Трансформация и транспорт авсцизовой кислоты при росте и покое у растений

Власов, Павел Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Трансформация и транспорт авсцизовой кислоты при росте и покое у растений
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Трансформация и транспорт авсцизовой кислоты при росте и покое у растений"

а правах рукописи ЦК 581.192.7+581:143

ВЛАСОВ Павел Валерьевич

ТРАНСФОРМАЦИЯ И ТРАНСПОРТ АБСЦИ30В0Й КИСЛОТЫ ПРйкюТЕ И ПОКОЕ У РАСТЕНИЙ

• Специальность: 03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук.

Москва 1996

Работа выполнена в лаборатории природных и синтетических регуляторов Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН.

Научный консультант - доктор биологических наук, профессор

В.И.Кефели

Официальные оппоненты: • академик РАСХН, профессор

Г.С.Муромцев

доктор биологических наук, Н.П.Кораблева , доктор биологических наук, ' Д.И.Чкаников

Ведущая организация - Главный ботанический сад РАН

Защита состоится 6 " июня 1996 года в 10 чао 30 мин на заседании Специализированного совета Д.002,45.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН. Адрес: 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Ученый совет ИФР РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Автореферат разослан 5 мая 1996 г.

профессор профессор

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Загоскина Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Абсцизовая кислота, которую физиологи растений изучают более 30 лет, представляет собой полифункциональный ингибитор регуляции хзста. Еще в начале 60-х годов опыты с почками явора привели Усрпн■ 'а к мысли, что существует специфический ингибитор роста, вызывав щй покой почек. Ингибитор со сходными свойствами был выделен Уо-шнгом и из почек березы (Betula pubescens). В связи с тем,. _что это (ещество, нанесенное на почки растущего растения, индуцировало у ;его состояние покоя, автор назвал его "дормином". .

Итак, опытами 1960-х годов было показано, что абсцизины спо-обны вызывать опадение черешков (abscission), задерживать (retsration) рост стеблей, ингибировать (inhibition) прорастание 'сеыян, лубней, почек, подавлять (depression) функции гормонов-стимулятор эв, иными словами, проявлять гамму свойств, приводящих к задержке злого ряда ростовых процессов, В 19В7 г. новый ингибитор роста бы-з решено назвать абсцизовой кислотой_(АБК).

В конце 1970-х - начале 80-х годов АБК стала рассматриваться iK гормональный фактор ингибиторного типа на том основании, что ia транспортируется по растению и оказывает тормозящее действие не >лько на рост, но и на фотосинтез и транспирацию растений £Усрккг, шлипс, 1984]. В свою очередь Дёрфлинг С1985] включил АБК jb систе ■ гормонов и ингибиторов растений и показал многозначность зффек-в АБК в системе целого растения. Изложенное позволило составить едставление о функциональной роли АБК в растительном организме, лее того, по уровню АБК стали оценивать на реакцию стресса сорта льскохозяйотвенных культур. Химики продолжают экспериментировать метаболитами и аналогами АБК, пытаясь создать сильный ингибитор и ретардант, имитирующий эффект природной АБК.

Актуальность исследований абсцизовой кислоты тесно связана о ?спективами изучения этого гормона в самом растении на разных злах онтогенеза и с вопросом практического его использования. Неценно, что в ближайшем будущем найдут свое перспективное разви-» такие актуальные проблемы как:

1) практическое использование самой АБК и её дериватов как по-[циальных защитников растений от стрессов (стресс-протекторов); •

2) проблема биосинтеза АБК в отдельных частях растений: кср-

нях, стареющих листьях и семенах;

3) транспорт как самой АБК, так и её дериватов в растениях;

4) изучение роли АБК в процессах обезвоживания семян и ухода их в состояние покоя и в хранении семян.

Проблема функции АБК тесно соприкасается с регуляцией основных физиологических процессов, в которых участвуют и другие гормоны. В то же время исследования АБК выходят на новые рубежи, в частности на уровень практического применения этого гормона и его дериватов в сельском хозяйстве.

Цеди и задачи исследования. Основной целью- настоящей' работы' явилось создание современной концепции о физиологии действия абсци-зовой кислоты, которая включает:-

1) Охарактеризовать методы выделения и идентификации"абсцизо-вой кислоты;

2) Изучить проблему образования биосинтеза, катаболизма и транспорта абсцизовой кислоты. Для этого:

- рассмотреть особенности тормозящего действия абсцизовой кислоты и других природных ингибиторов;

- дать характеристику проблеме абсцизовая кислота как регулятор покоя и роста растений;

- описать основные свойства абсцизовой кислоты, её функщй;

- суммировать основные представления о возможных механизмах действия абсцизовой кислоты в связи с биосинтезом и функционированием в растительном организме.

Научная новизна исследований. Впервые дано систематизированное ' представление о роли абсцизрвой кислоты.как гормональном ингибиторе роста. Представлены данные о зависимости активности АБК и ее дериватов от химической структуры. Охарактеризована система транспорта абсцизовой кислоты вместе с пасокой по ксилеме древесного растения, а также конъюгация и катаболизм абсцизовой кислоты. Установлено, что весной ' в пасоке березы содержание АБК достигало значительной величины (40 нг/мл). 14С-АЕК, введенная в основание черенков березы, сравнительно быстро перемещалась в акропетальном направлении и

метаболизировалаоь в коре с камбием и древесине с образованием -глю-*козного эфира АБК. [Власов, Леманн, 19853. Форма, в виде которой АБК перемещается, пока неясна, большинство данных позволяет эаклю-

- б -

чить, что это свободная форма АБК. Итогом научных поисков в области физиологии абсциэовой кислоты явилась книга "Природный ингибитор роста - абсцизовая кислота", написанная с соавторами.

Практическая ценность. В настоящее время.большое внимание уделяется поиску аналогов абсциэовой кислоты, как возможных антистрессовых факторов. Познание физиологии АБК и механизмов её действия ускорит этот процесс поиска и сделает его более целенаправленным. Проведенные исследования по изменении уровня АБК при действии стрессовых факторов с несомненностью указывает на её роль в регуляции устойчивости растений. В связи с этим АБК может быть использована как основа для поиска нового класса стресс-протекторов. Несомненно знание физиологии действия АБК при росте, дифференцировке, покое и в условиях стресса создаст основу для конструирования- молекул нового класса регуляторов и дефолиантов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано работ и две монографии в соавторстве.

Структура и объем диссертации. Текст диссертации излЬден на страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, методов и результатов исследования и выводов, списка литературы наименований. Диссертация иллюстрирована рисунками и содержит таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Растительные объекты.

Объектом исследований служили следующие виды растений:

1. Побеги березы (Betula pendula L.) прироста прошлого (весна) или текущего (осень) года. Опыты проводили с-растениями, находящимися в состоянии покоя или в период распускания почек и интенсивного сокодвижения.

2. Трехлистные флеши из зрелых побегов чая (Thea sinensis), сорт "Кимынь". Сбор флешей проводили в периоды активного роста (май) и покоя (декабрь).

3. Шестидневные проростки пшеницы (Triticum aestivum, сорт "Harti"). Исследовались растения, подвергавшиеся действию высокой (37°, 14 час), низкой (4°, 14 чао) температур и обезвоживанию. Листовые экспланты хлопчатника (Gossypium hirsutum L.). Изучались -зе;

ленью и альбиносные мутанты. »

4. Листья томата (Lycopersicon peruvianum), полученные-из целых растений, находящихся в фазе цветения. Трехдневная суспензионная культура клеток томата (Lycopersicon peruvianum), полученная из семядолей. Культура выращивалась на модифицированной среде Ыураси-ге-Скуга, содержащей обычные количества макро- и микроэлементов, за исключением РеБОд, содержание которого было в два раза выше. Клетки выращивали в режиме свет (500 люкс)-- темнота (соответственно 14 час/10 час), на роторных качалках (150 об/мин).

5. Изолированные семядоли тыквы (Cucurbita pepo L.), семена табака (Nicotiana tabacum L.) и фисташки (Pistacea vera L,).

Определение .АБК.

- Прежде чем остановится на приемах выделения АБК, необходимо отметить, что этот растительный гормон является сесквитерпекоидоы с молекулярной массой 264 и обладает оптической активностью, так как содержит в положении 1' ассимыетрический атом углерода. В растении встречается только один S = (+) энантиомер. Помимо оптической, молекула АБК проявляет также и геометрическую изомерию. В растениях наиболее широко распространена S - (+)2, цис-4-транс-абсцизовая кислота, которую обычно называют абоцизовой кислотой , или АБК (рис. 1).

Экстракция, фракционирование

Экстракцию АБК из свежего растительного материала проводили охлажденным метанолом, из лиофшшзированного материала - Q0X метанолом. Водный остаток, полученный после выпаривания, очищали.замо раживанием с последующим оттаиванием и обрабатывали сернш эфиром, свободным от перекисей. Полученную эфирною фракцию подвергали 6и-карбонатной очистке. В отдельных экспериментах вместо би^рбонатной очистки применяли очистку эфирной фракции на колонках (15 х 1,3 см) о щелочным или нейтральным AI2O3 CKrawiarz; 1973]. Последующий анализ АБК из кислой эфирной фракции (pH 3) включал в себя очистку с помощью хроматографии на бумаге, тонкослойной, жидкостной хроматог-рафш, оценку биологической активности, идентификацию (снятие спектров дисперсии оптического вращения (ДОВ), хромато'-масс-спект-. рометрия, газожидкостная хроматография (ГКХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЗЖХ) ).

Хроматография на бумаге. Оценка активности АБК с помощью биотестов.

Хроматография на бумаге применялась в сочетании с биотестами. При этом учитывалось, что при одномерной хроматографии некоторые вещества фенольной или гормойёльной природы■могут иметь одинаковые с АБК значения ИГ и тем самым исказить результаты биотеста. В связи с этим нами была проведена специальная работа по выявлению селективных смесей растворителей, позволяющих отделить АБК от других ре-гуляторных веществ (табл. 1). Разделение проводилось в восходящем токе растворителей [Власов и др., 1973].

Таблица 1

Значения природных регуляторов роста, разделенных о помощью хроматографии на бумаге в разных смесях растворителей

ч Смесь растворителей 1 |Абсцизо-| вая |кислота I 1 1 |Пара-ку-|Флорид- |мировая | айн |кислота | ■ 1 1 ■ 1 | ГК 1 > | ИУК 1 '

н-Бутанол-СНэСООН-НгО 0,77 0,35 0,37- 0,62 0,53

(3.2:95)

а-Бутанол-СНэСООН-НгО 0,96 0,94 0,80 0,90 - 0,96

(40:12:28)

Я-Бутанол-1,Б N ЫН40Н (3:1) , 0,63 0,15 0,16 0,34 0,21

а-Бутанол-этанол-НгО 0,87 0,75 0,77 . 0,60 0,02

(4:1:1)

я-Бутанол-5 Н МН40Н (1:1) 0,56 0,12 0,16 0,49 0,53

Язопропанол - Ш4ОН Н2О 0,74 ' 0,39 0,33 0,52 0,37

(10:1:1)

Изопропанол (ЩОН «НаО 0,81 0,54 0,52 0,75 0,53

(80:5:15)

з-Пропанол - Н^О (3:1) 0,88 0,81 0,86 0,73 0,73

1.5Х-ная СН3СООН 0,76 0,62 0,58 0,79 0,68

5Х-ная СНэСООН 0,71 0,40 0,40 ' 0,83 0,3.

Язопропанол - Н2О (5:2) 0,92 0,86 0,89 0,83 0,87

- а -

Проведенная работа оказалась одним из немногих исследований, связанных с выделением селективных смесей растворителей при анализе АБК. Её результаты приводятся в сводках по методам и определен;® АБК в растительном материале [Dorfling, Tietz, 19833. Принцип селективности применялся нами и при выборе биопроб на АБК. Для'определения активности АБК атому критерию соответствовали тосты на ингибирование роста отрезков колеоптилей пшеницы [Бояркин,. 1968] и торможение прорастания семян горчицы СПоздова, 1973; Коф. к. др., 1973]. Эти тесты являются специфичными (рис.2), а растительный материал, используемый для биопроб - стандартным, т.к. кривая Гаусса - одновершинная и вытянута вдоль оси ординат (рио.З) [Кефели и др., 1973, 1975]. "Л:

Тонкослойная хроматография. Для анализа использовали готовые пластинки о тонким слоем силикагеля Silufol UV-254 (Kavalier, ЧССР), HF-254, GF-254 (Merck, ФРГ). Хроматографическое разделение проводили в следующих системах растворителей: хлороформ-метанол-вода (70:12:0,5), бензол-этилацетат-СНзСООН (50:5:2), хлоро-форм-бензол-СНзСООН (100:100:1), толуол-этилацетат-ыетакол-'СНзСООН (50:30:7:4).

Хроматография на колонках. Очистку экстрактов проводили на колонках о ДЭАЕ-сефадексом А-25 [Grabner et si., 1975; Dathe et al., 1978]. После выпаривания экстракта досуха осадок растворяли б СО* метаноле и наносили на колонку (45 х 1,1 см). Злнция проводилась в следующем порядке: предварительная злюция - 50 мл 80% метанола, предварительная злюция (вторая) - 50 мл 0,25% СНзСООН в 80% метаноле, злюция (1-5) последовательно по 80 мл 0,25 н; 0,5 н; 0,.75 н; 1 н и 3 н СНзСООН в 80% метаноле.

Газожидкостная хроматография (ГКХ). Предварительно 'очищенные пробы метилировали эфирным раствором диазометана. Анализ проводили на газовом хроматографе "Газохром НОВ" (СССР) с детектором по захвату электронов. Условия хроматографического разделения: колонка 2,0 х 0,003 м, заполненная Gaschrom Q (80-100 меш) с 3% SE-30. Температура: испарителя - 250°, детектора - 230°, колонки - 180°; газ-носитель - азот (40 мл/мин). Для идентификации АБК с помощью ГЖХ метилированные образцы облучали светом (X -254 ни). В этих условиях цис форма изомеризуется в транс-форму LSaunders, 1978; Маргвелашви-ли, Власов, 1986]. Для снятия спектров дисперсии оптического вращения (ДОВ) подготовка растительного образца включала в себя последа-

вательную хроматографию на колонках и тонкослойную хроматографию. Спектр ДОВ снимался на спектроподяриметре "Jasco".

Определение глюкоэного эфира АБК (АБК-глю). Растительный материал гомогенезировали в 80% метаноле. Экстракт выпаривали до водной фазы, последнюю центрифугировали (20000xg, 30 мин) и экстрагировали смесью этилацетат-н-пропанол-н-бутанол (50:5:10). Этим раствором полностью извлекается свободная АБК и около 92% глюкозного эфира [Lehmann, 1985]. Экстракт выпаривали, остаток растворяли в метаноЛе и хроматографировали на пластинках с силикагелем HF-254 в системе растворителей толуол-этилацетат-метанол-СНзСООН (50:30:7:4). Зоны хроматограммы, соответствующие веществам-стандартам - АБК и АБК-глю злюировали и анализировали с помощью высокоэффективной /&1Д КОС Т НОН хроматографии (ВЗЖХ) Li Chrosorb RP-(Ö мкМ), колонка 250 к 4 мм . Элюция: 50% метанол/0,IX водная Н3РО4 (для АБК-глю) ; 60% метанол/0,1% водная Н3РО4 (для свободной АБК).

Методы, применявшиеся при исследованиях транспорта и метаболизма 2-14С-АБК.

1. Побеги березы. Черенки однолетних побегов березы погружали

в раствор 2-14С-АБК (на 44 часа) (8,4'10е расп/мин)... Затем каждый

черенок разделяли на 6 частей (нижнюю часть черенка, погруженную в раствор не исследовали), каждую часть препарировали для отделения

коры, древесины и почки и определяли в них радиоактивность (спектрометр "Tricarb", Packard, США). При изучении метаболизма 2-14С--АБК анализ проводили следующим образом: 6-10 г растительного материала гомогенизировали в 80% метаноле (2-3 раза по 5 мин гомогенизатор

(Turex, ФРГ), затем гомогенат фильтровали под вакуумом через стеклянный фильтр N 1 или N 2 с кизельгуром. Фильтрат выпаривали до

водной фазы,■ которую затем центрифугировали (lOOOOxg, 10 мин), на-

досадочную жидкость очищали с помощью н-гексана (2-3 pasa), счищен-

ный экстракт выпаривали досуха, осадок растворяли в смеси мета-

нол-ацетон-зтилацетат (1:1:2) И хроматографировали в тонком слое

силикагеля (пластинки Silufol UV-254) вместе с веществами-стандар-

тами АБК и АБК-глю в смеси растворителей хлороформ-метанол-вода

(70:12:0,5). После просмотра хроматограмм в УФ-свете проводилось

измерение каждой зоны хроматограммы. Выход радиоактивности прове-

рялся после каждой ступени очистки экстрактов.

2. Листовые черенки и суспензионная культура клеток Lycopersi-con peruvianum. • '

Экстракция растительного материала.

1) Клетки. Препарат 2-14С-АБК асептически добавлялся к ил клеточной суспензии. Общая радиоактивность препарата составляла величины порядка 4"10® расп/мин. В каждом эксперименте использовали 15 мл' этой суспензии, содержащей 4,5 г клеток. После инкубации клеточную массу фильтровали на фильтре G-100, затем осадок промывали водой и гомогенизировали при 20000хе (3 мин) на гомогенизаторе "Ти-гех" в смеси этилацетат-метанол (50:10). После гомогенизации смесь ' фильтровали (фильтр G-100), осадок 3 раза промывали смесью етилаце-тат-метанод (50:10). Объединенный этилацетатно-метанолышй гомоге-нат выпаривали практически досуха и наносили на пластинку" с тонким слоем силикагеля. Хроматографическое разделение на Тонком слое си-ликагеля проводили на пластинках HF-254 (Merck, ФРГ) или Silufol UV-254 (KAVALIER, ЧССР) в следующих системах растворителей: 1. то-луол-этилацетат-метанол-СНзСООН (50:30:7:4); 2. бензол-этилацетат--СНэСООН (50:30:4).

2) Листья. Все процедуры после инкубации (20 час. с 2- 14С АПК проводили также, как и при экстракции клеток.

3) Фильтрат кудьтурадьной жидкости. Фильтрат и промывные воды объединяли, подкисляли (рН 3), затем экстрагировали (3 раза) смесью этилацетат-н-бутанол-н-пропанол (50:10:5). Экстракт упаривали досуха, осадок растворяли в небольшом объеме смеси атилацетат-метанол (50:10) и хроматографировали в тонком слое силикагеля.

Гидролиз продуктов метаболизма г-^'Чз-АБК. •

Для гидролиза вещества со значением Rf глюкозильного эфира АБК соответствующее пятно соединения (или зона, « если пятно не было видимым) счищали с пластинки шпателем на стеклянные фильтры (G-40) диаметром 1см. После алюции НгО элюат подщелачивали 1н NaDH до рН 8. Гидролиз проводился в течение 1 час при комнатной температуре, затем щелочной элюат подкисляли 1к НС1 до рН 3, экстрагировали 3 раза этилацетатом и для лучшего разделения полученную смесь центрифугировали в течение 1-2 мин на центрифуге ТН-212. Затем полученные этилацетатные"экстракты хроматографировали на пластинках' с тонким слоем силикагеля с веществами - стандартами. Радиоактивность препа-» ратов проверялась на каждом этапе очистки путем отбора проб по 100-200 мкл. Измерение радиоактивности проводили ка жидкостном

сцинциляционном счетчике Packard (США). Радиоактивность на пластинках определялась с помощью прибора для сканирования тонкйАдойных хроматограмм (Berthold-Frieseke, ФРГ).

Общую схему анализа можно представить в следующем виде:

Растительный материал

Фильтрование

осадок клеток

фильтрат

гомогенизация, экстракция смесью этил-ацетат-метанол (50:10)

экстракция смесью этилацетат-н-бутансл--пропанол (50:10:5)

осадок

экстракт

водный осадок

экстракт

выпаривание ТСХ

гидролиз

ТСХ

выпаривание ТСХ

гидролиз

ТСХ

Эксперименты по энзиматическоыу гидролизу коетегата АЕК.

Выделение растворимых белков. Растительный материал гомогенизировали в фосфатном буфере (0,33 М/л, рН 6,0) в фарфоровой ступке. После центрифугирования (20000х?, 30 мин) осадок 3 раза промывали тем же буфером и снова центрифугировали. Супернатанты, полученные после первого центрифугирования и промывки осадка объединяли, из объединенного раствора белки осаждали сульфатом аммония (852 насыщение). Затем после центрифугирования (20000x^,30 мин) осадок растворяли в 1,5 мл фосфатного буфера (рН 6,0), диализировали в течение ночи в том же буфере и снова центрифугировали. Для исследования эн-зиматической активности использовали супернатант.

Выделение мембраносвязанных белков. Осадки, полученные после

выделения растворимых белков обрабатывали в течение 30 мин IM RaCl. После центрифугирования (200QQxg, 30 мин) все процедуры для выделения белков были такими же, как и при выделении растворимых белков. Концентрацию белков определяли по Flores (1978).

Пробы на энзиматическую активность.

g-гдюкозидаза. К 25 мкл раствора белка в 1,5 мл фосфатноге буфера (pH 6,0) добавляли 25 мкл (1 мкМ) пара-нитрофенил-ß-D-глюкопи-раноэида (Lachema, ЧССР). Выход пара-нитрофенола после 20-мину,тной инкубации определяли спектрофотометрически (400 нм).

Эстераза. К 0,5 мл 0ранж-1-ацетата (1 мкМ, НгО)(Kamashi, 1*983) добавляли 25 мкл раствора белка в 1 мл фосфатного буфера (pH 7,1). Выход 0ранж-1 оценивали через 30 сек и 1 мин при 470 нм.

Расщепление р-р-гдюкопиранозида АБК (АБК-глю). К 75 или 150' мкл раствора белка в 3 мл фосфатного буфера (pH 6,0) добавляли 50 мкл (100 нМ, НгО) АБК-глю (Lehmann, 1975). Выход свободной АБК рассчитывали через 5, 10 и 15 мин инкубации, ооновываясь на разнице между уменьшением абсорбции при 275 нм (АБК-глю) и возрастанием абсорбции при 245 нм (АБК), используя стандартную кривую.

Распределение и транспорт абсцизовой киолоты в побегах березы.

Эндогенная АБК в коре, древесине и пасоке березы. Анализ содержания АБК в побегах березы в период покоя и выхода из покоя позволил выделить два центра локализации этого гормона - в коре' и древесине. Установлено, что содержание АБК в период покоя в коре было в 1,5 раза выше, чем в древесине, а в период сокодвижения при набухании почек её уровень превышал содержание АБК в древесине почти в 10 раз (табл.2). Резкое возрастание соотношения АБК в коре/АБК в древесине было обусловлено тем, что при набухании почек содержание гормона в древесине по сравнению с периодом покоя снижалось (с 1463 мкг/кг сырого веса до 450 мкг/кг сырого веса, а в коре, наоборот, увеличивалось 2158-4300 мкг/кг сырого веса соответственно). В древесине побегов при распускании почек уровень АБК продолжал резко снижаться (в 20 раз по сравнению с предыдущим периодом), а о появлением молодых листьев методами, применявшимися при анализе АБК, не была обнаружена. В это же время содержание АБК в коре тоже снижалось (табл.2).

Таблица 2

Содержание свободной АБК в коре, древесине (мкг/кг сырой массы)

и пасоке (нг/ил)

Пасока - 40 -

Древесина 1463 450 24 0

Кора 2168 4300 1300 76

Результаты проведенных экспериментов позволяют сделать вывод, . что в период, предшествующий распусканию почек в коре и древесине побегов березы локализуются большие количества АБК. В этот же период очень большое содержание АБК (40 нг/ил) обнаружено и в пасоке березы. Весной происходит последовательное онижение содержания АБК: оно начинается в древесине (в период набухания почек-К сокодвижения), затем - в коре. Вполне вероятно, что происходит перераспределение гормона из древеоины в кору, а-источником АБК может быть пасока, поставляющая гормон из корня.

