Тест-система [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции

Бобоев, Гиёсиддин Юнусович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Тест-система [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Тест-система [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции"

На правах рукописи

БОБОЕВ ГИЁСИДЦИН ЮНУСОВИЧ

Тест-система [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимераэной цепной реакции 06.02,02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

2 4 МАЙ 2012

Душанбе - 2012

005044807

Работа выполнена в Научно-производственном предприятии «Биологические препараты» Таджикской Академии сельскохозяйственных наук и на базе РГП Научно- исследовательского института проблем биологической безопасности Республики Казахстан

НИУЧНЫН ВШИИИИТММ доктор ветеринарных наук,

Научный консультант: доктор ветеринарных наук,

профессор, академик Сансыэбай Абылай Рысбайулы

Официальные оппоненты; доктор биологических наук, профессор

Защита состоится 11 мая 2012 г. в 10м часов на заседании диссертационного совета ДМ 050.001.01 при Институте ветеринарии Таджикской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 734005, Республика Таджикистан. г.Душанбе, ул, А. Каххарова, 43. тел. (992-372) 2739-95.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ветеринарии ТАСХН.

Автореферат разослан 10 апреля 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

Амирбекоа Муллоджон Амирбекоянч

Тишком Фарида Хаматгалневна

доктор ветеринарных наук, профессор Диев Вячеслав Иванович

Ведущая овгяниаамм Национальный центр

ветеринарной диагностики Служба государственного надзора Министерства сельского хозяйства Республики Таджикистан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Чума мелких жвачных животных - чрезвычайно инфекционное заболевание домашних и диких жвачных животных. Впервые оно было зарегистрировано в Западной Африке (Кот-д'Ивуаре) в 1942 году.

В последние годы болезнь была зарегистрирована на Ближнем Востоке и Аравийском Полуострове, в таких странах, как Исламская Республика Иран, Ирак, Израиль, Иордания, Кувейт, Ливан, Оман, Саудовская Аравия, Объединенные Арабские Эмираты и Йемен, а также есть серологические подтверждения в Сирийской арабской Республике и Турции. Известны вспышки чумы МЖЖ в Индии, Непале, Бангладеш, Пакистане и Афганистане. Распространение ЧМЖЖ на территориях в странах бывшего Советского Союза среди животных изучено недостаточно.

Для диагностики и идентификации вируса ЧМЖЖ на сегодняшний день в мире разработаны и применяются различные серологические и иммунологические методы. Все они имеют различную диагностическую ценность - одни требуют значительных затрат по времени, другие имеют низкую чувствительность и специфичность (133, 134, 135, 136). Поэтому усовершенствование и разработка более чувствительных и специфичных, а также экспрессных методов диагностики остается актуальной проблемой.

Метод ПЦР имеет ряд преимуществ - прямое определение ДНК возбудителя, высокая специфичность, высокая чувствительность, универсальность процедуры, простота и удобство проведения анализа, сравнительно небольшие затраты времени на проведение анализа. В зарубежных странах метод ПЦР успешно применяют для диагностики ЧМЖЖ. (56,57, 133, 134). Разработка эффективных, быстрых и надежных методов диагностики ЧМЖЖ является весьма актуальной проблемой для Таджикистана.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлась разработка тест-системы (набора) для диагностики ЧМЖЖ, с использованием компьютерно-моделированных и синтезированных специфических праймеров.

Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:

1. Отработать оптимальные методы очистки и концентрирования вируса ЧМЖЖ из вируссодержащих материалов с целью получения вирусной РНК;

2. Отработать оптимальные методы выделения РНК га очищенного вируса ЧМЖЖ;

3. Сконструировать, отобрать и синтезировать оптимальные специфические праймеры для амплификации участка геномной кДНК вируса ЧМЖЖ;

4. Отработать оптимальные условия проведения ПЦР (временный и температурный режим реакции, концентрация основных компонентов в реакционной смеси) при выявлении кДНК вируса ЧМЖЖ;

5. Изучить специфичность и чувств1гтельность ПЦР системы при выявлении кДНК вируса ЧМЖЖ.

Научная новизна работы. Впервые сконструированы и синтезированы оригинальные праймеры для амплификации фрагмента гена РНК-полимеразы вируса ЧМЖЖ, имеющие нуклеотидный состав:

- РСЯ_РРЯУ_0;

- РСЯ_РРЯУ_гЗ.

Данные праймеры ограничивали участок кДНК вируса ЧМЖЖ размером 274 п.о.

Установлено, что использование подобранных праймеров, позволяет сократить общее время проведения анализа. Показано, что для отжига данных специфических праймеров и наработки ПЦР-продукта размером 274 п.о. достаточно по 60 с.

Разработан и апробирован вариант ПЦР тест-системы для детекции кДНК вируса ЧМЖЖ.

Практическая значимость работы. Разработана ПЦР тест-система для детекции кДНК вируса ЧМЖЖ, которая является высокочувствительной, простой в исполнении, позволяет поставить диагноз в короткие сроки, включая ранние стадии инфекции.

По результатам исследований разработана н составлена нормативно-техническая документация, включающая:

- Тест-система [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции, СТ 405-1919-04 ГП-050-2012 (28 февраля 2012г.);

- Временная инструкция по изготовлению и контролю тест-системы [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (28 февраля 2012г.);

- Временное наставление по применению тест-системы [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (28 февраля 2012г.);

- Тавсияхо оид ба гузаронидани тадбирхои зидциэпизооти ва пешгирикунанда хангоми тоуни чорвои хурди шохдор (Рекомендации по проведению противоэпизоотаческих мероприятий при чуме мелких жвачных животных (15 марта 2011 г.))..

Таким образом, полученные в диссертационной работе результаты позволяют упростить диагностику ЧМЖЖ и повысить е6 эффективность, что может сократить экономические потери в животноводстве от данного заболевания.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на: заседаниях Ученого Совета Научно-производственное предприятие «Биологические препараты» (Среднеазиатского ящурного института) Таджикская Академия сельскохозяйственных наук - 2003-2011гг. Основные положения диссертационной работы изложены и обсуждены на научно - теоретических конференциях в гг. Бишкеке Республики Кыргызстан, в Казани и Москве Российской Федерации.

Основные положения, выносимые на защиту:

- сконструированные, отобранные и синтезированные специфические праймеры могут быть использованы для амплификации участка геномной кДНК вируса ЧМЖЖ размером 274 п.о.;

- предлагаемый температурно-временной режим, обеспечивающий отжиг праймеров и синтез ПЦР-продукта, позволяет уменьшить время постановки диагноза на ЧМЖЖ;

- создан ПЦР тест-системы для детекции кДНК вируса ЧМЖЖ, позволяющий упростить и сократить время постановки диагноза, значительно повысить эффективность обнаружения вируса, в том числе на ранних сроках инфекции.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные данные получены автором самостоятельно. Теоретическое обоснование, проведение экспериментов, анализ и обработка полученных данных проведена при личном участии автора и сотрудников РГП Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности Республики Казахстан. Результаты работы опубликованы и апробированы в производственных условиях.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность за неоценимую помощь, оказанную при выполнении данной работы, критическую оценку и ценные советы при оформлении диссертации сотрудникам РГП Научно- исследовательского института проблем биологической безопасности Республики Казахстан, Ж.К. Кошеметову, С. Нурабаеву, НПП «Биологические препараты» ТАСХН Т.К. Висковой, М.И. Косумбекову.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, из них три статьи в изданиях, по перечню ВАК Российской Федерации, в которых изложены основные положения и выводы по изучаемым вопросам.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 131 странице компьютерного текста (Word) и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и'списка литературы. Список используемой литературы включает 138 источников, из которых 114 иностранных. Диссертация иллюстрирована 29 рисунками, 9 таблицами. Приложение на 3 страницах.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работы были проведены на базах НЛП «Биологические препараты» ТАСХН и РГП Научно- исследовательского института проблем биологической безопасности Республики Казахстан, производственные опыты проводились на базе республиканской и областных ветеринарных лабораторий и в овцеводческих и козоводческих хозяйствах Республики Таджикистан.

В экспериментах по изучению вируса ЧМЖЖ принимали участие сотрудники лаборатории «Диагностики инфекционных заболеваний» РГП НИИ проблем биологической безопасности МОН Республики Казахстан, которым автор выражает искреннюю признательность за оказанную помощь и сотрудничество.

Материалы для исследования. Вирусы и вируссодержащие материалы. В качестве объекта исследований в работе использовали вакцинные и эпизоотические штаммы следующих возбудителей:

1. Вирус чумы КРС, штамм "К3770".

2. Вирус чумы мелких жвачных, штамм «G - 45».

3. Вирус чумы плотоядных, штамм "ЛД", вакцинный.

4. Вирус болезни Ньюкасла «Ла-Сота».

5. Вирус ЧМЖЖ, штамм "Темурмалик", эпизоотический. Выделен на территории Республики Таджикистан от больных овец в 2005 г.;

- 20 % суспензия органов (гортань, трахея, легкие, селезенка) от павших животных разных регионов Республики Таджикистан.

Методы исследований. Пробы патологического материала растирали в ступке на стерильном физиологическом растворе и готовили 20%-ную суспензию. Полученные суспензии замораживали при минус 40°С и оттаивали при комнатной температуре трехкратно. Суспензию центрифугировали при 3000-4000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочные жидкости использовали для лабораторных исследований. Кровь исследовали в цельном виде после однократного замораживания при температуре минус 40°С и оттаивания при комнатной температуре.

Статистическая обработка данных. Все исследования проводили с учетом повторностей, обеспечивающих получение достоверных результатов. Полученные результаты исследования обрабатывали математически. Подсчет среднего арифметического значения (М) и средней квадратической ошибки (ш) проводили с помощью компьютерной программы "Microsoft ЕхеР ("Microsoft", США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Очистка и концентрирование вируса ЧМЖЖ. Прежде чем приступить к разработке метода ПЦР для диагностики вируса ЧМЖЖ необходимо было выполнить предварительные этапы, которые включали наработку вируссодержащего материала, его очистку и концентрирование. Подготовительные этапы очень важны, поскольку для разработки ПЦР необходимо наличие нативных и высокоочищенных полноразмерных препаратов геномной РНК вируса во избежание получения недостоверных результатов. При этом одним из основных этапов при получении нативной РНК генома вируса является получение высокоочищенного вируса с отсутствием каких-либо примесей. Однако универсального способа очистки, пригодного для всех вирусов, не существует, что связанно с индивидуальной морфологией и физико-химическими свойствами вирусов. Выбор методики получеши вируса определяется также целью дальнейшего исследования.

Подбор оптимальных условий культивирования вируса ЧМЖЖ. При изучении оптимальных параметров культивирования вируса ЧМЖЖ проводили исследования по накоплению вируса в культуре клеток ПЯ в зависимости от величины инфицирующей дозы и состава поддерживающей среды.

Накопление вируса в культуре клеток ПЯ изучали при дозах инфицирования 0,01 и 0,001 ТЦД50/кл в динамике.

Полученные результаты опытов показывают, что при величине инфицирующей дозы 0,01 ТЦД50/кл репродукция вируса в культуре происходит в более ранние сроки (9-10 сут), а активность вируссодержащих суспензий достигает 6,0 ^ ТЦЦ50/смЗ.

При изучении зависимости накопления вируса ЧМЖЖ от поддерживающей среды и концентрации сыворотки в питательной среде было установлено, что присутствие сыворотки КРС в поддерживающих средах играет определенную роль.

При использовании поддерживающих сред без сыворотки вирус накапливался в сравнительно невысоких титрах (3,25-3,75 ТЦД50/смЗ). Вируссодержащие материалы с более высокой цитопатической активностью удавалось получать при использовании сред, содержащих 2% и 5% сыворотки.

В дальнейшем для культивирования вируса в ростовую среду вносили 2% прогретой при 56°С в течение 30 минут сыворотки КРС рН 7,5-7,6.

Получение очищенных и концентрированных препаратов вируса ЧМЖЖ из вируссодержащих материалов. С целью получения нативного препарата вируса ЧМЖЖ проводился подбор оптимальной методики очистки вируса. С учетом анализа литературных данных очистку вируса ЧМЖЖ проводили двумя методами в зависимости от контаминации микоплазмами вируссодержащего материала: хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе и осаждением полиэтиленгликолем (м.м. 6000).

Метод очистки и концентрирования вируса с помощью полиэтиленгликоля (м.м. 6000) и последующее центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, первоначально в ступенчатом, затем в линейном имел преимущество перед другими схемами очистки по скорости и простоте выполнения, а также позволил получать высокоочищенные препараты вируса. Отработанная схема пригодна только для вируссодержащих материалов, свободных от микоплазменной контаминации.

При необходимости удаления из вируссодержащей жидкости микоплазменной контаминации применяли схему очистки с использованием ионообменной хроматографии на волокнистой ДЕАЕ-целлюлозе. Общая схема очистки вируса ЧМЖЖ включала следующие этапы. На первом этапе вирус подвергали хроматографии на колонках с волокнистой ДЭАЭ-целлюлозой. Колонку нагружали вирусом из расчета 200-300 см3 вируссодержащего материала на 1 г ионообменика. После адсорбции колонку промывали 0,2 М раствором хлористого натрия на 0,05 М ФБР, рН 7,0 - 7,2 до тех пор, пока поглощение УФ-лучей при 280 нм оттекающей жидкости не становилось равным нулю. Вирус элюировали 0,5 М - 1,0 М растворами хлористого натрия на 0,05 М ФБР, рН 7,0 - 7,2. Элюаты концентрировали высокоскоростным центрифугированием через 30% сахарозную «подушку». Дальнейшую очистку проводили центрифугированием в ступенчатом градиенте (20-45-60%) сахарозы.

Таким образом, центрифугирование в градиенте плотности сахарозы являлось одновременно и контролем предшествующих стадий очистки вируса, и ее непременным заключительным этапом.

Электронно-микроскопические исследования подтвердили чистоту и целостность вирусных частиц.

Применение метода для очистки и концентрирования вируса ЧМЖЖ с использованием преципитации полиэтиленгликолем (М.М. 6000) позволяет успешно решать задачу по наработке препаративных количеств очищенного и концентрированного вируса.

Результаты экспериментов показали, что при использовании в качестве элюентов 0,2 М; 0,3 М; 0,4 М; 0,5 М; 0,6 М; 0,7 М; 0,8 М; 0,9 М; 1,0 М; 1,2 М; 1,5 М ЫаС1 выход вируса наблюдается в области 0,7 - 1,0 М №С1. Повышение концентрации хлористого натрия в элюирующем растворе до 1,5 М не привело к увеличению выхода вируса.

В результате подобранных условий очистки удалось получить лишенные примесей препараты вируса, в которых сохранялась целостность выделяемых вирусных частиц, о чем свидетельствовал электронно-микроскопический контроль препаратов и

спектрофотометрический метод анализа. Полученные результаты совпадают с данными других авторов по очистке представителя семейства парамиксовирусов.

При проведении экспериментов получены аналогичные данные по степени очистки вируса ЧМЖЖ, выход вируса составил 60%. Показатели очистки и концентрирования вируса ЧМЖЖ представлены в табл. 1.

Таблица 1

Показатели очистки вируса ЧМЖЖ _

Стадии очистки Объем, см3 Концентрация белка, мг/см3 (М±т, п=5) Процент очистки вируса (%) (М±ш, п=5)

Исходный материал 500 78,00±2,99 .

Осветление ВСС 492 72,19±2,22 9,94±1,0

Очистка и концентрирования через ДЭАЭ-целлюлозы 5 5,26±0,44 99,87±11

При использовании данного метода удалось очистить вирус от основной массы балластных белков и при этом не нарушить структуру вирионов.

Выбранный нами метод имел преимущества перед другими схемами очистки по скорости и простоте выполнения.

Подбор оптимальных методов выделения РНК вируса. Для выделения РНК вируса ЧМЖЖ использовали методики, применяемые для РНК содержащих вирусов.

При отработке оптимальных условий выделения нативных РНК в опытах использовали очищенные препараты исследуемого вируса. Выделение РНК проводили модифицированными методами с использованием протеиназы К и гуанидинизотиоцианата (ГИТЦ) с последующей фенольной депротеинизацией.

В нашем опыте для выделения РНК вируса ЧМЖЖ более приемлемым оказался метод с использованием ДСН и протеиназы К.

Проверку целостности РНК проводили электрофорезом в агарозном геле. Электрофорез проводили в 0,8% агарозном геле, при напряжении 5 В/см в течение 2 ч, визуализацию полосы РНК осуществляли с помощью бромистого этидия. Электрофоретический анализ РНК вируса ЧМЖЖ представлен на рис. 1.

1 2

Рисунок I - Электрофоретический профиль РНК вируса чумы МЖЖ

1 - РНК, выделенная 1 методом, 2 - РНК, выделенная 2 методом.

Спектрофотометрмческие характеристики переосажденных препаратов РНК имели отношение Е2«>/Е28о=2. Выход очищенной РНК составил 15-25%. Электрофоретический анализ полученных препаратов РНК показал наличие одной гомогенной полосы.

Таким образом, результаты качественного и количественного анализа показали, что наилучшим является метод с использованием ДСП и протеиназы К. Оптимальная схема выделения РНК вируса ЧМЖЖ при использовании данного метода представлена ниже:

- Очищенный и концентрированный препарат вируса чумы МЖЖ инкубировали с протеиназой К (к/к 0,2мкг/см3 и 1-1,5 % ДСН) при 37°С в течение 20-30ч;

- Депротеинизация фенол/хлороформом 2 раза, 1 раз хлороформом. Разделение фаз при центрифугировании 2500 g, 20 мин;

- Осаждение РНК спиртом, в присутствии ацетата натрия.

Выход геномной РНК при данном методе составлял 60-80%. В экспериментах количество полученной РНК варьировало в зависимости от титра инфекционности вируссодержащего материала.

Разработка метода ПЦР для идентификации вируса ЧМЖЖ. Эффективность метода ПЦР и его специфичность зависит от многих параметров, включающих буферный состав реакционной смеси, температурно-временной режим и специфичность подобранных праймеров. Однако, наиболее критическим этапом при разработке метода ПЦР, оказывающим в особенности на его специфичность, является правильный подбор праймеров, его локализация на исследуемой ДНК или РНК.

Подбор праймеров. Конструирование праймеров с соблюдением необходимых параметров проводится с помощью различных компьютерных программ, основными из которых являются Ршпег 3, О^о 6, 0^о5ой\уаге и другие. В результате проведенных работ было сгенерировано различное количество пар праймеров на проанализированные участки вируса ЧМЖЖ.

При разработке метода ПЦР для идентификации вируса ЧМЖЖ на начальном этапе исследований был проведен анализ всех имеющихся нуклеотидных последовательностей генома ЧМЖЖ в международном банке генов. Определены консервативные участки, присущие только для представителей данного рода и на данные участки были сконструированы специфические праймеры, позволяющие нарабатывать ПЦР-продукты. В данном случае также проводили предварительный отбор пула праймеров по основным критериям, предъявляемым для ПЦР праймеров. В первую очередь длина олигонуклеотида не должна была превышать 22 нуклеотида, имела допустимое процентное соотношение ОС-оснований - 40-70%, температуру плавления и прогнозируемый размер ПЦР продукта, находящийся в пределах 150-400 п.н. на предварительном этапе работы нами были подобраны 16 пар праймеров.

Из всего пула конструированных праймеров на первом этапе для дальнейших исследований отобраны пять пар праймеров для разработки ПЦР. Параметры праймеров представлены в табл. 2.

Таблица 2

Краткие характеристики праймеров для постановки ПЦР при идентификации __вируса ЧМЖЖ __

№ Название праймера Последовательность (5'-3') поз.на геноме Тш, ОС Та,0С GC,% ПЦР продукт

1 PCR._PPR.V_fl GGA САС CCA АСС АСС GAA АСАО 4974 75.8 61.4 57.1 200

PCR_PPRV_rl TTC ССТ GCC GTT TGG тсо 5157 69.2 58.8

2 PCR_PPRV_f2 АТС CAG AGT CGG CTG ААТ АССО 7533 68,9 53,3 52,4 343

PCR_PPRV_r3 GCC CAA GAG TCA ATG ATT G C() 7856 69,1 50,0

з TGC CGT СТА CCG ATG TT 8425 64,5 54,6 52,9 230

AAG АТС CAT GCC AGA TAG GTG 8634 67,4 47,6

4 CGT TGC CAT GTT CCC ATA GAA 8802 71,0 54,3 47,6 325

CGG TCA GCC CTC TCG TAT 9109 67,3 61,1

5 PCR_PPRV_f3 CAA AGA AAG GGC AGT GTT АТС 0 12643 64,9 55,3 42,9 274

PCR_PPRV_r3 АСА CGA AGA GCC GAA GTC () 12899 64,9 55,6

Сконструированные праймеры затем синтезировали на синтезаторе олигонуклеотидов Expedite 8909, согласно инструкции прилагаемой к прибору. Очистку праймеров проводили методой спиртового переосаждения, конечную концентрацию праймера доводили до 20 nr.

Проведенные эксперименты по выбору пары праймеров показали, что оптимальными оказались праймеры PCR_PPRVJ3 и PCR_PPRV_r3, позволяющие нарабатывать ПЦР продукт размером 274 п.н. гена полимеразы, представленные на рисунке 2

на-

ЯС:

fmmfxni • i »«r-a

Г ¡ЛЛИжааяи-

Г<ют te« man»

PaetftiStuax,.

eai^^s»««

tltv.liii

Ш*93?ЛЪ.<И с Й*

в * * о«*«*«« t * « * уШ

Рисунок 2. Локализация специфических праймеров РСКРРЯУО и РСЯРРЯУгЗ на геноме вируса ЧМЖЖ

Подбор и отработка температурно-временного режима* Подбор и отработка температурно-временного режима амплификации является очень важным и сложным моментом при разработке метода ПЦР.

Температурный профиль »нотифицируемого цикла соответствует трем последовательным стадиям ПЦР (денатурации матрицы при нагревании, отжигу праймеров с одноцепочечной матрицей и синтезу второй цепи с помощью термостабильной ДНК-полимеразы). Для каждой стадии подбирается своя определенная температура и время. В общем случае температура этапа денатурации обычно выбирается между 90-95°С, отжига между 40-60°С, а достройки между 70-75°С.

На первом этапе исследований проводили синтез кДНК на РНК вируса ЧМЖЖ. Для наработки кДНК использовали специфический праймер, обратную транскриптазу и свободные нуклеотиды.

Синтез кДНК проводили в реакционной смеси, состоящей из:

Вода - до 50 мкл

5х буфер для ОТ - 10 мкл

MgCb -2,0 мкл

дНТФ (10 мМ) - 1,0 мкл

праймер -5,0 мкл

обратная транскриптаза MuLVRT - 0,6 мкл

РНК вируса ЧМЖЖ -4 мкл

Для синтеза кДНК пробирку помещали в термостат с температурой 37°С и инкубировали в течение 50 минут. По истечении времени пробы синтезированной кДНК использовали непосредственно в реакции ПЦР или помещали в холодильник на минус 20°С до использования.

Амплификацию специфического ПЦР продукта проводили в реакционной смеси, состоящей из:

10х ПЦР буфер -2,0 мкл

ДНТФ - 0,5 мкл

праймер PCR_PPRV_ß -1,0 мкл праймер PCR_PPRV_r3 - 1,0 мкл Taq ДНК полимераза - 0,5 мкл кДНК вируса ЧМЖЖ -1 мкл вода до . 20 мкл

Двуспиральная кДНК-матрица денатурируется при температуре, зависящей от содержания в ней GC оснований. Чем выше их содержание, тем выше требуется температура для полного расхождения цепей в молекуле кДНК. Также, более длинные матрицы кДНК требуют большей температуры для полной денатурации. Если температура денатурации будет слишком низкой, или время слишком коротким, будут денатурировать только регионы богатые АТ-основаниями. Однако слишком продолжительное время денатурации или слишком высокая температура приводят к нежелательной потере ферментативной активности полимеразы.

В наших экспериментах при подборе температурного режима для денатурации использовали стандартные условия - 95°С, так как содержание G+C пар генома ЧМЖЖ не превосходит 45 %. Выбор такого режима гарантирует денатурацию матричной кДНК на первом шаге. С целью полного расхождения цепей кДНК проводили преденатурацию при температуре 95°С в течение 2 минут.

Критичным для специфичности амплификации является, в основном, только выбор температуры отжига праймеров, при которой они взаимодействуют с комплементарными участками кДНК-матрицы. Несмотря на то, что праймеры присутствуют с самого начала, они не образуют связей при 90-95°С. При температуре в пределах 50-60°С праймеры способны гибридизоваться с комплементарными последовательностями на матричных нитях. Очень важно правильно подобрать температуру отжига праймеров. Считается, что температура отжига зависит от длины праймера и содержания в нем GC-nap. На сегодняшний день существует много компьютерных программ, которые определяют температуру посадки праймеров. Однако для каждой пары праймеров существует своя температура отжига и лучше всего оптимальную температуру подбирать эмпирически. В наших экспериментах оптимальную температуру отжига определяли на термоциклире ТС-512, Techne, используя градиент температур (55±25)°С. Полученные пробы анализировали в 2 % агарозном геле, приготовленном на TBE буфере. Полученные результаты представлены на рис. 3.

м 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Рисунок 3. Электрофореграмма амплифицированной кДНК вируса ЧМЖЖ при различных температурах отжига праймеров

Примечание: М - маркер "50 ЬрОКАЬасМег." Фирмы ВюЬаЬя, 1-отрицательный контроль 2-45,4°С, 3-46,6°С, 4-47,6°С, 5-49,3°С, 6-51,2°С, 7-52,5°С, 8-54,2°С, 9-55,0°С, 10-58 2°С 11-59,3°С, 12-61,6°С,13- 63,3°С, 14-65,3°С, 15-67,5°С.

Из рисунка 3 видно, что при температуре 45,4°С не происходит посадки праймеров. С увеличением температуры отжига начинает повышаться специфичность и выход ПЦР-продукта. При температурах от 52,5 до 59,3°С ПЦР-продукт нарабатывается в достаточных количествах, отсутствуют шлейфы. При температуре 61,6°С количество продукта начинает резко снижаться, по-видимому, она начинает превышать критическую температуру для данной пары праймеров. В дальнейших наших экспериментах при проведении ПЦР для детекции кДНК вируса ЧМЖЖ использовали 55°С.

При проведении ПЦР важное значение имеет фермент - полимераза, которая работает с комплексом элонгации (праймер и матрица ДНК). На данный момент известно, что существует три класса полимераз. Фермент выбирается в зависимости от размера специфического продукта. В наших исследованиях длина ПЦР-продукта составляет порядка 274 п.о. Рекомендуемой полимеразой при синтезе до 1000 п.о. является Тац-полимераза. Фермент оптимально работает при 72°С. Выбор такой температуры обеспечивает максимальную активность Тая-полимеразы на третьем шаге цикла амплификации.

Как известно, время синтеза определяется скоростью работы Тая-полимеразы и длиной амплифицируемого фрагмента. Как правило, при расчётах принимают во внимание, что для синтеза продукта размером 1000 п.о. необходима одна минута достраивать вновь синтезированные комплементарные цепи кДНК. Введение же в конце дополнительного времени синтеза (10 мин) при 72°С обеспечивает завершение синтеза всего неполного имеющегося амплификата. В проводимых исследованиях было изучено влияние продолжительности синтеза на наработку специфического продукта. Сокращение времени необходимого для синтеза, позволяет сократить время постановки диагноза. Поэтому, при отработке параметров метода ПЦР большое значение было уделено определению оптимального времени синтеза для амплификации продукта размером 274 п.о. Первоначально синтез проводили в течение 1 минуты, далее уменьшали время на каждые 10 секунд. Результаты исследований представлены на рис. 4.

Рисунок 4. Электрофореграмма амплифицированной кДНК вируса ЧМЖЖ при различной продолжительности синтеза.

Примечание: М - маркер ДНК "50 ЬрЭЫАЬасМег." ВшЬаЬя ", 1 - отрицательный контроль, 2 - 5 с синтез, 3 - 10 с, 4 - 15 с, 5 - 20 с, 6 - 30 с, 7 - 40 с, 8 - 50 с, 9 - 60 с, 10 -70с.

Из рисунка 4 видно, что при использовании в качестве времени синтеза 5 и 10 секунд отсутствуют какие-либо ПЦР-продукты. В течение 15 секунд нарабатывается ПЦР-продукт, но с очень низкой специфичностью. Достаточное количество ПЦР-продукта размером 274 п.о. нарабатывается в пробах, для которых используют время синтеза от 20 до 60 секунд. Таким образом, за 30 секунд полимераза полностью достраивает вновь синтезированные комплементарные цепи кДНК. В наших дальнейших экспериментах для синтеза ПЦР-продукта использовали 30 секунд.

На основании выбранных в процессе экспериментов оптимальных параметров времени и температур для всех стадий амплификации, был составлен следующий режим для проведения ПЦР:

95°С - 2 минуты - денатурация кДНК

72°С- 10 минут

После того как были определены временные и температурные условия амплификации, проводили оптимизацию содержания компонентов в реакционной смеси и отработку ПЦР.

Подбор оптимальных условий проведения ПЦР. Специфичность и чувствительность ПЦР находятся в большой зависимости от таких параметров, входящих в состав буфера, как концентрация MgCl2 и KCI, рН буфера. Изменения в буфере для ПЦР вызывают качественное или количественное изменение выхода амплификата.

MgCl2 необходим для поддержания активности Taq-полимеразы. Концентрация MgCl2 также влияет на отжиг праймеров и денатурацию образца. Однако избыток может вызывать неспецифичность продукта. КС1 и Трис-HCl обеспечивают необходимую ионную силу и рН смеси. Хлорид калия является активатором ПЦР и его добавляют для улучшения отжига праймеров. Предельной концентрацией КС1 является 50 мМ, так как последующее увеличение может привести к ингибированию полимеразы.

Варьирование концентраций MgCI2, КС1 и рН буфера может приводить к уменьшению выхода неспецифического продукта и увеличению выхода амплификата. Обычно оптимальные концентрации перечисленных выше соединений подбираются эмпирическим путем в процессе оптимизации условий реакции. Однако существующие на сегодняшний день наборы для оптимизации ПЦР значительно упрощают эту задачу.

Для подбора оптимальных условий проведения ПЦР был использован набор для оптимизации ПЦР - "PCROptimizationKitH" фирмы "Sigma".

94°С-30 сек 55°С-30 сек 72°С - 60 сек

В ходе работы были апробированы 10 буферных систем, которые различались концентрацией хлористого магния и калия, а также величиной рН. Состав буферных систем приведен в табл. 3.

Таблица 3

Состав б уферных систем, используемые при оптимизации ПЦР

№ буфера Состав ПЦР буфера, хЮ

1 100 мМ Трис НС1, рН 8,3, 15 мММёС12, 250 мМКС1

2 100 мМ Трис НС1, рН 8,3, 15 мММ§С12, 750 мМКС1

3 4 100 мМ Трис НС1, рН 8,3, 35 \iMMgCl2, 250 мМКС1 100 мМ Трис НС1, рН 8,3. 35 мMMga2, 750 мМКС1

5 100 мМ Трис НС1, рН 8,8, 15 мММ£С12,250 мМКС1

6 100 мМ Трис НС1, рН 8,8, 15 мММ^С12, 750 мМКС1

7 100 мМ Трис НС1, рН 8,8, 35 мММ§СЬ, 250 мМКС1

8 100 мМ Трис НС1, рН 8,8, 35 мMMgCI2, 750 мМКС1

9 100 мМ Трис НС1, рН 9,2, 15 мMMgCl2,250 мМКС!

10 100 мМ Трис НС1, рН 9,2, 15 мMMgCl2, 750 мМКС1

Амплификацию специфического ПЦР продукта проводят в реакционной смеси состоящей из:

10х ПЦР буфер - 2,0 мкл

дНТФ - 0,5 мкл

праймер РС11_РРК\/_13 - 1,0 мкл праймер РСЯ РРЯУ гЗ - 1,0 мкл Тац ДНК полимераза - 0,5 мкл

к ДНК вируса ЧМЖЖ - 1 мкл вода до 20 мкл

Амплификацию специфического участка проводили на термоциклере "ОепеАтрРСК 9700", фирмы "АррПе(1Вю5у51етз" при следующих режимах: 95 °С - 2 минуты - денатурация кДНК 94 °С- 30 сек

55 °С - 30 сек [40 циклов 72 °С- 60 сек Г 72 °С- 10 минут-1

По завершению наработки кДНК, полученные пробы детектировали электрофорезом в 2% агарозном геле, приготовленном на ТБЕ буфере в присутствии бромистого этидия. Полученные результаты представлены на рис. 5.

Рисунок 5. Электрофореграмма амплифицированной кДНК вируса ЧМЖЖ в различных буферных системах и режимах.

Примечание: М - маркер ДНК "ЛтрП517.еМо!еси!аг11и1ег 50-2000 Ьр", 1-10 - буферные системы.

Из полученных результатов видно, что при использовании буферных систем № 6, 7 и 10 не происходит амплификации фрагмента. При использовании остальных буферных систем (№ 1, 2, 3, 4, 5, 8 и 9) нарабатывается ПЦР-продукт размером 274 п.о., представленный на рисунке яркими и четкими полосами. Существенных различий при использовании буферных систем (№1, 2, 3, 4, 5, 8 и 9) не наблюдается. По-видимому, в буферных системах (№ 6, 7 и 10) сочетание более высокой рН и использование данных концентраций К^С12 и КС1 приводит к ингибированию реакции.

При проведении ПЦР как было упомянуто основная роль, отведена ферменту Тщ-полимеразе. Концентрация фермента в реакции подбирается в зависимости от индивидуальной мишени (кДНК) или праймеров. Если концентрация фермента слишком высокая, то могут образовываться неспецифические продукты, а если слишком низкая, то образуется недостаточное количество амплификата. При подборе оптимальной концентрации брали активности фермента в реакционной смеси от 0,5 ед до 3,0 ед/50 мкл, и проверяли результаты амплификации гель-элеюрофорезом в 2 % агарозе, которые представлены на рис. 6.

М 1 2 3 4 5 6

Рисунок 6. Оптимизация концентрации Taq ДНК-полимеразы в реакционной смеси при обнаружении кДНК вируса ЧМЖЖ (штамм "Темурмалик") методом ПЦР.

Примечание: 1 - 0,5 ед; 2 - 1,0 ед; 3-1,5 ед'; 4 - 2,0 ед; 5 - 2,5 ед; 6 - 3,0 ед; М -маркер "01гес1Ьоас1 \¥1<1еК.ал§еМагкег, 10.000 п.о. - 50 п о."

Как видно из рисунка 6 концентрация "Г ац ДНК-полимеразы влияет на выход конечного продукта; заметно, что с повышением концентрации фермента в реакционной смеси происходит увеличение интенсивности полос, а, следовательно, и концентрации ДНК. Однако при активности фермента всего 0,5 ед. нарабатывается ПЦР-продукт, который достаточно легко визуализировать в 2 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия под УФ-светом. Нужно отметить, что в разрабатываемой тест-системе полимераза является самым дорогим компонентом. Поэтому в наших экспериментах мы выбрали экономичный расход фермента - 0,5 ед.

Ионы М§2+ являются необходимым кофактором для ДНК-полимеразы в ПЦР. Многие компоненты реакционной смеси связывают эти ионы, в том числе ДНК-матрица, праймеры, ампликоны и дНТФ. Как известно, избыток концентрации ионов магния может приводить к появлению неспецифичности продукта реакции. Поэтому, чтобы определить и создать оптимальный избыток несвязанного иона проводили оптимизацию для выбранных концентраций ДНК-матрицы, праймера, дНТФ и ДНК-полимеразы путем изменения концентрации ионов в интервале 1-5 мМ. В наших экспериментах мы изучили влияние концентрации хлорида магния, начиная с 1 мМ постепенно повышая концентрацию до предельного значения 2,5 мМ. Результаты представлены на рис. 7.

М 1 2 3 4 5 6

Рисунок 7. Оптимизация концентрации !^С12 в реакционной смеси при обнаружении кДНК вируса ЧМЖЖ (штамм "Темурмапик") методом ПЦР.

Примечание: 1 - 1 мМ; 2 - 1, 5 мМ; 3 - 1,75 мМ; 4-2 мМ; 5 - 2,5 мМ; 6 -отрицательный контроль. М- маркер ДНК "АтрП51геМо1еси1агКи1ег 50-2000 Ьр"

Как видно из рисунка 7, изменение концентрации соли в пределах 1-2,5 мМ существенно не влияло на процесс амплификации. Выход специфического ПЦР-продукта был приблизительно одинаков. Нужно заметить, что и при максимальной концентрации М§С12 (2,5 мМ) нарабатывалось достаточно большое количество специфического продукта. На основании полученных экспериментальных данных в дальнейших экспериментах при проведении ПЦР, для приготовления реакционных смесей использовали концентрацию соли 1,5 мМ.

Определение специфичности и чувствительности ПЦР при идентификации ЧМЖЖ. На первом этапе исследований проводили синтез кДНК на РНК вируса ЧМЖЖ. Для наработки кДНК использовали специфический праймер, обратную транскриптазу и свободные нуклеотиды.

Синтез кДНК проводили в реакционной смеси состоящей из:

Вода - до 50 мкл

5х буфер для ОТ - 10 мкл

М§С12 - 2,0 мкл

дНТФ (10 мМ) - 1,0 мкл

праймер - 5,0 мкл

обратная транскриптаза МиЬУК'Г - 0,6 мкл

РНК вируса ЧМЖЖ- 4 мкл

Амплификацию специфического ПЦР продукта проводили в реакционной смеси, состоящей из:

10х ПЦР буфер -2,0 мкл

ДНТФ - 0,5 мкл

праймер РСЯ_РРЯУ_{3 - 1,0 мкл праймер РСИ РРКУ гЗ - 1,0 мкл Тац ДНК полимераза - 0,5 мкл кДНК вируса ЧМЖЖ - 1 мкл вода до -20 мкл

Амплификацию ПЦР-продуктов проводили в следующих температурно-временных режимах:

95°С - 2 минуты - денатурация кДНК 94°С - 30 сек

55°С - 30 сек 40 циклов 72°С - 60 сек Г 72°С-10 минут J

Дальнейшие исследования проводили по определению специфичности отработанного метода ПЦР при идентификации вируса ЧМЖЖ. В качестве исследуемых проб использовали РНК вирусов ЧМЖЖ, ЧКРС, ЧП и БН. Полученные результаты исследований представлены на рис. 8.

1 2 3 4 М

Рисунок 8. Определение специфичности ПЦР при идентификации вируса ЧМЖЖ. Примечание: М - маркер ДНК, 1 - кДНК ЧМЖЖ штамм "Темурмалик", 2 - кДНК вируса чумы плотоядных, 3 - кДНК вируса ЧКРС штамм "К37-70", 4- кДНК вируса болезни Ньюкасла штамм "Ла-Сота"

Как видно из представленных данных при использовании пар праймеровРСЖРРК V П и PCR._PPR.V_rl и подобранных условий постановки ПЦР образовался ПЦР-продукт размером 274 п.н. только в пробе с вирусом ЧМЖЖ, в остальных пробах кДНК обнаружено не было.

Дальнейшие исследования проводили по определению чувствительности разработанного метода ПЦР при идентификации вируса ЧМЖЖ. Чувствительность метода определяли десятикратными разведениями кДНК. Полученные результаты представлены на рис. 9.

вируса ЧМЖЖ пг; 7-0,1 пг; 8- 10

Рисунок 9. Определение чувствительности ПЦР при идентификации Примечание: 1 - 100 нг; 2- 10 нг; 3 - 1 нг;4-0,1 нг; 5 - 10 пг; 6 - 1 фг; 9 - 1 фг. М - маркер ДНК "ВюЬа1к 50 ЬрВЫАЬасШег, "50 - 1350 Ьр".

Как видно из данных рисунка 9 чувствительность разработанного метода ПЦР при выявлении кДНК вируса ЧМЖЖ составляет 0,1 пг.

Таким образом, в результате исследований по определению параметров постановки ОТ-ПЦР для идентификации вируса ЧКРС оптимальными оказались использование специфических праймеров PCR._PPR.V_fl и РСЯ_РРЯУ_г1, позволяющие нарабатывать ПЦР продукт размером 274 п.н., характерный только для вирусов ЧМЖЖ.

Была также показана высокая специфичность разработанного метода, при котором только в положительных пробах нарабатывались специфические ПЦР продукты размером 274 п.н. Полученные результаты представлены на рис. 10.

М 1 234567 89

Рисунок 10. Электрофоретический профиль разделения ПЦР продуктов при апробации тест-системы по выявлению кДНК вируса ЧМЖЖ из патологических материалов методом ПЦР.

Примечание - М - маркер ДНК "АтрИ51геМо1еси1аЖи1ег 50-2000 Ьр", 1 - кДНК вируса чумы МЖЖ, штамм "Темурмалик" (положительный контроль) , 2-8 - 20 % суспензия органов от павших животных от ЧМЖЖ из Хатлонской области, 9 - отрицательный контроль.

Из рисунка 10 видно, что на дорожках 2-8 образуются полосы, лежащие на одном уровне с положительным контролем. Данный факт позволяет заключить, что во всех исследуемых пробах методом ПЦР с последующей детекцией электрофорезом выявлена к ДНК вируса ЧМЖЖ.

Таким образом, результаты испытаний показывают, что разработанная ПЦР тест-система позволяет выявлять кДНК вируса ЧМЖЖ из патологических материалов.

Тест-система для диагностики ЧМЖЖ на основе ПЦР. Тест-система для диагностики ЧМЖЖ, состоит из двух комплектов. Комплект А предназначен для выделения РНК из вируссодержащего материала, который включает раствор 1, раствор 2 и раствор 3 и РНК-элюент. Комплект Б предназначен для проведения реакции обратной транскрипции и постановки ПЦР, состоящий из: обратной транскриптазы, смеси праймера и нуклеотидов для синтеза кДНК, буфера для обратной транскрипции, ПЦР-буфера, смеси специфических праймеров и нуклеотидов для ПЦР, ДНК полймеразы, положительного контроля и воды.

В результате подбора компонентного состава набора, состоящего из двух комплектов, для выделения РНК и постановки ПЦР при обнаружении РНК вируса ЧМЖЖ был определен оптимальный его состав, представленный в таблицах 4 и 5.

Таблица 4

Комплект для выделения РНК вируса ЧМЖЖ___

Наименование компонентов в наборе Объем компонента (мл) Тип упаковки Кол-во пробирок (шт.)

Раствор 1 5,0 пластиковый флакон объемом 10 мл 1

Раствор 2 25,0 пластиковый флакон объемом 50 мл 1

Раствор 3 25,0 пластиковый флакон объемом 50 мл 1

РНК-элюент 0,5 пластиковая пробирка объемом 1,5 мл 10

Таблица 5

Наименование компонентов в наборе Объем компонента (мкл) Тип упаковки Кол-во пробирок (шт.)

Буфер для обратной транскрипции 1000,0 пластиковая пробирка объемом 1,5 мл 1

Обратная транскриптаза 50,0 пластиковая пробирка объемом 1,5 мл 1

Смесь праймера и дНТФ для кДНК 250,0 пластиковая пробирка объемом 1,5 мл 1

ДНК полимераза 50,0 пластиковая пробирка объемом 1,5 мл 1

ПЦР-буфер 500,0 пластиковая пробирка объемом 1,5 мл 1

Смесь праймеров и дНТФ для ПЦР 300,0 пластиковая пробирка объемом 1,5 мл 1

Положительный контроль кДНК вируса ЧМЖЖ 100,0 пластиковая пробирка объемом 1,5 мл 1

Вода 1000,0 пластиковая пробирка объемом 1,5 мл 2

Испытание тест-системы при выявлении кДНК вируса ЧМЖЖ на основе ПЦР проводили в лабораторных условиях на базе НПП «Биологические препараты» ТАСХН.

Применение данной тест-системы подразумевает проведение трех этапов: выделение РНК, обратная транскрипция для синтеза кДНК и постановка ПЦР, при которой амплифицируется специфический фрагмент к-ДНК вируса ЧМЖЖ, размером 274 п.н. ПЦР продукт детектируется с помощью электрофореза в агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

Компоненты для проведения электрофореза ПЦР продуктов в агарозном геле в данную тест-систему не входят и приобретаются отдельно.

Таким образом, использование тест-системы для диагностики ЧМЖЖ позволяет проводить анализ исследуемых проб на наличие или отсутствие вируса ЧМЖЖ. Реакция считается положительной, если в исследуемой пробе наблюдается ПЦР продукт размером 274 п.н. Отсутствие полос ДНК или наличие полосы ДНК другого размера говорит об отрицательном результате. Тест-система предназначена для проведения 50 ПЦР-анализов.

Выводы

1. Подобраны оптимальные условия очистки и концентрирования вируса ЧМЖЖ штамма «Темурмалик», позволяющие получать вирус, пригодный для выделения РНК.

Очистка и концентрирование через ДЭАЭ-целлюлозы позволил сконцентрировать вирус ЧМЖЖ в 100 раз с концентрацией вирусных белков (5,26±0,44) мг/см3.

2. Подобраны оптимальные условия выделения нативных препаратов геномной РНК из очищенного и концентрированного вируса ЧМЖЖ штамма «Темурмалик», позволяющие получать высокоочищенную и нефрагментированную нуклеиновую кислоту. Обработка вируса протеиназой К в присутствии додецилсульфата натрия и инкубирование при 56оС в течение часа с последующей экстракцией фенол/хлороформом позволяет получать образцы вирусной РНК с выходом 15-25%.

3. Впервые сконструированы и синтезированы специфические праймеры на ген тимидинкиназы для амплификации участка геномной кДНК вируса ЧМЖЖ, имеющие нуклеотидный состав:

- PCR_PPRV_fl;

- PCR_PPRV_rl.

4. Установлено, что для отжига сконструированных праймеров и синтеза ПЦР-продукта требуется 30; 30 и 60 секунд для каждой стадии. Определен оптимальный состав реакционный смеси при проведении ПЦР по обнаружению кДНК вируса ЧМЖЖ.

5. Предлагаемая ПЦР тест-система позволяет выявлять кДНК вируса ЧМЖЖ в пробах органов взятых от больных и павших животных, при отсутствии у них клинической картины.

Практические предложения

Разработана и оформлена научно-техническая документация:

- Тест-система [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции, CT 405-1919-04 ГП-050-2012 (28 февраля 2012г.);

- Тавсияхо оид ба гузаронидани тадбирхои зиддиэпизооти ва пешгирикунанда хангоми тоуни чорвои хурди шохдор (Рекомендации по проведению противоэпизоотических мероприятий при чуме мелких жвачных животных (15 марта 2011г.)).

Лабораторный вариант ПЦР тест-системы для детекции кДНК вируса ЧМЖЖ рекомендуется к использованию в ветеринарных лабораториях и животноводческих хозяйствах Республики Таджикистан. Данная тест-система адаптирована к вирусам, циркулирующим на территории Таджикистана.

Результаты данных исследований можно использовать при серийном выпуске тест-систем для диагностики ЧМЖЖ на основе ПЦР.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аноятбеков М. Серомониторинг чумы мелких жвачных животных Таджикистана /Джумаев Ш.Н., Бобоев Г.Ю. и др. // ж. Ветеринария: изд-во. «Эчод»,- Душанбе.- 2005.- № 3.-С.30.

2. Джумаев Ш.Н. Эпизоотическая ситуация по трансграничным болезням животных в Таджикистане /Бобоев Г.Ю., Косумбеков М.И. и др. // ж. Ветеринария: изд-во. «Эчод».-Душанбе,- 2005. № 4,- С. 15-18.

3. Бобоев Г.Ю. Серологический мониторинг чумы мелких жвачных животных /, Джумаев Ш.Н. и др. // Актуальные проблемы, перспективы развития сельского хозяйства: Сб.н.тр.. Том III. - Душанбе: изд-во. «Дониш» - 2006,- С. 195-197.

4. Амирбеков М. О чуме овец и коз в Таджикистане / Мурватуллоев С.А, Аноятбеков М., Бобоев Г., Джумаев Ш. и др. // Вестник Кыргызского научно-исследовательского института животноводства, ветеринарии и пастбищ имени А. Дуйшева,- Бишкек.-2007.-С.171-174.

5. Аноятбеков М.А. Приготовление и контроль иммунопероксидазных конъюгатов для иммуноферментного анализа при чуме мелких жвачных животных /Джумаев Ш.Н., Бобоев 3 "с 48 53^ ^0КЛаДЫ Таджикской академии сельскохозяйственных наук,- Душанбе.-2007. №

6. Аноятбеков М.А. Изучение культуральных свойств вируса чумы мелких жвачных животных, выделенного в Республике Таджикистан /Джумаев Ш.Н., Бобоев Г.Ю. и др // Материалы международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных рыб и пчел», посвященной .110-летнему юбилею Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко.-М.: ВИЭВ.-2008.- С. 41-45.

7. Бобоев Г.Ю. Распространение и особенности проявления чумы мелких жвачных животных в Таджикистане /Джумаев Ш.Н., Вискова Т.К. и др.//Материалы международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел», посвященной 110-летнему юбилею Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко.-М.: ВИЭВ.-2008.-С. 55-60.

8. Кошеметов Ж.К. Изучение антигенных свойств вируса чумы мелких жвачных животных в лабораторных тест-системах /Джумаев Ш.Н., Бобоев Г.Ю и др //ж Ветеринария: изд-во. «Эчод».- Душанбе.- 2008,- № 4,- С. 26-31.

9. Кошеметов Ж.К. Изучение культурального свойства штамма «Кентау-7» вируса чумы мелких жвачных животных /Джумаев Ш.Н., Бобоев Г.Ю. и др. И ж Ветеринария- изд-

во. «Эчод».-Душанбе,-2009.-№ 2,-С. 31-35.

10. Бобоев Г.Ю., Эпизоотическая ситуация по чуме мелкого рогатого скота в Республике Таджикистан /Джумаев Ш.Н., Аноятбеков М.А. и др. Ветеринарная медицина домашних животных: сборник науч. статей,- Выпуск 7.-Казань:- КВА.-2010,- С. 83-85.

11. Джумаев Ш.Н. Оптимальные условия проведения иммуноферментного анализа для выявления антител против чумы мелких жвачных животных /Бобоев Г.Ю., Аноятбеков M А и др. // Ветеринарная медицина - 2011,- № 1- С. 72-74.

12. Строчков В.М. Разработка полимеразной цепной реакции для диагностики чумы мелких жвачных животных / Кошеметов Ж.К., Бобоев Г.Ю., и др.// Теоретический и научно-практический журнал «Кишоварз» (Земледелец) ТАУ им. Ш.Шотемур №1(53) 2012г.

Бумы* 60/14 Почать офсетная, Занв 21/4. Тираж 100 экз.

Отечмтамж в тяпогрлфян издательство «Ноднр» улАйни ,44

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Бобоев, Гиёсиддин Юнусович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Краткая характеристика ЧМЖЖ.

2.2. Эпизоотология ЧМЖЖ.

2.2.1. Распространение ЧМЖЖ.

2.2.2. Факторы распространения ЧМЖЖ.

2.3. Биологические свойства вируса ЧМЖЖ.

2.4. Физико-химические свойства вируса ЧМЖЖ.

2.5. Антигенные свойства вируса ЧМЖЖ.

2.6. Диагностика ЧМЖЖ.

2.7. Молекулярно-генетические методы диагностики.

2.7.1. Полимеразная цепная реакция.

2.7.2. Применение ПЦР для диагностики ЧМЖЖ.

2.8 .Выводы по обзору литературы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.1.1. Вирусы и вируссодержащие материалы.

3.1.2. Реактивы, растворы и оборудование.

-33.2. Культивирование и титрование вируса ЧМЖЖ.

3.3. Очистка и концентрирование вируса ЧМЖЖ.

3.4. Оценка эффективности методов очистки и концентрирования 41 вируса ЧМЖЖ.

3.5. Электрофоретический анализ белков ЧМЖЖ.

3.6. Электрофоретический анализ вирусного белка в ПААГе.

3.7. Выделение нуклеиновых кислот из очищенных препаратов 42 вирусов, культуральных и органо-тканевых вируссодержащих материалов.

3.7.1. Выделение РНК из очищенных и концентрированных препаратов вируса ЧМЖЖ.

3.8. Сбор данных нуклеотидных последовательностей вируса.

3.9. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей.

3.10. Конструирование праймеров.

3.11. Синтез и очистка олигонуклеотидов.

3.11.1 Синтез к ДНК на РНК вируса.

3.12. Оптимизация параметров постановки ПЦР при идентификации

3.12.1. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот.

3.12.2. Определение чувствительности и специфичности ПЦР.

3.12.3. Определение диагностической ценности ПЦР.

3.13. Постановка и учет результатов серологических реакций.

3.13.1. Подготовка проб патологического материала.

-43.13.2. Постановка РДП.

3.13.3. Постановка ИФА.

3.14. Статистическая обработка данных.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Очистка и концентрирование вируса ЧМЖЖ.

4.1.1. Подбор оптимальных условий культивирования вируса 50 ЧМЖЖ.

4.1.2. Получение очищенных и концентрированных препаратов 51 вируса ЧМЖЖ из вируссодержащих материалов.

4.1.3. Электронномикроскопическое изучение морфологии и 53 структуры вируса ЧМЖЖ.

4.2. Подбор оптимальных методов выделения РНК вируса.

4.3. Определение физико-химических свойств РНК вируса ЧМЖЖ.

4.3.1. Определение константы седиментации РНК вируса ЧМЖЖ.

4.3.2. Определение плавучей плотности РНК вируса ЧМЖЖ.

4.4. Поиск и анализ нуклеотидных последовательностей генома 58 вируса чумы МЖЖ в международных базах данных.

4.5. Разработка метода ПЦР для идентификации вируса ЧМЖЖ.

4.5.1. Подбор праймеров.

4.5.2. Подбор и отработка температурно-временного режима.

4.5.3. Подбор оптимальных условий проведение ПЦР.

-54.5.4. Определение специфичности и чувствительности ПЦР при идентификации ЧМЖЖ.

4.5.5. Тест-система для диагностики ЧМЖЖ на основе ПЦР.

4.6. Комиссионная апробация тест-системы для диагностики 82 ЧМЖЖ на основе ПЦР.

4.7. Эпизоотологический мониторинг и использование метода ПЦР 86 для выявления кДНК вируса ЧМЖЖ в полевых материалах.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Тест-система [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции"

Актуальность проблемы

Среди многих проблем Таджикистана, связанных с интенсификацией животноводства, существует и такая, как разработка и усовершенствование методов и средств борьбы с заразными заболеваниями животных и их профилактика. В значительной мере её решение определяется уровнем знаний биологии и экологии возбудителей заболеваний, климато-географических и биологических факторов местности и их влияния, как на микро-, так и на макроорганизмы.

Однако эпизоотология, экология возбудителей многих социально и экономически опасных заболеваний животных, таких как сибирская язва, эмфизематозный карбункул, энтеротоксемия, контагиозная эктима овец, катаральная лихорадка овец и многие другие в Таджикистане недостаточно изучены. К таким инфекциям относится и чума мелких жвачных животных, тогда, как известно, что без изучения эпизоотологической ситуации и свойств возбудителя немыслима организация эффективных мер борьбы с этой болезнью.

Чума мелких жвачных животных (ЧМЖЖ) - чрезвычайно инфекционное заболевание домашних и диких жвачных животных. Впервые оно было зарегистрировано в Западной Африке (Кот - Дивуаре) в 1942 году. Постепенно было выявлено, несколько клинических одинаковых болезней, возникающих в других частях Западной Африки.

Чума мелких жвачных животных выявлена во многих Африканских странах, расположенных между Атлантическим Океаном и Красным морем.

Последние годы болезнь была зарегистрирована на Ближнем Востоке и Аравийском Полуострове, в таких странах, как Исламская Республика Ирана, Ирак, Израиль, Иордания, Кувейт, Ливан, Оман, Саудовская аравия, Объединенные Арабские Эмираты и Йемен, а также есть серологическое подтверждение в Сирийской арабской Республике и Турции. Известны вспышки ЧМЖЖ в Индии, Непале, Бангладеш, Пакистане и Афганистане. ЧМЖЖ в странах бывшего Советского Союза недостаточно изучены.

В Таджикистане до недавнего времени не имелось сообщений о присутствии вируса ЧМЖЖ. И лишь благодаря болыпым усилиям Службы государственного ветеринарного надзора МСХ РТ, сотрудниками ФАО ООН и сотрудниками Научно-Производственного предприятия «Биологические препараты» Республики Таджикистан и РГП Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности Республики Казахстан был проведён в овцеводческих хозяйствах республики эпизоотологический мониторинг степенни зараженности ЧМЖЖ.

В Таджикистане ЧМЖЖ была подтверждена экспертной лабораторией МЭБ.

Экономический ущерб от ЧМЖЖ в Таджикистане значительный. В ряде хозяйств согласно данным ветеринарной отчетности РТ заболеваемость овец и коз в среднем превышало 40%-45%.

Недостаточная изученность заболевания, отсутствие методов диагностики, мер борьбы и специфической профилактики поставили перед нами разрешение следующих вопросов.

Для успешной борьбы с ЧМЖЖ необходимы глубокие знания эпизоотологии болезни, возбудителя болезни циркулирующего в данном регионе, природно-климатических особенностей местности и методов ведения животноводства.

Для диагностики и идентификации вируса ЧМЖЖ на сегодняшний день в мире разработаны и применяются различные серологические и иммунологические методы. Все они имеют различную диагностическую ценность - одни требуют значительных затрат по времени, другие имеют низкую чувствительность и специфичность [133, 134, 135, 136]. Поэтому усовершенствование и разработка более чувствительных и специфичных, а также экспрессных методов диагностики, остается актуальной проблемой.

Метод ПЦР имеет ряд преимуществ - прямое определение ДНК возбудителя, высокая специфичность, высокая чувствительность, универсальность процедуры, простота и удобство проведения анализа, сравнительно небольшие затраты времени на проведение анализа. В зарубежных странах метод ПЦР успешно применяют для диагностики ЧМЖЖ [56, 57, 133, 134]. Разработка эффективных, быстрых и надежных методов диагностики ЧМЖЖ является весьма актуальной проблемой для Таджикистана.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлась разработка тест-системы [набора] для диагностики ЧМЖЖ, с использованием компьютерно-моделированных и синтезированных специфических праймеров.

Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:

2. Отработать оптимальные методы выделения РНК из очищенного вируса ЧМЖЖ;

5. Изучить специфичность и чувствительность ПЦР системы при выявлении кДНК вируса ЧМЖЖ.

Научная новизна работы

Впервые сконструированы и синтезированы оригинальные праймеры для амплификации фрагмента гена РНК-полимеразы вируса ЧМЖЖ, имеющие нуклеотидный состав:

- РСЯРРРЛМЗ;

- РСЯРРЮ/гЗ.

Данные праймеры ограничивали участок кДНК вируса ЧМЖЖ размером 274 п.о.

Разработан и апробирован вариант ПЦР тест-системы для детекции кДНК вируса ЧМЖЖ.

Основные положения, выносимые на защиту:

- сконструированные, отобранные и синтезированные специфические праймеры могут быть использованы для амплификации участка геномной к ДНК вируса ЧМЖЖ размером 274 п.о.;

Практическая значимость работы

Разработана ПЦР тест-система для детекции кДНК вируса ЧМЖЖ, которая является высокочувствительной, простой в исполнении, позволяет поставить диагноз в короткие сроки, включая ранние стадии инфекции.

По результатам исследований разработана и составлена нормативно-техническая документация, включающая:

Тавсияхо оид ба гузаронидани тадбирхои зиддиэпизооти ва пешгирикунанда хангоми тоуни чорвои хурди шохдор (Рекомендации по проведению противоэпизоотических мероприятий при чуме мелких жвачных животных (15 марта 2011г.)).

Таким образом, полученные в диссертационной работе результаты позволяют упростить диагностику ЧМЖЖ и повысить её эффективность, что может сократить экономические потери в животноводстве от данного заболевания.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на: заседаниях Ученого Совета Научно-производственное предприятие «Биологические препараты» (Среднеазиатского ящурного института) Таджикская Академия сельскохозяйственных наук - 2003-2011гг. Основные положения диссертационной работы изложены и обсуждены на научно -теоретических конференциях в гг. Бишкеке Республики Кыргызстан, в Казани и Москве Российской Федерации.

Публикации по теме диссертации

По теме диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, из них три статьи в изданиях, по перечню ВАК Российской Федерации, в которых изложены основные положения и выводы по изучаемым вопросам.

Личный вклад соискателя

Экспериментальные данные получены автором самостоятельно. Теоретическое обоснование, проведение экспериментов, анализ и обработка полученных данных проведена при личном участии автора и сотрудников РГП Научно- исследовательского института проблем биологической безопасности Республики Казахстан. Результаты работы опубликованы и апробированы в производственных условиях.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность за неоценимую помощь, оказанную при выполнении данной работы, критическую оценку и ценные советы при оформлении диссертации сотрудникам РГП Научно- исследовательского института проблем биологической безопасности Республики Казахстан, Ж.К. Кошеметову, С. Нурабаеву, Hi ill «Биологические препараты» ТАСХН Т.К. Висковой, М.И. Косумбекову.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 131 странице компьютерного текста (Word) и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы. Список используемой литературы включает 138 источников, из которых 114 иностранных. Диссертация иллюстрирована 29 рисунками, 9 таблицами. Приложение на 3 страницах.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Бобоев, Гиёсиддин Юнусович

6. выводы

По результатам исследований можно сделать следующие выводы:

1. Подобраны оптимальные условия очистки и концентрирования вируса ЧМЖЖ штамма «Темурмалик», позволяющие получать вирус, пригодный для выделения РНК. Очистка и концентрирование через ДЭАЭ-целлюлозы позволил сконцентрировать вирус ЧМЖЖ в 100 раз с о концентрацией вирусных белков (5,26±0,44) мг/см .

3. Впервые сконструированы и синтезированы специфические праймеры на ген тимидинкиназы для амплификации участка геномной к ДНК вируса ЧМЖЖ, имеющие нуклеотидный состав:

-РСРМРРЯУА;

- РСЯРРЮ/г1.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработана и оформлена научно-техническая документация:

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Бобоев, Гиёсиддин Юнусович, Душанбе

1. Бакулов И.А. Эпизоотическая ситуация в мире по особо опасным болезням животных к концу XX столетия / Бакулов И.А. // Материалы межд. науч.-практ. конф. 15-16 авг. 2000г., г. Покров 2000г. С. 11-17.

2. Бакулов И.А. Мировая эпизоотическая ситуация по болезням диких животных / Бакулов И.А., Котляров В.М. // Материалы межд. науч. -практ. конф. 16-18 апр. 2002г., г. Покров.

3. Диев В.И. Изучение чувствительных различных клеточных культур к вирусу чумы мелких жвачных животных / Диев В.И., Соколов Л.Н., Мамкова Р.В., Евсеев A.M., Куляшбекова Ш.К. // Вирусные болезни сельскохозяйственных животных. Владимир, 1995. - С.94.

4. Кутумбетов Л.Б. Динамика накопления вируса ЧМЖЖ в органах и тканях больных и павших животных / Кутумбетов Л.Б., Л.В. Половиника, А.Г. Демченко и др.// Ветеринарная вирусология: тез. докл. науч.- теорет.конф. -Гвардейский, 1989. Т.1. С.41-43.

5. Курченко, Г.А. Чума мелких жвачных животных / Г.А. Курченко // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: тез.докл. науч. конф. Покров, 1985. С.63-67.

6. Михалкин И.П. Чумы мелких жвачных / Михалкин И.П. // Сибирская язва и другие опасные инфекционные болезни животных. Покров, 2005. - С.159-163.

7. Митин Н.И. Чума мелких жвачных / Митин Н.И. // Карантинные и малоизвестные болезни животных под редакцией И.А.Бакулова М. Колос 1983г.-С.106-108.

8. Мурватуллоев С. А., Шоназар Джилваи Муносиб. О Чуме мелких жвачных животных. \Ветеринария, Душанбе, 2009, №1, С. 28-32.

9. Русанов, P.C. Устойчивость вируса ЧМЖ к различным температурным воздействиям и ультрафиолетовому облучению / P.C. Русанов, Б. Н. Карпов, Г.А. Гуленок // Тез. докл. науч. конф. по вет. вирусологии -Гвардейский, 1983.- С.293-295.

10. Степанов А.В Персистенция вируса чума мелких жвачных в перевиваемых культуре клетке / Степанов A.B. Вишняков И.Ф., Стрижаков А. // Материалы межд. науч. практ. конф. 15-16 авг. 2000г. г. Покров 2000. - С. 206-209.

11. Степанов A.B. Молекулярно-генетический метод диагностики чумы мелких жвачных /Степанов A.B. // Материалы межд. науч.-практ. конф. 15-16 авг. 2000г., г. Покров.

12. Степанов, A.B. Использование полимеразной цепной реакции для выявления вируса чумы мелких жвачных / A.B. Степанов, Я.С. Цыбанов, И.Ф. Вишняков // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Щёлково, 200. С. 232-233.

13. Сюрин В.Н. Руководство по ветеринарной вирусологии /Сюрин В.Н.// Москва-1966г. С. 120-127.

14. Сюрин B.H. Диагностика вирусных болезней животных.-М.: Агропромиздат, 1991.-С.90-101.

15. Сюрин В.Н. Вирусные болезни животных / Сюрин В.Н., А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина. М.: ВНИТИБП, 1998. - С. 928.

16. Справочник под ред. Д.Ф. Осидзе., М.Агропромиздат./ Инфекционные болезни животных // 1987г. С.73.

17. Abedunde А.А. Excretion of the virus of peste des petits ruminants by goats-Bull / Abedunde A.A, Adu F.D. // Anim. Health Product in Africa, 1977, v. 25,3.307-311.

18. Abu-Elzein EME. Isolation of peste des petits ruminants from goats in Saudi Arabia /Abu-Elzein EME, Hassanien M.M, Al-Afaleq AI, Abdelhadi M.A., Honsawai FMJ.// Vet Rec 1990; 27:309.

19. Ajala O.O. Treatment of peste des petits ruminants (PPR) in pre-weaned West African Dwarf Goat /Ajala O.O., Daneji, A.l, Kumshe H.A. and Oyeyemi M. О.// Kids. Trop. Vet. 1(1997) 15: 39-42.

20. Alcigir G. Tiirkiye'de kuzularda peste des petits ruminants virus enfeksiyonunun patomorfolojik ve immunohistolojik ilk tanimi /Alcigir G., Vural S.A., Toplu N.//Ankara Universitesi Veteriner Fakiiltesi Dergisi 1996;43:181-9.

21. Al-Naeem A.Epizootiological aspects of peste des petits ruminants and rinderpest in sheep and goats in Saudi Arabia /Al-Naeem A, Abu-Elzein EME, Al-Afaleq AI.// Rev Sci Tech (International Office of Epizooties) 2000; 19:855-8.

22. Anderson J. The detection of antibodies against peste des petits ruminants virus in cattle, sheep and goats and the possible implication to rinderpest control programmes /Anderson J. & McKay J.A. // Epidemiol. Infect., (1994).112, 225-234.

23. Appel M.J. Dog lymphocyte cultures facilitate the isolation and growth of virulent canine distemper virus. /Appel M.J., S. Pearce Kelling and B.A. Summers. 1992.//J. Vet. Diagn. Invest. 4:258-263.

24. Awa D.N.Economics of prophylaxis against peste des petits ruminants and gastrointestinal helminthosis in small ruminants in north Cameroon /Awa D.N., Njoya A., Ngo Tama A.C.// Trop Anim Health Prod 2000; 32:391-403.

25. Barrett T. Rinderpest and distemperviruses / Barrett T. // In: R.G Webster and A. Granoff(eds). Encvci. Virol. (1994). 3: 1260-1268.

26. Barrett T. Dolphin and porpoise morbilliviruses are genetically distinct from phocine distemper virus /Barrett T., Visser, I.KG., Mammaev, L., Van Bressem, M.F., Osterhaus, A.D.M.E.// (1993). Virology 193: 1010-1012.

27. Brown C.C. An immunohistochemical study of the pneumonia caused by peste des petits ruminants virus /Brown C.C., Mariner J.C. and Olander H. J.// 1991. Vet. Pathol. 28:166-170.

28. Banyard A. C. A role for virus promoters in determining the pathogenesis of Rinderpest virus in cattle / Banyard A. C., Baron M. D., Barrett T.// (2005). J Gen Virol 86: 1083-1092 Abstract. [Full Text]

29. Baron M.D. The Plowright vaccine strain of Rinderpest virus has attenuating mutations in most genes /Baron M.D., Banyard A.C., Parida S., Barrett T.// (2005).J Gen Virol 86: 1093-1101 Abstract.[Full Text]

30. Bao J, Li L, Wang Z, Barrett T, Suo L, Zhao W, et al. Development of one-step real-time RT-PCR assay for detection and quantization of peste des petits ruminants virus. J. Virol. Methods. 2008; 148:232-236.

31. Braide V.P. Peste des petits ruminants, a review /Braide V.P.//FAO World Animal Review, (1981). 39: 25-28.

32. Bundza A. Experimental peste des petits ruminants (goat plague) in goats and sheep / Bundza A., Afshar A., Dukes T.W., Myers D.J., Dulac G.C. & Becker S.A.W.E.// (1988). Can. J. Vet. Res., 52, 46-52.

33. Bourdin P. Note sur la structure du virus de la Peste des petits ruminants-Rev/Bourdin P., Laurent A.// Elev. Med. Vet. Pays trop, 1967,20, 3, p. 383-386.

34. Bourdin P. Em ploi d'um vaccin antibo vipestigue produit sur cultures cellulaires dans la prophylaxia de la peste des pepits ruminants au Dahomey-Rev /Bourdin P., Rioche M., Laurent A.// Elev. Med. Vet. Pays trop, 1970, v.23, 3, p. 295-300.

35. Bourdin P. La peste des petits ruminants et so prophylaxia an Senegal en Afrique de L'Ouest-Rev / Bourdin P.//Elev. Med. Pays trop, 1967, v.36, 4, p. 71-74.

36. Cilli V. La peste dei piccoli ruminanti. Arcu /Cilli V., Arush M.A.// Vet. Ital., 1980, v.31, 6, p. 147- 154.

37. Couacy-Hymann E. Rapid and sensitive detection of peste des petits ruminants virus by a polymerase chain reac-tion assay /Couacy-Hymann E., Roder F., Hurard C., Guillou J.P., Libeau G.// J. Virol. Meth. -2002. -100. -P. 17-25.

38. Cosby S.L. Characterisation of a seal Morbillivirus /Cosby S.L., S. Mc Quaid, N. Duffy, C. Lyons, B. K. Rima, G. M. Allan, S. J. McCullough S., Kennedy J. A., Smyth F., Mc Neilly, C. Craig and C. Orvell.// 1988.Nature (London) 336:115-116.

39. Couacy-Hymann R.F. Rapid and sensitive detection of peste des petits ruminants virus by a polymerase chain reaction assay /Couacy-Hymann R.F., Hurard C., Guillou J.P., Libeau G. & Diallo. A.// (2002). J. Virol. Methods, 100, 17-25.

40. Croi K.S. Monoclonal antibody- based competitive ELISA for simultaneous detection of rinderpest virus and peste des petits rumi-nants virus antibodies /Croi K.S., Naha J.J., Choi C.U.// Veterinary Microbiology. -2003.-96.-P. 1-16.

41. Dardiri A.H. Response of American goats and cattle to peste des petit ruminants /Dardiri A.H., De Boer C.J, Hamdy F.M.// Vet Lab Diagn 1976;337—344.

42. Dardiri, A.H. Peste des petits ruminants / A.H. Dardiri // Reference Manual. Foreign Animal Disease Courses. 1978. P. 92-102.

43. Diallo A. Resent developments in the diagnosis of rinderpest and peste des petits ruminants /Diallo A., Libeau G., Couacy-Hymann E., Barbron M.// Veterinary Microbi-ology. -1995. -44. P. 307-317.

44. Diallo A. Differentiation of rinderpest and peste des petits ruminants viruses using specific cDNA clones /Diallo A., T. Barrett M., Barbron S. M., Subbarao and W. P.Taylor.// 1989.J. Virol. Methods 23:127-137.

45. Diallo A. Attenuation souche de virus de la peste des petits ruminants: candidat peour un vaccine homologue vivant /Diallo A., Taylor W.P., Zeferve P.C., Provost A.// Revue Elev. Med. Vet. Pays Trop., 1989, №42, №3, p. 311319.

46. Diallo A. Comparison of proteins induced in cells infected with rinderpest and peste des petits ruminants viruses / Diallo A., T. Barrett, P.-C. Lefvevre, and W. P. Taylor.// 1987. J. Gen. Virol. 68:2033- 2038.

47. Durojaiye O.A. Precipitating antibody in sera of goats naturally affected with peste des petits ruminants /Durojaiye O.A.// Trop. Anim. Health Prod., 14,98-100.

48. Durojaiye O.A. (1984). Detection of the antigen of peste des petits ruminants virus in tissues by indirect immunofluorescence technique /Durojaiye O.A.// (1984). Niger. Vet. J., 13, 77-80.

49. Durojaiye O.A. Virological and serological diagnosis of peste des petits ruminants /Durojaiye O.A., Obi T.U. & Ojo O.// (1983).Trop. Vet., 1, 13-17.

50. Durojaiye O.A. Application of counter current immunoelectro-osmophoresis to the serology of peste des petits ruminants /Durojaiye O.A. & Taylor W.P.// (1984). Rev. Elev. Med. Vet. Pays Trop., 37, 272-276.

51. Dunn, S. D. 1986. Effects of the modifications of transfer buffer composition and the renaturation of proteins in gels on the recognition of proteins on Western blots by monoclonal antibodies /Dunn, S. D.// 1986. Anal. Biochem. 157:144-147.

52. El Hag Ali.B. The isolation of peste des petits ruminants virus (PPRV) from the Sudan /El Hag Ali, B., and W. P. Taylor.// 1984. Res. Vet. Sci. 36:1-4.

53. EMPRES (Livestock) Animal Production and Health Division Viale delle Terme di Cara-calla 00100 Rome, Italy 2005.

54. Furley C. W. An outbreak of peste des petits ruminants in a zoological collection /Furley, C. W., W. P. Taylor, and T. U. Obi.// 1987. Vet. Rec. 121:443-447.

55. Gargadennec L. & Lalanne A. (1942). La peste des petits ruminants /Gargadennec L. & Lalanne A.// (1942). Bull. Serv. Zoo. A.O.F., 5, p 15-21.

56. Gould, A.R. Comparison of the deduced matrix and fusion protein sequences of equine morbillivirus with cognate genes of the Paramyxoviridae /Gould, A.R. // (1996) Virus Research, 43, 17-31.

57. Gibbs E.P.L. The isolation of adenoviruses from goats appected with peste des petits ruminants in Nigeria Res /Gibbs E.P.L., Taylor W.P., Lawman M.L.P.//Vet. Sci., 1977, v. 23, 3,p. 331-335.

58. Gibbs E.P.L. Classitication of pesre des petits ruminants virus as the faurth member of the genus Morbillivirus Intervirology /Gibbs E.P.L. Taylor W.P, Lawman M.L.P. Bruanr J.// 1979, 11, p. 268-274.

59. Gilbert E.P.L. Adaptation olu virus de la des petits ruminants aux cultures cellulaires /Gilbert E.P.L., Monnier A.// Note prelimimaire -Rev. Elev. Med. Vet. Pays trop., 1862, v.15 4, p. 321-325.

60. Haas L. Editing of morbillivirus P gene transcripts in infected animals /Haas L., Baron, M.D., Liess, B. and Barrett, T.// (1995) Veterinary Microbiology, 44, 299-306.

61. Hyatt A.D. Ultrastructure of equine Morbillivirus /Hyatt A.D., and Selleck, P.W.// (1996) Virus Research, 42, 1- 15.

62. Hamdy F. M. Etiology of stomatitis pneumoenteritis complex in Nigerian dwarf goats /Hamdy F. M., A. H. Dardiri, O. Nduaka, S. S. Breese, and E. C. Ihemelandu// 1976. Can. J. Comp. Med. 40:276-284.

63. Hamdy F.M. Response of white-tailed deer to infection with peste des petits ruminants virus /Hamdy F.M. and Dardiri, A.H.// (1976). J. Wildlife Diseases, 12:516-522.

64. Hamdy F.M. Immunological relationship brtween rinder pest and peste des petits ruminants viruses /Hamdy F.M., Dardyry A.H., Brease S.S., De Boer C.L.// Proc. 79-th. An. Med. of the V.S. Anim Heatth Assoc. Portland, Oregon, 1975, p. 168-179.

65. Helder R.S. Some virus diseases of domestic animals in the sultanate of Oman /Helder R.S., Barnett L.T.R., Gray D.F.// Trop Amim HI th Prod, 1980, v.12, 2, p. 107-114.

66. Haffar A. The matrix protein gene sequence analysis reveals close relation ship between peste des petits ruminants virus (PPRV) /Haffar A., Libeau G., Moussa A.// Veterinary Microbiology. -1999. -64. P. 69-75.

67. Imagawa D.T. Relationship among measles, canine distemper and rinderpest-viruses /Imagawa D.T.// Pradr. Med. Virol. 1968, v. 10, p. 160-193.

68. Ismail I.M. and House, J. (1990). Evidence and identification of peste des petits ruminants from goats in Egypt /Ismail I.M. and House, J.// (1990).Archiv fur Experimentelle Veterinärmedizin, 44(3):471-474.

69. Kingsbury D. W. Paramyxoviridae /Kingsbury D. W., M. A. Bratt P. W., Choppin R. P., Hanson Y., Hosaka V. ter Meulen E., Norrby W., Plowright R., Rott and W. H. Wunner.// 1978. Intervirology 10:137-152.

70. Laviada M. D. Detection of African horsesickness virus in infected spleens by a sandwich ELISA using two monoclonal antibodies specific for VP7 /Laviada M. D., M. Babin, J. Dominguez and J. M. Sanchez Vizcaino.// 1992.J. Virol. Methods 38:229-242.

71. Laurent A. Aspects biologigues de la multiplication au virus de la peste des petits ruminants on PPR sur les cultures cellulaires /Laurent A.// Rev. Elev. Med. Vet. Pays trop, 1968, v.21, 3, p. 297-308.

72. Lu W., F. A. Osorio, M. B. Rhodes and R. A. Moxley. 1991 A capture-enzyme immunoassay for rapid diagnosis of transmissible gastroenteritis virus /Lu W., F. A. Osorio, M. B. Rhodes and R. A. Moxley.// 1991J. Vet. Diagn. Invest. 3:119-123.

73. Lefevre P.C. and Diallo A. (1990). Peste des petits ruminants /Lefevre P.C. and Diallo A//(1990). Rev Sei Tech, OIE, 9(4):951-965.

74. Libeau G. Rapid differential diagnosis of rinderpest and peste des petits ruminants using an immunocapture ELISA /Libeau G., Diallo A., Colas F. & Guerre L.// (1994). Vet. Ree., 134, 300-304.

75. Lefevre P.C. Serological evidence of peste des petits ruminants in Jordan /Lefevre PC, Daillo A, Schenkel S, Hussein S, Staak G.//Vet. Rec.- 1991.- P. 110-128.

76. Libeau G. Development of a competitive ELISA for detecting antibod-ies to the peste des petits ruminants virus using a recombinant nucleoprotein /Libeau G. et al.// Vet. Sci. 1995. -58. - P. 50-55.

77. Limo Molecular cloning of the rinderpest virus matrix gene: comparative sequence analysis with other paramyxoviruses /Limo and Yilma// (1990) Virology, 175,323-327.

78. Mahdy M.M. et al (1988). Pathological studies of rinderpest like diseases in deer and goats in the United Arab Emirates /Mahdy M.M. et al// (1988). Egyptian Journal of Comparative Pathology and Clinical Pathology, 1(1):36-44.

79. Mahy B.W.J., Barrett T., Evans S., Anderson E.C., Bostock C.J. (1988). Characterisation of a seal Morbillivirus /Mahy B.W.J., Barrett T., Evans S., Anderson E.C., Bostock C.J.// (1988). Nature 336, 115.

80. Majiyagbe K.A. Rapid diagnosis of PPR infection, application of immuno-electro-osmophoresis (IEOP) technique /Majiyagbe K.A., Nawathe D.R. and Abegunde A.// (1984).Rev. Elev. Med. Vet. Pays Trop., 37, 11-15.

81. McCullough K.C. Identification of epitope (s) on the internal virion proteins of rinderpest virus which are absent from peste des petits ruminants virus (PPRV) /McCullough K.C., Obi T.U.// Veterinary Microbiology. -1991. -26. P. 313-321.

82. Nanda S. K. Rinderpest Virus Blocks Type I and Type II Interferon Action: Role of Structural and Nonstructural Proteins /Nanda S. K., Baron M. D.// (2006). J. Virol. 80: 7555-7568 Abstract.[Full Text].

83. Nawathe D.R., Majiyagbe K.A. and Abegunde, A. 1980. Paper presented at the International Workshop /Nawathe D.R., Majiyagbe K.A. and Abegunde, A.// 1980.Seminar on PPR in Sheep and Goats, September 1980, Ibadan.

84. Nawathe D.R. Experimental infection of domestic pigs with the virus of peste des petits ruminants /Nawathe D.R. and Taylor, W.P. // (1979).Trop Anim Hlth Prod, 11: 120-122.

85. Nawathe D.R. The control of pestedes petits ruminants in Nigeria /Nawathe D.R.// (1984).Prev. Vet.Med. 2: 147-155.

86. New Zealand Ministry of Agriculture and Fisheries (NZMAFF) (1991a). Peste des petits ruminants. Surveillance, 18(3): 19-20.

87. Neumann G., Whitt M. A., Kawaoka Y. (2002). A decade after the generation of a negative-sense RNA virus from cloned cDNA what have we learned /Neumann G., Whitt M. A., Kawaoka Y.// (2002). J Gen Virol 83: 2635-2662 Abstract.[Full Text],

88. Nonda Y.P. Chatterjee A., Purohit A.K., Diallo A. The isolation of peste des petits ruminants virus (PPRV) /Nonda Y.P. Chatterjee A., Purohit A.K., Diallo A.// Veterinary Microbiology. -1996. -51. P. 207-216.

89. Obi T. U., and D. Patrick. 1984. The detection of peste des petits ruminants (PPR) virus antigen by agar gel precipitation test and counter-immunoelectrophoresis /Obi T. U., and D. Patrick.// 1984.J. Hyg. 93:577-586.

90. Obi T. U. Dot enzyme immunoassay for visual detection of peste des petits ruminants virus antigen from infected caprine tissues /Obi T. U., and C. K. Ojeh.// 1989.J. Clin. Microbiol. 27:2096-2099.

91. Osterhaus A.D.M.E. Morbillivirus infections of aquatic mammals: newly identified members of the genus /Osterhaus A.D.M.E., De Smart R.L., Vas H.W., Robs P.S., Kenter M.J.H. and Barrett T.// (1995)Veterinary Microbiology, 44, 219-227.

92. Pandey K. D., M. D. Baron and T. Barrett. 1992. Differential diagnosis of rinderpest and PPR using biotinylated cDNA probes /Pandey K. D., M. D. Baron and T. Barrett.// 1992. Vet. Rec. 131:199-200.

93. Pavathe D.E. Experimental infection of domestic pigs with the virus of peste des petits ruminants Trop /Pavathe D.E., Taylor W.P.// Trop Amim HI th Prod, 1979,v.l 1, p. 120-122.

94. Plowright W. Studies with rinderpest virus in tissue culture. The use of attenuated culture virus as a vaccine for cattle /Plowright W., Ferris R.D.// Res. Vet. Sci., 1962, v.8, p. 172-182.

95. Pronob Dhara, Sreenivasaa B.P., Barrett T., et al. Recent epidemiology of peste des petits ruminants virus (PPRV) /Pronob Dhara, Sreenivasaa B.P., Barrett T., et al.// Veterinary Microbiology.-2002.-88.-P. 153-159.

96. Perl S. Peste des petits ruminants (PPR) of sheep in Israel: case report /Perl S., Alexander A., Yakobson B., Nyska A., Harmelin A., Sheikhat N., Shimshony A., Davidson N., Abramson M. & Rapoport E.// (1994). Israel J. Vet. Med., 49 (2), 59- 62.

97. Rima, B.K. The evolution of morbillivirases: a comparison of nucleocapsid gene sequences including a porpoise morbillivirus / B.K. Rima // Vet. Microbiol. -1995. Vol. 44. P. 127-134

98. Roeder P.L. Peste des petits ruminants in Ethiopian goats /Roeder PL, Abraham G, Kenfe G, Barrett T.// Trop Anim Health Prod 1994;26:69-73.

99. Shaila MS, Purushothaman V, Bhavasar D, Venugopal K, Venkatesan RA. Peste des petits ruminants of sheep in India /Shaila MS, Purushothaman V, Bhavasar D, Venugopal K, Venkatesan R.A.// Vet Rec 1989; 125:602.

100. Shaila M.S. Geographic distribution and epidemiology of peste des petits ruminants viruses Virus Res /Shaila, M.S., Shamaki, D., Morag, A.F., Diallo, A., Goatley, L., Kitching, R.P. and Barrett, T.// (1996). 43: 149-153.

101. Sumption K.J. Detection of peste des petits ruminants antigen in conjunctival smears of goats by indirect immunofluorescence /Sumption K.J., Aradom G., Libeau G. and Wilsmore A.J.// (1998).Vet. Rec., 142, 421-424.

102. Taylor W.P. The epidemiology of peste des petits ruminants in the Sultanate of Oman /Taylor W.P., Albusaidy S. Barrett T.// Vet. Microbiol., 1990. 22. P.-341-352.

103. Taylor, W. P. The isolation of peste des petits ruminants virus from Nigerian sheep and goats /Taylor, W. P., and A. Abegunde.// 1979.Res. Vet. Sci. 26:94-96.

104. Taylor, W. P. The distribution and epidemiology of peste des petits ruminants /Taylor, W. P.// 1984.Prev. Vet. Med. 2:157-166.

105. Taylor W.P. Protection of goats against peste des petits ruminants with attenuated rindesrpest virus /Taylor W.P.// Res. Vet. Sci. 1979, v.29, p. 321324.

106. Taylor W.P. Serological studies with the virus of peste des petits ruminants in Nigeria /Taylor W.P.// (1979). Res. Vet. Sci., 26, 236-242.

107. Worrwall E.E. Xerovac: an ultra-rapid method for the dehydration and preservation of live attenuated rinderpest and peste des petits ruminants vaccines /Worrwall E.E., Litamoi J.K., Seek B.M. & Ayelet G.ll (2001). Vaccine, 19, 834-839.

108. Wosu L.O. Haemagglutination test for diagnosis of peste des petits ruminants disease in goats with samples from live animals /Wosu L.O.// (1991). Small Rumin. Res., 5, 169-171.

109. Wosu L.O. Current status of peste des petits ruminants (PPR) disease in small ruminants-a review article /Wosu L.O.// Stud Res Vet Med 1994;2:83-90.13.

110. Wosu, L.O. (1989), Management of clinical cases of peste des petis ruminants (PPR) disease in goats /Wosu, L.O. // (1989) Beitr. Trop. Landw. Vet. Med. 27 357-361.

111. Zhiliang Wang, Jingyue Bao, Xiaodong Wu, Yutian Liu, et. al. Peste des Petits Ruminants Virus in Tibet, China. EID Journal Home, 2009, V. 15, N. 2.

Информация о работе

Бобоев, Гиёсиддин Юнусович
кандидата ветеринарных наук
Душанбе, 2012
ВАК 06.02.02

Диссертация

Тест-система [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы