Токсикологический и ультраструктурный анализ изменений в организме и клетках животных при хроническом воздействии ксенобиотиков и применении лечебно-профилактических средств

Саитов, Вадим Расимович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Токсикологический и ультраструктурный анализ изменений в организме и клетках животных при хроническом воздействии ксенобиотиков и применении лечебно-профилактических средств
ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Токсикологический и ультраструктурный анализ изменений в организме и клетках животных при хроническом воздействии ксенобиотиков и применении лечебно-профилактических средств"

На правах рукописи

САЙТОВ ВАДИМ РАСИМОВИЧ

ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ И УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ИЗМЕНЕНИЙ В ОРГАНИЗМЕ И КЛЕТКАХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ КСЕНОБИОТИКОВ И ПРИМЕНЕНИИ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

06.02.01 — диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 0 Ио,| 2014

Казань-2014

005555476

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») г. Казань.

Научные консультанты: Иванов Аркадий Васильевич

чл.-корр. РАН, заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор

Папуниди Константин Христофорович

заслуженный деятель науки РТ и РФ, доктор ветеринарных наук, профессор

Официальные оппоненты: Бондаренко Владимир Олегович

доктор биологических наук, в.н.с. отдела качества и стандартизации кормов фармакологических лекарственных средств для животных, ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (г. Москва);

Залялов Ильдар Надырович

доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный ветеринарный врач РТ, зав. кафедрой патологической анатомии и гистологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана»;

Рагинов Иван Сергеевич

доктор медицинских наук, доцент кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет».

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская академия

ветеринарной медицины» Защита состоится «2» декабря 2014 года в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности».

(420075, г. Казань, Научный городок - 2, ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань).

Электронный вариант автореферата и текст объявления о защите размещен на официальном сайте ВАК РФ www.vak.ed.gov.ru, текст диссертации, автореферата, отзыв научных консультантов - на официальном сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» www.vnivi.ru Автореферат разослан <у$» 2014 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, *

кандидат ветеринарных паук В.И. Степанов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Непрерывное увеличение промышленного производства химических веществ и расширение их ассортимента, связанное с возрастающими потребностями развивающегося социума, неизбежно повышает риски экологической опасности [5].

К числу наиболее пагубных загрязняющих природную среду компонентов относятся стойкие органические загрязнители (СОЗ) и тяжелые металлы. Они нарушают естественную функцию биоты, и их называют ксенобиотиками, т.е. чуждыми живому [19,26].

Диоксины и диоксиноподобные полихлорированные бифенилы относятся к супертоксикантам, способным аккумулироваться в пищевых цепях, что часто приводит к критическому загрязнению кормов, продовольственного сырья и практически любых готовых продуктов питания [17, 20, 23].

В результате диоксинового кризиса, разразившегося в конце 2010 года и приведшего к ограничениям поставок мяса из Германии, человечество в очередной раз осознало масштаб проблемы глобального загрязнения окружающей среды ксенобиотиками и убедилось в том, насколько неожиданными путями диоксины могут прорываться в технологические цепочки при производстве сельскохозяйственной продукции [2].

Изучение антропогенного воздействия тяжелых металлов и их соединений на состояние здоровья человека и животных является насущной проблемой биологии. Данные вещества могут длительное время сохраняться в объектах окружающей среды, мигрировать, накапливаться в организме человека и животных, вызывая изменения в органах и тканях [13, 14, 24]. В этой группе элементов одно из приоритетных мест занимает свинец, относящийся к ядам политропного действия и вызывающий широкий спектр негативных эффектов: поражение кроветворной, нервной, пищеварительной, выделительной и других систем [1].

Помимо диоксинов и тяжелых металлов, не менее важную роль в экологическом аспекте играют микотоксины - биогенные яды, включая Т-2 токсин [10, 25]. Грибы, продуценты токсинов, являются постоянной и серьезной угрозой здоровью людей и домашних животных, причем точное количество страдающих от микотоксикозов неизвестно. Опасность микотоксинов настолько высока, что эта проблема выходит за пределы отдельных стран. Значительное внимание ей уделяют такие организации, как ООН (ее продовольственный подраздел ФАО), Всемирная организация здравоохранения, Всемирная экологическая организация (ЮНЕП) и некоторые другие [22].

Научную заинтересованность вызывает и повышенная чувствительность к микотоксинам высокопродуктивных сельскохозяйственных животных и птицы современных пород и кроссов. Следует учитывать и то, что требования к экологической безопасности продукции растениеводства и животноводства, в частности зерна, молока и мяса, с каждым годом ужесточаются, усиливается контроль микотоксинов в продуктах питания [9].

Таким образом, на сегодняшний день последствия глобального загрязнения окружающей среды имеют приоритетное социально-экономическое значение и требуют постоянного усовершенствования терапии и профилактики животных к

отрицательному воздействию комплекса ксенобиотиков. В этом контексте актуально ультраструктурное исследование влияния цеолита и димефосфона на клетки органов сельскохозяйственных животных при раздельном и сочетанном введении диоксина, ацетата свинца и Т-2 токсина.

Работа выполнена в отделе токсикологии и секторе электронной микроскопии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» с 2008 по 2014 год согласно плану научных исследований: «Токсикологическая безопасность» (Per. номер 01200202603).

Степень разработанности темы. Неоспоримым аспектом токсикологических исследований, является познание механизмов сочетанного воздействия токсикантов различной природы на продуктивных животных, что однозначно важно для народного хозяйства, с последующей разработкой мероприятий и подбором специфических средств, профилактики и лечения [15, 27]. Подобные научные изыскания предполагают потенцирующие эффекты влияния токсикантов с множественными проявлениями на организменном (кровь), органном (печень, почки и др.) и ультраструктурном уровнях [12].

В свою очередь, изучение полиорганной дисфункции, вызванной влиянием ксенобиотиков на клеточном и субклеточном уровнях, необходимо для рассмотрения патологических процессов в рамках структурных и функциональных нарушений и позволит более глубоко раскрыть основы патологии [11].

Иначе говоря, электронно-микроскопические исследования, с одной стороны, позволят в значительной мере выявить негативные эффекты воздействия токсических агентов на клеточные компоненты, что, несомненно, представляет интерес для фундаментальной науки, с другой - практически использовать наработанный материал в случае реального возникновения подобных ситуаций.

Помимо изучения разного рода токсического влияния ксенобиотиков, не менее важное значение имеют подбор и обоснование лечебно-профилактических средств. На наш взгляд, перспективным в предупреждении прогрессирования системных цитотоксических повреждений, обусловленных воздействием ксенобиотиков, является комплексное использование средств метаболического и цитопротекторного типов действия (димефосфон, цеолит).

Согласно доступным литературным источникам, проблема, касающаяся ультраструктурных исследований цитопатологий продуктивных сельскохозяйственных животных при хроническом сочетанном влиянии ксенобиотиков различной природы, до сих пор полностью не раскрыта.

Цель и задачи. Цель работы - изучение ультраструктурных изменений и обоснование применения лечебно-профилактических средств при хроническом отравлении ксенобиотиками сельскохозяйственных животных.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. На модели хронической интоксикации кроликов и поросят изучить гематологические, биохимические и иммунологические изменения при воздействии диоксина, ацетата свинца и Т-2 токсина, раздельно, сочетанно и в комплексе с цеолитом, цеолитом и димефосфоном;

2. Оценить морфофункциональные изменения органов кроликов при воздействии диоксина и ацетата свинца раздельно, сочетанно, на фоне применения цеолита и цеолита с димефосфоном в условиях хронической интоксикации;

3. Исследовать морфофункциональные характеристики органов поросят при воздействии диоксина и Т-2 токсина, раздельно и сочетанно, на фоне применения цеолита с димефосфоном в условиях хронической интоксикации;

4. В условиях хронической интоксикации изучить морфологию клеток органов овец при воздействии диоксина и комбинации диоксина с Т-2 токсином;

5. Провести морфометрический анализ ультратонких изменений митохондрий и пероксисом в гепатоцитах животных, используя печень в качестве модели индикации микросомально-энергетических процессов биотрансформации ксенобиотиков;

6. Провести факторный анализ состояния организма свиней при воздействии токсикантов и лечебно-профилактических средств, позволяющий дать оценку их степени влияния.

Научная новизна. В настоящей работе обобщен материал новых оригинальных данных по результатам морфологических изменений при хроническом воздействии ксенобиотиков на организм животных.

• Методом просвечивающей электронной микроскопии проведено комплексное сравнительное исследование структурных и функциональных изменений органов животных - кроликов, свиней и овец при раздельном и сочетанном воздействии на них токсикантов различных групп соединений - диоксинов (2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксин), тяжелых металлов (ацетат свинца С4Н604РЬхЗН20) И МИКОТОКСИНОВ (Т-2 ТОКСИН С24Н34О9);

• На ультраструктурном уровне подтверждено взаимоусиливающее действие токсикантов различного происхождения при сочетанном отравлении трех видов животных;

• На субмикроскопическом уровне дана комплексная оценка эффективности применения цеолита с димефосфоном при раздельном и сочетанном хроническом воздействии диоксина и ацетата свинца, диоксина и Т-2 токсина на клетки кроликов и свиней.

• Впервые на ультратонком уровне посредством морфометрического анализа получены принципиально новые данные фундаментального характера об изменениях митохондрий и пероксисом в гепатоцитах животных, как показателя уровня микросомально-энергетических процессов биотрансформации ксенобиотиков. Показаны дозозависимые изменения, характеризующие степень энергетических процессов в клетках печени.

• Впервые на ультратонком уровне с помощью морфометрического анализа выявлены особенности влияния экотоксикантов на нервную ткань кроликов, свидетельствующие о пластичности нейронов в плане адаптационно-компенсаторных приспособлений.

• Посредством статистической обработки морфометрических, биохимических, иммунологических и цитологических показателей создана факторная модель, дающая комплексную оценку степени влияния диоксина и Т-2 токсина на организм животных.

Теоретическая и практическая ценность работы заключается в полученных результатах, сформулированных выводах и описанных методических подходах.

Теоретическая значимость заключается в апробировании существующих и применении инновационных подходов к морфометрическому анализу данных,

эмпирическому уточнению некоторых методических вопросов по обработке материала. У трех видов продуктивных сельскохозяйственных животных при воздействии ксенобиотиков установлены оригинальные подвижки полиорганной дисфункции. На основании проведенных исследований дана комплексная оценка токсикологических и ультраструктурных особенностей воздействия ксенобиотиков различной природы на клетки органов продуктивных сельскохозяйственных животных.

Практическая значимость отражена в ряде элементов представленной работы.

По результатам исследований цеолит с димефосфоном могут применяться при лечении токсикозов.

Полученные результаты могут быть использованы для изучения хронической токсичности ксенобиотиков и влияния лечебно-профилактических средств на коррекцию изменений в ряде органов продуктивных животных.

По материалам диссертации, разработаны и внедрены в научно-производственный процесс следующие нормативные документы: «Методические рекомендации по электронно-микроскопическим исследованиям биологических объектов»; «Подготовка образцов для трансмиссионной электронной микроскопии, применяемой при токсикологических исследованиях: компьютеризация расчетов»; «Токсикозы животных, вызванные диоксинами: этиология, профилактика и лечение».

Результаты исследований используются по специальностям ветеринарная фармакология с токсикологией, диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных, специалистами биологического профиля, прежде всего биологами - цитологами, применяющими в своих исследованиях методы электронной микроскопии.

Методология и методы исследования Предметом исследования служили разносторонние проявления организма животных на воздействие ксенобиотиков, в том числе на фоне применения лечебно-профилактических средств.

Объектами исследования являлись кровь, сыворотка и плазма крови, клетки изучаемых органов (печень, почки, селезенка, головной мозг и сердце).

Животных выводили из эксперимента в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных».

Исследования проводились с использованием следующих методов:

1. цитологических (световая и электронная микроскопия);

2. гематологических;

3. биохимических;

4. иммунологических;

5. морфометрических (вычислительная, программная морфометрия);

6. дескриптивной, вариационной и многомерной статистики.

В выполнении отдельных этапов диссертационной работы оказывали практическую и консультативную помощь д.б.н., профессор В.А. Козлов, д.б.н., профессор Л.Н. Воронов, к.б.н., с.н.с. И.Р. Кадиков и к.б.н., н.с. И.И. Идиятов, за что выражаем им сердечную благодарность.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Хроническое сочетанное воздействие диоксина и ацетата свинца (1/200 ЛД50 и 1/10 ЛД50), а также диоксина и Т-2 токсина (1/400 ЛД50 и 2 ПДК) вызывает необратимое повреждение клеточных органелл паренхиматозных органов сельскохозяйственных животных;

2. Применение цеолита и димефосфона у кроликов восстанавливает синаптические контакты в коре головного мозга и препятствует разрушению митохондрий лимфоцитов селезенки под действием диоксина и ацетата свинца;

3. Согласно факторному анализу, показатели группируются: фактор 1 -«гематобиохимический статус», фактор 2 - «фактор концентрирования лимфоцитов», фактор 3 - «фактор микросомального окисления». Сочетанное отравление (диоксин 1/400 ЛД50 и Т-2 токсин 2 ПДК) дезинтегрирует функциональные связи, за счет потери роли ряда показателей: количество пероксисом, общий белок, а-глобулины, глюкоза, коэффициент Де Ритиса, амилаза, ЩФ, ЛАСК, фагоцитарное число и емкость, лимфоциты. Цеолит с димефосфоном уменьшают токсическую нагрузку на митохондрии клеток.

Степень достоверности и апробация материалов диссертации.

Исследования проводились на достаточном количестве материала, согласно утвержденному плану НИР. Результаты не вызывают сомнений как по достоверности полученных данных, так и по выводам, сделанным на их основе.

Основные положения диссертации доложены и одобрены на ежегодных отчетных научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2009 - 2013 гг.; на Международной научно-практической конференции «Биотехно-логия: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность», посвященной 50-летию ФЦТРБ-ВНИВИ (Казань, 2010); на XXIII Российской конференции по электронной микроскопии (XXIII РКЭМ 31 мая - 4 июня 2010 года) в г. Черноголовка Московской области; на Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (РЭМ-2011, 31 мая - 2 июня 2011 года) в г. Черноголовка; в ФГОБУ Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана (Казань, 2012); на XXIV Российской конференции по растровой электронной микроскопии (РКЭМ-2012, 29 мая - 1 июня 2012 года), в секции XX «Применение электронной, зондовой и конфокальной сканирующей электронной микроскопии в биологии и медицине» в г. Черноголовка; на XVIII Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (РЭМ-2013, 3-7 июня 2013 года) в г. Черноголовка; на Международной научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава «Научное обеспечение агропромышленного производства» (Курск, 2014); на II Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки Российской Федерации и Республики Башкортостан, д.в.н., профессора Х.В. Аюпова «Современные достижения ветеринарной медицины и биологии - в сельскохозяйственное производство» (Уфа, 2014); на III международном конгрессе ветеринарных фармакологов и токсикологов «Эффективные и безопасные средства в ветеринарии» (Санкт-Петербург, 2014).

Достоверность полученных результатов подтверждается публикациями в рецензируемых научных журналах.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 23 научные работы, в том числе 13 статей в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации, два учебных пособия, одни методические рекомендации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 350 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, списка использованной литературы и приложений. Работа иллюстрирована 15 таблицами, 169 рисунками, из них 151 - электронно-микроскопическая фотография. Список литературы включает 400 источников, в том числе - 158 работ зарубежных авторов.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы

Работа выполнена в отделе токсикологии и секторе электронной микроскопии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» с 2008 по 2014 год.

В опытах было задействовано три вида продуктивных животных, относящихся к различным таксономическим единицам: кролики (п=30), свиньи (п=24) и овцы (п=18). Животных подбирали по принципу аналогов с учетом породы, возраста, пола и массы тела. Условия проведения опытов, схемы, видовую принадлежность, количество особей в группах, дозы и кратность применения препаратов приведены в соответствующих разделах работы.

Во время проведения экспериментов поддерживали одинаковые условия содержания и кормления подопытных и контрольных животных, согласно зоотехническим нормам [16].

Для экспериментальной хронической интоксикации животных применяли:

• 2,3,7,8-тетрахлордибензо-пара-диоксин (далее диоксин), изготовленный ПО «Химпром» (г. Уфа), Башкортостан;

• Свинца ацетат (С4Нб04РЬхЗН20) - ГОСТ 4426 - 75;

• Кристаллический Т-2 токсин, лаборатории микотоксинов ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань), отвечающий требованиям ГОСТ 10-07-301-86 и не отличающийся по физико-химическим параметрам и токсическим свойствам от существующих стандартов.

Для экспериментального лечения животных применяли:

• Димефосфон — димегиловый спирт (1,1-диметил-З-оксобутил фосфоновой кислоты), выпускается во флаконах в виде 15%-ного водного раствора и представляет собой прозрачную или слегка опалесцирующую жидкость со своеобразным запахом и горьким вкусом, рН раствора от 2,0 до 4,0. К основным положительным эффектам относят - мембраностабилизирующее, антиацидотическое, иммуностимулирующее, противовоспалительное и антиоксидантное действие, кроме того данное средство улучшает регуляцию кровообращения;

• Сорбент цеолит (Майнское месторождение Ульяновской области) - кристаллический пористый алюмосиликат, который, благодаря определенным размерам пор внутренних полостей, обладает молекулярно-ситовым свойством, и поэтому является хорошим адсорбентом для многих органических и неорганических веществ.

Кролики диоксин получали в хлебных болюсах, ацетат свинца - в виде водного раствора. Поросятам диоксин выпаивали через зонд в виде масляной эмульсии посредством нанесения на корень языка специально изготовленным для этих целей атравматическим

зондом, Т-2 токсин примешивали к корму. Овцам диоксин задавали в хлебных болюсах, Т-2 токсин - с кормом. Цеолит примешивали к корму из расчета 2% от сухого вещества рациона, димефосфон животным выпаивали.

Гематологические и биохимические исследования включали определение количества эритроцитов, гемоглобина, гематокрита и лейкоцитов по общепринятым методам И.П. Кондрахин [7]. Общий белок сыворотки крови определяли на рефрактометре ИРФ-22, белковые фракции - методом Олла и Маккарда в модификации С.А. Каргаока [6], основанном на свойствах фосфатных растворов осаждать белки, с последующим колометрированием на КФК - 2 при красном светофильтре.

Содержание продуктов перекисного окисления липидов - по М.С. Гончаренко, А.М. Латиновой [3], основанный на реакции 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК). Концентрацию продуктов белкового и липидного обменов, углеводов определяли на биохимическом анализаторе «Microlab 300».

Иммунологические исследования. Уровень Т- лимфоцитов в периферической крови определяли методом спонтанного розеткообразования с гетерогенными эритроцитами (Е-РОК). Идентификацию В - клеток проводили методом ЕАС - розеток по Г. Фримелю [21]. Фагоцитарную способность нейтрофилов в периферической крови определяли по методике С.А. Кост и М.И. Стенко [8], объектом фагоцитоза служила суточная культура Staphylococcus aureus с наличием 1 млрд клеток в 1 мл взвеси. Функциональную способность нейтрофилов определяли по показателям фагоцитоза: фагоцитарной активности - проценту активных (фагоцитирующих) нейтрофилов; фагоцитарному индексу — среднему числу микробных тел, приходящихся на один сосчитанный нейтрофил; фагоцитарному числу - среднему количеству микробов в одном активном нейтрофиле; фагоцитарной емкости, характеризующей общую фагоцитарную активность. Лизоцимную активность сыворотки крови (ЛАСК) устанавливали нефелометрическим методом по В.Г. Дорофейчук [4], основанном на способности фермента растворять мукополисахариды оболочки ряда бактерий. В качестве стандарта для определения титра лизоцима в испытуемом материале служила однодневная культура Micrococcus lisodecticus.

С помощью методов электронной микроскопии исследовали ультраслруктуру клеток паренхимы печени, коркового вещества почек, коры головного мозга, белой пульпы селезенки и миокарда. Подготовка отобранного материала проводилась по принятой классической схеме [18]. Образцы фиксировали в 1%-ном растворе глутаровош альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (РН 7,4) в течение нескольких суток в холодильнике. После этого промывали от фиксатора в 0,1М фосфатном буфере. Постфиксацию проводили в 2%-ном растворе четырехокиси осмия на том же буфере 2 часа. После постфиксации повторно промывали материал 0,1М фосфатным буфером. Далее проводилась дегидратация материала в спиртовом ряду с постепенно повышающейся концентрацией спирта (30, 5ff, 7Cf, 80, 96, 100), с последующим помещением материала в ацетон. После дегидратации кусочки ткани заключали в смесь эпоновых смол (Epon812 + DDSA + MNA + DMP-30 Fluka) и ацетона для постепенной пропитки.

После полимеризации смол готовили полугонкие срезы толщиной 1 мкм, которые просматривали в световом микроскопе для определения необходимого участка ткани, после чего блоки с материалом подготавливали для ультратонкой резки. Ультратонкие срезы (толщиной 70 нм) получали на ультрамикротоме LKB Ш 8800. Срезы монтировали на электронно-микроскопические сетки и окрашивали уранилацетатом (1 час) и цитратом

свинца (1,5 мин). Полученные сетки со срезами изучали в электронном микроскопе JEM 100СХ-П («Jeol», Japan).

Съемку проводили на фототехническую пленку AGFA ORTHOCHROMATIC. Оцифровку негативов производили на сканере EPSON PERFECTION 4990 PHOTO с разрешением 600 dpi. Конечный результат - обрабатывали с помощью программ ACD SeeProv.6. и Axio Vision Reí. 4.8 (Carl Zeiss). Микрофотографии объектов исследований описывали согласно современным научным требованиям.

Морфометрический подсчет проводили на микрофотографиях участков срезов с помощью программы Axio Vision Reí. 4.8 (Carl Zeiss).

Для статистической обработки применяли:

1. Дескриптивный анализ - с вычислением средней (М), стандартной ошибки (ш), среднеквадратического отклонения (5);

2. Статистическую обработку различий групповых средних оценивали по t-тесту Стьюдента, статистически значимыми считали различия при р<0,05;

3. Многомерное статистическое исследование полученного первичного численного материала проводили с помощью факторного анализа.

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ХРОНИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ТОКСИКАНТОВ И ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ НА ОРАГНИЗМ КРОЛИКОВ

2.2.1 Изучение общетоксического действия малых доз диоксина, ацетата свинца, применяемых раздельно, сочетанно и на фоне лечебно-профилактических средств, при длительном поступлении в организм кроликов

Длительность эксперимента составляла 60 дней. Животных опытных групп подвергали действию токсикантов в течение 40 дней. Дозы и сочетания токсических веществ, включая лечебно-профилактические средства, представлены в таблице 1.

Таблица 1. Схема опытов проведенных на кроликах

Группы животных Наименование препаратов Дозы

1 (контроль) Растительное масло -

2 Диоксин (2,3,7,8-ТХДД) 1/200 ЛД50(0,15 мкг/кг м.т.)

3 Свинца ацетат 1/10 ЛД50 (65 мг/кг м.т.)

4 сочетанно Диоксин (2,3,7,8-ТХДД), Свинца ацетат 1/200 ЛД5о(0,15 мкг/кг м.т.) 1/10 ЛД50 (65 мг/кг м.т.)

5 сочетанно Диоксин (2,3,7,8-ТХДЦ), Свинца ацетат, Цеолит 1 /200 ЛД50 (0,15 мкг/кг м.т.) 1/10 ЛД50 (65 мг/кг м.т.) 2% от рациона животного в сутки

6 сочетанно Диоксин (2,3,7,8-ТХДЦ), Свинца ацетат, Цеолит, Димефосфон 1/200 ЛД50(0,15 мкг/кг м.т.) 1/10 ЛД50 (65 мг/кг м.т.) 2% от рациона животного в сутки 90 мг/кг массы тела

Гематологические, иммунологические и биохимические показатели

На основании полученных результатов к 40-м суткам в группе кроликов, получавших диоксин в дозе 1/200 ЛД50, относительно фоновых величин, отмечалось понижение концентрации гемоглобина, Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, альбуминов и а-глобулинов соответственно при р<0,05 на 15,0, 14,7, 13,0, 13,2 и 15,6%. Значения показателей Р-, у-глобулинов, аланинаминотрансферазы (далее AJIT), аспартатаминотрансферазы (далее ACT) и малонового диальдегида (далее МДА в плазме крови) характеризовались повышением показателей соответственно при р<0, 05 на 40,8, 38,6, 61,9, 71,5 и 112,2%. К 60 суткам (20 дней после отравления) в этой группе кроликов выявлено статистически достоверное (р<0,05) снижение уровня гемоглобина, лейкоцитов, альбуминов и а-глобулинов соответственно на 18,4, 10,3, 6,2, 9,1 13,1 и 21,2%. Концентрация Р-глобулинов, у-глобулинов, AJIT, ACT и МДА увеличивалась соответственно при р<0,05 на 39,1,41,1,26,6, 86,1 и 30,1%.

В группе животных (ацетат свинца 1/10 ЛД50) к 40 суткам содержание эритроцитов, гемоглобина, Т- и В-лимфоцитов, общего белка и альбуминов понижалось соответственно прир<0,05 на 18,1,14,0,12,6,20,0,9,7 и 20,0%.

Значения Р-глобулинов, у-глобулинов, AJIT, ACT и МДА статистически достоверно поднимались соответственно на 62,6, 28,9, 79,4, 127,6, 44,1%. К 60 суткам уровень эритроцитов, гемоглобина и лейкоцитов, Т- и В-лимфоцитов, общего белка и альбуминов снижался соответственно при р<0,05 на 20,2, 12,9, 9,7, 13,4, 21,4, 9,2 и 20,5%. Концентрация Р-глобулинов, у-глобулинов АЛТ, ACT и МДА повышалась соответственно прир<0,05 на 64,3,29,4,43,3,150,3 и 12,2%.

При сочетанной затравке кроликов диоксином и ацетатом свинца (1/200 ЛД50 и 1/10 ЛД50), к 40-му дню отмечалось понижение уровня эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов, фагоцитарной активности, фагоцитарного индекса, фагоцитарного числа, фагоцитарной емкости, лизоцимной активности сыворотки крови (далее JIACK), Т- и В- лимфоцитов, общего белка и альбуминов, соответственно при р<0,05 на 25,1,22,0,21,6,22,0, 41,0, 39,2, 55,1, 35,1, 28,2, 22,6, 19,0 и 23,0%. Уровни значений а-глобулинов, р-глобулинов, у-глобулинов, AJIT ACT МДА поднимались соответственно при р<0,05 на 23,8, 100,4, 23,6, 226,8,254,2 и 158,2%.

К 40-му дню в группе животных (получавшей комплексно с токсикантами цеолит 2% от рациона) выявлялось снижение фагоцитарного индекса, фагоцитарной емкости, JIACK, общего белка и альбуминов, при р<0,05 соответственно на 15,5, 13,4, 17,1, 5,6 и 11,1%. Концентрация а-глобулинов, Р-глобулинов, AJIT, ACT и МДА статистически достоверно повышалась, соответственно на 16,8, 28,0, 34,8, 93,2 и 83,2%. На 60-й день отмечалось понижение значений фагоцитарного числа, фагоцитарной емкости, ЛАСК, Т-лимфоцитов, общего белка и альбуминов соответственно при р<0,05 до 9,5,15,8,18,5, 8,0, 6,4 и 12,8%). Уровень Р-глобулинов, у-глобулинов, АЛТ, ACT и МДА поднимался соответственно при р<0,05 до 34,0,10,2,23,6,98,7 и 8,9%.

У кроликов получавших наряду с токсикантами цеолит и димефосфон, значения исследуемых показателей оставалось в пределах фоновых величин.

Проведенные токсикологические исследования на кроликах показали, что наибольшее негативное воздействие отмечалось при сочетанием отравлении: диоксином в дозе 1/200 ЛД50 и ацетатом свинца в дозе 1/10 ЛД50. Таким образом, данные токсиканты в сочетанном поступлении оказывали взаимоусиливающее влияние на организм животных.

2.2.2 Электронно-микроскопические исследования воздействия ксенобиотиков и лечебно-профилактических средств на клетки органов кроликов

Ультратонкие исследования гепатоцитов. При исследовании ультраструктурной организации и морфометрического анализа на 40 день хронической затравки диоксином в дозе 1/200 от ЛД50 в гепатоцитах отмечено сильное набухание митохондрий (более чем в 2 раза), которые характеризуются округлой формой и просветленным матриксом. Уменьшается количество митохондрий (рис. 1).

Набухание является результатом разобщения окислительно-восстановительных процессов в этих органеллах. Пероксисомы в гепатоцитах кроликов затравленных диоксином, увеличиваются в размерах при р<0,05 на 70% (рис. 2). Эти органеллы содержат окислительные ферменты, и по сути защищающие клетку от окислительного стресса. Кроме этого, в гепатоцитах отмечается расширение каналов ЭПР, просветление цитоплазмы, перераспределение ядерного материала (рис. 3-4).

■ кол-во митохондрии - средняя площадь митохондрий

в кол-во пероксисом - средняя площадь пероксисом

Рис. 1. Морфометрические показатели митохондрий гепатоцитов кроликов. Левая ось ординат - количество митохондрий на 100 мкм2 снимка, правая ось ординат - средняя площадь сечений митохондрий (в мкм2), ось абсцисс - группы животных, * - Р <0,05 по сравнению с контрольным значением.

Условные обозначения-. К - контроль; Д - диоксин в дозе 1/200 ЛД50; С - ацетат свинца дозе 1/10 ЛД50; Д+С - диоксин и ацетат свинца; Д+С+Ц - диоксин, ацетат свинца и цеолит (2% рациона животного в сутки); Д+С+Ц+Д - диоксин, ацетат свинца, цеолит и димефосфон (90 мг/кг массы тела); РД - репарация (20 дней) после затравки диоксином, РС - репарация (20 дней) после затравки ацетатом свинца, РДСЦ - репарация (20 дней) после затравки диоксином, ацетатом свинца и применения цеолита, РДСЦД - репарация (20 дней) после затравки диоксином, ацетатом свинца и применения цеолита и димефосфона.

Рис. 2. Морфометрические показатели пероксисом гепатоцитов кроликов. Левая ось ординат - количество пероксисом на 100 мкм2 снимка, правая ось ординат - средняя площадь сечений пероксисом, ось абсцисс -группы животных, * - Р <0,05 по сравнению с контрольным значением.

Стоит отметить, что на этом фоне происходит повышение уровней биохимических показателей характеризующих состояние, как клеточных мембран, так и гепатоцитов в целом. Так показатели МДА, AJIT и ACT достоверно повышаются, (р<0,05), соответственно на 112,2, 61,9 и 71,5%.

Ацетат свинца, в дозе 1/10 от ЛД5о, оказывает специфичное, отличное от диоксина действие на ультраструктуру митохондрий гепатоцитов кроликов, выражающееся нарушаем структуры матрикса и крист, увеличением количества митохондрий без изменения их площади. Пероксисомы, достаточно крупные, что с | одной стороны является признаком имеющегося в клетке окислительного стресса, с ; другой наличия адпатационно-приспособительных процессов. Концентрация МДА, ; АЛТ и ACT характеризуется статистически достоверным подъемом значений до 44,1, 79,4 и 127,6%, что также свидетельствует о процессах клеточной деструкции.

MX ПС

1. ИХ

ЭПР ■ .. , ядро • MX

■ f : : -ч 1цт * инХРг .

! Рис. 3. Гепатоцит кролика контрольной Рис. 4. Гепатоцит кролика после воздействия

1 группы. диоксина в дозе 1/200 ЛД50.

Условные обозначения: ЭПР - гранулярный эндоплазматический ретикулум, MX -I митохондрии, ПС - пероксисомы, инХРг - интерхроматиновые гранулы.

При сочетанном отравлении диоксином и ацетатом свинца в дозах 1/200 ЛД50 и 1/10 ЛД50, проявляются наиболее выраженные патологические изменения ультраструктуры гепатоцитов: изменение ядерного аппарата, дезинтеграция рибосом и всего белок-синтезирующего комплекса, нарушение энергетического I баланса. Морфометрический анализ демонстрирует (рис. 1 и 2) минимальные показатели количества митохондрий и пероксисом в сравнении со всеми остальными группами. Мембраны крист визуализируются как размытые, располагаются в основном по периферии внешней оболочки. В некоторых митохондриях просматриваются плотные гранулы. По всей цитоплазме распределено очень большое количество мелких и крупных вакуолей с электронно-прозрачным содержимым. Жировых включений, гликогена мало, отмечаются 1 телолизосомы, остаточные тела и МЛТ. Присутствует гранулярный эндоплазматический ретикулум с набухшими цистернами. Уровни МДА, АЛТ и ACT по сравнению с фоновыми значениями достоверно повышаются, соответственно на 158,2, 226,8 и 254,2%.

На фоне применения цеолита, происходит максимальное повышение количества митохондрий с незначительной тенденцией увеличения их площади (рис. 1). Количество пероксисом также начинает расти относительно предыдущей группы, размеры на отметке контрольной группы (рис. 2). Концентрация МДА, AJ1T и ACT при р<0,05 повышается соответственно на 83,2, 23,6 и 98,7%. Полученные значения свидетельствует о повышении величины активности пероксисом и митохондрий. Усиление энергизации способствует защите клетки от окислительного стресса и детоксикации ксенобиотиков.

Добавление димефосфона характеризуется резким подъемом уровня активности пероксисом (увеличены в размерах при р<0,05 на 47,0% от контроля). Количество и размеры митохондрий близки к контрольным показателям. Кристы митохондрий хорошо визуализируются. Как видно, проявляется протекторный эффект лечебно-профилактических средств, в том числе, мембранно-стабилизирующее действие препарата димефосфон на гепатоциты кроликов.

Таким образом, электронно-микроскопическими исследованиями и морфометрическим анализом установлено, что диоксин в дозе 1/200 ЛД50 в гепатоцитах кроликов приводит к набуханию митохондрий и увеличению площади пероксисом. Ацетат свинца, в дозе 1/10 от ЛД50 нарушает структуры матрикса и крист, при этом увеличивается количество митохондрий и площадь пероксисом.

Улыпратонкие исследования клеток коркового вещества почек.

Эпителиоциты проксимальных канальцев почек кроликов после воздействия диоксина в дозе 1/200 ЛД50. Ядра эпителиоцитов в основном округлой формы с хроматином средней электронной плотности. Отмечается гетерогенная реакция митохондрий на воздействие диоксином. Много пероксисом. Складки плазматической мембраны базальной части клетки характеризуются наличием участков с расширенным межмембранным пространством. Вся цитоплазма равномерно заполнена очень большим количеством мелких вакуолей с электронно-прозрачным содержимым. Некоторые эпителиоциты проксимальных канальцев имеют в цитоплазме липидные капли, вторичные лизосомы. Отмечаются расширенные фильтрационные щели в гломеруле, слияние ножек подоцитов и отслоение эндотелия от базальной пластинки. В большинстве трабекул хорошо просматривается актиновый цитоскелет.

После воздействия ацетата свинца в дозе 1/10 ДЦ50 эпителиоциты проксимальных канальцев имеют ядра неправильной формы. Их перинуклеарное пространство имеет относительно равномерную ширину на всем своем протяжении. Эпителиоциты наличествуют множеством митохондрий с хорошо выраженным полиморфизмом (рис. 5, 6)

Отмечены митохондрии бубликовидной формы. В митохондриях этой группы кроликов выявлены плотные мелкие гранулы. Аппарат Гольджи встречается редко. Очень много пероксисом, имеют место телолизосомы. Отмечаются расширенные фильтрационные щели и нарушение эндотелия фильтрационного барьера. В некоторых трабекулах цитоскелет хорошо развит, а в некоторых, почти отсутствует.

Рис. 5. Участок проксимального Рис. 6. Участок коркового слоя почек

; канальца кролика после воздействия ацетата кролика после воздействия ацетата свинца в

свинца дозе 1/10 ЛД50, стрелками обозначена дозе 1/10 ЛД50. \ складчатость мембраны базальной части клетки.

Условные обозначения: МХ - митохондрии, БП - базапьная пластинка, ЦП - цитоподии, ЭНД - эндотелий.

Наиболее выраженные патологические изменения ультраструктуры проявляются , при сочетанном отравлении диоксином и ацетатом свинца в дозах 1/200 ЛД50 и 1/10 ЛД5о. Ядра эпителиоцитов округлой формы, цитоплазма просветленная. Гранулярный эндоплазматический ретикулум плохо развит. Митохондрии эпителиоцитов имеют либо электронно-прозрачный хлопьевидный матрикс с короткими кристами по периферии, либо кристы в виде остаточных мембран. Гладкая эндоплазматическая сеть представлена мелкими каналами.

В цитоплазме повсеместно встречаются пероксисомы и телолизосомы. Базальная мембрана фильтрационного барьера почечных клубочков кроликов после сочетанного воздействия диоксина и ацетата свинца обладает толщиной в среднем 209 нм.

Отмечаются суженные фильтрационные щели. Присутствует отслоение эндотелия от базальной пластинки фильтрационного барьера и его фрагментирование. | Митохондрии подоцитов содержат электронно-прозрачный матрикс. Перечисленные признаки характеризуют процессы клеточной деструкции.

Морфометрические анализ коркового вещества почек кроликов. Помимо ультраструктурного анализа электронно-микроскопических снимков корковой зоны почек кроликов, нами был проведен морфометрический, по складчатости проксимальных канальцев, толщины базальной пластинки и количества диафрагм фильтрационного барьера гломерулы.

Из морфометрических данных, представленных на рисунке 7 следует, что из двух апробированных по отдельности токсикантов, наибольшее влияние на протяженность базальной плазмалеммы клеток проксимальных канальцев почек кроликов, оказывает ацетат свинца.

Рис. 7. Морфометрические показатели складчатости базальной плазмалеммы проксимальных канальцев почек контрольной и опытных групп кроликов. Ось ординат -средняя протяженность базальной плазмолеммы (мкм) относительно 5 мкм базальной пластинки, ось абсцисс - группы животных, * - Р <0,05 по сравнению с контрольным значением.

Рис. 8. Морфометрические показатели количества диафрагм фильтрационного барьера гломерулы на единицу длины (3 мкм базальной пластинки) почек контрольной и опытных групп кроликов. Ось ординат -количество диафрагм (шт), ось абсцисс -группы животных, * - Р <0,05 по сравнению с контрольным значением.

Условные обозначения: к - контроль; д - диоксин; с - ацетат свинца; дс - диоксин, ацетат свинца; дсц - диоксин, ацетат свинца, цеолит; дсцд - диоксин, ацетат свинца, цеолит и димефосфон.

Максимальные изменения наблюдаются при сочетанием действии диоксина и ацетата свинца. Наибольшая защитная эффективность отмечается при совместном использовании лекарственных препаратов. Кроме этого, определено изменение количества диафрагм фильтрационного барьера гломерулы на единицу длины и средней толщины (нм) базальной мембраны фильтрационного барьера почек кроликов (рис. 8).

Рис. 9. Средняя толщина (нм) базальной пластинки фильтрационного барьера почек кроликов. Ось ординат - средняя толщина базальной пластинки, ось абсцисс - группы животных, * - Р <0,05 по сравнению с контрольным значением.

Условные обозначения: к - контроль; д — диоксин; с - ацетат свинца; дс - диоксин, ацетат свинца; дсц - диоксин, ацетат свинца, цеолит; дсцд -диоксин, ацетат свинца, цеолит и димефосфон.

Графические данные на рисунке 9 свидетельствуют, что из апробированных по отдельности токсикантов в большей мере влияние на уменьшение средней толщины базальной мембраны оказывает диоксин. Наибольшая защитная эффективность отмечается при совместном использовании лечебно-профилактических средств.

Анализ ультраструктуры и морфометрическая обработка электронно-микроскопических снимков почек кроликов, наглядно отражает мембранно-

стабилизирующее действие препарата димефосфона в комплексе с адсорбентом цеолитом на морфофункциональные показатели клеток коркового слоя почек кроликов.

Ультратонкие исследования клеток белой пульпы селезенки. Ядра лимфоцитов в лимфоидных узелках селезенки кроликов после воздействия диоксина в дозе 1/200 ЛД50 овальные неправильной формы, кариоплазма просветленная, у большинства клеток увеличенное с выпячиваниями пери-нуклеарное пространство. Особо обращает внимание неудовлетворительное состояние митохондрий лимфоцитов. Наблюдается их перерождение, сопровождающееся, просветлением матрикса, исчезновением крист, деструкцией мембран и в конечном итоге появлением вакуолей.

После воздействия ацетата свинца в дозе 1/10 ЛД50 ядра лимфоцитов в лимфоидных узелках неправильной формы, кариоплазма средней электронной плотности. Некоторые ядра имеют глубокие инвагинации кариолеммы. Перинуклеарное пространство равномерное по своей ширине. Конденсированный хроматин локализуется по периферии ядерной оболочки. Ядрышки хорошо выражены. Цитоплазма лимфоцитов хлопьевидной консистенции. Но при этом в отличие от предыдущей группы, можно сделать вывод о том, что митохондрии при воздействии ацетата свинца страдают в меньшей степени. Так как, несмотря на то, что во многих лимфоцитах наблюдаются деструктурированные формы, зачастую встречаются и нормальные, с электронно-плотным матриксом, с неповрежденной двойной мембранной и четко выраженными кристами.

■•'--.'"Ч- -..е.' . Ы """ ■ • «ЯР» .> • -й-. • "А« «ДЖ^шав 1. чмгг*- л*л* ^Мст&Ш ядро ^ / „„ н ЯЯро «х

Рис. 10. Лимфоциты селезенки Рис. 11. Лимфоцит кролика после

кролика после сочетанного воздействия сочетаниого воздействия диоксина (1/200 ЛД50), диоксина (1/200 ЛД50), ацетата свинца (1/10 ацетата свинца (1/10 ЛД50) и применением ЛД50). цеолита (2% от рациона животного в сутки) и

димефосфона (90 мг/кг массы тела).

Условные обозначения: В - вакуоли, ПНП — выпячивание перинуклеарного пространства, МХ - митохондрии.

В группе кроликов после сочетанного воздействия диоксина и ацетата свинца в дозах 1/200 ЛД50 и 1/10 ЛД5о обнаруживаются самые серьезные деструктивные процессы (рис. 10). Цитоплазма клеток просветленная, заполнена большим количеством вакуолей различной величины, иногда исключительно крупных до 1,3 мкм. В клетках отмечаются мультиламеллярные тела. Нормальные митохондрии не встречаются. В большинстве своем, они находятся в стадии сильнейшего перерождения с полной потерей содержимого.

