Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ТОКОФЕРОЛСИНТЕЗИРУЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ РУБЦА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ТОКОФЕРОЛСИНТЕЗИРУЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ РУБЦА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА"

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИМ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА

<ВИЖ>

На правах рукописи

ПОПОВ Андрей Николаевич

УДК 636.2:612.32:577.161.3

ТОКОФЕРОЛСИНТЕЗИРУЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ РУБЦА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.13 — ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п. Дубровнцы, Московской обл.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени иаучно-нсследовательского института животноводства.

Научный руководитель — доктор биологически); наук, профессор И. Г. ПИВНЯК.

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук Б. В. ТАРАКАНОВ, кандидат биологических наук А. А. ЧУПИН.

Ведущее научное учреждение — Всесоюзный научно-исследовательский институт незаразных болезней животных.

Защита диссертации состоится « а 19 г.

на заседании Специализированного Совета Д. 020.16.02 при Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно* исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142012, Дубровины, Подольского района, Московской области.

ознакомиться в библиотеке и нети т1

о^У, ,9 /3 ,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

И. Н. ШМЫГИН

ОЩАЯ ХАШТВИКГШа

A^pr^jnqpcflft туу. Е«о техно логах стаиоватся одам в* гл&вкнх шшрихенвй я равввтв* оовремююЯ кцп. В хпетвоюд-етм болмяе перспентавн свяяаш в срвивнеакем пробаотаков, получавшие в* оовове нормальноII рубцовой мякрофлорн, актввяа сввтеаа-рущей ферменте, ватамикн, аитибаотга и диги» баологичвсяв «к-твмш» аецветва ( ¿yo-иь Т«Р., 1987, S. ,19в7, 1.Г.

Пввшж, 1968, Н.Г.Пявнак, А.Н.Конххяа, 19731.

Исследования*! ряд* jraeimx установлено, что »кроорганяа*» i рубца жвачных кявотшх способ» вввтеаврова» вятаыянн гцшш

витамин К и jt-каротмв ( S.J.&wlidel , H.B. Wo>«veíí , 19Й7, У.Светжиковокаа, 1967, ИЛ.Чебан, I968t П.В.Ьребфв, В.М.Враив,-1970, Е.И.Нолеаько, Д.Г.ГЪгоаадво, 1970, И.Г.Плш, 1976). Некоторые исследователя находили у жжрооргаиваиов в токоферол { J. Сгае-Н. o.a., 1969, А.Т.D<)j/oc* , o.a., 1961, J.Я. ¿ítfo* , J.lCrféet*) 1975, P.P. fawbn е.a., 1977). Б ооотааа шкрофю-рм рубца хвачмгс оовск товоферохсявтвввргичис мвкрооргашмюв вообще не'проводило«.

Ижегтса работ, косвенно подтверждаете, что синтез токоферола микрофлорой рубца шивт место. Так, В.Н. T«»<as, С.у. Са**о*. (1937) скармливала ковам радой, дефицитный по ватамвцг К, но нарушений воспроизводства я» мабжада«, T. V. 6ч Мм*. «.а. (1949) прово я« акало гячшй опат ва крупном рогатом окоте в также » вабила» нарт* роста, .ооярояввоясгва в дактаци, хота t ва вест но, как раавообрааны функцив витаю на Е в органа вне (М.Н.

» Смирнов, 1974, А.Р.Валъдман, 1976, В.Б.Спирнчев ж др., 1979,

Н.В.Бламвевич, Н64 в др.).

Паль я аавача после юиашИ. Целы* исследований бмло устааоа-хенве способности бактерий рубца синтезировать токоферол.

- 2 -

В ндгаг ввомдамня модаю:

- мдоять п 00ОЧАМ нгбдоо! мпгрофюрв коров бантерм,

- ыучвтъ тохофв роюиггевжрагичг» ажтивиооть бактери! рубца » уело них Сц уЦю ,

-рааработатк мвтодму опрадмош* токоферо«а, образуемого бактермш fV<fqfc»

- примет кденпфаеацшэ мхофарохов» обравгемш: бажтвржя-

- вромета щдрявфпиицпв бмтвряЖ ИГбца, саятеамруоди.

I

Чмтпч роыаяа. Впервве (htm пожучены дчят» о способном« рубфвжх бактермж оиитвавровать токоферол.

Определены уотоюи кухьтявяроваввя токофероасантезирущих бактерий*

Раеработан метод определения то кофе рои» обравуемого биприш рубца«

Вмчвм и двмпгтт «www получвня» дша»

о «umw J. -то кофе ром бактерия рубца крупного рогатого окоте раошравт наш «нами о рот Рубцовых микроорганизмов в пита-шм жвачтх кивотнмх.

Тояофоровсхитевирушре бактерии рубца в перспективе могут бить иепохмоваш дхя получешя пробмотмков.

natfoyi. Материалы диссертации изложены:

- ка мучной конференция можодк учены* и асгшрантов ВИХа (Мвв),

- на Ученом Совете ЯИКа в отчете лаборатории микробиологии (1968),

- яа выставке работ молодо ученых стран СЭВ, ВДНХ (1989).

Объем работ. Дисоертация изложена m 120 етраяпрх нами» пнсного текст», содержит 23 табжяци, 9 рнауюмв, 10 фотографа! ■ 3- приложения. Список используемо! литература кшмт 261 яшме нованяе, в той числе 96 ка ннострашш ямках.

ЛИКРШ Я МЕТОДЫ НССВДрШШ

Матеряадом для научении служили никрооргжниаш, вцявлеште кз содержимого ру<5ца & фястульинх коров черно-пестрой пород». Животные содержахись на фквиохопгаеском дворе ВЙКа. Ращюя фистульных животик первого опыта состоял ка (кг): сяюоа кукуруамо-го - 15,0, сенажа злакового,- 10,0, комбикорма - 3,0. Во пером о пет« жмвотше получали (кг): сена »лакового - 4,0, свекхн кормовой - 12,0, сенажа викового - 10,0, травяной муки - 1,0, комбикорма - 1,0. В третьем опте рацион жявотшг состоял: свежлн кор-мовой-10,0, сенат sлакового - 20,0, реэжн сениой влаковой -4,5, комбикорма - 4,0. В первом в втором опмтах аооольэовали отеяымс сухостоЯжх хоров, в третьем - шярир!.

Всего в опмтах ив оодермимого рубца било вцдвлемо 122 мпм-■а бактерий. Вмтве проб цельного содержимого осуществили черев фвотулу о помоцыо мприца ялиполюй металлической трубки. Иэ получеяюго материала го то sao рея раз веде яя! от КГ* до Вмдехеняе б ах теряй проводили методам ааробиого ■ ана» ровно го кулътнвнровашя, согласно "Иетодамеским рекомвщмкрям по я »учению микрофлоре тщеваритеяъмого тракта оельвкоховяйетвеншх . животных" (1979). Способность к продуцировали) токофероха определяли путем культивирования ввдедеюак бактерия в течении 5 суток m жидкой питательной среда следующего состава (г яли мл): дрожжевой автоляэат - 2,0, глвкоэа-20,0, глицерин - 40,0, ас-парагнн-5,0, дагидроортофоофат калия -3,0,' сульфат магния -

1,0, лцфмрмфоофм яиряя - 4,0, цвтрм «миоюи - 2,5, вода дкеммярмшм » 1 л.

Токофаролоантвварущую актшвность определяй ш методу, pis-работают« ним (1969) на основе методов А.СЛнвкява (1961), П.9. Сыграй, Ы.СДедек (1964) > др. Метод основан на флуораметрк-чводом опрдохеввв -токоферола в бшомаос« бактерия« с предва-рктмыюв »кстракцие* гексааом i хроматографической очнстиц на птотшшх Свлуфож.

Идентмфвицип тскоферод^ов проводят не годами ТСХ (П.Ф.Сурай, *.С.1ед/и, 2964), ВЭКХ (Ю.Ь.Стукалов и др., 1988), спектрогра-{ J.Gmi* е.*., 1959, J.J. Oftti^, 1972,

Р.ХДафкмв ш др., 1275, Р.Появдек-®*бв1в, Т.Бейрк, 1961 к др.) ■ шапрофцгорографт ( P.f.'Ou^/a*. ,1959, S.lT^yh-i «.а. 1976, С.Цдайрецц, 1965 ж др.).

. ВядовУо арннаддвхноогь у ввдвхенннх токоферовяштевируздвх бактеркй определим no Ь. âeijey (1986), « fane о помощью дапбхяитвдыюй литературе (В.С.Рождетственский, А .П.Васильев, 1940, А.С»Бовдарвв, 1954, Б.В.Тараканов, 1969, 1985, А.И.Сизова, 1970, Т.В.№>ронеыш, 1964, О.А.Нестервнко и др., 1965)«

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЩОВ&Ш

Выделена« я» рубца коров токоферолсннтеэирупцих ваиерий

Всего, в опытах было вцвепево 122 штамма рубцовых бактерий.

Ив nu 90 при аэробном »«делении, 32 - оря анаэробном (табл.1).

Таблица I

КЬхкчоетво «ташов,вцпэ1еюш ив рубца коров

Метод вцдвленм :_■ _0 g н * н___

.____:__I__:_2_; 3

АвробшК 16 16 56

Анаеробннй 6 7 19

Все оак исследованы в* способность образовать токоферол. Токоферолсингезирусцм активность бежа установлена у 22 штаммов. (г 17» ввдеженных авроб», а у 5 выделениях анаэроб») (табж. 2).

Таблица 2

Токоферожбимтезнруящие втамш, выделенные на рубца коровСМР втамюв)

Метод :_____0 д в т и______

ввдежепия . ^ : ¡> : 3

Аэробный 20,21,22,23, 46,48,51 62,66,90,93

25,35,37 56,66,59

Анаэробный 27,31 40,43 99

Из всех токоферолсинтевирупцих штаммов, 6 лтатов сжнтеэи-роваля боле« 5 мкг </. -токоферола / 100 их питательной среди (4,9% от общего числа наследованных мташов), 7 нтамиов - менее 5 икр <1 -токоферола/ 100 мл питательной среда (5,7$) я г 9 агатов были обнаружены следовые количества с/-токоферола (7,4$)«

Таким обравом, из 122 вццеленшх из рубца крупного рогатого скота бактерий, токоферолсинтезнрущей способностью обладали около 18% вташюв.

Влияние пигментообразования, способности синтезировать липоды к каротины на синтез токоферола бактерияш рубца

Из 122 ввдеивняых агатов 63 были пигментированы (от желтого всех оттенков до оранжевом). Из всех пигментирован»« штатов токоферолсинтезяруюцая активность была отменена у 22 вташюв, что составляет ЗЭ£. У изученных непигментированных штатов токоферол не обварит.

Связь между синтезом липидов и каротинов, с одной сто рода, и синтевом и -токоферола, о другой сторож, была исследована в

_ 6 -

условиях ¿и vUto в »амкнутоЯ системе н& лскуостванвой питательной сред» путем расчета коэффициента хор£«ггшцяи. S результате нзученхж вмяснелось, что мевду юштазом наротика и -токоферола бактериями рубца существует статистически достоверная прюая »авиеииость í £ = 0,493, -t - 2,537 , Р < 0,02). При иаучехп связи мещдj см иге »ом липмдов и .¿-токоферола, было обнаружено ». что между двуия пхмм процессами нет статистически достоверной вавиеимоотя ( - 0,03 , ~¿ = 0,136 , Р > 0,5).

Изучение токоферолгсинтеэируичей активности бмтврий рубца

Исследования по опредехеш» токоферолсинтезируяцвй активно стя бактерий рубца проводили в omrrar С*, viito » аеробпх условиях на сшнтетмческой питательной среде (ем, вше), путем добавления в последив* различии ростовых веществ: (на 100 мл вреда): »таном - I и», витаминов Bj - 50 мжг, Bj¿ - 20 мкг и ПАНК - I мкг« »таиола вместе в витаминами, янтарной кислоты -2 мг, лецитина - 0*1 их. Все используемые добавкм не оказали влияния m ос держание токоферола /г биомассы бактерий. Однако, когда ростовое шрество увеличивало накопление биомассы - увеличивалось я содержание .¿-токоферола / 100 мл питательной среди (по сраиидо с основной средой). Этанол увеличил содержание

Л -токоферола у штаммов W 59, 90' (Р < 0,01), витамиш - у -■гамма V 43 (Р < 0,02) и у штата » 59 (Р < 0,001), »та-яол ♦ витамины - у штатов Ш 21,43 (Р < 0,001), 59 (Р < 0,05) м у штамм * 90 (Р < 0,01), янтарная кислота - у штsuata > 90 (Р < 0,001). Хецитян не повысил содержания <¿ -токоферола у научаема штамюв (табл. 3 и 4).

Накопление биомассы в анаэробных условиях было слабым.

Тябоца 3

Вшяние равхляннзс добавок в тттвхьяуо среду на наюпмтв бяокассн, г'

мов

Основ

■ЙВ)

:0С с :втанохои : Ь. - 3 : M ± ««

ОС о вма- : ОС с эта. НОВОМ M

U = 3 H ±<ш

«»б К ± 'т

:0С е китар-

.ho« клсю-*Т01

Î Ъ - 3 ■

:0С е

.ЫфПШОМ

: fe. -3

. U

* *

21 1,1740.06 I,I5¿M9 1,01+0,06 2,22ip,08 1.28^0,11 0^-57^0,20 i

23 2,18^0,09 2,2IjO,I5 2»I8jp,08 2,31^0,14 2,22áO,I8 I,97jO,I8

43 0,86-10,10 0,30i0,06 I*2Bjp,09 2,0040,11 0t88¿<5,15 0,25+0,07 i

48 0,96^0,12 0,97^0,09 i, ayo ,07 0,94jO,II 0,82j0,l6 0,32+0,09

59 2,34jO,I3 3,50áP,XI 3,47±0,I0 3,33^0,18 2,50^0,23 I,27jO,I6

90 I,76ap,I5 2,61^0,13 I,88jp,I2 3,02j0,19 3,43ip,34 1,48*0,14

93 1,3640,10 1,22*0,06 0,9^,09 O.TJfcp.K lt9ljOt22

Табшця 4

Вгяшяя» рилгак добавок s пхммхыап» среду m содержа вне «/ -токоферола , юр/100 мл пятатежыю! среда

m шшт : Осяовмя " î ЭТ1 : ..Срмш.с »6 шаш »стояк веавств

:впшш : :л= 3 ï • 1 ± ♦ * » пташвю и = 3 И ±1ч :»uou e ; Mit« IRnpwf жясаот«^ щртхяа ti 3 U±-ni

21 6,i6aP,23 0,01^,66 5,24±0,53 II,49jO,43 6,48¿0,54 2,78jp,69

23 31,06^1,68 32,33^2,61 31,86±Г,59 32,18+2,44 3I,8I¿S,93 27,52^2,25

43 3,49 j0,48 I,37¿0,28 5,20jp,39 8,32^0,85 3,46jO,63 0,88jp,24

48 3,27 ¿0,46 3,0IjP,24 3,82¿0,09 2,97^,39 2,57j0,56 0,98jP,26

59 8,lÇfO,73 Iî,90jp,89 12,48+0,74 10,64^0,68 7,9ZjO,0O 3,92j0,50

90 11,85^1,06 16,41+0,51 I2,03¿0,92 19,42+1,89 22,89^2,42 9,22jI,II

93 6,06^0 ,ЭВ 5,4740,43 4,I8jO,44 3,I9ip,47 Q,07¿I,I8 5,44¿},64

- 9 -

U - токоферол в биомассе бактерий хульпвирремнх в течении 5 «уток, содержался в следрвмх количествах (ме боям О,ISO икр/100 их питательной среда). Добавление в питательна» среду ростовмх веществ не прнвеяо к увеличению содержания </-токоферола в образцах биомасса. Следует отметить, что при анаэроб-ннх условиях культивирования, в биомасса не ко то рис штаммов били обнаружен! другие неомерн токоферол« и токе в следовнх количествах (ji + í* В -токоферолы). '

Для' изучения динамики накопления биомасса н синтеза то кофе-, рола исследуемые иташш культивировали в аеробнкх условиях в течении 3,5,7 и 10 суток. Проведенные анализы показали, что для максимального »(хода .¿-токоферола втаынв меобходнмо внрацивать в течения 5 суток.

Идентификация токоферолов, синтевируемнх микрофлорой рубца

Были изучены токоферолы, синтезируемые пяты> наиболее активная итаимши Н 21, 23, 43, 59 и 90. При ТСХ на пластинах Силу-фок на хлороформе исследуемое пятно, пожученное в процессе хрома-тографмческого разделения, имею kj - 0,63, что соответствовало Rf d. -токоферола. При опрыскивании этого пятна свежепржготов-леннш раствором Эммерн-Энгеля, оно приобретало розово-красный цвет. t¡L - Л - токоферол окраин вался идентично. При иепольврва-нии ВЭЖХ <¿- токоферол был идентифицирован по временя удержания .с использованием DL - J. - токоферола в качестве внутреннего стандарта. На спектрофотометре " CP- i4 " бел получен спектр поглощения микробного U -токоферола (веде ленного от изучаемых штатов). Максимум и минимум поглощения последнего .соответствовали экстремумам t)L - *L - токоферола (Рис. I).

Ряс. I, Спектр поглощения агат» * 23»

- II -

На спектрофлуорометре * №Г - 4 били получены

спектры возбуждают и эмиссии микробного ¿-токоферола, эжстрему мы которых также соответствовали экстремумам 01- и- токоферола. ИК - спектры VI~ <1 - токоферола и микробного (/-токоферола также полностью оовоалн!

Морфологическое и фмеио лого-биохимическое

исследование токоферолсянтезирующях бактерий рубца

Бала проведана идентификация 13 штаммов бактерий рубца» образуйся* более 0,1 мкг ./-токоферола/ 100 мл питательной среды. Исследовались морфологические, культу рал ыте и фявиолого-бко химические свойства. Обнаружено, что вое мвучаеюе штамм - хемоор-гавотрофм, Ах клетки не обладает скользящим движением, не нитевидные, не кислотоустойчивое, каталамяодожителмве.

В результате проведенных исследований токоферояеинтеаируицие бактерии были рааделени на 4 таксономические группы:

- грамположителыае кокки, не обравущие эндоспор Снтаммы » 35 и 43],

- грамиолохительные палочки, не обрааущие эндоспор (штамм I» 20, 48, 56 и 99).

- грамоположктеяыше палочки, обраеуэдне ецдосоорм (втамш М» 22, 99 н 66),

- группа бактерий порядка ОГ^'ио^еД!«^ (паше Ж 21, 23, 90 и 93).

Токоферолсинтеэируюцая активность анализируемых атаммов отражена в таблице 5.

Получендае сведения о способности бактерий рубца синтезировать токоферол, позволяют пересмотреть существуйте взгляда на роль бактерий рубца в обеспечении животных витамином Е, становится реальной возможность получения пробиотика на основе токоферола»-

- 1« -

тезирущих рубцових бактерий, появляется возможность разработки микробиологического способ* получения Л-токоферола.

Таблица 5

аиово* ~состяк в синтез ■/-токоферол» у изучавши

9В

щ штатов !Вид __

_¡.___;__________:100 му_среиш_.. г.биомассы

35 ^лг/в-иД 0,56 0,26

43 а««оеве«и v¡нt^t*м& 8,32 3,94

21 ЯМш*и*ьх 11,49 5,20

58 <иМмеА 0,46 0,11 20 Ы^ыЬЖы'ь»« </е«ее«/» 3,63 1,92

48 р-ыртй&ьеХ****уи а^'Лм* 3,82 3,13

99 а ».'¿Л'- ^ьыр/'ет'*} 1,87 0,60

22 чиеЛ^л . 3,89 2,26

59 йылИмХ. ■иычтфсн&Ъ 12,40 3,бЬ

0,66 0,07

23 Не идентифицировал 32,33 14,53 90 Не идентифицирован 22,89 6,65 93 Не идектяфицирюан 8,07 4,17

1 - Идентифицирован только род.

ВЫВОДЫ

1. В результате изучения микрофлоры рубца крупного рогатого скота впервые выделены токоферолсинтеэнрупщке микроорганизмы.

2. Существует прямая корреляция между синтезом бактериями каротинов и »¿-токоферола, т.е., если данная культура синтевкру-ет каротины, то у неб может идти и синтез «/-токоферола.

3. Этанол, витают В^, В^ и ПАБК, янтарная кислота - при добавлении их к основной питательной среде оказали стимулмрущее влияние на накопление биомассы и синтез ^-токоферола у многих токоферодоинтезидоцих штатов бактерий.

4. На ивомеуга то кофе ром оря «ероблк условиях кульпяяро-ваняя аявтевировалсж только »/-то кофе рож, я ори анаеробяшг услови- -

теяоферожш.

5. Максимальное количество о/-то кофе рожа образуется иа 5 сутки культивирования. Токофе ролей итезирущие бактерии в условиях

и< тЧта образовали до 32 мяг -то кофе рожа / 100 их тгтатежь-ной вредя.

6. Токоферолсаатвзиргщив культуре обгединеш в 4 таксономические группы: груша кокков, не образуприс эндоспор (Ы/с^се**^ г«гы>>«5) а<лл>ыеи*4. )(группа палочек, не обрааувцих эодосвор ( елЛШе.о^г/Я*** ,

Ч&иш*I Рицины****'"« ) ? группа пало-

чек, обраяущнх эндоспора ( Алмйил , ,

шф<£ь*& ) я группа бактерий порядка .

7. Наибольший синтез «¿-токоферола отечен у вида

,у представителя рода Яб*/оыеиа. и у двух представителей групп» ¿агтвряй порядка Си&ъсыуа&и**.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ОЩШШ

1. Рекомендуется при виде хеши токофе ролейнтезируюцих бактерий иа соетава рубцовой микрофлоры отбирать, прежде всего, штяж мы, образующие на ША пигментированные колоши, а также обращать внимание на способность культур синтезировать каротиш.

2. Рекомендуется при определеши ^-токоферола, ояитевируе-мого микрофлорой рубца, иепожьяовать разработаншй метод определения У -токофероле, опубликованный в «рудах ВИ1а (ом. ниже).

■атермалм диссертации ооубаковахи в работах:

1. Я.Г.Ш8ИЯК, А.Н.ПОШВ Надоям бактерий рубца крупного рогатого окота, синтеаирувщих альфа-то кофе род (ЯП) //Микроорга-nam в сельск. хов-ве / Республиканская конференция 29-30 ноня 1968 г. (Тезисы докладов).- АН МССР, Кишинев, 1968.- С.225-226.

2. А.Н.ПОПОВ Определение альфа-токоферола в микробной нас се рубца // Физиология я биохимия с.-х. животике } Бел. научн. работ ЕПа, Дубровицн, 1968.- В.90.- С.93-94.

Подпиоано в печать 25.08.89. Л-36060. Заказ 9ву. Объем 1,0 п.л. Тираж ЮОвкз.

Типография ВНИИТЭИР.