Имитация действия АБК на распускание почек. В пасоке помимо АБК были обнаружены ауксины, гиббереллины и цитокинины. Это позволяет предположить .их важную физиологическую роль именно весной в период активного.роста. Для выяснения этого были поставлены специальные опыты, в которых растворы природных регуляторов роста вводились в основание срезанных побегов о нераспустившимися почками. Проведенные эксперименты показали, что только ГК достаточно сильно . стимулировала распускание почек, а АБК тормозила этот процесс. При совместном введении в черенки ГК и АБК последняя ослабляла стимулирующее действие гибберелдина, а при понижении концентрации ГК до 0,1 мг/л АБК полностью подавляла распускание почек СВлаоов и др., 1978]. 1

Связанные формы АБК. С помощью хроматографии на колонках о ДЕ-АЕ-сефадексом А-25 в коре и древесине побегов березы в этилацетат-ной и бутанольных фракциях метанодьных экстрактов были обнаружены □вязанные (т.н. "нейтральные", элюирующиеся из колонок растворителем при нейтральном рН) формы АБК. Определения были сделаны только в период покоя и при образовании молодых лиотьев. Несмотря на это

представляет интерес сравнить распределение этих соединений в коре и древесине. В коре содержание связанной АБК этилацетатной и бута-нольной фракций в период покоя составляло 3200 и 7190 мкг/кг сырого веса, после образования листьев 3530-4320 мкг/кг сырого веса соответственно. В древесине: в период покоя 859 (этилацетатная фракция) и 1582 мкг/кг сырого веса (бутанольная фракция), после появления молодых листьев - 417 и 1253 мкг/кг сырого веса. Таким образом, уровень овяаанной АБК был намного выше в коре, чем в древесине.

Итак, в побегах березы приг /тствует значительное количество АБК и её дериватов, распределение которых таково , что они доминируют в коре, но в большом количестве находятся и в древесине [Власов и др., 1978, 1991; Dathe et al., 1978]. Проведенные исследования позволили определить комплеко регуляторов роста в различных частях березы в разное время года и имитировать регуляцию распускания почек путем введения с вооходящим током абсцизовой кислоты. Динамика распределения свободной и связанной форм АБК, их перемещение в побеге более детально исследовались в экспериментах с введением в основание черенка 2-14С-АБК (инкубация 44 часа). Опыты проводили о растениями, находящимися в состоянии покоя (осень) или в период распускания почек и интенсивного сокодвижения (весна).

Транспорт 2-14С-АБК

При введении в основание осеннего черенка 2-14С-АБК перемещение метки в верхнюю часть и почки было полностью заблокировано -около 9531 радиоактивности локализовалось в основании черенка и только 5Х - в остальных частях. Весной в нижней части черенка обна-® руживалось около 50Х радиоактивности, т.е. почти в два раза меньше, чем осенью (рис.4). Остальная часть метки передвигалась в верхнюю часть черенка и поглощалась почками. Анализ распределения метки в тканях'черенка и почках показал, что большая часть радиоактивности после обработки 2-14С-АБК локализовалась в коре осенних и весенних черенков, весной радиоактивность обнаруживалась и в почках (рис.5).

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что весной транспортирующаяся в восходящем токе метка распределяется в коре, древесине и-почках. Для выяснения динамики этого распределения были поставлены специальные опыты, в которых 2-14С-АБК вводилась в основание черенков в течение 24, 48 и 72 час. Через 24 часа после обработки уровень радиоактивности в коре и древесине был примерно оди-

наковым по 40Х),а в коре составлял 20Х общей активности (рис.6). Через 48 чао происходило перераспределение метки из древесины в- кору и почки - радиоактивность в коре снижалась в 2 раза, тогда как в коре и древесине она возрастала (рис. ). В дальнейшем (72 час) радиоактивность в коре, древесине и почках продолжала возрастать, но она была самой низкой в древесине и самой высокой в коре.

Метаболизм 2-14С-АБК в коре, древесине и почках березы.

-АБК очень быстро метаболизировалась как в осенних, так и в весенних черенках, образуя конгюгат АБК-С-Б глюкопиранозид АБК (рис. ). Наиболее интенсивно процесо конъюгирования проходил в коре и древесине. Весной акропетально перемещавшаяся АБК помимо коры и древесины метаболизировалась и в почках (рис.8); но в меньшей степени, чем в коре и древесине.

Результаты экспериментов с меченой абсцизовой кислотой подтверждают полученные ранее данные о распределении эндогенной АБК в коре и древесине. Вместе с тем, эти данные предполагают важную роль коррелятивных взаимоотношений наземный побег-корень. Осенью во время покоя, когда уровень АЕК в древеоине очень высок, 2-14С-АБК, введенная в основание черенка не транспортируется по нему. Наоборот весной, когда содержание АБК падает она может перемещаться по растению, распределяясь в коре, древесине и почках. В этом случае источником АБК в этих частях растения может быть корень, поставляющий с пасокой это соединение. Вместе с тем результаты экспериментов как о эндогенной, так и о экзогенной АБК не всегда согласуются о представлениями об АБК как ингибиторе роста. Экзогенная АБК, введенная в основание черенка подавляет распускание почек, ослабляет и даже сводит на нет стимулирующее действие гиббереллина. Содержание эндогенной АЕК в древесине при распускании почек резко снижается. Эти данные говорят в пользу ингибирующего действия АБК. В то же время наиболее интенсивный Транспорт по растению чрезвычайно больших количеств АБК (40 нг/мл) проходих в период, предшествующий распусканию почек, в этот же период уровень АБК в древесине и особенно в коре очень высок. Наиболее значительно он понижается только во время появления молодых листьев. Очевидно в этот период функции АБК не ограничиваются влиянием на распускание почек, а связаны и с антистрессовым действием гормона - защитой распускающихся почек от потери воды и избыточного солнечного освещения весной. Резкое снйже-

ние в десятки раз содержания АБК в древесине и коре только после распускания почек и появления листьев связано, очевидно, с "переключением" мест синтеза из корней в лист. Экспериментальные данные, полученные при исследовании другого древесного растения - чая, также свидетельствуют, что снижение уровня АБК не всегда коррелируют о активным ростом.

Абсцизовая кислота в чайном растении в период, вегетации.

У вечнозеленого растения чая Tea sinensis, вегетативная деятельность которого в условиях субтропиков протекает о марта по сентябрь , выделяют три основных периода роста: весенний (май), летний (июль), осенний (сентябрь) [Маргвелашвили, Власов, 1986]. Наиболее активен рост флешей в мае, когда отрастают побеги предшествующего года (рис.9). При количественном анализе содержания АБК в верхушечных побегах чайного растения, проведенного с помощью ГЖХ было показано, что весной во время интенсивного роста побегов количество АБК составляло 7,2 мкг/г сухой маосы [Власов и др., 1986; 19893. Летом (июль) во время закладки и дифференциации генеративных органов . на чайном растении уровень АБК снижался, а осенью (оентябрь) во время цветения вновь возрастал (рис.10). Во.время периода покоя содержание АБК в побегах резко снижалось. Её количество в этот период составляло всего 1,5 мкг/г сухой маосы, т.е. было в 6 раз ниже, чем в период интенсивного роста. Таким образом, снижение уровня АБК не было связано с активным ростом побегов. Вполне вероятно, что повышенное содержание гормона в молодых растущих листьях необходимо для поддержания в них водного' баланса, оно предохраняет молодые листочки от избыточной потери воды в период активного роста СУоринг, Фил-липс, 1984].

Абсцизовая кислота в семенах

Для изучения влияния абсцизовой кислоты на процессы прорастания и покоя семян были использованы следующие модельные системы: завязи, незрелые семена, семена в период покоя фисташки, семена табака, изолированные зародыши тыквы [Ильин . и др., 1973, Бардиуов и др., 1968]; семена табака [Ильин и др., 19733; изолированные .зародыши тыквы [Кулаева, 1982]. Анализ АБК с помощью ГЖХ (ДЭЗ) показал присутствие гормона в семенах фисташки в период их созревания, покоя, набухания и прорастания. Наиболее высоким содержанием свободной АБК (7,8 мкг/2 г сухой массы) характеризовались незрелые семена

(оболочки удалялись перед анализом), собранные через 90 дней после цветения, наименьшим - завязи (0,1 мкг/2 г сухой массы) (рис." 11). АБК в связанной форме в завязях не обнаружена, затем в незрелых семенах её уровень достигает значения 0,47 мкг/2 г сухой массы. В период зрелости с наступлением покоя семян снижается содержание как свободной, так и связанной формы гормона. При замачивании и прорастании семян фисташки содержание свободной АБК снижается еще сильнее, но уровень связанной формы гормона возрастает.

Таким образом, в нашей работе, выполненной совместно с О.Н.Ку-лаевой и сотр., самый высокий уровень АБК был обнаружен в незрелых семенах фисташки. Это подтверждает полученные ранее данные о том, что высокое содержание АБК в незрелых семенах служит защитой семени от преждевременного прорастания. Высокое содержание АБК в зародыше может быть следствием её синтеза In situ. В то же время гормон может диффундировать из семенной кожуры в зародыш по градиенты рН, т.е. кожура имеет "кислое" рН, чем зародыш CZeevaart, Creelman, 1988]. При культивировании на воде больших порций семян такое перемещение АБК из семенной кожуры в раствор удается зафиксировать.

Рассмотрим эффект самоингибирования прорастания семян некоторых видов растений, описанном для табака Ильиным и Кефели til'in, Kefeli, 1966]. Сущность эффекта состояла в следующем. Если фильтровальная бумага, на которую помещали семена табака, увлажнялась равномерно, то их прорастание также было одинаковым в разных частях чашки Петри. Если же воду вносили в центр диска фильтровальной бумаги, то прорастание семян, расположенных на его периферии, подавлялось Наоборот, при нанесении воды на периферийные участки прорастание семян подавлялось в центре чашки Петри. Создавалось впечатление, что вода, увлажняя семена, экстрагирует из них кзкой-то фактор, способный тормозить прорастание соседних семян. Дальнейшие эксперименты подтвердили, что вода, находившаяся в контакте с семенами табака Nicotiana tabacum L., содержала такой фактор. Инкубация на ней оемян табака подавляла их прорастание [Ильин и др., 1973]. Анализ водной фракции вначале с помощью хроматографии на бумаге и биотестирования, а затем КД и ДОВ показал, что этот фактор самоингибирования семян табака идентичен (+) АБК [Ильин и др., 1973; Коф и др., 1973].

Ингибирующая роль абсцизовой кислоты была продемонстрирована и

в нашей работе, выполненной совместно с лабораторией О.Н.Кулаевой на изолированных семядолях тыквы. Было показано, что их рост в течение 96-часового замачивания в воде делится на два основных этапа [Кравяж и др., 19773: начальный период (0-48 ч), когда сырая масса семядолей увеличивается довольно медленно, и второй этап (48-96 ч), характеризующийся сильной активацией их роста (rhc. 12)s Экзогенный цитокинин - 6-бензиламинопурин (6-БАП, 10 мг/л) - сильно активировал рост семядолей. Эта стимуляция начинала проявляться в самом конце первого периода и достигала максимума во втором. Из сухих семядолей тыквы была выделена (+) АБК, идентифицированная с помощью КД. Её уровень в сухих семенах достигал 0,18 мкг/ 50 семядолей (рис. 13). Через 21 ч инкубации в воде он снижался до 0,04 мкг. Инкубация в 6-БАП, вызывала еще более резкое онижение концентрации АБК. Таким образом, уменьшение концентрации АБК в тканях семядолей предшествует активации их роста, который наблюдается и при прорастании интактного семени. При этом эффекты цитокинина на рост начинают проявляться в период, когда АБК практически исчезает из тканей семядолей.

Приведенные результаты экспериментов позволяют сделать общий вывод о том, что одной из функций АБК в семени является ингибирова-ние прорастания. Оно осуществляется на ранних стадиях эмбриогенеза и при покое. Обращает на себя внимание усиление образование конъ-югата АБК при прорастании семян фисташки и одновременное возрастание уровня свободной АБК. Это предполагает, что одним из механизмов инактивации АБК может быть образование её связанных форм.

Метаболизм абсцизовой кислоты и её транс-изомера

в оуопензионной культуре клеток Lycopersion Peruvianum

В многочисленных исследованиях метаболизма АБК показано, что этот гормон растений метаболиэируется в соединения кислой природы и конъюгаты [Milborrow, 1974; Sembdner et al., 1980; Walton, 1980; Zeevaart, 19793. Кроме того в экспериментах по изучению метаболизма изомера АБК - транс-транс АБК было обнаружено, что в побегах томата и проростках яблони происходит очень быстрая метаболизация этого соединения с образованием конгюгата транс-АБК, причем скорость его образования была выше, чем в случае с АБК [Milborrow, 1970; Powell, Seeley, 19743.

В связи с вышеизложенным представляло интерес исследовать раз-

личные пути метаболизма, а также ход биотрансформации обоих изомеров АБК, используя как суспензионную культуру клеток Ьусорегз1соп рептапшп, так и целые растения.

Метаболизм АБК и её траноизомера в листьях побегов томата

Ьусорегз1соп регцу1апш1.

В опытах использовали листовые черенки, полученные из целых раотений томата, находящихся в ' фазе цветения. 2-14С-АБК и 2-14С-транс-АБК вводили в листья растений через основание черешка, затем после 20 часов экспозиции о помощью тонкослойной хроматографии проводили анализ характера метаболизма обоих форм АБК. На рис.

представлены денситограммы фракций экстрактов из листьев томата, из которого видно^ что распределение радиоактивности после обработки листьев АБК следующее : свободная АБК - 38%, фазеевая кислота -39X, метаболит М1 - 67., кониогат АБК (АБК-глю) - 172. После 20-ти часовой экспозиции трано-АБК в листьях томатов был обнаружен только конъюгат (рис. ).

Радиоактивность в клетках после ¿бработки 2-14С-АБК и

2-14С-трано-АБК

Меченую АБК и соответственно транс-АБК в стерильных условиях вносили в 150 мл клеточной суспензии (конечная концентрация соединении - 7,6'10~® М). В каждом эксперименте использовали 15 мл этой суспензии, содержащей 4,5 г клеток (сырая масса). После инкубации (до 5 часов) проводили экстракцию образовавшихся меченых метаболитов из клеток и культуральной жидкости и разделение их на пластинках с тонким слоем силикагеля. Было обнаружено, что радиоактивность в клетках после обработки АБК оставалась относительно постоянной в течение 1-5 часов (рис.14). В то же время радиоактивность после обработки транс-АБК возрастала и достигала более высоких значений, чем в случае АБК.. Вполне вероятно, что при внесении в культуру клеток АБК между радиоактивностью внутри и снаружи клеток достигалось равновесие. В связи с этим представлял интерес более подробное изучение характера метаболизма обоих изомеров АБК как в клетках, так и в культуральной жидкости культуры клеток.

Абсцизовая кислота и её метаболиты в клетках

Через 20 минут после обработки АБК в клетках в больших коли-

чеотвах была обнаружена только АЕК. В последующие 30 минут уровень свободной АБК повышалоя, а в последующем понижался. Через 40 минут после обработки начинали обнаруживаться метаболиты АБК - фазеевая кислота (ФК) и кислый метаболит, идентифицированный только по значению № (М1) - вероятно 6-окои АБК и р-Б глюкозиловый эфир АЕК (АБК-глю). Уровень ФК возрастал вплоть до 4 часов инкубации и достигал более высоких значений, чем АЕК и других метаболитов. Уровень АБК-глю продолжал в этот период возрастать, а содержание метаболита М1 оставалось постоянным (Рио.15).

АБК и её метаболиты в кудьтурадьной среде

Анализ фильтрата культуральной среды дал следующие результаты. Через 20 минут после введения АБК в среду в раотворе присутствовала только свободная АБК. Еще через 20 минут уже можно было обнаружить ФК и М1, причем концентрация ФК продолжала возрастать вплоть дс 5 часов после внесения АБК. В течение всего времени эксперименте (5 часов) АБК-глю в культуральной среде не был обнаружен (Рис.16).

На рис.17 представлена общая радиоактивность АБК и её метаболитов в целой суопензии (клетки и культуральный фильтрат). Главньа метаболитом является ФК; после 4 часов её концентрация выше, че> свободной АБК. Уровень АБК-глю возрастает с временем инкубации, н< он значительно ниже уровня ФК.

Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, чт> поглощение АБК клетками Ьусорегэюоп регтаапигп проходит очен быстро. После 40 минут около 70% нанесенной АБК локализовалос внутри клеток. Кислые метаболиты АБК были обнаружены как в клетках так и в культуральной среде. Это говорит о том, что метаболизацк возможно имеет место на поверхности клеток или что кислые продут метаболизма транспортируются из клетки в среду активно или вымь ваясь. Противоположно этому АБК-глю аккумулируется исключительно клетках (вакуоль?) и не может транспортироваться в культуральщ среду. Рассмотрим теперь метаболизм трано-АБК.

Трано-АБК и транс-АБК-глю в клетках Ьусорегз1оп региу1апш1

Уже через 20 минут после нанесения как транс-АБК, так и ' конъюгат (транс-АБК-глю) были обнаружены в клетках (рис.18). Ур вень конъюгатов возрастал вплоть до 5 часов после обработки. Кол чество свободной транс-формы АБК увеличивалось только в первый *

и затем уменьшалось. Других метаболитов в клетках не было обнаружено.

Трано-АБК в кудьтуральной среде

Культуральная среда содержала только свободную форму транс-АБК, концентрация которой уменьшалась в течение времени эксперимента. Конъюгат в культуральной среде не был обнаружен. Поглощение транс-АБК проходило не так быстро как АБК, но оно непрерывно возрастало вплоть до 5 часов. С началом.поглощения биотрансформации транс-АВК начиналась без лаг-фазы и проходила только с образования транс-АБК-глю. В течение первого часа скорость поглощения транс-АБК была выше, чем метаболизация. Позже метаболизация становилась преобладающей. После 5 часов почти вся транс-АБК была представлена в конъюгированной форме (рис.19). Транс-АБК аккумулировалась клетками • и не транспортировалась в культуральную среду. Изомеризация транс-АБК в АБК-глю ни разу не была обнаружена.

Таким образом, биотрансформация обоих изомеров АБК в суспензионной культуре клеток Ьусорегэюоп рептапит проходит различно. С . поглощением транс-АБК в клетки метаболизация начинается сразу и приводит к образованию только транс-АБК-глю. Глюкозный конъюгат аккумулируется в клетках в возрастающих концентрациях таким образом, что к концу эксперимента практически вся транс-АБК, введенная в культуру, находится внутри клеток в форме своего глюкозного эфира. В противоположность этому АБК биотрансформируется клетками не только в глюкозный эфир, но и в кислые метаболиты. Метаболизация в этих двух направлениях начинается в одно и то же время после короткого лаг-периода по сравнению с метаболизацией транс-АБК. С началом метаболиэации АБК количество как кислых, . так и нейтральных метаболитов одинаково. Затем уровень ФК в значительной степени повышается и достигает более высоких значений, чем уровни свободной АБК и других обнаруженных метаболитов. Содержание свободной АБК уменьшается не таким же путем как транс-АБК; её уровень остается относительно высоким в течение всего экспериментального периода. Формирование глюкозного эфира АБК проходит медленнее, чем формирование ФК. В то время, когда кислые метаболиты АБК обнаружены в клетках и культуральной среде, конъюгат АБК аккумулируется исключительно в клетках и вероятно является стабильным по крайней мере в течение 5 часов.

В противоположность фитогормону АБК транс-АБК трансформируется очень быстро и полностью в глюкозный эфир. Трано-АБК, располагаясь

в клеточных компартментах без реконверсии в кислоту, выводится из метаболизма клетки. Этот факт может служить подтверждением .тому, что образование сахарных эфиров является одним из способов/кдетки утилизации ненужных для жизнедеятельности соединений. О том, что таким соединением для растения является транс-АБК говорят немногочисленные данные исследований её биологической активности. Было показано, что трано-изомер АБК или вообще не обладает биолргичеокой активностью, или проявляет активность во много раз меньшую, чем цис-изомер АБК. Так, трано-АБК в концентрациях 2,5 и 25 мг/л подавляла на 50-65% рост листового влагалища проростков риса, причем в этих же концентрациях цис-АБК полностью ингибировала роот [Oritani, Yamashita, 19703. Транс-изомер АБК был неэффективен в теоте на закрывание устьиц в листьях дурнишника и сахарной свеклы CKridemann et al., 19723. В биотесте на роот сырой массы зародышевых осей фасоли транс-АБК была в 17 раз менее активна, чем цис-АБК CSondheimer, Walton, 19703, а в тесте на рост отрезков мезокоптилей овса - в 30 раз.

Таким образом, изомерация 2-цис, 4-транс пентадиеновой цепи АБК в 2-транс-, 4-транс-форму приводит.к резкому снижению биологической активности [Walton, 19833. Характерно, что 2-транс-изомеры некоторых аналогов АБК также не обладают ингибиторной активностью [Milborrow, 19743. Можно предположить, что транс-изомер АБК является полностью неактивным, а его небольшое ингибиторное действие на роот. биотестов связано с присутствием в препарате трано-АБК небольших количеств цис-изомера [Walton,19733, изомерирующегося из транс-формы [Milborrow, 19833.

В суспензионной культуре клеток томата после 5-ти часовой инкубации около половины, введенной в культуру АБК оставалась в свободном состоянии, тогда как транс-АБК полностью метаболизировалась. Данные наших экспериментов по изучению метаболизма АБК в клетках разного розраста, находящихся в стадии активного роста, показали, что даже при 20 часовой экспозиции АБК полностью не метаболи»ирует-ся. . . ,

Таблица 3

Метаболизм 2-14С-АБК в клетках томата разного возраста

Внесение 1 1 Общая радиоактивность

метки в 1

1 1 1 1

культуру | АБК |Фазеевая кислота| Метаболит М1 | АБК- тлю

1 день 18 20 38 35 12 . 13 32 40

2 день 29 11 40 35 11,5 15 22,9 39

3 день - 16 - 35 - 13 36

4 день - 20 - 40 - ■ 15 - 25

5 день 13 43 35 13 17 28 34

6 день 19 . 13 33 36 17 17 31 35

2-14С-АБК вводили в суспензионную культуру клеток Ьусорегз1соп рептапит, находящихся в отадии активного роста в течение 6 дней с интервалом в 1 день (табл.3). Экспозиция 20 часов.

Как видно из табл.3 метаболизм 2-14С-АЕК в клетках разного возраста был практически одинаковым: 30-35% радиоактивности соответствовало соединению со значением ИГ глюкозилового эфира АБК, 35-40% - фазеевой кислоте, 12-17% - соединению М1 и около 15%' свободной абсцизовой кислоте! Таким образом, в период активного роста в клетках томата происходили очень быстрые процессы инактивации АБК, которые осуществлялись как за счет её окисления в фазеевую кислоту и другое соединение кислой природы, так и за счет образования конъюгированной формы АБК.

Энаиматический гидролиз кониагата абсцизовой кислоты

Наши исследования показали, что в коре, древесине и почках березы, побегах чая, семенах фисташки, листьях и суспензионной культуре томата основным конъюгатом АБК является, очевидно, ц-0-глюко-пиранозиловый эфир абсцизовой кислоты (АБК-глю). Он был обнаружен как эндогенное вещество или как метаболит экзогенной АБК. Было сделано предположение, что этот конъюгат скорее всего является конечным продуктом метаболизма АБК, а не запасной или транспортной формой гормона.

Возможно, что в растительном материале может иметь место расщепление конъюгата о образованием свободной формы АБК. Однако до настоящего времени ничего неизвестно о ферментах, участвующих в этом процессе. В связи о этим представлял интерео изучить влияние условий стресса на образование конъюгированной формы АБК и параллельно с этим - энзиматический гидролиз этого конъюгата. Исследовались гидролизующие ферменты во фракциях растворимых и мембрано-свя-занных белков проростков пшеницы, подвергнутых действию различных (засуха, низкая положительная или высокая температура) стрессов. Сравнивалось действие следующих ферментов: в-глюкозидаза (субстрат- п-нитрофенил-р- глюкопиранозид-п-НФ- в- глю) , эстераза (субстрат- Оранж-1-ацетат) и ферменты, расщепляющие глюкопиранозиловый эфир АБК. Было показано, что растворимая фракция белков из листьев, корней и остающейся части семян проростков пшеницы гидролизует АБК-глю с оптимальной скоростью при рН 6,0.

Активность гидролиэующих ферментов (за исключением эстеразы) в экстрактах из листьев было выше, чем активность ферментов из корней.

. Для исследования характера ферментов гидролиэующих АБК-глю были проведены эксперименты по очистке этих ферментов из сырого белкового экстракта из листьев проростков пшеницы с помощью хроматографии на колонках с Б) ЕАЕ-Сефарозой С1, используя градиент ЫаС1. Активность полученных фракций изучалась по их действию на расщепление АБК-глю, п-НФ-В-глю (определение 8-глюкозидагы) и 0ранж-1-аце-тата (определение эстеразы) (рис.20). Было показано, что эстеразная активность ограничивается фракциями; 5-7, в то фремя как белки, расщепляющие АБК-глю локализовались главным образом во фракциях 4-8 и 35-47. Эти фракции содержали также основную активность в-глюкоэида-зы. Для того, чтобы -установить различия между активностями эстеразы и в-глюкозидазы во фракции вносили ингибитор в-глюкоэидазы в-глюко-молактон (конечная концентрация 5 мМ). Это вещество тормозило (редуцировало) эстеразную активность только приблизительно на 10%,в то время как активность по отношению к АБК-глю и п-НФ-В-глю во фрак--циях 3-8 и 25-47 тормозилась в пределах 92% и 94%. Исходя из этих результатов мы сделали предположение (заключение), что коныогат АБК гидролизуется неспецифической в-глюкозидаэой в большей степени, чем эстеразой. •

Существует много экспериментальных доказательств того, что под действием водного стресса резко возрастает количество АБК. В уело-

íhx нашего эксперимента это возрастание было шестикратное в листь-< и 19-ти кратное в корнях в корнях проростков пшеницы, подверг-кся действию засухи (табл.4). Если возрастание уровня свободной ЗК является следствием расщепления АБК-глю и если предположить, го активность ферментов во фракциях растворимых и ыембраноовязан-jx белков отражает ситуацию клетки in vivo, то можно ожидать иэме-жие активности ферментов. Интересно отметить, что таких изменений ; было обнаружено в экстрактах белков ни из лиотьев, ни ив корней юростков пшеницы, подвергнувшихся действию водного стресса (табл.

6). В связи о этим разумно предположить, что возрастание уровня >ободной АБК, которое наблюдается в течение водного стресоа, не (ляется результатом усиления активности ферментов, расщепляющих >К-глю во всех исследованных фракциях белка.

Таблица 4

Содержание АБК и глюкозного эфира АБК (АБК-глюк) в листьях и корнях и увеличение длины первичных лиотьев в проростках пшеницы, культивируемой при различных стрессовых условиях

гвеличение длины есть ев за 14 ч, см i | Содержание, i нг/часть растения

i i АБК i | АБК-глюк. i

1 | листья 1 | корни 1 i i | лиотья 1 1 1 корни

(нтроль 3,5 (100%) 1,48 0,54 ' 60,7 46,4

1,2 +0,21 +0,31 • +Р.З +0,2

шядание 0,2(8%) 8,02 10,34 Ь,7 45,0

+0,08 +0,14 +0,4 ±0,3

«действие жарой

0 (114%) 1,40 0,50 56,0 48,3

1,3 +0,12 +0,21 +0,3 +0,3

«действие холодом

1 (60%) 1,32 ' 0,52 60,5 41,6

1,2 +0,31 +0,28 +0,2 +0,2

!имечание: Величины погрешности (+) от 20 измерение даны для измерения увеличения длины, и содержания АБК и АБК-глюк. CLehmann, Ylasov,"1988].

Высокотемпературный отресо вызывал уменьшение активности ферментов в отношении пНФ-в-глю, оранж-1-ацетата и АБК-глю фракций растворимого белка листьев. В корнях изменялась активность только в отношении пНФ-0-глю и АБК-глю. Активность исследованных ферментов, а также содержание свободной АБК и АБК-глю в листьях и корнях не изменялись при дейотвии холодового отресса. ч

Таблица 5

Активность гидролизующих ферментов фракций растворимых белков из лиотьев, корней и остатков семян пшеницы

-1-

| ' Раотворимые белки

_I_:_1_:_I_

Лиотья

контроль 18,1 14,0 0,08

засуха 15,5 11,0 . 0,06

высокая температура 7,3 6,9 0,04

низкая температура 18,9 14,6 0.07

Корни

контроль 17,1 4,0 0,05

засуха 10,5 3,4 0,03

высокая температура 9,0 4,5 0,03

низкая температура 13,7 3,5 0.04

Остатки семян

контроль 2,2 23,9 0,01

засуха 2,2 20,4 0,02

высокая температура 1.0 16,4 . 0,01

низкая температура 1,7 21,0 0.01

Под влиянием повышенной температуры рост проростков стимулировался на 114% по отношению к контролю, в то время как стресс, вызванный низкой температурой тормозил рост на 60Х от контроля. Содержание эндогенной АБК не отражало реакцию растений на низко- или вы--

сокотемпературный стресо - оно практически было равным. В противоположность этому водный дефицит вызывал увеличение уровня АБК и приводил к резкому торможению роста (8% от контроля) (табл.4). •

Проведенное исследование является первой попыткой в изучении возможной функций АБК-глю в растении на энзиматическом уровне в условиях стресса. Полученные результаты подтверждают представления, что конъюгаты АБК являются конечными продуктами метаболизма АБК также и при различных видах стресса.

Таблица В

Активность гидролизующих ферментов фракций мембраносвязанных (ЫаС1-растворимых) белков из листьев, корней и остатков семян пшеницы

Растворимые белки

|в-глюкоэидаза |нкат/мг белка

Эстераза нкат/мг белка

|Белки, расщепляющие АБК-глю |нкат/мг белка

Листья

контроль 22,7

засуха 12,5

высокая температура 15,6

низкая температура 18,5 <орни

контроль 4,7

засуха 3,5

высокая температура 4,6

низкая температура 5,1 Зстатки семян

контроль 7,3

засуха 7,2

высокая температура 8,1

низкая температура 6,6

7.3

5.7

3.4 5,6

3.6 2,9 3,3

3.8

4.5

3.7 4,5

3.8

0,11 0,10 .0,08 0,10.

0,08 0,06 . 0,08 0.06

0,02 0,02 0,03 0.02

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что основным конъюгатом абсцизовой кислоты является fl-D-глюкопиранозиловый эфир АЕК. KÍaK эндогенное вещество он был обнаружен в листьях и корнях пшеницы и семенах фисташки, как метаболит экзогенной АЕК - в коре, древесине и почках березы, верхушечных побегах чая и суопензионной культуре клеток томата.

2. B-D-глюкопиранозиловый эфир не является источником увеличения свободной абсцизовой кислоты в растении. Этот конъюгат, вероятно, конечный продукт катаболизма АЕК. Основанием такого заключения послужили следующие результаты проведенного исследования:

1) При водном стрессе, когда происходило резкое увеличение содержания свободной АЕК в листьях и корнях проростков пшеницы, уровень глюкозилового эфира не изменялся;

2) В семенах фисташки при максимальных количествах свободной АЕК содержание конъюгированной формы этого гормона не уменьшалось;

3) В листьях и корнях проростков пшеницы активнооть расщепляющих глюкозиловый эфир ферментов в условиях водного отресса не изменялась.

3. Уменьшение содержания свободной АЕК может быть связано с образованием конъюгата АЕК. Об этом говорят опыты о прорастанием семян фисташки, когда уменьшение уровня свободной АЕК происходило одновременно с возрастанием количества конъюгированной формы гормона. В период распускания почек в них происходила интенсивная конъюгация АЕК, что, вероятно, является одним из путей онижения уровня этого гормона.

4. Инактивация АЕК в суспензионной культуре клеток томата происходила не только за счет образования конъюгата, но и путем превращения в окисленные продукты этого соединения - фазеевую кислоту, содержание которой в клетках было выше уровня конъюгата в 2 раза, и не идентифицированный метаболит М1.

5. Метаболизм трано-АЕК протекал только по пути образования одного продукта - глюкозилового эфира транс-АБК. Глюкозиловые эфиры АЕК и транс-АБК аккумулировались в клетке и не проникали в куль ту -ральную среду.

6. Эндогенный уровень АБК в растении определяется оинтезом * гормона in ' vivo и его метаболическими превращениями. Вместе с тем

изменение содержания АБК может быть результатом её транспорта, и пе-

рераспределении в растении. АБК могла перемещаться через клеточную оболочку (суспензионная культура клеток томата), в то время как её конъюгат аккумулировался в клетке и не проникал в культуральную среду, в опытах с самоингибированием семян табака АБК перемещалась из семенной кожуры. Эксперименты о эндогенной й экзогенной АБК показали, что при дальнедистанционном транспорте'о током пасоки происходит её перераспределение в тканях березы. 2-14С-АБК перераспределялась из древесины в почки и в наибольшей степени - в кору, в апикальной части черенка АБК аккумулировалась в почках, поступая туда главным образом из коры.

7. Функции АБК как ингибитора наиболее четко прослеживались при её действии на рост, прорастание и покой семян. Так было показано, что абсцизовая кислота подавляла прорастание семян табака; уменьшение содержания АБК в изолированных семядолях тыквы предшествовало активации их роота; при выходе из состоянии покоя и прорастании оемян фисташки происходило снижение уровня эндогенной АБК.

8. По всей вероятности АБК выотупает как ингибитор роота и в процессах распускания почек. Об этом говорят результаты экспериментов с эндогенной и экзогенной АБК, .в которых было показано резкое снижение уровня эндогенной АБК в древесине во время раопускания почек и подавление распускания почек при введении АБК в основание срезанного побега. Вместе о тем было обнаружено и отсутствие прямой зависимости между содержанием АБК в других частях растения и распусканием почек: в пасоке обнаружено высокое содержание АБК; установлена аккумуляция АБК в почках весной; в кору распределялась большая часть экзогенной АБК, уровень эндогенной АБК в коре был самым высоким. Все эти данные говорят о том, что функции АБК в древесном растении не ограничиваются только ингибированием роста.

9. Абсцизовая кислота может присутствовать в растении во время интенсивного роста: даже при увеличении времени инкубации АБК никогда полностью не подвергалась метаболическим превращениям в суспензионной культуре клеток томата. Малоактивный изомер АБК - транс--АБК полностью конъюгировался; в побегах березы АБК полноотью не конъюгировалась; в верхушечных побегах чая во время их интенсивного роста уровень АБК повышался, а в период покоя снижался.

СПИСОК ТРУДОВ П.В.ВЛАСОВА

Власов П.В., Кефели В.И., Турецкая Р.Х. К вопросу о разделении фи-тогормонов и природных ингибиторов с помощью хроматографии на бумаге//Физиология растений. 1973. Т.20, вып.4. С. 865-868.

Кефели В.И., Турецкая Р.Х., Коф Э.М., Власов П.В. Определение биологической активности свободных ауксинов и ингибиторов//В кн.: Методы определения природных регуляторов роста. М.: Наука. 1973. С. 7-21.

Ильин Г.С., Кефели В.И., Турецкая Р.Х., Яковлева Л.В., Власов П.В. Фактор самоингибирования у семян табака//Докл. АН СССР. 1973. Т.210, N 4. С. 982-986.

Коф Э.М., Власов П.В., Ласовский Я., Ильин Г.С. Обнаружение абсци-зовой кислоты в тканях покоящихся растений//Д0кл. АН СССР. 1973. Т.2122, N 4. С. 1003-1006.

Кефели В.И., Чайлахян М.Х., Турецкая Р.Х., Власов П.В. и др. Комплексный метод определения природных регуляторов роста: биотес-ты//Физиология растений. 1975. Т.22, вып.6. С. 1291-1298.

Кравяж К., Власов П.В., Каравайко H.H., Кефели В.И. Влияние 6-бен-зиламинопурина на содержание эндогенной абсцизовой кислоты и других ингибиторов роста в изолированных семядолях тыквы//Физиология растений. 1977, Т.24, вып.2. С. 365-370.

Власов П.В., Кефели В.И., Артеменко E.H., Умнов A.M., Семднер Г., Датте В. Фитогормоны и ингибиторы в пасоке, древесине и коре побегов березы//Физиология растений. Т.25, N-4. С. 688-697.

Dathe W,, Semdner G., Kefeli V.l., Vlasov P.V. Gibberellins Abscis-ic Acid, and Related Inhibitors in Branches and Bleeding Sap of Birch//Biochem.Physiol. Pflanzen. 1978, Bd.173. S. 238-248.

Власов П.В., Мазин B.B. ,■ Турецкая Р.Х. и др. Комплексный метод определения природных регуляторов роста. Первичный анализ незрелых семян кукурузы на активность свободных ауксинов, гибберел-линов и цитокининов с помощью биотеотов// Физиология растений. 1979. Т.26, вып.З. С. 648-655.

Власов П.В.; Земднер Г., Дате В., Леманн X. Фитогормоны и ингибиторы в пасоке, древесине и коре побегов березы//В сб. Регуляторы роста и развития организмов. М.: Наука. 1981. С. 65.

Lehmann Н., Vlasov P.V. Time Course of the Metabolism of Abscisic

* Aoid and its trans-trans Isomer in Cell Suspension Cultures// Biochem. Physiol. Pflanzen. 1982. Bd. 177, S. 387-394. •

Lehmann H., Vlasov P. Metabolismus von Absoisinsaure und trans--Abscisinsaure in Zellsuspensionskulturen von Lycopersicon peruvianum//Janrg-anff, XXXII, 1983, Heft 3-4. S. 102-103.

Власов П.В., Леманн X. Природные регуляторы роста в тканях березы в период распускания почек//Рост растений и его регуляция. Кишинев: Штиинца, 1985. С. 138-145. ,

Кефели В.И., Власов П.В., Коф Э.М., Поляков A.C. Фенольные соединения и абсцизовая кислота в зеленых и альбиносных растениях гороха и хлопчатника//ХХ1-оэ научно-координационное совещание СЭВ: "Регуляция метаболизма первичных продуктов фотосинтеза в растительных организмах. Варшава, 1985.

Власов П.В., Маргвелашвили Н.З. Изменение уровня абсциаовой кислоты в побегах чайного растения в связи о уровнем азотного питания// Тез.докл. V Воес.биохим.съезда. М.: Наука. 1986. Т.З. С:368.

Маргвелашвили Н.Э., Власов П.В. Природный ингибитор роста чайного растения//Субтроп.культуры. 1986. N 4. С. 81-85.

Власов П.В., Кефели В.И. Транс-абсцизовая кислота и её свойства// Изв. АН Тадж.ССР. 1988. N 3. С. 26-30.

Бардинов Ш.Э., Ниматжанова H.H., Власов П.В. Абсцизовая кислота в созревающих .покоящихся и прорастающих семенах фисташки//Рост и устойчивость растений. Новосибирск: Наука. СО. 1988. С.103-108.

Lehmann Н., Vlasov P. Plant Growth and Stress - The Enzymatic Hydrolysis of Abscisio Acid Conjugate//J. Plant Physiol. 1988. V.132, N 1. P. 98-101.

Кефели В.И., Коф Э.М., Власов П.В., Кислин E.H. Природный ингибитор роста абсцизовая кислота// М.: Наука. 1989. 184 с.

Власов П.В., Маргвелашвили Н.З., Кефели В.И. Абсцизовая кислота в период вегетации и покоя чайного растения//Тез,докл. Междунар. симпозиума в рамках Комплексной программы стран-членов СЭВ "Регуляция.покоя и устойчивости растений к неблагоприятным факторам. СССР, г.Душанбе, 25-30 сентября 1989 г. М. 1989. С.14.

Кефели В.И., Власов П.В., Прусакова Л.Д. Общие проблемы регуляции онтогенеза//В кн.: "Природные и- синтетические регуляторы онтогенеза растений. Итоги науки и техники. Сер..Физиология расте-■ нии. 1990. Т.7. С.6-40.

Информация о работе

Власов, Павел Валерьевич
доктора биологических наук
Москва, 1996
ВАК 03.00.12

Автореферат

Похожие работы