Исследования группы кроликов получавших кроме сочетанной затравки цеолит показали, морфологическую картину практически не отличающуюся от групп животных с моноинтоксикацией диоксином и ацетатом свинца. Мы не выявили эффекта адсорбента цеолита на селезенке, положительный результат показало лишь комплексное использование лечебно-профилактических средств (рис. 11).

Морфометрические показатели клеток лимфоидных узелков селезенки контрольной и опытных групп кроликов. С целью сравнения, различных популяций, митохондрий клеток лимфоидных узелков селезенки, контрольных и опытных групп кроликов провели подсчет различных типов митохондрий на микрофотографиях в пересчете на 1 мкм площади среза. По ультраструктурным характеристикам все митохондрии были разделены на три типа:

1. нормальные — пластинчатые кристы заполняют профиль органеллы, матрикс средней электронной плотности;

2. митохондрии с отклонениями от нормы - округлая форма, электронно-светлая центральная часть матрикса, короткие кристы располагаются по периферии, сохраняется целостность мембран;

3. митохондрии с патологическими признаками - разрывы наружной и/или внутренней мембраны.

Подсчет количества митохондрий провели на микроснимках на единицу площади среза. Данные представлены в диаграмме на рис. 12. Результаты исследования и морфометрический анализ показал, что диоксин в дозе 1/200 ЛД50 в большей степени, чем ацетат свинца в дозе 1/10 ЛД50 нарушает структуру мембран митохондрий, вероятно, это связано с запуском механизма перекисного окисления липидов (ПОЛ). У кроликов при сочетанном отравлении диоксином и ацетатом свинца практически отсутствуют митохондрии 1-го типа и преобладают митохондрии с отклонениями от нормы, что явно приводит к дефициту биоэнергии в клетках и свидетельствует о потенцированном эффекте экотоксикантов. Из представленной диаграммы видно, что наибольшее количество «нормальных» митохондрий (более чем в два раза по сравнению с контролем) и почти полное отсутствие митохондрий 3 типа наблюдается в группе животных, получавших диоксин, ацетат свинца, цеолит и димефосфон, что говорит о ярко выраженном мембрано-стабилизирующем и защитном действии комплекса лечебно-профилактических средств.

Рис. 12. Морфометрический анализ митохондрий клеток лимфоидных узелков селезенки контрольной и опытных групп кроликов. 1, 2, 3 - типы митохондрий. На оси абсцисс представлены группы животных, на оси ординат - процентное отношение каждого типа митохондрий от общего количества митохондрий.

Условные обозначения, диоксин в дозе 1/200 ЛД50, свинец - ацетат свинца в дозе 1/10 ЛД50, д+с - диоксин, ацетат свинца; дсц - диоксин, ацетат свинца, цеолит (2% от рациона животного); дсцд - диоксин, ацетат свинца, цеолит и димефосфон (90 мг/кг массы тела).

Ультратонкие исследования клеток коры головного мозга кроликов.

Упаковка хроматина в ядрах нейронов после воздействия диоксина в дозе 1/200 ЛД5о изменяется от клеток контрольной группы животных в сторону увеличения конденсированного хроматина. Встречаются инвагинации ядерной оболочки, расширение ПНП. В ядросодержащей части нейрона имеют место набухшие каналы ЭПР, аппарата Гольджи. Пероксисомы фиксируются часто. На ультратонких срезах нервных клеток и скоплений нейритов регистрируется полиморфизм митохондрий. Отмечается выраженное снижение цитоскелета в отростках нервных клеток (рис. 13). Некоторые отростки заполнены синаптическими пузырьками со светлым или плотным содержимым. По результатам морфометрических измерений (рис. 15) при р<0,05 снижается количество синапсов на 60,2% от контрольной группы, а средняя протяженность синаптической щели увеличивается на 50%.

Белое вещество коры больших полушарий головного мозга кролика после воздействия ацетата свинца в дозе 1/10 ЛД50 представлено небольшим количеством тел нервных клеток с переплетающимися отростками нейронов, последние имеют ядра округлой формы. Морфологически нарушения ядерного аппарата проявляются перераспределением хроматина, увеличением межмембранного околоядерного пространства, просветлением кариоплазмы. Много пероксисом, телолизосом с липофусцином.

Рис. 13. Участок коры больших полушарий головного мозга кролика после воздействия диоксина в дозе 1/200 ЛД50, стрелками обозначена синаптическая щель.

Рис. 14. Участок коры больших полушарий головного мозга после

воздействия ацетата свинца в дозе 1/10 ЛД50, стрелкой обозначены плотные гранулы в митохондрии.

Условные обозначения: MX - митохондрии, СВ - синаптические везикулы, НО -нервный отросток, МО - миелинизированная оболочка, MHO - миелинизированные нервные отростки, постСО — постсинаптическая окончание.

О о „<У

„О

я Количество синапсов

Рис.15. Морфометрический анализ синаптических контактов. На левой оси ординат - количество синапсов на 100 мкм2, на правой оси ординат - средняя длина СЩ в мкм. На оси абсцисс представлены группы животных, * - Р <0,05 по сравнению с контрольным значением.

Условные обозначения. К - контроль; Д - диоксин в дозе 1/200 ЛД50; С - ацетат свинца дозе 1/10 ЛД50; Д+С - диоксин и ацетат свинца; Д+С+Ц - диоксин, ацетат свинца и цеолит (2% рациона животного); Д+С+Ц+Д - диоксин, ацетат свинца, цеолит и димефосфон (90 мг/кг массы тела); РД — репарация (20 дней) после затравки диоксином, РС - репарация (20 дней) после затравки ацетатом свинца, РДСЦ - репарация (20 дней) после затравки диоксином, ацетатом свинца и применения цеолита, РДСЦЦ - репарация (20 дней) после затравки диоксином, ацетатом свинца и применения цеолита, димефосфона.

Эндоплазматическая сеть слабо выражена. В данной группе кроликов характерной особенностью является наличие плотных гранул в матриксе митохондрий (рис. 14). Это особенно четко просматриваются в просветленном матриксе, в нейроплазме отростков и в кариоплазме некоторых ядер.

Велика доля митохондрий с хорошо развитыми кристами в матриксе умеренной плотности. Отмечается снижение количества цитоскелета в отростках нервных клеток. Некоторые отростки заполнены синаптическими пузырьками со светлым или плотным содержимым. По результатам морфометрических измерений (рис. 15) при р<0,05 снижается количество синапсов на 61,1%, а средняя протяженность синаптической щели увеличивается при р<0,05 на 35,0%.

Ядра нейронов кроликов после сочетанного воздействия диоксина и ацетата свинца в дозах 1/200 ЛД5о и 1/10 ЛД50 имеют округлую форму и характеризуются преимущественно фибриллярным хроматином и просветленной нуклеоплазмой. Цитоплазма хлопьевидная, сильно просветленная, каналы ЭПР набухшие, встречаются пероксисомы как в теле нейрона, так и в их отростках. Также в цитоплазме тела нейрона встречаются телолизосомы, заполненные липофусцином. Среди митохондрий значительно преобладают органеллы с признаками деструкции. В электронно-прозрачном матриксе митохондрий, в нейритах и в кариоплазме появляются электронно-плотные гранулы, такие как отмечены выше в группе кроликов получавших свинец в дозе 1/10 ЛД50. В целом наблюдается выраженное снижение количества микротрубочек в отростках нервных клеток. Резко сокращается количество синапсов, при р<0,05 на 73,2%, а средняя протяженность синаптической щели уменьшается при р<0,05 всего на 5%.

Выраженные признаки сохранности структур нервной ткани коры головного мозга, отмечаются на фоне введения цеолита и димефосфона (2% рациона и 90 мг/кг массы тела). Хорошо визуализируется гранулярный эндоплазматический ретикулум. Однако фиксируются набухшие и разрушенные митохондрии, в матриксе митохондрий сохраняются плотные гранулы. Нервные отростки заполнены цитоскелетом и секреторными везикулами. По результатам морфометрических измерений количество синапсов от нормы различается р<0,05 на 45,2% и средняя протяженность синаптической щели почти достигает контрольного уровня. Средняя длина синаптической щели составляет 0,21 мкм.

Представленные результаты электронно-микроскопических исследований и анализ морфометрических измерений показывают, что на 20 сутки после окончания затравки, обнаруживается частичное восстановление клеточных структур большинства нервных клеток и их отростков. Количество синапсов после отравления обоими экотоксикантами на фоне применения лекарственных средств на 20 сутки увеличивается при р<0,05 на 70,0% и это значение меньше чем в контрольной группе всего на 2,9%. Средняя длина синаптической щели остается на уровне интактной группы.

Ультратопкие исследования кардиомиоцитов. Обращает внимание изменения кардиомиоцитов группы кроликов после сочетанной интоксикации диоксином и ацетатом свинца в дозах 1/200 ЛД50 и 1/10 ЛД50: наличие в цитоплазме вакуолей с электронно-прозрачным содержимым. Сеть миофибрилл рыхлая.

Митохондрии цитоплазмы с просветленным матриксом и единичными хаотичными кристами расположены между пучками волокон. Ядра кардиомиоцитов кроликов после сочетанного воздействия диоксина, ацетата свинца в дозах 1/200 ЛД50,1/10 ЛД50 и применения цеолита с димефосфоном (2% рациона животного и 90

мг/кг массы тела) удлиненной формы с ядерной оболочкой имеющей множественные складки-инвагинации. Примечательно, что некоторые кардиомиоциты в околоядерной саркоплазме, наличествуют существенным количеством митохондрий. Основная масса удлиненных митохондрий локализуется в миофибриллярной зоне, многие из них связаны межмитохондриальными контактами. Митохондрии содержат матрикс средней электронной плотности с параллельно расположенными пластинчатыми кристами. Межмембранное расстояние крист постоянно на всей их протяженности. В цитоплазме регистрируются телолизосомы.

В группе кроликов, которым вместе с экотоксикантами задавали лечебно-профилактические средства, ультраструктурная картина характеризуется сохранностью клеток.

2.3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ХРОНИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ТОКСИКАНТОВ И ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ НА ОРГАНИЗМ СВИНЕЙ

2.3.1 Изучение общетоксического действия малых доз диоксина, Т-2 токсина, применяемых раздельно, сочетанно и на фоне лечебно-профилактических средств, при длительном поступлении в организм свиней

Длительность эксперимента составляла 45 дней. В течение этого срока животных опытных групп подвергали действию токсикантов. Дозы и сочетания токсических веществ, включая лечебно-профилактические средства, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Схема опытов проведенных на поросятах

Группы животных Наименование препаратов Дозы

1 контроль Растительное масло —

2 Диоксин (2,3,7,8-ТХДД) 1/400 ЛД50 (15 мкг/кг м.т.)

3 Диоксин (2,3,7,8-ТХДД) 1/600 ЛД50 (10 мкг/кг м.т.)

4 Диоксин (2,3,7,8-ТХДД) 1/800 ЛД50 (7,5 мкг/кг м.т.)

5 Т-2 токсин 2 ПДК, (200 мкг/кг корма/сут.)

6 сочетанно Диоксин (2,3,7,8-ТХДД), Т-2 токсин 1/400 ЛД50 (15 мкг/кг м.т.) 2 ПДК, (200 мкг/кг корма/сут.)

7 сочетанно Диоксин (2,3,7,8-ТХДД), Т-2 токсин 1/800 ЛД50 (7,5 мкг/кг м.т.) 2 ПДК, (200 мкг/кг корма/сут.)

8 сочетанно Диоксин (2,3,7,8-ТХДД), Т-2 токсин, Цеолит Димефосфон, 15% раствор, 1/400 ЛД50 (15 мкг/кг м.т.) 2 ПДК, (200 мкг/кг корма/сут.) 2% от рациона животного 90 мг/кг массы тела (0,6 мл/кг)

Гематологические, иммунологические и биохимические показатели

К 45-м суткам, при хроническом отравлении поросят диоксином в дозе 1/400 ЛД50 в сравнении с фоновыми значениями отмечалось понижение концентрации эритроцитов, гемоглобина, фагоцитарной активности, фагоцитарного числа, фагоцитарной емкости, ЛАСК, Т- лимфоцитов, В- лимфоцитов, общего белка, альбуминов и глюкозы при р<0,05 соответственно на 19,7, 11,7,25,0, 36,4, 39,3, 22,5, 24,1, 38,6, 19,4, 29,8 и 19,2%. На этом фоне происходило статистически достоверное повышение концентрации Р-глобулинов, у-глобулинов, АЛТ, ACT, щелочной фосфатазы (далее ЩФ), щелочной фосфатазы (далее ЩФ), общего билирубина, холестерина, креатинина, мочевины и МДА, соответственно на 49,4, 26,8, 62,9, 146,4,118,3, 90,5, 46,3, 26,1, 170,1 и 170,1%.

В группе животных, затравленных диоксином в дозе 1/600 ЛД50, выявлялось снижение уровня показателей - эритроцитов, гемоглобина, фагоцитарной активности, числа, емкости, ЛАСК, Т- и В- лимфоцитов, общего белка и альбуминов при р<0,05 соответственно на 12,4, 5,7, 20,5, 26,9, 30,7, 12,0, 17,8, 25,6, 14,6 и 15,0%. Концентрация р-глобулинов, у-глобулинов, ACT, ЩФ, общего билирубина, холестерина, мочевины и МДА при р<0,05 повышалась соответственно на 14,4,27,8,

83.5, 72,8, 74,4, 28,7, 110,6 и 93,5%.

При дозе диоксина 1/800 от ЛД50 морфологические и иммунологические показатели оставались в пределах исходных значений. Имелись некоторые статистически достоверные подвижки уровня ряда биохимических показателей: содержание общего белка понижалось на 8,2%; уровень АЛТ, ACT, ЩФ, общего билирубина, холестерина, креатинина, мочевины и МДА превышал фоновые значения соответственно на 23,2, 37,8, 35,7, 51,1, 13,0, 15,6 52,2 и 47,6%.

При затравке Т-2 токсином в дозе 2 ПДК наблюдалось снижение значений показателей эритроцитов, лейкоцитов, фагоцитарной активности, фагоцитарного числа, фагоцитарной емкости, ЛАСК, Т- и В-клеток, общего белка, а-глобулинов и глюкозы при р<0,05 соответственно на 14,0, 9,1, 18,5, 21,5, 28,7, 14,0, 14,5, 14,5, 8,7, 6,6 и 14,8%. Концентрация АЛТ, ACT, ЩФ, общего билирубина, мочевины и МДА увеличивалась при р<0,05 соответственно на 18,9, 64,7, 36,9, 88,9, 56,7 и 75,8%.

Сочетанное поступление диоксина в дозе 1/400 ЛД5о и Т-2 токсина в дозе 2 ПДК характеризовалось понижением уровня эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов, фагоцитарной активности, фагоцитарного числа, фагоцитарного индекса, фагоцитарной емкости, ЛАСК, Т- и В лимфоцитов, общего белка, альбуминов и глюкозы при р<0,05 соответственно на 22,8, 22,2, 29,9, 37,3, 44,3, 11,3, 61,0, 28,2,

30.6, 44,2, 28,2, 35,2 и 45,6%. Концентрация Р- глобулинов, у-глобулинов, АЛТ, ACT, ЩФ, общего билирубина, холестерина, креатинина, мочевины и МДА повышалась при р<0,05 соответственно на 53,6, 41,6, 198,9, 270,0, 140,0, 215,1, 68,8, 32,1, 260,0 и 195,9%.

У поросят получавших сочетано диоксин в дозе 1/800 ЛД50 и Т-2 токсин (2 ПДК), количественные показатели эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов, фагоцитарной активности, числа, емкости, ЛАСК, Т- и В- лимфоцитов, общего белка, альбуминов и глюкозы статистически достоверно понижались, соответственно на 17,4, 13,2, 13,7, 18,6, 24,7, 35,0, 20,0, 16,9, 21,3, 17,9, 23,1 и 21,9%. Уровень р- глобулинов, у-глобулинов, АЛТ, ACT, ЩФ, общего билирубина,

холестерина, креатинина, мочевины и МДА при р<0,05 соответственно поднимался на 27,0, 26,1, 29,9,109,9, 85,0,129,4, 39,4,17,2, 110,2 и 153,6%.

Применение цеолита и димефосфона одновременно с сочетанным поступлением в организм диоксина (1/400 ЛД50) и Т-2 токсина (2 ПДК) проявилось их протекторным действием. Причем концентрация эритроцитов повышалась при р<0,05 на 15,0%. Понижение уровня фагоцитарного числа с ЛАСК было не существенным и при р<0,05 составляло 12,6 и 10,6%. Впрочем как и повышение концентрации общего билирубина и мочевины при р<0,05 на 39,5 и 27,9%.

Таким образом, воздействие на организм поросят диоксина, Т-2 токсина, как раздельно, так и сочетанно проявляется комплексом, гематологических, биохимических и иммунологических изменений. Применение цеолита и димефосфона способствует нормализации гомеостатических систем организма и коррекции нарушенной функциональной способности органов, оказывая благоприятное влияние на кровь, процессы окисления, коррегирующее воздействие на звенья иммунной системы.

2.3.2 Электронно-микроскопические исследования воздействия ксенобиотиков и профилактических средств на организм свиней

Ультратонкие исследования гепатоцитов. При воздействии диоксина в дозе 1/800 от ЛД50 происходит усиление биоэнергетических процессов в гепатоцитах, которое проявляется в увеличении количества митохондрий (рис. 16), уплотнением их матрикса, гиперплазией грЭПР, появлением интерхроматиновых гранул. При этом отмечено увеличение количества и объема пероксисом (рис. 17), что также свидетельствует об активации процессов утилизации свободных радикалов. Митохондрии в большинстве своем имеют нормальную структуру с четко выраженными кристами и матриксом средней электронной плотности (рис. 18). Но встречаются митохондрии с хлопьевидным электронно-светлым содержимым и отсутствующими кристами. Значения биохимических показателей МДА, АЛТ и ACT повышались, при р<0,05 соответственно на 170,1,23,1 и 37,8%.

Доза диоксина 1/600 от ЛД50 ведет к снижению энергетической активности гепатоцитов (хлопьевидный матрикс и уменьшение количества митохондрий на единицу площади клетки). При влиянии диоксина в дозе 1/400 от ЛД50, отмечается значительное набухание митохондрий (рис. 16), просветление и коагуляция цитоплазмы, фрагментация ЭПР характеризует начало патологических процессов (рис. 19). При обеих дозах количество пероксисом растет (рис. 17), их размеры несколько выше контрольных значений. Биохимические показатели также статистически достоверно изменяются: значения МДА повышаются на 93,5 и 47,6, АЛТ на 37,0 и 62,1, ACT на 83,5 и 146,4%, соответственно. Уровни общего белка статистически достоверно понижаются на 14,6 и 19,4%, что характеризуют усиливающиеся процессы деструкции в клетках.

Т-2 токсин в дозе 2 ПДК понижает как количество митохондрий, так и их размеры от контрольных показателей. Происходит уплотнение матрикса и деструкция крист. В ядерном аппарате преобладает фибриллярный хроматин. Среди фибриллярного или вокруг конденсированного хроматина повсеместно

регистрируются скопления интерхроматиновых гранул, которые характеризуют признаки экспрессии генов. Имеется ядрышко, ядерных пор много. Количество пероксисом резко падает и минимально относительно других опытных групп. Уровни МДА, АЛТ и ACT статистически достоверно повышаются на 75,8, 18,9 и 64,7%, соответственно.

Максимальные негативные изменения отмечаются при сочетанной затравке диоксином и Т-2 токсином (1/400 ЛД50 и 2 ПДК): резкое уменьшение количества митохондрий (рис. 16), деструкция матрикса, увеличение пероксисом (рис. 17), увеличение ПНП ядерной оболочки можно встретить в любых клетках, крупные вакуоли в цитоплазме. Показатели МДА, АЛТ и ACT соответственно, повышаются на 195,9, 198,9 и 270,0%.

Рис. 16. Морфометрические показатели Рис. 17. Морфометрические

митохондрий гепатоцитов поросят. Левая ось показатели пероксисом гепатоцитоЕ ординат - количество митохондрий на 100 поросят. Левая ось ординат - количестве мкм2 снимка, правая ось ординат - средняя митохондрий на 100 мкм2 снимка, правая площадь митохондрий (в мкм2), ось абсцисс - ось ординат - средняя площадь группы животных, * - Р <0,05 по сравнению с митохондрий (в мкм2), ось абсцисс -контрольным значением. группы животных, * - Р <0,05 пс

сравнению с контрольным значением.

Условные обозначения: Д - диоксин (1/800, 1/600, 1/400 от ЛД50); Т-2 - Т-2 токсин (2 ПДК); Л - Лечение: цеолит (2% от рациона животного в сутки) и димефосфон (90 мг/кг массы тела)

При лечении (цеолит и димефосфон цеолита 2% от рациона животного и 90 мг/кг массы тела соответственно) в гепатоцитах проявляется выраженный терапевтический эффект: площадь митохондрий и пероксисом находится на уровне близком к контрольной группе, ультраструктурная картина характеризует активный метаболизм, который способствует процессам детоксикации. Особенностью проявления активного метаболизма является наличие комплексов состоящих из ЭПР, митохондрий, пероксисом и остаточных тел. Эти данные достоверно согласуется с биохимическими и иммунологическими показателями.

Таким образом, электронно-микроскопическими исследованиями и морфометрическим анализом установлено, что диоксин в дозах 1/400 ЛД5о, 1/600 ЛД5о на гепатоцитах поросят приводит к набуханию митохондрий и увеличению

пероксисом. Длительное пероральное введение животным Т-2 токсина характеризуется значительной вариабельностью проявлений токсического эффекта. Наибольшие морфологические нарушения, наблюдаются при сочетанном воздействии на организм поросят диоксина в дозе 1/400 ЛД50 и Т-2 токсина в дозе 2 ПДК. При лечении цеолитом и димефосфоном в гепатоцитах проявляется выраженный терапевтический эффект.

Рис. 18. Фрагмент гепатоцита свиньи Рис. 19. Фрагмент гепатоцита свиньи

группы получавшей диоксин в дозе 1/800 группы получавшей диоксин в дозе 1/400 / ЛД50. ЛД50. I

Условные обозначения: Я - ядро, МХ - митохондрии, ГрЭПР - гранулярный эндоплазматический ретикулум, ПС - пероксисомы.

Ультратонкие исследования клеток коркового вещества почек. Среди клеток коркового вещества почек свиней в первую очередь пострадали эпителиоциты проксимальных канальцев. В группе животных, получавших диоксин в дозе 1/400 ЛД50, выражен резкий полиморфизм митохондрий (рис.20, 21). В некоторых клетках происходит нарушение структуры митохондрий, отмечается резкое просветление центральной части. По периферии располагаются обрывочные кристы. Много пероксисом, лабиринт базальной мембраны просматривается отдельными фрагментами. Ядра эпителиоцитов округлой или неправильной формы. Конденсированный хроматин занимает пристеночное положение и хаотично расположен по центральной части ядра. Наблюдаются ядрышки, одно или два, на периферии ядра. Центральная часть ядрышка выделяется мелко-глобулярной структурой. Перинуклеарное пространство располагается равномерной тонкой полосой между ядерными мембранами. Много ядерных пор. В подоцитах выявляется потеря малых цитоподий.

ПС 1 , в/.'

пс ч * 1 МХ . •

У Ж? МХ ШР пс ■ : : :у БПл ■ : Ш . ■ Г МХ 4 ■ » в В

■ Я |1ЛП

Рис. 20, 21. Эиителиоциты проксимального канальца свиньи группы получавшей диоксин в дозе 1/400 ЛД50.

Условные обозначения: МХ - митохондрии, БПл - базальная пластинка, ПС - пероксисомы; короткими стрелками показаны складки клеточной мембраны базальной части клеток.

Очень интересные и яркие проявления ответной реакции отмечаются в клетках проксимальных и дистальных канальцев коркового слоя поросят после воздействия Т-2 токсина в дозе 2 ПДК. Соседние клетки в тканях зачастую имеют > индивидуальные ультраструктурные особенности. Выражен резкий полиморфизм митохондрий в пределах одной клетки - рядом с набухшими формами можно наблюдать митохондрии с плотным матриксом и множеством крист. Иногда регистрируются митохондрии уникальной структуры. Набухшие кристы (ламеллярной, трубчатой формы) и матрикс средней или высокой плотности говорит об активности процессов окислительно-восстановительного фосфорилирования. Наличие таких митохондрий можно отнести к проявлению адаптационно-компенсаторным механизмов. Встречаются они между складками клеточной мембраны базальной части клетки и в околоядерной зоне. В подоцитах отмечается как изменение формы малых цитоподий, так их слияние. Цитоплазма плотная с фрагментами грЭПР, диктиосомами комплекса Гольджи и пузырьками. Клетки с выраженными патологическими процессами не обнаружены.

В эпителиоцитах свиней после сочетанного воздействия диоксина и Т-2 токсина в дозах 1/400 ЛД50 и 2 ПДК отмечается большое количество крупных и мелких вакуолей. Наблюдается полиморфизм митохондрий. Преобладают округлые митохондрии с просветленным матриксом и отдельными кристами. В цитоплазме много пероксисом, встречаются отдельные цистерны глобулярного ЭПС, телолизосомы, пиноцитозные пузырьки. Микроворсинки в норме. В ядрах имеются участки с мелкогранулярным хроматином. Небольшое количество конденсированного хроматина хаотично распределено по площади ядра, некоторая часть занимает пристеночное положение. Видны ядрышки, центральная часть которых заполнена гомогенным мелко-глобулярным содержимым и четко выделяется на фоне ядерного хроматина. Незначительное увеличение

перинуклеарного пространства в клетках проксимальных канальцев. В подоцитах отмечается изменение формы малых цитоподий.

В подоцитах и клетках проксимальных канальцев почек группы свиней получавших вместе с экотоксикантами (диоксин, Т-2 токсин в дозах 1/400 ЛД50 и 2 ПДК) лекарственные препараты цеолит и димефосфона наблюдается ярко-выраженный терапевтический эффект.

Ультратонкие исследования клеток белой пульпы селезенки. Ядра лимфоцитов лимфоидных узелков свиней после воздействия диоксина в дозе 1/400 ЛД50 имеют овально-неправильную форму. У некоторых ядер просматриваются инвагинации значительных размеров. Конденсированный хроматин (гетерохроматин) располагается преимущественно по периферии, эухроматин — в центре ядра. В ряде лимфоцитов просматривается отдельные цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума. В целом у многих клеток (в основном не лимфоцитов) наблюдается выраженная вакуолизация цитоплазмы (характерный признак воздействия токсикантов). Кроме того, идентифицируются клетки с признаками необратимой деструкции.

Сравнение морфометрических показателей митохондрий клеток лимфоидных узелков селезенки контрольной и опытных групп свиней. С целью сравнения, различных популяций, митохондрий клеток лимфоидных узелков селезенки, контрольных и опытных групп поросят провели подсчет различных типов митохондрий на микрофотографиях в пересчете на 100 мкм2 площади среза. По ультраструктурным характеристикам все митохондрии были разделены на три типа:

1. нормальные — пластинчатые кристы заполняют профиль органеллы, матрикс средней электронной плотности;

3. митохондрии с паталогическими признаками - разрывы наружной и/или внутренней мембраны.

Сопоставляя эти показатели, провели подсчет количества митохондрий на микроснимках на единицу площади среза. Данные представлены в рисунке 22.

Результаты исследования и морфометрический анализ митохондрий, клеток лимфоидных узелков селезенки свиней показали, что апробированные дозы диоксина в меньшей степени нарушают структуру митохондрий, чем экотоксиканты апробированные на кроликах. Из представленной диаграммы видно, что сдвиг в сторону увеличения по количеству митохондрии с паталогическими признаками обнаруживается лишь в группах диоксин 1/400 ЛД50 (самая высокая дозировка диоксина), Т-2 токсин 2 ПДК и 1/400 ЛД50+Т-2 токсин 2 ПДК, имеют сходные показатели.

Из представленной диаграммы видно, что в группах диоксин 1/800 ЛД50 и 1/800+Т-2 токсин 2 ПДК токсин количество «нормальных» митохондрий остается на уровне контрольной группы, но при этом увеличивается доля митохондрий 3-й группы с патологическими характеристиками, что вероятно, приводит к некоторому недостатку энергетического ресурса клеток.

^ с» ср гК> л/ ^ ^ /

/ ^ V V

■О -О' XV

Г ^

V* . V

Рис. 22. Морфометрический анализ митохондрий белой пульпы селезенки контрольной и опытных групп свиней. 1, 2, 3 - типы митохондрий. На оси абсцисс представлены группы животных, на оси ординат - процентное отношение каждого типа митохондрий от общего количества митохондрий.

Условные обозначения: Д - диоксин (1/800, 1/600, 1/400 от ЛД50); Т-2 - Т-2 токсин (2 ПДК); Л - Лечение: цеолит (2% от рациона животного) и димефосфон (90 мг/кг массы тела).

В группе диоксин 1/400 ЛД50+Т-2 токсин 2 ПДК+лечение количество митохондрий 3 группы меньше, чем во всех группах свиней, которые получали затравку токсикантов, но больше, чем в контрольной группе. Эти факты характеризуют защитный эффект цеолита и димефосфона.

Ультратонкие исследования клеток коры головного мозга. Упаковка хроматина в ядрах нейронов после воздействия диоксина в дозе 1/400 ЛД50 изменяется от клеток контрольной группы животных в сторону увеличения фибриллярного хроматина. Встречаются инвагинации ядерной оболочки, у большинства ядер наблюдается расширенное перинуклеарное пространство. В ядросодержащей части нейрона имеют место набухшие каналы ЭПР, аппарата Гольджи, пероксисомы. На ультратонких срезах нервных клеток и скоплений нейритов регистрируется полиморфизм митохондрий. Наряду с «нормальными» митохондриями видны и набухающие. Достаточно часто визуализируются митохондрии с признаками деструкции (нарушение целостности оболочки, обрывки мембран или МЛТ в матриксе). Отмечается выраженное снижение количества цитоскелета в отростках нервных клеток. Некоторые отростки заполнены синаптическими пузырьками со светлым или плотным содержимым, снижается количество синапсов.

Ядра нервных клеток после воздействия диоксина в дозе 1/800 ЛД50 округлой формы. Кариоплазма электронно-прозрачная, глыбки гетеро-хроматина прилегают к внутренней мембране ядра или равномерно распределены по всей нуклеоплазме, встречаются интерхроматиновые гранулы. В цитоплазме преобладающее большинство митохондрий с плотным матриксом и четкими кристами. В ней также присутствует большое количество пероксисом с электронно-плотным содержимым. В отростках

наблюдается хорошо развитый цитоскелет, многие отростки заполнены синаптическими пузырьками, регистрируются синаптические контакты.

Упаковка хроматина в ядрах нейронов после воздействия Т-2 токсина изменяется от клеток контрольной группы животных в сторону увеличения фибриллярного хроматина и появления интерхроматиновых гранул в большом количестве. В цитоплазме преобладающее большинство митохондрий с плотным матриксом и четкими кристами, пластинчатой или трубчатой формы. Наличествуют миелинизированные нервные отростки. Кроме этого присутствует большое количество пероксисом с электронно-плотным содержимым, аппарат Гольджи, ЭПР. В отростках наблюдается хорошо развитый цитоскелет, много синаптических пузырьков и синапсов.

Ядра нейронов свиней после сочетанного воздействия диоксина и Т-2 токсина в дозах 1/400 ЛД50 и 2 ПДК имеют округлую форму и характеризуются преимущественно фибриллярным хроматином и просветленной нуклеоплазмой. Слабо конденсированный хроматин занимает пристеночное положение. Отмечается локальное увеличение перинуклеарного пространства. Цитоплазма хлопьевидная, сильно просветленная, каналы ЭПР набухшие, встречаются пероксисомы как в теле нейрона, так и в их отростках. Также в цитоплазме тела нейрона отмечается наличие телолизосом. Среди митохондрий значительно преобладают органеллы с признаками деструкции. Цитоскелет в нейроплазме встречается не везде, мало контактов между нейритами.

В группе животных, получавших сочетано диоксин, Т-2 токсин в дозах 1/400 ЛД50 и 2 ПДК с применением цеолита и димефосфона, нейроны имеют признаки сохранности структур по сравнению с остальными опытными группами. Цитоплазма соматической зоны нейрона средней электронной плотности, встречаются полисомы и пероксисомы. Хорошо визуализируется гранулярный эндоплазматический ретикулум. Однако фиксируются набухшие и разрушенные митохондрии. Нервные отростки заполнены цитоскелетом и секреторными везикулами. Наблюдаются синаптические контакты между нейритами.

Ультратонкие исследования кардиомиоцитов свиней. В ядрах кардиомиоцитов поросят после воздействия диоксина в дозе 1/400 ЛД50 конденсированный хроматин и занимает пристеночное положение, центральная часть кариоплазмы становится просветленной. Регистрируется рыхлое расположение миофибрилл в цитоплазме. Отмечается полиморфизм митохондрий. От просветленных без крист, до гигантских. Причем в гигантских митохондриях имеются участки как с электронно-прозрачным, так и с плотным матриксом. Встречаются митохондрии, с хорошо просматриваемыми пластинчатыми кристами на фоне просветленного матрикса, изредка можно обнаружить депозиты кальция.

Кардиомиоциты свиней после воздействия диоксина в дозе 1/600 ЛД50 имеют ядра овально-удлинённой формы, с неправильным извилистым контуром. Хроматин средней электронной плотности занимает центральную часть кариоплазмы, конденсированный хроматин располагается по периферии. Митохондрии очень 1 активны, имеют пластинчатые кристы и матрикс средней плотности, встречаются депозиты кальция. Много межмитохондриальных контактов (ММК).

Форма ядер и упаковка хроматина кардиомиоцитов после воздействия диоксина в дозе 1/800 ЛД50 соответствуют норме. Митохондрии очень активны, много крист, матрикс средней плотности, много ММК.

В кардиомиоцитах после воздействия Т-2 токсина в дозе 2 ПДК изменяется соотношение между конденсированным и неконденсированным хроматином. В различных ядрах по-разному. Появляется гранулированный хроматин. Локально увеличивается перинуклеарное пространство, цитоплазма вокруг ядер просветляется. Митохондрии очень активны, имеют пластинчатые и трубчатые кристы и матрикс средней плотности (чаще хлопьевидный), депозиты кальция не встречаются. Много ММК. Иногда можно видеть гигантские митохондрии.

В ядрах кардиомиоцитов после сочетанного воздействия диоксина и Т-2 токсина в дозах 1/400 ЛД50 и 2 ПДК увеличивается доля неконденсированного хроматина. Отмечается гранулярный хроматин, просветление цитоплазмы, образование электронно-прозрачной полости вокруг ядра (цитоплазма без рибосом). Митохондрии в большинстве с хорошо развитыми кристами и просветленном матриксом. Изредка встречаются гигантские митохондрии. Мышечные волокна рыхло расположены, между ними видны участки просветленной цитоплазмы.

Кардиомиоциты поросят после сочетанного воздействия диоксина, Т-2 токсина в дозах 1/400 ЛД50 и 2 ПДК с применением цеолита и димефосфона имеют ядра неправильной формы, сильно изрезанные границы и глубокие инвагинации. Конденсированный хроматин располагается хаотично по всему ядру. Просветленная цитоплазма локализуется в отдельные полости или исчезает полностью, происходит уплотнение упаковки мышечных волокон. Митохондрии с хорошо развитыми пластинчатыми кристами и матриксом средней плотности, встречаются депозиты кальция. Отмечаются ММК. При этом встречаются электронно-прозрачные вакуоли, которые образуются при разрушении митохондрий.

* ..ч®

/ мх

гХР

Ч А ул( -я я

мх в

мх

МФ

МИШИ

ШШШ -ттт

1 уш

Рис. 23. Кардиомиоцит свиньи опытной Рис. 24. Кардиомиоцит свиньи опытной группы после воздействия диоксина в дозе группы Т-2 токсин в дозе 2 ПДК. 1/800 ЛД50.

Условные обозначения: Я - ядро, МХ - митохондрии, МФ - миофибриллы, В - вакуоли, гХР - гранулированный хроматин.

2.4 РЕЗУЛЬТАТЫ УЛЬТРАСТРУКТУРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ХРОНИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ТОКСИКАНТОВ НА ОРГАНЫ ОВЕЦ

Длительность эксперимента составляла 60 дней. В течение этого срока животных опытных групп подвергали действию токсикантов. Дозы и сочетания токсических веществ, представлены в таблице 3.

Таблица 3. Схема опытов проведенных на овцах.

Группы животных Наименование препаратов Дозы

1(контроль) Растительное масло —

2 Диоксин (2,3,7,8-ТХДД) 1/200 ЛД5о 1,0 мкг/кг м.т.

3 Диоксин (2,3,7,8-ТХДД) 1/400 ЛД50 0,5 мкг/кг м.т.

4 Диоксин (2,3,7,8-ТХДД) 1/800 ЛД50 0,25 мкг/кг м.т.

5 Диоксин (2,3,7,8-ТХДЦ) 1/1000 ЛД50 0,2 мкг/кг м.т.

6 сочетание Диоксин (2,3,7,8-ТХДД), Т-2 токсин 1/1000 ЛД50 0,2 мкг/кг м.т. 2 ПДК (200 мкг на 1 кг массы корма в сутки или 0,2 мг/кг)

2.4.1 Электронно-микроскопические исследования воздействия ксенобиотиков на клетки органов овец

Ультратонкие исследования гепатоцитов. В гепатоцитах овец после затравки диоксином в дозе 1/200 ЛД50 встречаются ядра неправильной формы, в некоторых маргинальное расположение хроматина. Отмечается увеличение перинуклеарного пространства, глубокие инвагинации наружной ядерной оболочки в сторону цитоплазмы. Внутри некоторых ядер обнаруживаются крупные мембранно-ограниченные вакуоли с везикулярным содержимым. Имеются ядра в состоянии пикноза. Цитоплазма гепатоцитов сильно вакуолизирована. Митохондрии с небольшим количеством пластинчатых крист в просветленном матриксе. Некоторые имеют признаки глубокой деструкции. Такие митохондрии включают электронно-прозрачное содержимое, в центре которого находятся мультиламеллярные или мультивезикулярные образования. Отмечаются набухшие каналы шероховатого и гладкого ЭПР, что, возможно, связано с процессами активного синтеза энзимов, участвующих в процессах детоксикации. Изменения в гепатоцитах говорят о деструктивных процессах при токсическом воздействии диоксина на печень овец, свидетельствующих о нарушениях функциональной активности.

В гепатоцитах овец после воздействия диоксина в дозе 1/400 ЛД5о отмечается неравномерно конденсированный хроматин на фоне просветленной кариоплазмы в ядрах, частично просветленная и вакуолизированная цитоплазма, набухшие каналы шероховатого и гладкого ЭПР. Митохондрии вариабельны, встречаются извитые, «гигантские» формы с плотным матриксом и кристами различных размеров, что говорит об их высокой активности. При этом могут встречаться митохондрии, с небольшим количеством пластинчатых или вакуолизированных крист. В

электронно-светлом матриксе, отдельные из них имеют признаки глубокой деструкции.

У экспериментальных животных 3 группы (диоксин в дозе 1/800 ЛД50) в клетках паренхимы печени ядра правильной формы, мало чем отличаются от контрольной группы. Конденсированный хроматин не отмечается, между мембранами ядерной оболочки ровной линией просматривается перинуклеарное пространство. Гиалоплазма средней электронной плотности. Цитоплазма вакуолизирована в отличие от гепатоцитов контрольной группы. Встречаются лизосомы с плотным содержимым. Митохондрии с электронно-прозрачным матриксом встречаются редко. Имеют место «гигантские» митохондрии.

В гепатоцитах после затравки диоксином в дозе 1/1000 ЛД50 ядра имеют округлую форму. Конденсированный хроматин располагается около ядерной мембраны небольшими скоплениями. Ядрышко хорошо просматривается. У некоторых ядер встречаются небольшие участки инвагинации кариолеммы. В цитоплазме отмечается хорошо развитый гладкий эндоплазматический ретикулум. Цитоплазма заполнена небольшим количеством розеток гликогена. Сильно развита гранулярная эндоплазматическая сеть. В большинстве митохондрий гепатоцитов кристы либо отсутствуют, либо имеются в очень небольшом количестве. Митохондрии в основном округлой формы. Имеют хлопьевидный матрикс средней электронной плотности. В цитоплазме гепатоцитов выражено очень большое количество скоплений остаточных мембран и мультиламеллярных тел. Встречаются мелкие вакуоли с электронно-прозрачным содержимым.

Гепатоциты овец после сочетанного воздействия диоксина и Т-2 токсина в дозах 1/1000 ЛД50 и 2 ПДК имеют ядра округлой формы, гетерохроматин формируется по периферии, эухроматин в центре. В цитоплазме отмечается гладкий эндоплазматический ретикулум и небольшое количество розеток гликогена. Сильно развита гранулярная эндоплазматическая сеть. Вместе с тем, состояние большинства митохондрий можно характеризовать, как неблагополучное. Несмотря на наличие двойной мембраны, многие из них имеют просветленный матрикс и практически полное отсутствие крист. Кроме того, в цитоплазме наблюдается скопления остаточных мембран и мультиламеллярных тел. Также встречаются мелкие вакуоли с электронно-прозрачным содержимым.

Ультратопкие исследования клеток коркового вещества почек. Клетки проксимальных канальцев коркового вещества почек овец после воздействия диоксина в дозе 1/200 ЛД50 имеют ядра округлой формы. Перинуклеарное пространство неравномерное. Конденсированный хроматин располагается по периферии ядерной оболочки. Встречаются деструктивные митохондрии. Некоторые из них лишены крист, их матрикс электронно-прозрачный. Складки базальной плазмалеммы не протяженные. Митохондрии подоцитов имеют электронно-плотный матрикс. Кристы плохо различимы, нечеткие. В подоцитах визуализируется просветление цитоплазмы и потеря малых вторичных цитоподий, соответственно, уменьшение количества фильтрационных пор.

Ядра эпителиоцитов проксимальных канальцев почек овец после воздействия диоксина в дозе 1/400 ЛД50 имеют неправильную форму. Конденсированный

хроматин располагается по периферии ядерной оболочки. Перинуклеарное пространство местами увеличено. Митохондрии также увеличены в размерах и округлой формы. Кристы четко выражены. Небольшая часть митохондрий без крист. Матрикс средней электронной плотности. Встречаются митохондрии с сильно просветленным матриксом. Складки базальной плазмалеммы эпителиоцитов имеют небольшую протяженность. Цитоплазма изобилует мелкими вакуолями с электронно-светлым содержимым. Встречаются крупные вакуоли с хлопьевидными включениями. В подоцитах наблюдается частичное просветление цитоплазмы и незначительная потеря малых вторичных цитоподий.

Ядра эпителиоцитов образующих проксимальные канальцы почек опытных животных (диоксин в дозах 1/800 ЛД50 и 1/1000 ЛД50) округлой формы. Хроматин равномерно распределен в ядре. Имеются ядрышки. Митохондрии средней электронной плотности. Хорошо просматриваются кристы. В клетках наблюдаются крупные вакуоли с хлопьевидным содержимым.

В подоцитах изменение формы малых цитоподий с большим содержанием микрофиламентов.

Клетки проксимальных канальцев почек овец после сочетанного воздействия диоксина и Т-2 токсина в дозах 1/1000 ЛД50 и 2 ПДК имеют цитоплазму средней электронной плотности с включениями гладкого эндоплазматического ретикулума. Изредка встречаются митохондрии с признаками деструкции. Складки лабиринта плазматической мембраны эпителиоцитов очень многочисленны.

Ультратонкие исследования клеток белой пульпы селезенки

Ядра лимфоцитов овец после воздействия диоксина в дозе 1/200 ЛД50 овальные неправильной формы, кариоплазма просветленная, увеличенное перинуклеарное пространство. У большинства типов клеток наблюдаются значительных размеров выпячивания перинуклеарного пространства.

В ядрах лимфоцитов отмечаются присутствие множественных мультиламеллярных образований. Состояние митохондрий лимфоцитов неудовлетворительное. Зачастую происходит перерождение данных органелл, сопровождающееся, просветлением матрикса, исчезновением крист, деструкцией мембран и в конечном итоге появлением вакуолей.

Клетки лимфоидных узелков селезенки овец после воздействия диоксина в дозе 1/400 ЛД50 имеют некоторые паталогические признаки: выпячивания перинуклеарного пространства, митохондрии с отсутствием крист в центральной части матрикса. Присутствует вакуолизация цитоплазмы.

Овально-неправильной формы ядра лимфоцитов характерны для овец после воздействия диоксина в дозе 1/800 ЛД50. Отмечается закономерное взаиморасположение гетерохроматина и эухроматина: первый локализуется по периферии, второй ближе к центру ядра. У лимфоцитов не визуализируется увеличения перинуклеарного пространства. Встречаются вариабельные митохондрии в равной степени как полноценные, так и с признаками деструкции. Лимфоциты лимфоидных узелков селезенки овец после воздействия диоксина в дозе 1/1000 ЛД50 имеют ультраструктурные характеристики подобные предыдущей группе.

Клетки белой пульпы селезенки овец после сочетанного воздействия диоксина и Т-2 токсина в дозах 1/1000 ЛД50 и 2 ПДК содержат лимфоциты с ядрами овально-неправильной формы. Эухроматин располагается в центре, гетерохроматин преимущественно по периферии ядра. Перинуклеарное пространство лимфоцитов не везде равномерное, но особых увеличений не наблюдается. Митохондрии вариабельны. Интересной особенностью является наличие в цитоплазме существенного количества пероксисом.

Ультратонкие исследования клеток коры головного мозга овец. В группе подопытных животных (после воздействия диоксина в дозе 1/200 ЛД50) отмечается демиелинизация аксонов. При подсчете количества миелиновых отростков на единицу площади среза в опытной группе оказалось в 3,5 раза меньше, чем в контроле. При этом в испытуемой группе встречаются синаптические контакты, митохондрии с кристами и плотным матриксом, на некоторых микрофотографиях видны органеллы с набухшими кристами и просветленным матриксом.

Клетки коры головного мозга овец после воздействия диоксина в дозе 1/400 ЛД50 имеют ядра округлой или слаболопастной формы. Кариоплазма электронно-прозрачная. Гетерохроматин располагается по периферии ядерной оболочки или равномерно распределен по всей нуклеоплазме. Отростки нервных клеток образуют плотную сеть. Некоторые аксоны имеют миелиновые оболочки. Митохондрии нейронов с матриксом средней электронной плотности и четко выраженными кристами. В некоторых митохондриях наличествуют разрывы мембран.

Ядра нейронов мозга овец после воздействия диоксина в дозах 1/800 ЛД50 и 1/1000 ЛД50 округлой формы. Часто встречаются синаптические контакты. Синаптические мембраны четко выраженные. Присутствуют синаптические пузырьки с электронно-светлым содержимым. Также в зоне синаптического контакта можно встретить одиночные синаптические везикулы с электронно-плотным наполнением. Митохондрии нейронов с пластинчатыми кристами. Матрикс средней электронной плотности.

В клетках коры головного мозга овец после сочетанного воздействия диоксина и Т-2 токсина в дозах 1/1000 ЛД50 и 2 ПДК наблюдаются ядра округлой формы. Гетерохроматин расположен вблизи кариолеммы. Митохондрии с матриксом средней электронной плотности. Некоторые их них имеют признаки деструкции. Встречаются большие инвагинации митохондриальных мембран. Синаптические мембраны местами с размытыми границами. Миелиновые оболочки также немногочисленны с признаками отслоения мембран.

3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Токсикологические исследования показали, что хроническое сочетанное введение кроликам в течение 40 суток диоксина и ацетата свинца в дозах 1/200 ЛД50 и 1/10 ЛД50 проявляется более выраженными гематологическими, биохимическими и иммунодепрессивными изменениями: по сравнению с исходными значениями концентрация эритроцитов, лейкоцитов, общего белка, альбуминов, фагоцитарной активности, Т- и В-лимфоцитов понижается при р<0,05, соответственно на 25,1, 21,6, 21,0, 23,0, 22,0, 28,2 и 22,6%. Уровни значений а-глобулинов, р-глобулинов, у-глобулинов, АЛТ, ACT и МДА повышаются при р<0,05, соответственно на 23,8, 100,4, 23,6, 226,8, 254,2 и 158,2%.

Ультраструктурный анализ подтверждает результаты токсикологических исследований: в гепатоцитах (перинуклеарное пространство местами достигает ширины 390 нм), подоцитах и лимфоцитах отмечается нарушение ядерного аппарата и белок-синтезирующего комплекса.

2. Электронно-микроскопические исследования и морфометрический анализ, демонстрируют, что токсический эффект диоксина в дозе 1/200 ЛД5о выражается политропным действием, в большей мере проявляющимся в гепатоцитах и клетках терминальных узелков белой пульпы селезенки: нарушение структуры митохондрий, изменения ядерного аппарата и набухание каналов эндоплазматического ретикулума. В данной группе влияние диоксина на гепатоциты кроликов, приводит к набуханию митохондрий при р<0,05 на 105,0% в сравнении с интактными животными.

3. Ультраструктурные исследования и морфометрический анализ, свидетельствуют, что воздействие ацетата свинца на организм кроликов в дозе 1/10 ЛД50 характеризуется органотропностью, в большей степени направлено на нервную ткань коры головного мозга и клетки коркового вещества почек — нарушение структуры цитоскелета, коммуникационных связей между нейронами (статистически достоверно снижается на 61,1% в сравнении с контролем) и нарушение базального лабиринта эпителиоцитов проксимальных канальцев (при р<0,05 меньше контрольной группы на 65,6%).

4. Уменьшение количества синапсов под действием экотоксикантов на организм кроликов приводит к увеличению средней длины синаптических щелей оставшихся синаптических контактов, что свидетельствует об адаптационно-компенсаторном механизме пластичности нейронов.

5. Применение цеолита из расчета 2% от сухого вещества рациона в сутки и димефосфона в дозе 90 мг/кг массы тела при сочетанной интоксикации кроликов диоксином и ацетатом свинца корригирует нарушения морфологического строения и функциональных связей организма, нормализует гематологические, биохимические, иммунологические показатели, предупреждает деструктивные изменения мембранных структур клеток, восстанавливает синаптические контакты коры головного мозга и препятствует разрушению митохондрий лимфоцитов селезенки. Все это согласуется со значениями уровня МДА, результатами анализа крови достоверно не отличающимися от фоновых величин и морфометрическими подсчетами.

6. Токсикологические исследования показали, что хроническое сочетанное отравление поросят диоксином и Т-2 токсином в дозах 1/400 ЛД5о и 2 ПДК к 45-м суткам характеризуется максимальным взаимоусилением токсического эффекта: снижение концентрация эритроцитов, лейкоцитов, общего белка, фагоцитарной активности, Т - и В - лимфоцитов при р<0,05, соответственно на 22,8, 29,9, 28,2, 37,3, 30,6, и 44,2%. Уровень 0- глобулинов, у-глобулинов, АЛТ, ACT, ЩФ, общего билирубина, холестерина, и МДА повышается при р<0,05, соответственно на 53,6, 41,6, 198,9,270,0,140,0, 215,1, 68,8 и 195,9%.

Анализ гематологических, биохимических и иммунологических тестов согласуется с электронно-микроскопическими исследованиями, показывающими следующие патологические изменения: увеличение перинуклеарного пространства, резкое уменьшение грЭПР, вакуолизация цитоплазмы. В гепатоцитах количество митохондрий уменьшаются статистически достоверно на 73,4% по сравнению с интактными животными

7. Электронно-микроскопические исследования и морфометрический анализ, проведенные на поросятах, свидетельствуют, что токсический эффект диоксина в дозе 1/400 ЛД50 проявляется в митохондриях клеток. Разрушение крист, с просветление матрикса в центральной части, хлопьевидный матрикс. В гепатоцитах количество митохондрий уменьшается при р<0,05 на 60,2% по сравнению с интактными животными.

Влияние диоксина в дозе 1/800 ЛД50, проявляется признаками активации процессов детоксикации: наличие интерхроматиновых гранул в ядрах преобладающего большинства клеток; увеличение окислительно-восстановительных реакций в пероксисомах гепатоцитов, в клетках нервной ткани и проксимальных канальцев; высокий уровень энергизации гепатоцитов, эпителиоцитов проксимальных канальцев, кардиомиоцитов; гиперплазия грЭПР в клетках печени. В условиях нарастания функционально-физиологических нагрузок эти процессы можно отнести к адаптационно-компенсаторным.

8. Т-2 токсин в дозе 2 ПДК вызывает изменения в упаковке хроматина, что указывает на признаки усиления экспрессии генов. Морфологически это выражается (перераспределением) увеличением неконденсированного хроматина и уменьшением гетерохроматина. В ряде ядер гетерохроматин вообще отсутствует. При этом изменения перинуклеарного пространства фактически не наблюдаются.

9. Показано, что комплексное введение цеолита и димефосфона при сочетанном отравлении поросят диоксином и Т-2 токсином предупреждает деструктивные изменения мембранных структур клеток и проявляется выраженным защитно-восстановительным эффектом, что согласуется со значениями уровней гематологических, биохимическими и иммунологических показателей существенно не отличающимися от фоновых величин.

10. Результаты факторного анализа свидетельствуют, что хроническая интоксикация свиней диоксином вызывает дозозависимое объединение гомеостатических функциональных систем, сопровождающееся постепенным усилением силы корреляционных связей с наибольшим проявлением при дозе 1/400

лд50.

Моноинтоксикация поросят Т-2 токсином в дозе 2 ПДК, протекает менее тяжело, чем диоксином в дозах 1/400 и 1/600 ЛД50.

Сочетанное отравление (диоксин 1/400 ЛД50 и Т-2 токсин 2 ПДК) вызывает наиболее значительный распад функциональных связей, за счет потери роли ряда показателей, которые их формируют: количество пероксисом, общий белок, альфа глобулины, глюкоза, коэффициент Де Ритиса, амилаза, ЩФ, ЛАСК, фагоцитарное число, фагоцитарная емкость, лимфоциты.

Примененное лечение, судя по влиянию на структуру факторов, эффективно. Цеолит с димефосфоном уменьшают нагрузку на митохондрии клеток.

11. Электронно-микроскопические исследования клеток печени, почек, селезенки, коры головного мозга и сердца овец показали, что самые существенные структурные перестройки происходят при влиянии диоксина в дозе 1/200 ЛД50, а также сочетанном отравлении диоксином и Т-2 токсином (1/1000 ЛД50 и 2 ПДК). Диоксин в дозах 1/800 ЛД50 и 1/1000 ЛД50 вызывает изменения, которые можно отнести к адаптационным приспособлениям организма при детоксикации.

4 Рекомендации производству

1. В качестве средств, профилактики и превентивного лечения хронических сочетанных отравлений животных диоксином с ацетатом свинца и диоксином с Т-токсином, рекомендуется совместное применение цеолита в дозе 2% от сухого вещества рациона и димефосфона в дозе 90 мг/кг массы тела.

2. Результаты исследований использованы при разработке научно-методических документов:

«Методические рекомендации по электронно-микроскопическим исследованиям биологических объектов» (Москва, 2011);

Методическое пособие «Подготовка образцов для трансмиссионной электронной микроскопии, применяемой при токсикологических исследованиях: компьютеризация расчетов» (Москва, 2012);

Методическое пособие «Токсикозы животных, вызванные диоксинами: этиология, профилактика и лечение» (Москва, 2013).

3. Основные положения диссертационной работы рекомендуется использовать на курсах повышения квалификации и в учебном процессе ВУЗов биологического и зооветеринарного профиля.

5. Список использованной литературы

1. Беккельман, И. Нейротоксические эффекты многолетней экспозиции свинцом / И. Беккельман, Э. Пфистер // Медицина труда и пром. экология. - 2001. -№ 5. - С. 22-25.

2. Галкин, A.B. Диоксины в кормах. Риски для человека / A.B. Галкин, П. Бениш // Комбикорма. - 2011. - №2. - С. 64-67.

3. Гончаренко, М.С. Метод оценки перекисного окисления липидов / М.С. Гончаренко, A.M. Латинова // Лабораторное дело. - 1985. - № 1. - С. 60-61.

4. Дорофейчук, В.Г. Определение активности лизоцима нефелометрическим методом // Лабораторное дело. - 1968. - №1. С. 28-30.

