Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансформация глюкозы в 2-кето-Д-глюконовую кислоту свободными к иммобилизованными клетками микроорганизмов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Трансформация глюкозы в 2-кето-Д-глюконовую кислоту свободными к иммобилизованными клетками микроорганизмов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ-НАУК. ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

. a j р f] »;• На правах рукописи

' I ' 1 ЗДК 573. 841. 11. 08

577. 151. 04

576. 809. 518

577. 156

ВАСИЛЕНКО МАРИНА ИВАНОВНА"

Трансформация гликоз» в З-кета-Л-глпионооцс кислотд свободннми к имкобилизованнняи клетками микроорганизмов.

С 01. Ой. 07 - 'микробиология-"" >

А в t er р е er е р : а г диссертации на-соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пдцшго, Î99Z

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Научные руководители:

Г. К. Скрябин

академик доктор биологических надк К. Я. Коцеенко Официальные оппоненты:

докт. биол. наук, профессор Финогенова Татьяна Васильевна кандидат биологических наук Войивилло Наталье Евгеньевна Ведуцее учрешдеиие:

Московский государственный университет йк^ И. В. Ломоносове кафедра Химической знзикологни

Зачнта состоитса 1дз2 г

в /4час. мин. на заседании специализированного совета С Л 00. 2, 59. 0{) пр» Институте биохимии и физиология микроорганизмов РАН. г« Пуцино Косковсхой обл.

С диссертацией мошо ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Автореферат разослав ~ ее^^гл^3^ 1392г.

Зченнй секретарь специализированного совета

доктор биологических наук В.. И. Вагабов

> 0'^"V.? Г* О КАЯ

" , Л

Актуальность проблемы. Одной из вахных задач современной «робиологии является изучение физиолого-биохикических особеи-ютей продуцентов практически важных углеводных соединений, юди которых особое место занимает глшконовые кислоти. Образую-1ясп п результате микробиологического окисления глюкозы 2-ке->-Д-глвконовая кислота является интерм'едиатон в химическом скн-.'зс нзоаскорбиновой кислоты - анткоксиданта и консерванта, при-:няемого в пищевой промыЕленности.

Прякой окислительный путь метаболизма глвкрзы до Б-Оосфопш-ната у микроорганизмов изучен достаточно подробно (Ое Ley, ¡GO. Shinagava Л al.,1976, Hatsushita et al.,1979.1982). Одна. литературное данные об условиях образования 2-кето-Л-глюковой кислоти - промежуточного соединенна данного пути метабо-зма гликозы - ограничены. • .

Одним из способов повыаения эффективности микробиологических оцессов является иммобилизация микроорганизмов. На основе им-билизованных клеток ( КмЮ получены биокатализатора пролонги-ванного действия для осуществления процессов трансформации ероидов, аминокислот, антибиотиков н других соединений. Но оцесс получения 2-кето-Д-глпконовой кислоты с поиоаьв ИмК до стоящего времени не изучен.В связи с зтик. актуальным является учение влияния иммобилизации бактерий-продуцентов на процесс разования 2-кето-Д-глпконовой кислоти и исследование физиоло--биохимических -я структурно-цитологических особелностей НкК в оцессе длительного функционирования

Целью настоящего исследования являлось сравнительное изуче-е физиолого-биохимических особенностей свободных и икиобилизо-шшх клеток микроорганизмов, окислявших глвкозу до 2-ке--Д-глпноновой кислоти, исследование возможности стабилизации тивности иммобилизованных клеток.

Для выполнения этой цели были поставлен» следувчие задачи: Изучить условия образования 2-кето-Д-гглшжовой кислоты сво-цными клетками продуцента.

Изучить зависимость процесса окисления глвкозы до 2-ке--Д-глвконовой кислоты от природы носителя-к условий иммобили-1ии клеток аикроорганизиа.

Исследовать пути стабилизации активности иммобилизованных кле-с.

- г -

4. Провести комплексное исследование физиолого-биохимических и структурно-цитологических характеристик иммобилизованных клеток в процессе длительного функционирования,

Нацчная новизна. Изучена динамика изменения -уровня актив-кости ферментов образования (глвкозо- и глвконатдегидрогеназ) и потребления í2-кетоглнжонаткиназы и 2-кето-Б-фосфоглвконатредук-тазк) 2-кето-Д-глвконовой-кислоты в процессе роста Pseudoiaonas putida ВКй i30i яа среде с глвкозой. Впервне установлен конститутивный характер 2-кетоглюконатдегидрогеназн у Ps. putída ВКН 1301, и изучено изменение уровня активности данного фермента в процессе окисления глюкозы до 2-кето-Д-глвконовой кислоты. Найдены условия накопления 2-кето-Д-глвконовой кислоты свободными клетками Ps. putida.Обнарувена способность клеток Ps. putida БКН 1301 к образованна наряду с 2-кето-Д-глвконовой кислотой 5-ке-то-Д-глвконовой кислоты.

Проведен сопоставительный' анализ способов и условий иммобилизации клеток Ps.putida в гели различной природы (ПААГ.карраги-нан, зостерин, альгинат, криогель ПВО* Создан биокатализатор процесса трансформации глвкозы в 2-кето-Д-глвконовув кислоту на основе клеток Ps.putida ВКИ 1301, вклвченнвх в волокна Са-альгл-натного геля. .

Установлено, что зашит,фактором стабилизации активности иммобилизованных клеток является регуляция их роста путем изменения состава питательной инкубационной-среды и реаима проведения инку-баций.

Проведено комплексное исследование физиолого-биохимических и структурно-цитологических охюбешостей .иммобилизованных -в алъги-яате клеток Ps.putida в лроцессв длительного функционирования.

Практическая ценность. Разработаны условия иммобилизации клеток Ps,putida в волокна Са-альгинатного геля, позволиввие создать активнув и стабильно функционирувцув. систему для ответвления процесса трансформации глвкозы в ;5-кето-Л-глвконовув кислоту.

Предлагенные способы стабилизации активности иммобилизован- * «их клеток и выявленные особенности функционирования системы в процессе многократных трансформаций могут быть использованы при создании новых ректабельнвх и экологически чистых технологий производства г-кето-Д-гликоиовой кислоты йа основе полученного биокатализатЬра пролонгированного действия.

Апробация работы. Осношшв полозения диссертационной работы бнлн представлены на Всесоюзном симпозиуме поинженерной знзиыо-логии (Кабулетти, 1985), на 7 съезде Всесовзного микробиологического общества (Алма-Ата, 1985), на вколе-сенинаре " Иммобилизованные клетки" (Пучшш, 1987), а также на совместном семинаре лаборатории " Иммобилизованные микроорганизмы " и лаборатории окислительного обмена веществ ИБФМ РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работу Диссертация изложена на /¿¿Рстра-ницах учетного иаяинописного текста, содержит /¿"таблиц и ¿^рисунков, состоит из обзора литературы ( £ главы), зкелерикенталь-ной части (»^глав.), обсуждения и выводов. Список литературы содержит ¿'^источник.

Объекты, материалы й методы исследований.

В работе использовали бактерии рода Pseudomana$ , пояученные из ВКН, Pseudosonas fluorescent liqufaciens получен из ВНИ31Г" НПО "Витамин", PseudoBonas pulida ВКН 1301 был либезно предое- ' тавлен к.б.л. С.Н.Трутко,

Для роста микроорганизмов использовали среду следующего состава (г/л) : глпкоза - 10-100; дрожжевой экстракт - 5; (НН^)г ПРО*- 3; HgSQj-71^0 - 0.5; КС1 - 0,5; CaCOj- 20-30; водопроводная вода; рП 6.8-7.2. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера на качалке 220 об/мин при 29*С. В опытах по определении условий накопления 2КГ использовали среду, содержали от 0.5 до 3.0 г/л ( HHV )г50< , от 0.1 до 2.0 г/л На2ЛРЦ, 20-100 г/л глюкозы, 0.05 г/л KgSQr 7И20, 0.05 г/л КСI и 20г/л СаС03, рН Б.8-7.2. В среду вносили 0.5 - 1.0 '/. ( от объема) посевного материала.

Активность ГДГ, Г-тДГ, а также 2КГК и 2ШГР определяли известным, методом (Roberts et al.,1973); активность 2КГ-тДГ по методу Shinaeaua (1973).

Для проведения трансформации клетки Ps.putlda отделяли от

Список использованных сокращений: 2КГ-2-кето-Д-глвкоиовая кислота; 5КГ-5-кето-Л-глвконовая кислота; 2.5 ДКГ-2.5-дикето-Д-глпконо-вая кислота;ГДГ- глвкозодегидрогеназа; Г-тДГ-гликонатдегидрогена-за; 2КГ-тДГ-2-кстоглвконатдегидрогеназа; 2КГК-2-кетоглвконагкина-за; 2КбФГР-2-кето-б-фосфоглвконатредуктаза: ИмК - иммобилизованные клетки. ПААГ-полиакриламидний гель; ЛВС- поливиниловый спирт..

• - 4 - Y

ростовой среды центрифугированием ( 5000g, 20 минут) и помечали в колбы Зрленмейера, содержание 10 - 100 мл среды следующего состава (г/л) : гликоза - 50 - 80: Не%7Нг0 7 0.05; KCl - 0.05; СаС03- 20; водопроводная вода , pH 6.В-7.2 . Концентрация клеток составляла 0.5 - 1.0 г/л.

