменом.

Данное заключение подтверждается в эксперименте по выявлению амилорид-ингибируемой компоненты в регистрируемом методом ЯМР суммарном обмене вне- и внутриклеточной воды со структурообразующими

компонентами самой мембраны. При добавлении во внеклеточное пространство амилорида время протонного обмена увеличивалось на 20 %, что, очевидно, связано с уменьшением скорости протонного обмена. Поскольку амилорид считается достаточно специфическим ингибитором №+/Н+ обмена, первично влияющим на транспорт натрия, факт присутствия составляющей обмена в общем обменном процессе, наблюдаемом в эксперименте, можно считать доказанным. Амилорид угнетает транспорт натрия только при добавлении к раствору со стороны наружной поверхности мембраны клетки. Механизм его действия еще до конца не ясен, однако его воздействие на №+/Н+ обмен хорошо изучено. Таким образом, импульсным методом ЯМР удается не только выявить наличие дефектов в плазматической мембране по изменению характерных зависимостей времени обмена от внешнего воздействия на систему, но регистрировать именно тот вид обмена, нарушение которого является одной из главных причин развития первичной гипертензии или первичной гипертонии у людей.

Чтобы определить функциональные свойства мембран у пациента, нет необходимости подробно исследовзть временные зависимости р а

(¿¡1) и

извлекать значения скорости протонного трансмембранного обмена. Достаточно измерить одно значение р*а при такой величине времени диффузии, когда уже выполняются условия промежуточного обмена. Для эритроцитов человека эта величина должна лежать в интервале от 20-50 мс.

г, мс

50 4030 20 10

контрольныя группа здоровых индивидуумов

- -а- ■- \УКУ - ■ - - здоровые люди, V- 120

- -о- - - БНИ - • — здоровые люди, V- 140

—А— пациенты, У=370

Т- - пациенты, У=550

- • • пациенты, \'=670

6,4

6,6

6,8

7,0 рН

7,2

7,4

7,6

Рис. 6 . Зависимость среднего времени трансмембранного обмена от внеклеточной рН в образцах эритроцитов крыс линий БНЯ и }УКУ, с одной стороны, и в эритроцитах здоровых и больных людей с различными скоростями Иа/Ы противотрнаспорта - с другой стороны.

ВЫВОДЫ

1. Впервые в суспензиях эритроцитов исследована форма диффузионного затухания (ДЗ) в диапазоне трех порядков величины амплитуды сигнала

спинового эха. Установлено, что форма ДЗ описывается суммой трех компонент, относящихся к протонам внутри- и внеклеточной воды, а также к протонам структурообразующих молекул мембраны.

2. Впервые показано, что эволюция формы ДЗ во времени в суспензии эритроцитов в области промежуточных времен диффузии может быть описана в терминах обмена. Установлено, что регистрируемый в эксперименте обмен обусловлен проницаемостью плазматической мембраны для молекул воды и протонным обменом вне- и внутриклеточной воды с протонами компонентов мембраны.

3. Установлена корреляция между скоростью Na/Na противотрансопрта, определенного в эритроцитах пациентов классическим способом Na/Li противотранспорта с временем протонного обмена, рассчитанным по данным

ЯМР игмп.

4. Наличие вклада Na/H обмена в общий процесс протонного обмена, регистрируемое методом ЯМР ИГМП, продемонстрировано результатом замедления наблюдаемого протонного обмена при ингибировании Na/H обмена амилоридом.

5. На основании сравнительного анализа полученных данных по скоростям трансмембранного протонного обмена в эритроцитах крыс линии SHR (опытная модель гипертонической болезни человека) и контрольных к ним крыс линии WKY показано, что различие в скоростях протонного обмена между больными и здоровыми выявляется при смещении внеклеточного рН или температуры. В естественных физиологических условиях • oí--..'-.. разница между обменными характеристиками клеточных мембран в контрольных и опытных образцах не обнаруживается

6. Предложена методика обнаружения мембранных нарушений на основе регистрации методом ЯМР ИГМП зависимости времени трансмембранного протонного обмена в эритроцитах от внешнего рН при первичной гипертонии.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Yo.Smirnov, V.Oslopov, N.Sorokina, A.Maklakov, E.Stolpner "Pecularities of the cellular ion-transport function of the gastrointestinal tract in spantaneously rats" Abstracts of the 8th International Symposium on SHR and Related Studies, Osaka, Japan, 1994, N 84-P-Z-l 1 .

2. Смирнов Ю.В., Ослопов B.H., Сорокина Н.Ю., Маклаков А.И. "Использование ЯМР-Радиоспектроскопии для дифференциальной диагностики почечной и первшшой гипертензий". 1 -ый Съезд нефрологов России, Тез. докладов ,1-3 окт. 1994, Казань, С. 210.

3. Смирнов Ю.В. Ослопов В.Н., Сорокина Н.Ю., Столпнер Е.И. Новый метод диагностики мембранной патологии при гипертонической болезни, язвенной болезни и двенадцатиперстной кишки. Новые методы диагностики и лечения {Тез. докл. республ. конф.) Казань ."Медицина", июнь 1995, С. 20.

4. Смирнов Ю.В., Ослопов В.Н., Сорокина Н.Ю., Маклаков А.И. "Самодиффузия и проницаемость клеточных мембран в эритроцитах и в слизистой оболочке

желудка у крыс со спонтанной гипертензией (SHR)". Кардиология, 1995, Т. 35, С. 34-37.

5. Смирнов Ю.В., Ослопов В.Н., Сорокина Н.Ю., Хузиахметов Н.З., Садыков А.Р. "Диагностика мембранной патологии при язвенной болезни". Российский журнал Гастроэнтерологии, Санкт-Петербург, 1995, № 3 , Т. 5, С. 220.

6. Yo.Smirnov, V.Oslopov, N.Sorokina, A.Maklakov, E.Stolpner "Pecularities of the cellular ion-transport function of the gastrointestinal tract in hypertensive rats" Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 1995, V. I, P. 218-220.

7. Yo.Smirnov, V.Oslopov, N.Sorokina at all "New method of diagnostics of membrane pathology in the hypertensity", The Journal of Invasive Cardiology, Original abstracts lbl Intern. Meeting on Interventional Cardiology, Jerusalem, Israel, 1995, V. 7, Suppl. C, P. 62,

8. Сорокина Н.Ю., Смирнов Ю.В., Маклаков А.И. "Влияние патологии клеточных мембран в эритроцитах на трансляционную диффузию". Структура и молекулярная динамика полимерных систем - Сб. статей - Йошкар-Ола, 1995, С. 36-38

9. Anisimov А.V., N.R. Dautova, N.Yu. Sorokina. "Water Diffusion in Biological porous systems over a wide range of water content. A NMR Approach" .in Book of selected papers and abstracts of 4lh Russian Conference "Structure and Dynamic of molecular systems", Yoshkar-Ola-Kazan - Moskow, 1997, P. 15-18.

10. A.V. Anisimov, N.Y. Sorokina and N.R. Dautova. "Water Diffusion in Biological Porous Systems: a NMR Approach." Abstracts of the 4U| International Meeting "Recent Advances in MR Applications to Porous Media", Trondheim, Norway, 1997, Ses. 7, N. 5.

11. N. Sorokina, V. Oslopov . "Ion Exchange in Blood Cells in Membrane Pathology. A NMR Approach". Abstracts of the 18th International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems, Metropolitan Univer., Hachioji, Tokyo, Japan, 1998, MP-09, P. 103.

12. N. Sorokina, V. Oslopov, L. Kapralova. "Ion Exchange in Membrane Pathology. A NMR Approach."; Extended Abstracts of the Joint 29th AMPERE -13 ISMAR International Conference, Techn. Univer. Berlin, Germany, 1998, V. 2, P. 749-750.

13. A.V. Anisimov, N.Y. Sorokina and N.R. Dautova "Water Diffusion in Biological Porous Systems: a NMR Approach". Magnetic Resonance Imaging 1998, V. 16, N 5/6, P. 565-568.

14. Сорокина Н.Ю., Ослопов B.H. "Исследование процессов самодиффузии и ионного трансмембранного обмена в эритроцитах крыс в норме и при патологии". Структура и динамика молекулярных систем - сб. статей, Казань, 1999, вып.6, С. 293-297.

15. Sorokina N., Oslopov V. "Disturbance of the Ion Exchange at Membrane Pathology. A NMR Study". Abstracts of the 5th International Conference on Magnetic Resonance Microscopy, German Cancer Research Center , Heidelberg, Germany, 1999, P. 22.