Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансляционный анализ и картирование генов структурных белков р12, р20, р42 и р90 вируса осповакцины

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Трансляционный анализ и картирование генов структурных белков р12, р20, р42 и р90 вируса осповакцины"

т ^ п 0 0 ?

всесоюзный шучно-шследовательсюш институт

МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ Ш10 "ВЕКТОР".

На правах, рукописи

Кетесова Нина Александровна

ТРАНСЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ И КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОВ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ р!2, р20, р42 . И р9С ВИРУСА ССПОВАКШКЫ

03.00,03 -...Молекулярная биология

А в т о . р эфе р сГт • диссертации на соискание ученой стэпен;: кандидата, биологических наук .

?а£ста выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте молекулярной биологии НПО 'Вектор"

Научный рукоьолисель-

локгор химических кауг. Г. Малыгш.

Официальные оппоненты:

Ведуц&я организация:

доктор биологических кеук К."П.Мертвецов

кандидат биологически;;: н&у. И.X.Урманов '

Институт цитологии и генетики -СО РАН •

Защита состоится " "QHmJ^p-i 1992 г. ь У час на заседании специализированного совета К 038.08. 01 ео ВНИИ, молекулярной биологии ( 623159,п. Кольцове Новосибирского р-на Новосибирской обл.;

С диссертацией можно ознакомиться ь библиотеке БНШ1 молекулярной -биологии НПО "ректор"

Авгорефера

т разослан ^ 1992 г.

1'чвнии сексета^; сягцкализкгоьакногс. созеу-á1 , ,

; / у

/// и / / /

i ^"- V .v /

ОШЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Вирус осповакцшш (ВОВ) признан в юследнее десятилетие наиболее перспективным вектором для экс-мессия чужеродной генетической информации с целью создания на го основе рекомбинантных вакцин. Особую практическую значимость этой связи имеют исследования , направленные на структур-о-фуикциональный анализ его генома с целья выявления в нем наи-олее эффективных мест встройки чужеродной генетической информа-ии. Перспективным! с этой- точки зрения рассматриваются гены по-ерхностных структурных белков ВОВ, поскольку в этой случае возмол-а встройка чужеродных иммуногенов непосредственно в состав зре-ого вириояа. Кроме toro, картирование генов структурных белков ОВ на вирусном геноме, определение их первичной структуры, яолу-еяие бактериальных продуцентов, существенным образом изменит си-, уацию в изучении самих этих белкой. - • .

В состав оболочки ВОВ штамма Л-ИБП входит 6 нагорных поли-ептидов: р12, р19, р20, р35, р42 и р61. Среди них с достаточной остоверностью картирован в настоящее время только белок р35.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Проведение трансляционного анализа рестрикцион-ьсс фрагментов ДНК ВОВ отамма Л-ИВП с последутодей иммунохимичес-ой идентификацией продуктов трансляции моноспецифическими эяти-ьшоротками к основным белкам оболочки. Получение бактериальных родуцентов белков, кодируемых генами ВОВ 9К и 15 и последутега центификация соответствуя®« им вирусных белков. Картирования зкоз структурных белкоз р!2, р20, р42 и pSQ ЕОВ итак?® Л:ЯВП.

ЗАДАЧИ РАБОТЫ включали:

1- Трансляционный анализ HindIII-E.F.C, J, I,H,K,L,M,0,P N.Ц-фрагментов, а также левого'Hind II I-A-Sal-фрагшнта pa змером 2500 п. я. ДНК. ЕОВ штамма Л-ИБП

2- Кммунохишч е с; ай анализ продуктов трансляции мРНК гибридизуююхся с левым Hind II I-A-Sal-фрагментом ДНК

3- Клонирование гена SK из Hind Ш-А-фрагыента и ген 15 из Hir.d ÜI-I- фрагмента ДНК в акспреесируших багетери алькых векторах.

4- 1Ьл7чение специфических ангисывороток к продукта ?ксчреесии клонированных в £.coli генов.

3- Идентификация виркояяых белков. взаимодействуй;-.,.,.,, аахисьаюрсткаш к продуктам экспрессии генов 15 и 9К

С í>„0 t

i.

НАУЧНАЯ КОВЙЗКА. Проведен транслационныЯ анализ рестрикаион цьз фрагментов ДК& EOS штамма Л-ИВП, перекрывающих 70% вируеног генома. Проведен иымунохидаческий анализ продуктов озсклеточно трансляции отселектированных мР'Ю с антиоьшсротками к белкам обо лочки вириона Проведено субтитрование открытых рамок трансля тля генов ЗК к J5 ЛНК ЮН Яэдучзнн клони Е. col i; экспресслруквд белковые продукты генов 9К и 15 8 составе химерных иолилептидов. Проведена иммунохимичеекая идентификация соответствуя®« генам 3 si Í5 вирусных белков. Проведено картирование генов структурны Сэлксн р20, р4£ и рЯО вируса осповакцины.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Сконструированные в данной рл боте плаэмлды vcryr оьть использованы в качестве потенциальны векторов для интеграции в геном ВОВ чужеродной генетической да "vOpä-HUiiiL Созданные оагсериальные продуценты вирусных белков лоз геллкт арсвсдить исглддогакия физико-химических и яммунехиьшчес

их свойств этих белков. Полученные в работе антисыворотки могут уть использованы для изучения антигенов ¡сак других шгашов В0£, ак и вообще поксвирусов. Проведенный трансляционный анализ генома ЭВ штамма л-ИБП может служить основой для дальнейшего кзртирсвЕ-;;я генов структурных белков вкриока.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. По материалам диссертации опубликовано 2 гатьи. Работа доложена на конференции "Молекулярная биология-НК-содеряашх вирусов"!Киев,1990г.:.

СТРУКТУРА РАЕОТЫ. Диссертационная работа изложена на 105 границах машинописного текста я состоит уз введения, обзора лк-ературы, описания методов исследования, трех разделов с изложением результатов исследования, вызолов и списка использованной итературы (119 источников). Диссертация содержат 20 рисунков.

00ДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Трансляционный анализ Фрагментов ДНК ВОВ штаыш Л-ЕВП.

Широко используемым подходом в картировании генома БОВ ваяется метод гибридивационной селекции вирусспештоичгских РНК "на фрагментах геномной ДКК с последующей трансляцией их в э с клеточной белок~синтезкрую!цей система и иммунохимичеекта налйзом продуктов трансляции. В нзстсярэе вреш, по ряду при-ин, в литературе отсутствует обиепринятая систеки обозначения елке в BOR Еще в Ослыйей степени это касается продуктов беск-еточной трансляции вир'усс'пеиифической tiPHK. Поэтому в данной аботе нам необходимо было провести собственный трансляционный лализ фрагментов генома ВОВ-иташа Л-ИБП з конкретных условк-х. в настоящей работе методом гибрвдизащюшюй селекции мРКК последующей трансляцией т в бесклеточной Селок-смнтегируг-

щей системе из ретикулоцитов кроликов нами были проаналиаиро Баны рестрикционные фрагменты ДНЯ ВОВ итамма Л-ЙВП, перекрыва шие около 701 вирусного генома, а именно Hin 111-Е, F,С, I, j, H,К, f.î,О, Р,N,Ь-фрагменты,. а такие левый Hin III-A-Sal- фрагмент, размером 2500 п.е..

В частности нами были, выявлены продукты бесклеточно: трансляции, совпадавшие по злектрофоретической подвижности i вирионными белками pli, р12, рЗЗ, р42. ©сего же нами в. лродук тах бесклеточной трансляции суммарной вирусной мРЩ, .а так» м?НК, гибридиэуюцейся с указанными фрагментами вирусной, геномной ДШ выявлено около 30 полипеятидев с мол. массой от Q ЮОкД. Выли выявлены продукты бесклеточной трансляции, взаимодействующие с антисыворотками к белкам р12, р20, р42 обслочю вяриона ВОВ. Шлученьт результаты трансляционного анализа использовались для картирования генов, белков р12, р20 и р£ оболочки вириона ВОЕ ...

■ 2. Кадрирование генов белков р12, р20 и р42 оболочки ВС®,

Pasee нами было показано,-что в состав оболочки.ВОВ штамма Л-ИВП входят 6 шторных .полипептидов: р12, р19, р20, р35 р42, p6l а также ряд минорных.

Шноспецифические антисыворотки к выделенным электрофоре-тическим белкам р12, р20 и р42 взаимодействовали в реакции им-муноблотянга с соответсгвуишаи полипепгидаыи, взятыми для им-пузиэацаи. Кроме того, ;наблвдалось- взаимодействие одной и то! хе антисыворотки с пояипептвдами. существенно отлмчапшмш друг от друга по »ил.массе (таблица)

Взаимодействую шнослецяфичегкж аотясьаюротод к йэдааи оболочки р12. р20 и р42 г суидарккш белкаап лириоиа г реакции ишунобяотяига и с продуяку® боскаеточноЯ трансляции суммарной вяруеснецафяческой мРНК .

иымуноблотют с суммарными яшунопреципигадия прс-бежаш вирйона ВОВ датов трансляции

pl 2 р20 р42 р12 р20 р42

АС12 + + - •*- л.

№20. - + + + + , +

h042 + + + 4 4- -

Нами был проведен икнунопреципитационшй эяадаз продуктов трансляции суммарной мРНК, выделенной m клеток CV-1 через «асов после начала гафекцш их ВОВ с помощью полученных. аяти-:ывороток к белкам оболочки р12, р20 и р42. Ешго обнаружно, это все спи, хотя и в разкой степени, преципи?ируто продукты 5есклеточноя трансляции, совпадающие по эл?еетро£воетичэской гадвижюсти с вирионными белками р12 и р42 (таблица).

Повторным электрофорезом в полиакриламидном геле СПААГ! 5шо показано, что 'белок pi2 является олигошроы белка р2й На

основании подученных дзжшхс таблица) наm было высказано Предположение о том, что белок р42 также является олигомером бежа р!2. Для проверки этого лредлоложния препараты индивидуально выделенных белков р12, р20, р42, 'а тага© суммарные белки вкри-она ВОВ мы анализировали методом ишуноблотинга с антисывороткой к белку р42 оболочки вириона. На рисЛ видно, что эта ан-тисызоротка во всех белковых препаратах вваимодейсвует с одни: полипептидом, имеющим мол, массу 42кД. Этот факт можно, объяснить только тем, что бедок р42, такж как и белок р20 образуется из белка р!2.

Далее нами было показано, что вируссецифическал ¿-„^i, гибридизувваяса с левым HindïIÎ-A-Sal-фрагментом направляет в бесклеточкой белок-синтезирующей системе из ретикулоцитов кроликов синтез полипептвдов с мол. массой 70, 42, 27, 17 и 12кД , причем полипептид с мол, массой 42кД совпадал по злектрофоре-тической подвижности с продуктом трансляции суммарной мРНК, который, как было показачо вьие специфически взаимодействовал

!

't' I

4 £

Рис. 1 Кммуноблотинг индивидуальных вирусных белков осповакцины с антисывороткой к белку оболочки р42.

1-суммарные белки вириона ВОБ;

2-белок оболочки р42;

3-белок оболочки рЕО;

4-белок оболочки pi 2.

с антисыворотками к белкам р12, р20, р42 оболочки вириона

таблица). Чтобы показать идентичность этого полипепда белку >болочки р42 ВОВ, нами была проведена йммунопрецшштация прс-;уктсв трансляции отселектированной MPffit антисывсроткзми к ¡труктуряым белкам вириона pi2 и р42. Оказалось, что обе эти штисыворотки специфически прецийитируют 35s- меченый полипеп-вд с мол. массой 42кД, а такяе небольшое количество полипепти-[а с мол. массой 12кД(рйс. 2

. По данным Rosel J. и Moss В. (1985), з левом Hind II-A-Sal-®párMeHTe ДЕК ВОВ имеется 4 левоналравленные откры-ые рамки трансляции, способные кодировать бедки с мол. массой (orf ЗК), 17(orf 17К), 26(orf 26Ю И 72кД (orf 72К)(рис.3 ) есьма ■ вероятно, что выявленный нами в продуктах трансляции

-:-—j Рис. i? Злектрофорегрзмма

—- - . ' „ иммунолреципигатов антисы-

с i

1 ■— дшш ■» . вороток с продуктами беск-

• . ' деточной трансляции отсе-

! .i . ' . лектированной мРНК.,

I. 1-преципитация продуктов трансляции - мРНН. отселекги-роваякой на ялазмиде pE¡R322 сывороткой неиммунизировая-: лого кролика; 2-то да с

....... антисывороткой к бедку р12

i Л 3 4 5 5

3-е антисызорЬгкой к белку р42; 4-.ггреципнтаяия лродук-зв трансляции.' мРНН,", -'отселектироваяньк > ва левом Hind t I-A-Sal-фрагменте. ДНК. BOB ; сывороткой йеимыунизнроваяного золика;-б-то *лэ " (; антисывороткой к. белку р12;б-с антксыэорот-)й к белку р42. ;

гибридазукщнхся ыРНН полшеитид с кол массой 70кД являете* 'иредяесменникои бедка- УР4Ь, гея которого был картирован ранее, а лодшгептиду с мол, массой 27кД и 17кД ссотЕетствута открытым раыкая трапсдяцш огГ 26К и ог.Г 17К. В этом случае яос-

esu л н w с а в я г о j я я ¿ г a / .у гг

( IIM I_' ' ' It»_i—i_t I , ■ ■ II» »11

С fffífí FBalGiJltZ) í *

z > 111,1-1-u—1... „, i i I ,,-ь—-^jjt---nr-

f

Hind Sa£I

i t^ l

\

. Sai Jai SMU

■i' ' - > ^

Hixé tfgg h i-

£

. SssjSt}

** orf я К vrf 16 К

VP №

artas

Pec. з Весгрикщипнш карты ДНК ЮЗ оташа VR.

1-карта Sail -фрагментов;

2-Hind Ш-фрапентов; 3-Hind III-A-iíparitóHTa со рост--лкгаге Sal!; -»-девьй Kind Il!-A-SaJ-<i¡paruenT ДНК ЭОЗ

едователыюсть ДЗК с открытой рамкой трансляции orf 9К иогди ы Сыть геном белка р12, одигомеризация которого приводит к оявлэнмо белков р20 и р42.

Для проверки этого иредпо-кмвения ген 9К был клонирован i; актериальном зкспресеирувдем векторе pUR 290 (рис.4). Прг. зонировании гена ыы использовали данные ло первичной структу-е ДНК пггаима WR. Из первичной структуры левого Hiño II-A-Sal-фрагмента штамма V/R следует, что при гидролизе зндо-yiote азами рестрикции Dra I и Hir.d III среди прочих доляен влепляться фрагмент длиной 1378 п. н. , содержаний ОРТ 9К. :ент сходной длины, предположительно содерасзщяй гомологичный en ЗК, вышеплялся также и при гидроличе Oral и Hind III плаз-ид ной ДНК, содерладрй Hind III-A-Sal- фрагмента ДНК ВОВ шгам-[а Л-ИВП. Выделенный фрагмент лигировадм с линеаризованной эя-,онуклеазой Sma I влазмндой pUC 19. Затеи ДНК экетригнровааи месью фенол-хлороформ, пэреосаядали и вновь обрабатывали зндо-уклеазой Sma I для гидролиза кольцевых молекул вектора, соз-;агвз«с при трансформации Е. col i высокий фон ( рис. 4) Шлученным репаратом трансформировали клетки Ecoli Jm 103 и высевали на едективную среду, содержащую ампициллин и ВИГ. Для последур-¡его анализа отбирали колонии с lac- йенотшок.

Ориентацию встроенного фрагмента вирусной ДНК проверяли естрикционным анализом гибридных плазыид. Кроме зтого Dar роведен анализ первичной структуры ДНК ллазмиды dU9K методом ¡аксаыа -Гилберта. Было показало, что рамка трансляции вирусого оелка. как и ожидалось, совпадает с рамкой трансляции пептида^-галактозидаа'ы Несмотря на это, экспрессия химерного елка в клетках ЕсоЬ , трансформированных- гибридной агазми-;ой рШК наблюдалась очень слабо (. в количествах, недостаточ-

кых дда получения антисыво ротки).

В вшш зтого ш перекяшзироважв последовательность вирусной ДШ из плазивды рШК в плазмиду pUR 290 по сайтам рестрикции Bgl II и Вгзя HI (рис.4 ). Анализ первичной структуры показал, что при этом рааса трансляции вирусного белка такяэ совпадала с ргис-хй трансляции - галастозидазы.

Здектрофсретяческий анализ показал, что в лжзатах клето! Е. coli ЕЩ 71-18, трансформированных полученной гибридно: ялазкидсй pUR 9К имеется дополнительный полипептид с мол. масо: 1.25-12СкД, отсутствующа в аналогичных лиэатах клеток, транс-аорыироваяных исходной плазыздой .

Зля идентификации продукта гена 9К в составе вириокил Зелкэа BOß каик была получена кэноспзцифическая антиекг-- — г;

:*(• нимш-А-вйМгедек«!

:<лшиссвання гена гг. из лаес сагжента ¿лл ¿СЬ штамма

;с х;гяр;юм7 боджу. выделензю«у эл&кггрофогетячзски из лизагов клэток Е. col i, травгфоркгарозашак пйридной пдазшщой pUR 9К.

Мзтодом ии^укоблптикга показано, что эта аятксквсротка гтцкйяпесга взаимодействует с белком р-12 и в меньшей етепеки 2 белком р12 оболочки виряоиа (рис. 5).

Цмсэденные данные подтверждают выдвинутое наич предположение о том, что гея 9К из левого Hind IlI-A-Sal-фрагмента ЛЕЕ ЗОВ кодирует белок оболочки pi 2. сляго^ризгция которого дри-зодит к появлению белков р£0 ;г с42.

Как ми уже отмечали, в. сс.сгаз оболочки ЮВ сгзмка Д-КШ сходят 5 маяоркых лолипептилез. Работа по картировании гена 5елка р'35, осуществляемая рядом исследователей, з настоясее -pev.cj заверена Изучении белков р12, р20 и р42 л локализации :х гегаз на карте генсма ВОВ яссвяяг>«1 описанная рзЗотз.

.Яомч были получены мояоспезрфичесете антисыворотки к ое-лчлыгнм бедедм оболочки pi9 » рб1, проверено :к взаимодействие

Рис. 5 йкауяоблстетг структурных бел-(QB ©а ■ кон ВОВ с аятаеызероткой к химерному

Сзлку.

i ' •

¡ 1-сукаряда белка вчркока ВОВ;

I 2-белка яе®г£иш!раваяшх клеток СУ-1;

] ; 2-белки оболочки Ейртена ЗОВ;

i <

-S-белкя сериаевиЕЫ вирисна ЗОЕ

с сушаршат вирусными белками, а такаэ проведен кммуаопроци-питашишыа азализ продуктов трансляции сугеваряых вирусспэци-фкческш «РЕК . Окаашгась.что эти антисыворотки ке взаимодействуют ни с одним из продуктов трансляции вирусспецифичесгав: ыРНК. По-видимому это связано с тем, чго в бескгетоздой 6с-лок-еинтезирущей системе скнтезяруотся полилелтиды, сущес?-ванно от дичащиеся по своим антигенным свойствам от зредш белков аириова р19 к рб1, использованных для иммунизации.

Таким образом мы обиарузеши, что направленное картирование генов этих белков методом гиб радиационной селекции ви-русспецифических мРНК на фрагментах вирусного генома с последующ« шнунохишческкм анализом продуктов бескдеточаой трансляции ке имеет перспектив. Поэтому ш попытались определил локализацию гена бежа оболочки рб1 при помоши аяьтернативиогс подхода.

Согласно данным Rosel J. L. и tes В. ( 1986.), открытая рамка. трансляции ОРТ f5 из Hind Ш-H-фрагмента fflli аггаша ЗД2, кодирует полипептид с мол. массой бУкД. фи анализе аииюкис-лотнЬй последовательности соответствующего полипептида . бшк обнаружено, что белок с мол. массой 67кД шзкет иметь поверхностную локализацию, т. е. может входить в состав оболочки в;<-риона. Исходя из этих данных' мы предположили, что ОРТ Нэ игаммг VR шжет соответствовать гену мадарного бежа оболочки вирионг ВОЬ- p6i.

3. Картирование гена белка р90 иэ Hind ПЫ-фрагментс ДНК ВОЕ.

Для проверки этого предположения ген 15 из Шпс Ш-1-фрагменга ЛНК шташа Л-ИВП был клонирован нами в бактериальном зксЕрессирутеем векторе plie 1S.

фи кяонироваакл гена ¡5 кз Hind ИЫ-Фрагшята ДНК DOB (гамма Л-ИШ использовали данные по первичной структуре гсио-:огичного Hind III-Н-фрагмента ДНК аггамма №. На рис. 6 предс-авлена использованная нами схеш клонировав^ гена 15 в зкс-рессирутощгм векторе pl'C 19.

Из первичной структуры Hinc) Ш-Н-фрагмента штампа ледует, что при гидролизе экдокукяеазами рзстрикции ffep i и ¡га I среди прочих дзллэн вылепляться фрагмент длиной 1684 :. я., содержащий ОРТ 15. Фрагмент сходной длины, предположи-зльно содержащий ген 15 выщеплялся таю» и при гидролизе укз-анныки рестриктазаии плазмидной ДНК, содержащей Hmd II-i-фрагмент ДНК ВОВ птамш. Л-Ш1 Выделенный фрапаенг ляги-

,-iiryjiu uaamtnt I

Оч» kMs< Or el o>J O-H

А», ^/g-BilWII

\*i.£ Cssia reioreipotamw гена 15 аз Hind 111-1-фрап«кт» ".-}'. 2C3 ':таюа Д-йБП

ровали с .¡мнеаризовазяой рестриктазой Sma I плазмидой pLC 19 ■Затем ДНК экстрагировали смесью фенол-хлороформ, 'переосаждая и вновь обрабатывали эндонуклеазой Sma I ря гидролиза кольце вше шлекул вектора, создающих при трансформации Е.coli высо кий фон (рис. б).. Отбор гибридных клонов вели по фенотипу 1а на среде, содержащей ампициллин и БИТ. ориентацию встроенное фрагмента вирусной ДНК определяли рестрикционным анализом гибридных плазмид. ' Один из отобранных наш клонов, содержали: гибридную плазмнду pUI5, со встроенным в нее геном 15 в правильной ориентации , наработали в препаративных количествах i условиях индукции сиятеза^-гадактозидаэы ШГГ.

Как следует из приведенной схемы (рис.6), при описанном способе клонирования рамка трансляции гена 15 должна совладал с рашой трансляции$г"алактозидазы. При этом в клетках £.coli , трансформированных гибридной плазмидой должен синтезироваться дополнительный полипегггид состоящий из 18-ти аминокислот, кодируемых векторной плазмидой, последовательности вирусного белка без 14-ти последних аминокислот и остатка -пептида -га-лактозидазы. Расчётная мох масса такого полипептида составляет 73кД. .

Злектрофорегический анализ показал, что в лизатах кле-токЕ. col 1 Jm 103, трансформированных плазмидой рШ5 имеется дополнительный белок с мол. массой 68кД, отсутствующий в аналог гичных лизатах клеток, трансформированных исходной плазмидой PÜC19 .

Цш идентификации продукта гена 15 в составе вириошшх белков ВОВ, нами была получена мояоспецифическая аятисыворотка к химерному бедку, ввделенному элекгрофоретически из лгаатов клеток ¿coli, трансформированных гибридной плазмидой pUI5. Оказаюсь, что данша антксызоротка в реакции иммуноблотинга

пецифически взаимодействует с одним белком Еириона ВОВ, вхо-зщим в состав его сердцевины и иыещим мол. массу в пределах >100кД . В составе сердцевины ВОВ в этой области иол. масс леется несколько лолипептидов,. в том числе и белок р90. Этот ;лок был выделен вами злектрофоретически из сердцевины вирио-1. Далее было показано, что именно белок р90 взаимодействует полученной антисыворогксй как в реакции кммуноблотинга.так и реакция РИА (рис. 7А).

Обращает на себя внимание несоответствие мое. массы белка Ю с расчетной юл. массой продукта гена 15. Как. говор;1лось 'ле, в настоящей работе наш были использованы данные по пер-чной структуре Ншб Ш-Н-фрагмекта ДНК ВОВ итамиа V-?. Сог-.сно данным йозе1 Ь. и В. (1365), вслед за геном Н5, в ной раже считывания с ним, расположи гея №1, кодирующий лок с расчетной мол.'массой 21,5кД. К моменту завершения нас-вдей работы в литературе были опубликованы данные по полной рвичной структуре ДНК ВОВ штамма Копенгаген . Согласно этим иным йоеЬе1 Б. Л. и Рао1еШ (1990) в ДНК ВОВ штамма Копенга-т по сравнению с опубликованной ранее структурой ДНК шгаша , имеются делецйя и вставка по одной п. в. , приводящие к юнию ОРТ Н4 и ОРТ Е5 (для штачма в одну ОРТ Н4 для шма Копенгаген, способную кодировать лолгагептзд с мол. шо-! 93, ад ' •

Вами такие было секвенировано 150п. н. в области' предпола-'мого стоп-кодона ОРТ 15 етамма Л-Ш1 Цри этом было усга-лено, что первичная структура этой области ШШ втачма Л-ИЕП достыо совпадает со структурой ДНК итамма Копенгаген и ст-ается от структуры ДНК штамма УД отсутствием терминирупзэгэ нала ОРТ 15. Ш-видимому в Н1пй Ш-1-фрагменте ДНХ БОЕ мма Л-рп, также, ^ак у вта}>9,я Копенгаген имеется сдаа

Рис.Яйакмодэйгавие антисыворотки к продукту экспресс;! гена I5CACI5) в клетках Е.coli с вирионкыми белками вируса ос иовакшшы в реакшга РИ.4. В качестве андаенов использовали: - белок рЭО сердцевины ьириона; б - суммарные белки вириош Si-ном додецилсульфате • натрия и 5%-аом й-мзркаотоэтаноае; t керавруиеннкй вяриов; г - кераарузвешая еерпдевияа. 1 - AG Iс 2 - кеиА!муняая сыворотка кролика. ГЬ оси абецксе - log^N г; К-разведекие сыворотки. По оси ординат - счет радиоактивное:

IZ5 -I

! (в тыс.ккк./мкк )

~1Ь-

слитая" OP?, кодирующая полипептид с мол, массой ЭЗ.бкД - pSO.

Далее.нами было замечено,что белок р90 в реакции иммуноб-отинга взаимодействует с кроличьей антивирусной сывороткой, оскольку при иммунизации кроликов живым вирусом преимуцзст-енно происходит наработка антител к поверхностным антигенам, ами было проверено, не экспонируется ли белок р90 на поверх-ости вириона ВОВ.

Для этого неразрушенный вирион BOB, разрушенный вирион, а акж его сердцевину, фиксировали этанолом на полистироле и спользовали их в методе РИА на способность взаимодействовать полученной антисывороткой к химерному белку. Ба рис."?(Б, BJ :;дно, что эта антисыворотка специфически взаимодействует как с азрушенньм вкрионом ВОВ, так и с неразрушенными сердцевиной и злым вирионом.

На основании этих данных можно заключить, что белок рЭО ■леет антигенные детерминанты, экспонированные на поверхности ариона.

Таким образом.нами было проведено клонирование гена 15 из ind I II-I-фрагмента ДНК ВОВ штамма Л-ИШ в составе бактери- . юьного экспрессирущего вектора pUC 19. Получена мояоспедофи-гская антисыворотка к продукту экспрессии данного гена, уста-звлено, что она взаимодействует с одним белком вириона -р90. сказано, что в ДЕ5С штамма Л-ИВП вместо двух ОРТ Н4 и Ш , писанных для штамма W? , присутствует одна "слитая " ОРТ. здирушая белок р90. Этот белок ассоциирован с сердцевиной 1риона ВОВ, однако имеет антигенные детерминанты , экспониро-шкые на его поверхности.'

- Полученные результаты меняет наши представления о морфо-згии вирионов БОЕ Оказалрсь, что бедчн , достаточно прочно гязанные с сердцевиной п:тр;;рна, могут прояизкваг.ь его сОолоч-

-TS3-

Рис.® Гипотетическая сх'ёма укладки белка р90 относительно вируЬкьк "меиб'рак.

ty и, при этом, частично экспонироваться на его поверхности. В гаучной литературе на сегодняшний день не описаны подобные фе-юмена Не исключено, что белок р90 ке является единственным в звоем роде белком, обладавшим описанными свойствами.

Далее нами была сделана попытка представить схему укладки занного беда относительно вирусных мембран. Анализ аминокислотной последовательности был проведен с помощью пакета данных 'C/6ENE версия Releas 5.50/1991. На основании проведенного кэмйыгаерного анализа построена гипотетическая схема компарта-антализации fiesta р90 (рис. 8).

Вместе с тем, необходимо отметить, что выдвинутое нами Предположение о том, что ОРТ 15 штамма Л-ИБП соответствует гену ¿агарного белка ободочки вириона р61 , не подтвердилось. Вод-юс с [картировании генов белков р!9 и р61 пока остается открытым.

Как мы уж отмечали, направленное картирование генов этих _ Зелков методом гибридизационной селекции и иммукохимическим шалязом продуктов бесклеточнсй трансляции не имеет перспектив. Возможным подходом к юс картирования молет быть либо пря-юе секвенирование ( если это возможна) : либо продолжение систематического анализа ОРТ с получением продуцентов отдельных шрусных белков и иммуксхимическим та анализом.

ШБОЛЫ

:. Проведен трансляционный анализ фрагдантов ЛНК ВОВ ламма Л-ЙЕП. перекрывающих около 7СХ генома ( h'md III-5Г< F, i, ]. H, К, H. O, P, N, L-фрагментоз, a такав левого ri i ne! ; IJ-A-Sai -фрагмента), В продуктах трансляции мРНК. гиеридизуг?-щхся с указанными фрагментами вирусной ДНК вшвлеяо около 30 ;с.та:ептидса с \«сл. массой от в до 1С0кД.

-Cl-

2. Трансляционным анализом, а также с помощью имыунохими ческой идентификации продукта экспрессии гена 9К из левого Hind III-A-Sal I-фрагмента в Е. coli установлено, что данный ген кодирует иалорньй белок оболочки р!2.

3. ГЬказано, что белки оболочки р20 и р42 являются олиго мерами белка оболочки р12.

4. Излучен бактериальный продуцент белка, кодируемого ге ном 15 из Hind III-¡-фрагмента ДНК ВОВ штамма Л-ЙВП.

5. С помощью иммунохимического анализа продукта зкспрес сии гена 15 в Е. coli показано, что исследуемый ген кодирует белок р90, ассоциированный с сердцевиной вириона и имекций антигенные детерминанты на его поверхности. Представлена гипотетическая схема компартаментализации белка р90.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях

1. Нетесова К А., - Муравлев А. И., Чешенко Е Е , Чиказв Е L , Цалыгия Э. Г. Иммунохимический аналиа продуктов бескдеточ-ной трансляции .. мРШ, гибридизукщейся с левьш Hind 111-A-SaL-tfparieHTOM ДНК вируса осйовакцины//Мзлекул. генетика. -1989. -M1-c. 21 -2а

2. Куравлев А. И., Нетесова К А., Тихонов Е Я., Малыгин Э. Г. Анализ структурных белков и продуктов бесклеточной трансляции мРНК вируса остовакцины с помощыз моноспецифическкк антисыаороток// Молекул, генетика.-1989-N10. с. 19-24.

а Нетесова К. А.-, МУравдев А. И., Чикаев Е А., Ызлыгга •З.Г. Структурно-функциональное исследование Hind Ш-1-фраг-й-зкта генома вируса осповакцины нтадма Л-Ш1 I Клонирование гена 15 м идентификация его белкового продукта //Мэлек. бкодо-Г'ля. 1091.7. 25 вьи. О. . с. 1525-1532.