Адсорбции клеток Ps.putida ВКЙ 1301 на керамическом носителе КС -31 осуществляли по методике Аринбасарова с соавт.(1982). на амберлите IRA 400 по известной методике (Pat.Fr.,1987h

Иммобилизацию клеток в ПППГ и получение гранул проводили по известной методике ( Кощеенко с соавт., 1981).Клетки иммобилизовали , в 2 - 6Z альгинат натрия по, методу Veelken. Pape ( 1982). Аналогичным методом включали клетки в 1.75Z и 3.50Х зостерин.Иммобилизации клеток в 27.. 4%, Tí каррагинан осуществляли но известной методике ( Hada et al.,1982), двойную иммобилизации (каррагинан, ПААГ) методом Kuu, Polack (1983).В криогели ПВС клетки вклвчали по методу Лозинского С Лозинский с соавт., 1990).

Количества адсорбированных клеток определяли по разности биомассы в суспензии до и после адсорбции. Биомассу иммобилизованных клеток оценивали по белку ( Freeian, 1382).

При проведении трансформации глюкозы ИмК в колбы Зрленмейера. содержащие 50-100 мл среды . вносили гранулы, керамические частицы, волокна с ИмК и инкубировали на качалкб. как описано выше. При повторных трансформациях гранулы или волокна перекосили в колбу со свежей средой в асептических условиях.

Глюкозу и. кетоглвконовые кислоты идентифицировали ТСХ (Gossel et al..1380)» Концентрации 2КГ в-среде определяли по известной методике С Тхи-Тхань-Хай с соавг., 1972), концентрацию глвкозы, помегоду СаггоГ(1982).

Удельную активность клеток выражал» в »r2KF* мг кл-час Смк*2КГ-мг кл-мик). Активность клеток оценивали такж? по количеству образованной 2КГ, выраженному в X от используемой глюкозы.

Потребление кислорода свободными в ИмК оценивали на поля-рографе LP-7(4CCPi с использованием ячейки объемом 2мл с помощьв закрытого тефлоновой пленкой платинового электрода.

Зльтраструктуру ИмК и Структуру геля анализировали с помочьв методов просвечивавщей и сканирувчей микроскопии. Образцы готовя-, ли по известны* методикам (Reynolds,1963. Spurr.1909) и просмат-

ривали в электронном микроскопе JEX100B и сканирующем микроскопе 3SH50A.

Результаты и их обсуждение, • Бактерии рода PseudoBonas способны к образование 2КГ в качестве монопродукта при росте на среде с глюкозой (Иамкаева. 1965, Kulhanek. 1389). В связи с зтим, изучалась способность 20 итаммов рода PseudoBonas- окислять глвкозу до 2КГ. На основании полученных результатов втами Pseudoionas put ida BKJÍ 1301 был отобран как наиболее активный продуцент 2КГ.

Влияние -условий культивирования на образование 2КГ Psendoaonas pulida ВКХ 1301. Известно, что важными факторами, влиящими на биосинтез органических кислот микроорганизмами, являвтся физиологическое согтояние бактерий, состав питательной среди, концентрация субстрата. условия аэрации,

2КГ является иитермедиатом прямого окислительного пути метаболизма глвкозы до Б-фосфоглюконата. Вровень накопления в среде 2КГ определяется соотношением активностей форионтов окисления глвкозы до 2КГ - глвкозо и глвконатдегидрогеяаз (ГДГи Г-тДГ) и Ферментов начальных этапов метаболизма 2КГ - 2-кетоглвконаТкина-зы и 2-кето-6-фосфоглюконатредуктазы (2КГК и 2К6ФГРХ

При исследовании влияния возраста культуре «а скорость образования 2КГ было установлено, что клетки, взятие в экспоненциальной фазе роста, вдвое боле« активны, чем в стационарной фазе ростаГскорость образования 2КГ при этом составляет 2/5 иг 2КГ- иг кл -час). Лолучегоше результата коррелирует с наиболее высоким цровнем активности ферментов окисление глвкозы до 2КГ <ГДГ и Г-тДП у культуре в экспоненциальной фаз» роста. Симвеиие скорости окисления глвкозы при использовании культуры стационарной фазы роста, возможно, связано также с ингибирОванием процесса продуктом - 2КГ - ингибитором Г-тДГ {Matsushita et al.,1979). -Известно, что окисление глвкозв До 2КГ бактермявм рода Pseudoionas в значительной мере зависит «т концентрации Субстрата, источников азота и фосфора íHhitlna et al.. ÍSfbl Kidgley et al..1973).

На рис.1 представлена динамика накопления 2КГ при рост« втамма Ps.putida BKI 1301 на средах с -различи» содерШаниеи глв-

- Б -

козы. Как видно из рис. 1а, через 24 часа роста бактерий па среде, содержащей 20 кг/ил глюкозы, уровень 2КГ достигал наибольшего значения (15 иг/кл). Переход культура в стационарнуп фазу роста сопровождался снижением концентрации 2КГ в среде до 3 иг/мл.

Увеличение .концентрации глюкозы до 100 мг/мл приводило не только к возрастании скорости образования 2КГ ( в 1.2 раза) но и к изменении динамики накопления кетокислоты в среде (рис. 16). С переходок культуре в стационарнуп фазу роста наблюдалось лишь снижение (более, чем в 2 раза) скорости накопления 2КГ , об*ий уровень которой продолжал повиваться.

' Изучение изменения уровня активности ферментов при этом показало, что при повменик. концентрации глвкозы от 20 до' 100 кг/мл активность ГДГ возрастает (в 1.2 - 1.5 раза), активность Г-тДГ практически не изменяется, в то время как активность ферментов потребления 2КГ (2КГК и 2К6ФГР) снижается вдвое.

Снижение концентрации источника азота от 3.0 мг/мл до 0.5 мг/мл приводило к значительному (в 6 раз) снижении биомассы . но не влияло на количество образуемой 2КГ, концентрация которой к' 24 часам достигала 13-15 м^/мл (табл.1). Однако, как видно из таблицы, процесс потребления кетокислоты бактериями при этом замедлялся, что' коррелировало со снижением активности 2КГК и 2КСФГР. Аналогичные зависимости наблвдались при снижении концентрации источника фосфора от 2.0 до 0.1 мг/мл. В условиях дефицита в среде азота (0.?мг/мл" (HH^SO,) и (или) фосфора (0.1мг/мл Na¿I!P04), а также при их полном исключении из состава среди, активность 2КГК и 2К6ФГР практически но проявлялась; активность Ферментов окисления глюкозы до 2КГ не изменялась; образуемая 2КГ накапливалась в среде.

Как следует из литературных данных, некоторые бактерии окислят глвкозу, глвконат и 2КГ до 2.5ДКГК (Stouthancr, 1301, Stroshene and Perlian. 1977, Kakisaka, 1901, Sonoiyaaa et. al, 1382,Шб). Клетки Ps.putida BKH 1301, как показали проведенные исследования, проявляет 2КГДГ активность в процессе окисления глвкозы. Установлен конститутивный Характер 2КГДГ и низкий уровень ее активности ( по сравнении с активностями ГДГ и Г-тДГ) при культивировании бактерий на средах с различными концентрациями глвкозы . источников азота и фосфора.

глюкоза, 2КГ

биомасса

20

40

1.0

-Í.0

w ео

Время» час

глпкоза, 2КГ

биокасса

Время, час

Рис.1. Влияние концентрации субстрата на процесс трансформация глюкозы в 2КГ клетками Ps. pulida BKlíi30i(a - концентрация глв-козы ,-20мг/мл; б-концентрация пнжозц-МОмг/мл); 1 - гликозаСмг/ мл); g - 2КГ(мг/*д); 3 - биомасса(1е Смг кл/мл)).

Таблица 1

Влияние концентрации азота в среде на образование и потребление 2КГ клетками Ps.putida ВКН 1301.

Концентра Возраст Биокасса, Концентра- Активность фер-

UHHfHH^SQj, культуры. . иг/ал ция 2КГ в ментов потребле-

кг/мл час. среде,мг/ыл ния 2КГ, мкй-ыин'-мг белка

3.0 24 1.1 14 0.10

48 1.8 2 0.12

2.о" 24 0.7 ■ 15 0.12

48' 1.2 4 0.12

1.5 24 0.8 13 0.12

• 48 1.0 7 0.14

1.0 24 1.0 14 ■ 0.06

48 1.1 10 0.0

0.7 24 0.7 14 0.0

• 4В .0.8 15 0.0

0.5 24 0.2 14 0.0

48 0.3 15 0.0

Концентрация глюкозы в среде 20 мг/мл.

Таким образом, высокий уровень активности ГДГ и Г-тДГ, обес-печивавцих образование 2КГ из глюкозы , низкий уровень активности 2КГДГ и практически отсутствие активности ферментов начальных этапов метаболизма 2КГ (2КГК и 2К6ФГР) при культивировании Ps.putida на среде , не содериацей источников азота и фосфора , определяют накопление 2КГ в высоких концентрациях.

Как показали результаты экспериментов по изучению влияния концентрации субстрата на скорость образования 2КГ, повивение концентрации глюкозы от 50 до 100 мг/ил не приводит к увеличению скорости образования кетокислоты . Поэтому в дальнейших экспериментах использовали субстрат в количестве 50-80 мг/мл.

Таким образом, представленные выие результаты свидетельствуют о целесообразности проведения процесса трансформации глюкозы в 2КГ клетками Ps.putida ВКМ 1301 в условиях лимитирования их

роста азотом и фосфором. На среде, содержащей Сиг/мл) :глвкозу (50-80), HßSO^HgO ( 0.05) . КСН 0.05) и СаС0л(0.2), при значении pH G.8-7.2, клетки накапливали до 90-952 2КГ (от используемой глюкозы ) через 48 часов трансформации.

Скрининг носителей и методов иииобилизачии.

Создание биокатализатора на основе живых иммобилизованных клеток микроорганизмов требует использования "мягких" условий иммобилизации , обеспечивающих сохранение жизнеспособности клеток и активности необходимых ферментных систем. В наибольшей степени этим требованиям отвечают методы адсорбции и включения живых клеток в гели.