5. Иванов, A.B. Влияние диоксина в малых дозах на организм овец / A.B. Иванов, К.Х. Папуниди, М.Я. Тремасов, И.Р. Кадиков, В.Р. Сайтов // «Прикладная токсикология» М.: 2011. - №3. - С. 49-53.

6. Карпюк, С.А. Определение белковых фракций сыворотки крови экспресс-методом / С.А. Карпюк // Лабораторное дело. -1962.-№7. - С. 33-36.

7. Кондрахин, И.П., Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник / И.П. Кондрахин, A.B. Архипов, В.И. Левченко, Г.А. Таланов, и др. - М.: Колос, 2004. - 520 с.

8. Кост, С.А. Определение фагоцитарной активности лейкоцитов / С.А. Кост, М.И. Стенко // Клиническая гематология животных. - М.: Колос, 1974. - С. 99-100. Крюков, В.И. Микотоксины в молочном скотоводстве / В.И. Крюков // Комбикорма. -2011,-№6.-С. 75-77.

9. Крюков, В.И. Микотоксины в молочном скотоводстве / В.И. Крюков // Комбикорма. - 2011. - №6. - С. 75-77.

10. Кузнецов, А.Ф. Ветеринарная микология / А.Ф. Кузнецов - СПб.: Лань, 2001.-416 с.

11. Начкина, Э.И. Системные цитотоксические поражения при эндотоксикозе и их коррекция препаратами метаболического типа действия: автореф. дис. ... д-ра биолог, наук: 14.03.03. / Начкина Элла Ивановна. - Саранск, 2011. - 42 с.

12. Нефедова С.А. Эколого-физиологические механизмы адаптации животных к антропогенным воздействиям (на примере Рязанской области) Автореферат дисс. ... д-ра биолог, наук: 03.02.08., 03.03.01. / Нефедова Светлана Александровна. - М., 2012.-46 с.

13. Новиков, В.А. Рекомендации по диагностике, лечению и профилактике отравлений животных солями тяжелых металлов и другими токсичными элементами / В.А. Новиков, В.А. Конюхова, М.Я. Тремасов, К.Х. Папуниди и др. - М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2006. - 36 с.

14. Папуниди, К.Х. Техногенное загрязнение окружающей среды как фактор заболеваемости животных / К.Х. Папуниди, И.А. Шкуратова // Ветеринарный врач. -2000. -№2.-С. 56-60.

15. Папуниди, К.Х. Влияние цеолита и натрия сульфида на токсикокинетику кадмия при сочетанном отравлении белых крыс диоксином и кадмия хлоридом / К.Х. Папуниди, В.А. Конюхова, И.Ф. Вафин, И.Р. Кадиков // Матер, второго съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов: Современные проблемы ветеринарной фармакологии и токсикологии. - Казань: «Стилус», 2009. - С. 309-311.

16. Томмэ, М.Ф. Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных / М.Ф. Томмэ, A.B. Модянов, А.П. Бечучев, А.И. Девяткин и др. - М.: Колос, 1969.-360 с.

17. Тремасов, М.Я. Мероприятия по предотвращению воздействия диоксинов на животных. Сб. науч. трудов. Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии / М.Я. Тремасов, В.А. Новиков // М., 2004. - Т.116. - С. 219 - 223.

18. Уикли, Б. Электронная микроскопия для начинающих // М.: Мир, 1975. -

336 с.

19. Улахович, Н.А. Экотоксиканты: Учебно-методическое пособие для лекционного курса «Химия в экологии» / Н.А. Улахович, М.П. Кутырева, Э.П. Медянцева, С.С. Бабкина. - Казань: КГУ, 2010. - 56 с.

20. Федоров, JI.A. Диоксины как экологическая опасность: ретроспектива и перспективы / Л. А. Федоров. - М.: Наука, 1993. - 266 с.

21. Фримель, Г. Иммунологические методы // - М.: Медицина, 1987. - 472 с.

22. Шамрай, С.М. Микотоксины постоянная угроза со стороны «экологически чистых» природных ядов [Электронный ресурс] / С.М. Шамрай // Биология. Все для учителя.-2010.-С. 7-14. http://www.e-osnova.ru/PDF/osnova_l_0_3.pdf

23. Alcock, R.E. A congener specific PCDD/F emissions inventory for the UK: do current estimates account for the measured atmospheric burden/ R.E. Alcock, A.J. Sweetman, K.C Jones // Chemosphere 2001. - N. 43. - P. 183-194.

24. Gillis, B.S. Analysis ofleadtoxicity in human cells / B.S. Gillis, Z. Arbieva, I.M. Gavin // BMC Genomics. - 2012. - V. 27. - N. 13. - P. 344.

25. Kovacs, M. Effect of chronicT-2 toxinexposure in rabbit bucks, determination of the No Observed Adverse Effect Level (NOAEL) / M. Kovacs, G. Tornyos, Z. Matics, M. Mezes, K. Balogh, V. Rajli, Z. Bloch-Bodnar, M. Rusvai, M. Mandoki, S. Cseh // AnimReprod Sci. - 2013. - V. 137. - P. 245-252.

26. Li, H.W. Protective effects of mangiferin in subchronic developmental lead-exposed rats / H.W. Li, J.G. Deng, Z.C. Du, M.S. Yan, Z.X. Long, T.P. Pham, K.D. Yang // Biol Trace Elem Res - 2013. - V. 152. - N. 2. - P. 233-242.

27. Zhang, L.M. Lipid Peroxidation and Ultrastructural Modifications in Brain after Perinatal Exposure to Lead and/or Cadmium in Rat Pups / L.M. Zhang, X.Z. Lio, H. Lu, L. Mei, Z.P. Liu // Biomedical and environmental scirnces/ - 2009. - V. 22. - P. 423-429.

6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ

1. Иванов, А.В. Влияние диоксина в малых дозах на организм овец / А.В. Иванов, К.Х. Папуниди, М.Я. Тремасов, И.Р. Кадиков, В.Р. Сайтов // «Прикладная токсикология» М.: - 2011. - №3. - С. 49-53.

2. Сайтов, В.Р. Влияние диоксина на ультраструктуру клеток различных органов овец в малых дозах / В.Р. Сайтов, К.А. Осянин, М.М. Сальникова, И.Ф. Рахматуллин, И.Р. Кадиков, И.И. Идиятов // Вестник Новосибирского государственного аграрного университета. - 2011. - № 4 (20). - С. 87-94.

3. Кадиков, И.Р. Оценка показателей естественной резистентности и ультраструктуры тканей организма кроликов при сочетанном отравлении диоксином и свинцом / И.Р. Кадиков, К.Х. Папуниди, В.Р. Сайтов, К.А. Осянин, М.Я. Тремасов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2012. - Т. 210. - С. 95-100.

4. Кадиков, И.Р. Воздействие диоксина на иммунобиологическую реактивность и морфологию клеток организма овец / И.Р. Кадиков, К.Х. Папуниди, К.А. Осянин, В.Р. Сайтов и др. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2012. - Т. 210. - С. 101-106.

5. Иванов, A.B. Эффективность лекарственных средств при сочетанном отравлении животных диоксином и свинцом / A.B. Иванов, К.Х. Папуниди, М.Я. Тремасов, И.Р. Кадиков, М.М. Сальникова, В.Р. Сайтов, К.А. Осянин, И.Ф. Вафин // Достижения науки и техники АПК. - 2012. - №3. - С. 58-62.

6. Сайтов В.Р. Изучение ультраструктуры белой пульпы селезенки кроликов при воздействии экотоксикантов и некоторых лекарственных препаратов / В.Р. Сайтов, К.Х. Папуниди, М.М. Сальникова, К.А. Осянин, И.Р. Кадиков, И.Ф. Рахматуллин // Ветеринарный врач. - 2012. - № 3. - С. 48-50.

7. Идиятов, И.И. Оценка биохимических показателей сыворотки крови на фоне воздействия диоксина как индикатор биологического действия на организм / И.И. Идиятов, A.A. Иванов, И.Р. Кадиков, В.Р. Сайтов // Ветеринарный врач. -2013.-№ 1,-С. 51-54.

8. Сайтов, В.Р. Изучение ультраструктуры белой пульпы селезенки свиней при воздействии диоксина, Т-2 токсина и применении лекарственных препаратов /

B.Р. Сайтов, М.М. Сальникова, И.Р. Кадиков // Ветеринарный врач. - 2013. - № 5. -

C. 2-7.

9. Сайтов, В.Р. Изучение ультраструктуры гепатоцитов свиней при воздействии диоксина, Т-2 токсина и применения лекарственных препаратов / В.Р. Сайтов, A.B. Иванов, М.М. Сальникова // Ветеринарный врач. - 2013. - № 6. - С. 2-5.

10. Сайтов, В.Р. Изучение ультраструктуры кардиомиоцитов свиней при воздействии диоксина, Т-2 токсина и применения лекарственных препаратов / В.Р. Сайтов // Ветеринарный врач. - 2013. - № 6. - С. 12-15.

11. Осянин, К.А. Морфометрический анализ митохондрий белой пульпы селезенки свиней и кроликов при отравлении токсикантами и на фоне применения лекарственных средств / К.А. Осянин, В.Р. Сайтов, М.М. Сальникова, К.Х. Папуниди // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2014. - Т. 217. - С. 200-205.

12. Сайтов В.Р. Изучение ультраструктуры коры больших полушарий кроликов, при сочетанном воздействии экотоксикантов и применении лекарственных средств / В.Р. Сайтов, М.М. Сальникова, JI.B. Малютина // Ветеринарный врач. - 2014. - № 1. - С. 14-20.

13. Кадиков, И.Р. Сочетанное действие диоксинов, микотоксинов и токсичных элементов на животных средств / И.Р. Кадиков, В.Р. Сайтов, К.Х. Папуниди, М.Я. Тремасов, И.И. Идиятов // Ветеринария. — 2014. - № 9. - С. 47-51.

Методические рекомендации и пособия

1. Иванов, A.B. Методические рекомендации по электронно-микроскопическим исследованиям биологических объектов / A.B. Иванов, A.A. Иванов, А.Н. Чернов, М.М. Сальникова, В.Р. Сайтов, И.Ф. Рахматуллин, E.JI. Матвеева. - ФГБНУ «Росинформагротех», 2011. - 67 с.

2. Иванов, A.B. Подготовка образцов для трансмиссионной электронной микроскопии, применяемой при токсикологических исследованиях: компьютеризация расчетов / A.B. Иванов, К.Х. Папуниди, A.A. Иванов, В.Р. Саитов и др. // ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 2012. - 29 с.

3. Иванов, A.B. Токсикозы животных, вызванные диоксинами: этиология, профилактика и лечение / A.B. Иванов, К.Х. Папуниди, М.Я. Тремасов, A.A. Иванов, И.Р. Кадиков, В.И. Степанов, И.Ф. Вафин, И.И. Идиятов, В.Р. Сайтов и др. - ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 2013. - 33с.

Публикации в других изданиях

1. Матвеева, E.JI. Ультраструктура клеток головного мозга при диоксиновой интоксикации / E.JI. Матвеева, В.Р. Сайтов // Матер, междунар. научно-практич. конф., посвящ. 50-летию Федерального Центра токсиколо-гической, радиационной и биологической безопасности «Биотехнология: токсикологическая радиационная и биологическая безопасность», Казань, 2010. - С. 327-329.

2. Сайтов, В.Р. Ультраструктура кардиомиоцитов кроликов: ксенобиотики и лечение / В.Р. Сайтов, К.А. Осянин, М.М. Сальникова // Матер, междунар. научно-практ. конф. профессорско-преподавательского состава: «Научное обеспечение агропромышленного производства», Курск, 2014. - С. 316-320.

3. Сайтов, В.Р. Клетки коркового слоя почек свиней после сочетанного воздействия диоксина и Т-2 токсина / В.Р. Сайтов, М.М. Сальникова, К.А. Асылбаева // Матер. II Всероссийской научно-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР и Башкирской АССР, докт. ветер, наук, профессора Х.М. Аюпова «Современные достижения ветеринарной медицины и биологии - в сельскохозяйственное производство», Уфа, 2014. - С. 258-261.

4. Сайтов, В.Р. Клетки коркового слоя почек свиней после сочетанного воздействия диоксина и Т-2 токсина и применения лекарственных средств / В.Р. Сайтов, М.М. Сальникова, К.А. Осянин // Матер. II Всероссийской научно-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР и Башкирской АССР, докт. ветер, наук, профессора Х.М. Аюпова «Современные достижения ветеринарной медицины и биологии - в сельскохозяйственное производство», Уфа, 2014. - С. 261-264.

5. Сайтов, В.Р. Влияние сочетанного действия диоксина и ацетата свинца на ультраструктуру гепатоцитов кроликов и применение средств лечения и профилактики / В.Р. Сайтов, К.А. Осянин, И.Р. Кадиков // Матер. IV Междунар. ветеринарного конгресса «Единый мир - Единое здоровье», Казань, 2014. - С. 329331.

6. Осянин, К.А. Ультратонкие исследования селезенки и сердца овец при хроническом воздействии ксенобиотиков / К.А Осянин, М.М. Сальникова, В.Р. Сайтов, И.Р. Кадиков, И.И. Идиятов // Матер. III междунар. конгресса ветер, фармакол. и токсикол. «Эффективные и безопасные средства в ветеринарии», С-Пб., 2014. - С. 202-204.

7. Сальникова, М.М. Ультратонкие исследования печени, почек и головного мозга овец при хроническом воздействии ксенобиотиков / М.М. Сальникова, К.А Осянин, И.Р. Кадиков, В.Р. Сантов, К.А. Асылбаева // Матер. III междунар. конгресса ветер, фармакол. и токсикол. «Эффективные и безопасные средства в ветеринарии», С-Пб., 2014. - С. 229-231.

Подписано в печать 27.10.2014. Бумага офсетная. Печать цифровая. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Times New Roman». Усл. печ. л. 2,36. Уч.-изд. л. 0,32. Тираж 100 экз. Заказ 216/10

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства Казанского университета

420008, г. Казань, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел. (843) 233-73-59, 233-73-28

Информация о работе

Саитов, Вадим Расимович
доктора биологических наук
Казань, 2014
ВАК 06.02.03

Автореферат

Токсикологический и ультраструктурный анализ изменений в организме и клетках животных при хроническом воздействии ксенобиотиков и применении лечебно-профилактических средств - тема автореферата по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы