Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Терпегоидные соединения в культуре тканей полыни и хартолеписа

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Терпегоидные соединения в культуре тканей полыни и хартолеписа"

РГ6 од

шли главный ботанический сад

- 7 ИЮН 13Шщиональной академии наук

республики казахстан

На правах рукописи

ХАРАСОВ Равиль Миргасимович

ТЕРПЕНОИДНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ В КУЛЬТУРЕ ТКАНЕЙ ПОЛЫНИ И ХАРТОЛЕПИСА

03.00.12-физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алматы—1993

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии растений Казахского Государственного Национального Университета им. Аль-Фа-раби и лаборатории химии природных соединений Института органического синтеза и углехимии НАНдЬК.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

И.Р.РАХИМБАЕВ доктор химических наук С.М.АДЕКЕНОВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

В.П.БВДЕНКО

кандидат биологических наук А.М.МАНАДИЯОВА

Ведущее учреждение: Карагандинский Государственный Университет им.Е.А.Букетова

Защита диссертации состоится " 14" мая 1993 года в № час, на заседании специализированного Совета К 008.12.02 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Главном ботаническом саде АН Республики Казахстан по адресу: 480070, г.Алматы, Главный ботанический сад.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Главного ботанического сада.

Автореферат разослан п /3" СУУ1 Л $ 1993 года

Ученый секретарь Специализированного Совета, ,•/

кандидат биологических наук у Уу"^ V -- Г.А.Нурмуханбетова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. При культивировании тканей и клеток растений можно получить широкий спектр соединений, имеющих большое практическое значение. В последнее время среди природах соединений обнаружены представители с выраженной антибактериальной, фун-гицидной, противоопухолевой, сердечно-сосудистой, гормональной и рострегулиругацей активностью. Все это создает предпосылки для разработки новых эффективных средств для защиты растений и медицинских препаратов. Большой интерес вызывают биологически активные терпеноиды и, в частности, природные сесквитерпеновые "¡Г-лактоны.

Получение сесквитерпеновых лактонов путем химического синтеза сопряжено с большими трудностями технологического характера. Это, в первую очередь, связано с тем, что для химического синтеза требуются дорогостоящие и труднодоступные реактивы и к тому же этот процесс включает много стадий. Получение сесквитерпеновых лактонов из растительного материала также имеет свои трудности из-за обеднения дикорастущих ресурсов и сложности создания культурных плантации для заготовки сырья. В связи с этим, особую актуальность приобретает изучение возможности биосинтеза сесквитерпеновых лактонов в культуре тканей для выявления возможности биотехнологического получения биологически активных соединений.

Цель и задачи исследования. Основной целью предпринятого исследования явилось изучение биосинтеза терпеноидных соединений в культуре тканей некоторых растений семейства сложноцветных.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) выявить эксплант стерильного растения, обладающий высокой каллусообраэующей способностью;

2) подобрать для выбранного экспланта питательную среду с различной модификацией гормонов,' вызывающую наибольшее каллусооб-разование;

3) выяснить, сохраняется ли биосинтез терпеноидных соединений в первичных' каллусах растений семейства сложноцветных;

4) изучить возможность биосинтеза терпеноидных соединений

в тканевой культуре при длительном культивировании: а) оптимизи-

ровать состав питательной среди; б) изучить гистологические особенности различных типов тканей и динамику их роста.1 в) выявить активность экстрактов, полученных из культуры тканей при длительном культивирований} г) химически идентифицировать биологически активные вещества, синтезируемые в культуре тканей.

Научная новизна* В работе впервые показано, что высокой каллусообразуицей способностью обладают эксиланты из листьев асептических проросткой хартолеписа среднего, полыни Сиверса и стеблей полыни гладкой. Инициация каллусогенеза осуществляется на модифицированной нами среде. Установлено, что в процессе культивирования каялусных тканей полыни гладкой и хартолеписа среднего в них сохраняется способность к синтезу сесквитерпено-вых лактонов.

Впервые получена длительно культивируемая фототрофная тканевая линия полыни Сиверса* имеющая морфологию "волосяного корня". Оптимизирован состав питательной среды для поддержания высокой ростовой активности данной тканевой линии. Показано, что спиртовые экстракты из каллусных тканей полыни Сиверса обладают биологической активностью. При длительном культивировании тканевой линии полыни Сиверса доказан синтез р> -ситостерола.

Практическая ценность. Подобраны экспланты и оптимизированы питательные среды для каллусообразования из полыни гладкой, хартолеписа среднего и полыни Сиверса, которые могут быть использованы для экспериментов при изучении механизма биосинтеза вторичных соединений в культуре тканей. Фототрофная тканевая линия полыни Сиверса, может быть в дальнейшем применена для создания автотрофной ткани.

Показана возможность биотехнологического получения ^-ситостерола из культуры ткани полыни Сиверса.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на Республиканском совещании "Рациональное использование лекарственных и технических растений" (Алма-Ата, 1986), 14 Международном конгрессе по биохимии (Чехословакия, Прага, 1988), УШ Индо-Советском симпозиуме по химии природных соединений (Индия, Хайдарабад, 1986), У Конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1991), Материалах Республиканской конференции молодых ученых и специалистов ВУЗов Казахстана

"Разработка теоретических основ и создание ресурсосберегающих экологически чистых технологий, методов и материалов" (Алма-Ата, IS9I), материалах научной конференции "Изучение и рациональное использование природных ресурсов" (Уфа, IS9I) и представлены на Международном симпозиуме "Клеточные и генные технологии для зерновых злаков" (Алма-Ата, 1989), на научно-практической конференции "Физиолого-биохимические и генетико-селекционные основы иммунитета сельскохозяйственных растений к грибным болезням" (Уфа, 1990).

По теме диссертационной работы опубликовано 9 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из 3 глав и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, основные результаты и их обсуждение, выводы, список использованной литературы, содержащей 94 названия источников. Работа изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы, иллюстрирована 21 рисунком.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили растения из семейства сложноцветных: полынь гладкая (Artemisia glabella Kar.et Kir.), харто-лепис средний ( Chartolepia intermedia Boisa.), полынь Сиверса (Artemisia Sieversiana ïïilld.). Семена стерилизовали в 10 % растворе пероксида водорода или 10 % растворе хлорамина.

Стерильные семена проращивали на среде Кнопа при естественном освещении. Растения выращивали до 10 недельного возраста для периодического взятия эксплантов.

В экспериментах по культивированию эксплантов из различных органов и тканей были использованы общие методические приемы, описанные в монографиях Р.Г.Бутенко (1964), Ф.Л.Калинина с сотр. (1980).

В качестве эксплантов использовали верхнюю, среднюю часть и основание листа, верхушечную почку и пазушные почки растений. Экспланты культивировали на среде Мурасиге и Скуга (MC) (Murashi-ge, skoog, 1962 ) с добавлением агара (8 г/л) и различных концентраций 2,4-Д и цитокининов. Каллусы культивировали при 28°С, в некоторых случаях на свету (1000 лк, фотопериод 16/8 ч) и через

каждые 4-Ъ недель пересаживали их на свежую среду.

Изучение морфологии каллусных культур проводили при помощи бинокулярного стереоскопического микроскопа МБС-Ю.

Предварительный подбор концентраций гормонов душ инициации каллусогенеза проводили в процессе однофакторных экспериментов. Учитывали процент каллусообразования и массу полученного каллуса. Оптимизацию среда для длительнокультивируемых тканевых линий проводили методами Бокса и Уилсона и по схемам ортогональных латинских прямоугольников (Максимов, 1980; Бирюков, 1967). При оптимизации среды учитывали ростовой индекс (РИ).

Для изучения гистологического строения тканевых культур готовили давленные препараты. Четырехнедельные каллусы окрашивали в красителе судан (Ш-1У) и затем подкрашивали в гематоксилине (Пирс, 1962).

Экстрагирование воздушно-сухого сырья проводили различными растворителями в аппарате Сокслета. Полученные экстракты упаривали на ротационном испарителе.

Для выявления биологической активности полученных экстрактов проводили лабораторные опыты на фунгицидную и рострегулирую-щую активность. Мутагенный эффект определяли на индикаторных штаммах Ба1топе11а typ^limuгium.

Разделение экстрактов проводили методом жидкостной колоночной хроматографии. Индивидуальность веществ контролировалась тонкослойной хроматографией. Для определения химического строения веществ использовались спектральные методы (ИК-, УФ-, ШР-, С13-ШР, масс-).

Результаты экспериментов обрабатывали общепринятыми статистическими методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Получение каллусных тканей.

Полынь Сиверса. Стерильные 6 недельные проростки (рис.1.1.) расчленяли на верхнюю, среднюю часть и основание листа, верхушечную почку укороченного стебля и гипокотиль. Экспланты культивировали на среде МС, содержащей 2,0 мг/л 2,4-Д. Инкубировали в темноте при 28°С. В таблице I представлены данные каллусообра-

зупцей способности эксплантов из различных органов полыни Сиверса.

Хорошей каллусообразугацей способностью обладает средняя часть листа. Из листа инициируются красные, желтые и бесцветные каллусы, некоторые из них обладают ризогенной способностью (рис.1.3.). Из эксплантов листовой пластинки также образуются бесцветные рыхлые каллусы (рис.1.2.). Была выявлена инициация каллусогенеза из всех эксплантов черешка (табл.1.). Из черешка образуются бесцветные, желтые и красноиптцо гетерогенные каллусы о корнями и желтоватые гомогенные каллусы (рис.1.5.). Верхушечная почка также обладает хорошей каллусообразующей способностью. После посадки на среду из почки происходит быстрый рост стебля и листьев. Далее на 21 день инкубирования из основания почки образуются гомогенные и-гетерогенные каллусы (рис.1.4.).

Таблица I

Сравнительная каллусообрй~*ющая способность эксплантов из различных органов полыни Сивероа, %

!___Орган___

Дни !верхняя!средняя!основание'черешок!верхушечная!гипокотиль ¡часть ¡часть ¡листа ¡листа ¡почка I ¿листа ¡листа ! ! ! !

Скорость каллусогенеза, наблюдаемая при культивировании ги-покотилей, более медленная, чем у других органов: только на 28-ой день культивирования происходит образование наибольшего количества каллусов. Из гипокотиля в основном образуются гомогенные рыхлые каллусы.

При изучении накопления биомассы оказалось, что наилучшей способностью обладают каллусные ткани листа и наименьшей - тканевые культуры, образованные из верхушечной почки. Следовательно, для изучения накопления терпеноидных соединений в биомассе кал-лусных тканей наилучшими эксплантами являются листья и черешки полыни Сиверса, которые обладают хорошей каллусообразующей способностью, и их каллусы способны накапливать большое количество

.14- 80 80 80 100, , 60

21 80 100 80 ЮО

28 90 100 80 100^*1.100

1Г5

60 70 90

о

Рис.1. Получение каллусных тканей с различными морфогенными потенциями из акоплантов стерильных проростков полыни Сиверса: I - стерильные проростки (6 недель); 2 - гомогенный каллус из листа; 3 - гетерогенный каллус из листа; 4 - регенерация растения и образование каллуса из верхушечной почки; 5 - гомогенный (справа) и гетерогенный (слева) каллусы из черешка, листа

биомассы.

При предварительном подборе гормонов (кинетина и 2,4-Д) для роста культуры ткани полыни Сиверса использовались первичные каллусы. С целью выявления влияния 2,4-Д на рост культуры ткани полыни Сиверса был поставлен однофакторный эксперимент. Выявлено, что на среде МС без 2,4-Д образуются в основном морфогенные каллусы. На среде, содержащей 2,4-Д, происходит образование рыхлых каллусов. Наиболее благоприятная концентрация 2,4-Д в среде 0,5-1,5 мг/л.

Для выявления влияния кинетина был поставлен однофакторный эксперимент на среде МС с концентрацией кинетина от О до 0,5 мг/л. Наилучшей концентрацией кинетина душ роста культуры ткани полыни Сиверса является 0,2 мг/л.

Каллусы полученные из листа и растущие на свету, приобретают зеленоватый оттенок и некоторые образуют зеленые зоны. Каллусы, растущие в темноте, имеют бесцветный, сероватый и желтоватый цвет. Вес каллусов, растущих на свету превышает вес каллусов растущих в темноте после пяти недельной инкубации в 1,5 раза.

Таким образом, предварительный подбор среды показывает, что душ культуры ткани полыни Сиверса подходит среда МС, содержащая 1,0 мг/л 2,4-Д и 0,2 мг/л кинетина. Для большего накопления биомассы, каллусы необходимо культивировать на свету.

Хатзтолепис средний. С целью выявления влияния ¡2,4-Д и кинетина на инициацию каллусов из органов хартолеписа среднего был поставлен опыт с двумя уровнями двух факторов. Листья стерильных проростков в фазе 3-4-ого настоящего листа расчленяли на одинаковые по площади части и высаживали на среду МС, содержащую различные концентрации 2,4-Д и кинетина. Было выявлено, что инициации каллусов на среде МС без гормонов не происходит. Добавление кинетина (1,0 мг/л) в среду МС также не вызывало образования каллусов. Введение в среду 2,4-Д (5,0 мг/л) вызывает каллусообразование. Добавление в среду кинетина вместе о 2,4-Д вызывает усиленный рост образовавшихся каллусов. Таким образом, главную роль душ каплусообразования имеет 2,4-Д, а кинетин усиливает рост образовавшихся каллусов. Наблюдается образование двух типов каллусов: гетерогенных и гомогенных рыхлых. Окраска каллусов варьирует: желтый, коричневый, белый и зеленоватый.

Для выявления оптимальной концентрации 2,4-Д для каллусооб-разования был поставлен однофакторный эксперимент с различным содержанием 2,4-Д в среде (от 0 до 6,0 мг/л) (табл.2).

Таблица 2

. Влияние различных концентраций 2,4-Д на каллусо-генез из листовых эксплантов хартолеписа среднего

Содержание 2,4-Д!Каллусообразование, Средний вес каллусов, мг в среде, мг/л ! !

0 0 0

2,0 44,0 97,8 ±-14,6

4,0 66,0 142,0 ± 21,2

6,0 43,8 58,0 ± 12,9

Показано, что наибольший процент каллусообразования и наибольший средний вес образовавшихся каллусов наблюдается на среде МС, содержащей 4,0 мг/л 2,4-Д. При наличии в среде МО 6,0 мг/л 2,4-Д наблюдается уменьшение веса образовавшихся каллусов, хотя процент каллусообразования сохраняется на прежнем уровне. Следовательно, концентрация 2,4-Д в среде для каллусообразования хартолеписа среднего должна быть в интервале 2,0-4,0 мг/л.

При изучении каллусообразувдей способности эксплантов из различных органов хартолеписа среднего на среде МС, содержащей 2,0 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина, обнаружено, что наилучшей каллусообразующей способностью обладает верхняя часть и основание листа и самая слабая каллусообразующая способность наблюдается у черешка.

Таким образом, для инициации каллусогенеза у хартолеписа среднего необходимо использовать листья и культивировать экс-планты на среде МС, содержащей 2,0 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина.

Полынь гладкая. Наилучшее каллусообразование выявлено на среде МС с 5,0 мг/л 2,4-Д и 1.1С с 5,0 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина. Каллусообразующей способностью обладают все органы (верхушечная почка, стебель и листья). Каллусы в основном гомогенные, рыхлые, желто-зеленые и желто-красные. Также образуются желто-зеленые гетерогенные каллусы с корнями. При этом отмечено, что

на среде МС без гормонов из верхушечной почки образуются проростки с корнями, каллусообразование слабое. На среде МС, содержащей 1,0 мг/л кинетика происходило также образование проростков. Кал-лусообразования не замечено. Проростки образуются как из верхушечной почки, так и из пазушных почек. Средний вес каллусов, полученных на среде ЫС с 2,0 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина меньше, чем на среде с 5,0 иг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина. Таким образом, наиболее подходящая среда для каллусообразования - среда с 5,0 мг/л 2,4-Д.

С целью определения влияния кинетина на накопление биомассы при каллусогенезе отрезков стеблей использовала среду МС с 4,0 мг/л 2,4-Д и различными концентрациями кинетина (от 0 до 2,0 мг/л). Выявлено, что по мере увеличения количества кинетина в среде, вес образовавшихся каллусных тканей уменьшается. Наилучшей способностью накапливать биомассу обладают каллусные ткани, полученные из отрезков стебля полыни гладкой на среде МС с 4,0 мг/л 2,4-Д.

Следовательно, для каллусогенеза полыни гладкой необходимо использовать отрезки стебля и вести посадку на среду МС, содержащую 4,0-5,0 мг/л 2,4-Д.

Химическое изучение первичных каллусов. Каллусные ткани полыни Сиверса постоянно пересаживали на среду МС, содержащую 1,0 мг/л 2,4-Д и 0,2 мг/л кинетина, хартолеписа среднего на среду МС, содержащую 2,0 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина, а полыни гладкой на среду МС, содержащую 4,0 мг/л 2,4-Д. После третьего пассажа каллусные ткани всех трех растений высушивали до воздушно-сухого состояния.

Воздушно-сухие каллусы загружали в аппарат Сокслета и пятикратно экстрагировали хлороформом при температуре 50-60°С. Полученные экстракты объединяли и упаривали на ротационном испарителе.

На основании спектрального анализа (ИК-спектр) обнаружено наличие полос, характерных для {Г-дактонов, в полученных экстрактах каллусных тканей.

В дальнейшем суммы веществ, полученные из каллусов полыни гладкой и хартолеписа среднего, проанализировали с помощью метода тонкослойной хроматографии (ТСХ) на наличие сесквитерпеновых лак-тонов. Хлороформные экстракты, полученные из каллусных тканей полыни гладкой и хартолеписа среднего, экстрагировали пятикратно

эфиром. Эфирные экстракты объединяли и упаривали на ротационном испарителе. Наносили пятно эфирного экстракта на пластинки БИи-(ЧССР) и элюировали в системе.гексан-эфир (4:1; 1:1). Проявитель - 0,5 в 0,5 % Н2304 .В качестве веществ - метчиков использовали идентифицированные лактоны (гроссгемин и арглабин), выделенные из суммы веществ исходных растений методом колоночной жидкостной хроматографии. ТСХ анализ показал наличие оесквитерпе-новых лактонов в суше в веществ, полученных из каллусов полыни гладкой и хартолеписа среднего. _

Выявлено совпадение ^пятен веществ - метчиков (гроссгемина и арглабина) с % пятен в сумме веществ из каллусных тканей полыни гладкой и хартолеписа среднего.

Таким образом, на начальном этапе культивировали каллусных тканей некоторых растений семейства сложноцветных сохраняется способность к синтезу сесквитерпеновых лактонов.

2. Оптимизация состава питательной среды для культуры ткани полыни Сиверса. Проведен эксперимент по четырем факторам на четырех уровнях. Факторы были следующие: макро - и микросоли в концентрации от 25,0 до 100,0 % состава среда МС, глюкоза от 0 до 6 %, 2,4-Д от 0,5 до 2,0 мг/л, кинетин от 0,05 до 0,30 мг/л.

По значениям РИ определялась зависимость роста культуры ткани от концентрации каждого из изучавшихся компонентов. Эти зависимости позволяют определить оптимальный уровень каждого фактора, средний по всем уровням других факторов.

Влияние различных концентраций ^акро- и микроэлементов, глюкозы, кинетина и 2,4-Д на РИ и их эффект представлены в таблице 3.

Таблица 3

Влияние различных концентраций микро- и макросолей, глюкозы, кинетина и 2,4-Д на РИ культуры ткани полыни Сиверса и их эффект

Фактор ! Концентрация ! .Ш ! Эффект

I ! 2 ! 3' ! 4

макро- и 25 % 6,18 ± 0,21 - 3,165

микросоли 50 % 9,95 ± 0,28 . + 0,606

75 % 10,17 ± 0,48 + 0,842

100 %_ 11,08 ± 0,68 + 1,717

I ! 2 ! 3 -1___4___

глюкоза 0 % 12,80 ± 0,53 + 3,457

2 % 10,97 ± 0,52 + 1,646

4 % 8,83 ± 0,41 - 0,527

6 % 4,77 ± 0,19 - 4,576

2,4-Д 0,5 мг/л 12,45 ± 0,56 + 3,088

1,0 мг/л 8,84 ± 0,44 - 0,496

1,5 мг/л 8,40 ± 0,34 - 0,944

2,0 «¡с/л 7,69 ± 0,30 - 1,648

кинетин 0,05 мг/л 10,89 ± 0,47 + 1,544

0,10 мг/л 12,63 ± 0,39 + 3,275

0,20 мг/л •7,55 ± 0,46 - 1,803

0,30 мг/л 6,32 ± 0,32 - 3,016

Доверительная оценка € = 3,231

При увеличении концентрации макро- и микросолей происходит увеличение РИ, но при содержании их в среде от 50 до 100 % не найдено достоверного различия (при Р = 0,95). Увеличение концентрации глюкозы в среде от 0 до 6,0 % приводит к уменьшению РИ. При концентрации кинетина в среде 0,1 мг/л наблюдается наилучший рост культуры ткани. Уменьшение концентрации 2,4-Д в среде приводит к увеличению РИ, следовательно, 0,5 мг/л 2,4-Д в среде является наилучшей для роста каллусов полыни Сиверса. Модно достоверно утверждать, что оптимальное содержание кинетина в среде для культуры ткани полыни Сиверса должно быть 0,1 мг/л, а глюкоза как источник углеводов для культуры ткани полыни Сиверса не подходит.

В результате экспериментов по оптимизации для тканевой культуры полыни Сиверса предложена среда следуюдего состава, мг/л:

ИН4И03 412,5

СаС1£2 Н20 330,0

Н&304'7 Н2е 185,0

КН2Р04 127,5

МпвО^' 4 Н20 Н,5

КЛ ■ . 0,41

ZnSO^'7 Н20 4,3

CuS04'5 Н20 0,012

Na2MoO^' 2 Н£0 0,12

СоС12 '6 Н20 0,012

FeS(V 7 Н20 13,9

Na2 ЭДТА 18,62

инозит 100

тиамин 0,10

глицин 2,00

сахароза 3 . Ю4

агар-агар 8-9-Ю3

2,4-Д 0,5

кинетин 0,1

3. Структура и динамика роста культуры ткани полыни Сивепса. Структура зеленеющей рыхлой гомогенной культуры ткани полыни Си-верса изучалась с помощью метода давленных препаратов. Среди рыхлой массы клеток каллуса наблюдаются "плотные" зоны. Эти зоп интенсивно окрашиваются и состоят из меристематических клеток, сцепленных друг с другом. Ширина клеток 503 - 28 мкм и длина

252 - 23 йзсм (ргс.2.1.), Внутри-клеток ясно различимы специализированные шестилшца - идиобласты.

В "рыхлой." зоне каллусов в основном локализованы паренхимные клетки. Ширина клеток 569 ± 27 мкм и длина 1049 ± 57 мкм (рис.2.3). Клетки этого типа образуют вытянутые нитевидные структура типа "волосяного корня".

Важным является установление факта, что полученная нами культура ткани полыни Сиверса способна накапливать терпеновдные соединения во внутриклеточных вместилищах-идиобластах.

При изучении динамики накопления биомассы выявлено, что скорость роста ткани была наивысшей между 25 и 35 днями. После 7-ой недели культивируемые каллусы прекращали рост.

Следовательно, цикл роста каллусной ткани полыни Сиверса (на свету) равен 7-ми неделям. Изучаемая культура ткани полыни Сиверса состоит из сцепленных клеток и накапливает терпеноидныо соединения во внутриклзточных вакуолях.

4. Влияние света на культуру ткани полыни Сиверса. По данным литературы, хлорофиллоносные клетки синтезируют терпеноидные сое-

динения. Для выявления влияния света на содержание хлорофилла к рост тканевой культуры были проведены эксперименты с применением ингибитора электронно-транспортной цепи хлоропластов - диуроном. Обнаружено подавление диуроном ростового индекса в 4,6 раза, а количество хлорофилла уменьшается в 10,3 раза. Исследования АТФаз-ной активности сопрягающего фактора хлоропластов культуры ткани полыни Сиверса показали, что свойства АТФазы хлоропластов тканевой линии идентичны и сходны со свойствами АТФазы хлоропластов целых растений. Следовательно, в зеленеющих каллусных тканях имеются вполне нормально функционирующие хлоропласта. Поэтому, можно предположить, что синтез веществ происходящих в хлоропластах (например, низших терпеноидов) должен^сохраняться. Данная фотогетеротрофная культура ткани может слушть исходным материалом для последующего получения автотрофной культуры.

5. Биологическая активность экстрактивных веществ из культу-то ткани полыни Сиверса. Биомассу исследуемой культуры ткани полыни Сиверса по истечении цикла выращивания отделяли от среды и высушивали до воздушно-сухого состояния. Выход воздушно-сухсЧ биомассы составляет 3,9-4,1 %. Воздушно-сухие каллусы полыни Сиверса загружали в аппарат Сокслета и пятикратно экстрагировали спиртом. Полученные экстракты объединяли и упаривали на ротационном испарителе.

Спиртовый. экстракт из культуры ткани полыни Сиверса испытывали на биологическую активность. Были проведены лабораторные опыты для определения влияния экстрактивных веществ из культуры ткани на всхожесть семян полыни Сиверса и гречишки татарской (табл.4).

Выявлено, что спиртовый экстракт культуры ткани полыни Сиверса при концентрации 0,1-1,0 % обладает способностью к подавлению всхожести семян.

Проведены опыты для выявления влияния спиртового экстракта на рост культуры ткани полыни Сиверса (табл.5).

Показано, что начиная с 5,0 мг/л спиртовый экстракт достоверно подавляет рост тканевой культуры. Следовательно, спиртовый экстракт культур! ткани полыни Сиверса обладает гербицидной активностью.

Кроме того испытано действие экстрактивных веществ культуры ткани полыни Сиверса на мутагенную активность на индикаторных

Рис.2. Гистологическое изучение культуры ткани полыни Сиверса (увеличение в 144 раза):

1 - меристеглатические клетки из "плотной" зоны

культуры ткани;

2 - меристематические клетки культуры ткани,

соединенные друг с другом в нитевидную структуру;

3 - паренхимные клетки из "рыхлой" зоны культуры ткани;

4 - паренхимные клетки культуры ткани, соединенные

друг с другом в нитевидную структуру

Таблица 4

Влияние спиртового экстракта из каллусных тканей полыни Сиверса на всхожесть семян полыни Сиверса и гречишки татарской (на пятый день)

Семена испытываемого растения, ¡Среднее, в #!0ткло..ение от концентрация экстракта в % ! ¡среднего, -

Полынь Сиверса

Контроль 10,0 2,0

1.0 0 0

0,5 0 0

0,1 16,7 3,4

Гречгаика татарская

Контроль 06,7 3,4

1.0 0 0

0,5 14,7 4.8

од 40,0 9,4

Таблица 5

Влияние спиртового экстракта из каллусных тканей полыни Сиверса на ростовой индекс (РИ) культуры ткани полыни Сиверса

Концентрация экстракта, мг/л!_РИ_

!среднее, в #!отклонение+от среднего,

4,71 0,42

4,52 0,41

3,13 0,31

2,00 0,18

1,50 0,16

штаммах Salmonella typbimurum ТА 1535 и ТА 1538 (табл.6).

Генетический эффект при использовании спиртового экстракта культуры ткани полыни Сиверса в наименьшей дозе до 10 мкг/чашку превышает спонтанный уровень реверсий в'16-21 раза. Максимальный уровень реверсий отмечался при концентрации 1000 мкг/чашку в 29,7-38,8 раза. Эти данные свидетельствуют о том, что сумма сое-

0

2,5 5,0 ' 7,5 10,0

Таблица 6

Мутагенный эффект спиртового экстракта из культуры ткани полыни Сиверса на индикаторных штаммах Б^урМтигит

Концентрация мкг/чашку! Среднее число ревертантов на чашку

!штамм ТА 1535 ! штамм ТА 1538

1000 815 ± 36,7 682 ± 29,3

100 468 ± 22,0 504 ± 24,7

10 444 ± 21,3 354 ± 15,9

0 21 ± 1,0 22 ± 1,0

динений из спиртового экстракта полыни Сиверса индуцирует мутации и обладает средней мутагенной активностью.

6. Химическое изучение биологически активных компонентов из биомассы каллусной ткани полыни Сиветса. Проведено химическое изучение спиртового, гексанового и хлороформного экстрактов из тканевой культуры полыни Сиверса. Разделение суммы веществ проводили методом жидкостной колоночной хроматографии. Из спиртовой суммы веществ было выделено индивидуальное кристаллическое соединение.

С целью дальнейшего изучения суммы веществ из культуры ткани полыни Сиверса 97,2 г воздугчо-сухих каллусов от 13-18 пассьжа экстрагировали последовательно, гексаном и хлороформом. Экстракты упаривали на ротационном испарителе. Было получено 0,33 г гексанового экстракта и Х,38гхлороформного экстракта. Сумму веществ из гексанового экстракта каллусной биомассы полыни Сиверса.хромато-графировали на колонке с силикат ел ем (табл.7).

Таблица 7

Хроматографическое разделение суммы веществ из гексанового экстракта каллусной биомассы полыни Сиверса

№ франции¡Система растворителей!Выход ве-!ИК-спектр,!Характерис-! !ществ,мг ! см-1 |тика фракции

__!__!_____I I _ 11 I 11 1Г I ~411 Т I "б! 11

масло салатного цвета

масло соломенного цвета

1-5 гексан 104,1 1750-

1760

6-10 гексан-эфир 38,8 1740

(9:1)

I___!_____2____i _ _3_ _ 1 _ _4_ _!___5

II—15 гексан-эфир (4:1) 35,1 17201750 желтое масло с кристаллами

16-20 эфир 62,5 1725, 17401760 коричневое „масло

Рехроматографированием фракции 11-15 изолированы кристаллы с т.пл.135-137°С (петролейгшй эфир) ]д°-34° (хлороформ), Rf 0,58. Выделено 9,5 мт кристаллов, составляющих 2,88 % в расчете на гексановый экстра!« или 0,31 % от воздушно сухой биомассы каллусов.

По масс-спектру вещество имеет молекулярный вес 414 (рис.3).

При ацетилировании уксусным ангидридом в пиридине вещество образует моноацетат состава £31^52^2* т.пл.126-1280С (из спирта).

В ПМР-спектре (рис.4) синглеты в области 0,66 м.д. (ЗН) и 0,98 м.д. (ЗН) соответствуют протонам ангулярных метилвных групп; мультиплет с центром 0,81 м.д. (6Н) - вторичным метильным группам С-25 и С-26; триплет при 1,50 м.д. (ЗН,^ = 6 Гц) - метальной группе при С-28; синглет в области 1,80 м.д. (IH) - протону ги-дроксшгьной группы; октет в области 3,50 (1Н,7= 4 Гц, J = I Гц) относится протону, геминальному гидроксильной группе, синглеты в области 5,07 м.д. = 8 Гц) и 5,32 м.д. (IH, 5 Гц) -

олефиновым протонаг,1.

На основании данных ИК-, ШР-спектров, физико-химических констант, сопоставления их с литературными, а также пробой смешения выделенное вещество идентифицировано как ß- ситостерол. Известно, что f>- ситостерол обладает биологической активностью.

Яри химическом изучении хлороформного экстракта также был выделен fi- ситостерол.

Хроматографическое разделение экстрактов из длительно культивируемых каллусов полыни Сиверса показало, что в ИК-спектре отдельных фракции тлеются полосы поглощения, характерные для Jf-лактонов.

На основе химического исследования экстрактивных веществ из культуры ткани полыни Сиверса, можно утверждать, что каллусные ткани сложноцветных и при длительном культивировании синтезируют сесквитерпеновне ^Г-лактоны и стерины. Следовательно, можно пред-

n i n0

«1Н1 «а I I

<00 <и

«I

СпНмО

га но

, «и ж I

Рис.3. Масс спектр .Р-ситостерола

Рис.4. ШР--ситостерола из каллусной биомассы полыни Сиверса

положить, что именно терпеноидные соединения из экстрактов культуры тканей в основном, обуславливают их биологическую активность.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что высокой каллусообразугацей способностью обладают экспланты из листьев асептических проростков-хартолеписа среднего, полыни Сиверса и стеблей полыни гладкой.

2. Инициация каллусогенеза осуществляется на „чреде Мурасиге и Скуга Модифицированной нами и дополненной фитогормонами: 2,0 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина (хартолепис средний), 4,0 мг/л 2,4-Д (полынь гладкая), 2,0 мг/л 2,4-Д (полынь Сиверса).

3. Установлено, что в процессе культивирования каллусных тканей полыни гладкой и хартолеписа среднего в них сохраняется способность к синтезу сесквитерпеновых лактонов.

4. Оптимизирован состав питательной среды Мурасиге и Скуга для поддержания долговременной ростовой активности каллусных тканей в течение 18 месяцев.

5. Впервые получена длительно культивируемая фототрофная тканевая линия полыни Сиверса, имеющая морфологию "волосяного корня".

6. Спиртовые экстракты из каллусных тканей полыни Сиверса обладают биологической активностью (ингибируют прорастание семян, подавляют рост культуры ткани), а также проявляют мутагенную активность (хромоcotíHHе перестройки Salmonella typhirium ).

7. В культуре каллусных тканей полыйи Сиверса с помощью хроматографических и спектральных (ИК-, ШР-, масс-) методов доказан синтез ß -ситостерола.

8. Рекомендуется использовать выделенную тканевую линию полыни Сиверса для биотехнологического получения ß -ситостерола.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Адекенов C.U., Куприянов А.Н., Кагарлицкий А.Д., Харасов P.M. Флора Центрального Казахстана -перспективный источник биологически активных соединений //Тез.респуйл.совещ. "Рациональное использование лекарственных и технических растений". - Алма-Ата, IS86. - с.289-291.

2. Адекенов С.М., Харасов P.M., Куприянов А.Н., Турмухамбе-тов А.Е. Нитрозин - новый сесквитерпеновый лактон из Artemisia nitrosa //Химия природных соединений. - 1986. - ÍS 5. - с.644-645.

3. Adekenov S.M., Kharasov R.M., Kupriyanov A.H., Gafurov N.M.Sesquiterpene lactones of Artemisia nitrosa // Abstracts of VIII Indo-Soviet symposium on the chemistry of natural products - Hyderabad, 1986,

4. Kharasov H.M., Adekenov S.M., Rakhimbaev I.H. Synthesis sesquiterpene lactones of Artemisia glabella and Chartolepis intermedia by the method of tissue culture // Abstracts of Internatiohal congress of biochemistry - Prague Chechoslovakia, 1988. -p. 191

5. Харасов P.M., Рахимбаев И.Р., Адекенов C.M. Культура изолированных тканей полыни Сиверса ( Artemisia Sieversiana Willd.) //Известия Казахской ССР, серия биологическая - 1989. - 1 4.-

6. Харасов P.M. Возможность микроразмножения некоторых растений семейства сложноцветных Центрального Казахстана. //В сб. "Охрана генофондов и рациональное.использование растительности Центрального Казахстана", Караганда, 1990, - с.102-106.

7. Харасов P.M. Культура ткани Artemisia Sieversiana- гро-дуцент биологически активных веществ. //В сб."Разработка теоретических основ и создание ресурсосберегающих экологически чистых технологий, методов и материалов", Алма-Ата, 1991, - с.90.

8. Харасов P.M. Гербицвдная активность суммы соединений, полученный из культуры ткани Artemisia Sieversiana //В сб."Изучение и рациональное использование природных ресурсов", Уфа, 1991, -

9. Токсобаева ГЛ., Харасов P.M., Колумбаева S.C. Свойства АТФазы хлоропластов каллусной ткани полыни Сиверса. /Дез.У Конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана. - Ташкент, 1991, - с.234.

с.81-84

с.73