Низкие клеточные нагрузки на^носитель при адсорбции на керамике и амберлите (не более 14-10 нг/мг носителя) обусловливали неэффективность использования этих сорбентов для иммобилизации PS.putida ВКН 1301.

Как видно из табл.2, активность бактерий, иммобилизованных методом включения в гели, а также прочность удерживания ИыК в носителе, в значительной степени зависели от свойств геля и условий иммобилизации.

Известно, что включение микроорганизмов в ПЙАГ. сопряжено с жесткими термическими и химическими воздействиями (Koshcheynko, 1985 ). Однако, включение клеток Ps.putida 8КМ 1301 в 1ШАГ в "чадящих" условиях иммобилизации (длительность полимеризации - 2 минуты, температура - Ю'С) позволило сохранить высокий.уровень их активности (выход 2КГ составил 70%) при . полном удерживании клеточной популяции в носителе. Период полужизни такой системы в неростовых условиях составил - 8 суток.

Такой же уровень активности сохранялся после иммобилизации клеток в гранулы криогеля ПВС, однако процесс трансформации глюкозы в 2КГ сопровождался при этом выходом клеток в среду, что приводило к быстрой потере активности (период полужизни - 7суток). .

После включения, в каррагинаковнй гель снижение активности' Ps.putida DKM 1301 не превывало 152, однако, в процессе трансформации наблюдалось значительное вымывание клеток из носителя, разрушение геля. "Вторичная иммобилизация", то есть покрытие гранул с вклпченными клетками пленкой ПМГ, согласно известному методу (Kuu. Polack, 1981) не только не способствовала удерживанию клеток в носителе, но и приводила к снижении активности ИмК.

Таблица 2.

Влияние типа носителя на активность и стабильность ИмК Ps. pulida.

Концент- Диаметр Концент- Активность Концент- Период

Носитель рация гранул рация ИмК, У. от рация сво- полухиз-

геля. и воло- ИмК, контроля — бодных-кле- ни, сут

7. кон,мм иг/мл геля ток, кг/мл ки

ПййГ 10 1.0 2.1 . 70-75 0 8

Карраги-

нан 4 3.0 2.0 85-30 1.0 -

Кгфраги-

нан.ПппГ 3.5 2.0 15-20 1.0 -

Зостерин 3.5 1.5 2.5 50 0 11

ПВССкрио

гель) 3.0 - 75-80 . 0.6 7

йльгинат

(волокно) 4.0 1,0 2.0 90 0 " /

Свободные

клетки(конт- 100 • б

роль)

Трансформации проводились в неростовых условиях.

* Концентрация клеток в среде к концу трансформации (48часов) при использовании ИмК,

Использование другого типа ионотропных носителей - полиуро-нидов обеспечивало высокую прочность удермивания бактерий в гелях. Известно, что структуры зостеринового и Са-альгинатного гелей идентичны (Donova el al, 1990). Однако, как видно из табл.2, активность Ps.putida ВКИ 1301 после 'вкличения в зостериновый гель была почти в два раза ни*е, чем после включения в Са-альги-нзтный гель той же концентрации, что, возможно связано с различными условиями микроокрукения ИмК в этих гелях.

Таким образом, на основании сравнительного анализа носителей и методов иммобилизации установлено, что включение в волокна

Са-альгинатного гсла является наиболее эффективным способом иммобилизации Ps.putida. обёспочивавцим высокий уровень окислительной активности ИмК и ее стабильности (выход 2КГ - 85Х .период полужизни -14 суток).

Трансформация глюкозы в 2-кето-Д-глвконовур кислоту иммобилизованными в альгинате клетками Ps.putida РКП 1301.

Изучение физико-химических параметров трансформации позволило установить, что при обчем более низком уровне активности ИыК (2.8 иг 2КГ.-мг ил-час) по сравнении со свободными клетками (3,3 мг 2КГ-мг кл-час), условия, обеспечивавшие максимальные активность клеток Ps.putida BK1Í 1301, окислявших глвкозу до 2КГ. сов-падавт. Температура 27-30'С, рН 7.0, а также концентрация глвко-зн в среде 50-80 мг/мл в равной степени оптимальны для свободных и иммобилизованных клеток.

При увеличении диаметра волокна от 1 до 5ми скорость накопления 2КГ в среде снижалась от 2.В до 2.0 мг 2КГ- мг .кл-час'. Это свидетельствовало о наличии диффузионных ограничений в Са- аль-гинатном геле.

Однако, Км по гликозе для свободных и иммобилизованных клеток различались незначительно и составляли , соответственно. 30

кН и 33 мК.Полученные результаты коррелирует с известными данны-?

ми о том. что матрикс Са-альгинатного геля не препятствует свободной диффузии глвкозы (Tanaka et al..1384 ).

Наиболее вероятной причиной снижения.скорости трансформации глюкозы в 2КГ ИмК является ограничение диффузии кислорода. Так.данные полярографических исследований,, представленные на рис.2, показали, что после вклвчения клеток в гель скорость потребления кислорода снижалась от 85 мкй'мг кл-мин у свободных клеток до .60 мкИ-мг кл-мин у ИмК (Км по кислороду составляла, соответственно, 6.5 мк¥ и 13.2 мкИ). Кинетика потребления кислорода имела линейный характер в более узком диапазоне концентраций кислорода (от 250 мкК до 30 мкХ).

Повнжение плотности клеточной популяции Ps.putida в геле приводило . вероятно, к усиленно конкуренции за кислород и субстрат между клетками , локализованными в разных слоях геля, и создавало дополнительные диффузионные барьеры для транспорта этих вецсств вглубь носителя. Это подтверждается данными, полученными при изучении влияния концентрации вклвчасмой о гель био-

массы на удельную активность ИнК.Яве^ииение концентрации биомассы от 0.6 до 6.6 иг/мл г ела приводило к снижению удельной активности от 280 до 55 мкК/мг кл-мин.

1

I

-1 глакоэа

ЗОмкН

£5'

1 мин

Рис.2 Потребление кислорода свободными и иммобилизованными клетками при окислении глюкозы: 1 -свободные клетки. 1.0 иг/мл; 2 -ИнК, 1.2мг/мл. Концентрация глюкозы -0.5 мг/мл. Цифрами на кривых указана скорость потребления кислорода С мкМ-мг кл-мин ).

Многократное использование иммобилизовании)! плеток Ps.putlda для трансформации глюкозы в 2КГ. Одно из главных преимуществ ИмК перед свободными при использовании их в качестве биокатализаторов заключается в значительно больней стабильности их ферментативной активности,

Период полукизни ферментативной активности включенных в аль- « гинатный гель клеток Ps.putlda ВКМ J301 был в два раза больше, чем у свободных клеток и составил 14 суток (рис.3). Солее высокая в сравнении со свободными клетками стабильность активности ИмК в неростовых условиях трансформации комет являться проявлением "защитного" действия носителя, обеспечивающего постоянные условия микроокрухения ИмК, а такке результатом замедления лиги-

глвкоза

- t3 -

ческнх процессов в ИмК ( Brodelius, 1987 ).

2-кето-Д-глЕКоновая кислота

я

м--

о -1-Ц-1-1-

О 20 43 " 63 83 Ï0

» Время, сутки

- Г -+- 2 3 -43- 4

Рис.3. Динамика накопления 2 - кето-Д-гликоновой кислоты клетками Ps.putida в процессе многократных трансформаций: 1- свободные клетки; 2 - ИмК; 3 - ИмК. периодически инкубируемые в богатой среде; 4 - ИмК, периодически инкубируемые в обедненной среде.

Как -известно, одним из наиболее эффективных способов стабилизации активности ИмК являится их периодические инкубации в питательной среде, приводящие к обновлении популяции в геле и регенерации ферментативной активности системы С Коцеенко с соаат. . 1981, Bihari et al., 1984, ). При этом ваянуп роль играат ре-гиы и условия инкубации - время проведения, продолжительность, состав питательной среды и т.д. (Uicente, Canovas, 1975, Haggstroa, Forberg. 1988).

С целью изучения возмоаности увеличения продолжительности функционирования полученного биокатализатора исследовали влияние реянма проведения и условий инкубации в питательной среде на активность ИмК Ps.putida ВКН 1301 и ее стабильность.

При этом использовали два различных варианта инкубации:

- 14 -

- кратковременные (не более 4 час.) инкубации в богатой ростовой среде через каждые 14 суток;

- продолжительные (до 72 ча&) инкубации в обедненной, лимитированной по источникам азота (0.7мг/мл (К!!4 )г 50« ) и фосфора (0.1 мг/мл На^НРО^). питательной среде через каждые 4 суток.

Данные, характеризующие стабильность процесса трансформации глюкозы в 2КГ при периодическом инкубировании носителя с ИмК в питательных средах, представлены на рисунке 3.

Как видно из рисунка (кривая 3?, после инкубаций альгинатных волокон с клеткам в богатой питательной среде активность системы восстанавливалась. Однако, через 48 дней работы ИмК. после трех кратковременных инкубаций, выход 2КГ снижался более, чем в 1.5 раза. Дальнейпее проведение инкубаций с той же периодичностью позволило стабилизйровать систему в .течение еще 34 суток, однако уровень активности при этом составлял в среднем 60Х от исходного, Через 85 суток активность необратимо снижалась и к 100 суткам составляла 9—1первоначальной.

Методом сканирующей электронной микроскопии было установлено, что уже после первой кратковременной инкубации в ростовой среде практически вся поверхность волокна покрывалась многочисленными колониями бактерий, отделенными от среды тонкой пленкой геля (рис.4а). Во многих местах поверхности имели место наруяе-ния целостности пленки и клетки вымывались в среду. Выход клеток из носителя наблюдался и в процессе последующих трансформаций. Таким образом возникала смешанная популяция из свободных и иммобилизованных клеток, которая интенсивно окисляла глюкозу с образованием 2КГ. Кроме того, бурный приповерхностный рост бактерий в процессе инкубации приводил, возможно, к возрастанию конкуренции клеток, локализованных в различных слоях геля, за субстраты и лизису "глубинной" части популяции ИмК. Это,наряду с разрушением геля вследствие избыточного роста ИмК и определяла постепенное снижение активности системы.

Для ограничения избыточного роста ИмК и сохранения целостности волокон использовали вариант инкубации в обедненной питательной среде. Внесение при этом в среду трансформации лимитированных количеств источников азота и фосфора с одновременным увеличением концентрации глюкозы в среде до 70 кг/мл и длительности

Рис.4. Структурно-цитологические изменения И«К в процессе многократных трансформаций с периодическими инкубацияыи: а - рост приповерхностной популяции бактерий в процессе инкубации в богатой питательной среде; б - формирование клеточных колоний после инкубации в обедненной питательной среде; в - мембранные остатки после лнзиса бактериальных клеток через 1.5 месяца работы ИмК в ренимс периодических инкубаций в обедненной питательной среде; г - литическая деструкция клеток и транслокация мембранных везикул через уплотненный слой полости (а - сканирующая электронная микроскопия; б. в. г - просвечивающая электронная микрбскопия). Звеличение: а - 4400; б -8000; в -20000; г -50000.

- 16 - . / процесса до 72 часов позволяло совмещать инкубации ИкК и зффек-тивнув трансформации тлвкозн в 2КГзтимиже клетками.Как видно из рис.3 (кривая 4), в «о* случае Высокий уровень накопления 2КГ ИмК сохранялся в течение 32 суток, после чего начинал снижаться, и'через 41 сутки составлял линь А-ОД от исходного. Яа протяжении всего »того времени выхода-клеток-в среду не наблюдалось.

Таким образок, реактивация иммобилизованной системы .окислявшей глжжозу до ¿КГ.путемпериодических " подпиток" в условиях обедненной питательной среды обеспечивает повывение стабильности процесса (период полужизни возрастаете 1.5 раза).

С цельв выяснения причин снижения активности ИмК исследовали структурно-цитологические особенности системы в процессе многократных трансформаций-с периодическими инкубациями. Оценку состояния системы проводили методой просвечивавшей 'электронной микроскопии.1 .-.•'.'•,■ "

Характерным для выросвей в процессе хнкубации популяции была округлая форма больнинства крупных колоний. необычайно плотная упаковка в них клеток. иаходявихся на разных стадиях сохранности, и значительная толщина -уплотненного фибриллярного иатрикса -носителя, ограничивавшего отдельные колония (рис.46).

Литическая деструкция в "большей степени затрагивала мембраны бактериальной клетки. Фрагментвмембран и произвольные везикулы диаметром 15-30 ни-заполняли пространство, свободное от клеток (рис.4г ). Транслокация мембран через уплотненный фибриллярный слой, е чвм -свидетельствовало *х присутствие на значительной расстоянии -от «ккрвколоний т иатриксе геля, подтверждает пластичность альгинатак-указкваетва то, чт-отиотнве ^астки матрицы неявлявтся препятствием для перемещения клеточного детрита. Перераспределение лизированной васси в гель приводит возможно, к сокращения -фибриллярного «атрикса* о -чей свидетельствует отсутствие вальгинате пустых -полостей * наличие сплщенных полоса гей с остатками лизированнвх клеток.

Длнние ыикроскопнчесхихяаблвдени* за системой Им* в процессе длительного ее функционирования -показали, что со временем процесс авмлкзакультурв в геле вачинал преобладать над процессов -обравования новых клеток, Через 42 суток в массе носителя содервалвсь преимущественно остатки лизированных клеток

(рис.4b). что коррелировало с необратимо низкой активность!» система ИмК.

Таким образом, сравнительное изучение .структурно-цитологических особенностей.ИмК в процессе многократных трансформаций с периодическими кнкубациями в "богатой" и "бедной" средах- свидетельствует о том, что разрувение геля обусловлено в болъвей степени интенсивности размножения ИмК, чем его прочностными свойствами: прогрессирувций лизис вкличеннойг клеточной популяцшг приводит к- сниаенив активности системы.

В процессе длительного функционирования ИмК Ps. putida ВКМ 1301 обнаругена их способность к образовании наряду с 2КГ побочного продукта-5-кето-Д-глвконовой кислоты. Необходимо заметить, что в литературе крайне редки 'упоминания об образовании 5КГ у псевдомонад (Steuart , 1959 ).

Учитывая возможные изменения в физиологии клеток как в результате- иммобилизации, так и в результате длительного функционирования ИмК в.условиях многократных трансформаций, мы провели эксперименты по выявления времени начала образования побочного продукта - 5КГ. Полученные результаты показали", чю свободные клетки стационарной фазы роста (20 часов) образовывали 5КГ через 3 суток, ИмК то» se фазы роста - через 6 суток, тогда как клетки-логарифмической фазы роста (12 часов) лиаь через б и 10 суток, соответственно. Таким образом, возраст культуры является домини-рувцим фактором инициирования процесса образования 5КГ. Иммобилизация клеток, обеспечивавчая некоторув консервации исходного состояния, способствует более длительному сохранение селективности процесса трансформации глвкоз» в- 2КГ.

В- В- В а Д. S

1. Остановлено, что скорость образования 2-кето-Д-глвконовой кислоты клетками Ps.putida BKÏ 1301 зависит от возраста культуры и достигает наибольвего значения g клеток фазы экспоненциального роста ( 2.5 мг 2КГ мг кд час). Обнаруяена способность клеток Ps.putLda. ВКК 1301 к образованию наряду с 2-кето-Д-глвконовой кислотой 5-кето-Д-гшсояовой кислоты.

2. Показано, что высокий выход 2-кето-Д-глвконовой кислоты < 30 - 952 от исходного субстрата» ъ нерестовых условиях трансформации глвкози свободными клетками Ps. putida ВКК 1301 коррелирд-

ет с низким уровнем суммарной активности 2-кетоглвконаткиназы и 2-кето-б-фосфоглвконатредуктази. Установлен конститутивный характер 2-кетоглвконатдегидрогеназы и низкий уровень ее активности в процессе окисления глвкозы до 2-кето-Д-глшконовой кислоты клетками Ps.pulida.

3. Ka основании сравнительного анализа способов включения клеток Ps.putída ВКМ 1301 е ге'л.ч различной природы установлены преимущества использования волокон Са-альгинатного геля, обеспечивавшего высокую активность ИмК (30% от активности свободных клеток) и ее стабильность ( период полушзни 14 суток).

4. Показана стабилизация активности клеток Ps.pulida ВКИ ¡301, иммобилизованных в Са-альгинатном геле, путем их периодических инкубаций в питательной среде. В зависимости от состаза '.".нкубационной среды и режима проведения инкубаций ИмК актив -ность системы сохраняется в течение 1-3-х месяцев.

5. На основании исследования цитологических особенностей иммобилизованных в Са-альгинате клеток Ps. putida ВКК 1301, изменения структуры геля в процессе длительного функционирования системы в режиме периодических инкубаций установлено, что основными причинами снижения активности системы является: возрастание во времени числа лизированных клеток и разрувение геля, обусловленное интенсивным развитием приповерхностной клеточной популяции.

Список ясновных публикаций по материалах диссертации:

1. Воловенко МЛ!.. Дислер.Е.П., Коцеенко К.й. Иммобилизация культуры Pseudomonas putida,- ойразувцей 2-кето-Д-глвконовуй кислоту. Биотехнология. 1985, 1, Н5, с. 43-47. "

2.'Воловенко М.И., Дислер E.H., Кощеенко К.й. Влияние некоторых факторов на активность ферментов, связанных с накоплением 2-кето-Д-глвконовой кислоты культурой Pseudosonas putlds. Тез.Uli съезда Всесоюзного микробиологического общества. Сб. "Физиология, биохимия и организация микроорганизмов"., йлма-ата, 1985, с. 73.

3. Коцеенко К.Й., Волопенко Й.И., Дислер H.H. Иммобилизация культуры Pseudosonas putida - продуцента 2-ксто-Д-глвконовой кислоты. Тез. Всесоюзного .симпозиума по инженерной знЗимологии, Кабулетти, 1385, с. 49.

4. Боловенко Й.И., Дислер E.H., Комарова Г.В. Влияние состава среды на накопление 2-кето-Д-глшоновой кислота культурой Pseudoaonas putida. ПрийЛ. биохив. микробиол., 1987, т.23, в.2. с. 199-203.

5. Волоаенко H.H.. Дислер E.H., Кощеенко К.й. Сравнительное ■изучение образования 2-кето-Д-глвконовой кислоты свободными и иммобилизованными клетками Pseudononas putida. Прикл.биохим. микробиол., 1988, т.24, в.б. с. 773-753.

"6. Кощеенко К.Й., "Волоиеико О., Дислер E.H., Гулевская tvfl., Скрябин Г.К. Многократное -использование иммобилизованных клеток Pseudononas putida для получения 2-кето-Д-глвконовой кислоты. Биотехнология. 1339,-5, Н4. t„ 458-403.

7. Гулевская С.Й., Воловенко Н.И., Кощеенко О., Скрябин Г.К. Структурная характеристика иммобилизованной системы клеток для трансформации глюкозы в 2-кето-Д-глвконовув кислоту. Биотехнология, 1989. 5, Нб, с. 722- 728.