Токсический эффект синергичного воздействия цитостатика циклофосфана и экзогенной ДНК

Долгова, Евгения Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Токсический эффект синергичного воздействия цитостатика циклофосфана и экзогенной ДНК
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Токсический эффект синергичного воздействия цитостатика циклофосфана и экзогенной ДНК"

На правах рукописи

Долгова Евгения Владимировна

ТОКСИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ СИНЕРГИЧНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ЦИТОСТАТИКА ЦИКЛОФОСФАНА И ЭКЗОГЕННОЙ ДНК

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 НОЯ 2012

Новосибирск 2012

005055093

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук в лаборатории молекулярной биологии клетки, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Богачев Сергей Станиславович

Официальные оппоненты: Омельянчук Леонид Владимирович

доктор биологических наук, • : заведующий лабораторией генетики

клеточного цикла

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск

Синицына Ольга Ивановна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник сектора мутагенеза и репарации Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Защита диссертации состоится « УЬ » ROA^-iA 2012 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу: пр. академика Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090 тел/факс: (383) 363-49-06 (1321); e-mail: dissov@bionet.nsc.ru. факс: (383) 333-12-78

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН. Автореферат разослан « 11 » ОКПК)}^ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.М. Хлебодарова

ВВЕДЕНИЕ

Акггуалыюсть.

При воздействии на живой организм у-радиации и химических цитостатиков в первую очередь и в наибольшей степени страдают клетки эпителия, волосяных фолликул и стволовые клетки крови (СКК).

Показано, что инъекции экзогенной фрагмеитированной геномной ДНК связаны с эффектами, при которых затрагивается функциональная целостность СКК. Так, в экспериментах, выполненных в работе (Likhacheva et al., 2007) отмечалось появление селезеночных колоний у смертельно облученных мышей после своевременных инъекций экзогенной ДНК. Это наблюдение свидетельствовало о том, что экзогенная ДНК при внутрибрюшинном (в/б) введении достигает клеток костного мозга (ККМ) и воздействует на CD34+ (поверхностный гликопротеин, являющийся маркером гемапоэтических прогениторных клеток) СКК таким образом, что сохраняется их жизнеспособность. Потомки СКК формируют колонии в селезенке, которые способствуют восстановлению иммунной системы экспериментального животного. Таким образом, СКК (ККМ), по-видимому, являются первыми и наиболее легкодоступными клетками-мишенями, на которые как химические агенты и радиация, так и экзогенная ДНК, действуют в первую очередь.

Считается, что наиболее важным фактором, определяющим участие фрагментов экзогенной ДНК в репаративных процессах, является появление в ядре двуценочечных разрывов (ДЦР) хромосом (Лихачева и др., 2008). При появлении таких повреждений активируется каскад иерархических киназ и их субстратов, что приводит к остановке клеточного цикла и запуску ренарационно-рекомбинационной молекулярной машины клетки. Если в этот момент времени в ядерном пространстве присутствуют фрагменты экзогенной ДНК, то они становятся равноправными участниками процесса рекоминации (Kohzaki et ai, 2007; Rodrigue et a!., 2006; Лихачева и др., 2008).

В настоящее время в практике лечения онкологических заболеваний совместно с кросслинкирующими цитостатиками все чаще используют лсйкостимулирующис препараты на основе ДНК (деринат, дезоксинат, нолидан). Однако в современной литературе отсутствуют данные о возможных эффектах, которые может оказывать экзогенная ДНК, попадая в организм в момент воздействия цигостатика. Исследуя на мышах лейкостимулирующее действие экзогенной ДНК после миелосупрессии, вызванной цитоетатиком циклофосфаном (ЦФ), было обнаружено следующее явление. Инъекции экзогенной ДНК в препаративных количествах на фоне предобработки ЦФ приводят к появлению характерного симптомокомплекса (набору специфических признаков заболевания мышей) и гибели экспериментальных животных. В предлагаемой работе предпринята попытка как можно ближе

подойти к пониманию механизмов, определяющих возникновение губительного для организма эффекта. Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы являлось изучение механизмов синергичного воздействия цитостатика циклофосфана и экзогенной ДНК на организм мышей.

В рамках цели предлагаемой работы были поставлены следующие задачи:

1. Определить критический промежуток времени введения препарата ДНК после инъекции циклофосфана, который определяет появление характерного симптомокомплекса и гибель мышей, используя в качестве маркерного признака параметр «выживаемость».

2. Получить экспериментальные доказательства доставки фрагментов экзогенной ДНК в клетки костного мозга мышей как при инъекциях in vivo, так и при совместном культивировании в системе ex vivo. Дать количественные и качественные характеристики доставляемой экзогенной ДНК.

3. Определить динамику формирования и репарации двуцепочечных разрывов, возникающих как обязательный интермедиат при репарации межцепочечных сшивок, индуцированных цитостатиком циклофосфапом.

4. Сопоставить временной промежуток введения препарата ДНК после инъекции циклофосфана, в результате чего у экспериментальных животных проявляются патологические процессы, со временем репарации двуцепочечных разрывов в клетках костного мозга мышей.

5. Дать характеристику некоторым патологическим процессам, происходящим в клетках костного мозга при одновременном присутствии в ядерном пространстве двуцепочечных разрывов и фрагментов экзогенной ДНК: а) оценить количественные изменения умеренных повторов в геноме экспериментальных животных; б) определить уровень и длительность апонтоза клеток костного мозга в норме и при синергичном действии циклофосфана и препарата ДНК; в) охарактеризовать морфологические изменения хромосом, произошедшие в результате проведенных обработок; г) выявить изменения в различных популяциях клеток костного мозга, вызванные совместным действием циклофосфана и экзогенной ДНК.

6. Провести патологоморфологический анализ тканей и органов животных в период развития заболевания. Дать заключение о возможных причинах гибели экспериментальных животных.

Научная новизна.

1. Впервые показано, что при совместном инкубировании с экстракоропорально сгенерированными клетками костного мозга мышей, фрагменты экзогенной ДНК достигают внутреннего пространства указанного типа клеток в исходном виде без проведения процедуры трансфекции.

2. Впервые описаны некоторые особенности молекулярных процессов, протекающих в клетках костного мозга, и в частности в CD34+ стволовых клетках крови, подтверждающие, что экзогенная ДНК принимает участие в процессе репарации двуцепочечных разрывов, нарушая правильный ход репарационного процесса как у мышей стандартного содержания, так и у животных с присвоенным статусом SPF (Specific Pathogen Free).

3. Впервые продемонстрировано, что сочетание воздействия циклофосфана и препарата экзогенной ДНК приводит к патологическим изменениям в органах и тканях экспериментальных мышей стандартного содержания. При использовании SPF-мышей характерный симптомокомплекс не развивается. Положения, выносимые на защиту.

Совместные инъекции цитостатика циклофосфана и экзогенной ДНК мышам стандартного содержания приводят к аберрантному митозу, гибели и разрушению функции популяции костномозговых предшественников, ответственных за развитие лимфоидного ряда кроветворения. Практическая значимость.

Результаты проведенных исследований могут являться основанием для выбора безопасных временных параметров при использовании лейкостимулирующих препаратов на основе ДНК (деринат, дезоксинат, полидан, панаген) в терапевтической практике при лечении онкологических заболеваний с применением кросслинкирующих цитостатиков. Апробация работы.

Результаты работы представлены в материалах Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина и V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (21-27 июня 2009 года, Москва); XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (10-14 апреля 2010 года, Новосибирск); международной конференции Annual Main Meeting of Society for experimental Biology (1-4 июля 2011 года, Глазго, Великобритания); международной конференции 7th European Course and 11th Euroconference of ISAC-ICCS-ICyS-ESCCA Joint Meeting (13-17 сентября 2011 года, Дублин, Ирландия); международной конференции A Current Opinion in Structural Biology conference (16-18 октября 2011 года, Амстердам, Нидерланды); 50-й юбилейной международной студенческой научной конференции «Студент и научно-технический прогресс» (13-19 апреля 2012 года, Новосибирск). Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 4 статьи, входящих в «Перечень ВАК», и 6 тезисов.

Вклад автора.

Основные результаты были получены автором самостоятельно. Эксперименты, связанные с использованием лабораторных животных, проводились совместно с к.м.н. В.П. Николиным и к.б.н. H.A. Поповой. Патологоанатомический анализ тканей и органов больных животных проводился совместно с к.б.н. О.С. Тарановым. Анализ мазков крови и костного мозга экспериментальных животных проводился при экспертной поддержке Т.Д. Дубатоловой.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, четырех глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение), выводов, списка литературы и двух приложений. Работа изложена на 191-й странице, содержит 86 рисунков, 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Разведение экспериментальных животных

В экспериментах использовали 2-3 месячных мышей линии CBA/Lac разведения вивария №2 Института цитологии и генетики СО РАН (стандартное содержание), а также SPF-мышей этой же линии разведения SPF-вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали в пластиковых клетках по 5-10 особей в каждой со свободным доступом к пище и воде. Мыши получали гранулированный корм ПК 120-1 (Лабораторснаб, Москва). Препарат ДНК человека

Препарат человеческой ДНК получали из плацент здоровых рожениц, результаты анализа крови которых отрицательны на наличие ВИЧ, сифилиса, гепатитов В и С. Для выделения ДНК использовали безфенольный метод (раздел промышленного регламента производства препарата «Панаген»). Фрагментацию ДНК осуществляли ультразвуковым дезинтегратором при частоте 22 КГц, в результате чего получали набор фрагментов ДНК, размером от 200 до 6 ООО п.н. Препарат ДНК хранили при -20°С. Данный препарат является фармакопейным препаратом (патентованное название «Панаген», регистрационное свидетельство ЛСР №004429/08 от 09.06.2008) и в качестве объекта промышленной собственности принадлежит ООО «Панаген». Введение мышам ЦФ и ДНК человека

ЦФ вводили мышам внутрибрюшинно (в/б) из расчета 200 мг/кг веса. Затем через определенные интервалы времени мышам в/б вводили по 0,5-1 мг препарата фрагментированной человеческой ДНК.

Приготовление препаратов из ККМ мышей и иммунофлуореецентный анализ фокусов репарации ДЦР

Из трубчатых костей мышей фосфатно-солевым буфером (PBS) вымывали красный костный мозг. Клетки осаждали центрифугированием и

ресусиепднровали в PBS. Каплю полученной взвеси клеток наносили на предметное стекло, иммуннофлуоресцентный анализ был сделан по методике, описанной в работе Niedernhofer et al, 2004.

Инкубирование экстракорпорально сгенерированных ККМ с препаратом ДНК

Из трубчатых костей мышей вымывали ККМ средой MEM-Glasgow (GibcoBRL, Великобритания), содержащей раствор незаменимых аминокислот, глутамин, 0,1 мМ ß-меркаптоэтанол, 1000 ед/мл LIF. Клетки инкубировали с 32Р мечеными фрагментами ДНК. По окончании инкубации клетки промывали два раза этой же средой, заливали в блоки легкоплавкой агарозы, высушивали гель и проводили засветку па Molecular Imager FX Pro+. Выделение ДНК из ядер ККМ экспериментальных мышей

ККМ мышей вымывали из трубчатых костей физиологическим раствором, ресуспепдировали в 0,5 мл лизирующего буфера (Roberts, 1986), содержащего 0,5% Тритон Х-100 и инкубировали 10 мин на льду. Смесь наслаивали на 1 мл раствора 10% сахарозы в лизирующем буфере и центрифугировали при 600 g, 4°С в течение 15 мин. Осадок ядер промывали буфером, повторно центрифугировали и ресуспепдировали в небольшом объеме воды. Суспензию ядер лизировали 0,5% SDS и обрабатывали протеиназой К. Дспротеинизацию проводили экстракцией фенол / хлороформ в соотношении 1:1. ДНК переоеаждали 0,6 объемами изопропанола из 0,3 М NaAc pH 5,2, промывали 70% этиловым спиртом и растворяли в воде.

Анализ количества зрелых предшественников (CD34+) и предшественников лимфоидного ряда в костном мозге мышей

ККМ мышей осаждали центрифугированием и ресуспепдировали в PBS с 0,1% NaN3, 1% FBS. К 1 млн. клеток добавляли 5 мкг антител (FITC Rat anti-Mouse CD34, BD Pharmingen) и, соответственно, 5 мкг изотип контроля (ПТС Rat IgG2a, к Isotype Control, BD Pharmingen) и инкубировали в течение 40 мин при 4°С. Процент клеток CD34+ и предшественников лимфоидного и эритроидного ряда определяли при помощи проточного цитофотометра BD FACSAria.

Патологоанатомическин анализ тканей и органов погибших мышей

Кусочки органов фиксировали в 4% параформальдегиде, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, просветляли ксилолом, заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной до 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином (Волкова, Елецкий, 1971). Просмотр препаратов и микрофотосъемка проводились на световом микроскопе Axiolmager ZI (Zeiss, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Временные параметры проявления эффекта «отсроченной смерти» мышей

В ранних работах при исследовании лейкостимулирующей активности; инъекций препаратов экзогенной ДНК в группе экспериментальных животных была отмечена массовая гибель, достигавшая 80% (икЬасЬеуа е/ а/., 2007). Эффект был обнаружен как следствие трехкратного введения мышам 0,5 мг экзогенной ДНК на фоне действия цитостатика ЦФ. Используя подхо многократного введения препарата экзогенной ДНК после инъекции ЦФ е: варьирование 6 и 12 часовыми промежутками времени, у разных групп бы определен период времени, когда гибель мышей достигала 60-90%, и которы;: мы обозначили как «окно смерти» (Рис. 1).

«Окно смерти» представляет собой два 6 часовых промежутка времени поел : введения ЦФ. Первый отрезок 18-24 часа, второй обязательный 6 часовор промежуток времени или следует непосредственно за первым (24-30 часов, группы 8, 9, 10, 14, 15), либо отнесен к концу вторых суток (42-48 часов, груши 4, 13). Двенадцатикратное введение ДНК человека, инъекция ЦФ (200 мг/кг) в виде монопрепарата, а также введение ЦФ в сочетании с ДНК человека в друга, временные промежутки (группы 7, 11, 12) не оказывало негативного эффекта не выживаемость животных.

12 18 24 30 ЗВ 42 43

время после введения циклофоефана, часы

Рис. 1. Прямые отрезки обозначают различные группы мышей, числа рядом - номера групп. Точками на отрезках указана каждая индивидуальная инъекция экзогенной ДНК Нулевая точка - момент введения ЦФ. Проекция на ось У показывает процент смертности мышей в каждой группе. Группа 11 представляет собой совокупность 6 трупп, которые каждый час получали инъекции ДНК человека в периоды времени 1-6, 7-12, 13-18, 19-24, 25-30 и 31-36 ч после введения ЦФ. Прерывистая кривая показывает процент ККМ, которые достоверно находятся под воздействием цитостатика ЦФ. Промежуток времени, представляющий собой «окно смерти», выделен серым цветом.

Следует отметить, что при использовании в экспериментах SPF-мышей заметного токсического эффекта обнаружено не было. В дальнейшем во всех экспериментах использовали линию мышей СВА стандартного содержания, кроме случаев, когда отдельно указано, что эксперимент проводили с использованием SPF-животных.

Исходя из экспериментальных данных, следует, что наблюдаемый феномен не связан с токсичностью ЦФ, не связан с присутствием в организме экзогенной ДНК, проявляется только в результате совместного действия ЦФ и экзогенной ДНК и во многом зависит от времени введения ДНК после инъекции ЦФ, а также определенной кратности введений препарата ДНК.

Препараты цитостатической группы губительно воздействуют на ККМ, в частности на СКК, вызывая тяжелую эритро- и лейкопению (Salem et al., 2010). Одновременно с этим имеются данные о том, что ККМ, включая СКК, могут являться одной из основных мишеней воздействия экзогенной ДНК при ее введении в организм экспериментального животного (Likhacheva et al., 2007). Именно эти два свойства ККМ были основанием при выборе данной клеточной системы в качестве модели для выяснения молекулярных причин губительного эффекта синергичного воздействия цитостатика ЦФ и экзогенной ДНК.

Анализ динамики возникновения и репарации ДЦР

Для того чтобы привязать установленные промежутки времени, когда наблюдается видимый эффект воздействия экзогенной ДНК на мышиный организм, к молекулярным процессам, происходящим в ККМ, при помощи антител к фосфорилированному гистону уН2АХ были проведены эксперименты по анализу количества ДЦР в ядрах указанных клеток (Niedernhofer et al., 2004) (Рис. 1, прерывистая кривая).

Из сопоставления графиков гибели мышей и динамики количества ДЦР (Рис. 1) можно сделать заключение, что мыши заболевают и гибнут только в том случае, если введение ДНК происходит во время репарации ДЦР основного количества ККМ (промежуток времени 18-24 часа после инъекции ЦФ). Если же введение экзогенной ДНК происходит в любой другой промежуток времени, то мыши выживают.

Дополнительно было проведено сравнение репарации ДЦР в ККМ мышей после воздействия одного ЦФ и в сочетании с ДНК человека (Рис. 2). Показано, что при появлении в организме экзогенной ДНК в ККМ в течение 10 мин исчезают фокусы репарации, выявляемые антителами к гистону уН2АХ. В группе мышей, обработанных ЦФ, основная масса ДЦР репарируется к 28 часам после инъекции цитостатика (Рис. 2).

время после введения циклофосфана, часы

Рис. 2. Анализ количества ККМ,

находящихся под

воздействием ЦФ. Сплошная кривая -ККМ мышей после введения цитостатика в виде монопрепарата; прерывистая кривая -ККМ мышей после инъекций ЦФ и экзогенной ДНК

человека.

Интернализация экзогенной ДНК в ККМ экспериментальных мышей

Для подтверждения того факта, что экзогенная ДНК при в/б инъекциях доставляется в ядра ККМ мышей в виде фрагментов определенного размера, был проведен ПЦР анализ материала ДНК ядер ККМ мышей с праймерами на уникальный ген каспазы 3 человека (Рис. 3). Обнаружено присутствие фрагментов человеческой ДНК в ядерной фракции ККМ мышей, при этом размер интродуцированных в ядро фрагментов составляет не менее 260 п.н.

Рис. 3. Электрофореграмма (а) и рентгенограмма (6) продуктов ПЦР с праймерами на уникальный ген каспазы 3 человека. 1 - маркер молекулярного веса; 2 - ДНК человека; 3 - ДНК ККМ мышей СВА; 4 - ДНК ядерной фракции ККМ мышей, выделенных через 8 часов после введения ЦФ и ДНК. В качестве зонда для гибридизации использовали 32Р меченую ДНК гена каспазы 3 человека. Стрелка обозначает гибридизующийся фрагмент, соответствующий продукту ПЦР с праймерами на ген каспазы 3 человека.

Для решения вопроса о количестве доставляемых в ККМ фрагментов ДНК была разработана процедура экстракорпоральной генерации ККМ, их совместной инкубации с индивидуальными радиоактивно мечеными фрагментами ДНК и анализа материала этих клеток после заливки в блоки легкоплавкой агарозы.

Были выполнены серии экспериментов с фрагментом ДНК, меченым по липкому концу (гидролизованная рестриктазой Нт<Ш1 плазмида рНОГР-Ы 1). Оказалось, что фрагменты в не деградированном состоянии доставляются как в нативные, так и в находящиеся под действием ЦФ ККМ. Меченая плазмида начинает лигироваться в кольцо к 7 ч инкубации в ККМ, выделенных из мышей обеих групп (Рис. 4-А). Наблюдается быстрое конечное насыщение меченым материалом клеток, находящихся под воздействием ЦФ, и непрерывное увеличение количества меченого материала в клетках, выделенных из необработанных ЦФ мышей (Рис. 4-Б). Результаты экспериментов показали, что в ККМ может находиться до 1800 т.п.н. экзогенной ДНК в форме фрагментов.

А Б ЦФ контроль ЦФ контроль ЦФ контроль '=0300 ......................................................................................................................

12 4 7 1 2 4 7

Рис. 4. А - Результаты инкубации ККМ с ллазмидой pEGFP-N1, гидролизованной рестриктазой Hindill и меченой по липкому концу, в течение различного времени -1,2, 4 и 7 ч. Электрофореграмма (слева) и рентгенограмма (справа) после заливки в блоки легкоплавкой агарозы и электрофореза ядер ККМ мыши, выделенных через 18 ч после воздействия ЦФ, и интактной мыши. М - маркеры молекулярного веса. Стрелками показаны линейная (нижняя) и кольцевая (верхняя) формы плазмиды. Б - Количественная оценка меченой ДНК плазмиды pEGFP-N1, содержащейся в ядрах ККМ. Оценка проведена с использованием фосфоимеджера Molecular Imager FX Рго+ и программы Quantity One. CNT'mm2 - относительные единицы, характеризующие силу радиоактивного сигнала мембраны на единицу площади.

Характеристика изменения количества умеренных повторов В1 и В2 в геноме ККМ экспериментальных мышей

Первоначально в работе было отмечено изменение количества гомологичных Alu повтору повторяющихся последовательностей ДНК в геномной фракции, выделенной из ККМ мышей, обработанных ЦФ. Предполагалось изменение количества умеренных повторов в геноме мыши.

Для проверки этого предположения в качестве анализируемых повторов были выбраны В1 и В2 умеренные повторы генома мыши, которые в условиях жесткой гибридизации, используемых в настоящей работе, не имеют перекрестной гомологии ни между собой, ни с человеческим геномом. Благодаря этому можно было оценить изменение количества указанных повторов как в группе мышей, обработанных ЦФ, так и в группе экспериментальных животных, получавших инъекции ЦФ и ДНК человека, вне зависимости от присутствия в

геномной фракции ККМ ДНК экзогенного происхождения (Va.ssety.ky е1 а!., 2003).

Для анализа происходящих в геноме событий были выбраны точки 11, 15, 18, 24, 28 часов для группы ЦФ и 18, 24, 28 часов для группы ЦФ+ДНК. Оказалось, что в условиях использования ЦФ как монопрепарата происходят колебания в количестве последовательностей генома, гомологичных В1 повтору. При этом в образцах геномной ДНК, выделенной из ККМ мышей группы ЦФ+ДНК, количество повторов остается неизменным на протяжении контролируемого временного отрезка (Рис. 5). Аналогичные данные были получены для В2 повтора.

время после введения ЦФ, часы

Рис. 5. Анализ относительного количества В1 повторов в геноме ККМ мышей. Сплошная кривая - после инъекции ЦФ (200 мг/кг) в виде монопрепарата, пунктирная кривая - после инъекции ЦФ с последующим введением экзогенной ДНК человека в промежуток времени 18-30 часов после инъекции цитостатика. Отдельная точка - ДНК из ядер ККМ интактных мышей. CNT*mm2- относительные единицы, характеризующие силу радиоактивного сигнала мембраны на единицу площади, подсчитанные в программе Quantity One.

Характеристика динамики апоптоза в ККМ экспериментальных мышей

В рамках исследований по анализу состояния ККМ была проведена серия экспериментов по оценке степени и продолжительности апоптотической деградации ККМ в двух группах животных, получавших ЦФ как монопрепарат и ЦФ в сочетании с экзогенной ДНК. Оказалось, что если вводить экзогенную ДНК, начиная с 18 и до 30 часов с момента инъекции ЦФ («окно смерти»), то индуцированный к 16 часам апоптоз не прекращается и продолжается вплоть до последней инъекции ДНК. Для контрольной группы (ЦФ) возбуждение нормализуется к 24 часам после введения ЦФ (Рис. 6).

— ЦФ

-« - ЦФ4-ДНК |

— ■-!"

_1__

^^ 1 1

О 2 4 6 в 10 12 14 15 18 20 22 24 26 26 30 32 34 36 аром» после введения ЦФ чесы

Рис. 6. Анализ апоптоза ККМ. Сплошная кривая -ККМ, выделенные из мышей после инъекции ЦФ в виде монопрепарата; пунктираня кривая - ККМ, выделенные после

введения мышам

цитостатика в сочетании с инъекциями ДНК в «окно смерти».

Оценка влияния ЦФ и экзогенной ДНК на субпопуляционный состав ККМ

Полученные данные предполагали, что присутствие в ядре костномозговых клеток фрагментов экзогенной ДНК должно было нарушать корректный ход репарации и приводить к аберрантному митозу и гибели клеток вследствие нарушения целостности хромосом. При анализе метафазных пластинок, выделенных из ККМ мышей, установлено, что в группе, получавшей инъекции ЦФ и ДНК человека, не менее 65% метафаз демонстрируют эффект пульверизации хромом. В группе, получавшей один ЦФ, количество метафаз в таком состоянии оценено как 42%. Дополнительно был проведен анализ состава С034+ прогениторных клеток и общий анализ изменения состава популяции ККМ в ходе развития болезни (Рис. 7-А, Б).

'ЦФ

¡:!ЦФ*ДНК|

5-15 >15

время после инъекции ЦФ, дни

I ОЦФ

ш цф*дас|

5-15 время па

>15 ЦФ, дни

Рис. 7. Графики абсолютного количества клеток предшественников лимфоидного ряда (А) и зрелых Сй34+ предшественников (Б) в костном мозге интактных мышей (контроль), мышей после инъекции ЦФ и ЦФ в сочетании с ДНК человека в периоды снижения и восстановления клеточности костного мозга на фоне инъекции ЦФ.

Общее количество ККМ в обеих группах (ЦФ, ЦФ+ДНК) снижается до минимального значения к 3-м суткам после введения цитостатика и составляет около 20 млн. клеток. К 15-м суткам происходит полное восстановление количества ККМ до исходного уровня 35 млн. При этом С034+ СКК как популяция клеток восстанавливается и сохраняется у больных мышей, получавших инъекции ЦФ и экзогенной ДНК, в такой же динамике, как и в группе мышей, получавших только ЦФ (относительное содержание предшественников не отличается от нормы и составляет 1.2-1.4% от всей популяции ККМ) (Рис. 7-Б). Тем не менее, обнаружено, что основной характеристикой ККМ болеющих мышей является практически полное исчезновение субпопуляции клеток размером 12-20 нм (Рис. 7-А). Проведенный анализ форменных элементов в отпечатках костного мозга, полученных из грудины болеющих животных, свидетельствует, что в популяции ККМ отсутствуют молодые формы коммитированных. клеток-предшественников лимфоиммунопоэза.

Для анализа возможных причин гибели мышей стандартного содержания были проведены аналогичные исследования на вРР-животных, свободных от оппортунистической инфекции. Показано, что у ЭРР-животных не формируется симптомокомплекс, характерный для мышей стандартного содержания. Также не было отмечено гибели мышей как в контрольных, так и экспериментальных группах. В связи с отсутствием визуальных критериев заболевания анализ функционального состояния костного мозга осуществляли в выбранные контрольные точки: на 9, 15, 21 и 29 сутки. 9 сутки характеризуются резким уменьшением количества предшественников лимфоцитарного ростка крови у мышей, обработанных как ЦФ, так и ЦФ+ДНК. Также небольшое снижение обнаруживается в группе животных, получавших инъекции ДНК в виде монопренарата. На 15 и 21 сутки у мышей, обработанных ЦФ, анализируемая популяция ККМ начинает восстанавливаться, в то время как в группе ЦФ+ДНК процент клеток данной популяции остается на критически низком уровне. К 29 суткам состав ККМ у мышей всех групп полностью восстанавливается (Рис. 8).

Рис. 8. Динамика изменения количества костномозговых предшественников лимфоидного ряда у БРР-мышей. Темная сплошная линия отражает количество

предшественников лимфоцитов в группе мышей, обработанных препаратом ДНК, светлая сплошная линия - обработанных ЦФ, прерывистая линия - обработанных сочетанием ЦФ и препарата ДНК. Нулевая точка соответствует проценту костномозговых предшественников лимфоидного ряда у интактных БРЯ-мышей.

Патологоморфологический анализ тканей и органов погибших мышей

Основными симптомами заболевания экспериментальных животных были следующие: общее угнетение двигательной активности, обильное потение, лихорадка, отек морды, выпадение волос на затылке и мордочке, неоткрывание глаза, судороги, параличи. Иногда мыши погибали сразу без видимых симптомов болезни. Иногда мыши выздоравливали после характерных симптомов заболевания.

В органах мышей, получавших совместные инъекции препаратов ЦФ и экзогенной ДНК в «окно смерти», в период от 2 до 6 суток не обнаружено визуально заметных морфологических отклонений от контрольных животных, обработанных ЦФ. Начиная с 9 суток и далее, определяются достаточно яркие признаки нарушения структуры со стороны легких, печени, иммунокомпетентных органов и головного мозга.

В легких наблюдается интенсивная воспалительная реакция, проявляющаяся отеком межальвеолярных перегородок, кровоизлияниями, массивной воспалительно-клеточной инфильтрацией перибронхиальных и периваскулярных пространств с переходом на респираторный отдел легкого. В печени на первый план выступают многочисленные мелкоочаговые лимфоидно-клеточные инфильтраты внутри долек, а также по ходу желчных протоков и сосудов портальной системы. Местами внутридольковые инфильтраты сопровождаются деструкцией отдельных гепатоцитов. У одной из мышей описанные поражения легких и печени сопровождаются крупноочаговым некрозом поджелудочной железы.

Практически все мыши данной группы демонстрируют признаки ответной реакции со стороны органов иммунной системы. Так, со стороны тимуса отмечается снижение плотности коркового вещества, что находит отражение в визуальном стирании его границы с областью мозгового слоя. Селезенка многих животных характеризуется заметным сокращением как числа фолликулов в целом, так и уменьшением их размеров до масштаба периартериальной зоны (Рис. 9). Лимфатические узлы в унисон с изменением морфологии тимуса и селезенки также показывают сокращение количества фолликулов в пределах корковой зоны.

Во многих случаях отмечается заметный отек ретикулярной ткани мозгового вещества. В головном мозге у обеих групп мышей, получавших инъекции ЦФ в виде монопрепарата и ЦФ в сочетании с ДНК человека, наблюдаются очаговые лимфоидноклеточные инфильтраты в коре полушарий либо изолированно, либо в сочетании с аналогичными клеточными скоплениями в перивентрикулярных и

других отделах мозга. Со стороны других органов патологических изменений структуры не выявлено.

А Б

Рис. 9. Гистологические срезы селезенки. А - контрольные мыши, получившие инъекцию ЦФ 200 мг/кг; паренхима селезенки отчетливо дифференцирована на красную и белую пульпу, крупные лимфоидные фолликулы белой пульпы селезенки указаны стрелками. Б - мыши, которые находились на конечных стадиях заболевания, получившие совместные инъекции ЦФ и ДНК человека в «окно смерти»; наблюдается резко выраженная редукция фолликулов белой пульпы селезенки.

ОБСУЖДЕНИЕ

Общая картина начала и развития патологического процесса складывается из анализа результатов деструктивных процессов, произошедших в костном мозге, и на уровне гистологического анализа срезов органов, затронутых патологическими изменениями.

Фрагменты экзогенной ДНК достигают ядерного пространства ККМ. В присутствии ДЦР, фрагменты экзогенной ДНК нарушают процесс репарации разрывов, который в норме идет по пути гомологичной рекомбинации. Такое предположение подтверждается следующими найденными фактами. После инъекции экзогенной ДНК мышам в течение 10 мин наблюдается 2-кратное снижение количества ККМ с ДЦР, т.е. происходит практически мгновенная репарация ДЦР. Также в пользу концепции нарушения корректного течения репарации свидетельствуют результаты анализа структуры метафазных пластинок и данные по изменению количества умеренных повторов в геноме ККМ.

В ККМ мышей группы, обработанной ЦФ, образуются межцепочечные сшивки (МЦС), которые распознаются клеткой при вхождении в Б фазу клеточного цикла, когда репликативная(ые) вилка(и) наталкивается на повреждение (Аккап е1 ей., 2000). В этот момент в месте МЦС образуется ДЦР, что запускает каскадный путь активации остановки клеточного цикла С\¥агтегс1ат, Капааг, 2010). Наряду с этим происходит активация систем репарации ДЦР. При этом возобновление продвижения по клеточному циклу не

наступит до тех пор, пока все повреждения не будут удалены из внутриядерного пространства клетки (Shibata et al., 2010). В описанной ситуации, когда произошла остановка репликации, но какое-то количество ДНК уже успело закончить репликацию, удвоение генома прошло неравномерно. При этом в суммарной фракции геномной ДНК меняется относительное количество определенных последовательностей: становится больше участков ДНК, которые успели удвоиться и, соответственно, уменьшается количество тех последовательностей, которые реплицируются в последнюю очередь. Показано, что только 86% SINE последовательностей реплицируются в ранней фазе репликации, тогда как 14% приходятся на позднюю S фазу (Holmquist et al., 1986). В наших экспериментах количество В1 и В2 повторов в геноме мыши в указанных экспериментальных условиях уменьшается ориентировочно на 20%, что хорошо согласуется с выводами, полученными в указанной работе.

Сохранение относительного количества умеренных повторов на одном уровне при инъекциях экзогенной ДНК может определяться немедленным лигированием ДЦР в стохастическом порядке. Предполагается, что фрагменты экзогенной ДНК активируют специфическую систему аварийного лигирования, что приводит к несанкционированному объединению двуцепочечных концов (Lee et al., 2005; Wang et al., 2005; Kotnis et al., 2009) и экстренному завершению репликации ДНК. В результате аварийного восстановления целостности генома синтез ДНК возобновляется, и уменьшение относительного количества повторов, связанного с остановкой репликации, не происходит.

Нарушения в структуре хромосом ККМ приводят к массовому апоптозу. При сравнении цитометрических облаков различных популяций ККМ с использованием бокового светорассеивания (SSC) было обнаружено, что в процессе развития патологического процесса из костного мозга исчезает популяция клеток, представляющая собой молодые формы предшественников лимфоидного ряда.

Характер выявленных патологических изменений морфологии легких, печени, поджелудочной железы, центральных и периферических органов иммунной системы и головного мозга указывает на преобладание воспалительных реакций. Подтверждением этому служат структурные эквиваленты функционального истощения лимфоидных органов. Можно полагать, что причиной гибели мышей является полиорганная недостаточность, вызванная системным воспалением и акцидентальной инволюцией лимфоидных органов.

По-видимому, воспаление развивается по нескольким направлениям. Повышение количества Д11К в форме нуклеосом, вызванное масштабным апонтозом активно делящихся клеток, согласно последним исследованиям, приводит к некрозу популяции периферических лимфоцитов (Decker et al.,

2003). Индуцированные некротические процессы ведут к развитию очаго воспаления в организме больных мышей. Воспаление также индуцируе экзогенная ДНК сама по себе, запуская механизмы сверхпродукции интерферон Р и активацию синтеза ФНОа (Martin, Elkon, 2006; Coban et al., 2008 Одновременно с указанным действием большое количество экзогенной ДНК интродуцированное в организм мыши, может привести к активаци аутоиммунных процессов, которые также заканчиваются воспаление! (McMahon et al., 1998). Развитие системного воспаления приводит к истощенш иммунокомпетентных органов. При этом происходит долговременная потер CD34+ стволовыми клетками возможности дифференцироваться в клеш лимфоидного ростка. Следствием таких изменений в организме больных мыше] является возникновение острого иммунодефицита, приводящего к активаци! оппортунистической инфекции (Shirota et al., 2006; Coban et al., 2008] Совокупность указанных процессов индуцирует акселеративную нетлл воспаления, в результате чего развивается системный сенсис, приводящий i полиорганной недостаточности и растянутой во времени гибел! экспериментальных животных.

ВЫВОДЫ

1. Экзогенная ДНК при совместном культивировании ex vivo достигает i депонируется в клетках костного мозга мышей. Одновременно bi внутриклеточном пространстве клеток может находиться до 1800 т.п.н экзогенной ДНК в виде фрагментов.

2. Инъекции мышам стандартного содержания экзогенной ДНК в сочетанш с кросслинкирующим цитостатиком циклофосфаном индуцируют в стволовыз клетках крови нарушения функциональной активности, характеризующие^ дегенеративными изменениями лимфоидного ряда кроветворения.

3. На фоне дегенеративных изменений лимфоидного ряда кроветворения i связанной с этим естественной активацией оппортунистической инфекции у мышей стандартного содержания развивается невосполнимое истощение лимфоидных органов. Возникает полиорганная недостаточность, приводящая i растянутой во времени гибели экспериментальных животных.

4. У SPF-животных, характеризующихся практически полным отсутствием оппортунистических микроорганизмов, при аналогичных режимах обработки происходит развитие сходных патологических процессов на уровне функционирования гемапоэтических предшественников, которые, однако, не сопровождаются развитием характерного симптомокомплекса и последующей гибелью экспериментальных мышей.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Е.В. Долгова, A.C. Лихачева, К.Е. Орищенко, Е.А. Алямкина, С.С. Богачев, М.А. Шурдов. Репарация межцепочечных сшивок молекулы ДНК // Информационный вестник ВОГиС. 2010. Т. 14, № 2, С. 332-356.

2. Е.В. Долгова, A.C. Проскурина, В.П. Николин, H.A. Попова, Е.А. Алямкина, К.Е. Орищенко, А.Г. Шилов, Я.Р. Ефремов, Е.Р. Черных, A.A. Останин, С.С. Богачев, A.B. Прокопенко, Е.М. Малкова, О.С. Таранов, Т.С. Гвоздева, В.А. Рогачев, С.Н. Загребельный, М.А. Шурдов. Характеристика временных параметров проявления эффекта токсического действия инъекций экзогенной ДНК на фоне предобработки цитостатиком циклофосфаном // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2011. Т. 15, № 4, С. 674-689.

3. Dolgova E.V., Proskurina A.S., Nikolin У.Р., Popova N.A., Alyamkina E.A., Orishchenko K.E., Rogachev V.A., Efremov Y.R., Dubatolova T.D., Prokopenko A.V., Chernykh E.R., Ostanin A.A., Taranov O.S., Omigov V.V., Zagrebelniy S.N., Bogachev S.S., Shurdov M.A. "Delayed death" phenomenon: a synergistic action of cyclophosphamide and exogenous DNA // Gene. 2012. V. 495. P. 134-145.

4. E.B. Долгова, В.П. Николин, H.A. Попова, A.C. Проскурина, К.Е. Орищенко, Е.А. Алямкина, Я.Р. Ефремов, Е.Р. Черных, A.A. Останин, Е.М. Малкова, О.С. Таранов, В.А. Рогачев, C.B. Сидоров, С.С. Богачев, М.А. Шурдов. Интернализация экзогенной ДНК во внутренние компартменты клеток костного мозга мышей // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2012. Т. 16, №2, С. 397-414.

Подписано к печати 16.10.2012 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ № 75

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Долгова, Евгения Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.:.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Горизонтальный перенос генетической информации.

1.2. Естественные источники экстраклеточной ДНК в организме.

1.3. Механизмы проникновения фрагментов экзогенной ДНК в компартменты эукариотической клетки.

1.4. Рекомбиногенная ситуация в соматической клетке. Основные характеристики.

1.5. Активация систем контроля клеточного цикла. Индукция репаративного процесса.

1.5.1. Активация системы иерархических киназ.

1.5.2. Активация эффекторных киназ. Остановка клеточного цикла.

1.6. Организация концов ДЦР хромосомы. Основные пути репарации.

1.7. Пути утилизации фрагментов экзогенной ДНК, доставленных в клеточные компартменты.

1.7.1. Репарация по механизму ГР. Интеграция фрагментов экзогенной

ДНК с использованием механизма ГР.

1.7.2. Негомологичное объединение концов молекулы ДНК. Захват фрагментов ДНК.

1.8. Экстраклеточная ДНК и ее взаимоотношения с системой остановки клеточного цикла.

1.9. Цитостатические препараты. Механизм формирования МЦС. ДЦР, индуцированные кросслинкирующими цитостатиками.

1.10. Основные молекулярные механизмы репарации МЦС.

1.10.1. Экспериментально обоснованные схемы репарации МЦС у млекопитающих, описанные в мировой литературе.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Токсический эффект синергичного воздействия цитостатика циклофосфана и экзогенной ДНК"

Актуальность

Циклофосфан (ЦФ) относится к алкилирующим противоопухолевым препаратам, широко используемым в практике лечения онкологических заболеваний (Fleming, 1997; Yu et al., 1999). Основным механизмом, обеспечивающим противораковый эффект действия цитостатика, является индукция межцепочечных сшивок (МЦС) его метаболитом фосфорамид мустардом в активно делящихся клетках. При воздействии ЦФ на живой организм вместе с разрушением раковых клеток разрушительное действие оказывается и на другие активно пролиферирующие клетки организма, включая клетки костного мозга (ККМ) - стволовые клетки крови (СКК) (Salem et al., 2010).

Существует несколько путей репарации МЦС. Конкретный механизм, выбираемый клеткой, зависит от ее свойств, стадии клеточного цикла, в котором она находилась в момент получения повреждения, наличия тех или иных факторов репарации (Долгова и др., 2010). В рамках настоящего исследования наиболее актуальным является характеристика молекулярных событий при репарации МЦС, происходящих в момент репликации клеток. При репарации МЦС в момент столкновения репликативной вилки с повреждением возникают двуцепочечные разрывы (ДЦР) как необходимые интермедиаты репарации (Akkari et al., 2000; Niedernhofer et al.,2004).

Существуют факты, свидетельствующие о том, что при инъекциях экзогенной фрагментированной геномной ДНК затрагивается функциональная целостность СКК. Так, в экспериментах, выполненных в работе (Likhacheva et al., 2007b), отмечалось появление селезеночных колоний у смертельно облученных мышей после своевременных инъекций экзогенной ДНК. Это наблюдение свидетельствовало о том, что экзогенная ДНК при внутрибрюшинном введении достигает ККМ и воздействует на CD34+ (поверхностный гликопротеин, являющийся маркером гемапоэтических прогениторных клеток) СКК, сохраняя их жизнеспособность. Также многократно показано, что инъекции экзогенной ДНК экспериментальным животным стимулируют гемо- и лейкопоэз, что свидетельствует об активации CD34+ СКК (Николин и др., 2006; Долгова и др.,

2009). Эти факты говорят о том, что экзогенная ДНК достигает ККМ, в частности СКК и их потомков разной степени зрелости, и становится равноправным участником определенных общеклеточных событий или непосредственно индуцирует эти события в указанном типе клеток. Другой важный вывод из имеющихся экспериментальных фактов заключается в том, что, по-видимому, ККМ (ССК) являются первыми и наиболее легкодоступными клетками-мишенями, на которые как химические агенты и радиация, так и экзогенная ДНК, интродуцированная в организм, действуют в первую очередь.

Исходя из этого, в общей схеме представлений о действии ЦФ и экзогенной ДНК на ККМ можно выделить два главных события. Во-первых, это образование ДЦР, как основных интермедиатов репарации МЦС. Во-вторых, это присутствие фрагментов экзогенной ДНК во внутриядерном пространстве в момент репарации этих разрывов в клетке.

В настоящее время в практике лечения онкологических заболеваний совместно с кросслинкирующими цитостатиками все чаще используют лейкостимулирующие препараты на основе ДНК (деринат, дезоксинат, полидан). Однако в современной литературе отсутствуют данные о возможных эффектах, которые может оказывать экзогенная ДНК, попадая в организм в момент воздействия цитостатика. Исследуя на мышах лейкостимулирующее действие экзогенной ДНК после миелосупрессии, вызванной ЦФ, было обнаружено следующее явление. Инъекции экзогенной ДНК в препаративных количествах на фоне предобработки ЦФ приводят к появлению характерного симптомокомплекса (набора специфических признаков заболевания мышей, проявляющихся в настоящих экспериментах) и гибели экспериментальных животных. В предлагаемой работе предпринята попытка подойти как можно ближе к пониманию механизмов, определяющих возникновение губительного для организма эффекта.

Цель и задачи работы

В рамках цели предлагаемой работы были поставлены следующие задачи:

5. Дать характеристику некоторым патологическим процессам, происходящим в клетках костного мозга при одновременном присутствии в ядерном пространстве двуцепочечных разрывов и фрагментов экзогенной ДНК: а) оценить количественные изменения умеренных повторов в геноме экспериментальных животных; б) определить уровень и длительность апоптоза клеток костного мозга в норме и при синергичном действии циклофосфана и препарата ДНК; в) охарактеризовать морфологические изменения хромосом, произошедшие в результате проведенных обработок; г) выявить изменения в различных популяциях клеток костного мозга, вызванные совместным действием циклофосфана и экзогенной ДНК.

Научная новизна

Положения, выносимые на защиту

Практическая значимость

Результаты проведенных исследований могут являться основанием для выбора безопасных временных параметров при использовании лейкостимулирующих препаратов на основе ДНК (деринат, дезоксинат, полидан) в терапевтической практике при лечении онкологических заболеваний с применением кросслинкирующих цитостатиков.

Апробация работы

Результаты работы представлены в материалах Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина и V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (21-27 июня 2009 года, Москва); XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (10-14 апреля 2010 года, Новосибирск); международной конференции Annual Main Meeting of Society for experimental Biology (1-4 июля 2011 года, Глазго, Великобритания); международной конференции 7th European Course and 11th Euroconference of ISAC-ICCS-ICyS-ESCCA Joint Meeting (13-17 сентября 2011 года, Дублин, Ирландия); международной конференции A Current Opinion in Structural Biology conference (1618 октября 2011 года, Амстердам, Нидерланды); 50-й юбилейной международной студентческой научной конференции «Студент и научно-технический прогресс» (13-19 апреля 2012 года, Новосибирск). По теме диссертации опубликовано 4 работы, из которых 3 работы в рецензируемом отечественном журнале и 1 работа в рецензируемом зарубежном журнале.

Вклад автора

Основные результаты были получены автором самостоятельно. Эксперименты, связанные с использованием лабораторных животных, проводились совместно с к.м.н. В.П. Николиным и к.б.н. Н.А. Поповой. Патологоанатомический анализ тканей и органов больных животных проводился совместно с к.б.н. О.С. Тарановым. Анализ мазков крови и костного мозга экспериментальных животных проводился при экспертной поддержке Т.Д. Дубатоловой.

Структура и объем работы

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Долгова, Евгения Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Экзогенная ДНК при совместном культивировании ex vivo достигает и депонируется в клетках костного мозга мышей. Одновременно во внутриклеточном пространстве клеток может находиться до 1800 т.п.н. экзогенной ДНК в виде фрагментов.

2. Инъекции мышам стандартного содержания экзогенной ДНК в сочетании с кросслинкирующим цитостатиком циклофосфаном индуцируют в стволовых клетках крови нарушения функциональной активности, характеризующиеся дегенеративными изменениями лимфоидного ряда кроветворения.

3. На фоне дегенеративных изменений лимфоидного ряда кроветворения и связанной с этим естественной активацией оппортунистической инфекции у мышей стандартного содержания развивается невосполнимое истощение лимфоидных органов. Возникает полиорганная недостаточность, приводящая к растянутой во времени гибели экспериментальных животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как известно, активно пролиферирующие ККМ являются одной из основных мишеней для действия алкилирующих цитостатиков, которые вызывают образование МЦС в молекулах ДНК клеток. Доза ЦФ 200 мг/кг приводит к обратимой миелосупрессии.

Ранее было показано, что при облучении мышей смертельной дозой у-радиации, вызывающей образование ДЦР в молекуле ДНК, и последующих инъекциях экзогенной ДНК мыши выживают (ЫкЬасЬеуа et а1, 2007Ь). Жизнеспособность мышей связана с сохранением СКК, которые впоследствии образуют селезеночные колонии, что способствует восстановлению кроветворной функции в организме. Предполагалось, что экзогенная ДНК попадает в ККМ и участвует в процессе репарации ДЦР таким образом, что целостность поврежденной хромосомы корректно восстанавливалась. Вышесказанное предполагало, что главной мишенью воздействия ЦФ и экзогенной ДНК на экспериментальных животных являются ККМ (СКК) в ядрах которых, как было подтверждено в настоящей работе, интернализуются фрагменты экзогенной ДНК.

Обязательным интермедиатом репарации МЦС являются ДЦР, которые возникают в течение Б фазы клеточного цикла, когда репликативная вилка останавливается в местах МЦС. При этом активируется репаративная машина, удаляющая нежелательные структуры из ядерного пространства. Репарация ДЦР в таком контексте идет по пути деликатной ГР, результатом чего является восстановление репликативной вилки со сменой лидирущей и отстающей цепей и последующее возобновление репликации.

При сравнении динамики образования и репарации ДЦР в ККМ после воздействия ЦФ и времени введения экзогенной ДНК, когда наблюдались появление характерного симптомокомплекса и гибель экспериментальных животных, оказалось, что инъекции ДНК должны затрагивать момент репарации ДЦР основного количества ККМ (СКК). Фрагменты экзогенной ДНК, присутствующие в ядерном пространстве ККМ в момент репарации ДЦР, нарушают корректных ход репаративного процесса. Предполагается, что фрагменты экзогенной ДНК активируют специфическую систему аварийного лигирования (Derbyshire et al., 1994; Lees-Miller, Meek, 2003; Lee et al., 2005; Wang et al., 2005), что приводит к несанкционированному объединению ДЦ концов. Это предположение подтверждают следующие полученные в работе факты. После инъекции мышам экзогенной ДНК в период репарации в течение 10 мин наблюдается двукратное снижение количества ККМ с ДЦР, то есть происходит практически мгновенная репарация повреждений, которая невозможна при использовании клеткой механизма ГР. Произошедшее стохастическое лигирование приводит к окончанию репликации и сохранению относительного количества умеренных повторов В1 и В2 в геноме мононуклеаров ККМ. При этом в контроле происходит достоверное уменьшение их количества, связанное с недорепликацией определенных участков генома вследствие остановленного в процессе корректной репарации ДЦР клеточного цикла.

При инъекциях экзогенной ДНК на фоне действия ЦФ наблюдается непрекращающийся интенсивный апоптоз ККМ, вероятно, являющийся следствием нарушений в структуре хромосом ККМ, о чем свидетельствуют результаты анализа структуры метафазных пластинок.

Анализ популяций ККМ мышей показал, что при используемой схеме обработок наблюдается длительное исчезновение популяции ККМ размером 12-20 нм, относящейся к предшественникам лимфоидного ряда. Одновременно с этим оказалось, что динамика восстановления количества CD34+ клеток у больных мышей не отличается от контроля. Один из вариантов объяснения полученных результатов предполагает временную потерю CD34+ ККМ способности дифференцироваться в лимфоидный росток крови в результате синергичного действия ЦФ и экзогенной ДНК.

Вместе приведенные данные и проведенный патоморфологический анализ тканей и органов животных, находящихся в агонистической стадии развития заболевания, выявили, что причиной гибели мышей является полиорганная недостаточность, вызванная системным воспалением и акцидентальной инволюцией лимфоидных органов.

Таким образом, экзогенная ДНК при ее появлении в чужеродном организме представляет собой не инертный материал, а субстанцию, влияющую на многие молекулярные и физиологические системы эукариотической клетки. Этот факт необходимо всегда помнить при осуществлении любых терапевтических процедур с использованием экзогенной ДНК. На наш взгляд, СБ34+ СКК остаются наиболее привлекательной моделью в исследованиях воздействия экзогенной ДНК на эукариотическую клетку. Это определяется легко достигаемым контактом указанного типа клеток с экзогенной ДНК. Кроме этого важным является многоплановый эффективный ответ указанного типа клеток на воздействие чужеродных фрагментов. Мы полагаем, что настоящая работа вызовет интерес и индуцирует работы в указанном направлении.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Долгова, Евгения Владимировна, Новосибирск

1. Алямкина Е.А., Лихачева A.C., Николин В.П. и др. Действие экзогенной ДНК, ассоциированной с протамином, на рост экспериментальных опухолей мыши // Вопросы онкологии. 2009. Т. 55. № 6. С. 765-768.

2. Афанасьев Ю.И., Кузнецов С.Л., Юрина H.A. и др. Гистология, цитология и эмбриология. М.: Медицина, 2004. С. 768.

3. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии и гистологической техники // 1971. М.: Медицина, 272 с.

4. Долгова Е.В., Рогачев В.А., Николин В.П. и др. Лейкостимулирующее действие фрагментов экзогенной ДНК, защищенных протамином, при вызванной циклофосфаном миелосупрессии мышей // Вопросы онкологии. 2009. Т. 55. № 6. С. 761-764.

5. Долгова Е.В., Лихачева A.C., Орищенко К.Е. и др. Репарация межцепочечных сшивок молекулы ДНК // Вестник ВОГиС. 2010. Т. 14. № 2. С. 332-356.

6. Кимиссаренко C.B., Лукинов Д.И., Черепенко Е.И. Биосинтез различных классов последовательностей ядерной ДНК при пролиферации клеток мышинной плазмоцитомы МОРС-21 // Биополимеры и клетка. 1986. Т. 2. № 4. С. 220-23.

7. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. 2000. Т. 65. № 1. С. 5-33.

8. Лихачева A.C., Рогачев В.А., Николин В.П. и др. Участие экзогенной ДНК в молекулярных процессах, протекающих в соматической клетке // Вестник ВОГиС. 2008. Т. 12. № 3. С. 426-473.

9. Макгрегор Г., Варли Д. Методы работы с хромосомами животных. М.: Мир, 1986. С. 268.

10. Маниатис Е., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М.: Мир, 1984. С. 480.

11. Мейл Д., Бростофф Д., Рот Д.Б. и др. Иммунология. М.: Логосфера, 2007. С. 568.

12. Николин В.П., Попова Н.А., Себелева Т.Е. и др. Влияние экзогенной ДНК на восстановление лейкопоэза и противоопухолевый эффект циклофосфана // Вопросы онкологии. 2006. Т. 52. № 3. С. 336-340.

13. Проскуряков С.Я., Гавай В.П., Коноплянников А.Г. Иммунология некроза и апоптоза // Биохимия. 2005. Т. 70. № 7. С. 557-567.

14. Рыкова Е.Ю., Лактионов П.П., Власов В.В. Активирующее влияние ДНК на иммунную систему//Успехи современной биологии. 2001. Т. 121. С. 160-171.

15. Хегай И.И., Богачев С.С., Оськина И.Н. и др. Изменение симптоматики гипоталамического несахарного диабета после воздействия гомологической экзогенной ДНК // Докл. РАН. 2004. Т. 394. № 4. С. 571-573.

16. Челобанов Б.П., Лактионов П.П., Власов В.В. Белки, участвующие в связывании и поглощении клетками нуклеиновых кислот // Биохимия. 2006. Т. 71. №6. С. 725-741.

17. Шестова О.Е., Андреева А.Ю., Власов В.В. и др. Транспорт комплексов олигонуклеотидов с белками клеточной поверхности в клеточное ядро // Докл. РАН. 1999. Т.1368. № 3. С. 264-267.

18. Якубов Л.А., Петрова Н.А., Попова Н.А. и др. Роль экстраклеточной ДНК в поддержании постоянства и изменчивости клеточных геномов // Докл. РАН. . 2002. Т. 382. № 3. С. 406-410.

19. Abrams R.A., McCormack К., Bowles С. et al. Cyclophosphamide treatment expands the circulating hematopoietic stem cell pool in dogs // J Clin Invest. 1981. V. 67. № 5. p. 1392-1399.

20. Adair G.M., Rolig R.L., Moore-Faver D. et al. Role of ERCC1 in removal of long non-homologous tails during targeted homologous recombination // Embo J. 2000. V. 19. №20. P. 5552-5561.

21. Akkari Y.M., Bateman R.L., Reifsteck C.A. et al. The 4N cell cycle delay in Fanconi anemia reflects growth arrest in late S phase // Mol Genet Metab. 2001. V. 74. №4. P. 403-412.

22. Akkari Y.M., Bateman R.L., Reifsteck C.A. et al. DNA replication is required To elicit cellular responses to psoralen-induced DNA interstrand cross-links // Mol Cell Biol. 2000. V. 20. № 21. P. 8283-8289.

23. Amyere M., Mettlen M., Van Der Smissen P. et al. Origin, originality, functions, subversions and molecular signalling of macropinocytosis // Int J Med Microbiol. 2002. V. 291. № 6-7. P. 487-494.

24. Andrews N.W. Membrane repair and immunological danger // EMBO Rep. 2005. V. 6. № 9. P. 826-830.

25. Arnaudeau C., Lundin C., Helleday T.J. DNA double-strand breaks associated with replication forks are predominantly repaired by homologous recombination involving an exchange mechanism in mammalian cells // Mol Biol. 2001. V. 307. № 5. P. 1235-1245.

26. Anker P., Jachertz D., Stroun M. et al. The role of extracellular DNA in the transfer of information from T to B human lymphocytes in the course of an immune response // J Immunogenet. 1980. V. 7. № 6. P. 475-481.

27. Ayares D., Chekuri L., Song K.Y. et al. Sequence homology requirements for intermolecular recombination in mammalian cells // Proc Natl Acad Sei USA. 1986. V. 83. № 14. P. 5199-5203.

28. Barber G.N. Cytoplasmic DNA innate immune pathways // Immunol Rev. 2011. V. 243. № l.P. 99-108.

29. Bartek J., Lukas J. DNA damage checkpoints: from initiation to recovery or adaptation // Curr Opin Cell Biol. 2007. V. 19. № 2. P. 238-45.

30. Bartsch S., Kang L.E., Symington L.S. RAD51 is required for the repair of plasmid double-stranded DNA gaps from either plasmid or chromosomal templates // Mol Cell Biol. 2000. V. 20. № 4. P. 1194-1205.

31. Bennett C.B., Lewis A.L., Baldwin K.K. et al. Lethality induced by a single site-specific double-strand break in a dispensable yeast plasmid // Proc Natl Acad Sei USA. 1993. V. 90. № 12. P. 5613-5617.

32. Bergsmedh A., Szeles A., Henriksson M. et al. Horizontal transfer of oncogenes by uptake of apoptotic bodies // Proc Natl Acad Sei USA. 2001. V. 98. № 11. P. 64076411.

33. Bergsmedh A., Szeles A., Spetz A.L. et al. Loss of the p21(Cipl/Wafl) cyclin kinase inhibitor results in propagation of horizontally transferred DNA // Cancer Res. 2002. V. 62. № 2. P. 575-579.

34. Bhagwat N., Olsen A.L., Wang A.T. et al. XPF-ERCC1 participates in the Fanconi anemia pathway of cross-link repair // Mol Cell Biol. 2009. V. 29. № 24. P. 64276437.

35. Bischoff F.Z., Lewis D.E., Simpson J.L. Cell-free fetal DNA in maternal blood: kinetics, source and structure // Hum Reprod Update. 2005. V. 11. № 1. P. 59-67.

36. Branzei D., Foiani M. Template switching: from replication fork repair to genome rearrangements // Cell. 2007. V. 131. № 7. P. 1228-1230.

37. Buckley R.H. Primary immunodeficiency diseases due to defects in lymphocytes // N Engl J Med. 2000. V. 343. № 18. P. 1313-1324.

38. Budker V., Budker T., Zhang G. et al. Hypothesis: naked plasmid DNA is taken up by cells in vivo by a receptor-mediated process // J Gene Med. 2000. V. 2. № 2. P. 76-88.

39. Camenisch U., Dip R., Schumacher S.B. et al. Recognition of helical kinks by xeroderma pigmentosum group A protein triggers DNA excision repair // Nat Struct Mol Biol. 2006. V. 13. № 3. P. 278-284.

40. Cannistraro V.J., Taylor J.S. Ability of polymerase eta and T7 DNA polymerase to bypass bulge structures // J Biol Chem. 2007. V. 282. № 15. P. 11188-11196.

41. Cerqueira A., Santamaría D., Martinez-Pastor B. et al. Overall Cdk activity modulates the DNA damage response in mammalian cells // J Cell Biol. 2009. V. 187. №6. P. 773-780.

42. Chung J.H., Bunz F. Cdk2 is required for p53-independent G2/M checkpoint control // PLoS Genet. 2010. V. 6. № 2. P. el000863.

43. Coban C., Koyama S., Takeshita F. et al. Molecular and cellular mechanisms of DNA vaccines // Hum Vaccin. 2008. V. 4. № 6. P. 453-456.

44. Cook R., Wu C.C., Kang Y.J. et al. The role of the p38 pathway in adaptive immunity // Cell Mol Immunol. 2007. V. 4. № 4. P. 253-259.

45. Crisp M., Liu Q., Roux K. et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex // J Cell Biol. 2006. V. 172. № 1. P. 41-53.

46. Dalbies R., Payet D., Leng M. DNA double helix promotes a linkage isomerization reaction in trans-diamminedichloroplatinum(II)-modified DNA // Proc Natl Acad Sei USA. 1994. V. 91. № 17. P. 8147-8151.

47. De Silva I.U., McHugh P.J., Clingen P.H. et al. Defining the roles of nucleotide excision repair and recombination in the repair of DNA interstrand cross-links in mammalian cells // Mol Cell Biol. 2000. V. 20. № 21. P. 7980-7990.

48. De Silva I.U., McHugh P.J., Clingen P.H. et al. Defects in interstrand cross-link uncoupling do not account for the extreme sensitivity of ERCC1 and XPF cells to cisplatin // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. № 17. P. 3848-3856.

49. Decker P., Wolburg H., Rammensee H.G. Nucleosomes induce lymphocyte necrosis // Eur J Immunol. 2003. V. 33. № 7. P. 1978-1987.

50. Deng C., Capecchi M.R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus // Mol Cell Biol. 1992. V. 12. № 8. P. 3365-3371.

51. Derbyshire M.K., Epstein L.H., Young C.S. et al. Nonhomologous recombination in human cells //Mol Cell Biol. 1994. V. 14. № 1. P. 156-169.

52. Dronkert M.L., Kanaar R. Repair of DNA interstrand cross-links // Mutat Res. 2001. V. 486. № 4. P. 217-247.

53. Ellenberger T., Tomkinson A.E. Eukaryotic DNA ligases: structural and functional insights // Annu Rev Biochem. 2008. V. 77. № P. 313-338.

54. Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death // Toxicol Pathol. 2007. V. 35. №4. P. 495-516.

55. Escarceller M., Buchwald M., Singleton B.K. et al Fanconi anemia C gene product plays a role in the fidelity of blunt DNA end-joining // J Mol Biol. 1998. V. 279. № 2. P. 375-385.

56. Evans E., Fellows J., Coffer A. et al Open complex formation around a lesion during nucleotide excision repair provides a structure for cleavage by human XPG protein // Embo J. 1997. V. 16. № 3. P. 625-638.

57. Falck J., Mailand N., Syljuasen R.G. et al The ATM-Chk2-Cdc25A checkpoint pathway guards against radioresistant DNA synthesis // Nature. 2001. V. 410. № 6830. P. 842-847.

58. Filaci G., Gerloni M., Rizzi M. et al Spontaneous transgenesis of human B lymphocytes // Gene Ther. 2004. V. 11. № 1. P. 42-51.

59. Fleming R.A. An overview of cyclophosphamide and ifosfamide pharmacology // Pharmacotherapy. 1997. V. 17. № 5 Pt 2. P. 146S-154S.

60. Fugmann S.D. RAG1 and RAG2 in V(D)J recombination and transposition // Immunol Res. 2001. V. 23. № 1. P. 23-39.

61. Garcia-Olmo D., Garcia-Olmo D.C., Ontanon J. et al Horizontal transfer of DNA and the "genometastasis hypothesis" // Blood. 2000. V. 95. № 2. P. 724-725.

62. Gatei M., Jakob B., Chen P. et al ATM Protein-dependent Phosphorylation of Rad50 Protein Regulates DNA Repair and Cell Cycle Control // J Biol Chem. 2011. V. 286. № 36. P. 31542-31556.

63. Gormally E., Caboux E., Vineis P., et al Circulating free DNA in plasma or serum as biomarker of carcinogenesis: practical aspects and biological significance // Mutat Res. 2007.V. 635. № 2-3. P. 105-117.

64. Gottlieb T.A., Ivanov I.E., Adesnik M. et al Actin microfilaments play a critical role in endocytosis at the apical but not the basolateral surface of polarized epithelial cells // J Cell Biol. 1993. V. 120. № 3. P. 695-710.

65. Gupta A., Sharma G.G., Young C.S. et al. Involvement of human MOF in ATM function // Mol Cell Biol. 2005. V. 25. № 12. P. 5292-5305.

66. Guzder S.N., Habraken Y., Sung P. et al. Reconstitution of yeast nucleotide excision repair with purified Rad proteins, replication protein A, and transcription factor TFIIH // J Biol Chem. 1995. V. 270. № 22. P. 12973-12976.

67. Hamlin J.L. Mammalian origins of replication // Bioessays. 1992. V. 14. № 10. P. 651-9.

68. Hanada K., Budzowska M., Modesti M. et al. The structure-specific endonuclease Mus81-Emel promotes conversion of interstrand DNA crosslinks into doublestrands breaks // Embo J. 2006. V. 25. № 20. P. 4921-4932.

69. Hanss B., Leal-Pinto E., Bruggeman L.A. et al. Identification and characterization of a cell membrane nucleic acid channel // Proc Natl Acad Sci USA. 1998. V. 95. № 4. P. 1921-1926.

70. Hartwell L.H., Weinert T.A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events // Science. 1989. V. 246. № 4930. P. 629-634.

71. Harty J.T., Tvinnereim A.R., White D.W. CD8+ T cell effector mechanisms in resistance to infection // Annu Rev Immunol. 2000. V. 18. № P. 275-308.

72. Hashizume T., Shimizu N. Dissection of mammalian replicators by a novel plasmid stability assay // J Cell Biochem. 2007. V. 101. № 3. P. 552-565.

73. Hastings P.J., Ira G., Lupski J.R. A microhomology-mediated break-induced replication model for the origin of human copy number variation // PLoS Genet. 2009. V. 5. № 1. P. el000327.

74. Hastings P.J., McGill C., Shafer B. et al. Ends-in vs. ends-out recombination in yeast// Genetics. 1993. V. 135. № 4. P. 973-980.

75. Hebert E. Improvement of exogenous DNA nuclear importation by nuclear localization signal-bearing vectors: a promising way for non-viral gene therapy? // Biol Cell. 2003. V. 95. № 2. P. 59-68.

76. Hefeneider S.H., Bennett R.M., Pham T.Q. et al. Identification of a cell-surface DNA receptor and its association with systemic lupus erythematosus // The Journal of investigative dermatology. 1990. V. 94. № 6 Suppl. P. 79S-84S.

77. Helleday T. Pathways for mitotic homologous recombination in mammalian cells // Mutat Res. 2003. V. 532. № 1-2. P. 103-115.

78. Herrik J. Genetic variation and DNA replication timing, or why is there late replicating DNA? // Evolution. 2011. V. 65 № 11. P. 3031-47.

79. Herz J., Strickland D.K. LRP: a multifunctional scavenger and signaling receptor // J Clin Invest. 2001. V. 108. № 6. P. 779-784.

80. Hiom K. DNA repair: how to PIKK a partner //Curr Biol. 2005. V. 15. № 12. R473-5.

81. Holmquist G.P., Caston L.A. Replication time of interspersed repetitive DNA sequences in hamsters // Biochim Biophys Acta. 1986. V. 868. № 2-3. P. 164-77.

82. Holmgren L., Szeles A., Rajnavolgyi E. et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies // Blood. 1999. V. 93. № 11. P. 3956-3963.

83. Huang L.C., Clarkin K.C., Wahl G.M. Sensitivity and selectivity of the DNA damage sensor responsible for activating p53-dependent Gl arrest // Proc Natl Acad Sei USA. 1996. V. 93. № 10. P. 4827-4832.

84. Huertas P. DNA resection in eukaryotes: deciding how to fix the break // Nat Struct Mol Biol. 2010. V. 17. № 1. P. 11-16.

85. Ikura T., Ogryzko V.V., Grigoriev M. et al. Involvement of the TIP60 histone acetylase complex in DNA repair and apoptosis // Cell. 2000. V. 102. № 4. P. 463473.

86. Ishiai M., Kimura M., Namikoshi K. et al. DNA cross-link repair protein SNM1A interacts with PIAS1 in nuclear focus formation // Mol Cell Biol. 2004. V. 24. № 24. P. 10733-10741.

87. Ishii K.J., Akira S. Innate immune recognition of, and regulation by, DNA // Trends Immunol. 2006. V. 27. № 11. P. 525-532.

88. Johnson R.D., Jasin M. Sister chromatid gene conversion is a prominent doublestrand break repair pathway in mammalian cells // Embo J. 2000. V. 19. № 13. P. 3398-3407.

89. Johnstone A.P., Williams G.T. Role of DNA breaks and ADP-ribosyl transferase activity in eukaryotic differentiation demonstrated in human lymphocytes // Nature. 1982. V. 300. № 5890. P. 368-370.

90. Jones C.J., Wood R.D. Preferential binding of the xeroderma pigmentosum group A complementing protein to damaged DNA // Biochemistry. 1993. V. 32. № 45. P. 12096-12104.

91. Karle P., Renner M., Salmons B. et al. Necrotic, rather than apoptotic, cell death caused by cytochrome P450-activated ifosfamide // Cancer gene therapy. 2001. V. 8. № 3. P. 220-230.

92. Kaufmann S.H., Schaible U.E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections // Curr Opin Immunol. 2005. V. 17. № 1. P. 79-87.

93. Khalil I.A., Kogure K., Akita H. et al. Uptake pathways and subsequent intracellular trafficking in nonviral gene delivery // Pharmacol Rev. 2006. V. 58. № 1. P. 32-45.

94. Kimura A., Horikoshi M. Tip60 acetylates six lysines of a specific class in core histones in vitro // Genes Cells. 1998. V. 3. № 12. P. 789-800.

95. Krieg A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects // Annu Rev Immunol. 2002. V. 20. P. 709-760.

96. Krishan A. Rapid flow cytofluorometric analysis of mammalian cell cycle by propidium iodide staining // J Cell Biol. 1975. V. 66. N 1. P. 188-193.

97. Kohzaki M., Hatanaka A., Sonoda E. et al. Cooperative roles of vertebrate Fbhl and Bim DNA helicases in avoidance of crossovers during recombination initiated by replication fork collapse // Mol Cell Biol. 2007. V. 27. № 8. P. 2812-2820.

98. Kotnis A., Du L., Liu C. et al. Non-homologous end joining in class switch recombination: the beginning of the end // Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 2009. V. 364. № 1517. P. 653665.

99. Kramerov D.A., Vassetzky N.S. Short retroposons in eukaryotic genomes // Int Rev Cytol. 2005. V. 247: 165-221

100. Krasikova Y.S., Rechkunova N.I., Maltseva E.A. et al. Interaction of nucleotide excision repair factors XPC-HR23B, XPA, and RPA with damaged DNA // Biochemistry (Mosc). 2008. V. 73. № 8. P. 886-896.

101. Krasnoshtein F., Buchwald M. Developmental expression of the Fac gene correlates with congenital defects in Fanconi anemia patients // Hum Mol Genet. 1996. V. 5. № l.P. 85-93.

102. Krayev A.S., Kramerov D.A., Skryabin K.G. et al. The nucleotide sequence of the ubiquitous repetitive DNA sequence B1 complementary to the most abundant class of mouse fold-back RNA // Nucleic Acids Res. 1980. V. 8. № 6. P. 1201-1215.

103. Kucherlapati R.S., Eves E.M., Song K.Y. et al. Homologous recombination between plasmids in mammalian cells can be enhanced by treatment of input DNA // Proc Natl Acad Sci USA. 1984. V. 81. № 10. P. 3153-3157.

104. Kuraoka I., Kobertz W.R., Ariza R.R. et al. Repair of an interstrand DNA cross-link initiated by ERCC1-XPF repair/recombination nuclease // J Biol Chem. 2000. V. 275. № 34. P. 26632-26636.

105. Langerak P., Russell P. Regulatory networks integrating cell cycle control with DNA damage checkpoints and double-strand break repair // Phil. Trans. R. Soc. 2011. V. 366. P. 3562-3571.

106. Langston L.D., Symington L.S. Gene targeting in yeast is initiated by two independent strand invasions // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. V. 101. № 43. P. 15392-15397.

107. Larminat F., Germanier M., Papouli E. et al. Deficiency in BRCA2 leads to increase in non-conservative homologous recombination // Oncogene. 2002. V. 21. № 33. P. 5188-5192.

108. Lawen A. Apoptosis-an introduction // Bioessays. 2003. V. 25. № 9. P. 888-896.

109. Leal-Pinto E., Teixeira A., Tran B. et al. Presence of the nucleic acid channel in renal brush-border membranes: allosteric modulation by extracellular calcium // American Journal of Physiology. 2005. V. 289. № 1. P. 97-106.

110. Le Breton C., Hennion M., Arimondo P.B. et al. Replication-fork stalling and processing at a single psoralen interstrand crosslink in Xenopus egg extracts // PloS one. 2011. V. 6. № 4. P. el8554.

111. Lee J.M., Bernstein A. Apoptosis, cancer and the p53 tumour suppressor gene // Cancer metastasis reviews. 1995. V. 14. № 2. P. 149-161.

112. Lee S.H., Oshige M., Durant S.T. et al. The SET domain protein Metnase mediates foreign DNA integration and links integration to nonhomologous end-joining repair // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. V. 102. № 50. P. 18075-18080.

113. Lees-Miller S.P., Meek K. Repair of DNA double strand breaks by non-homologous end joining // Biochimie. 2003. V. 85. № 11. P. 1161-1173.

114. Lekstrom-Himes J.A., Gallin J.I. Immunodeficiency diseases caused by defects in phagocytes //NEngl J Med. 2000. V. 343. № 23. P. 1703-1714.

115. Leung W., MalkoVa A., Haber J.E. Gene targeting by linear duplex DNA frequently occurs by assimilation of a single strand that is subject to preferential mismatch correction // Proc Natl Acad Sci USA. 1997. V. 94. № 13. P. 6851-6856.

116. Li J., Read L.R., Baker M.D. The mechanism of mammalian gene replacement is consistent with the formation of long regions of heteroduplex DNA associated with two crossing-over events // Mol Cell Biol. 2001. V. 21. № 2. P. 501-510.

117. Li L., Peterson C.A., Lu X. et al. Mutations in XPA that prevent association with ERCC1 are defective in nucleotide excision repair // Mol Cell Biol. 1995. V. 15. № 4. P. 1993-1998.

118. Lieber M.R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the -nonhomologous DNA end-joining pathway // Annu Rev Biochem. 2010. V. 79. № P. 181-211.

119. Likhacheva A.S., Nikolin V.P., Popova N.A. et al. Exogenous DNA can be captured by stem cells and be involved in their rescue from death after lethal-dose -radiation // Gene Therapy and Molecular Biology. 2007b. V. 11. № P. 305-314.

120. Lin J., Krishnaraj R., Kemp R.G. Exogenous ATP enhances calcium influx in intact thymocytes // J Immunol. 1985. V. 135. № 5. P. 3403-3410.

121. Lin Y., Waldman A.S. Capture of DNA sequences at double-strand breaks in mammalian chromosomes // Genetics. 2001. V. 158. № 4. P. 1665-1674.

122. Lisby M., Barlow J.H., Burgess R.C. et al. Choreography of the DNA damage response: spatiotemporal relationships among checkpoint and repair proteins // Cell. 2004. V. 118. №6. P. 699-713.

123. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H. et al. Characterization of oligonucleotide transport into living cells // Proc Natl Acad Sei USA. 1989. V. 86. № io. P. 34743478.

124. Ludtke J.J., Zhang G., Sebestyen M.G. et al. A nuclear localization signal can enhance both the nuclear transport and expression of 1 kb DNA // J Cell Sei. 1999. V. 112 (Pt 12). № P. 2033-2041.

125. Luo D., Woodrow-Mumford K., Belcheva N. et al. Controlled DNA delivery systems // Pharm Res. 1999. V. 16. № 8. P. 1300-1308.

126. MacDougall C.A., Byun T.S., Van C. et al. The structural determinants of checkpoint activation // Genes Dev. 2007. V. 21. № 8. P. 898-903.

127. Mahaney B.L., Meek K., Lees-Miller S.P. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining // Biochem J. 2009. V. 417. №3. P. 639-650.

128. Maltseva E.A., Rechkunova N.I., Petruseva I.O. et al. Crosslinking of nucleotide excision repair proteins with DNA containing photoreactive damages // Bioorg Chem. 2008. V. 36. № 2. P. 77-84.

129. Martin D.A., Elkon K.B. Intracellular mammalian DNA stimulates myeloid dendritic cells to produce type I interferons predominantly through a toll-like receptor 9-independent pathway // Arthritis Rheum. 2006. V. 54. № 3. P. 951-962.

130. Medzhitov R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response // Nature. 2007. V. 449. № 7164. P. 819-826.

131. Merrell D.S., Falkow S. Frontal and stealth attack strategies in microbial pathogenesis //Nature. 2004. V. 430. № 6996. P. 250-256.

132. Miller D.G., Petek L.M., Russell D.W. Human gene targeting by adeno-associated virus vectors is enhanced by DNA double-strand breaks // Mol Cell Biol. 2003. V. 23. № 10. P. 3550-3557.

133. Monack D.M., Mueller A., Falkow S. Persistent bacterial infections: the interface of the pathogen and the host immune system // Nat Rev Microbiol. 2004. V. 2. № 9. P. 747-765.

134. Mondal T.K., Bhatta D., Ray P.K. et al. Synergistic immunopotentiating effects induced by T-cell and B-cell superantigen in mice // Immunol Invest. 2001. V. 30. № 3. P. 169-180.

135. Mu D., Bessho T., Nechev L.V. et al. DNA interstrand cross-links induce futile repair synthesis in mammalian cell extracts // Mol Cell Biol. 2000. V. 20. № 7. P. 2446-2454.

136. Mu D., Hsu D.S., Sancar A. Reaction mechanism of human DNA repair excision nuclease // J Biol Chem. 1996. V. 271. № 14. P. 8285-8294.

137. Mu D., Park C.H., Matsunaga T. et al. Reconstitution of human DNA repair excision nuclease in a highly defined system // J Biol Chem. 1995. V. 270. № 6. P. 2415-2418.

138. Munkonge F.M., Dean D.A., Hillery E. et al. Emerging significance of plasmid DNA nuclear import in gene therapy // Adv Drug Deliv Rev. 2003. V. 55. № 6. P. 749-760.

139. Napirei M., Karsunky H., Zevnik B. et al. Features of systemic lupus erythematosus in Dnasel-deficient mice // Nat Genet. 2000. V. 25. № 2. P. 177-181.

140. Niedernhofer L.J., Odijk H., Budzowska M. et al. The structure-specific endonuclease Erccl-Xpf is required to resolve DNA interstrand cross-link-induced double-strand breaks // Mol Cell Biol. 2004. V. 24. № 13. p. 5776-5787.

141. O'Donovan A., Davies A.A., Moggs J.G. et al. XPG endonuclease makes the 3' incision in human DNA nucleotide excision repair // Nature. 1994. V. 371. № 6496. P. 432-435.

142. Ondrej V., Lukasova E., Krejci J. et al. Intranuclear trafficking of plasmid DNA is mediated by nuclear polymeric proteins lamins and actin // Acta biochimica Polonica. 2008. V. 55. № 2. P. 307-315.

143. Orkin S.H., Zon L.I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology // Cell. 2008. V. 132. № 4. P. 631-644.

144. Orr-Weaver T.L., Szostak J.W., Rothstein RJ. Yeast transformation: a model system for the study of recombination // Proc Natl Acad Sci USA. 1981. V. 78. №10. P. 6354-6358.

145. Paques F., Haber J.E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae // Microbiol Mol Biol Rev. 1999. V. 63. № 2. P. 349-404.

146. Park C.H., Bessho T., Matsunaga T. et al. Purification and characterization of the XPF-ERCC1 complex of human DNA repair excision nuclease // J Biol Chem. 1995. V. 270. № 39. P. 22657-22660.

147. Park C.H., Sancar A. Formation of a ternary complex by human XPA, ERCC1, and ERCC4(XPF) excision repair proteins // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. V. 91. №11. P. 5017-5021.

148. Perucho M., Hanahan D., Wigler M. Genetic and physical linkage of exogenous sequences in transformed cells // Cell. 1980. V. 22. № 1 Pt 1. P. 309-317.

149. Perucho M., Wigler M. Linkage and expression of foreign DNA in cultured animal cells // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1981. V. 45 Pt 2. № P. 829-838.

150. Pinkel D., Straume T., Gray J.W. Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization // Proc Natl Acad Sci USA. 1986. V. 83. № 9. P. 2934-2938.

151. Porteus M.H., Cathomen T., Weitzman M.D. et al. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks // Mol Cell Biol. 2003. V. 23. № 10. P. 3558-3565.

152. Ravetch J.V. A full complement of receptors in immune complex diseases // J Clin Invest. 2002. V. 110. № 12. P. 1759-1761.

153. Raynard S., Niu H., Sung P. DNA double-strand break processing: the beginning of the end // Genes Dev. 2008. V. 22. № 21. P. 2903-2907.

154. Reardon J.T., Spielmann P., Huang J.C. et al. Removal of psoralen monoadducts and crosslinks by human cell free extracts // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. № 17. P. 4623-4629.

155. Reddy Y.V., Perkins E.J., Ramsden D.A. Genomic instability due to V(D)J recombination-associated transposition // Genes Dev. 2006. V. 20. № 12. P. 15751582.

156. Reinhardt H.C., Yaffe M.B. Kinases that control the cell cycle in response to DNA damage: Chkl, Chk2, and MK2 // Current opinion in cell biology. 2009. V. 21. № 2. P. 245-255.

157. Rodrigue A., Lafrance M., Gauthier M.C. et al. Interplay between human DNA repair proteins at a unique double-strand break in vivo // Embo J. 2006. V. 25. № 1. P. 222-231.

158. Rogachev V.A., Likhacheva A., Vratskikh O. et al. Qualitative and quantitative characteristics of the extracellular DNA delivered to the nucleus of a living cell // Cancer Cell Int. 2006. V. 6. № P. 23.

159. Rogakou E.P., Boon C., Redon C. et al. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo // J Cell Biol. 1999. V. 146. № 5. P. 905-916.

160. Robert D.B. // Drosophila: a practical approach. M.: 1986. P. 295

161. Rosen F.S., Cooper M.D., Wedgwood R.J. The primary immunodeficiencies // N -Engl J Med. 1995. V. 333. №> 7. p. 431-440.

162. Rossi D.J., Jamieson C.H., Weissman I.L. Stems cells and the pathways to aging and cancer // Cell. 2008. V. 132. № 4. P. 681-696.

163. Rothfuss A., Grompe M. Repair kinetics of genomic interstrand DNA cross-links: evidence for DNA double-strand break-dependent activation of the Fanconi anemia/BRCA pathway // Molecular and cellular biology. 2004. V. 24. № 1. P. 123134.

164. Rouse B.T., Suvas S. Regulatory cells and infectious agents: detentes cordiale and contraire // J Immunol. 2004. V. 173. № 4. P. 2211-2215.

165. Rubnitz J., Subramani S. The minimum amount of homology required for homologous recombination in mammalian cells // Mol Cell Biol. 1984. V. 4. № 11. P. 2253-2258.

166. Saijo M., Kuraoka I., Masutani C. et al Sequential binding of DNA repair proteins RPA and ERCC1 to XPA in vitro // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. № 23. P. 47194724.

167. Salem M.L., El-Naggar S.A., Cole D.J. Cyclophosphamide induces bone marrow to yield higher numbers of precursor dendritic cells in vitro capable of functional antigen presentation to T cells in vivo // Cell Immunol. 2010. V. 261. № 2. P. 134143.

168. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. M.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. C.

169. Sargent R.G., Rolig R.L., Kilburn A.E. et al Recombination-dependent deletion formation in mammalian cells deficient in the nucleotide excision repair gene ERCC1 // Proc Natl Acad Sci USA. 1997. V. 94. № 24. P. 13122-13127.

170. Savill J., Fadok V., Henson P. et al Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis // Immunol Today. 1993. V. 14. № 3. P. 131-136.

171. Serdobova I.M., Kramerov D.A. Short retroposons of the B2 superfamily: evolution and application for the study of rodent phylogeny // J Mol Evol. 1998. V. 46. № 2. P. 202-214.

172. Sharma S., Choudhary B., Raghavan S.C. Efficiency of nonhomologous DNA end joining varies among somatic tissues, despite similarity in mechanism // Cellular and molecular life sciences : CMLS. 2011. V. 68. № 4. P. 661-676.

173. Sharma S., Raghavan S.C. Nonhomologous DNA end joining in cell-free extracts // Journal of nucleic acids. 2010. V. 2010. № P.

174. Shi F., Gounko N.V., Wang X. et al In situ entry of oligonucleotides into brain cells can occur through a nucleic acid channel // Oligonucleotides. 2007. V. 17. № l.P. 122-133.

175. Shibata A., Barton O., Noon A.T. et al Role of ATM and the damage response mediator proteins 53BP1 and MDC1 in the maintenance of G(2)/M checkpoint arrest // Mol Cell Biol. 2010. V. 30. № 13. P. 3371-3383.

176. Shimizu N., Hashizume T., Shingaki K. et al. Amplification of plasmids containing a mammalian replication initiation region is mediated by controllable conflict between replication and transcription // Cancer Res. 2003. V. 63. № 17. P. 52815290.

177. Shimura T., Torres M.J., Martin M.M. et al. Bloom's syndrome helicase and Mus81 are required to induce transient double-strand DNA breaks in response to DNA replication stress // J Mol Biol. 2008. V. 375. № 4. P. 1152-1164.

178. Shirota H., Ishii K.J., Takakuwa H. et al. Contribution of interferon-beta to the immune activation induced by double-stranded DNA // Immunology. 2006. V. 118. № 3. P. 302-310.

179. Shrivastav M., De Haro L.P., Nickoloff J.A. Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice // Cell Res. 2008. V. 18. № 1. P. 134-47.

180. Silva J., Smith A. Capturing pluripotency // Cell. 2008. V. 132. № 4. P. 532-536.

181. Smeaton M.B., Hlavin E.M., McGregor Mason T. et al. Distortion-dependent unhooking of interstrand cross-links in mammalian cell extracts // Biochemistry. 2008. V. 47. № 37. P. 9920-9930.

182. Smith A.J., Berg P. Homologous recombination between defective neo genes in mouse 3T6 cells // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1984. V. 49. № P. 171-181.

183. Smith K. Theoretical mechanisms in targeted and random integration of transgene DNA // Reproduction, nutrition, development. 2001. V. 41. № 6. P. 465-485.

184. Stanyon, R., Galleni, R. A rapid fibroblast culture technique for high resolution karyotypes // Ital. J. Zool. 1991. - V. 58. - N 1. - P. 81-83.

185. Storici F., Bebenek K., Kunkel T.A. et al. RNA-templated DNA repair // Nature. 2007. V. 447. № 7142. P. 338-341.

186. Stracker T.H., Usui T., Petrini J.H. Taking the time to make important decisions: the checkpoint effector kinases Chkl and Chk2 and the DNA damage response // DNA repair. 2009. V. 8. № 9. P. 1047-1054.

187. Syljuasen R.G., Sorensen C.S., Hansen L.T. et al. Inhibition of human Chkl causes increased initiation of DNA replication, phosphorylation of ATR targets, and DNA breakage // Mol Cell Biol. 2005. V. 25. № 9. P. 3553-3562.

188. Symington L.S. Focus on recombinational DNA repair // EMBO Rep. 2005. V. 6. №6. P. 512-517.

189. Takeshita F., Ishii K.J. Intracellular DNA sensors in immunity // Curr Opin Immunol. 2008. V. 20. № 4. P. 383-388.

190. Tamkovich S.N., Litviakov N.V., Bryzgunova O.E., et al. Cell-surface-bound circulating DNA as a prognostic factor in lung cancer // Ann N Y Acad Sci. 2008. V. 1137. P. 214-217.

191. Taghian D.G., Nickoloff J.A. Chromosomal double-strand breaks induce gene conversion at high frequency in mammaliancells // Mol Cell Biol. 1997. V. 17. № 11. P. 6386-6393.

192. Thomas K.R., Folger K.R., Capecchi M.R. High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome // Cell. 1986. V. 44. № 3. P. 419-428.

193. Thomas K.R., Deng C., Capecchi M.R. High-fidelity gene targeting in embryonic -stem cells by using sequence replacement vectors // Mol Cell Biol. 1992. V. 12. № 7. P. 2919-2923.

194. Vassetzky N.S., Ten O.A., Kramerov D.A. B1 and related SINEs in mammalian genomes // Gene. 2003. V. 319. P. 149-160.

195. Vatolin S.Y., Okhapkina E.V., Matveeva N.M. et al. Scheduled perturbation in DNA during in vitro differentiation of mouse embryo-derived cells // Mol Reprod Dev. 1997. V. 47. № 1. P. 1-10.

196. Vlassov V.V., LaktionovP.P., RykovaE.Y. Extracellularnucleic acids//Bioessays. 2007. V. 29. № 7. P. 654-667.

197. Volker M., Mone M.J., Karmakar P. et al. Sequential assembly of the nucleotide excision repair factors in vivo // Mol Cell. 2001. V. 8. № 1. P: 213-224.

198. Wang H., Rosidi B., Perrault R. et al. DNA ligase III as a candidate component of backup pathways of nonhomologous end joining // Cancer Res. 2005. V. 65. № 10. P. 4020-4030.

199. Warmerdam D.O., Kanaar R. Dealing with DNA damage: relationships between checkpoint and repair pathways // Mutat Res. 2010. V. 704. № 1-3. P. 2-11.

200. Warren J.S., Yabroff K.R., Remick D.G. et al. Tumor necrosis factor participates in the pathogenesis of acute immune complex alveolitis in the rat // J Clin Invest. 1989. V. 84. № 6. P. 1873-1882.

201. Wilson R.D. Cell-free fetal DNA in the maternal circulation and its future uses in obstetrics. // J Obstet Gynaecol Can. 2005. V. 27. № 1. P. 54-62.

202. Wurtele H., Little K.C., Chartrand P. Illegitimate DNA integration in mammalian cells // Gene Ther. 2003. V. 10. № 21. P. 1791-1799.

203. Yakubov L.A., Deeva E.A., Zarytova V.F. et al. Mechanism of oligonucleotide -uptake by cells: involvement of specific receptors? // Proc Natl Acad Sei USA. 1989. V. 87. № 17. P. 6454-6458.

204. Yakubov L.A., Petrova N.A., Popova N.A. et al. Extracellular genomic DNA protects mice against radiation and chemical mutagens // Genom Biology. 2003. V. 5. № P. 3.

205. Yoo, H.Y., Shevchenko, A., Shevchenko, A., Dunphy, W.G. Mcm2 is a direct substrate of ATM and ATR during DNA damage and DNA replication checkpoint responses // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - N 51. - P. 53353-53364.

206. Yu J., Thomson J.A. Pluripotent stem cell lines // Genes Dev. 2008. V. 22. № 15. P. 1987-1997.

207. Yu L.J., Drewes P., Gustafsson K. et al. In vivo modulation of alternative pathways of P-450-catalyzed cyclophosphamide metabolism: impact on pharmacokinetics and antitumor activity // J Pharmacol Exp Ther. 1999. V. 288. № 3. P. 928-937.

208. Zamecnik P., Aghajanian J., Zamecnik M. et al. Electron micrographie studies of transport of oligodeoxynucleotides across eukaryotic cell membranes // Proc Natl Acad Sei USA. 1994. V. 91. № 8. P. 3156-3160.

209. Zhang N., Liu X., Li L. et al. Double-Strand Breaks Induce Homologous Recombinational Repair of Interstrand Cross-Links via Cooperation of MSH2, ERCC1-XPF, REV3, and the Fanconi Anemia Pathway // DNA Repair. 2007. V. 6. № 11. P. 1670-1678.

210. Zhou B.B., Elledge S.J. The DNA damage response: putting checkpoints in perspective // Nature. 2000. V. 408. № 6811. P. 433-439.

211. Zou L. Single- and double-stranded DNA: building a trigger of ATR-mediated DNA damage response // Genes Dev. 2007. V. 21. № 8. P. 879-885.

Информация о работе

Долгова, Евгения Владимировна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2012
ВАК 03.03.04

Диссертация

Токсический эффект синергичного воздействия цитостатика циклофосфана и экзогенной ДНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы